CN115252787B - Zip7在抑制阿片类药物诱发的痛觉过敏中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了Zip7在抑制阿片类药物诱发的痛觉过敏中的应用。本发明构建了瑞芬太尼诱发的痛觉过敏动物模型，同时对动物模型中的Zip7基因敲除，动物痛觉过敏改善。因此本发明的研究成果为临床提供一种瑞芬太尼诱发的痛觉过敏的新治疗方案。

Description

Zip7在抑制阿片类药物诱发的痛觉过敏中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及Zip7在抑制阿片类药物诱发的痛觉过敏中的应用。

背景技术

阿片类药物是临床治疗急、慢性疼痛及癌痛的最重要的镇痛药物，临床用药量极大，但它们在镇痛的同时还能够激活体内的促伤害感受机制，表现为机体对伤害性刺激的反应性增强，镇痛药物需求量增加，即阿片类药物诱发的痛觉过敏(opioid-inducedhyperalgesia，OIH)。瑞芬太尼是一种超短效的μ-阿片受体激动剂，由于它具有起效快、清除快、无蓄积、代谢不依赖于肝肾功能等优点广泛应用于临床术中镇痛。但是，瑞芬太尼诱发术后痛觉过敏(remifentanil-induced postoperative hyperalgesia，RIH)的发生率远高于其他阿片类镇痛药物，高达85%。另有一项研究发现，手术时间超过2小时的患者，RIH的发生率为32.7%，累计输注量超过30 μg/kg时，RIH的发生率甚至高达41.8%。RIH的主要特征为瑞芬太尼以0.05~0.3 μg/kg/min的速度输注60~90 min后出现术后切口疼痛的程度和范围增加，以及阿片类镇痛药需求增加。RIH不仅降低了药物的镇痛效果，还促进了痛觉感知，产生异常疼痛，甚至引发术后慢性疼痛的发生，患者对阿片类药物剂量需求越来越大，不仅增加住院时间、医疗费用、占用医疗资源，最关键的是增加了患者的身心创伤，加重了患者的痛苦，严重影响了患者的生活质量。目前，临床无有效的治疗措施，主要是因为其发生机制目前尚不清楚，因此，深入阐明瑞芬太尼诱发痛觉过敏的发病机制和寻找有效治疗策略是当务之急。

发明内容

第一方面，本发明提供了抑制Zip7的试剂在制备预防或治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏的药物中的应用。

第二方面，本发明还提供了一种预防或治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏的药物组合物，所述药物组合物包括抑制Zip7的试剂。

第三方面，本发明还提供了一种预防或治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的前面所述的抑制Zip7的试剂。

附图说明

图1显示Zip7 mRNA表达结果图；

图2显示Zip7 蛋白表达结果图，其中A：免疫印迹图；B：柱状统计图；

图3显示Zip7对瑞芬太尼痛觉过敏的结果图，其中A：缩足频率MWF(%)；B：热缩足潜伏期（TWL）；***P<0 .001，与C组相比；&&& P<0 .001；与R组相比；two-way ANOVA。

具体实施方式

现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。

除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。

治疗应用

本发明提供了抑制Zip7的试剂在制备预防或治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏的药物中的应用。

进一步，所述阿片类药物是瑞芬太尼。

进一步，抑制Zip7的试剂包括抑制Zip7表达的试剂。

进一步，抑制Zip7表达的试剂包括抑制Zip7基因mRNA表达的试剂和/或抑制Zip7蛋白表达的试剂。

进一步，抑制Zip7基因mRNA表达的试剂包括利用基因敲除技术、反义核苷酸技术、RNAi技术抑制Zip7基因表达过程中使用的试剂。

“反义核苷酸”指含有与编码目标基因的mRNA互补的序列的核酸。反义核苷酸可以由DNA、RNA或二者组成。反义核酸不需要与靶基因的mRNA 100%互补。反义核酸可含有非互补碱基，只要它能够在严格条件下特异性杂交即可。当将反义核酸引入细胞时，它结合靶多核苷酸并抑制转录、RNA加工、翻译或稳定性。除反义多核苷酸之外，反义核酸还包括多核苷酸模拟物，它含有经过修饰的主链、和3′和5′端部分。这样的反义核苷酸可以根据目标基因序列信息来恰当设计并使用本领域技术人员公知的方法来生成。

