CN1390141A - 含核酸的复合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含核酸复合物,该复合物含有核酸和生物可降解聚合物,尤其是带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物。该复合物具有向需治疗的位点持续释放目的核酸,尤其是DNA的优秀性质。由于该复合物可以被吞噬细胞例如巨噬细胞摄取,并特异地递送至靶位点,因此,可以以靶位点特异性方式展现核酸的功能,由此可以实现更特异的基因治疗。该复合物无不良作用,例如采用病毒载体如腺病毒、或脂质体所可能导致的重组或毒性的发生。因此,对于基因治疗领域,该复合物是尤其优选的。而且,该复合物可以增强导入细胞中的核酸的生物学作用,从而使得可以采用较低剂量的核酸进行基因治疗。

Description

含核酸的复合物

发明背景

发明领域

本发明涉及含核酸的复合物，其特征在于含有核酸和带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物，本发明还涉及控制复合物的核酸释放速率的方法。

本发明还涉及包含有含核酸和生物可降解聚合物的含核酸复合物的吞噬细胞(phagocytic cells)(之后称作吞噬细胞(phagocytes))。本发明还涉及含有该含核酸复合物作为活性成分并且可以用于吞噬细胞介导的基因治疗的药物。

相关领域描述

近年来，随着人类疾病的分子遗传因素的明朗化，越来越多的重点被放在基因治疗研究上。基因治疗的目的是在靶位点或细胞表达DNA。对于该治疗，有利的是，直接将DNA带到靶位点或细胞处，使之有效地转移至靶位点或细胞中，并在特异位点或在细胞中作功能性表达。已经报道了多种用于有效转移和表达外源DNA的方法(Fumimaro Takaku编，“Idenshichiryo no Saizensen：Kisogijutu kara Rinsho Oyo made(基因治疗前沿，从基础技术到临床应用)”，Experimental Medicine，第12卷，第15期，1994；Robert E.Sobol和Kevin J.Scanlon，基因治疗的互联网书籍(The Internet Book of Gene Therapy)，Appleton&LangeStamford，Connecticut，1995)。可以将它们粗略地分为(1)用于DNA转移的物理方法(显微注射、电穿孔)、(2)用于DNA转移的化学方法(磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖转染)、和(3)生物学方法(病毒载体，如逆转录病毒载体和腺病毒载体)。一般地，现有化学方法，如磷酸钙转染和DEAE-葡聚糖转染，的基因转移效率低。物理方法，如显微注射和电穿孔，可能要求特殊的设备，并且它们对于常规临床使用是不实际的。由于病毒载体的高基因转移效率，人们期望发现它的临床用途。然而，由于它们的病毒本质，这些载体有产生不良反应如免疫反应的危险。

为了克服以上缺点，已开发了新的技术。脂质体方法将基因掺入脂质体中以保护基因免遭失活或降解。脂质体不含病毒DNA，由此排除了发生潜在的危险重组事件的可能性。然而，它们对多种细胞类型具有的强毒性限制了脂质体作为DNA载体的用途。甚至现在新的基因递送物质和手段仍在不断的开发中。

在血管损伤的基因治疗领域，还开发了所谓的水凝胶法，该方法包括将水凝胶附着在待导入血管的导管的表面、将质粒基因放置在该水凝胶中、并直接将该水凝胶涂在血管内(Marchall，E.，Science，269，1050-1055，1995)。根据该方法，质粒通过简单扩散缓慢地从水凝胶中释出。采用该方法，一般而言，缓释期短，且难于控制该时期的释放速率和时间长度。基因治疗要求治疗性基因的量或其供给期可以随待治疗的疾病或疾病的状态得到调节。因此，需要一种方法能够根据治疗的要求控制治疗性基因的缓释期。

当在临床背景如基因治疗中使用外源基因时，以稳定水平持续向靶位点提供该基因是该基因进行功能性表达所必需的。

而且，对采用反义寡核苷酸进行的基因治疗的研究近年来已吸引了人们的注意力。在受控的时间期内位点特异性地体内稳定提供这些核酸的手段将增加该方法的有效性。

发明概述

本发明的一个目的是提供安全的、可以高效地将核酸导入细胞、并能够向靶位点持续提供核酸的含核酸复合物，以及提供方法控制该含核酸复合物的核酸释放速率。

本发明的另一目的是提供安全、易于操作且擅长体内位点特异性功能表达的含核酸复合物，以及采用该含核酸复合物可以特异地在靶位点展示核酸的功能的方法。

本文所用短语“核酸的功能”是指核酸所编码的基因的表达，但它也可以指直接发挥作用的核酸。直接发挥作用的核酸的例子包括反义核苷酸(Robert E.Sobol和Kevin J.Scanlon，基因治疗互联网书籍，Appleton&Lange Stamford，Connecticut，1995)、核酶(美国专利6,127,173)、能够发挥诱铒作用的双链DNA分子(Sobol，同上)、和DNA/RNA杂合体(Bartlett等，(2000)Nat.Biotech.18：615)。

根据这些目的，本发明的发明人进行了深入的研究并获得了下列发现。首先，通过将带负电荷的核酸和带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物复合在一起形成稳定的复合物，可以抑制核酸的体内降解，并且可以在期望的靶位点或细胞处以恒定的速率释放该核酸。其二，通过核酸和生物可降解聚合物的复合获得的复合物，如本文所述含核酸的复合物，可以容易地被免疫系统中扮演着重要角色的吞噬细胞摄取(首先，复合物靶向吞噬细胞)。摄取了复合物的吞噬细胞迁移至靶位点(其次，吞噬细胞靶向靶位点)，由此吞噬细胞通过使所加入核酸的作用靶向靶位点而增加该技术的有效性。基于这些发现，本发明人完成了本发明。

一方面，本发明涉及含有核酸和带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物的含核酸复合物，其中该核酸可以通过该生物可降解聚合物的降解得到释放。

另一方面，本发明涉及含有核酸和在聚合物中加入了带正电荷基团的带正电荷水不溶性生物可降解聚合物的含核酸复合物。

在本发明的含核酸复合物中，该带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物含有至少一个选自下组的成员：胶原、明胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、褐藻酸、淀粉、和所有这些物质的衍生物。优选地，该衍生物是氨基衍生物。

在一个优选实施方案中，该带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物是具有引入的带正电荷基团的交联明胶。在另一优选实施方案中，该核酸是至少一个选自下组的成员：质粒DNA、寡核苷酸、和双链核酸化合物。

在一个优选实施方案中，该核酸编码多肽，其包含至少一个选自下组的成员：血管内皮生长因子基因、肝细胞生长因子基因、和成纤维细胞生长因子基因、以及其它基因如激酶、磷酸酶、转录因子、细胞因子、蛋白酶、细胞凋亡诱导因子和细胞凋亡阻滞因子。更优选地，该DNA包含序列表中SEQ ID NO.1所示编码FGF4/HST1的碱基序列。

另一方面，本发明涉及包含本发明的含核酸复合物作为活性成分的药物组合物。在一个优选实施方案中，该药物组合物被用于基因治疗，尤其是通过局部施用基因进行的基因治疗。

再一方面，本发明涉及控制核酸释放速率的方法，其特征在于将核酸掺入带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物中、并通过该生物可降解聚合物的降解释放该核酸。

另一方面，本发明涉及控制核酸释放速率的方法，其特征在于将核酸掺入具有引入的带正电荷基团的带正电荷水不溶性生物可降解聚合物中，并通过该生物可降解聚合物的降解释放该核酸。

另一方面，本发明涉及增强核酸的功能性表达的方法，其特征在于将核酸掺入带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物中，并通过该生物可降解聚合物的降解释放该核酸，以展示核酸的功能。本发明还涉及增强核酸的功能性表达的方法，其特征在于将核酸掺入具有引入的带正电荷基团的带正电荷水不溶性生物可降解聚合物中，并通过该生物可降解聚合物的降解释放该核酸，以展示核酸的功能。

在一个优选实施方案中，带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物具有至少一个选自下组的成员：胶原、明胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、褐藻酸、淀粉、和所有这些物质的衍生物(例如氨基衍生物)。优选地，带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物是具有引入的带正电荷基团的交联明胶。核酸是至少一个选自下组的成员：编码基因的DNA、寡核苷酸、和双链核酸化合物。核酸可以编码血管内皮生长因子基因、肝细胞生长因子基因、和成纤维细胞生长因子基因、以及其它基因如激酶、磷酸酶、转录因子、细胞因子、蛋白酶、细胞凋亡诱导因子和细胞凋亡阻滞因子。在一个优选实施方案中，DNA分子包含序列表中SEQ ID NO.1所示碱基序列。

再一方面，本发明涉及包含有含核酸和生物可降解聚合物的含核酸复合物的吞噬细胞。在一个优选实施方案中，该生物可降解聚合物具有至少一个选自下组的成员：胶原、明胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、褐藻酸、淀粉、和所有这些物质的衍生物。

