CN115590974A - 功能化靶向制剂及其制备方法、应用 - Google Patents

功能化靶向制剂及其制备方法、应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了功能化靶向制剂及其制备方法、应用，该功能化靶向制剂包括两亲性聚合物和生物制剂，所述两亲性聚合物包括与白蛋白相结合的分子、亲水间隔基团以及与蛋白生物制剂反应的官能基团。本发明利用两亲性聚合物如亲脂二酰基链等修饰生物制剂，如hCTLA4重组蛋白和TNF‑α单克隆抗体，利用亲脂二酰基链DSPE能与白蛋白特异性结合的性质，“搭便车白蛋白”，利用白蛋白的体内生物分布特性，优化生物制剂的体内分布和药代动力学，增强药物对炎症关节腔和淋巴结的靶向性，从而显著提高疗效。

Description

功能化靶向制剂及其制备方法、应用
技术领域
本发明涉及功能化靶向制剂及其制备方法、应用。
背景技术
类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)作为一种慢性、全身性的自身免疫性疾病，是最常见的关节炎疾病之一，以关节疼痛、滑膜炎症、软骨破坏和骨侵蚀为主要特征。RA的全球发病人数约为7000万人，女性发病率高于男性。中国的RA患者约为700万人，发病人数有逐年增加的趋势。临床上，RA除了影响关节部位，亦可引起一些系统并发症，造成多器官、多系统的损伤，如类风湿结节、肺损害和血管炎、心膜炎等，严重影响患者的生活质量，威胁心理健康。此外，RA严重的患者会丧失劳动力，甚至导致残疾，给社会医疗体系造成沉重的经济和运行负担。
RA的发病机制较为复杂，增生的滑膜内浸润有大量的T细胞、B细胞、巨噬细胞等，这些细胞分泌多种促炎因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6等，进一步召集外周血中的免疫细胞到达炎症部位，恶化炎症程度。目前，类风湿关节炎的临床治疗策略是控制体内的不良炎症反应，抑制免疫细胞活性。甲氨蝶呤(Methotrexate，MTX)作为临床上治疗RA的一线用药，通过抑制二氢叶酸还原酶的活性，抑制免疫细胞特别是巨噬细胞的生长和繁殖。但MTX治疗效果存在较大的个体差异，长期使用还会产肝肾毒性和骨髓抑制。生物制剂，如单克隆抗体TNF-α和重组蛋白CTLA4，其抗炎效果较传统治疗方式更强，但长期全身性用药会导致患者治疗耐受和免疫力低下，产生严重的毒副反应。此外，生物制剂的临床响应率依旧欠佳。其中，阿巴西普(Abatacept，CTLA4重组蛋白)与MTX联用时，病人ACR(American College ofRheumatology)70响应率为19.8％，阿达木单抗(Adalimumab，TNF-α单抗)与MTX联用时，病人ACR70响应率为26.9％。因此，如何改变药物在体内的生物分布，增强靶部位的有效浓度从而精准提高RA的疗效，成为亟待解决的重要公共性健康难题。
纳米载体体系能将药物靶向递送至病灶处，提高疗效，降低药物的系统性毒副反应，已被运用于治疗类风湿关节炎的临床前/临床实验中。关节炎部位由于过度的炎症反应，造成血管内皮细胞间隙宽达700nm，形成了与肿瘤类似的高渗透长滞留(EPR)效应。因此，设计适当尺寸的纳米载体可实现炎症部位的快速靶向。如构建负载MTX的脂质体或壳聚糖自主装纳米粒，可用于关节炎部位的被动靶向。但由于关节周围毛细血管较少，降低了纳米粒通过血液在关节腔周围的灌注水平，难以达到有效的药物浓度。因此设计依靠配体受体相互作用的主动靶向体系可进一步提高靶向性。例如，利用中性粒细胞或巨噬细胞表面的蛋白与炎症血管内皮细胞粘附分子的相互作用，制备细胞膜包被纳米粒，可实现炎症关节腔的高效靶向。或制备HA包被纳米粒，利用HA与CD44分子的相互作用，靶向巨噬细胞，提高炎症部位的药物浓度。但纳米药物制备过程相对复杂，且材料具有免疫原性等安全问题，限制了其临床转化。
发明内容
本发明在于提供功能化靶向制剂及其制备方法、应用，本发明利用两亲性聚合物，如亲脂酰基链DSPE-PEG(DP)等修饰生物制剂，如人源CTLA4重组蛋白(hCTLA4)和TNF-α单克隆抗体(aTNF-α)，利用DSPE能与白蛋白特异性结合的性质，“搭便车白蛋白”，利用白蛋白的体内生物分布特性，优化生物制剂的体内分布和药代动力学，增强药物对炎症关节腔和淋巴结的靶向性，从而显著提高疗效。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：功能化靶向制剂，包括两亲性聚合物和蛋白生物制剂，所述两亲性聚合物包括与白蛋白相结合的分子、亲水间隔基团以及与蛋白生物制剂反应的官能基团；
所述与白蛋白结合的分子包括亲脂二酰基链、亲脂酰基链、烷基链、脂肪酸、维生素E、或含有AVGALEGPRNQDWLGVPRQL序列的多肽。
作为优选，所述亲水间隔基团的结构如下所示：
Figure BDA0003665572670000021
其中，X为含有醚键的多个碳原子的碳链。
作为优选，所述与蛋白反应的官能基团包括能够与蛋白生物制剂的氨基、巯基或二硫键反应的官能基团。
作为优选，所述与蛋白反应的官能基团如下所示：
Figure BDA0003665572670000022
其中，Y为氧，或含有醚键的多个碳原子的碳链。
作为优选，所述与蛋白反应的官能基团如下所示：
Figure BDA0003665572670000023
其中，Z为含有多个碳原子的碳链。
作为优选，所述蛋白生物制剂包括CTLA4 Ig重组蛋白、TNF-α抗体、IFN-α单抗、IL-1单抗、IL-6单抗、CD20单抗、CD22单抗、IL-12单抗、IL-23单抗、IL-17A单抗、BAFF单抗。
作为优选，所述两亲性聚合物包括DP-NHS和DP-MAL。
上述所述功能化靶向制剂的制备方法，在两亲性聚合物为DP-NHS时，其制备方法如下所述：
1)、将蛋白生物制剂和DP-NHS混合至反应管中，调节pH值至8～9，同时PBS调节蛋白终浓度为0.5～2mg/mL，进行反应；
2)、合成得到的产物进行离心处理，并去除游离的DP-NHS。
上述所述功能化靶向制剂的制备方法，在两亲性聚合物为DP-MAL时，其制备方法如下所述：
1)、用还原剂在EDTA溶液中处理含二硫键或含巯基的蛋白生物制剂，并过脱盐离心柱；
2)、将步骤1)得到的蛋白生物制剂和DP-MAL进行混合使其反应；
