TWI267380B - Nucleic acid-containing complex - Google Patents

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1267380 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（1 ) 〔發明所屬之技術領域〕 本發明爲關於含有核酸與帶正電荷之水不溶性生物分 解性高分子爲其特徵之含核酸複合體及控制由該複合體釋 出核酸速度之方法。 本發明爲再關於含有含核酸與生物分解性高分子之含 核酸複合體之具有吞噬作用之細胞（以下亦稱爲呑噬細胞 )，及以該含核酸複合體做爲有效成分之可使用於吞噬細 胞中介型基因治療之醫藥。 〔先前之技術〕 近年，隨著人類疾病之分子遺傳學上之要因的闡明， 使得基因治療硏究日益受到重視。基因治療法爲以D N A 於標的部位的表現爲目的，其重要爲D N A如何到達標的 部位，D N A於標的部份如何有效率地導入，於該部位是 否機能性地表現。於外來D N A的有效導入及表現上已報 告各種方法，其大致可分成（1 )經由物理性方法導入 D N A (微注射法、電穿孔法等），（2 )經由化學性方 法導入D N A (磷酸鈣法，D E A E葡聚糖法法），（3 )生物學方法（逆轉錄病毒和腺病毒之病毒載體等）。磷 酸鈣法、D E A E葡聚糖法等先前的化學性方法均爲基因 導入效率低。微注射法和電穿孔法等物理性方法爲需要特 殊的裝置，於臨床上的使用未實用化。病毒載體雖因高基 因導入效率而可被期待於臨床面上的應用，但在使用病毒 方面伴隨著副作用的危險。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-4- 1267380 A7 B7 五、發明說明（2 ) 爲了克服上述缺點，亦開發出新的技術。脂質體爲將 基因攝入其內部，保護基因免受惰化和分解。又，不使用 病毒D N A，可完全排除發生危險重組體的可能性。但是 ，因爲對於各種細胞的強毒性，使得脂質體做爲D N A載 體的使用受到限制，故現在亦持續開發用以導入的新物質 〇 又，在對於血管病變之基因治療領域中，亦已知於導 入血管之套管表面附著水凝膠，並於其中放入質體基因， 直接於血管塗佈之水凝膠法（Marchall，E·，Science， 2 69,1 050- 1 055,1995 )。此方法爲令質體由水凝膠中，經由 單純擴散而緩慢釋放。但是此方法爲緩釋期間短，且其期 間的控制困難。於基因治療中必須根據欲治療疾病和其狀 況，調整治療基因之份量，或供給期間，因此，追求可將 治療基因的緩釋期間視需要而自由控制的手段。 又，於基因治療等之臨床中使用時，爲了令外來基因 機能性表現，乃必須將該基因於安定程度下，持續供給至 標的部位。 更且，近年注目集中於使用反意義寡核酸之基因治療 的硏究，並且追求令核酸於部位專一性地，且安定於一定 期間供給至生體的手段。 〔發明所欲解決的課題〕 本發明之目的爲在於提供安全且對於細胞的導入效率 高，且可於標的部位持續供給核酸的含核酸複合體，及控 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _壯衣--------訂---------

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -5- 1267380 A7 B7 五、發明說明（3 ) 制由該複合體釋出核酸速度之方法。 更且，本發明之另外目的爲在於提供安定且操作容易 ’且於生體之部位專一性機能表現優良之含核酸複合體， 及使用該含核酸複合體之可標的部位專一性地表現核酸機 能的方法。 〔用以解決課題之手段〕 本發明者等人爲鑑於上述課題，進行致力硏究，結果 發現經由將帶負電荷之核酸與帶正電荷之水不溶性生物分 解性高分子予以複合化，作出安定的複合體，則可抑制核 酸於體內之分解，及在所欲部位持續釋出核酸。更且發現 如該含核酸複合體般，經由將核酸與生物分解性高分子複 合體化所得之複合體，可被免疫系中擔任重要職務之吞噬 細胞輕易地攝入（該複合體對於吞噬細胞的尋靶作用）， 攝入該複合體之吞噬細胞爲基於其游走能力而運送至標的 部位（吞噬細胞對於標的部位的尋靶作用），核酸於該標 的部位具有機能表現優良之效果，且完成本發明。即，本 發明爲如下。 (1 ) 一種含核酸複合體，其爲含有核酸與帶正電荷 之水不溶性生物分解性高分子，且可經由該生物分解性高 分子的分解而釋出核酸。 (2) —種含核酸複合體，其爲含有核酸，與導入正 電荷基之帶正電荷之水不溶性生物分解性高分子。 (3 )如上述（1 )或（2 )記載之含核酸複合體’ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ，---I--I I 訂 — — — — —----

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -6 - 1267380 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（4 ) 其中帶正電荷之水不溶性生物分解性高分子爲由膠原、明 膠、殻多糖、奎尼酸、透明質酸、藻酸、澱粉及其衍生物 所組成群中選出至少一種。 (4 )如（3 )記載之含核酸複合體’其中衍生物爲 胺基衍生物。 (5 )如上述（1 )或（2 )記載之含核酸複合體， 其中帶正電荷之水不溶性生物分解性高分子爲導入正電荷 基的交聯明膠。 (6 )如上述（1 )或（2 )記載之含核酸複合體， 其中核酸爲由質體D N A、寡核苷酸及雙鏈核酸化合物所 組成群中選出至少一種。 (7 )如上述（1 )或（2 )記載之含核酸複合體， 其中核酸爲由血管內皮細胞增殖因子基因、肝細胞增殖因 子基因及纖維芽細胞增殖因子基因（特佳爲序列表序列編 號1所記載之鹼基序列所構成之D N A )所組成群中選出 至少一^種。 (8) —種醫藥，其爲以上述（1)〜（7)任一項 記載之含核酸複合體做爲有效成分。 (9 )如上述（8 )記載之醫藥，其爲基因治療用， 特別爲將基因局部投與所進行之基因治療用。 (1 0 ) —種控制核酸釋出速度之方法，其特徵爲令 帶正電荷之水不溶性生物分解性高分子中含有核酸，並經 由該生物分解性高分子之分解而將核酸釋出。 (1 1 ) 一種控制核酸釋出速度之方法，其特徵爲令 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝

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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1267380 ” A/ B7 五、發明說明（5 ) 導入正電荷基之帶正電荷水不溶性生物分解性高分子中含 有核酸，並經由該生物分解性高分子之分解而將核酸釋出 〇 (1 2 ) —種令該核酸之機能表現增強的方法，其特 徵爲令帶正電荷之水不溶性生物分解性高分子中含有核酸 ，並經由該生物分解性局分子之分解釋出核酸而令其機能 表現。 (1 3 ) —種令該核酸之機能表現增強的方法，其特 徵爲令導入正電荷基之帶正電荷水不溶性生物分解性高分 子中含有核酸，並經由該生物分解性高分子之分解釋出核 酸而令其機能表現。 (1 4 )如上述（1 0 )或（1 1 )記載之控制核酸 釋出速度之方法，或如上述（1 2)或（1 3)記載之令 核酸機能表現增強的方法，其中帶正電荷之水不溶性生物 分解性高分子爲由膠原、明膠、殼多糖、奎尼酸、透明質 酸、藻酸、澱粉及其衍生物（例如胺基衍生物）所組成群 中選出至少一種。 (1 5 )如上述（1 0 )或（1 1 )記載之控制核酸 釋出速度之方法，或如上述（1 2)或（1 3 )記載之令 核酸機能表現增強的方法，其中帶正電荷之水不溶性生物 分解性高分子爲導入正電荷基的交聯明膠。 (1 6 )如上述（1 0 )或（1 1 )記載之控制核酸 釋出速度之方法，或如上述（12)或（13)記載之令 核酸機能表現增強的方法，其中核酸爲由質體D N A、寡 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂---------

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -8- 1267380 A7 B7 五、發明說明（6 ) 核苷酸及雙股核酸化合物所組成群中選出至少一種。 (1 7 )如上述（1 〇 )或（1 1 )記載之控制核酸 釋出速度之方法，或如上述（1 2)或（1 3) s5載之节 核酸機能表現增強的方法，其中核酸爲由血管內皮細胞增 殖因子基因、肝細胞增殖因子基因及纖維芽細胞增殖因子 基因（特佳爲序列表序列編號1所記載之鹼基序列所構成 的D N A )所組成群中選出至少一種。 (1 8 ) —種吞噬細胞，其爲由含有含核酸與生物分 解性高分子之含核酸複合體所構成。 (1 9 )如上述（1 8 )記載之吞噬細胞，其中生物 分解性高分子爲由膠原、明膠、殼多糖、奎尼酸、透明質 酸、藻酸、澱粉及其衍生物所組成群中選出至少一種。 (2 0 )如上述（1 8 )記載之吞噬細胞，其中含核 酸複合體爲上述（1 )或（2 )記載之含核酸複合體。 (2 1 ) —種方法，其爲於標的部位表現核酸機能之 方法，至少包含（1 )將含有核酸與生物分解性高分子之 含核酸複合體攝入吞噬細胞中之過程、（i i )該核酸於 該吞噬細胞內誘導表現之過程、及（i i i )令該吞噬細 胞到達標的部位之過程。 (2 2 )如上述（2 1 )記載之方法，其中含核酸複 合體爲上述（1 )或（2 )記載之含核酸複合體。 (2 3 )如上述（2 1 )記載之方法，其中生物分解 性高分子爲由膠原、明膠、殼多糖、奎尼酸、透明質酸、 藻酸、澱粉及其衍生物所組成群中選出至少一種。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝----

