JP2003505473A - アニオン性高分子の送達のための生分解性ポリカチオン組成物 - Google Patents

アニオン性高分子の送達のための生分解性ポリカチオン組成物

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、２〜２０００の範囲の量のサッカリド単位及び５個のサッカリド単位あたり少なくとも１個のグラフト化されたオリゴアミンを有するポリサッカリド鎖を含有する、アニオン性高分子の送達のための生分解性ポリカチオン組成物を提供する。上記オリゴアミンは、少なくとも２個のアミノ基を有する、線状、分枝状及び環状アルキルアミンからなる群から選択される。

Description

【発明の詳細な説明】
（発明の分野） 本発明は、アニオン性高分子の送達のための生分解性ポリカチオン組成物に関
する。
【０００１】 （背景） 遺伝子治療は、遺伝子が細胞中に導入され、次いで患者の生命を改善するに必
須な化合物を細胞又は組織中で製造及び放出する小さな工場となるプロセスであ
る。遺伝子治療は、遺伝的障害（癌、ＡＩＤＳ及び多くの他の疾患のような遺伝
成分と関連している疾患）の処置に変革を起こす可能性を秘めている。遺伝子治
療は、それ以外では死亡するか又は重篤な障害をかかえる幾人かの個体に対する
唯一の治療であり得る。遺伝子導入はまた、全身的なタンパク質及びペプチド様
ホルモン投与に用いられ得る。タンパク質（インスリン、成長ホルモン）をコー
ドする核酸配列が患者に投与され、それら自身の医薬の内因的産生を可能にする
。
【０００２】 首尾のよい遺伝子治療は、その遺伝子が効率的かつ正確の両方で所望の細胞型
に送達され得る送達系に加えて、疾患の処置に対する適切な治療遺伝子の同定を
必要とする。遺伝子導入の初期の試みは、個体からの細胞の摘出、及び遺伝子の
機能性コピーの導入による、培養中の細胞の改変を必要とする。次の段階として
は、遺伝子操作された細胞を患者に移植して戻すことを含んだ。遺伝子治療に対
するこのエキソビボアプローチは、移植された細胞の進行的排除を引き起こし得
る頻繁な増殖及び細胞の発生を受けていない標的組織に明確に制限される。改変
された細胞が標的組織と効率的に組換えする能力は、エキソビボアプローチの別
の制限因子である。なぜなら、多くの細胞は組換えする能力を示さないからであ
る。
【０００３】 エキソビボアプローチの制限及び複雑性は、直接的インビボ遺伝子導入方法の
開発を容易にした。直接的な遺伝子治療は、身体中への遺伝子の投与、所望の細
胞への遺伝子の標的化、この遺伝子の核への標的化、及び核中での機能的遺伝子
産物の発現を含む。現在、直接的な遺伝子導入に関して２つの異なるアプローチ
が存在する。１つはウイルス性のアプローチであり、もう一方は非ウイルス性の
アプローチである。ウイルス性及び非ウイルス性遺伝子治療は、標的細胞に遺伝
子を送達し、かつ核への遺伝子の取り込みを指向するために使用される方法にお
いて異なる。ウイルス性遺伝子治療は、標的細胞に遺伝子を送達するために遺伝
子操作されたウイルス粒子を用い、非ウイルス性遺伝子治療は、合成又は半合成
遺伝子処方物から構成された遺伝子送達系を用いる。ウイルス治療の限界は、免
疫原性、細胞障害性又は組換え原性であり得る、ウイルスベクター内の残りのウ
イルス性エレメントに関係する。
【０００４】 アンチセンス技術は、個々の遺伝子の発現をダウンレギュレート又は特異的に
消失させる可能性を導入した。この技術は、多くの治療可能性を有する。アンチ
センスオリゴデオキシヌクレオチド（ＡＯＮ又はＯＤＮ）は、遺伝物質を標的と
する特異性を分子に提供する指令用ヌクレオチドを有する、１５〜２１個のヌク
レオチドの配列を構成する。その塩基が特定のｍＲＮＡの相補部分に仕立てられ
たオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡのその区画に結合し、複合体化する。これは
、ｍＲＮＡ翻訳の受動的又は反応的な阻害によりタンパク質合成を妨げ得る遺伝
子発現を妨げ得る。ＤＮＡに対するアンチセンスＯＤＮは、３重ヘリックスの形
成によるＤＮＡ転写を阻害するようである。
【０００５】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞表面抗原に結合した後に、ピノサイ