3)、合成得到的产物进行离心处理，去除游离的DP-MAL。
上述所述的功能化靶向制剂在治疗自身免疫性疾病上的应用。
白蛋白生物相容性好，结构空腔可负载小分子药物，已被运用于抗癌纳米制剂的制备。白蛋白对淋巴结有天然的靶向性，可富集在淋巴结。白蛋白也可通过与SPARC蛋白的结合，富集在炎症部位。在治疗类风湿关节炎的生物制剂上修饰能与白蛋白结合的亲脂酰基链，可以使生物制剂“搭白蛋白便车”，利用白蛋白的体内生物分布特性，从而优化生物制剂的体内分布和药代动力学，增强这些生物制剂对炎症病灶处和淋巴结的靶向性，提高疗效。本发明运用两亲性分子,如亲脂酰基-聚乙二醇(DSPE/DOPE/DLPE/DPPE-PEG)，通过蛋白的不同位点(氨基、二硫键、巯基等)修饰了多种治疗RA的生物制剂如hCTLA4 Ig、TNF-α单抗等，使其通过酰基链DSPE搭载体内白蛋白，靶向到淋巴结和炎症关节腔内，提高药物在靶部位的有效浓度，显著增强生物制剂治疗RA的效果。该技术为靶向治疗炎症疾病提供了新思路，也可适用于RA之外的其他自身免疫性疾病。两亲性分子修饰方法简单，可应用于多种蛋白药物，包括重组蛋白、抗体等，具有广泛的应用前景。此外，两亲性分子中的DSPE-PEG2000是CFDA备案的药用辅药，安全可靠，性价比高。因此，该技术具有快速临床转化的潜力和可行性。
附图说明
图1为生物制剂表面DP修饰率的测定和与白蛋白的结合；(A)DP修饰生物制剂的制备示意图；(B)DP的1H NMR图；(C)PEG浓度的1H NMR标准曲线；(D)DP-hCTLA4的1H NMR图；(E)NMR表征hCTLA4蛋白DP连接个数；(F)PEG ELISA表征hCTLA4蛋白DP连接个数；(G)DP与BSA微米粒的体外结合；(E-G)数据表示为平均值±标准差(n＝3)；ns，无显著性差异；***，p<0.001；****，p<0.0001；
图2为DP的炎症部位靶向性和淋巴结靶向性；(A)实验流程图；(B)注射80μg DP-Cy5炎症模型小鼠的足爪荧光图像；(C)足爪荧光强度柱状图；(D)腹股沟淋巴结的荧光图像(从上往下，四组注射剂量依次为0、30、30、80μg)；(E)淋巴结荧光强度柱状图；(F)主要器官的荧光图像(H，heart；Li，liver；S，spleen；L，lung；K，kidney；LN，lymph node)；(G)主要器官质量标准化的荧光强度柱状图；(E，G)数据表示为平均值±标准差(n＝3)；(C)数据表示为平均值±标准差(n＝5)，使用双尾t检验用于两组数据的比较；ns，无显著性差异；**，p<0.01；***，p<0.001；
图3为DP-CC-Cy5的淋巴结靶向性；(A)实验流程图；(B)腋窝和腹股沟淋巴结的荧光图像；(C)淋巴结荧光强度柱状图；数据表示为平均值±标准差(n＝5)，使用双尾t检验用于两组数据的比较；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001；
图4为DP-NHS和DP-NH2的体外溶血实验；(A)溶血图片；(B)溶血率；数据表示为平均值±标准差(n＝3)；
图5为mCTLA4和hCTLA4治疗RA的疗效比较；(A)实验流程图；(B)足爪肿胀度评分；(C)足爪厚度；(D)体重变化；数据表示为平均值±标准差(n＝4)；(B，D)使用Two-way ANOVA和Tukey检验用于多组数据的比较；(C)使用One-way ANOVA和Tukey检验用于多组数据的比较；ns，无显著性差异；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001；
图6为DP修饰的hCTLA4在RA小鼠模型中的疗效评估；(A)实验流程图；(B)足爪肿胀度评分；(C)体重变化；(D)足爪厚度；(E)旋转笼图片；(F)运动最大转速。(G)运动时间；数据表示为平均值±标准差(n＝5)；(B，C)使用Two-way ANOVA和Tukey检验用于多组数据的比较；(D，F-G)使用One-way ANOVA和Tukey检验用于多组数据的比较；ns，无显著性差异；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001；
图7为DP修饰的hCTLA4对RA的炎症抑制程度评估；(A)IVIS拍摄图片(红色圆圈表示足爪炎症部位)与小鼠右后爪照片；(B)足爪荧光强度柱状图；(C)血清IL-1β浓度；(D)血清IL-6浓度；(E)血清TNF-α浓度；(F)足爪H&E染色切片图；(G)足爪Micro-CT图；(B-E)数据表示为平均值±标准差(n＝4-5)；(B)使用双尾t检验用于两组数据的比较；(C-E)使用One-way ANOVA和Tukey检验用于多组数据的比较；ns，无显著性差异；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001；
图8为DP修饰增强hCTLA4疗效的机制探寻；(A)DPM-hCTLA4的1H NMR图谱。(D)NMR表征hCTLA4蛋白DPM连接个数；(E)PEG ELISA表征hCTLA4蛋白DPM连接个数；(D)实验流程图；(E)足爪肿胀度评分；(F)体重变化；(G)足爪厚度；(H)运动最大转速；(I)运动时间；(B，C)数据表示为平均值±标准差(n＝3)；(E-I)数据表示为平均值±标准差(n＝5)；(B，C，G-I)使用One-way ANOVA和Tukey检验用于多组数据的比较；(E，F)使用Two-way ANOVA和Tukey检验用于多组数据的比较；ns，无显著性差异；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001；
图9为DPM-hCTLA4治疗RA的炎症程度评估；(A)IVIS拍摄图片(红色圆圈表示足爪炎症部位)与小鼠右后爪照片；(B)足爪荧光强度柱状图；(C)血清IL-1β浓度；(D)血清IL-6浓度；(E)血清TNF-α浓度；(F)足爪H&E染色切片图；(G)足爪Micro-CT图(B-E)数据表示为平均值±标准差(n＝4-5)；(B)使用双尾t检验用于两组数据的比较；(C-E)使用One-wayANOVA和Tukey检验用于多组数据的比较；ns，无显著性差异；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001；
