WO2012129767A1 - 阳离子修饰的琼脂糖水凝胶和核酸药物组合物及制法和应用 - Google Patents
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Description
阳离子修饰的琼脂糖水凝胶和核酸药物组合物及制法和应用
一、 技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及阳离子修饰的琼脂糖水凝胶和核酸药物 组合物及其制备方法和在类风湿关节炎， 红斑狼疮， 多发性硬化和强直性脊柱炎 中等风湿性疾病中的应用。
二、 背景技术
脾脏是最大的外周淋巴器官，是天然免疫反应与获得性免疫反应相互作用的重要 场所。 抗原的捕获与呈递， T细胞的活化， B细胞分化成熟和抗体的产生等重要 免疫反应过程都在脾脏中发生或完成。 多数免疫相关疾病都涉及脾脏功能异常。 类风湿关节炎， 红斑狼疮， 多发性硬化， 强制性脊柱炎等自身免疫疾病的发病过 程中通常会伴随着脾脏功能的亢进。理论上，对脾脏中免疫反应的重要环节进行 干预，可以调节全身的免疫系统功能，对免疫相关的自身免疫疾病的发生和发展 产生影响。
然而， 长期以来， 针对脾脏功能调节的临床手段还仅仅是脾切除， 缺少药物 治疗等更为安全有效的手段。这主要是因为脾脏结构特殊， 功能复杂， 其中的细 胞很多来自循环系统和其他免疫器官， 构成多变，缺少小分子药物治疗的脾特异 性的靶点。在缺少脾特异性治疗分子靶点的情况下， 小分子药物的治疗效果是不 确定的， 副作用会很大。抗体等蛋白药物较小分子药物， 能更直接的干预细胞相 互作用过程中的蛋白分子，但与小分子药物相类似， 蛋白抗体的作用也是全身性 的， 很难获得仅限于脾脏的药物作用。 以质粒， 小片段的 DNA和 RNA为主要 构成的核酸药物， 在体内外应用时， 都需要载体材料的辅助， 如一些阳离子聚合 物载体， 与核酸分子形成纳米复合物颗粒， 可以实现体内的药物输送。但是目前 尚未有报道载体-核酸药物给药体系可以实现脾特异性的药物富集。
三、 发明内容
本发明需要解决的问题就是公开了一种靶向脾脏的载体 -核酸药物给药体系 及其在自身免疫疾病中的应用， 具体涉及到阳离子修饰的琼脂糖水凝胶 (C-agarose)和核酸药物组合物的脾靶向特性在类风湿关节炎， 红斑狼疮， 多发 性硬化和强直性脊柱炎中等自身免疫疾病的治疗应用。
本项发明提供的阳离子修饰的琼脂糖是具有以下结构的化合物：
阳离子修饰的琼脂糖的 Rl， R2， R3， R4可以分别是一个氢原子或者是一个 选自以下基团组的取代基， 这个基团组包括伯氨基， 仲氨基， 叔氨基和长链长约 一到十个碳原子的直链或者支链的含有氨基的碳链，上述化合物至少含有一个取 代基。
阳离子修饰的琼脂糖制备过程中所采用的各种试剂配比是获取阳离子修饰 的琼脂糖的最佳反应试剂配比，但是不应视为对阳离子修饰的琼脂糖制备方法的 限制。
本项发明中使用的核酸药物包括质粒， 小片段的 DNA， RNA以及 DNA和 R A 的杂合。 本次实验中采用的核酸药物为针对肿瘤坏死因子的反义核酸 (ASO) ，但是不应视为对核酸药物使用种类的限制。
本项发明的载体 -核酸药物脾靶向给药体系采取皮下给药方式给予合适剂量。 合适的剂量是那些能得到所需要的最终量的剂量。而治疗不同的疾病也可能需要 不同的剂量。 该试剂的有效量是能导致类风湿关节炎， 红斑狼疮， 多发性硬化， 强制性脊柱炎等免疫疾病症状明显降低的量。