再一方面，本发明涉及在靶位点展现核酸功能的方法，该方法至少包括步骤：(i)允许吞噬细胞摄取含有核酸和生物可降解聚合物的含核酸复合物，(ii)使摄取的核酸能够行使其功能或诱导核酸在吞噬细胞中表达，并将该吞噬细胞递送至靶位点。优选地，该生物可降解聚合物是至少一个选自下组的成员：胶原、明胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、褐藻酸、淀粉、和所有这些物质的衍生物。

再一方面，本发明涉及含有含核酸复合物作为活性成分的基因治疗用药物组合物，该含核酸复合物中含有核酸和生物可降解聚合物，其中该基因治疗至少包括步骤：(i)允许吞噬细胞摄取含有核酸和生物可降解聚合物的含核酸复合物，(ii)使摄取的核酸能够行使其功能或诱导核酸在吞噬细胞中表达，和(iii)将该吞噬细胞递送至靶位点。在一个优选实施方案中，该生物可降解聚合物具有至少一个选自下组的成员：胶原、明胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、褐藻酸、淀粉、和所有这些物质的衍生物。

附图简述

图1是显示明胶水凝胶的三维晶格与质粒DNA的离子键合的示意图。

图2显示了随着时间的推移lacZ质粒掺入明胶水凝胶的过程。

图3显示了在给ddY小鼠的右股肌肉施用后，明胶水凝胶结合的质粒DNA的体内存活情况研究结果。该存活通过放射性碘的残存放射活性得到证实。

图4显示了显微照片，这些照片证明，在施用颗粒性胺化明胶水凝胶结合的lacZ质粒后两周lacZ基因在兔下肢缺血模型中表达。图4A：颗粒性胺化明胶水凝胶结合的lacZ质粒(lacZ质粒：500μg)。图4B：未与颗粒性胺化明胶水凝胶结合的裸lacZ质粒(500μg)。图4C：颗粒性胺化明胶水凝胶结合的lacZ质粒(lacZ质粒：50μg)。

图5显示显微照片，这些照片证明，借助腺病毒载体施用lacZ基因后lacZ基因在兔下肢缺血模型中表达。图5A：施用lacZ基因后3天。图5B：施用lacZ基因后两周。

图6A-D显示放射显影图，这些图证明，在施用FGF4/HST1质粒后兔下肢缺血模型中有血管生成。图6A：颗粒性胺化明胶水凝胶结合的FGF4/HST1质粒(500μg)。图6B：颗粒性胺化明胶水凝胶结合的FGF4/HST1质粒(5μg)。图6C：颗粒性胺化明胶水凝胶结合的lacZ质粒(500μg)。图6D：未与颗粒性胺化明胶水凝胶结合的裸FGF4/HST1质粒(500μg)。

图7是显微照片，该照片显示了lacZ在兔动脉管壁的巨噬细胞中的表达。并指出具有表达的lacZ的巨噬细胞(箭头)。

图8是通过放射微血管造影术获得的出现在显示器上的中间色调图象照片，显示了基线(顶图)和血管舒张(腺苷处理)期间(底图)的血管密度。给出了施用裸VEGF₁₆₅质粒后的结果。

图9是通过放射微血管造影术获得的出现在显示器上的中间色调图象照片，显示了基线(顶图)和血管舒张(腺苷处理)期间的血管密度。给出了施用明胶水凝胶结合的VEGF₁₆₅质粒后的结果。

图10显示了显微照片，这些照片证明巨噬细胞摄取了交联明胶颗粒-GFP质粒。图10A显示了相差图像，而图10B显示了图10A相同区域的荧光图像。在巨噬细胞中观察到荧光，这说明交联的明胶颗粒-GFP质粒已进入巨噬细胞中。

图11显示了向人树突细胞(DC)的基因转移效率的FACS分析结果。图11A：与颗粒性胺化明胶水凝胶结合的GFP质粒一起培养的DC的结果。图11B：与裸GFP质粒一起培养的DC的结果。

优选实施方案详述

可以掺入本发明复合物中的核酸并不受限制。然而，优选实施方案是导入可带来治疗效果的核酸，并且可以根据复合物的使用目的按意愿选择它们。在本发明中，除了各种编码基因的DNA外，还可以优选使用针对某些基因的反义寡核苷酸、和双链核酸化合物如诱饵核酸(decoynucleic aid)(Sobol，同上)。还可以递送核酸结构以纠正点突变(Bartlett等(2000)Nat.Biotech.18：615)。更具体地，表1列出了可以掺入本发明的含核酸复合物中用于心血管领域的基因治疗和癌症的基因治疗的核酸、以及它们的治疗目的。然而，本发明并不局限于它们，且正如本领域技术人员已知的，可以将本发明应用于其它临床领域。

                                    表1

	目的	核酸类型
			心血管领域的基因治疗	增加血管生成和可用于阻塞性动脉硬化和缺血性心脏病	·血管内皮生长因子(VEGF)基因·肝细胞生长因子(HGF)基因·成纤维细胞生长因子(FGF)基因
再生血管内皮细胞和可用于防止动脉成形术后的再狭窄	·VEGF基因·HGF基因·内皮细胞一氧化氮合成酶基因·PGI2合成基因
		调节血管平滑肌细胞的细胞周期和可用于预防动脉成形术或分流手术后的再狭窄		·c-myb的反义寡核苷酸·PCNA基因的反义寡核苷酸·cdc-2激酶的反义寡核苷酸
可用于分流手术后的再狭窄的预防等	·具有与转录因子E2F结合序列相同的序列的双链核酸化合物·E2F诱饵
		可应用于基因治疗缺血-再灌注造成的损伤		·NFκB诱饵
癌症的基因治疗	自杀基因的转移				·单纯疱疹病毒胸苷激酶基因
		肿瘤抑制基因的转移	·p53基因
	保护骨髓干细胞免受抗癌药物的作用			·广谱抗药(MDR)基因
		免疫治疗	·白介素12基因·B7基因
	反义RNA			·ras基因

可掺入本发明含核酸复合物中的核酸的优选实例是血管内皮细胞生长因子基因、肝细胞生长因子基因、和成纤维细胞生长因子基因。其它的此类基因是本领域技术人员已知的，包括激酶、磷酸酶、转录因子、细胞因子、蛋白酶、细胞凋亡诱导因子和细胞凋亡阻滞因子。可以引用具有序列表中SEQ ID NO.1所示碱基序列的FGF4/HST1基因作为成纤维细胞生长因子基因的例子。

FGF4/HST1基因经分离后被确定是一种具有转化NIH3T3细胞活性的基因(hst-1；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：3997-4001，1986)。之后，发现该基因与成纤维细胞生长因子(FGF)有同源性，并成为FGF家族的第4个成员(FGF4)。目前，已知FGF家族的20名成员，FGF 1-20。

FGF4/HST1蛋白是具有信号肽的分泌蛋白，已经报道它具有以下活性：促进成纤维细胞和血管内皮细胞生长；血管生成；促进巨核细胞生长和分化；促进巨核细胞分泌细胞因子；促进巨核细胞和内皮细胞间的粘着；体外诱导外周血小板计数增加；在化疗或放疗引起的血小板减少症模型中，通过预先施用减缓血小板的降低并缩短恢复期；和通过预先施用增加致死性放射剂量处理后的存活率。

当将FGF4/HST1基因应用于基因治疗时，人们尝试过使用其中整合了该基因的腺病毒载体治疗动脉硬化引起的慢性稳定性心绞痛(间接疗法，Collateral Therapeutics)。

在本发明中，核酸以可导入细胞并能够在细胞中表现出功能的形式使用。例如，对于DNA，可以使用其中定位有该DNA的质粒，以便该DNA在其导入的细胞中得以转录，然后可以产生该DNA编码的多肽，并通过该多肽展示出期望的功能。优选地，将启动子区、起始密码子、编码具有目的功能的蛋白质的DNA、终止密码子、和终止区连续地安排在质粒中。这些技术和DNA元件是本领域技术人员熟知的。

如果需要的话，可以在一个质粒中掺入两个或更多个核酸。而且，如果需要的话，可以将两个或更多个核酸独立地与水不溶性生物可降解聚合物相连接(如下述)，以形成一种含核酸复合物。

方便地，可以借助适合的限制性酶位点，通过将期望的核酸插入本领域可获得的质粒中，制备目的载体。还可以通过合成手段或半合成手段基于待导入的核酸的碱基序列，制备载体。这些技术均是本领域技术人员熟知的。例如“分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Sambrook，Fritsch和Maniatis编，1989中所述的技术，该书被完整地(包括所有的数字、表或图)并入本文作为参考。