图10为DP-aTNF-α的合成和对RA小鼠治疗作用的评估；(A)DP-aTNF-α的1H NMR图谱；(D)NMR表征aTNF-α抗体DP连接个数；(E)PEG ELISA表征aTNF-α抗体DP连接个数；(D)实验流程图；(E)足爪肿胀度评分；(F)体重变化；(G)足爪厚度；(H)运动最大转速；(I)运动时间；(B，C)数据表示为平均值±标准差(n＝3)；(E-I)数据表示为平均值±标准差(n＝6)；(B，C，G-I)使用One-way ANOVA和Tukey检验用于多组数据的比较；(E，F)使用Two-wayANOVA和Tukey检验用于多组数据的比较；ns，无显著性差异；*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001；
图11为DP-aTNF-α治疗RA的炎症程度评估；(A)IVIS拍摄图片(红色圆圈表示足爪炎症部位)与小鼠右后爪照片；(B)足爪荧光强度柱状图；(C)血清IL-1β浓度；(D)血清IL-6浓度；(E)血清TNF-α浓度；数据表示为平均值±标准差(n＝6)；(B)使用双尾t检验用于两组数据的比较；(C-E)使用One-way ANOVA和Tukey检验用于多组数据的比较；ns，无显著性差异；*，p<0.05；**，p<0.01；****，p<0.0001。
具体实施方式
参照附图对本发明做进一步说明。
本实施例公开了功能化靶向制剂，包括两亲性聚合物和蛋白生物制剂，所述两亲性聚合物包括与白蛋白相结合的分子、亲水间隔基团以及与蛋白生物制剂反应的官能基团；
所述与白蛋白结合的分子包括亲脂二酰基链、亲脂酰基链、烷基链、脂肪酸、维生素E、或含有AVGALEGPRNQDWLGVPRQL序列的多肽。
上述技术方案中，亲水间隔基团的结构如下所示：
Figure BDA0003665572670000061
其中，X为含有醚键的多个碳原子的碳链，n为1～200。
进一步的，亲水间隔基团的结构如下所示：
Figure BDA0003665572670000062
上述技术方案中，与蛋白反应的官能基团包括能够与蛋白生物制剂的氨基、巯基或二硫键反应的官能基团。
在一些实施方式中，与蛋白反应的官能基团如下所示：
Figure BDA0003665572670000063
其中，Y为氧，或含有醚键的多个碳原子的碳链。
进一步的，与蛋白反应的官能基团如下所示：
Figure BDA0003665572670000064
在一些实施方式中，与蛋白反应的官能基团如下所示：
Figure BDA0003665572670000065
其中，Z为含有多个碳原子的碳链。
进一步的，与蛋白反应的官能基团如下所示：
Figure BDA0003665572670000066
上述技术方案中，所述蛋白生物制剂包括CTLA4 Ig重组蛋白、TNF-α抗体、IFN-α单抗、IL-1单抗、IL-6单抗、CD20单抗、CD22单抗、IL-12单抗、IL-23单抗、IL-17A单抗、BAFF单抗。
上述技术方案中，所述两亲性聚合物包括DP-NHS和DP-MAL。
上述功能化靶向制剂的制备方法，在两亲性聚合物为DP-NHS时，其制备方法如下所述：
1)、将蛋白生物制剂和DP-NHS混合至反应管中，调节pH值至8～9，同时PBS调节蛋白终浓度为0.5～2mg/mL，进行反应；
2)、合成得到的产物进行离心处理，并去除游离的DP-NHS，最终修饰比例为每个蛋白分子上有0～7个DP。
在一些实施方式中，优选的，蛋白生物制剂和DP-NHS的摩尔比为1：(2～18)，具体的，蛋白生物制剂：DP-NHS摩尔比为1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14、1：15、1：16、1：17或1：18。
上述功能化靶向制剂的制备方法，在两亲性聚合物为DP-MAL时，其制备方法如下所述：
1)、用还原剂在EDTA溶液中处理含二硫键或含巯基的蛋白生物制剂，并过脱盐离心柱纯化；其中，还原剂包括DTT或GSH。
2)、将步骤1)得到的蛋白生物制剂和DP-MAL进行混合使其反应；
3)、合成得到的产物进行离心处理，去除游离的DP-MAL，最终修饰比例为每个蛋白分子上有0～3个DP。
在一些实施方式中，优选的，蛋白生物制剂和DP-MAL的摩尔比为1：(2～10)，具体的，蛋白生物制剂和DP-NHS的摩尔比为1：2、1：3、1：4、1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10。
上述所述的功能化靶向制剂在治疗自身免疫性疾病上的应用，如类风湿关节炎、红斑狼疮，强制性脊柱炎，多发性硬症，炎症性肠炎等。
类风湿性关节炎是一种自身免疫性疾病和全身性的炎症疾病。目前，传统的抗风湿药物和新兴的生物制剂的疗效都还有待提高，主要制约因素包括病灶处的有效药物浓度不足和长期增加给药剂量后导致的毒副反应。该技术利用两亲性聚合物(如亲脂酰基链中的DSPE-PEG)修饰生物制剂，如hCTLA4重组蛋白(hCTLA4)和TNF-α单克隆抗体(aTNF-α)，利用DSPE能与血清白蛋白特异性结合的性质，“搭便车白蛋白”，利用白蛋白的体内生物分布特性，优化生物制剂的体内分布和药代动力学，增强药物对炎症关节腔和淋巴结的靶向性，从而显著提高疗效。在小动物RA模型中，DP修饰的生物制剂如hCTLA4和aTNF-α改善症状、降低炎症和恢复小鼠运动的能力的效果均比同剂量未修饰的生物制剂有大幅提高。该方法简单，能适用于多种自身免疫性疾病和多种蛋白生物制剂，应用范围广泛，且DSPE-PEG2000是国家批准的药用辅料、安全性高，因此该技术具有快速临床转化的潜力。
具体实施例
1.实验方法
1.1试剂
二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-N-羟基琥珀酰亚胺(DSPE-PEG2000-NHS，DP-NHS)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-马来酰亚胺(DSPE-PEG2000-Maleimide，DP-MAL)和二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-氨基(DSPE-PEG2000-NH2，DP-NH2)购自上海芃硕生物科技有限公司，DSPE-PEG2000-Cy5(DP-Cy5)、DSPE-PEG2000-Cy7(DP-Cy7)购自西安瑞喜生物科技有限公司，Cy5-NHS购自美国APExBIO公司，DTSSP购自上海艾博抗贸易有限公司。