进一步，所述基因敲除技术包括CRISPR技术、锌指酶ZFN技术、TALEN技术。

优选地，基因敲除技术使用的是CRISPR技术；

更优选地，CRISPR技术使用的是CRISPR/Cas系统。

如本文所用的术语“CRISPR/Cas”、“CRISPR系统”或“CRISPR-Cas系统”统称为参与表达或指导CRISPR相关基因（Cas）活性的转录本和其他元素，包括编码Cas基因的核酸、tracr（反式激活CRISPR）序列（例如活性部分tracrRNA），tracr-mate序列（在内源性CRISPR系统的背景下包含“直接重复”和tracrRNA处理的部分直接重复），引导序列（gRNA，例如用于引导Cas的RNA，例如Cas9；CRISPR RNA和反式激活（tracer）RNA或单个引导RNA（sgRNA））或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。CRISPR-Cas任选地是II类单体Cas蛋白，例如II型Cas或V型Cas。II型Cas蛋白可以是Cas9蛋白，例如来自化脓性链球菌（Streptococcuspyogenes），新弗朗西斯菌（Francisella novicida），内氏放线菌（a.Naesulndii），金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）或脑膜炎奈瑟球菌（Neisseriameningitidis.Optiona）的Cas9。优选地，Cas9来自化脓性链球菌。V型Cas蛋白可能具有RNA加工活性。V型Cas蛋白可能是Cas12a（也称为Cpf1）Cas蛋白，如来自Lachnospiraceae细菌的Cas12a（Lb-Cas12a））或来自Acidaminococcus sp.BV3L6（as-Cas12a）。CRISPR系统也可以是CRISPR-Cpf1系统，其中Cas9等Cas被Cpf1取代。CRISPR系统的典型特征在于促进在靶序列位点形成CRISPR复合物的元件。

这里使用的术语“gRNA”或“引导RNA”是指与特定DNA序列(例如crRNA)杂交的RNA分子，并且还包括与称为tracrRNA的CRISPR-Cas蛋白结合的蛋白结合片段。gRNA还可以包括直接重复序列。引导RNA中与特定DNA序列杂交的部分在本文中称为核酸靶向序列，或crRNA或间隔区序列。根据上下文可以理解，gRNA也可以指编码gRNA的相应DNA序列或由其表示。由于靶特定部分或crRNA可以与不同的tracrRNA结合，因此本文提供的引导序列最小限度地包括crRNA序列。

术语“crRNA”也称为“间隔物序列”或包括本文使用的间隔物序列，指的是与靶序列形成或能够形成RNA-DNA双链的gRNA部分。该序列可以是互补的或对应于特定的CRISPR靶序列。CrRNA/间隔区序列的核苷酸序列可以确定CRISPR靶序列，并且可以被设计成靶向期望的CRISPR靶位点。CrRNA也可以指从上下文中理解的编码crRNA的相应DNA序列或由其表示。

在本发明的具体实施方案中，CRISPR/Cas系统是CRISPR/Cas9系统。

进一步，RNAi技术抑制Zip7基因表达过程中使用的试剂包括如下：短干扰RNA、短发夹RNA或微小RNA。

siRNA是21-23个碱基的双链RNA。siRNA可以通过本领域技术人员公知的方法来制备，例如通过化学合成或作为天然存在RNA的类似物。shRNA是具有发夹转角(hairpinturn)结构的短链RNA。shRNA可以通过本领域技术人员公知的方法来制备，例如通过化学合成或通过将编码shRNA的DNA引入细胞并表达DNA。

进一步，抑制Zip7蛋白表达的试剂包括包括与Zip7蛋白特异性结合的抗体。

进一步，所述Zip7蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述Zip7蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与Zip7蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

进一步，痛觉过敏包括机械痛觉过敏和热痛觉过敏。

本发明的药物可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剂、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的药物可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的药物施用于人，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。