本发明中，待导入核酸的“细胞”优选是需要该核酸在其中作功能性表达的细胞，以及具有摄取细胞外物质(即吞噬作用)特性的细胞。在优选实施方案中，这些细胞是吞噬细胞如巨噬细胞，描述如下。可以例如根据所使用的核酸(即其功能)，以不同方式选择核酸应当在其中进行功能性表达的细胞。实例是心肌细胞、骨骼肌细胞、和血管内皮细胞。吞噬细胞如单核细胞、树突细胞、巨噬细胞、组织细胞、枯否细胞、破骨细胞、A型滑膜细胞(Synovial A cells)、小胶质细胞、郎格汉斯细胞、上皮样细胞、和多核巨细胞；白细胞；成纤维细胞；和某些上皮细胞(胃肠道上皮细胞、肾小管上皮细胞)可以通过吞噬作用有效地将含核酸复合物摄入它们的内部(首先，使该含核酸复合物靶向吞噬细胞)，并且借助于它们的体内迁移性质它们有利于将该核酸递送至目的位点(其次，使吞噬细胞靶向靶位点和细胞)。由此，所有的器官或组织，如心脏、肌肉、血管、血液、骨髓、淋巴组织、结缔组织、肝、骨、滑膜、神经、皮肤、炎症组织、或癌组织，均可以接受基因治疗。

本发明中，“生物可降解聚合物”是指由于体内存在的生理活性物质，如酶，的作用而第一次被水解的聚合物。生物可降解聚合物的实例是多糖如壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、褐藻酸、淀粉、和果胶，蛋白质如明胶、胶原、纤维蛋白和白蛋白，及这些物质的衍生物。优选的例子是明胶或其衍生物。为了本说明书的目的，“生物可降解聚合物”不包括核酸。在本发明中，如上所述，“生物可降解聚合物的降解”是指聚合物在体内存在的生理活性物质如酶的作用下、或在体内的非酶性作用下水解。

此处，“衍生物”是指适于形成含核酸复合物的生物可降解聚合物的修饰形式，包括例如在聚合物上引入了氨基基团的氨基衍生物，见下述。

本发明中，如果需要更强地控制含核酸复合物的核酸释放，则与核酸形成复合物的生物可降解聚合物优选是水不溶性的。此处，水不溶性是指由于分子间的化学或物理交联而不在水中溶解的性质。根据日本药典的规定，水不溶性相当于“少量溶解”至“事实上不溶”。

生物可降解聚合物并不限于某一组分子，只要它可以与核酸形成复合物即可。如果希望获得持续释放，则聚合物应优选带有正电荷，以便形成稳定的含核酸复合物。可以改变正电荷的携带程度，以便允许聚离子(polyion)与正常带负电荷的核酸形成复合物。可以通过测量将水溶性状态存在的成分在水中混合后获得的混合物的混浊度增加，验证聚离子复合物的形成。

核酸的负电荷和生物可降解聚合物的正电荷之间的强结合(离子键合)导致形成稳定的含核酸复合物。如果在本发明中使用中性或仅轻微带正电荷的生物可降解聚合物，则可以通过预先在其中引入氨基基团或诸如此类的基团，使该聚合物阳离子化。甚至在已经带有正电荷的生物可降解聚合物中，也可以引入正电荷基团如氨基基团。这样，就增加了整个分子的正电荷，并增强了与核酸的结合，以致可以形成更为稳定的含核酸复合物。赋予阳离子的过程可以通过本领域技术人员已知的方法来实施。

赋予阳离子的方法并不受限制，只要该方法可以引入在生理条件下带阳离子的官能团即可。一个优选方法是在温和条件下，在已是生物可降解聚合物一部分的羟基基团或羧基基团上引入氨基基团或铵基。该方法的一个实例包括采用多种缩合剂中的任意种使聚合物与烷基二胺如乙二胺或N，N-二甲基-1，3-二氨基丙烷、乙酰肼三甲基铵、精胺、亚精胺、或二乙基氨基氯反应，其中所述缩合剂的例子是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、氰尿酰氯、N，N’-碳化二咪唑(carbodiimidazole)、溴化氰、双环氧化合物、甲苯磺酰氯、二酐化合物如二乙基三胺-N，N，N′，N″，N″-戊酸二酐、或三苯甲基氯。在一个优选实施方案中，由于乙二胺的方便性和通用性，该方法涉及与乙二胺的反应。

本发明中，“引入带正电荷基团”的步骤是指引入使生物可降解聚合物在生理条件下为阳离子的官能团。这就意味着在生物可降解聚合物上引入上述官能团。

而且，在本发明中，为了能够控制核酸的释放，还优选通过交联处理或其它类似的有效处理使该生物可降解聚合物不溶于水。一般地，许多生物可降解聚合物都是水溶性的，因此所获的含核酸复合物也是水溶性的。当体内施用该复合物时，核酸会快速地自复合物中释出，由此难于获得稳定而持久的局部核酸供应。本发明采用水不溶性生物可降解聚合物，这就使得可以根据体内该生物可降解聚合物的降解性以可控制的方式释放核酸。即，可以根据生物可降解聚合物的降解控制核酸持续释放的速率。而且，该持续释放形式使得可以增加含核酸复合物的局部基因表达效率。

在优选实施方案中，用于本发明的水不溶性生物可降解聚合物是通过交联形成的不溶于水的明胶水凝胶。在更优选的实施方案中，明胶水凝胶具有85％、88％、91％、94％、95％、97％、99％、或更多的水含量。

生物可降解聚合物的交联可以通过本领域技术人员已知的方法进行。例子有使用交联剂的方法、热处理、和使用紫外辐射的方法。

可以根据采用的生物可降解聚合物的类型选择优选的交联剂。通常，使用以下交联剂：甲醛、戊二醛、水溶性碳二亚胺类[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺-N-甲基-对-甲苯磺酸盐等]、表氯醇、和双环氧化合物[双环氧二乙二醇、1，4-双-(2，3-环氧丙氧基)-丁烷等]。在交联反应中，生物可降解聚合物的浓度按重量计为1-30％、优选按重量计为5-10％，而交联剂的浓度按重量计为10^-3-10％、优选按重量计为10^-2-1％。反应在0-40℃，优选25-30℃，进行1-48个小时，优选12-24个小时。

还可以通过热处理实现生物可降解聚合物的交联。热交联的方法将以明胶为例子在以下实例中进行描述。

将明胶水溶液(优选地，按重量计约10％)浇注在塑料平皿中，并空气干燥以获得明胶膜。将该膜在110-160℃(优选120-150℃)的温度、减压(优选约10mmHg的减压)下，放置1-48小时，优选6-24小时，籍此使膜发生热交联。

当采用紫外线使明胶膜交联时，通常在0-40℃、优选室温下将明胶膜放置在杀菌灯下。

所用明胶可以是具有不同物理性质，如溶解性、稳定性和溶胀性质，的明胶的混合物。也可以使用物理性质不同的交联明胶的混合物。

待掺入本发明含核酸复合物中的带正电荷水不溶性生物可降解聚合物可以以如下方式掺入该复合物中：可以将具有上述特性的生物可降解聚合物单独地掺入其中，或将两种或更多种类型的生物可降解聚合物以混合物的形式掺入其中(将它们简单地混合以便掺入相同的含核酸复合物中)。或者，可以通过化学方法预先将两种或更多种类型的生物可降解聚合物键合在一起，然后掺入复合物中。本发明包括所有这些实施方案。

为了通过化学方法预先将两种或更多种类型的生物可降解聚合物键合在一起，然后将该键合产物掺入复合物中，可以分别赋予各生物可降解聚合物水不溶性，然后通过化学方法将它们键合在一起；或者可以通过化学方式将这些聚合物键合在一起后再赋予其水不溶性。在优选实施方案中，首先通过化学方法将各生物可降解聚合物键合在一起，然后进行处理以使它们具有水不溶性。

本发明中，含有核酸和带正电水不溶性生物可降解聚合物的复合物可以容易地通过混合前述核酸和前述带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物来制备。核酸和带正电荷水不溶性生物可降解聚合物的量之间的比例可以根据所用生物可降解聚合物的正电荷携带程度而不同。通常在混合过程中，相对于生物可降解聚合物，使用饱和浓度的核酸。

在一个优选实施方案中，为了制备在交联明胶凝胶中含有核酸的含核酸复合物，直接将交联剂加入按重量计5％-30％的明胶水溶液中，以制备交联明胶凝胶。在一个更优选的实施方案中，将未交联的明胶凝胶滴加在交联剂水溶液中以制备交联的明胶凝胶。然后直接将所获交联明胶凝胶滴加至含有核酸的溶液中。在一个优选实施方案中，干燥该交联的明胶凝胶，然后使之在含有核酸的溶液中再次溶胀。

带强负电荷的核酸与带正电荷的生物可降解聚合物通过离子键结合，形成复合物。在本发明的该复合物中，掺入复合物中的核酸的特征在于其通过生物可降解聚合物在酶作用下、或其它生理过程作用下的降解从复合物中释出。图1显示了复合物的示意图，其中以DNA作为核酸的例子。