鼠源CTLA4重组蛋白(mCTLA4)购自上海爱必信生物科技有限公司，人源CTLA4重组蛋白(hCTLA4 Ig)(hum/hum)和TNF-α单抗(Clone：XT3.11)购自美国Bio X Cell公司，细胞色素C(Cytochrome C，CC)购自上海源叶生物科技有限公司，牛血清白蛋白(Bovine serumalbumin，BSA)购自上海雅酶生物医药科技有限公司。牛II型胶原蛋白(Bovine type IIcollagen，BCII)、完全弗式佐剂(Complete Freund’s Adjuvant，CFA)、不完全弗式佐剂(Incomplete Freund adjuvant，IFA)购自美国Chondrex公司。PEGylated Protein ELISA试剂盒购自英国Abcam公司，IL-1β、TNF-α和IL-6ELISA试剂盒购自美国Thermo Scientific科技公司。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)购自上海碧云天生物科技有限公司，5-氨基-2,3-二氢-1,4-酞嗪二酮(鲁米诺，Luminol)购自上海易恩化学技术有限公司，N,N-二甲基二吖啶硝酸盐(光泽精，Lucigenin)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
缩写词表
Figure BDA0003665572670000081
Figure BDA0003665572670000091
1.2实验动物
6-8周的雄鼠DBA/1和雌性BALB/C购于常州卡文斯实验动物有限公司，动物饲养于苏州大学SPF动物房，饲养条件为湿度20±2℃，温度50±5％，每日光照12h。小鼠在正式实验开始前适应性饲养1-3天。所有实验的开展均在苏州大学动物伦理委员会的批准和监督下进行，所有操作流程均符合动物伦理规范。
1.3DP-hCTLA4、DPM-hCTLA4和DP-aTNF-α的合成及表征
按照hCTLA4：DP-NHS摩尔比为1：0、1：4、1：8、1：16的比例加入至低蛋白吸附管(分别命名为hCTLA4组、DP4-hCTLA4组、DP8-hCTLA4组、DP16-hCTLA4组)，1M的NaHCO3调节pH值至8.5，PBS调节蛋白终浓度为1mg/mL，室温下四维旋转仪(BE-1100，中国Kylin-Bell公司)反应4h后，4℃保存。DP4-aTNF-α和DP8-aTNF-α的反应步骤同DP-hCTLA4。用10mM DTT在2mMEDTA溶液中于室温下处理hCTLA4 2min，过脱盐离心柱(MWCO 7k)后，按照摩尔比例1：4和1：8加入DP-MAL，反应18h后分别得到DPM4-hCTLA4和DPM8-hCTLA4。
合成得到的产物转移至50kDa超滤管，5500rpm离心10min，纯水超滤4次去除游离的DP。一部分产物定量蛋白浓度(NanoDrop2000/2000C，美国Thermo Scientific)后，按照PEG ELISA试剂盒的说明书操作，确定蛋白上DP的连接个数。另一部反应产物使用冷冻干燥机(HUAX-LGJ，上海华玺科学仪器有限公司)冻干并称重，重水溶解，平均分为3份，每份加2.5μL DMSO作为内参，核磁共振氢谱(1H NMR)(UNTTYINOVA-600，美国Agilent公司)检测。
1.4DP-Cytochrome C-Cy5的合成
100μL 10mg/mL的Cy5-NHS(溶于DMSO)加入至1mL 10mg/mL的Cytochrome C(CC)中，1M的NaHCO3调节pH值至8.5，PBS调节蛋白终浓度为1mg/mL，室温下四维旋转仪中反应24h。反应结束后，PBS缓冲液(pH 8.0，10mM)透析(3500Da)24h，去离子水中透析(3500Da)24h，冻干得产物CC-Cy5。
按照CC-Cy5：DP-NHS摩尔比为1：0、1：5、1：20的比例加入至低蛋白吸附管(分别记做CC-Cy5组、DP5-CC-Cy5组、DP20-CC-Cy5组)，1M的NaHCO3调节pH值至8.5，PBS调节蛋白终浓度为1mg/mL，四维旋转仪反应12h得产物DP-CC-Cy5。
1.5DP与BSA微米粒的体外结合
按照BSA：DTSSP摩尔比为1：100合成BSA微米粒。50μL 10mg/mL的DTSSP加入500μL1mg/mL的BSA中，磁力搅拌反应1h，然后加入500μL BSA反应1h，最后加入50μL DTSSP反应1h，所得BSA微米粒于4℃保存。
将适量DP-CC-Cy5分别加到1mL的BSA微米粒中(记做DP-CC-Cy5+BSA组)和1mL PBS中(记做DP-CC-Cy5+PBS组)，混匀后使用酶标仪(M1000 Pro，瑞士Tecan公司)测定上清荧光强度，然后置于37℃恒温振荡反应器中孵育4h，15000rpm离心10min后，再次检测上清荧光强度。
1.6DP修饰的小分子对炎症部位和淋巴结的靶向性考察
BALB/C小鼠左后爪或右后爪皮下注射20μL 2.5μg/μL的LPS，造模急性炎症模型。48h后，小鼠尾根部皮下注射不同剂量的DP-Cy5(左后爪造模：40、80μg；右后爪造模：20、40、80μg)，另取未造模的小鼠尾根部皮下注射DP-Cy5 40μg。24h后使用小动物活体成像仪器(IVIS Lumina II，美国Perkin Elmer公司)测定炎症部位的荧光强度(Ex＝620nm，Em＝680nm)。
同样方法造模LPS炎症小鼠模型。48h后，小鼠尾根部皮下注射不同剂量的DP-Cy7(左爪造模：30μg；右爪造模：30、80μg)，另取健康小鼠作为空白组。24h后将小鼠安乐死并解剖，取心、肝、脾、肺、肾、淋巴(腹股沟淋巴结和腋下淋巴结)，进行IVIS成像(Ex＝710nm，Em＝780nm)并称重。
1.7DP修饰蛋白在炎症小鼠中的淋巴结靶向性
BALB/C小鼠左右爪同时注射LPS造模炎症模型。48h后将小鼠分为1)空白组、2)CC-Cy5组、3)DP5-CC-Cy5组、4)DP20-CC-Cy5组，然后每只小鼠尾根部皮下注射60μg CC-Cy5，24h后安乐死小鼠，解剖取淋巴结进行IVIS成像(Ex＝620nm，Em＝680nm)。