經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 -9- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1267380 A7 B7 五、發明說明（7 ) (2 4 ) —種醫藥，其爲基因治療用之含有核酸與生 物分解性高分子之含核酸複合體做爲有效成分醫藥，該基 因治療爲至少包含（i )將含有核酸與生物分解性高分子 之含核酸複合體攝入吞噬細胞中之過程、（i i )該核酸 於該吞噬細胞內誘導表現之過程、及（i i i )令該吞噬 細胞到達標的部位之過程。 (2 5 )如上述（2 4 )記載之方法，其中生物分解 性高分子爲由膠原、明膠、殼多糖、奎尼酸、透明質酸、 藻酸、澱粉及其衍生物所組成群中選出至少一種。 (2 6 )如上述（2 4 )記載之醫藥，其中含核酸複 合體爲上述（1 )〜（7 )任一項記載之含核酸複合體。 於本發明複合體中所含之核酸並無特別限定，但其導 入爲帶來治療效果者爲佳，並且根據該複合體的使用目的 而適當選擇。於本發明中，除了各種質體D N A以外，某 基因的反意義寡核苷酸和誘導型核酸（decoi)般之雙股核 酸化合物等爲適合使用。更具體而言，於循環器領域之基 因治療及癌之基因治療中，本發明之含核酸複合體中所含 之核酸與其使用目的合倂例示於表1，但本發明不被其所 限定，且業者公知於其他的臨床領域中亦當然可能適用。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-10- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1267380 五、發明說明（8 ) rn 1__ 目 的 核酸之種類 循環器領域的基因治療 癌之基因治療 經由增強血管新 生而可適用於閉 塞性動脈硬化症 和缺血性心臟疾 病 •血管內皮細胞增殖因子（VEGF)基因 •肝細胞增殖因子（HGF)基因 •纖維芽細胞增殖因子（FGF)基因 經由再生血管內 皮細胞而可適用 於動脈形成術後 之再狹窄的預防 •血管內皮細胞增殖因子（VEGF)基因 •肝細胞增殖因子（HGF)基因 •內皮型-氧化氮合成酵素基因 • PGI2合成基因 經由調節血管平 滑肌細胞等之細 胞周期而可使用 於動脈形成術後 和分流術後之再 狹窄的預防等 •相對於C-myb之反意義寡核苷酸 •相對於PCN A基因之反意義寡核苷 酸 •相對於cdc-2激酶之反意義寡核苷 酸 於分流術後之再 狹窄的預防等中 可使用 •具有與轉錄因子E2F結合序列相同 序列之雙股核酸化合物 • E2F decoi 可適用於對於缺 血再灌流損害之 基因治療 • NFkB decoi 自殺基因導入 •單純疱疹病毒-胸苷激酶基因 癌抑制基因導入 • P53基因 對於抗癌劑保護 骨髓幹細胞 •多劑耐性基因（MDR) 免疫療法 •白介素12基因 • B7基因 抗意義R N A • ras基因 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -11 - 1267380 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（9 ) 本發明之含核酸複合體中所含核酸之較佳例可列舉血 管內皮細胞增殖因子基因、肝細胞增殖因子基因及纖維芽 細胞增殖因子基因。此類一連串之基因爲業者所熟知，可 列舉例如具有序列表序列編號1所示鹼基序列之F G F 4 / H S T 1基因做爲纖維芽細胞增殖因子基因。 FGF4/HST1基因爲以具有轉形ΝΙΗ3Τ3 細胞活性之基因型式被分離，鑑定（h s t -1; P r 〇 c. N a 11. Acad. Sci· USA，83:3997-4001，1986 )，其後明白與纖維芽 細胞增殖因子（F G F )具有相同性，爲第4 F G F族的 成員（FGF4)。現在，已知FGF1〜20之20種 F G F 族。 F G F 4/H S T 1蛋白質被報導爲具有訊號胜肽之 分泌性蛋白質，爲對於纖維芽細胞、血管內皮細胞具有細 胞增殖促進作用、血管新生作用。巨核細胞之增殖、分化 促進、促進巨核細胞分泌細胞激動素、促進巨核細胞與內 皮細胞之接合、於生體外誘導末梢血小板數的上升、經由 化學療法劑投與、放射線照射令於血小板減少症模型經由 事前投與改善血小板減少及恢復期間的縮短化、經由事前 投與照射致死量之放射線提高生存率等之活性。 FGF4/HST1基因對於基因治療的應用，已嘗 試將嵌入該基因之腺病毒載體，應用於動脈硬化所造成之 慢性的安定型狹心症（Collateral Therapentics公司）。 於本發明中，該核酸爲經由被導入細胞，而以可在此 細胞內表現機能之型態供使用。例如於D N A之情況，令 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-12- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 1267380 A7 ___^B7 五、發明說明（1〇 ) 該D N A於導入細胞內轉錄，並且經過產生其所編碼之多 肽而表現機能地配置該D N A之質體型式供使用。較佳爲 令啓動子區域、起始密碼子、編碼具有所欲機能蛋白質之 D N A、經止密碼子及終止區域連續排列。 視所欲亦可含有二種以上核酸之一的質體。又，視所 欲，亦可將二種以上之核酸個別與後述之水不溶性生物分 解性高分子結合，作成一個含核酸複合體。 節便上爲將該領域可取得之質體，利用適當限制酶部 位插入所欲之核酸則可調製。以欲導入核酸之鹼基序列爲 基礎，經由合成、半合成手段則亦可調製。 於本發明中，做爲導入核酸對象之所欲的「細胞」， 除了爲要求該核酸表現機能之細胞以外，以具有將細胞外 之異物攝入細胞內性質（吞噬作用）之細胞，即以後述之 巨噬細胞所代表之吞噬細胞爲佳。要求該核酸表現機能之 細胞例如可根據所使用之核酸（即其機能）而作出各種選 擇，其可列舉例如心肌細胞、骨骼肌細胞、血管內皮細胞 等。又，單球、樹狀細胞、巨噬細胞、組織球、枯氏細胞 、破骨細胞、滑膜A細胞、小膠細胞、朗氏細胞、類上皮 細胞、多核巨細胞等之吞噬細胞及白血球、纖維芽細胞和 某種上皮細胞（消化道上皮細胞、尿細管上皮細胞等）或 經由其吞噬作用而可有效率將含核酸複合體攝入其內部（ 含核酸複合體對於吞噬細胞的尋靶作用），且經由其標的 指向性而令核酸送達所欲部位（標的細胞對於吞噬細胞的 尋靶作用）爲佳。藉此’可將心臟、肌肉、血管、血液、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} ·壯衣

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-13- 1267380 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 五、發明說明（11 ) 骨髓、淋巴組織、締結組織、肝臟、骨、滑膜、神經、皮 膚、發炎組織、癌組織等所有之臟器、組織做爲基因的導 入對象。 於本發明中，所謂「生物分解性高分子」爲意指經由 生體所具有的生理活性物質，例如酵素等之作用方令該高 子水解者。更具體而言可列舉殼多糖、奎尼酸、透明質酸 、藻酸、澱粉、果膠等之多糖類、明膠、膠原、原纖蛋白 、白蛋白等之蛋白質及其衍生物’且較佳爲明膠或其衍生 物。於本發明中，所謂「生物分解性高分子之分解」爲如 上述，意指經由生體所具有之酵素等生理活性物質的作用 和非醇素作用而被水解。 此處所謂之「衍生物」爲意指修飾成適於形成含核酸 複合體之型式，具體而言可列舉後述導入胺基的胺基衍生 物。 該生物分解性高分子之來源並無特別限定，可使用以 人類爲首之豬、牛等各種動物。其可爲天然取得，且亦可 使用微生物經由醱酵法而取得。於人類之應用，特別於使 用於基因治療時，鑑於抗原性及微生物感染之危險性，以 來自人類爲佳。 於本發明中，於期待來自含核酸複合體之核酸之更優 良的緩釋性時，較佳令形成核酸與複合體之生物分解性高 分子爲水不溶性。此處所謂水不溶性，爲意指經由分子間 的化學性或物理性交聯而賦與在水中不溶解之性質，且根 據日本藥典之規定時，爲意指稍微難溶解〜完全不溶解之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