在核酸形成复合物的过程中，如果需要的话，为了例如所获含核酸复合物的稳定性、核酸的持续释放、和所释放核酸的功能性表达，可以加入其它成分。这些其它成分的例子是氨基糖或它们的大分子化合物或脱乙酰壳多糖寡聚物、碱性氨基酸或它们的寡聚物或大分子化合物、和碱性聚合物如聚烯丙胺、聚二乙基氨基乙基丙烯酰胺、和聚乙烯亚胺。而且，还可以加入能够和以器官特异性方式表达的受体结合的配体蛋白质、或特异指向所选靶标的抗体，籍此使得可能将含核酸复合物递送至期望位点，最终实现核酸的定位释放。这些配体和/或抗体是本领域技术人员熟知的。

本发明还涉及控制核酸释放速率的方法，其特征在于将核酸掺入带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物中，并允许核酸在生理环境下释放。

对于可以在根据本发明控制核酸释放速率的方法中使用的核酸和带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物而言，此处指出的所有那些生物可降解聚合物和核酸，以及本领域技术人员已知的其它生物可降解聚合物和核酸均可以使用。

掺入复合物中的核酸由于水不溶性生物可降解聚合物在体内的降解而自复合物中缓慢释出(换言之，降解速率决定释放速率)。优选仅通过生物可降解聚合物的介导来实现该释放，因为这样将能够使释放速率的控制更具有可重复性。释放速率与复合物中核酸和生物可降解聚合物之间的键合强度、以及复合物的稳定性、和所用生物可降解聚合物的生物可降解程度(这又可能取决于生物可降解聚合物的水含量)紧密相关。释放速率还可以受复合物中正电荷和负电荷间的平衡所控制。通常，所用生物可降解聚合物的正电荷越高，所获含核酸复合物中的核酸就保留得越久。因此，就通过水不溶性生物可降解聚合物的降解产生的核酸受控释放而言，具有更高正电荷的生物可降解聚合物是更佳的。如果生物可降解聚合物的正电荷不足以使释放受到控制时，可以再向聚合物中引入氨基基团或类似取代基以使聚合物阳离子化，籍此增加它的正电荷。

本发明还提供包含有含核酸复合物的吞噬细胞，其中该含核酸复合物含有核酸和生物可降解聚合物。其基础是以下新发现：该复合物可以容易地被免疫系统中起着重要作用的吞噬细胞所摄取(首先，使复合物靶向吞噬细胞)，而且这些吞噬细胞可以基于其正常的体内迁移被运至靶位点(其次，使吞噬细胞靶向靶位点)，因此使得可以容易地在靶位点稳定地展示核酸的功能。用于本发明的吞噬细胞不受限制，只要它们是具有吞噬作用并可迁移至损伤处(如炎症部位、癌组织等)的细胞即可。例如，巨噬细胞和单核细胞是该细胞的优选实例。而且，树突细胞、组织细胞、枯否细胞、破骨细胞、A型滑膜细胞、小胶质细胞、郎格汉斯细胞、上皮样细胞、和多核巨细胞也是优选的，尽管它们仅有最低限度的迁移。含有核酸和生物可降解聚合物的含核酸复合物可以容易地通过吞噬作用被摄取至吞噬细胞中。吞噬细胞对含核酸复合物的摄取可以根据使用目的在原位发生、或体外进行。

对于掺入所用含核酸复合物中的核酸和生物可降解聚合物，本文列出的所有那些生物可降解聚合物均可以使用。生物可降解聚合物的电荷性质和溶解性均不受限制。从易被吞噬细胞摄取、摄取的效率和摄取的速度来看，该生物可降解聚合物优选具有水不溶性。鉴于与核酸牢固键合对于可靠结合核酸是理想的，该生物可降解聚合物优选带正电荷。术语“水不溶性”和“带正电荷”旨在具有前述的相同意义。

包含有含核酸和生物可降解聚合物的含核酸复合物的吞噬细胞可以用于实验目的，也可以优选用作药物。即，可以体外制备包含有含核酸复合物的吞噬细胞，然后体内施用所获吞噬细胞，籍此可以通过利用吞噬细胞在损伤或其它患病部位的特征性聚集，使来自核酸的目的遗传信息在靶位点表达。

本发明还提供以靶位点特异性方式展示核酸功能的方法，该方法至少包括步骤：(i)允许吞噬细胞摄取含有核酸和生物可降解聚合物的含核酸复合物，(ii)诱导该核酸在吞噬细胞中表达，和(iii)将吞噬细胞递送至靶位点。以下将对每一步进行描述。(i)允许吞噬细胞摄取含有核酸和生物可降解聚合物的含核酸复合物的步骤：

如前述，该步骤通过利用吞噬细胞固有的吞噬作用使含核酸复合物进入吞噬细胞中来实现。可以通过预先体外混合含核酸复合物和吞噬细胞、或通过体内施用含核酸复合物并利用体内吞噬细胞对它的摄取，来实现该步骤。在体外含核酸复合物与吞噬细胞的混合比例并不受限制，可以是吞噬细胞能够摄取含核酸复合物的任何比例。通常，该步骤通过加入过量的含核酸复合物来进行。可以根据含核酸复合物和本发明药物(见下述)的施用方式，体内施用含核酸复合物、或在体内条件下施用体外制备的吞噬细胞。为了本发明的目的，这些体外制备的具有含核酸复合物的吞噬细胞也可以被认为是药物。当向活生物体施用包含有含核酸复合物的本发明吞噬细胞时，必需在施用的同时维持吞噬细胞生活力和活性。可以采用适用于骨髓移植或免疫治疗的方法，这些方法是本领域技术人员已知的。优选地，施用方法的典型实例如下：(a)向损伤或附近组织给药；(b)向体腔(心包腔、胸腔、腹腔、脑脊髓腔)给药；(c)向控制损伤部位的血管或淋巴组织给药；(d)向损伤部位外的血管或皮肤组织、脂肪组织或骨骼肌组织给药。由于吞噬细胞固有的迁移能力，可以预期所有这些给药方法将在损伤部位而非给药部位产生效果。(ii)诱导核酸在吞噬细胞中表达的步骤：

采用本领域技术人员已知的技术实施该步骤。即，采用核酸在导入吞噬细胞后能够在这些细胞中展示其功能的方式，掺入该核酸以实现该步骤。在优选实施方案中，掺入的核酸的功能是核酸所编码基因的表达。在其它优选实施方案中，核酸的功能可以通过包含在复合物中的核酸的直接作用来体现。在本发明中，核酸以含核酸复合物的形式被吞噬细胞摄取，在该含核酸复合物中该核酸与生物可降解聚合物结合形成复合物。因此，受到含核酸复合物的生物可降解性控制的核酸持续释放增加了核酸导入细胞的效率，并促进了核酸在细胞中的表达或其它功能。(iii)将吞噬细胞递送至靶位点的步骤：

该步骤可以容易地通过吞噬细胞的迁移安全地实现。优选地，根据期望的靶位点选择吞噬细胞。例如，如果期望靶向癌组织或炎症组织，则优选使用巨噬细胞、上皮样细胞和多核巨细胞。优选使用单核细胞以靶向血液；使用树突细胞以靶向骨髓和淋巴组织；使用组织细胞以靶向结缔组织；使用枯否细胞以靶向肝；使用破骨细胞以靶向骨；使用A型滑膜细胞以靶向滑膜；使用小胶质细胞以靶向神经系统；使用郎格汉斯细胞以靶向皮肤。而且，在各种器官的表面施用吞噬细胞能够使核酸(吞噬细胞中携载的)向靶器官的深处转运。

本发明还提供基因治疗用新药物，该药物利用了以吞噬细胞的吞噬作用为基础的含核酸复合物的摄取，并利用了以吞噬细胞固有迁移能力为基础的复合物向靶位点的递送，见以上详述。该药物具有含核酸和生物可降解聚合物的含核酸复合物作为活性成分。复合物中成分的预期范围在上文和下文中作了描述。

本发明的含核酸复合物可以通过多种方法体内施用。为了在期望的特定位点获得持续的局部核酸释放，尤其优选肠胃外给药。如果需要的话，可以将本发明的含核酸复合物与可药用载体(稳定剂、防腐剂、增溶剂、pH调节剂、增粘剂等)混合来制备含有该复合物作为活性成分的药物。这些载体是本领域技术人员已知的。还可以加入用于调节持续释放效果的各种添加剂，这些添加剂是本领域技术人员已知的。

具有本发明含核酸复合物作为活性成分的药物还可以包括两种或更多种类型的含核酸复合物，其中这些复合物含有不同类型的核酸。具有多种治疗目的的该药物在变得多样化的基因治疗领域中是尤其有用的。

根据预期目的，本发明含核酸复合物可以通过制药方式制成各种形式。这些形式的实例是颗粒、圆柱或棱柱、片、盘、糊等形式的固体和半固体制剂，或注射剂如混悬剂和乳剂。优选在期望的特定位点有优秀的缓释效果的固体制剂，并优选局部给药。例如，以片状形式制备的本发明含核酸复合物适合于固定在局部血管的内壁上。更具体地，目前已有此类方法：使片状含核酸复合物缠绕在用于动脉成形术的支架上，借助导管将此支架插入适当的血管分支中，并在局部血管中给囊充气以便将含核酸复合物固定在血管内壁上。该方法使得基因可以转移至复合物固定处的血管壁中，并实现对固定位置周围区域的基因治疗。优选的实施方案包括癌症的基因治疗如抗血管生成治疗，或循环系统疾病的基因治疗如血管生成治疗。