トーシス及び／又はレセプター媒介性エンドサイトーシスによって細胞に進入す
る。非荷電オリゴマーは、受動拡散によって細胞に進入し、荷電オリゴマーはエ
ンドサイトーシスによって進入する。オリゴマーは、細胞によって非常に効率的
には内部移行(internalize)しないようである。ＯＤＮの細胞性取り込み及び生
物学的有効性を改善するための方法が考案されている。この方法としては、ＯＤ
Ｎのトランスフェリンを用いた若しくは用いない、合成ポリペプチドポリ（Ｌ−
リジン）テイルとのコンジュゲーション、又はカチオン性若しくは抗体−標的化
リポソームでのカプセル化が挙げられる。
【０００６】 現代の遺伝子治療の他の様式に関しては、送達は、中心的かつ重要な問題のま
まである。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド自体は、インタクトな血液
脳関門（ＢＢＢ）を通過しないと考えられている。血液脳関門を横切るアンチセ
ンスオリゴマーの通過を分析している研究は存在しない。コンジュゲーション後
の高浸透圧ＢＢＢ破壊又はリポソーム中への取り込みによりＢＢＢを横切ってア
ンチセンスオリゴマーを送達させる試みは、全体的に、成功していない。遊離ア
ンチセンスの直接的な注射は、それらの迅速な破壊を生じる。
【０００７】 しかし、インビボ遺伝子治療におけるほとんどの研究は、組換えウイルスベク
ターの使用に焦点を当てていたが、インビボヒト遺伝子治療のための遺伝子の非
ウイルス処方物の開発に対して進歩がなされている。非ウイルスベクターの利点
は、それらが非分裂細胞中にＤＮＡを導入し得、染色体に組み込まれず、感染リ
スクを持たず、ウイルスベクターよりも潜在的により増殖しないという点である
。非ウイルス遺伝子送達の根本をなす原則は、インビボでＤＮＡを送達する問題
が身体中の細胞内区画に従来の薬物又は生物学的産物を送達する問題と有意には
異ならないということである。非ウイルス性遺伝子治療は、インビボで選択され
た細胞に遺伝子を投与しかつ標的化させ、その遺伝子に治療用産物を発現させる
ための既知の薬物送達方法を含む。
【０００８】 「裸」のプラスミドＤＮＡの直接的な投与から複雑な合成処方物の全身投与ま
での範囲にわたる、非ウイルス性遺伝子治療についての種々の方法が記載されて
いる。いくつかのアプローチは、合成又は半合成成分を使用してウイルス感染の
プロセスを模倣するように試みる「人工ウイルス」を開発することをねらいとし
ている。他は、選択された体性標的にＤＮＡを投与するために進んだ微粒子薬物
送達の理論及び方法を適用する。これらのアプローチは、脂質、タンパク質、ペ
プチド又はポリマー性キャリアを含むプラスミドＤＮＡ複合体を用いる。非ウイ
ルス系に付随する主な不都合な点は、種々の細胞型についての、遺伝子発現の不
十分なレベル、再現性の乏しさ、及び遺伝子発現における顕著な変動であった。
【０００９】 最も活発に調査されている合成遺伝子送達系の２つのクラスは、カチオン性リ
ポソーム又はポリカチオン性ポリマーのいずれかの使用を必要とする。これらの
系のアセンブリは、「アニオン性」ＤＮＡと脂質又は合成ポリマーのいずれかの
「カチオン性」部分との静電的縮合によって達成される。カチオン性ポリマーベ
ース系が、レセプター媒介性遺伝子送達系の処方物と最も広範に関連している。
この技術は、種々の異なる細胞の表面上のレセプターがリガンドを効率的に結合
しかつ内部移行させる能力を用いる。いくつかのリガンドが、ＤＮＡ−リガンド
複合体の効率的なインターナリゼーションのために利用されている。これらとし
ては、肝臓アシアロ糖タンパク質レセプターを標的とするアシアロオロスムコイ
ド(asialoorosmucoid)及び他のガラクトシル化タンパク質；トランスフェリンレ
セプターに結合するトランスフェリン及びマクロファージのマンノースレセプタ
ーによって認識されるマンノシルが挙げられる。標的化リガンドは、ポリカチオ
ン性ポリマー、代表的にはポリ（リジン）誘導体に共有結合され、次いで正に荷
電したポリ（リジン）と負に荷電したＤＮＡとの間のイオン性相互作用によって
リガンド−ポリ（リジン）−ＤＮＡ複合体を形成する。しばしば、高いトランス
フェクション効率を達成するために、エンドソーム溶解剤が、トランスフェクシ
ョン混合物に添加されて、エンドソーム溶解を誘導し、エンドソームからのＤＮ