具有常规技术的研究人员将能够确定本项发明所提供的试剂的最有效的给 药剂量和时间考虑给药方式， 药物代谢， 以及其他一些药代动力学参数例如药物 分布， 清除率等。 - 这项发明通过体内对类风湿关节炎， 红斑狼疮， 多发性硬化， 强制性脊柱炎 等疾病模型进行例证。 此处的动物包括但是不限于： 小鼠， 大鼠， 驯养动物包括 但是不限于猫， 狗， 以及其它一些动物例如但是不限于牛， 羊， 猪， 马， 灵长类 动物例如但是不限于猴子和人。 小鼠类风湿关节炎， 红斑狼疮， 多发性硬化， 强 制性脊柱炎等疾病模型的体内检测是被广泛认可和接受的体内药物活性检测的 模型， 同时也可以为其它生物例如但是不限于人提供参考。
下面的例子用以解释这项发明的具体细节， 但是不应被视作对这项发明的功 能范围的限定。
替换页 （细则第 26条)
本发明所述的 C-agarose的制备方式：
取一定量的 agarose溶解到 DMS0中， 加入 Ν,Ν'-羰基二咪唑活化羟基， 加 入含氨基的化合物比如乙二胺进行反应， 反应完全后通过透析冻干获得 C-agarose
本发明所述的 C-agarose+ASO的凝胶制备方法
将 C-agarose用生理盐水在微波炉中加热溶解， 制得琼脂糖溶液， 然后加入 AS0, 恢复溶液温度至室温， 形成凝胶。 这样就制得了荷载 AS0的凝胶。
本发明所述的 C-agarose+ASO给药体系在类风湿关节炎（RA)治疗中的应用：
1. 使用完全弗氏佐剂于 C57 BL/6小鼠右足跖部皮下注射，建立佐剂型关节炎模 型 （CFA)。
2. 在佐剂诱导两周后， 于小鼠皮下注射 C-agarose+ASO凝胶， 对关节炎进行治 疗。
3. 在治疗两周后处死小鼠， 治疗结束时观察小鼠脚踝肿胀程度， 进行关节疾病 评分， 取小鼠右足做关节组织切片， 通过病理评分来评价治疗效果。
本发明所述的 C-agarose+ASO给药体系在红斑狼疮治疗中的应用：
1. 选用 MRL/lpr自发狼疮小鼠作为疾病模型。
2. 在 MRL/lpr小鼠 6周龄时开始于皮下注射 C-agarose+ASO凝胶， 此后每四周 给药一次， 对红斑狼疮进行治疗。
3. 在 MRL/lpr小鼠 22周龄时处死小鼠，治疗结束时测量小鼠尿液中蛋白含量和 血清中尿素氮含量。
本发明所述的 C-agarose+ASO给药体系在多发性硬化治疗中的应用：
1. 联合百日咳毒素尾静脉注射， 不完全弗氏佐剂， 结核分枝杆菌， 髓磷脂寡聚 糖蛋白（MOG)皮下注射于 C57/B6小鼠， 建立小鼠多发性硬化模型（EAE)。
2. 在模型建立时同时小鼠皮下注射 C-agarose+ASO凝胶， 对多发性硬化进行治 疗。
3. 治疗 25天后处死小鼠， 治疗结束时根据小鼠行为进行评分， 评价治疗效果。。
本发明所述的 C-agarose+ASO给药体系在强直性脊椎炎 (AS)治疗中的应用：
1. 人软骨蛋白， 不完全弗氏佐剂， 完全弗氏佐剂联合皮下注射 BALB/C小鼠。
2. 在模型建立六周后开始小鼠皮下注射 C-agarose+ASO凝胶，每四周给药一次，
对强直性脊椎炎进行治疗。
3. 36周时处死小鼠， 取小鼠脊柱进行组织学染色， 通过评分来评价治疗效果。
本发明的有效成果是提供一种新的治疗自身免疫疾病的方法， 通过给予阳离 子修饰的琼脂糖水凝胶（C-agarose)和核酸药物组合物给药体系来抑制脾脏中的 异常活化的免疫反应， 从而起到治疗自身免疫疾病的效果。 同时， 本发明所使用 的核酸和阳离子修饰的琼脂糖易于获取，价格低廉，性质稳定，便于保存和运输。 四、 具体实施方式