文中使用的术语“药学上可接受的”涉及化合物、成分、材料、组合物、剂型等，它们在医学判断的合理范围内，适于与患者的组织接触，并未带来过度的不希望的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症，并有合理的益处/风险比。

药物组合物

本发明还提供了一种预防或治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏的药物组合物，所述药物组合物包括抑制Zip7的试剂。

优选地，抑制Zip7的试剂包括抑制Zip7表达的试剂；

优选地，抑制Zip7表达的试剂包括抑制Zip7基因mRNA表达的试剂和/或抑制Zip7蛋白表达的试剂；

优选地，抑制Zip7表达的试剂包括利用基因敲除技术、反义核苷酸技术、RNAi技术抑制Zip7基因表达过程中使用的试剂。

治疗方法

本发明还提供了一种预防或治疗阿片类药物诱发的术后痛觉过敏的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的前面所述的抑制Zip7的试剂。

本文所用的术语“有效量”是指足以治疗指定紊乱、病症或疾病如改善、缓和、减轻和/或延迟其一个或多个症状的化合物或组合物的量。

本发明的“受试者”可以是动物、哺乳动物、胎盘哺乳动物、啮齿动物(例如豚鼠、仓鼠、大鼠、小鼠)、鼠科动物(例如小鼠)、兔类动物(例如兔)、犬科动物(例如狗)、猫科动物(例如猫)、马科动物(例如马)、猪类(例如猪)、羊类(例如羊)、牛类(例如奶牛)、灵长类动物、猿猴(例如猴子或者猿)、猴类(例如绒猴、狒狒)、猿类(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩、长臂猿)或者人类。

本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：

(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；

(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者

(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。

实施例 Zip7与瑞芬太尼诱发的痛觉过敏相关性研究

一、实验方法

(1)实验分组：健康雄性C57BL6小鼠12只，1月龄，由中国北京军事医学科学院实验动物中心提供，采用随机数字表法分为2组(n＝6)；Zip7基因敲除小鼠，由南京生物医药研究院利用 CRISPR Cas9 技术构建 Zip7 敲除小鼠，12只：

生理盐水组(C组)：经尾静脉输注与瑞芬太尼等容量的生理盐水60min；

瑞芬太尼组(R组) ：经尾静脉输注瑞芬太尼1.0 μg• kg^-1•min^-1（批号：H20030197，湖北宜昌人福药业有限责任公司）60 min；

Zip7基因敲除（knockout）组（ZK组）：经尾静脉输注与瑞芬太尼等容量的生理盐水60min；

ZK+瑞芬太尼组 (ZK+R组) ：对Zip7基因敲除鼠经尾静脉持续输注瑞芬太尼1μg·kg^-1•min^-1共60min。

(2)瑞芬太尼痛觉过敏模型制作：小鼠吸入2%七氟醚麻醉，小鼠仰卧位固定于操作台。30～40°C温水浸润小鼠尾部，使用较钝的备皮刀刮除小鼠尾部表面环状表皮鳞，再用酒精棉球反复擦拭待穿刺静脉，并在鼠尾根部结扎止血带，很快可见扩张的血管。进针部位应选择尾中部或略偏下，看清血管走向，将针头与静脉成15～25°夹角，对准血管中央，针尖轻轻抬起与血管平行刺入，平行皮肤小角度进针。置管位置正确最可靠的指征是进针后针芯立即见有血液顺畅流出。用粘膏固定留置针。尾静脉输注瑞芬太尼1.0 μg• kg^-1•min^-1。

(3) 构建 Zip7 基因敲除小鼠：由南京生物医药研究院利用 CRISPR Cas9 技术构建 Zip7 敲除小鼠，饲养于SPF 级屏障系统中进行后代繁育。

(4)行为学实验：于输注瑞芬太尼或生理盐水前24 h(T0)、停止输注瑞芬太尼或生理盐水后2、6、24和48 h（T1-4）时测定机械缩足频率（the frequency of The mechanicalfoot contraction response，MWT(%)）和热缩足潜伏期（thermal foot contractionlatency，TWL），测试前使大鼠适应15 min。采用BSEVF3电子von Frey纤维丝（HarvardApparatus公司，美国）测定MWT。以von Frey纤维丝对大鼠右后足2、3趾骨间垂直施加刺激，记录出现阳性反应（如快速缩足反应、舔舐右足或嘶叫）的刺激力度，连续测定10次，间隔1min，取缩足频率为MWF(%)。