可以通过肌内途径向脂肪组织中，通过皮下、皮内、静脉内途径向淋巴管中、淋巴结中，通过动脉内途径向体腔(心包腔、胸腔、腹腔、脑脊髓腔)或向骨髓中，施用含核酸复合物的注射剂。优选肌内给药。也可以直接向患病组织给药。

对于固体和半固体制剂，引用以下方法作为例子：将制剂直接包埋在期望核酸释放的位置；通过注射器注射浆状制剂；注射胃肠外悬浮液形式的颗粒制剂；以经皮跨腔方式插入导管，并通过该导管将附着在支架上的复合物本身保留在血管中；以及通过导管注射细小的复合物颗粒(颗粒大小：约几个微米至约15微米)，并将其定位在期望核酸释放的位置。这些方法和其它方法均是本领技术人员已知的。

在通过制药方式制备本发明复合物的过程中，还期望对其实施灭菌步骤如过滤灭菌。

根据本发明，给予动物、尤其是人的剂量随各种因素而变，这些因素有例如目的核酸、所用生物可降解聚合物、给药方式、待治疗的具体位点。然而，剂量应是足以产生治疗反应的量。这些剂量是本领域技术人员已知的。

本发明含核酸复合物优选用于基因治疗。该复合物适用的疾病根据掺入复合物中的核酸的类型而不同。疾病的例子有心血管领域的疾病、如外周动脉疾病、冠状动脉疾病、和动脉扩展术后引起损伤的疾病如再狭窄。其它例子有癌症(恶性黑素瘤、颅内肿瘤、转移性恶性肿瘤、乳腺癌等)、感染(HIV等)、和单基因疾病(囊性纤维化、慢性肉芽肿性疾病、α₁-抗胰蛋白酶缺乏、戈谢病等)。

在优选实施方案中，当使用成纤维细胞生长因子基因，尤其是包含序列表SEQ ID NO.1所示碱基序列的DNA，作为掺入复合物的核酸时，可以将其应用于前述FGF4/HST1蛋白质的生理活性具有治疗效果的各种疾病。实施例

我们提供实施例和实验实施例以便更详细地描述本发明，但这些实施例不以任何方式限制本发明。实施例1

(1)制备胺化明胶

将具有9.0等电点的1g明胶(Nitta Gelatin公司)溶解在50ml 0.1M磷酸缓冲液(PB，pH5.0)中。然后，在该溶液中按每mol明胶羧基基团(分子量：10,000，羧基含量：95mol/明胶分子)50mol的量加入乙二胺(分子量：60.1)，然后再按每mol羧基50mol的量加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(分子量：191.7)。37℃搅拌所获混合溶液12个小时。反应结束后，将反应混合物对水透析2天，并冻干以获得胺化明胶。采用三硝基苯磺酸钠对氨基作的比色定量分析显示，56％的明胶羧基基团被胺化。

(2)制备颗粒性胺化明胶水凝胶

将40℃预处理的100mg/ml胺化明胶水溶液(0.2ml)加入5ml橄榄油中。通过40℃接触混合1分钟，乳化该混合物。通过超声40秒对该乳化的混合物作进一步乳化，之后在冰上快速冷却。加入丙酮(1.43ml)，离心(5,000rpm，5min，4℃)混合物以回收未交联的颗粒。采用丙酮对所获颗粒进行离心洗涤(5,000rpm，5min，4℃)。然后将所获颗粒悬浮在30μl 25％(w/v)戊二醛水溶液和20ml 0.1％(w/v)Tween 80水溶液的混合水溶液中。4℃搅拌该悬浮液40个小时，以通过化学方法使明胶颗粒发生交联。然后，离心(5,000rpm，5min，4℃)回收所获颗粒。之后，为了封闭未反应的醛基，将颗粒分散在含有100mM甘氨酸的0.1(w/v)％Tween 80水溶液(20ml)中，并37℃搅拌该分散体系1小时。反应结束后，用0.1％(w/v)Tween 80水溶液(两次)、然后用蒸馏水(三次)离心洗涤该反应混合物，以回收颗粒。用丙酮彻底洗涤后，空气干燥这些颗粒。从显微照片上测量干燥颗粒的大小、和37℃在PB(pH7.0)中溶胀12小时后颗粒的大小。基于它们大小的比例，按体积计算的水含量为98.6％(颗粒性胺化明胶水凝胶)。所获颗粒的平均大小在干燥状态为100μm(溶胀状态为200μm)。(3)制备与颗粒性胺化明胶水凝胶结合的DNA

所用DNA是通过将大肠杆菌的lacZ基因插在具有CAG启动子(鸡β-肌动蛋白启动子；Gene，108：193-200，1991)的pCAGGS表达载体的EcoRI位点中获得的lacZ表达质粒DNA，该启动子尤其在肌肉中具有高活性(该质粒被称作pCAGGS-lacZ，或简单地称作lacZ质粒；由Miyazaki实验室(Molecular Defense Medicine，Osaka Universtiy Faculty of Medicine)提供)。用TlCl₃放射标记此DNA。即，将5μl Na¹²⁵I溶液(0.1N NaOH水溶液中740MBq/ml，NEN Research Products，Dupont)与0.3mM Na₂SO₃水溶液(2μl)混合，使该混合物在25℃放置30分钟。向该混合物中加入其中溶有5μg DNA的5μl 0.1M CH₃COONa-40mM CH₃COOH混合溶液(pH5.0)。再加入其中溶有0.3mg TlCl₃的0.3ml 0.2M CH₃COONa-1.0mM CH₃COOH混合溶液(pH 4.0)。然后，将所获混合物置于60℃40分钟。然后，向该混合溶液中加入0.1ml 0.1mM Na₂SO₃水溶液，并再加入含有0.9ml 1mMEDTA的0.1mM NaCl-50mM tris盐酸溶液(pH7.0)。所获溶液在60℃加热30分钟。反应完成后，冷却所获溶液，并在PD-10凝胶层析柱上分离放射性碘化DNA和游离的放射碘。然后，向冻干的颗粒性胺化明胶水凝胶滴加10μl放射性碘化DNA水溶液，并使该系统在25℃放置1小时。此期间，颗粒被水溶液浸渍，获得含有放射性碘化DNA的复合物。实施例2

在明胶水溶液(终浓度：按重量计5％)中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的水溶液(终浓度：10.7mM)。然后，将该混合物倾入15cm×15cm大小的塑料平皿中，并4℃放置24小时以进行交联反应。所用明胶是具有4.9等电点的经碱处理的明胶。反应结束后，从平皿中取出交联的明胶凝胶，获得厚200μm的明胶片。用水彻底洗涤所获片，然后将其冻干。将干燥的交联明胶片置于按实施例1相同方式制备的放射性碘化DNA(lacZ质粒)水溶液中，以获得含放射性碘化DNA的交联明胶片。实验实施例1

将基因掺入颗粒性胺化明胶水凝胶中

对核酸被摄取至带正电荷水不溶性生物可降解聚合物中进行证实。

将含500μg/ml浓度lacZ质粒的水溶液与实施例1-(2)中制备的颗粒性胺化明胶水凝胶混合，并通过紫外吸收法(波长：260nm)测量随着时间的过去水溶液中lacZ质粒的浓度。使用水(不含lacZ质粒)作为对照。结果显示在图2中。

水溶液中的lacZ质粒在1小时内快速地掺入颗粒性胺化明胶水凝胶中(通过lacZ质粒浓度在水溶液中的降低所测量到的)。lacZ质粒浓度在水溶液中的降低一直持续到24小时之后，说明lacZ质粒持续被吸收到明胶水凝胶中。参考实验实施例1

颗粒性胺化明胶水凝胶的生物可降解性

验证本发明含核酸复合物中的成分，颗粒性胺化明胶水凝胶，是可生物降解的。

在试管中加入0.1ml量的¹²⁵I-Bolton-Hunter试剂(NEN-120X，无水苯中147MBq/ml，NEN Research Products，DuPont)的无水苯溶液。通过氮气起泡蒸发苯。向该试管中加入5ml蒸馏水，在该蒸馏水中分散了浓度达10mg/ml的实施例1-(2)制备的颗粒性胺化明胶水凝胶。4℃搅拌该混合物12小时，以便放射性碘化标记该明胶水凝胶。用蒸馏水离心洗涤(5,000rpm，5min，4℃)所获放射性碘化颗粒性胺化明胶水凝胶，以除去未参与标记的¹²⁵I-Bolton-Hunter试剂。最后，用0.1M磷酸缓冲盐溶液(PBS，pH7.0)将颗粒浓度调节至0.5mg/ml。