1. 阳离子修饰的琼脂糖的合成
琼脂糖可以通过商业购买获得 （南京生兴生物有限公司）， 阳离子修饰的琼 脂糖可以通过一种合适的含有氨基的化合物比如乙二胺通过与羟基连接获得。具 体步骤如下： lOOmg琼脂糖加入 100ml无水 DMSO中， 加热搅拌使其溶解， 然 后恢复至室温配成琼脂糖的 DMSO溶液， 加入 0.5gN,N'-羰基二咪唑， 反应 1小 时活化琼脂糖的羟基， 然后加入 3ml的乙二胺反应过夜， 透析袋双蒸水透析， 经 透析反应体系形成胶状， 透析 2天， 每天换水 3次。将上述反应所得胶体微波炉 加热溶化，滴入预冷的无水乙醚中制得直径约 0.1mm的小球，将小球用 O. lmol/L 的重碳酸钠溶液透析 2天， 每天换水 3次， 再用双蒸水透析， 透析 2天， 每天换 水 3次， 冻干即得阳离子化的琼脂糖 （C-agar0Se)。
2. 本发明所述的 C-agarose+ASO的凝胶制备方法
C-agarose用生理盐水在微波炉中加热溶解， 制得不同修饰度和不同浓度的琼 脂糖溶液， 然后根据需要加入不同量的 ASO， 恢复溶液温度至室温， 形成凝胶。 这样就制得了不同浓度的荷载 ASO的水凝胶。
3. C-agarose+ASO给药体系的脾靶向特性验证
将阳离子修饰的琼脂糖凝胶（200 μΐ, 胶体含有 l mg ASO)植入小鼠体内 48 h后， 处死小鼠， 取出心、 肝、 脾、 肺、 肾、 脑、 皮肤、 肌肉等器官组织， 匀浆， 提取 ASO, Southern印记法定量各器官的 ASO含量。
表一 C-agarose+ASO给药体系的体内分布图
裸 ASO组 45±1.2 243±5.2 24±0.5 12±0.5 68±1.2 0 13±0.2 11±0.2 C-agarose+ASO
2±0.3 3±1.2 347±6 13±0.2 14±0.8 0 14±0.3 12±0.3 组
数据均以平均值±标准差的形式加以显示.
如表 1所示， C-agarose/ASO给药系统可以保证 ASO在脾脏中特异性富集， 而裸的 ASO并没有这样的脾脏靶向结果。
4. C-agarose+ASO给药体系在类风湿关节炎治疗中的治疗
按照文献报道方法建立小鼠 CFA型关节炎模型， 即取雌性 C57BL/6小鼠 40 只，体重 16-18g，将小鼠随机分为四组， CFA模型组， C-agarose+ASO组， C-agarose 组， ASO组， 使用完全弗氏佐剂于小鼠右足跖部皮下注射 20μ1， 建立佐剂型关 节炎模型。在佐剂诱导两周后，于小鼠皮下注射 C-agarose+ASO凝胶 lOO KASO 5mg/kg)， 对关节炎进行治疗， C-agarose组给等量的 C-agarose， ASO组给等量 的裸 ASO， 模型组不做处理。 在治疗两周后处死小鼠， 治疗结束时对小鼠脚踝 肿胀程度进行关节疾病评分，取小鼠右足做关节组织切片，通过病理评分来评价 治疗效果。
( 1 ) 小鼠关节疾病评分
给药两周后观察小鼠脚踝肿胀程度， 评分标准为： 各关节病变按 0~4共五级 评分法， 即 0分： 无红肿； 1 分： 小趾关节红肿； 2分： 趾关节和足趾肿胀； 3 分： 踝关节以下的足爪肿胀； 4分： 包括踝关节在内的全部足爪肿胀。 关节炎指 数 （AI) 为每只小鼠各关节病变分数的总和， 每足不超过 4分， 总分不超过 16 分。
(2) 小鼠关节病理评分