1.8mCTLA4和hCTLA4的疗效比较
构建胶原诱导的关节炎(Collagen induced arthritis，CIA)小鼠模型。将BCII和CFA按照1：1体积混合后制备成乳剂，DBA/1小鼠尾根部皮内注射100μL进行初次免疫；21天后，同样方法注射由BCII和IFA制备成的乳剂，进行二次免疫诱导。第26天将RA模型小鼠分成1)RA组、2)mCTLA4组、3)hCTLA4组，每3天皮下给药一次进行治疗，共给药4次(第26、29、32、35天)。给药剂量为mCTLA4组40μg/只、hCTLA4组60μg/只。治疗期间观察小鼠的生存状况，并记录各组小鼠体重和足爪肿胀度，第40天测量足爪厚度。
1.9DP修饰hCTLA4在RA模型中的疗效评估
按照2.8方法造模CIA模型。第26天将小鼠分为1)Healthy组、2)RA组、3)hCTLA4组、4)DP4-hCTLA4组、5)DP8-hCTLA4组、6)DP16-hCTLA4组、7)aTNF-α组、8)MTX组。每3天皮下给药一次进行治疗，共给药5次(第26、29、32、35、38天)，给药剂量为hCTLA4组60μg/只、aTNF-α组50μg/只、MTX组50μg/只。治疗期间记录小鼠体重和足爪肿胀度，第40天测量足爪厚度。
1.10DP修饰hCTLA4增强RA疗效的机制探索
按照2.8方法造模CIA模型。第26天将小鼠分为1)RA组、2)Healthy组、3)hCTLA4组、4)DP4-hCTLA4组、5)PEG-hCTLA4、6)DP4-NH2+hCTLA4组、7)DPM8-hCTLA4组。每3天皮下给药一次进行治疗，共给药5次(第26、29、32、35、38天)，给药剂量为60μg/只。治疗期间记录小鼠体重和足爪肿胀度，第40天测量足爪厚度。
1.11DP修饰aTNF-α在RA模型中的疗效评估
按照2.8方法造模CIA模型。第26天将小鼠分为1)RA组、2)Healthy组、3)aTNF-α组、4)DP4-aTNF-α组。每3天皮下给药一次进行治疗，共给药5次(第26、29、32、35、38天)，给药剂量为50μg/只。治疗期间记录各组小鼠的体重和足爪肿胀度，第40天测量小鼠足爪厚度。
1.12旋转笼实验
将小鼠放置于旋转笼(公司定制)，逐渐升高转速至70rpm，当小鼠无法抓住横杆掉落时，此时的转速记为该小鼠所能承受的最大转速；固定转速为25rpm，记录每只小鼠坚持的时间，最长时间为90s。
1.13足爪炎症程度的定量
Luminol和Lucigenin溶解在含有10％DMSO的PBS中，依次配置成2mg/mL和0.5mg/mL，超声溶解。使用前，将两种溶液按照1：1体积比混合后，每只小鼠腹腔注射100μL，5min后使用IVIS检测小鼠足爪的生物荧光，曝光时间为1min。
1.14血清中促炎细胞因子的检测
小动物麻醉机(R500，深圳市瑞沃德生物科技有限公司)麻醉小鼠后，眼眶后静脉丛取血，室温静置2h，1200g 4℃离心20min取上清。根据ELISA试剂盒操作步骤，测定血清中促炎细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-6的浓度。
1.15踝关节H&E切片染色
小鼠安乐死后，解剖取右后足爪，多聚甲醛固定保存。小鼠足爪剔除皮肉，骨组织用5％硝酸钾脱钙处理至组织软化，石蜡包埋切片，使用苏木素和伊红染色，脱水封片，显微镜观察滑膜和踝关节的病变程度。
1.16足爪Micro-CT成像
小鼠右后足爪琼脂固定，使用Micro-CT仪器(SkyScan 1176，美国Bruker公司)进行扫描，具体设置参数为：X射线发生器50kv、500μA，过滤片0.5mm AI，扫描辨析率9μm，共扫描180°且每步旋转0.7°。
1.17DP的溶血实验
兔子耳源静脉取血4mL，置于提前加入肝素钠的试管中，轻轻混匀。加入两倍体积PBS，10000g 4℃离心5min，弃上清，PBS重复洗5次，下层红细胞用PBS稀释至40mL。EP管中加入200μL红细胞溶液，再加入0.8mL的DP-NHS和DP-NH2的PBS溶液，使其终浓度依次为1000、500、250、100、50、25μg/mL。加PBS作为阴性组，加水作为阳性组。样品于37℃静置4h，10000g4℃离心3min，观察溶血情况。取上清液，以655nm作为参比波长，测定577nm处吸光度。
1.18统计学分析
所有数据的统计分析采用GraphPad Prism软件。除非另外说明，两组数据的比较使用双尾t检验，多组数据的比较使用One-way ANOVA和Tukey检验。RA评分和体重曲线用Two-way ANOVA和Tukey检验。ns代表无显著性差异，*代表p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001，****代表p<0.0001。
2.实验结果
2.1运用能与白蛋白结合的亲脂酰基链修饰生物制剂
我们运用不同官能团功能化的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG，DP)，通过不同位点(氨基、巯基等)修饰了多种生物制剂(蛋白、抗体等)(图1A)。例如，将人源重组融合蛋白hCTLA4与不同摩尔比例的DP-NHS(hCTLA4：DP-NHS＝1：0，1：4，1：8，1：16)混合，过夜反应后超滤除去未反应游离的DP-NHS，产物分别记为hCTLA4、DP4-hCTLA4、DP8-hCTLA4、DP16-hCTLA4。为了定量DP在hCTLA4上的修饰率，采用1H NMR和PEG ELISA两种方法分别进行表征。
我们首先验证了运用1H NMR定量PEG浓度的可行性。在不同浓度的DP-NH2溶液中，加入固定浓度的DMSO作为内参，进行1H NMR检测。在所得图谱中，PEG峰化学位移在3.5ppm左右，DMSO峰在2.5ppm左右(图1B)。将PEG的峰面积(IPEG)做为单位峰面积1，积分DMSO峰面积(IDMSO)。IPEG/IDMSO比值与加入的DP呈浓度依赖性，且线性回归的R2值为0.9997，说明可用1H NMR定量溶液中DP的含量(图1C)。此外，DP溶液中蛋白质(BSA)的存在不会影响PEG峰的化学位移和IPEG/IDMSO比值(图1B)。在DP-hCTLA4的核磁图谱中，出现明显的PEG特征质子峰(δ3.5)(图1D)，证明DP-NHS成功链接到hCTLA4。根据加入的hCTLA4量和IPEG/IDMSO比值，代入公式1依次计算出PEG即DP的摩尔浓度，再根据加入的蛋白的摩尔浓度，计算出hCTLA4、DP4-hCTLA4、DP8-hCTLA4、DP16-hCTLA4中每个hCTLA4蛋白修饰的DP个数为0、1.4、2.3、4.7个(图1E)。