14- A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制农 1267380 ——___B7____ 五、發明說明（12 ) 狀態。 該生物分解性高分子若爲可形成核酸與複合體者即可 ，並無特別限定，特別於期待緩釋性釋出之情形中，則以 可形成安定含核酸複合體之帶正電荷者爲佳。該正電荷之 程度，通常期待可與帶負電之核酸形成聚離子複合體之程 度。該聚離子複合體之形成可根據分別以水溶性狀態於水 中混合所得之混合液混濁度之上升則可確認。 核酸所具有之負電荷、與生物分解性高分子所具有之 正電荷爲強力結合（離子結合），而形成安定的含核酸複 合體。於本發明中’利用未帶正電荷、或幾乎不帶正電何 之生物分解性高分子之情形中，經由預先導入胺基等予以 陽離子化亦可。又，即使對於已帶正電荷之生物分解性高 分子，亦可經由導入胺基等之正電荷基而令正電荷變強’ 增加與核酸之結合力，並可形成更安定的含核酸複合體。 該陽離子化可依先前公知的方法進行。 陽離子化之工程若爲在生理條件下，可導入陽離子化 官能基之方法即可，並無特別限定，但較佳爲於生物分解 性高分子之羥基或羧基中，將胺基或銨基於溫和條件下導 入之方法。例如將乙二胺、N，N —二甲基—1 ，3 —二 胺基丙烷等之烷基二胺和三甲基銨乙醯肼、精胺、精脒或 二乙基醯胺氯化物等，使用各種縮合劑、例如1 一乙基-3 -（3 -二甲胺丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽、氰尿醯氯、 N，N / -碳化二咪唑、溴化氰、二環氧化合物、甲苯磺 醯氯、二乙基三胺一 ，ΝΧ/ —戊酸二 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-15- 1267380 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 五、發明說明（13 ) 酐等之二酐化合物、三苯甲基氯等進行反應之方法。其中 亦以乙二胺反應之方法爲簡便且具有活用性故爲佳。 於本發明中，「導入正電荷基」之工程爲意指將生物 分解性高分子，於生理條件下導入陽離子化官能基，且具 體而言，將上述之官能基導入該生物分解性高分子中。 更且，本發明以可將核酸控制緩釋之該生物分解性高 分子，經由交聯處理等作成水不溶性性爲佳。一般，許多 的生物分解性高分子爲水溶性，故所得之含核酸複合體亦 爲水溶性，投與生體時，核酸爲一次性地由該複合體中釋 出，難以安定且局部持續的供給核酸。本發明爲經由使用 將水不溶化者做爲生物分解性高分子，則可根據該生物分 解性高分子於生體的分解性而自由控制核酸之釋出。即， 核酸之緩釋速度可根據生物分解性高分子的分解而控制。 而且經由緩釋化，則可令該含核酸複合體於局部的基因表 現效率提高。 本發明所使用之水不溶性生物分解性高分子較佳爲經 由交聯處理，進行水不溶化之明膠水凝膠，更佳爲含水率 85〜99%之明膠水凝膠。 生物分解性高分子之交聯化可依據先前公知之方法進 行。具體而言，可列舉使用交聯劑之方法，熱處理法或使 用紫外線之方法等。 交聯劑可根據所使用之生物分解性高分子之種類，而 選取適當之物質，通常爲使用甲醛、戊二醛、水溶性碳化 二亞胺〔1 一乙基一 3 —（3 —二甲胺丙基）碳化二亞胺 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ---------訂-------- -16- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1267380 A7 _____B7 _ 五、發明說明（14 ) 鹽酸鹽、1 一環己基一 3 —（ 2 —嗎啉乙基）碳化二亞胺 一對-甲苯磺酸酯等〕、表氯醇、二環氧化合物〔雙環氧 二甘醇、1 ，4 一雙（2，3 -環氧丙氧基）一丁烷等〕 等之交聯劑。交聯反應中之生物分解性高分子濃度爲1〜 3〇重量％、較佳爲5〜1 0重量％，交聯劑之濃度爲 1 〇 — 3〜1 0重量％、較佳爲1 〇一2〜1重量％，於0〜 4 0 °C，較佳爲2 5〜3 0 t：下進行1〜4 8小時，較佳 爲12〜24小時反應。 生物分解性高分子之交聯亦可經由熱處理而進行。關 於熱交聯之方法爲以明膠情況爲例，於下具體說明。 將明膠水溶液（1 0重量％左右爲佳）於塑膠皿上流 涎，風乾取得明膠薄膜。將此薄膜於減壓下，較佳爲1 〇 mmHg左右且通常於1 1〇〜160°C，較佳爲1 20 〜1 5 0 °C下，通常放置1〜4 8小時，較佳爲6〜2 4 小時。 又，經由紫外線將該明膠薄膜交聯時，乃將所得之明 膠薄膜於殺菌燈下通常以室溫，較佳爲0〜4 0 °C下放置 〇 所使用之明膠可將溶解性、安定性及泡脹性等物性不 同之明膠混合使用。另一方面，調製之交聯明膠可爲單一 或視需要混合物性不同之物質亦可。 本發明之含核酸複合體中所含之帶正電荷水不溶性生 物分解性高分子，除了可於該複合體中含有單獨一種具有 上述特徵之生物分解性高分子以外，亦可於該複合體中含 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)

-17- 1267380 A7 B7 五、發明說明（15 ) 有混合二種以上生物分解性高分子（包含單純混合相同之 含核酸複合體）之狀態，又，亦可將二種以上之生物分解 性高分子預先進行化學鍵結後，被包含於該複合體中。任 何態樣均被本發明所包含。 於二種以上之生物分解性高分子預先進行化學鍵結後 ，被包含於該複合體中之情形中，可將各生物分解性高分 子個別作成水不溶性後進行化學鍵結，或令各生物分解性 高分子以化學鍵結後進行水不溶化處理，但由處理之簡便 度方面而言，則以令各生物分解性高分子以化學鍵結後進 行水不溶化處理爲佳。 於本發明中，含有核酸與帶正電荷之水不溶性生物分 解性高分子之複合體，經由將上述之核酸與帶正電荷之水 不溶性生物分解性高分子混合則可簡單地調製。核酸與帶 正電荷水不溶性生物分解性高分子之份量比爲根據所使用 之生物分解性高分子的正電荷程度而異，但通常爲使用過 量之核酸，並將生物分解性高分子爲以核酸予以飽和之狀 態下供使用。 更具體而言，於調製交聯明膠凝膠內含有核酸之含核 酸複合體時，可在明膠之5〜3 0重量％水溶液中直接添 加交聯劑調製成交聯明膠凝膠’或者於交聯劑水溶液中將 未交聯之明膠凝膠予以浸漬所調製的交聯明膠凝膠’直接 於含核酸溶液中浸漬’或者將交聯之明膠凝膠予以乾燥後 ，於含核酸溶液中再泡脹則可調製。 強力帶負電之核酸爲與帶正電之生物分解性高分子以 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

---------訂-----I I I I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -18- A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1267380 -----B7__ 五、發明說明（16 ) 離子鍵結形成複合體。於此類本發明複合體中，其特徵爲 內部困住的核酸爲經由酵素等之作用，將生物分解性高分 子予以分解而由該複合體中釋出。以D N A做爲核酸之例 爲於圖1中示出該複合體的模式圖。 於複合化時，根據所得含核酸複合體之安定性和核酸 釋出持續性，所釋出之核酸的機能表現等目的，視需要亦 可加入其他成分。其他成分可列舉例如胺基糖或其高分子 量體和奎尼酸寡聚物、鹼性胺基酸或其寡聚物和高分子量 體、聚烯丙胺、聚二乙胺基乙基丙烯醯胺、聚乙二亞胺等 之鹼性高分子等。更且，經由在臟器專一性表現受體所結 合之配位蛋白質或標的中加入專一性抗體，則可令含核酸 複合體送達到所欲部位，進而於局部釋出核酸。 本發明爲再關於令帶正電荷之水不溶性生物分解性高 分子中含有核酸，並且釋出核酸爲其特徵之控制核酸釋出 速度的方法。 於本發明之控制核酸釋出速度之方法中所使用的核酸 ，及帶正電荷之水不溶性生物分解性高分子可列舉上述物 質。 該複合體中所含之核酸爲經由水不溶性生物分解性高 分子於生體內的分解，而慢慢釋出至複合體外部（即分解 控速型之釋出）。由可更加控制速度方面而言，以該釋出 爲僅經由該生物分解性高分子而進行爲佳。此釋出速度爲 與所使用之生物分解性高分子之生物分解性程度（例如亦 受到該生物分解性高分子之含水率等所影響），及該複合 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

-19- A7 1267380 _____B7_ 五、發明說明（17 ) 體內核酸與生物分解性高分子之結合強度的程度、安定性 均具有密切關連，經由正負電荷之平衡則可控制其釋出速 度。通常，使用愈富正電荷之生物分解性高分子時’則愈 可提高所得含核酸複合體內之核酸的保持性’並且由水溶 性生物分解性高分子分解控制核酸緩釋性方面而言爲佳。 於生物分解性高分子的正電何不足時’可如上述於該局分 子中再導入胺基等，將其陽離子化並且提高正電荷。 本發明爲再提供含有含核酸與生物分解性高分子之含 核酸複合體之吞噬細胞。其爲根據該複合體爲可被輕易攝 入免疫系中擔任重要職務的吞噬細胞中（含核酸複合體對 於細胞的尋靶作用）、且經由吞噬細胞所具有的游走能力 而被搬運至標的部位（吞噬細胞對於標的部份的尋靶作用 )，即根據可於所欲部位輕易且安全的表現核酸機能之新 發現。本發明所用之吞噬細胞若爲具有吞噬作用，且對於 病變部位（例如發炎部、癌組織等）具有游走能力之細胞 即可，並無特別限定，可列舉例如巨噬細胞、單核細胞等 。又，樹狀細胞、組織球、枯氏細胞、破骨細胞、滑膜A 細胞、小膠細胞、朗氏細胞、類上皮細胞、多核巨細胞等 較佳爲使用不缺乏游走能力者。含有核酸與生物分解性高 分子之含核酸複合體，可經由上述吞噬細胞的吞噬作用而 輕易地被困入該呑噬細胞中。該含核酸複合體於該吞噬細 胞中的困入作用，可依據使用目的，以原位（in situ )、 生體外任一種均可進行。 此處所用之含核酸複合體中所含的核酸’及生物分解 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --I-----訂---------