给药 4周后处死动物， 取踝关节及膝关节， 4%甲醛固定 24小时， 包埋切 片， HE染色， 显微镜观察其病理变化。 显微镜 （Olympus BX51 )下关节炎症评 分标准： 0 分： 关节具有正常的结构， 如关节间隙、 软骨、 骨、 滑膜组织等。 1 分： 关节组织中有空泡形成和轻度的关节炎症， 并有滑膜增生， 血管数量增加， 以及小的炎性细胞灶， 可见软骨的轻微破坏， 无骨的侵蚀破坏。 2分： 关节有明 显的软骨侵蚀破坏， 有中度的关节炎症. 血管翳形成. 无骨破坏， 关节结构无破
坏。 3分： 有严重的血管翳形成， 广泛的软骨侵蚀破坏， 可见骨破坏. 关节结构 遭破坏。 关节炎病理评分（AS)为每只鼠各关节病变分数的总和， 每足不超过 3 分， 总分不超过 12分。
表二 C-agarose+ASO给药体系治疗类风湿关节炎疗效
数据均以平均值±标准差的形式加以显示， 显著性差异通过 ANOVA检验加 以确定。
*代表 P<0.05
如表 2所示， C-agarose/ASO传输系统能够明显抑制大鼠关节局部水肿， 组 织肿胀， 关节变形等关节损害， 而单独使用 C-agarose或 ASO都没有治疗效果。 而通过组织学评分我们可以发现 C-agarose/ASO传输系统治疗组中仅见滑膜轻度 增生，偶见关节局部少量炎症细胞浸润； 而裸 ASO组和琼脂糖 /ASO组大量炎细 胞浸润， 滑膜增生明显， 部分关节可见软骨面缺损， 偶见骨质破坏。 由此可见 C-agarose/ASO传输系统可以通过特异性抑制脾脏中过度活化的免疫反应从而抑 制疾病的发作。
5. 本发明所述的 C-agarose+ASO给药体系在红斑狼疮治疗中的应用：
选用 MRL/lpr自发狼疮小鼠作为疾病模型， 即取 MRL/lpr小鼠 40只， 体重 16-18g， 将小鼠随机分为四组， 模型组， C-agarose+ASO组， C-agarose组， ASO 组。 在 MRL/lpr小鼠 6周龄时于小鼠皮下注射 C-agarose+ASO凝胶 ΙΟΟμΙ (ASO 5mg/kg)， 进行治疗， C-agarose组给等量的 C-agarose， ASO组给等量的裸 ASO， 模型组不做处理， 此后每四周给药一次， 对红斑狼疮进行治疗。 治疗结束时测量 小鼠尿液中蛋白含量以及血清中尿素氮含量， 通过上述指标来评价治疗效果。
( 1 ) 测定小鼠尿液中蛋白含量
使用蛋白定量试剂盒测定小鼠尿液中蛋白含量。
(2) 测定小鼠血清中尿素氮含量
眼眶取血， 使用试剂盒测定小鼠血清中尿素氮含量。
表三 C-agarose+ASO给药体系红斑狼疮疗效
数据均以平均值±标准差的形式加以显示， 显著性差异通过 ANOVA检验加 以确定。
*代表 P<0.05
如表 3所示， C-agarose/ASO传输系统可以有效降低小鼠尿液中蛋白含量和 血清中尿素氮含量，而单独使用 C-agarose或 ASO都没有抑制效果，此结果表明 C-agarose/ASO传输系统可以有效缓解狼疮引起的肾小球肾炎的发作， 由此可见 C-agarose/ASO传输系统可以通过特异性抑制脾脏中过度活化的免疫反应从而抑 制疾病的发作。
6. 本发明所述的 C-agarose+ASO给药体系在多发性硬化治疗中的应用