Figure BDA0003665572670000131
公式1：IPEG代表PEG的峰面积；CDMSO代表DMSO的浓度；6代表DMSO中氢的个数；IDMSO代表DMSO的峰面积；DPPEG为PEG的聚合度，其中PEG2000为452；4代表每个PEG重复单位中氢的个数。
我们也通过PEG ELISA试剂盒定量了DP修饰率，结果表明hCTLA4、DP4-hCTLA4、DP8-hCTLA4、DP16-hCTLA4中每个hCTLA4蛋白连接DP的个数分别为0.1、1.6、2.7、4.6个(图1F)。两种表征方法得到的结果无统计学差异，证明所得DP修饰率的可靠性(表1)。此外，随着DP反应摩尔量的增大，每个hCTLA4分子上连接的DP个数也随之增多。
表1：PEG ELISA和1H NMR量化分析每个hCTLA4分子通过DP-NHS修饰的DP数量
Figure BDA0003665572670000132
Figure BDA0003665572670000141
为了考察修饰在蛋白上的DP与BSA的结合能力，我们用DP修饰了带有荧光分子Cy5的模型蛋白细胞色素C(Cytochrome C，CC)(DP-CC-Cy5)，并合成了BSA微米粒。DP-CC-Cy5+PBS组在离心前后溶液荧光强度无明显变化，而DP-CC-Cy5+BSA微米粒组离心后，管底形成蓝色沉淀，上清颜色变浅，荧光强度降低了87.9％(图1G)。该结果说明DP-CC-Cy5通过DP成功连接到BSA微米粒上，离心时BSA微米粒沉淀聚集到离心管底部，导致上清中DP-CC-Cy5减少，荧光显著降低。
2.2DP修饰的小分子具有炎症部位和淋巴结靶向性
在小鼠左后爪或右后爪注射脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)构建急性炎症模型，第2天尾根部皮下注射链接有荧光分子的DP，第3天使用小动物活体成像仪IVIS监测小鼠的足爪部荧光强度(图2A)。小鼠炎症部位的荧光强度随着DP-Cy5注射剂量的增加而增强，且炎症部位的荧光强度显著高于无炎症足爪(图2B、C)。在左后爪造模时，注射80μg荧光DP，左后爪的平均荧光强度是右后爪的1.5倍；在右后爪造模时，注射80μg荧光DP，右后爪的平均荧光强度是左后爪的1.6倍(图2B、C)。注射40μg荧光DP时，DP靶向炎症部位的趋势类似(图2B、C)。当未造模炎症时，注射DP分子后，左后爪和右后爪的荧光强度无统计学差异(图2C)。以上结果证明DP具有炎症靶向性。
亲脂酰基链DSPE在体内能够结合血清BSA，通过“搭载白蛋白便车”靶向淋巴结[28]。因此在LPS炎症小鼠模型中皮下注射DP-Cy7，进一步考察DP荧光分子在小鼠腹股沟淋巴结中的蓄积情况。随着DP-Cy7注射剂量的增加，腹股沟淋巴结中DP-Cy7的蓄积增多，荧光强度增强(图2D、E)。在右后爪造模时，左右淋巴结的荧光强度没有因为炎症造模部位的不同(Right-80组和Right-30组)而出现显著差异(图2D、E)。在左后爪造模时，左右淋巴结的荧光强度也没有统计学差异(Left-30组)(图2D、E)。注射80μg DP荧光分子组，强度约是30μg组的3倍，而未注射DP荧光分子的淋巴结只有背景荧光(图2D、E)。以上结果证明DP具有淋巴结靶向性，且对炎症部位的引流和非引流淋巴结的靶向性无统计学差异。
我们还考察了DP荧光分子在炎症小鼠心、肝、脾、肺、肾器官的生物分布情况。各器官的荧光强度随着DP-Cy7剂量的增加而增强，主要分布在肝脏和肾脏代谢器官。但荧光强度质量标准化后，淋巴结荧光强度最强，其次是肝脏和肾脏；注射剂量为80μg时，淋巴中的质量标准化荧光强度可达肝脏的2.2倍(图2F、G)。
2.3DP修饰的蛋白具有全身淋巴结靶向性
构建LPS炎症小鼠模型，尾根部皮下注射DP修饰的模型蛋白CC(DP-CC-Cy5)，IVIS检测淋巴结荧光强度(图3A)。相同剂量的CC-Cy5由于表面修饰的DP数量不同，导致在淋巴结的富集显著不同。DP-NHS反应摩尔比越高，即DP修饰率越高，淋巴结的靶向性也越强。DP20-CC-Cy5组和DP5-CC-Cy5组腹股沟淋巴荧光强度分别是未修饰DP的CC-Cy5组的5.2倍和2.2倍(图3B、C)。在相同DP-NHS摩尔比下，腋窝淋巴结和腹股沟淋巴结的荧光强度无统计学差异(图3B、C)。以上结果证明DP修饰可增强模型蛋白CC的全身淋巴结靶向性。
2.4DP的生物安全性考察
通过溶血实验考察DP-NHS和DP-NH2的安全性。PBS组为阴性对照，红细胞保持稳定，无溶血现象；H2O组为阳性对照，红细胞由于破裂导致溶液由澄清变红，发生明显溶血现象(图4A)。随着DP-NHS和DP-NH2浓度的提高，溶血率有所增加，但远未达到10％的毒性指标；1000μg/mL远高于样品制备时DP的浓度，DP-NHS在此浓度下的溶血率为2.4±0.2％，DP-NH2在此浓度下的溶血率为1.4±0.2％(图4B)。以上结果证明DP-NHS和DP-NH2具有良好的生物安全性。
2.5mCTLA4和hCTLA4治疗RA小鼠的疗效比较
由于交叉反应，人源hCTLA4(临床批准用药)可一定程度代替鼠源mCTLA4在小鼠中进行实验，且人源hCTLA4的数据更有利于临床转化[31,32]。因此，我们将hCTLA4和mCTLA4对RA小鼠的治疗效果进行了头对头比较。DBA/1小鼠尾根部皮内注射两针牛II型胶原蛋白诱导产生关节炎(CIA模型)，然后尾根部皮下注射mCTLA4和hCTLA4进行治疗(图5A)。由于hCTLA4在小鼠模型中的疗效比mCTLA4低，因此采用40μg mCTLA4与60μg hCTLA4进行比较。
与RA组相比，mCTLA4和hCTLA4治疗组足爪肿胀度评分和足爪厚度均有降低，mCTLA4组和hCTLA4组之间无统计学差异(图5B、C)。第40天时，mCTLA4组和hCTLA4组足爪厚度分别是RA组的0.7和0.8倍(图5C)。mCTLA4组和hCTLA4组体重下降幅度均较RA组平缓，但两组之间的体重变化无统计学差异(图5D)。以上结果证明hCTLA4可以代替mCTLA4进行RA小鼠的治疗。