采用红外足底测痛仪(IICT Life Science 390)测定TWL，记录从左后足接触热板至出现回缩、踮脚、挣扎、嘶叫、舐足任一反应的时间为TWL，连续测定3次，间隔5min，取平均值作为PWL(sec)。为防止烫伤鼠爪，TWL上限定设置为20s。

(5)Real-time PCR（QPCR）反应

根据实验分组和所检测的基因数，设计 QPCR 加样顺序，每个实验样本需设置3个复孔。根据下表所示配置每孔所需试剂，阴性对照孔的 DNA 模板需用DEPC 水来替代。混匀后瞬时离心，居中放置于QPCR 仪内。选择程序： 95℃10min，95℃ 15 s，60℃ 60 s，35 个循环，4℃ ∞。目的基因的引物序列如下：

Zip7-F：CCTCTGGGCCTATGCACT；

Zip7-R：ATGCCTGGGAGAGTTTGACT；

(6) Western Blot：采用Western Blot法测定蛋白的表达。于最后1次行为学测定结束后，处死大鼠，取脊髓L4-6节段，加入预冷的组织蛋白裂解液，研磨成组织匀浆。将匀浆液4℃离心5min，12000rpm，离心半径10cm，上清液即为脊髓组织总蛋白。用膜蛋白提取试剂盒(Thermo公司，美国)，按照说明书进行具体操作提取膜蛋白。使用兔源 Zip7 抗体 （美国 Invitrogen 公司）和兔源GAPDH（Abcam公司，美国），按照说明书的指南进行实验测定ZIP7表达。

(7)统计学分析：采用SPSS 18 .0统计学软件进行分析，正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示，随机区组设计的计量资料比较采用单因素方差分析，重复测量设计的计量资料比较采用重复测量设计的方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

二、实验结果

(1)瑞芬太尼输注增加脊髓Zip7 mRNA的表达

在瑞芬太尼痛觉过敏模型后48h，处死大鼠取脊髓L4-6，在Real-time PCR结果发现Zip7 mRNA表达明显增加(P<0 .001，图1)。以上结果表明，瑞芬太尼输注后的痛觉过敏与脊髓Zip7 mRNA表达增加有关。

(2)瑞芬太尼输注增加脊髓Zip7蛋白质的表达

在瑞芬太尼痛觉过敏模型后48h，处死大鼠取脊髓L4-6，在Western Blot结果发现Zip7蛋白表达明显增加(P<0.001，图2)。以上结果表明，瑞芬太尼输注后的痛觉过敏与脊髓Zip7表达增加有关。

(3)Zip7基因敲除抑制了瑞芬太尼输注导致机械痛敏和热痛觉过敏

结果如图3所示，与生理盐水组(C组)相比，瑞芬太尼 (R)组MWF(%)显著增加，热缩足潜伏期（TWL）缩短(***P<0 .001)。这些结果表明，以1μg·kg^-1·min^-1的速度输注瑞芬太尼可引起机械痛敏和热痛觉过敏。与C组比较，ZK组MWF(%)及TWL未见显著改变，说明较低Zip7表达不影响正常小鼠的机械痛阈及热痛阈。与R组比较，ZK+R组的MWF(%)显著降低，TWL显著延长(&&&P<0.001)，说明敲除Zip7可以缓解瑞芬太尼输注引起的机械痛敏和热痛敏。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (2)

1.抑制Zip7的试剂在制备预防或治疗瑞芬太尼诱发的术后机械痛觉过敏的药物中的应用；所述抑制Zip7的试剂是通过基因敲除技术抑制Zip7表达的试剂，所述基因敲除技术是CRISPR Cas9技术。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型是药剂学上可以接受的任何药物剂型。

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