将所获放射性碘化颗粒性胺化明胶水凝胶，按每只小鼠0.1ml的剂量，施用在ddy小鼠(雌性，6周龄，购自Shimizu Experimental Material公司)的右股肌肉中。预先确定的时间过后，切下右股肌肉，测量放射活性。将测量到的放射活性与最初施用的放射活性比较，以评价残存的放射性活性。在每种实验条件下均对3只小鼠进行这些实验。颗粒性胺化明胶水凝胶在体内随时间降解，由此证实其是可生物降解的。实验实施例2

评价DNA的体内存活情况

将按参考实验实施例1相似方式制备的放射性碘化胺化明胶水凝胶、和实施例1(3)制备的具有放射性碘化DNA的颗粒性胺化明胶水凝胶，都分散在0.1ml PBS中。然后，将此分散体系施用在ddy小鼠(雌性，6周龄，购自Shimizu Experimental Material公司)的右股肌肉内。作为对照，在90μl PBS中加入10μl放射性碘化DNA水溶液，然后将此混合物施用在小鼠的右股肌肉内。对于每种实验条件，实验小鼠的数目都是3，残存放射活性表示为平均值±标准差。结果显示在图3。

明胶颗粒的残存放射活性随时间推移逐渐减少，由此说明这些颗粒在体内发生降解，换言之，它们是可生物降解的(-·-)。包含在明胶水凝胶中的DNA的残存放射活性(-°-)也随时间的过去而减少，并且其随时间流逝的分布图与颗粒性胺化明胶水凝胶本身的残存放射活性的时间分布图是相同的。这证实DNA由于颗粒的降解以持续方式自颗粒中释出。当施用DNA水溶液时，残存放射活性快速减少(-△-)。该发现说明，DNA在施用部位被快速排出或代谢，而不被保留。实验实施例3

胺化明胶水凝胶结合的DNA的基因表达

除去兔股动脉，制备下肢缺血模型。10天后，在缺血部位的肌肉内施用lacZ质粒。施用后2周，对缺血部分的肌肉组织进行lacZ染色，以研究该基因的表达。结果显示在图4A-4C。

对实施例1(3)中制备的颗粒性胺化明胶水凝胶(溶胀时直径200μm)结合的lacZ质粒(lacZ质粒的量为500μg：图4A)、未与颗粒性胺化明胶水凝胶结合的裸lacZ质粒(500μg，对照：图4B)，进行这些研究。并对lacZ质粒的量减少至1/10(lacZ质粒的量为50μg：图4C)的颗粒性胺化明胶水凝胶(溶胀时直径200μm)结合的lacZ质粒的施用进行了该研究。

按以下方式进行lacZ染色；

1.在37％甲醛-25％戊二醛混合溶液中4℃固定样品5分钟。

2.用PBS洗涤(3次)。

3.用染液(1mg/ml X-gal，5mM六氰基高铁(III)酸钾，5mM六氰基高铁(II)酸钾，1M氯化镁)进行染色。

与单独施用lacZ质粒相比，与颗粒性胺化明胶水凝胶结合的lacZ质粒表现出更广泛的基因表达(A与B的比较)。

与颗粒性胺化明胶水凝胶结合的lacZ质粒，甚至在其剂量减少至1/10时，还表现出显著的基因表达。参考实验实施例2

采用腺病毒载体进行的基因表达

在兔下肢缺血模型中按实施例3相同方式研究使用腺病毒载体进行的基因转移。

施用含有1×10⁹pfu lacZ基因的腺病毒载体(由Saito实验室提供，The Institute of Medical Science，The University of Tokyo)。施用后3天，与单独施用lacZ质粒及施用与颗粒性胺化明胶水凝胶结合的lacZ质粒相比，lacZ基因的表达更强(图5A)。然而，施用后2周基因表达显著下降(图5B)。实验实施例4

兔下肢缺血模型中的血管生成

在实验实施例3相同的兔下肢缺血模型中研究施用成纤维细胞生长因子FGF4/HST1质粒导致的血管生成。

除了所用核酸是FGF4/HST1质粒(500μg或5μg)外，按实施例1相同方式制备颗粒性胺化明胶水凝胶结合的FGF4/HST1质粒。对于该质粒，使用的是通过将FGF4/HST1基因(序列表SEQ ID NO.1)插在pRc/CMV2载体(INVITORGEN)的HindIII位点中获得的FGF4/HST1表达质粒DNA(之后简称FGF4/HST1质粒)。

使用裸FGF4/HST1质粒(500μg)、和与相同明胶水凝胶结合的lacZ质粒(500μg)，作为对照。

在下肢缺血模型制备后10天，通过肌内方式向缺血部位注射以上实施方案的各种质粒。在给药后2周，对新生血管实施血管造影术(放射线照相术)。结果显示在图6A-6D。

图6A和6B显示了施用颗粒性胺化明胶水凝胶结合的FGF4/HST1质粒(FGF4/HST1质粒的量：图6A中500μg，图6B中5μg)的结果。图6C显示了施用颗粒性胺化明胶水凝胶结合的lacZ质粒(500μg，对照)的结果。图6D显示了施用裸FGF4/HST1质粒(500μg，对照)的结果。施用与颗粒性胺化明胶水凝胶结合的FGF4/HST1质粒比施用裸形式的该质粒导致更多的新血管生长。由此，我们发现FGF4/HST1质粒的功能性表达得到增强(图6A与图6C及6D的比较)。甚至在其剂量减少至1/100时(图6B)，仍观察到此效果。而且，当以和明胶水凝胶结合的形式、而非以裸形式施用时，FGF4/HST1质粒可以局部地高效发挥功能。

使用VEGF₁₆₅质粒(500μg)替代FGF4/HST1质粒进行的实验给出了相似的结果。VEGF₁₆₅质粒由东京大学Shibuya教授提供。该质粒是通过将VEGF₁₆₅基因插入pCAGGS表达载体的XhoI位点获得的(Shibuya M，Adv.Cancer Res.，67，281-316，1995)。实验实施例5

向兔动脉管壁进行基因转移(1)lacZ质粒

将实验实施例2制备的干燥交联明胶薄片放置在无菌支架(Synthesis：Cardio Vascular Dynamics，Inc.)上。向该交联明胶薄片滴加lacZ质粒溶液(5-10μg/μl)，重复滴加2小时以避免干燥(滴加的总量：50-100μl)。通过此手段，使交联明胶与lacZ质粒结合。将此交联明胶包被的支架植入兔髂动脉中。5天后，取出该髂动脉，包埋在Tissue-Tek(R)O.C.T.化合物中，然后在液氮中固定。样品在使用前保存在-80℃。从该固定的样品制备切片，并对其进行苏木精-伊红(HE)染色、DAB(二氨基联苯胺)(diaminobenzenezidene)、和Xgal染色。结果显示在图7。

在血管平滑肌被膜的外层中，观察到lacZ的表达，证实质粒被巨噬细胞摄取并且质粒得到表达。

(2)VEGF165质粒

以上面(1)中所述相同的方式，向交联明胶薄片滴加50μl-100μl量的1-2μg/μl VEGF165质粒溶液。通过免疫组织化学染色(使用抗人VEGF IgG组分(Austral Biologicals)作为一抗)验证该质粒的表达。实验实施例6

通过放射微血管造影术研究新生血管网(Vasoganglia)的成熟

(1)施用质粒

在患有下肢缺血的兔(同实验实施例3)的患病下肢股肌肉中肉眼施用含有未与交联明胶结合的500μg裸VEGF₁₆₅质粒的水溶液。

独立地，在患有下肢缺血的兔的患病下肢股肌肉内肉眼施用含有与4mg交联明胶微粒(直径约200μm)结合的500μgVEGF₁₆₅质粒的生理盐水。

(2)输入腺苷

以100μg/kg/min的剂量向腹主动脉施用腺苷。

(3)测量和结果

通过放射微血管造影术(间距分辨率25微米)，测量裸VEGF₁₆₅质粒组和明胶水凝胶结合的VEGF₁₆₅质粒组中新生血管网的成熟。图8显示了裸VEGF₁₆₅质粒处理的结果，而图9显示了明胶水凝胶结合的VEGF₁₆₅质粒处理的结果。在裸VEGF₁₆₅质粒处理的组中，与基线比较(未输入腺苷)，输入腺苷后(血管舒张期间)血管密度降低。在明胶水凝胶结合的VEGF₁₆₅质粒处理的组中，输入腺苷后血管密度明显增加。这些发现显示，在明胶水凝胶结合的VEGF₁₆₅质粒组中，基线血流被控制在一个低水平，且在腺苷输入期间调动了血管舒张储备能力。在裸VEGF₁₆₅质粒组中，则相反，基线血流并不被控制在低水平，而且在腺苷输入期间也没有调动血管舒张储备能力。新生血管中血管系统的成熟，如血管平滑肌和神经或体液调节机制的成熟，是腺苷输入过程中血流和血管舒张控制所必需的。已经发现施用明胶水凝胶结合的VEGF₁₆₅质粒能够实现这些状态。参考实施例3