2.6DP修饰的hCTLA4在RA动物模型中的疗效评估
RA小鼠的治疗实验流程如图6A所示。DBA/1小鼠尾根部分别皮下注射hCTLA4、DP4-hCTLA4、DP8-hCTLA4、DP16-hCTLA4，并选用临床上用于治疗RA的TNF-α单克隆抗体(aTNF-α)和甲氨蝶呤(MTX)做为对照。相对于未修饰的hCTLA4组，DP4-hCTLA4组的足爪肿胀度评分显著降低，评分均在5分以下；DP16-hCTLA4组相较于DP4-hCTLA4组评分显著上升，与未修饰的hCTLA4组相似，说明增大DP的修饰率，治疗效果反而有所下降(图6B)。相对于aTNF-α(50μg)和MTX(50μg)两组，hCTLA4(60μg)组的足爪肿胀度评分无统计学差异，而DP4-hCTLA4组评分指数显著下降，明显优于同剂量(或更大剂量)的各临床药物(图6B)。DP4-hCTLA4组体重下降相较于hCTLA4组更为平缓，且与健康组小鼠无统计学差异，证明DP4-hCTLA4更能抑制RA发展对小鼠健康的危害(图6C)。
第40天时，健康组小鼠足爪厚度约为6.7mm，RA组约为14.5mm。hCTLA4组为11.0mm，抑制了约44.9％的足爪增厚；DP4-hCTLA4组的足爪厚度显著降低，仅为8.6mm，抑制了约75.6％的增厚，疗效是hCTLA4组的1.7倍(图6D)。与DP8-hCTLA4组、DP16-hCTLA4组相比，DP4-hCTLA4组足爪厚度明显降低，说明过度增大DP的修饰率，治疗效果反而有所下降(图6D)。为了更好地评估小鼠足爪的运动能力，将小鼠放在旋转笼(图6E)中进行运动实验。当小鼠足爪肿胀时，对横杆抓力下降，因此能承受的最大转速和运动时间均会降低。当转速逐渐升高时，健康组小鼠能承受的最大转速是69.0rpm，RA组是16.8rpm，未修饰的hCTLA4是36.0rpm，DP4-hCTLA4组能适应的最大转速显著提高至53.8rpm，恢复小鼠运动能力是hCTLA4组的2.0倍(图6F)。当固定转速为25rpm时，DP4-hCTLA4组小鼠运动时长是hCTLA4组的1.5倍，是aTNF-α组、MTX组的1.4和4.8倍(图6G)。
以上结果证明，DP修饰可显著提高hCTLA4对RA的疗效，DP4-hCTLA4的治疗效果最强且优于目前同剂量(或更大剂量)的临床主流治疗药物，可以最大程度降低足爪肿胀度，恢复小鼠体重和运动能力。但过度DP修饰，会导致疗效降低。
Luminol和Lucigenin可被炎症部位的免疫细胞代谢产生荧光，因此可用其评估炎症程度[33]。DP4-hCTLA4治疗组小鼠足爪荧光强度最弱；DP4-hCTLA4组抑制足爪炎症的能力分别是同剂量hCTLA4组和DP8-hCTLA4组的1.5倍和1.4倍，是aTNF-α组和MTX组的1.7倍和8.7倍(图7A、B)。通过检测血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度进一步判断体内的炎症程度。与RA模型组相比，各治疗组可显著抑制血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的浓度，其中DP4-hCTLA4组效果最好，抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的效果约是同剂量hCTLA4组的1.5至2倍(图C-E)。
在RA的发展过程中，持续的炎症导致滑膜内衬细胞层增厚，免疫细胞浸润，新生不规则血管结构形成血管翳，对骨骼和组织完整性造成不可逆的损害[34-36]。由足爪H&E染色切片可以看出，RA组滑膜内衬细胞层增厚明显，大量免疫细胞浸润并出现血管翳，且出现骨侵蚀(图7F)。hCTLA4组滑膜周围免疫细胞浸润，内衬细胞增生；DP4-hCTLA4组滑膜内衬细胞形态正常，无血管翳(图7F)。DP8-hCTLA4、DP16-hCTLA4、aTNF-α和MTX组均出现滑膜增生和炎症细胞的浸润(图7F)。由Micro-CT图可以看出RA组小鼠踝关节和指关节骨侵蚀严重；DP4-hCTLA4组与健康组小鼠相比无明显变化，关节正常；hCTLA4、DP8-hCTLA4、DP16-hCTLA4、aTNF-α和MTX组均出现不同程度、不同部位的骨侵蚀情况(图7G)。
综上所述，一定程度的DP修饰(DP4-hCTLA4)可以显著增强同剂量hCTLA4治疗RA的效果，更好的降低小鼠足爪和血清炎症水平，减少关节的病变。而过度的DP-NHS修饰(如DP16-hCTLA4)会造成治疗效果下降，可能是由于hCTLA4活性位点的氨基被反应，导致生物活性降低。
2.7DP修饰增强hCTLA4疗效的机制探寻
为了防止hCTLA4中氨基与DP-NHS反应后导致活性下降，因此利用hCTLA4融合蛋白IgG铰链区的巯基与DP-Maleimide(DP-MAL，DPM)进行反应。DPM-hCTLA4的核磁图谱显示出PEG的特征质子峰(δ3.55)，证明DPM成功修饰hCTLA4(图8A)。根据IPEG/IDMSO比值计算得hCTLA4、DPM4-hCTLA4、DPM8-hCTLA4中每个hCTLA4分子上连接DP的个数分别为0、0.8、1.3个(图8A、B)。PEG ELISA结果表明hCTLA4、DPM4-hCTLA4、DPM8-hCTLA4中连接的DP个数分别为0.2、0.9、1.2个(图8C)。两种方法得出的DP修饰个数无统计学差异，证明DP修饰率的可靠性(表2)。由于DPM8-hCTLA4(连接1.3个)与DP4-hCTLA4(连接1.5个)具有相似的DP修饰率，因此RA的疗效实验使用DPM8-hCTLA4。
表2：PEG ELISA和1H NMR分析每个hCTAL4分子上通过DPM修饰的DP数量
Figure BDA0003665572670000171
进一步评价对RA小鼠的治疗效果，实验流程如图8D所示。相对于hCTLA4组，DP4-hCTLA4组和DPM8-hCTLA4组均可显著降低足爪肿胀度至5分左右，说明DP修饰的位点与提高疗效无显著关联(图8E)。此外，DP4-hCTLA4组和DPM8-hCTLA4组的RA评分显著优于PEG-hCTLA4组，证明DP修饰中DSPE部分起到了提高疗效的关键作用(图8E)。DP4-NH2+hCTLA4组(游离DP未链接至hCTLA4)与hCTLA4组的RA评分无差异，显示DP需链接至hCTLA4才能发挥功效(图8E)。与hCTLA4组相比，DPM8-hCTLA4组和DP4-hCTLA4组均可显著恢复小鼠体重、降低足爪厚度，增大小鼠的运动时间和最大运动转速，而PEG-hCTLA4组和DP4-NH2+hCTLA4组与hCTLA4组相比无显著差异(图8F-I)。