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -20- 1267380 A7 B7 五、發明說明（18 ) (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 性高分子可列舉同上述之物質。關於該生物分解性高分子 之電荷性，溶解性只要對生體不會造成不良影響即可，並 無特別限定，但由吞噬細胞攝入之容易度，其效率之良好 性及其速度遲早之觀點而言，則以水不溶性爲佳，又’由 期望可確實搬運並強力結合核酸之觀點而言，則以帶正電 荷爲佳。「水不溶性」及「帶正電荷」用語之意義爲如前 述。 含有含核酸與生物分解性高分子之含核酸複合體之吞 細胞除了於實驗目的使用以外，亦可適合使用做爲醫藥 。即，於生體外調製含有含核酸複合體之吞噬細胞後’將 所得之吞噬細胞於生體中投與，並且利用吞噬細胞對於病 變部位聚集性之特性，則可在標的部位令來自所欲核酸的 基因資料表現出來。 本發明爲再提供至以包含（i )將含有核酸與生物分 解性高分子之含核酸複合體攝入呑噬細胞中之過程、（ i i )該核酸於該吞噬細胞內誘導表現之過程、及（ i i i )令該吞噬細胞到達標的部位之過程之於標的部位 專一性地表現核酸機能之方法。以下，說明每個過程 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (i )將含有核酸與生物分解性高分子之含核酸複合體攝 入吞隨細胞中之過程 該過程爲如前述，經由呑噬細胞本來所具有的吞噬作 用，將含核酸複合體攝入則可達成。該過程爲預先於生體 外，將該含核酸複合體與吞噬細胞混合’或者’將該含核 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -21 - 1267380 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（19 ) 酸複合體投與至生體中，利用生體內吞噬細胞的攝入則亦 可實施。生體外之含核酸複合體與吞噬細胞之混合比，若 爲可令吞噬細胞攝入該含核酸複合體即可，並無特別限定 ’通常，加入過量的含核酸複合體則可達成。對於生體投 與含核酸複合體、或將生體外調製之吞噬細胞對於生體之 投與，可依據後述本發明之含核酸複合體及醫藥之投與方 法進行。特別於生體投與本發明之吞噬細胞（攝入含核酸 複合體者）之情形中，必須依舊維持吞噬細胞活動的處理 ’具體而言可採取骨髓移植或免疫療法之手法。更具體而 言，投與方法之代表例爲如下列。（a )於病變部或其附 近組織內投與。（b )於體腔（心膜腔、胸腔、腹腔、腦 脊髓腔）內投與。（c )於支配病變部之血管內、淋巴組 織內投與。（d )於病變部所分離之血管或皮膚、脂肪、 骨骼肌組織內投與。任何情況均經由吞噬細胞所具有之游 走能力，而可期待病變部比投與部更具效果。 (i i )核酸於呑噔細胞內誘導表現之過程 該過程可使用通常該領域所進行之手法進行。即，經 由導入吞噬細胞則可於細胞內表瑰機能之型態（上述）下 ，以包含核酸型式進行。特別於本發明中，因爲以與生物 分解性高分子複合體化之含核酸複合體型態下，令該核酸 被攝入吞噬細胞中，故可經由該含核酸複合體之生物分解 性所控制之核酸的緩釋，而促進該核酸於細胞內之導入效 率及核酸於細胞內的表現。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝---- ·11111111

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -22- 1267380 Α7 Β7 五、發明說明（2〇 ) (i i i)令吞噬細胞到達標的部位之過程 該過程可藉由吞噬細胞之游走能力而輕易進行，且爲 安全。較佳根據標的部位而適當選擇吞噬細胞。例如於欲 對於癌組織和發炎組織進行尋靶作用時，可適當使用吞噬 細胞、類上皮細胞、多核巨細胞，對於血液進行尋靶時可 使用單核細胞，對於骨髓和淋巴組織進行尋靶時可使用樹 狀細胞，其他對於締結組織可使用組織細胞、對於肝藏可 使用枯氏細胞、對於骨可使用破骨細胞、對於滑膜可使用 滑膜A細胞、對於神經可使用小膠細胞、對於皮膚可使用 朗氏細胞。又，經由對於各種臟器表面投與該吞噬細胞’ 則可令核酸（該吞噬細胞所承載者）運送至臟器深部。 本發明爲再提供利用如上述吞噬細胞之吞噬作用之含 核酸複合體的攝入，及利用該吞噬細胞之游走能力送達標 的部位之新穎的基因治療用醫藥。.該醫藥爲以含有核酸與 生物分解性高分子之含核酸複合體做爲有效成分’且其各 個意圖範圍爲如上述。 本發明之含核酸複合體可依任意方法投與生體’但爲 了核酸可於目的特定部位持續且局部性釋出，則以非經口 性投與爲特佳。該複合體再視需要可與製劑上容許載體（ 安定劑、保存劑、可溶化劑、P Η調整劑、增粘劑等）混 合，則可調製以本發明之含核酸複合體做爲有效成分的醫 藥。此些載體可使用公知物質。更且，亦可含有調節緩釋 效果的各種添加劑。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -----I--訂·--------· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -23- 1267380 A7 B7 五、發明說明（21 ) 以本發明之含核酸複合體做釋有效成分之醫藥，亦包 含含有二種以上所含核酸種類不同之含核酸複合體。兼倂 具有此類複數治療目的之醫藥，特別有用於多樣化基因治 療之領域。 本發明之含核酸複合體可依據目的製劑化成各種形狀 。其可列舉例如粒狀、圓和角柱狀、薄片狀、圓盤狀、糊 狀等之固形、半固形製劑、或懸浮劑和乳劑等之注射劑。 較佳爲於目的特定部位之緩釋效果優良，且適於局部投與 的固形製劑。例如，製成薄片狀之本發明含核酸複合體爲 適於固定在局部血管的內壁。更具體而言，可列舉在動脈 形成術用之移植片固定模（Stent )中捲入該薄片狀之含核 酸複合體，並以套管將該移植片固定模插入任意的分枝血 管’並於局部血管內使得氣囊（balloon)膨脹，將含核酸 複合體固定於血管內壁之方法。該方法可於固定部位之血 管壁本身導入基因，並且對於固定部位末梢區域進行選擇 性的基因治療（對於癌症之基因治療，例如抗血管新生療 法、或對於循環損害之基因治療，例如血管新生療法等） 〇 注射劑可對肌肉內、脂肪組織內、皮下、皮內、靜脈 內、淋巴管內、淋巴節內、動脈內、體腔（心膜腔、胸腔 、腹腔、腦脊髓腔等）內、骨髓內等進行投與，較佳爲於 肌肉內投與。亦可對於病變組織內直接投與。 固形、半固形製劑之情況可列舉對期待核酸釋出之部 位直接埋入該製劑之方法、將糊狀製劑注入注射器之方法 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) · I I I I I I I 訂· — — — — — —--

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -24- 1267380 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（22 ) 、將粒狀製劑以懸浮注射予以注入之方法、經皮經管地插 入套管、並且透過其附著於移植片固定模之複合體留置於 血管內之方法、將複合體之微粒子（約數微米〜約1 5微 米）以套管注入並且於期待部位釋出核酸之局部存在方法 等。 本發明於製劑化時，更期望經過除菌過濾等之無菌化 工程。 若根據本發明，則投與動物、特別爲投與人類之用量 爲根據目的核酸、所使用之生物分解性高分子、投與方法 及所治療之特定部位等各種要因而變化。但是，其投與量 必須爲可充分造成治療上之回應。 本發明之含核酸複合體較佳爲適用於基因治療。可應 用之疾病爲根據該複合體所含之核酸種類而異，其除了可 末梢動脈疾病、冠狀動脈疾病、動脈擴張術後再狹窄等病 變所產生之於循環器領域中的疾病以外，亦可爲癌症（惡 性黑色腫瘤、腦腫瘤、轉移性惡性腫瘤、乳癌等）、感染 症（Η I V等）、單一遺傳病（囊胞性纖維症、慢性肉芽 腫瘤、α 1 —抗胰蛋白酶缺損症、Gancher病等）等。 更具體而言，於使用纖維芽細胞增殖因子基因，尤其 是序列表序列編號1所記載之鹼基序列所構成之D N A做 爲該複合體中所含之核酸時，上述FGF 4/HST 1蛋 白質所具有之生理活性可適用於治療各種疾病。 〔實施例〕 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） >裝---- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1111111 §# 25 - 1267380 A7 B7 五、發明說明（23 ) 爲了更詳細說明本發明，乃列舉出實施例及實驗例， 但本發明不被其所限定。 實施例1 (1 )胺基化明膠之製作 將等電點9 · 0之明膠（新田Gelatin (株））1克溶 解於5 0毫升之0 · 1 Μ磷酸緩衝液（p B，p Η 5 · 0 )中。其後，於此溶液中相對於明膠的羧基（分子量 1〇，000，羧基含量：95莫耳/明膠分子），加入 50倍莫耳量的乙二胺（分子量60 · 1)，再相對於羧 基加入5 0倍莫耳量之1 一乙基一 3 —（3 —二甲胺丙基 )碳化二亞胺鹽酸鹽（分子量1 9 1 · 7 )。將此混合溶 液於3 7 °C攪拌1 2小時。反應終了後，對水透析2日， 並且經由冷凍乾燥則可取得胺基化明膠。使用三硝基苯磺 酸鈉進行胺基的比色定量時，明膠之5 6 %羧基已被胺基 化。 (2 )粒子狀胺基化明膠水凝膠的製作 將預先於4 0 °C加溫之1 0 〇 m g / m 1胺基化明膠 水溶液（0 · 2毫升）投入5毫升之橄欖油中，並於4 0 °C以接觸混合乳化1分鐘。更且，於進行4 0秒鐘之超音 波乳化後立即以冰急冷，加入1 · 4 3毫升之丙酮，並以 離心（5，0 0 0 r p m，5分鐘，4 T：)回收未交聯粒子 。所得之粒子使用丙酮進行離心洗淨（5，0 〇 〇 r p m ’ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅？事項再填寫本頁) *裝 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -26- 1267380 A7 B7 五、發明說明（24 ) 5分鐘，4 °C )。其次’將所得之粒子懸浮於3 0微升之 2 5重量％戊二醛水溶液與2 0毫升之0 · 1重量％ Tween 8 0水溶液之混合水溶液中’且於4 °C攪拌4 0小時’將 該明膠粒子予以化學交聯。其後’將所得之粒子以離心分 離（5，0 0 0 r p m ’ 5分鐘’ 4 °C )回收。其次’以封 阻未反應醛基之目的下’將粒子於1 〇 〇 m M甘胺酸之 〇 · 1重量％Tween8 0水溶液（2 0毫升）中分散’且 於3 7 °C攬拌1小時。反應終了後，使用〇 · 1重量％ Tween 8 0水溶液（2回）及蒸餾水（3回）離心洗淨回收 粒子，並以丙酮充分沖洗後將粒子風乾。將乾燥粒子、及 於P B ( p Η 7 · 0 )中3 7 °C，1 2小時之條件下泡脹 之粒子大小，分別由顯微鏡照片中計測，且由其比評價含 水率時，爲9 8 · 6容量％ (粒子狀胺基化明膠水凝膠） 。又，所得粒子於乾燥時之平均大小爲1 〇 〇 // m (泡脹 時 2 0 0 // m )。 (3 )粒子狀胺基化明膠水凝膠結合D N A之製作 D N A爲使用於肌肉中特別具有活性高之啓動子 C A G ( chicken β — actin promoter; Gene, 108:193-200, 1991)之pCAGGS表現載體之E c 〇R I部位中插入 大腸桿菌1 a c Z基因結合所得之1 a c Z表現質體 DNA (pCAGGS— 1 a cZ ;以下單稱爲 1 a cZ 質體）（由大阪大學醫學部分子防禦醫學宮崎純一硏究室 所供給）。將該D N A以T 1 C 1 3予以放射標幟化並供使 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