按照文献报道建立小鼠 EAE模型，即取 C57BL/6小鼠 40只，尾静脉注射 200ng 的白喉毒素， 同时小鼠皮下注射含有 500ng的结核分枝杆菌， ΙΟΟμΙ不完全弗氏 佐剂， 300μ§ Μ( }的乳液。 48小时后再次尾静脉注射 200ng的白喉毒素。 将小 鼠随机分为四组， 模型组， C-agarose+ASO组， C-agarose组， ASO组。 在建立模 型的同时， 皮下注射 C-agarose+ASO 凝胶 ΙΟΟμΙ (ASO 5mg/kg)， 进行治疗， C-agarose组给等量的 C-agarose， ASO组给等量的裸 ASO， 模型组不做处理。 治疗后两周观测小鼠行为， 进行打分评价治疗效果。 评分标准如下： 0分， 无任 何症状； 1分， 尾巴无力； 2分， 后肢轻瘫； 3分， 半身不遂； 4分， 前肢瘫痪； 5分， 全瘫或死亡。
表四 C-agarose+ASO给药体系在 EAE模型疗效
C-agarose+ASO
模型组 C-agarose组 ASO组 组
行为打分 4.1±0.3 1.2±0.4* 4.0±0.4 4.3±0.3
数据均以平均值±标准差的形式加以显示， 显著性差异通过 ANOVA检验加 以确定。
*代表 P<0.05
如表 4所示， EAE模型小鼠经 C-agarose/ASO治疗以后， 其行为评分结果明 显高于模型组， 而独使用 C-agarose 或 ASO 都没有治疗效果， 由此可见 C-agarose/ASO传输系统可以通过特异性抑制脾脏中过度活化的免疫反应从而抑 制疾病的发作。
7. 本发明所述的 C-agarose+ASO给药体系在强直性脊椎炎（AS )治疗中的应用 按照文献报道方法建立小鼠强直性脊椎炎， 每只小鼠皮下注射含有 100μ§人 软骨蛋白的完全弗氏佐剂， 分别在第 3周和第 5周重复一次，其中第 5周注射时 将完全弗氏佐剂换成不完全弗氏佐剂。 在模型建立后 6 周， 小鼠皮下注射 C-agarose+ASO凝胶 ΙΟΟμΙ ( ASO 5mg/kg), 对关节炎进行治疗， C-agarose组给 等量的 C-agarose， ASO组给等量的裸 ASO，模型组不做处理。 36周时处死小鼠， 取小鼠脊柱进行组织学染色， 通过评分来评价治疗效果。 评分标准如下： 1分， 附着点炎症， 炎症细胞在脊椎盘聚集； 2分， 脊椎盘 50%融合； 3分， 脊椎盘全 部融合； 4分， 软骨 /骨胶着。
表四 C-agarose+ASO给药体系在 AS模型疗效
数据均以平均值±标准差的形式加以显示， 显著性差异通过 ANOVA检验加 以确定。
*代表 P<0.05
如表 5所示， AS模型小鼠经 C-agarose/ASO治疗以后， 其行为评分结果明 显高于模型组， 而独使用 C-agarose 或 ASO 都没有治疗效果， 由此可见 C-agarose/ASO传输系统可以通过特异性抑制脾脏中过度活化的免疫反应从而抑 制疾病的发作。
Claims
1. 一种阳离子修饰的琼脂糖凝胶和核酸药物组合物， 其特征是由阳离子修饰的 中阳离子修饰的琼脂糖的结构式是 
其氨基修饰的方式是氨基为伯氨基或 仲氨基或叔氨基， 氨基化形式为单氨基化或多氨基化， 连接方式和数量不受 限制； 核酸药物为质粒或小片段的 DNA或 RNA或 DNA和 RNA的杂合。
2. 根据权利要求 1 所述阳离子修饰的琼脂糖凝胶和核酸药物组合物的制备方 法， 其特征是阳离子修饰的琼脂糖用生理盐水在微波炉中加热溶解， 制得不 同修饰度和不同浓度的琼脂糖溶液， 然后根据需要加入不同量的核酸药物， 恢复溶液温度至室温， 即制得了不同浓度的荷载核酸药物的水凝胶。
3. 根据权利要求 1所述阳离子修饰的琼脂糖凝胶和核酸药物组合物在制备治疗 类风湿关节炎或红斑狼疮或多发性硬化或强直性脊柱炎药物中的应用。
替换页 （细则第 26条)
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