与hCTLA4组相比，DP4-hCTLA4组和DPM8-hCTLA4组均可显著降低足爪荧光强度，降低血清炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度，但这两组之间并无统计学差异(图9A-E)。PEG-hCTLA4组和DP4-NH2+hCTLA4组与hCTLA4组相比，足爪荧光强度、炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α均无统计学差异(图9A-E)。H&E染色和Micro-CT结果均显示出DP4-hCTLA4组和DPM8-hCTLA4组有良好的治疗效果，可显著缓解滑膜增生、炎症浸润和骨侵蚀的程度(图9F、G)。
综上所述，DPM8-hCTLA4组治疗效果与DP4-hCTLA4组相当，能显著降低小鼠足爪和体内炎症水平，恢复小鼠运动能力，说明DP修饰的位点与提高疗效无显著关联。而PEG-hCTLA4组和DP4-NH2+hCTLA4组显示出与hCTLA4组相似的治疗效果，证明hCTLA4疗效的提高依赖于DP链接至hCTLA4，并且与DSPE密切相关，与PEG部分关联不大。
2.8DP修饰对生物制剂TNF-α单抗治疗效果的影响
为了验证DP修饰对其他生物制剂治疗效果的影响，验证DP修饰的应用范围，我们用DP修饰另一个临床药物aTNF-α，治疗RA。DP-aTNF-α的核磁图显示出PEG的特征质子峰(δ3.55)，证明DP成功修饰aTNF-α。根据IPEG/IDMSO比值计算得aTNF-α、DP4-aTNF-α、DP8-aTNF-α连接DP的个数分别为0、1.5、1.9个(图10A、B)。PEG ELISA结果表明aTNF-α、DP4-aTNF-α、DP8-aTNF-α连接的DP个数分别为0.2、1.2、1.9个(图10C)。两种方法得出DP修饰个数基本一致(表3)。由于DP4-aTNF-α(连接1.4个)与DP4-hCTLA4(连接1.5个)具有相似的DP连接个数，因此RA的疗效实验使用DP4-aTNF-α。
表3：PEG ELISA和1H NMR量化分析每个aTNF-α分子上的DP修饰数
Figure BDA0003665572670000181
DP4-aTNF-α治疗RA小鼠的实验流程如图10D所示。aTNF-α足爪肿胀度评分在7分左右，DP4-aTNF-α组的评分均在5分以下，显著降低足爪肿胀度；DP4-aTNF-α的体重降低程度比aTNF-α组显著减小(图10E、F)。第40天时，aTNF-α组足爪厚度为10.5mm，抑制了44.3％的增厚；而DP4-aTNF-α组的足爪厚度显著降低，仅为8.0mm，抑制了79.8％的增厚，疗效是aTNF-α组的1.8倍(图10G)。DP4-aTNF-α组小鼠的运动能力也得到有效恢复，恢复小鼠最大转速和运动时间的能力是均是aTNF-α组的1.7倍(图10H、I)。
足爪炎症程度荧光成像表明，DP4-aTNF-α组显著降低足爪荧光强度，抑制足爪炎症的能力是aTNF-α组的2.4倍(图11A、B)。血清炎症因子测定结果显示，DP4-aTNF-α组抑制血清IL-1β、IL-6、TNF-α的能力约是aTNF-α组的1.5倍(图11C-E)。
综上所述，DP修饰也显著提高了生物制剂aTNF-α对RA小鼠的疗效果，证明DP修饰可应用于其它蛋白药物，包括重组蛋白、抗体等多种生物制剂，具有广泛的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.功能化靶向制剂，其特征是，包括两亲性聚合物和蛋白生物制剂，所述两亲性聚合物包括与白蛋白相结合的分子、亲水间隔基团以及与蛋白生物制剂反应的官能基团；
所述与白蛋白结合的分子包括亲脂二酰基链、亲脂酰基链、烷基链、脂肪酸、维生素E、或含有AVGALEGPRNQDWLGVPRQL序列的多肽。
2.权利要求1所述的功能化靶向制剂，其特征是，所述亲水间隔基团的结构如下所示：
Figure FDA0003665572660000011
其中，X为含有醚键的多个碳原子的碳链。
3.权利要求2所述的功能化靶向制剂，其特征是，所述与蛋白反应的官能基团包括能够与蛋白生物制剂的氨基、巯基或二硫键反应的官能基团。
4.权利要求3所述的功能化靶向制剂，其特征是，所述与蛋白反应的官能基团如下所示：
Figure FDA0003665572660000012
其中，Y为氧，或含有醚键的多个碳原子的碳链。
5.权利要求3所述的功能化靶向制剂，其特征是，所述与蛋白反应的官能基团如下所示：
Figure FDA0003665572660000013
其中，Z为含有多个碳原子的碳链。
6.权利要求5所述的功能化靶向制剂，其特征是，所述蛋白生物制剂包括CTLA4 Ig重组蛋白、TNF-α抗体、IFN-α单抗、IL-1单抗、IL-6单抗、CD20单抗、CD22单抗、IL-12单抗、IL-23单抗、IL-17A单抗、BAFF单抗。
7.权利要求6所述的功能化靶向制剂的制备方法，其特征是，所述两亲性聚合物包括DP-NHS和DP-MAL。
8.权利要求7所述的功能化靶向制剂的制备方法，其特征是，在两亲性聚合物为DP-NHS时，其制备方法如下所述：
1)、将蛋白生物制剂和DP-NHS混合至反应管中，调节pH值至8～9，同时PBS调节蛋白终浓度为0.5～2mg/mL，进行反应；
2)、合成得到的产物进行离心处理，并去除游离的DP-NHS。
9.权利要求6所述的功能化靶向制剂的制备方法，其特征是，在两亲性聚合物为DP-MAL时，其制备方法如下所述：
1)、用还原剂在EDTA溶液中处理含二硫键或含巯基的蛋白生物制剂，脱盐离心柱；
2)、将步骤1)得到的蛋白生物制剂和DP-MAL进行混合使其反应；
3)、合成得到的产物离心处理，去除游离的DP-MAL。
10.权利要求1～9任一项所述的功能化靶向制剂在治疗自身免疫性疾病上的应用；其中，自身免疫性疾病包括类风湿关节炎、红斑狼疮，强制性脊柱炎，多发性硬症，炎症性肠炎。
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