· I I I I I 丨 I 訂-—--I I I I ·· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -27 A7 1267380 B7 _ 五、發明說明（25 ) 用。即，將5微升之Na125I溶液（740MBQ/ ml— 0 · IN Na〇 Η 水溶液中，NEN Research Prodncts，DuPont 公司製）與 0 · 3 mM N a 2 S 〇3 水溶 液（2微升）混合，並於2 5 °C，放置3 0分鐘。此溶液 中加入溶解5微克DNA之0 · 1M CH3C00Na-4 0 m M CH3C〇〇H混合溶液（ρΗ5 · 0) 5微升 ，再加入溶解0 · 3毫克τ 1 C 1 3之〇 · 2Μ CHsCOONa-l.〇mM CH3C〇〇H混合溶液 (pH4 · 0) 0 · 3毫升。其後，於60t：放置40分 鐘。其後，於此混合溶液中加入0 · 1毫升之0 . 1 m Μ Na2S〇3水溶液，及含有0 · 9毫升ImM EDTA 之 O.lmM NaCl — 5〇mM Tris— HC1 溶液（p H 7 · 0 )，且於6 0 °C加溫3 0分鐘。反應終 了後，將溶液冷卻，並以P D — 1 〇膠層析柱（Amersham-Pharmacza Biotech公司製）將放射碘化D N A與游離放射 化碘予以分離。其次，將此放射碘化D N A之水溶液1 〇 微升滴下至冷凍乾燥之粒子狀胺基化明膠水凝膠中，且於 2 5 °C放置1小時，令粒子於水溶液中含浸，取得含有放 射碘化D N A的複合體。 實施例2 於明膠水溶液（最終濃度5重量％ )中加入1 一乙基 一 3 -（ 3 -二甲胺丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽水溶液（最 終濃度1〇· 7mM)後，於15cmxl5cm之塑膠 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·裝 -------1T---------私 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -28- A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1267380 B7_______ 五、發明說明（26 ) 器皿中流入，於4 °C保持2 4小時，進行交聯反應。所使 用之明膠爲等電點4 · 9鹼處理明膠。反應終了後，由器 皿上將交聯明膠凝膠剝離，取得厚度爲2 0 0 // m之明膠 薄片。所得之薄片以水充分淸洗後，冷凍乾燥。將此乾燥 交聯明膠薄片於同實施例1處理調製之放射碘化D N A ( 1 a c Z質體）水溶液中放置1小時，取得含有放射碘化 D N A之交聯明膠薄片。 實驗例1 於粒子狀胺基化明膠水凝膠中攝入基因 確認於帶正電荷之水不溶性生物分解性高分子中攝入 核酸。 將含有5 0 0 // g/m 1濃度1 a c Z質體之水溶液 ，與實施例1 ( 2 )所調製之粒子狀胺基化明膠水凝膠混 合，並以紫外線吸光度法（波長：2 6 0 n m )經時計測 水溶液中之1 a c Z質體濃度。對照組爲使用水（不含有 1 a c Z質體）。結果示於圖2。 水溶液中之1 a c Z質體爲於1小時以內迅速地被攝 入粒子狀胺基化明膠水凝膠中（水溶液中之1 a c Z質體 濃度降低）。此類水溶液中之1 a c Z質體濃度之降低爲 於以後2 4小時持續降低，可知該1 a c Z質體爲持續吸 附於明膠水凝膠。 參考實驗例1 粒子狀胺基化明膠水凝膠之生體內分解性 確認本發明之含核酸複合體構成要素之粒子狀胺基化 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁)

-29- 1267380 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（27 ) 明膠水凝膠爲生體內分解性。 將1 2 5 I - Bolton-Hunter試藥之無水苯溶液（N E N —12〇X、 147MBq/ml —無水苯中、NEN Research Products, DuPont公司製）於試管中裝入〇 · 1毫 升，並以氮氣吹氣，令苯蒸發。於此試管中加入以1 0毫 克/毫升濃度分散實施例1 ( 2 )調製之粒子狀胺基化明 膠水凝膠之蒸餾水5毫升，且於4 °C攪拌1 2小時，將該 明膠水凝膠予以放射碘化。所得之放射碘化粒子狀胺基化 明膠水凝膠使用蒸餾水離心洗淨（5，0 0 0 r p m，5分 鐘，4 °C )，除去未參與標幟化之1 2 5 I — Bolton-Hunter 試藥。最終，將粒子以0 · 1 Μ磷酸緩衝生理食鹽水溶液 (PBS，ρΗ7 · 0)調製成0 · 5毫克/毫升之濃度 〇 將所得之放射碘化粒子狀胺基代明膠水凝膠，於 d d Υ鼠（由淸水實驗材料股份有限公司購入，母鼠6週 齢）之右大腿肌肉內投與（每鼠0 · 1毫升）。於經過指 定時間後，切除右大腿肌肉，並測定其放射活性，與初期 之投與放射活性比較，評價殘存放射活性。關於各實驗條 件爲各以3隻進行實驗。結果，確認粒子狀胺基化明膠水 凝膠爲於生體內經時分解，爲生體分解性。 實驗例2 D N A之生體內殘存性的評價