Ａ放出を増強する。多数の細胞型をインビトロでトランスフェクトする際のポリ
（リジン）−ＤＮＡコンジュゲートの効率が実証されているが、インビボヒト遺
伝子治療に対するそれらの潜在的有用性は、それらの細胞毒性のために制限され
る。
【００１０】 より進んだポリマー性遺伝子送達系は、エンドソーム緩衝系として作用する非
常に高いカチオン性電荷密度を有する高分子を用い、それによりエンドソーム酵
素活性を抑制し、分解からＤＮＡを保護する。高いカチオン性電荷密度は、ＤＮ
Ａ濃縮能及び緩衝能の両方をもたらし、エンドソーム溶解剤の添加の必要性を減
少させる。
【００１１】 （遺伝子導入に使用されるポリマー） 遺伝子複合化に使用されるポリカチオンは、生理学的条件でカチオン性になる
ポリアミンである。全てのポリマーは、生理学的条件下でＤＮＡと静電的複合体
を形成し得る、一級、二級、三級又は四級アミノ基のいずれかを含む。最高のト
ランスフェクション活性は、ポリカチオン対ＤＮＡ比 １．１〜１．５で得られ
る。遺伝子導入について最も研究されているポリアミンとしては、ポリ（リジン
）及びその誘導体、ポリアミドアミンスターバースト(starburst)デンドリマー
、ポリエチレンイミン、天然及び改変ポリサッカリド、並びにアクリル性カチオ
ンポリマーが挙げられる。各ポリマーのクラスについての詳細は、Dombら（A. D
omb, M. Levy, 遺伝子治療におけるポリマー, Frontiers in Biological Polyme
r Applications, R. M. Ottenbrite（編）, Technomic, 第2巻, 1999年, 1-16）
に記載されている。 ポリカチオンは、リポソーム及び他の従来使用されていた球形の遺伝子キャリ
アよりも使用に関してよりいろいろ利用され得る。いくつかのポリカチオン（例
えば、ジエチルアミノエチルデキストラン及び他のカチオン性ポリサッカリド）
は、遺伝子発現を誘導することが報告されている（F. D. Ledley, ヒト遺伝子治
療, 6, 1129, 1995年;Yamaokaら, Chemistry Letters, 1171-72, 1998年）。こ
れらのポリマーは、カチオン性基を保有することを除いて、互いに構造類似性を
ほとんど有しない。
【００１２】 カチオン性ポリサッカリドは、遺伝子送達のために使用されている。キトサン
（線状のカチオン性ポリサッカリド）は、遺伝子送達に関する数人の著者によっ
て示唆されている（K.W.Leongら, ＤＮＡ−キトサン ナノスフェア; トランス
フェクション効率と細胞取り込み, Proceed. Intl. Symp. Control. Rel. Bioac
t. Mater. 24:75-76, 651-652, 671-674, 1997年; R. Richardson, H. V. J. Ko
lbe, R. Buncan, 潜在的遺伝子送達ベクターとしての高度に精製されたキトサン
の評価, Proceed. Intl. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24: 649-650, 1
997年）。ＤＮＡ−キトサン ナノスフェアは、ＭＴＴ試験を使用してポリ（Ｌ
−リジン）又はリポフェクチンよりも毒性が有意に低いことが見出された。標準
的なリポフェクトアミン媒介性の遺伝子導入と比較して、これらのナノスフェア
は、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児性腎臓細胞）、ＩＢ３（気管支上皮細胞）及びＨＴ
Ｅ（ヒト気管上皮細胞）においてより低いレベルの遺伝子発現を示す。細胞中へ
の進入を促進し、かつ貯蔵安定性を改善するために、ポリ（エチレングリコール
）、トランスフェリン及びマンノース−６−リン酸レセプターを共有結合するこ
とによるＤＮＡ／キトサン複合ナノ粒子の表面の改変もまた研究された。精製さ
れ、かつ疎水化されたキトサンもまた、遺伝子のキャリアとして示唆されている
（K. Y. Lee, I. C. Kwon, Y. H. Kim, W. H. Jo, S. Y. Jeong, ＤＮＡ送達の
為の疎水性に改変されたキトサンの自己凝集, Proceed. Intl. Symp. Control.