巨噬细胞对含核酸复合物的摄取

体外制备吸收了含核酸复合物的巨噬细胞。向小鼠的腹膜内注射巯基乙酸盐，4天后采取巨噬细胞。独立地，将2mg绿色荧光蛋白(GFP)质粒(Prasher DC等，Gene，111，229-233，1992；Heim R等，Nature，373，663-664，1995)中的100μg与实施例1中制备的交联明胶颗粒相结合。该质粒是通过将GFP的cDNA(购自Clontech)插入HIV-CS载体的多克隆位点制备的。使交联明胶颗粒-GFP质粒与收集的巨噬细胞混合，并在PBS中33℃培养该混合物4天。培养4天后，采用荧光显微镜和荧光激活的细胞分选仪(FACS)，检查GFP的荧光。结果显示在图10。在巨噬细胞中观察到荧光，这证实摄取了交联明胶颗粒-GFP。在采用浸在伊红染液中的交联明胶颗粒进行的实验中，也证实了相似结果(证实巨噬细胞中的伊红颗粒)。实验实施例7

向树突细胞转移基因并诱导针对特定抗原的CTL

向分离自人外周血的树突细胞(DC)施用GFP质粒，并检测其抗原呈递能力。

除了所用核酸是GFP质粒(见前述；20μg)外，按实施例1相同方式制备颗粒性胺化明胶水凝胶结合的GFP质粒。

从健康实验对象的单核细胞中获得CD14阳性组分，并与GM-CSF和IL-4一起加入合并的人血清/RPMI培养基中，以诱导DC。4-6天过后，在DC中加入颗粒性胺化明胶水凝胶结合的GFP质粒。将该混合物放置60分钟，除去明胶水凝胶，然后再培养细胞3天。用CD1a-PE和CD83-PE作为DC的标志，染色培养后的DC，并通过FACS分析研究向DC转移基因的效率。结果显示在图11A和11B。使用裸GFP质粒(20μg)作为对照。基因转移效率是77％。

当使用WT1质粒(Call KM等，Cell，60，509-520，1990)替代GFP质粒时，获得相似的高基因转移效率。

通过CTL诱导能力，测定其中转移了WT1基因的DC是否具有细胞呈递基因产物的能力。将诱导了DC的相同健康实验对象的T淋巴细胞与带有WT1基因的DC一起共培养，以获得激活的T淋巴细胞。使用⁵¹Cr标记这些细胞以形成靶细胞。使用这些靶细胞，进行CTL分析。诱导了针对转移的WT1的CTL，这显示出WT1基因转化的DC具有呈递该抗原的能力。

根据本发明，正如上述，核酸的负电荷和生物可降解聚合物的正电荷之间的稳定牢固结合导致复合物形成。核酸的释放受到生物可降解聚合物体内降解的控制。由此，与在常规缓慢释放制剂中观察到的简单扩散引起的缓慢释放、以及采用水溶性生物可降解聚合物实现的核酸瞬时释放相比，可以实现对释放速率更为精确的控制。而且，改善了持续释放，使其在一个更长的时间内进行。

对于本发明的含核酸复合物，该复合物是不溶性的，并且核酸在体内受到保护不被降解。因此，能够使核酸维持在一种足够有活性的状态，直到核酸到达其应当通过基因表达或通过所包含核酸的直接作用表现出功能的位点。由此，可以实现核酸的局部表达和/或作用。即，可以使基因治疗局限于需要治疗的位点。

而且，核酸的释放速率受到所用生物可降解聚合物的类型、以及正电荷和负电荷间的平衡的控制。因此，释放速率是恒定的，在制备复合物的过程中无需特别关心其形状。

连贯并持久地局部长期释放核酸在基因治疗领域是尤其有用的。由于可能要长期向需要治疗的部位或活生物体施用目的基因，所以就愈需要调节基因转移的时间安排、和导入核酸的时间安排，以便对基因表达和功能性表达而言最优。

根据本发明，可以预期使用通常剂量约1/10-1/100的核酸量即可得到期望效果。即，本发明起到增强核酸有效活性的作用。从可以施用低剂量的基因、以及可以降低基因在非目的位点的其它位点的附属作用这些方面来看，该增强作用是优选的。

本发明含核酸复合物的另一实施方案是提供借助于吞噬细胞如巨噬细胞的吞噬作用、和吞噬细胞的迁移，能够实现核酸的靶位点特异性功能表达的新方法。该方法使得可以更为安全、容易地进行基因治疗。

                          序列表<110>CMIC Co.，Ltd.<120>含核酸的复合物<130>PCM-9001<150>JP 2000-278878<151>2000-9-13<150>JP11-318187<151>1999-11-09<160>1<210>1<211>3149<212>DNA<213>Homo sapiens<300><301>M.Taira，T.Yoshida，K.Miyagawa，H.Sakamoto，M.Terada and T.Sugimura<302>人转化基因hst的cDNA序列和转化活化所需编码序列的鉴定<303>Proc.Natl.Acad.Sci.USA<304>84<306>2980-2984<307>1987<400>gcactgctcc tcagagtccc agctccagcc gcgcgctttc cgcccggctc gccgctccat  60gcagccgggg tagagcccgg cgcccggggg ccccgtcgct tgcctcccgc acctcctcgg  120ttgcgcactc ctgcccgagg tcggccgtgc gctcccgcgg gacgccacag gcgcagctct  180gccccccagc ttcccgggcg cactgaccgc ctgaccgacg cacggccctc gggccgggat  240gtcggggccc gggacggccg cggtagcgct gctcccggcg gtcctgctgg ccttgctggc  300gccctgggcg ggccgagggg gcgccgccgc acccactgca cccaacggca cgctggaggc  360cgagctggag cgccgctggg agagcctggt ggcgctctcg ttggcgcgcc tgccggtggc  420agcgcagccc aaggaggcgg ccgtccagag cggcgccggc gactacctgc tgggcatcaa  480gcggctgcgg cggctctact gcaacgtggg catcggcttc cacctccagg cgctccccga  540cggccgcatc ggcggcgcgc acgcggacac ccgcgacagc ctgctggagc tctcgcccgt  600ggagcggggc gtggtgagca tcttcggcgt ggccagccgg ttcttcgtgg ccatgagcag 660caagggcaag ctctatggct cgcccttctt caccgatgag tgcacgttca aggagattct 720ccttcccaac aactacaacg cctacgagtc ctacaagtac cccggcatgt tcatcgccct 780gagcaagaat gggaagacca agaaggggaa ccgagtgtcg cccaccatga aggtcaccca 840cttcctcccc aggctgtgac cctccagagg acccttgcct cagcctcggg aagcccctgg 900gagggcagtg ccgagagtca ccttggtgca ctttcttcgg atgaagagtt taatgcaaga 960gtaggtgtaa gatatttaaa ttaattattt aaatgtgtat atattgccac caaattattt 1020atagttctgc gggtgtgttt tttaattttc tggggggaaa aaaagacaaa acaaaaaacc 1080aactctgact tttctggtgc aacagtggag aatcttacca ttggatttct ttaacttgtc 1140aaaagttgtc acgagtgtgc tgctattctg tgttttaaaa aaaggtgaca ttggattccg 1200atgtcatccc ctgtagtatg gcgtggagca tctctgtctg gaaaggcccg cctgaggctt 1260gggcagccag ttcagggagc tcccaggctt ggctctcggc tagcatcctc agaggcccac 1320tccctttgtg ccctgttgct attaatcggg acatatcggt ttacttcggg tacagaaagt 1380gcggtgttga agtcctcgct gccactctgt ttttagatct gccaagactg acctttgaac 1440tttcctgtag tcaatcttcc tcgatctacc agatgggaga gacccttgga caactttata 1500aactcctgtt tgcctttttt ggatcagcga cagcccccat cgctgtgact attggggaaa 1560agacgaagct ctttcataaa ttccatggag aggaatcaat atcccactgg aaggctagaa 1620atggacaaga tagtgtattt gcaatcacaa acaaaaccct agtgatgaaa aataatttgt 1680gatggcagat gcttctgatg gtgtgataga atatgttttt gaaaacaaac catcgaaccc 1740cccgccccac ccccaaaacg ggcttccctg tgtttaggga gctttgggct agaactagct 1800acgattttta ggtgaaatgt ccttgtaatt gtacaaagca cttggtgcag tgtttgcgtg 1860gagcagcctg ctgctttctg atgcattccc tgtttaagtg cgtttaacat ctacctcaca 1920agccctgaaa ccccaggcaa aacccacaga aagctcatac ccggtgcagg agtttgccat 1980cccaagtggc tttttttcca tatgtagcca aaaaggattg cagatagcgt cggtgcgtcc 2040cattcgaacc ttgtcacgtt tgagctatct ttaccctgtg atttactttt agtaagggtg 2100atcatggtga aaatatttgc agacagctgt tacagtacac tatatggtca ccaagtaacc 2160ttatattttt ctttatatat tttacaaatg taacccctgt cattgaagca accgtggaag 2220aggcagggtc ggtgatgttt aaaaaaagtt ccgaggtgat ggcaaacatt taattttaat 2280gaatgacttt ttagagttta tacaaaatga ccttagcttg ctaccagaaa tgctccgaat 2340gtttcgtcaa gactttaata ctctcctagg atgtttctga actgtctccc gaattaactt 2400tatgggagtc tacagacagc aagactggaa aatctgattg gagtttttgt ctttcacatt 2460ccttttgaaa actctttgtt cgaatgcaaa tcatcgactt aaaatactat tcttaaccaa 2520ggcctggaag aaagaagaca cttgcaaagc cgctaagaca ggaccacaca tcttaaactg 2580ctgttcctac catgcactaa actgttttta agttttaaac cacaccctag gctccaggag 2640tgttcaggaa agatggtgtt tgtaggtctc catgctgttt ggcgttgggg ggtgtggagg 2700gatcatccgt cgactttctg aattttaatg tattcactta gtaacaaacc atgattgtct 2760taaatgcctt aaattattat gagatttctt gtctcagagc ccaatcagat tgtcaggaat 2820taacatgtgt taggtttgat cacccttgac cacttcttat agatatttct tcaacaaatc 2880atgtgtgatg cctgtaggaa cacaactgta cctttaaaat attgttttca tattgctgtg 2940atggggattc gaggttcctg tatgtgccac tgttttcaga atctgtagtt ttatacaggt 3000gccgaccctc gttgtgatgt atgtgctgtg cacattgaca tgctgaccga caatgataag 3060cgtttatcgt gtataaaaag acaccactgg actggatgta cacaactggg aaaggaatta 3120aaagctatta aaattgtgcc ttgaaatgc 3149