將參考實驗例1同樣處理調製之放射碘化粒子狀胺基 化明膠水凝膠，或實施例1 ( 3 )調製之放射碘化D N A 本紙張尺度適財國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱) " (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) --------訂· ------- Π •30- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1267380 A7 广 _B7 五、發明說明（28 ) 所含浸之粒子狀胺基化明膠水凝膠分別以〇 . 1毫升之 P B S分散後，分別投與d d Y鼠（由淸水實驗材料股份 有限公司購入，母鼠6週齡）之右大腿肌肉內。對照組爲 於放射碘化D N A水溶液1 0微升中加入9 0微升P B S 後，投與鼠的右大腿肌肉。實驗動物數爲於各實驗條件中 使用3隻，殘存放射活性爲以其平均値土標準誤差表示。 結果示於圖3。 . 由於明膠粒子之殘存放射活性爲隨著時間而慢慢減少 ，故粒子於體內分解，即可知其爲生物分解性（-籲-） 。另一方面，明膠水凝膠中所含浸之D N A的殘存放射活 性亦隨著時間減少，且此時間經過爲與粒子狀胺基化明膠 水凝膠本身之殘存放射活性相同分布型式-）。此 顯示隨著粒子之分解，令D NA爲由粒子中被緩釋出來。 尙，將D N A以水溶液型式投與時，殘存放射活性爲急速 減少（一 △一）。此顯示D N A並非於投與部位停留且迅 速地被排泄或代謝。 實驗例3 粒子狀胺基化明膠水凝膠結合D N A的基因表 現 除去家兔的大腿動脈，作成下肢缺血模型。1 0曰後 對缺血部肌肉內投與1 a c Z質體，且於投與後經過2週 時，對於缺血部肌肉組織進行L a c Z染色，調查基因表 現的樣子。結果示於圖4。 對於投與實施例1 ( 3 )所調製之直徑2 0 0 # m ( (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 訂--------- Φ— 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -31 - A7 1267380 ____JB7___ 五、發明說明（29 ) 泡脹時）粒子狀胺基化明膠水凝膠結合1 a c Z質體（ lacZ質體之份量500微克：圖4A)，未與粒子狀 胺基化明膠水凝膠結合之裸露狀態（naked ) 1 a c Z質體 (5 0 0微克，對照：圖4 B )之情況進行調查。又，對 於投與同樣處理且1 a c Z質體份量減至1 / 1 〇之粒子 狀胺基化明膠水凝膠結合1 a c Z質體之情況亦進行調查 (lacZ質體之份量50微克：圖4C)。 L a c Z染色爲如下處理進行。 1 ·將標本以3 7 %甲醛一 2 5 %戊二醛混合溶液於 4 °C固定5分鐘。 2 ·以P B S洗淨（3回）。 3.以染色液（1毫克/毫升X— gal、5 m Μ 六氰鐵（I I I )酸钾、5 m M六氰鐵（I I )酸鉀、 1 M氯化鎂）染色。 與1 a c Z質體單獨投與相比較，於投與粒子狀胺基 化明膠水凝膠所結合之1 a c Z質體時可確認更廣範圍的 基因表現（A與B之比較）。 又，與粒子狀胺基化明膠水凝膠結合之1 a c Z質體 ，其投與量即使減少1 / 1 0亦可觀察到有意義的基因表 現。 參考實驗例2 使用腺病毒載體情況的基因表現 使用與實驗例3同樣的家兔下肢缺血模型，並調查使 用腺病毒載體之基因導入 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·裝 -·ϋ ·ϋ ·ϋ Βϋ n 1 一 ^OJ n ϋ n ϋ -ϋ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -32· 1267380 A7 B7 ------------ 五、發明說明（3〇 ) 投與1 X 1 09P f U之嵌入1 a c Z基因之腺病毒載 體（由東京大學醫科學硏究所、齊藤泉硏究室所提供）之 情況，於投與後3日則可察見比1 a c Z質體單獨投與及 粒子狀胺基化明膠水凝膠所結合之1 a c Z質體投與情況 更強的1 a c Z表現（圖5 A )。但是，於投與後2週則 該基因表現爲有意義地減弱（圖5 B)。 實驗例4 於家兔下肢缺血模型中的血管新生 使用與實驗例3同樣之家兔下肢缺血模型，調查投與 纖維芽細胞增殖因子F G F 4 / H S T 1質體所造成之新 生血管形成。 除了所使用之核酸爲FGF4/HST1質體（ 5〇0微克或5微克）此點以外，同實施例1處理調製粒 子狀胺基化明膠水凝膠結合F G F 4 / H S Τ 1質體。該 質體爲使用於pRc/CMV2載體（INVITORGEN公司 )之Hind III部位插入結合F G F 4 / H S Τ 1基因（序列 表序列編號1 )所得之F G F 4 / H S Τ 1表現質體 DNA (以下單稱爲FGF4/HST1質體）。 對照組爲使用裸露狀態（naked )之F G F 4 / HST1質體（ 5 0 0微克），與其明膠水凝膠所結合之 lacZ質體（500微克）。 於下肢缺血模型作成1 0日後，以上述態樣將各種質 體於缺血部肌肉內進行肌肉注射，且於投與後經過2週， 進行新生血管之造影（X射線攝影）。結果示於圖6。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） f請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁}

_ · 11 I I 11 I 訂-—- ----— II 0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -33- 1267380 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（31 ) 圖6 A及圖6 B爲示出投與粒子狀胺基化明膠水凝膠 結合 FGF4/HST1 質體（FGF4/HST1 質體 之份量於A爲投與5 0 0微克，B爲投與5微克）情況之 結果，圖6 C爲示出投與粒子狀胺基化明膠水凝膠結合 1 a c Z質體（5 0 〇微克，對照）情況之結果’圖6 D 爲示出投與（naked ) FGF4/HST1質體（500微 克，對照）情況之結果。經由令F G F 4 / H S T 1質體 與粒子狀胺基化明膠水凝膠結合投與，則比裸露狀態投與 新生成更多之血管，顯示令F G F 4/H S Τ 1質體的表 現機能增強（圖6 Α與圖6 C、D之對比）。又’即使將 投與量減至1/100亦可察見此效果（圖6B)。又’ 投與非裸露狀態而爲結合明膠水凝膠之F G F 4 / H S Τ 1質體，則可令該質體局部性地以高效率作用。 使用VEGF165質體（5 00微克）代替FGF4 / H S Τ 1質體之實驗亦可取得同樣之結果。 V E G F 165質體爲由東京大學涉谷正史先生所提供。該 質體爲於PCAGGS表現載體之Xho I部位插入結合 VEGF165基因所得者。 實驗例5 對於家兔動脈壁導入基因 (1 ) 1 a c Z 質體 將實驗例2調製之乾燥交聯明膠之薄層薄片安裝於不 銹鋼製移植片固定模（Synthesis; Cardio Vascular Dynamics，Inc.)。將5〜1 0微克/微升之1 a c Z質體 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ♦裝 -34- 1267380 A7 B7 五、發明說明（32 ) 溶液滴下至該交聯明膠薄層薄片並於2小時之間，令其不 會乾燥地重覆滴下（合計滴下約5 〇〜1 〇 〇微升）。藉 此令該交聯明膠與1 a c Z質體結合。將塗層此交聯明膠 之移植片固定模植入家兔的腸骨動脈。5日後取出腸骨動 脈並包埋於Tissue-Tek (R) O.C.T. Compound內，於液態氣 氣下固定後，於- 8 0 °C保存直到使用爲止。將固定薄片 製作薄切切片，並進行蘇木精-洋紅（Η E )染色、 D A Β 染色（二胺基聯苯胺（diaminobenzidine )、 X g a 1染色。結果示於圖7。 於血管平滑肌層更外層察見1 a c Z的表現，並確認 巨噻細胞攝入質體及其表現。 (2) VEGF165 質體 根據上述（1 )同樣之方法，將1〜2微克/微升之 VE GF165質體滴至交聯明膠薄層薄片5 〇〜i 〇 〇微 升。經由免疫組織化學染色法（一級抗體爲使用抗人類 VEGF IgG 餾分（Austral Biologicals 公司））確認 該質體爲呈表現。 實驗例6 根據放射光微小血管造影法檢討新生血管網的 成熟度 (1 )質體之投與 於具有下肢缺血之家兔（同實施例3 )的病側下肢大 腿肌肉內，將含有未結合交聯明膠之裸露狀態（naked )的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝—— II---------Φ— 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -35- 1267380 A7 ________B7_ 五、發明說明（33 ) V E G F i 6 5質體5 0 0微克之水溶液於直視下投與。 又，於具有下肢缺血之家兔的病側下肢大腿肌肉內， 將含有結合直徑的2 0 0 // m粒子狀交聯明膠4毫克之 V E G F 165質體5 0 0微克之生理食鹽水於直視下投與 〇 (2 )腺苷負荷 腺苷爲以1 0 0微克/公斤/分投與至腹部大動脈。 (3 )測定及結果 對於（naked ) V E G F : 6 5.質體投與例及明膠水凝膠 結合V E G F i 6 5質體投與例，根據放射光微小血管造影 法（空間解像度2 5微米）測定其新生血管網之成熟度。 (naked ) V E G F i 6 5質體投與時之結果示於圖8，明膠 水凝膠結合V E G F i 6 5質體投與時之結果示於圖9。於 (naked ) V E G F i 6 5質體投與例中，與基線（腺苷非負 荷時）比較則腺苷負荷時（血管擴張時）之血管密度減少 。另一方面，於明膠水凝膠結合V E G F i 6 5質體投與例 中，腺苷負荷時之血管密度明顯增加。於明膠水凝膠結合 V E G F i 6 5質體投與例中，基線之血流爲被抑低，於腺 苷負荷時則顯示動員到血管擴張預備能力。另一方面，於 (naked) V E G F 165質體投與例中’基線之血流並未被 抑低，於腺苷負荷時則顯示無動員到血管擴張預備能力。 於控制血流與腺苷負荷時之血管擴張中’新生血管中之血 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ! 11 I — I 訂·！1!11 Η 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -36- 1267380 A7 ____ B7 ___ 五、發明說明（34 ) 管平滑肌和神經、體液性調節機構等血管系之成熟爲不可 或缺，可知經由投與明膠水凝膠結合V E G F i 6 5質體則 可將其適當實現。 參考實驗例3 經由巨噬細胞攝入含核酸複合體 於生體外調製含有含核酸複合體之巨噬細胞。首先， 於鼠腹腔內注射硫乙醇酸酯，並於4日後採集巨噬細胞。 另外，令實施例1所調製之交聯明膠粒子結合2毫克之綠 色螢光蛋白質（green fluorescence protein，GFP )質體 100微克。該質體爲將GFP之cDNA (由clontech公 司購入）插入結合Η I V - C S載體的多克隆位點（ m u 11 i c 1 ο n i n g s i t e )所調製。將此交聯明膠粒子—G F Ρ質 體與採集之巨噬細胞混合，且於3 3 °C之P B S中培養4 日。培養4日後，以螢光顯微鏡及螢光活性化細胞分選儀 (FACS; fluorescence activated cell sorter )確認 G F P 之 螢光。結果示於圖1 0。於巨噬細胞察見螢光，確認攝入 交聯明膠粒子- G F P。同樣之結果於使用浸在洋紅染色 液之交聯明膠粒子之實驗中亦可確認（於巨噬細胞內確認 洋紅粒子）。 實驗例7 對於樹狀細胞的基因導入及C T L對於特定抗 原的誘導 於人類末梢血所分離之樹狀細胞（〇 C )中投與 G F P質體並且調查抗原提示能力。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 37- 1267380 A7 ____B7 _ 五、發明說明（35 ) 除了所使用之核酸爲GF P質體（上述，2 0微克） 此點以外，同實施例1處理調製粒子狀胺基化明膠水凝膠 結合G F P質體。 由建康人單核球（單核細胞）中取得C D 1 4陽性部 分，於人類混合血淸/ R Ρ Μ I培養基中加入G Μ -CSF與I L 一 4，誘導DC。經過4〜6日後，將粒子 狀胺基化明膠水凝膠結合G F P質體加至D C中。放置 6〇分鐘並且除去該明膠水凝膠後，再培養3日。培養後 之DC以DC標記物CDla—PE及CD83 — PE予 以染色，並以F A C S解析調查基因對於D C的導入效率 。結果示於圖1 1。對照組爲使用裸露狀態（naked )之 GFP質體（20微克）。基因導入效率爲77%。 於使用W T 1質體代替G F P質體之情況亦取得同樣 高之基因導入效率。 更且，導入該WT 1基因之D C爲基因產物是否具有 抗原提示能力，乃根據C T L誘導能力進行測定。對於將 透導D C之相同健康者的T淋巴球，與導入該WT 1基因 之D C共同培養所得之活性化T淋巴球，使用以5 1 C r標 幟之標的細胞，進行C T L分析。對於導入之W T 1誘導 出CTL，顯示該WT1基因導入DC的抗原提示能力。 〔發明之效果〕 若根據本發明，則經由核酸所具有之負電荷與生物分 解性高分子所具有之正電荷之安定強力結合，形成複合體 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ·裝