Rel. Bioact. Mater. 24: 651-652, 1997年）。
【００１３】 Ｍｉｄｏｘ（ＷＯ９５／３００２０）は、ヒドロキシル基保有分子を用いてｇ
−アミノ基で改変されたポリリジン等のポリペプチドを記載している。Ｇｅｎｚ
ｙｍｅは、ＷＯ９７／４６２において、遺伝子トランスフェクションにおける使
用のために短鎖アルキルアミン（例えば、スペルミン及びスペルミジン）の脂質
誘導体を記載している。例えば、１個又は２個のスペルミン又はスペルミジン基
が、アミド又はカルバメート結合を通じてコレステロールに付いている。Ｅｍｏ
ｒｙ Ｕｎｉｖ．のＷＯ９８／２７２０９は、遺伝子トランスフェクションにお
ける使用について、リジンに基づく一定範囲の改変カチオン性ポリペプチドを記
載している。
【００１４】 先行技術に記載されているポリマーは、２つのカテゴリー（ポリマー骨格（例
えば、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（アミド−アミン）デンドリマー、及びポ
リ（アルキルアミノ−グルカラミド(glucaramide)）の一部であるアミノ基のラ
ンダムな分布を有する線状又は星状ポリマーを含むもの、ポリマー単位に付いて
いる１個の一級、二級又は三級アミノ基を有する線状ポリマーを含む第２のもの
）に分類され得る。このようなポリマーの例は、ポリ（ジメチルアミノエチルメ
タアクリレート）、ジメチルアミノデキストラン、及びポリリジンである。
【００１５】 上記のポリマー全ては、ランダムな分布のカチオン性部位を有するポリカチオ
ンである。これらのポリマーがいくつかのヌクレオチド及び細胞型でうまく機能
し得、他ではうまく機能し得ないという事実に関しては、おそらく、このランダ
ム性が原因である。これらのポリマーのうちほとんどは、細胞に対し毒性があり
、かつ非生分解性であり、一方、アミノ酸に基づくポリマー（例えば、ポリリジ
ン）は免疫原性である。
【００１６】 先行技術において、以下の事項に関してはほとんど注意が払われていなかった
と言えるだろう： １．アニオン性ヌクレオチドとの複合体化を最適にする、ポリカチオンの構造、
電荷密度及びポリマー中のカチオン性基の空間分布； ２．カチオン性基の型（一級、二級又は三級基）は、カチオン性部位とみなされ
た。 ３．ポリマーの毒性及び免疫原性 ４．ポリマーキャリアの生分解性及び排除特性。 一般に、ポリマーのカチオン性電荷は、複合体化及びトランスフェクションに重
要な主要な因子であると信じられている。また、これらのカチオン性ポリマーは
、エキソビボ実験、加えて動物実験における商業的な目的のために十分に高いト
ランスフェクション効率を生じていなかった。ポリマーキャリアの分解及び排除
は、注意深く処理されておらず、そして遺伝子治療における使用について記載さ
れているほとんどのポリカチオンは、生分解性ではないか、及び／又は有毒であ
る。
【００１７】 遺伝子送達のための汎用的なポリカチオン系の設計において、プラスミドが細
胞及び組織中で活性化する様式を考慮すべきである。プラスミドは、初めに、細
胞外媒体でのＤＮＡ分解酵素から保護され、次いで細胞壁を貫通し、核にインタ
ーナリゼーションされるまでは、細胞内媒体中の消化系（すなわち、リポソーム
及び酵素）から保護され、核へと侵入し、そしてポリマー性キャリアからその活
性形態で放出される。