Claims (49)

1.包含核酸和带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物的含核酸复合物，其中所述核酸可以通过生物可降解聚合物的降解得以释放。

2.包含核酸和带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物的含核酸复合物，其中该聚合物具有引入的带正电荷基团。

3.权利要求1或2的含核酸复合物，其中所述带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物包含至少一个选自下组的成员：胶原、明胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、褐藻酸、和它们的衍生物。

4.权利要求3的含核酸复合物，其中所述衍生物包含氨基衍生物。

5.权利要求1或2的含核酸复合物，其中所述带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物包含具有引入的带正电荷基团的交联明胶。

6.权利要求1或2的含核酸复合物，其中所述核酸包含至少一个选自下组的成员：质粒DNA、寡核苷酸、和双链核酸化合物。

7.权利要求6的含核酸复合物，其中所述核酸包含至少一个选自下组的成员：血管内皮细胞生长因子基因、肝细胞生长因子基因、和成纤维细胞生长因子基因。

8.权利要求7的含核酸复合物，其中所述成纤维细胞生长因子基因包含SEQ ID NO.1。

9.包含权利要求1-8之任一项的含核酸复合物作为活性成分的药物组合物。

10.权利要求9的药物组合物，其被用于基因治疗。

11.权利要求10的药物组合物，其中所述基因治疗通过局部施用该基因来实现。

12.控制核酸释放速率的方法，包括：将核酸掺入带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物中；和允许核酸通过所述生物可降解聚合物的降解得到释放。

13.控制核酸释放速率的方法，包括：将核酸掺入具有引入的带正电荷基团的带正电荷水不溶性生物可降解聚合物中；和允许核酸通过所述生物可降解聚合物的降解得到释放。

14.权利要求12或13的方法，其中所述带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物包含至少一个选自下组的成员：胶原、明胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、褐藻酸、淀粉、和它们的衍生物。

15.权利要求14的方法，其中所述衍生物包含氨基衍生物。

16.权利要求12或13的方法，其中所述带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物包含具有引入的带正电荷基团的交联明胶。

17.权利要求12或13的方法，其中所述核酸包含至少一个选自下组的成员：质粒DNA、寡核苷酸、和双链核酸化合物。

18.权利要求17的方法，其中所述核酸包含至少一个选自下组的成员：血管内皮细胞生长因子基因、肝细胞生长因子基因、和成纤维细胞生长因子基因。

19.权利要求18的方法，其中所述成纤维细胞生长因子基因包含含有SEQID NO.1的DNA。

20.增强核酸的功能的方法，包括：将核酸掺入带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物中；和允许该核酸通过生物可降解聚合物的降解得以释放，以表现出该核酸的功能。

21.增强核酸的功能的方法：将核酸掺入具有引入的带正电荷基团的带正电荷水不溶性生物可降解聚合物中；和允许该核酸通过该生物可降解聚合物的降解得以释放，以表现出该核酸的功能。

22.权利要求20或21的方法，其中所述带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物包含至少一个选自下组的成员：胶原、明胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、海藻糖、和它们的衍生物。

23.权利要求22的方法，其中所述衍生物包含氨基衍生物。

24.权利要求20或21的方法，其中所述带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物包含具有引入的带正电荷基团的交联明胶。

25.权利要求20或21的方法，其中所述核酸包含至少一个选自下组的成员：质粒DNA、寡核苷酸、和双链核酸化合物。

26.权利要求25的方法，其中所述核酸包含至少一个选自下组的成员：血管内皮细胞生长因子基因、肝细胞生长因子基因、和成纤维细胞生长因子基因。

27.权利要求26的方法，其中所述成纤维生长因子基因包含SEQ ID NO.1。

28.包含有含核酸复合物的吞噬细胞，其中该含核酸复合物含有核酸和生物可降解聚合物。

29.权利要求28的吞噬细胞，其中所述生物可降解聚合物包含至少一个选自下组的成员：胶原、明胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、褐藻酸、淀粉、和它们的衍生物。

30.权利要求28的吞噬细胞，其中所述含核酸复合物包含权利要求1或2的含核酸复合物。

31.在靶位点表现核酸的功能的方法，包括步骤：

(i)允许吞噬细胞摄取含有核酸和生物可降解聚合物的含核酸复合物；

(ii)诱导核酸在吞噬细胞中发挥功能；和

(iii)将吞噬细胞递送至靶位点。

32.权利要求31的方法，其中所述含核酸复合物包含权利要求1-8之任一项的含核酸复合物。

33.权利要求31的方法，其中所述生物可降解聚合物包含至少一个选自下组的成员：胶原、明胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、褐藻酸、淀粉、和它们的衍生物。

34.包含含核酸复合物作为活性成分的基因治疗用药物组合物，其中所述含核酸复合物包含核酸和生物可降解聚合物，并且其中基因治疗包括步骤：

(i)允许吞噬细胞摄取含有核酸和生物可降解聚合物的含核酸复合物；

(ii)诱导核酸在吞噬细胞中发挥功能；和

(iii)将吞噬细胞递送至靶位点。

35.权利要求34的药物组合物，其中所述生物可降解聚合物包含至少一个选自下组的成员：胶原、明胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、褐藻酸、淀粉、和它们的衍生物。

36.权利要求34的药物组合物，其中所述含核酸复合物包含权利要求1-8之任一项的含核酸复合物。

37.通过给需要治疗的患者施用含核酸复合物治疗疾病或病症的方法，其中该含核酸复合物含有核酸和带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物。

38.权利要求37的方法，其中所述带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物包含至少一个选自下组的成员：胶原、明胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖、透明质酸、褐藻酸、淀粉、和它们衍生物。

39.权利要求38的方法，其中所述衍生物包含氨基衍生物。

40.权利要求37的方法，其中所述带正电荷的水不溶性生物可降解聚合物包含具有引入的带正电荷基团的交联明胶。

41.权利要求37的方法，其中所述核酸包含至少一个选自下组的成员：质粒DNA、寡核苷酸、和双链核酸化合物。

42.权利要求37的方法，其中所述核酸包含至少一个选自下组的成员：血管内皮细胞生长因子基因、肝细胞生长因子基因、和成纤维细胞生长因子基因。

43.权利要求42的方法，其中所述成纤维细胞生长因子基因包含含有SEQID NO.1的DNA。

44.权利要求37的方法，其中所述疾病或病症选自：癌症、免疫相关疾病和病症、心血管疾病、脑或神经相关疾病、代谢紊乱和单基因疾病。

45.权利要求44的方法，其中所述心血管疾病选自：外周动脉疾病、冠状动脉疾病、和引起损伤的疾病。

46.权利要求44的方法，其中所述单基因疾病选自：囊性纤维化、慢性肉芽肿性疾病、α₁-抗胰蛋白酶缺乏、和戈谢病。

47.权利要求37的方法，其中所述疾病或病症选自：癌症；中枢神经系统疾病；外周神经系统疾病；阿尔茨海默病；帕金森病；多发性硬化；肌萎缩性侧索硬化；病毒感染；朊病毒引起的感染；细菌引起的感染；真菌引起的感染；和眼病。

48.权利要求47的方法，其中所述癌症选自：恶性黑素瘤、颅内肿瘤、转移性恶性肿瘤、和乳腺癌。

49.权利要求37的方法，其中所述疾病或病症选自：偏头痛；疼痛；性功能障碍；心境障碍；注意力障碍；认知障碍；低血压；高血压；精神病性精神障碍；神经障碍；运动障碍；代谢紊乱；和器官移植排斥。

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