n ϋ 1 1 ϋ 一一口、I ϋ I ϋ ϋ ϋ ϋ ϋ I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -38- 1267380 A7 B7 __ 五、發明說明（36 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 。核酸之釋出爲經由此生物分解性高分子於生體內之分解 所控制，故比先前緩釋製劑所見般之單純擴散所造成之緩 釋，及使用水溶性生物分解性高分子情況之一次性的核酸 釋出，更可控制精密的釋出速度。又，可改善更長期間之 釋出，即改善緩釋性。 又，於本發明之含核酸複合體中，本複合體爲不溶的 ，且因爲可防止核酸受到生體內之分解，故可令核酸於到 達表現所欲機能部位爲止可維持保有充分活性之狀態，令 核酸可局部表現。即在必要治療之部位可進行限定的基因 治療。 更且，因爲經由所使用之生物分解性高分子種類，正 負電荷之平衡而控制核酸釋出速度，故釋出速度爲一定， 於製劑化時並不需要特別注意其形狀。 長期持續令核酸於局部釋出，於基因治療領域中爲特 別有用。使得目的基因可長期於必要治療部位，或於生體 中投與，並且令基因之導入、其後之基因表現、機能表現 上最適之核酸導入時期、捕捉時機的機會增大。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 更且，若根據本發明，則在通常使用份量之1 / 1 0 〜1 / 1 0 0左右之核酸量則可期待其效果。即，本發明 爲具有增強核酸機能表現之作用。該作用爲實現投與基因 份量的低用量化，並且對於目的部位以外可減低基因作用 之觀點而言爲佳。 又，本發明之含核酸複合體之另外態樣爲提供利用巨 噬細胞等吞噬細胞之吞噬作用及該吞噬細胞的游走能力之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -39- 1267380 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明說明（37 ) 可達成新標的部位專一性之核酸機能表現之方法，經由該 手法，可進行更安全且更容易的基因治療。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝--------訂--------- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -40- 1267380 A7 B7 五、發明說明（38 ) 〔配列表〕 序列表 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) < 1 1 0 > Hidezo Mori < 1 1 0 > Yasuhiko Tabata < 1 2 0 >含核酸複合體 < 1 3 0 > A4407

< 1 4 0 > JP < 1 4 1 > 2000-9-13 < 1 5 0 > JP 1999-11-09 < 1 5 1 > JP 11-318187 < 1 6 〇 > 1 < 2 1 0 > 1 < 2 1 1 > 3149

< 2 1 2 > DNA < 2 1 3 > Homo sapiens < 3 0 1 > M. Taira, T. Yoshida, K. Miyagawa, H. Sakamoto, M. Terada and T. Sugimura < 3 0 2 >人類轉形基因hst之c D N A序列及轉形活性所 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 需之編碼序列的鑑定

< 3 0 3 > Proc. Natl. Acad. Sci. USA < 3 0 4 > 84 < 3 0 6 > 2980-2984 < 3 0 7 > 1987 < 4 0 0 > 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -41 - 1267380 A7 B7五、發明說明（39 ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 gcactgctcc tcagagtccc agctccagcc gcgcgctttc cgcccggctc gccgctccat 60 gcagccgggg tagagcccgg cgcccggggg ccccgtcgct tgcctcccgc acctcctcgg 120 ttgcgcactc ctgcccgagg tc^gccgtgc gctcccgcgg gacgccacag gcgcagctct 180 gccccccagc ttcccgggcg cactgaccgc ctgaccgacg cacggccctc gggccgggat 240 gtcggggccc gggacggccg cggtagcgct gctcccggcg gtcctgctgg ccttgctggc 300 gccctgggcg ggccgagggg gcgccgccgc acccactgca cccaacggca cgctggaggc 360 cgagctggag cgccgctggg agagcctggt ggcgctctcg ttggcgcgcc tgccggtggc 420 agcgcagccc aaggaggcgg ccgtccagag cggcgccggc gactacctgc tgggcatcaa 480 gcggctgcgg cggctctact gcaacgtggg catcggcttc cacctccagg cgctccccga 540 cggccgcatc ggcggcgcgc acgcggacac ccgcgacagc ctgctggagc tctcgcccgt 600 ggagcggggc gtggtgagca tcttcggcgt ggccagccgg ttcttcgtgg ccatgagcag 660 caagggcaag ctctatggct cgcccttctt caccgatgag tgcacgttca aggagattct 720 ccttcccaac aactacaacg cctacgagtc ctacaagtac cccggcatgt tcatcgccct 780 gagcaagaat gggaagacca agaaggggaa ccgagtgtcg cccaccatga aggtcaccca 840 cttcctcccc aggctgtgac cctccagagg acccttgcct cagcctcggg aagcccctgg 900 gagggcagtg ccgagagtca ccttggtgca ctttcttcgg atgaagagtt taatgcaaga 960 gtaggtgtaa gatatttaaa ttaattattt aaatgtgtat atattgccac caaattattt 1020 atagttctgc gggtgtgttt tttaattttc tggggggaaa aaaagacaaa acaaaaaacc 1080 aactctgact tttctggtgc aacagtggag aatcttacca ttggatttct ttaacttgtc 1140 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝---- 訂--------- # 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -42- A7 1267380 B7 ___ 五、發明說明（4〇 ) aaaagttgtc acgagtgtgc tgctattctg tgttttaaaa aaaggtgaca ttggattccg 1200 atgtcatccc ctgtagtatg gcgtggagca tctctgtctg gaaaggcccg cctgaggctt 1260 gggcagccag ttcagggagc tcccaggctt ggctctcggc tagcatcctc agaggcccac 1320 tccctttgtg ccctgttgct attaatcggg acatatcggt ttacttcggg tacagaaagt 1380 gcggtgttga agtcctcgct gccactctgt ttt.tagatct gccaagactg acctttgaac 1440 tttcctgtag tcaatcttcc tcgatctacc agatgggaga gaccctt^ga caactttata 1500 aactcctgtt tgcctttttt ggatcagcga cagcccccat cgctgtgact attggggaaa 1560 agacgaagct ctttcataaa ttccatggag aggaatcaat atcccactgg aaggctagaa 1620 atggacaaga tagtgtattt gcaatcacaa acaaaaccct# agtgatgaaa aataatttgt 1680 gatggcagat gcttctgatg gtgtgataga atatgttttt gaaaacaaac catcgaaccc 1740 cccgccccac ccccaaaacg ggcttccctg tgtttaggga gctttgggct agaactagct 1800 acgattttta ggtgaaatgt ccttgtaatt gtacaaagca cttggtgcag tgtttgcgtg 1860 gagcagcctg ctgctttctg atgcattccc tgtttaagtg cgtttaacat ctacctcaca 1920 參 agccctgaaa ccccaggcaa aacccacaga aagctcatac ccggtgcagg agtttgccat 1980 cccaagtggc tttttttcca tatgtagcca aaaaggattg cagatagcgt cggtgcgtcc 2040 cattcgaacc ttgtcacgtt tgagctatct ttaccctgtg atttactttt agtaagggtg 2100 atcatggtga aaatatttgc agacagctgt tacagtacac tatatggtca ccaagtaacc 2160 ttatattttt ctttatatat tttacaaatg taacccctgt cattgaagca accgtggaag 2220 aggcagggtc ggtgatgttt aaaaaaagtt ccgaggtgat ggcaaacatt taattttaat 2280 gaatgacttt ttagagttta tacaaaatga ccttagcttg ctaccagaaa tgctccgaat 2340 gtttcgtcaa gactttaata ctctcctagg atgtttctga actgtctccc gaattaactt 2400 tatgggagtc tacagacagc aagactggaa aatctgattg gagtttttgt ctttcacatt 2460 ccttttgaaa actctttgtt cgaatgcaaa tcatcgactt aaaatactat tcttaaccaa 2520 ggcctggaag aaagaagaca cttgcaaagc cgctaagaca ggaccacaca tcttaaactg 2580 ctgttcctac catgcactaa actgttttta agttttaaac cacaccctag gctccaggag 2640 tgttcaggaa agatggtgtt tgtaggtctc catgctgttt ggcgttgggg ggtgtggagg 2700 gatcatccgt cgactttctg aattttaatg tattcactta gtaacaaacc atgattgtct 2760 taaatgcctt aaattattat gagatttctt gtctcagagc ccaatcagat tgtcaggaat 2820 taacatgtgt taggtttgat cacccttgac cacttcttat agatatttct tcaacaaatc 2880 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂--------- i·— 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 43- 1267380 A7 ____B7__ 五、發明說明（41 ) atgtgtgatg cctgtaggaa cacaactgta cctttaaaat attgttttca tattgctgtg 2940 atggggattc gaggttcctg tatgtgccac tgttttcaga atctgtagtt ttatacaggt 3000 gccgaccctc gttgtgatgt atgtgctgtg cacattgaca tgctgaccga caatgataag 3060 cgtttatcgt gtataaaaag acaccactgg actggatgta cacaactggg aaaggaatta 3120 aaagctatta aaattgtgcc ttgaaatgc 3149 〔圖面之簡單說明〕 〔圖1〕 示出明膠水凝膠之三次元格子與質體D N A之離子結 合的模式圖。 . 〔圖2〕 經時性示出1 a c Z質體被攝入明膠水凝膠過程之圖 示。 〔圖3〕 示出對d d Y鼠之右大腿肌肉內投與，調查明膠水凝 膠結合質體D N A之生體內殘存性之結果圖。殘存性爲以 放射碘之殘存放射活性予以確認。 〔圖4〕 示出於家兔之下肢缺血模型中，結合粒子狀胺基化明 膠水凝膠並於投與情況之投與後2週之1 a c Z基因表現 樣子之顯微鏡照片。 A :粒子狀胺基化明膠水凝膠結合1 a c Z質體（ 12〇2質體：5〇0微克） 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注咅J事項再填寫本頁) ·裝

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -44- 1267380 A7 B7 五、發明說明（42 ) B :未結合粒子狀胺基化明膠水凝膠之裸露狀態的（naked )lacZ質體（5〇0微克） C ··粒子狀胺基化明膠水凝膠結合1 a c Z質體（ 13〇2質體：5〇微克） 〔圖5〕 示出使用家兔之下肢缺血模型之投與使用腺病毒載體 之1 a c Z基因情況之基因表現樣子之顯微鏡照片 A: lacZ基因投與後第3日 B: lacZ基因投與後2週 〔圖6〕 示出使用家兔之下肢缺血模型之F G F 4/H S T 1 體質投與中之血管新生樣子之X射線照片。 A :粒子狀胺基化明膠水凝膠結合F G F 4 / H S T 1質 體（5 0 0微克） Β :粒子狀胺基化明膠水凝膠結合F G F 4 / H S Τ 1質 體（5微克） C :粒子狀胺基化明膠水凝膠結合1 a c Ζ質體（5 0 0 微克） D :未結合粒子狀胺基化明膠水凝膠之裸露狀態的（naked )FGF4/HST1 質體（500 微克） 〔圖7〕 示出家免動脈壁中之巨噬細胞內之1 a c Z表現樣子 之顯微鏡照片。存在表現1 a c Z的巨噬細胞（箭頭）。 〔圖8〕 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -45- A7 B7 1267380 五、發明說明（43 ) 根據放射光微小血管造影法所得之示出基線及血管擴 張時（腺苷投與時）之血管密度之顯示器上所表示的中間 調畫像的照片。示出（naked ) VEGF165質體投與時之 結果。 〔圖9〕 根據放射光微小血管造影法所得之示出基線及血管擴 張時（腺苷投與時）之血管密度之顯示器上所表示的中間 調畫像的照片。示出明膠水凝膠結合V E G F 1 6 5質體投 與時之結果。 〔圖 1 0〕 示出內部攝入交聯明膠粒子- G F P質體之巨噬細胞 的顯微鏡照片。（A )爲示出位相差像’ （B )爲不出與 (A )同視野之螢光像。於巨噬細胞內察見螢光’可知交 聯明膠粒子一 G F P質體爲被攝入巨ϋ細胞內。 〔圖 1 1〕 · 示出以F A C S解析基因對於人類樹狀細胞導入效率 之結果圖。 A :示出D C與粒子狀胺基化明膠水凝膠結合G F P質體 共同培養情況之F A C S解析結果圖。 B :示出D C與（naked ) G F P質體共同培養情況之 F A C S解析結果圖。 度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 tr---------搴· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印制衣 -46-

Claims (1)

1. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1267380 A8 B8 C8 D8六、申請專利範圍 第8 9 1 23 5 8 6號專利申請案 .....7：；；.....中文申請專利範圍修正本 ‘、 八一， J ... η、 」 ，. ν'. 民國95年7月5日修正 1 · 一種導入核酸之醫藥複合體，其特徵爲含有核酸 與胺基化明膠水凝膠，將經由該生物分解性高分子的分解 而釋出之核酸導入者。 2 ·如申請專利範圍第1項之醫藥複合體，其中胺基 化明膠水凝膠爲至少一種選自膠原、明膠、殼多糖、奎尼 酸、透明質酸、藻酸、澱粉及彼等之衍生物所成群。 3 ·如申請專利範圍第2項之醫藥複合體，其中衍生 物爲胺基衍生物。 4 ·如申請專利範圍第1項之醫藥複合體，其中胺基 化明膠水凝膠爲導入正電荷基的交聯明膠。 5 ·如申請專利範圍第1項之醫藥複合體，其中核酸 爲至少一種選自質體D N A、寡核苷酸及雙股核酸化合物 所成群。 6 ·如申請專利範圍第1項之醫藥複合體，其中核酸 爲至少一種選自血管內皮細胞增殖因子基因、肝細胞增殖 因子基因及纖維芽細胞增殖因子基因所成群。 7 ·如申請專利範圍第6項之醫藥複合體，其中纖維 芽細胞增殖因子基因爲鹼基序列所構成的D N A。 8 · —種控制核酸釋出速度之方法，其特徵爲令導入 正電荷基之胺基化明膠水凝膠中含有核酸，並經由該生物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1267380 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 分解性高分子之分解而將核酸釋出。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 9 ·如申請專利範圍第8項之方法，其中胺基化明膠 水凝膠爲至少一種選自膠原、明膠、殼多糖、奎尼酸、透 明質酸、藻酸、澱粉及彼等之衍生物所成群。 1 〇 ·如申請專利範圍第9項之方法，其中衍生物爲 胺基衍生物。 1 1 ·如申請專利範圍第8項之方法，其中胺基化明 膠水凝膠爲導入正電荷基的交聯明膠。 1 2 ·如申請專利範圍第8項之方法，其中核酸爲至 少一種選自質體DNA、寡核苷酸及雙股雙股核酸化合物’ 所成群。 1 3 ·如申請專利範圍第8項之方法，其中核酸爲至 少一種選自血管內皮細胞增殖因子基因、肝細胞增殖因子 基因及纖維芽細胞增殖因子基因所成群。 1 4 ·如申請專利範圍第1 3項之方法，其中纖維芽 細胞增殖因子基因爲鹼基序列所構成的D N A。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1 5 · —種於活體外增強該核酸之功能表現的方法， 其特徵爲令導入正電荷基之胺基化明膠水凝膠中含有核酸 ，並經由該生物分解性高分子之分解釋出核酸而使其表現 該功能。 1 6 ·如申請專利範圍第1 5項之方法，其中胺基化 明膠水凝膠爲至少一種選自膠原、明膠、殼多糖、奎尼酸 、透明質酸、藻酸、澱粉及彼等之衍生物所成群。 1 7 ·如申請專利範圍第1 6項之方法，其中衍生物 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -2 - 1267380 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 爲胺基衍生物。 (請先閲·«背面之注意事項再填寫本頁) 1 8 ·如申請專利範圍第1 5項之方法，其中胺基化 明膠水凝膠爲導入正電荷基的交聯明膠。 1 9 ·如申請專利範圍第1 5項之方法，其中核酸爲 至少一種選自質體D N A、寡核苷酸及雙股核酸化合物所 成群。 2 0 ·如申請專利範圍第1 5項之方法，其中核酸爲 至少一種選自血管內皮細胞增殖因子基因、肝細胞增殖因 子基因及纖維芽細胞增殖因子基因所成群。 2 1 ·如申請專利範圍第2 0項之方法，其中纖維芽 細胞增殖因子基因爲鹼基序列所構成的D N A。 2 2 · —種於標的部位表現核酸功能之方法，其特徵 爲至少包含（i )攝入含有核酸與導入正電荷基之胺基化 明膠水凝膠之含核酸複合體於具有吞噬作用之細胞中的過 程、（i i )該核酸於該具有呑噬作用之細胞內誘導表現 之過程、及（i i i )令該具有吞噬作用之細胞到達標的 部位之過程。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 2 3 ·如申請專利範圍第2 2項之方法，其中含核酸 複合體爲如申請專利範圍第1〜7項中任一項之含核酸複 合體。 2 4 .如申請專利範圍第2 2項之方法，其中生物分 解性高分子爲至少一種選自膠原、明膠、殻多糖、奎尼酸 、透明質酸、藻酸、澱粉及彼等之衍生物所成群。 本紙張尺度適用中國國家摞準（CNS ) A衫見格（210X297公釐） -3 -