【００１８】 本発明は、種々のプラスミド及びアンチセンスを複合体化し、それらを高効率
で種々の細胞にかつその活性形態で核に投与し、所望のタンパク質を産生し得る
天然又は合成ポリサッカリドにグラフト化されたオリゴアミンに基づく、いろい
ろ利用されかつ汎用的であるポリカチオン系を記載している。
【００１９】 本発明の目的は、以下のポリカチオンを提供することである： １．プラスミド又はアンチセンスの効率的な送達に関する複合体化の要件をより
適合させること； ２．制御された速度で非毒性フラグメントへと生分解すること； ３．インビボで非毒性かつ非免疫原性であること； ４．低分子量及び高分子量のポリヌクレオチド（治療用プラスミド及びアンチセ
ンスを含む）と十分に安定な複合体を形成すること； ５．一定範囲の細胞及び組織において高トランスフェクション効率を生じる効率
的なポリマー送達系を提供すること； ６．手ごろな費用で再現性良く調製され得ること。
【００２０】 本発明の別の目的は、徐々に脱複合体化してＤＮＡを放出するように設計され
たポリマーとＤＮＡとを複合化させることによって、又は数週間及び数ヶ月の期
間で挿入部位にＤＮＡを放出する生分解性マトリクス中に複合体化されたポリヌ
クレオチドを取り込ませることによって、組織又は細胞中へのＤＮＡの制御され
た放出を提供することである。
【００２１】 従って、本発明によれば、以下を含有する、アニオン性高分子を送達するため
の生分解性ポリカチオン組成物が提供される： ｉ）２〜２００００の範囲の量のサッカリド単位を有するポリサッカリド鎖； ｉｉ）ｂ）５個のサッカリド単位あたり少なくとも１個グラフト化されたオリゴ
アミン（上記オリゴアミンは、少なくとも２個のアミノ基を有する、線状、分枝
状及び環状アルキルアミンからなる群より選択される）。
【００２２】 本発明の好ましい実施形態において、上記アニオン性高分子は、プラスミド、
オリゴヌクレオチド、アンチセンス、ペプチド、タンパク質、アニオン性ポリサ
ッカリド（例えば、ヘパリン）及びそれらの組み合わせからなる群より選択され
る。
【００２３】 本発明の別の好ましい実施形態において、上記ポリサッカリド鎖は、デキスト
ラン、アラビノガラクタン、プルラン、セルロース、セロビオース(cellobios)
、イヌリン、キトサン、アルギネート及びヒアルロン酸からなる群より選択され
る。
【００２４】 本発明のさらに好ましい実施形態において、上記サッカリド単位は、アセター
ル、ヘミアセタール、ケタール、オルトエステル、アミド、エステル、カルボネ
ート及びカルバメートからなる群より選択される結合によって連結される。
【００２５】 本発明のよりさらに好ましい実施形態において、上記ポリサッカリドは、アル
ダル酸とジアミノアルカンとの縮合から形成された合成ポリサッカリドである。
【００２６】 本発明の好ましい実施形態において、上記グラフト化されたオリゴアミンは、
アミン、アミド及びカルバメートからなる群より選択される結合によって上記ポ
リサッカリド鎖にグラフト化される。別の好ましい実施形態において、オリゴア
ミンは、式： ＮＨ2−［ＣＨ2）x−Ｎ−（Ｒ）−ＣＨ2）y−Ｎ−（Ｒ’）−（ＣＨ2）z−］n −ＮＨ2 〔式中、ｘ、ｙ、ｚは、０〜４の間の整数であり、ｘ＋ｙ＋ｚは、１〜４の間で
あり、ｎは、ｘ＋ｙ＋ｚ＝２以上の場合に少なくとも１であるか、又はｘ＋ｙ＋
ｚ＝１の場合に少なくとも２であり、Ｒ及びＲ’基は、Ｈ又は１〜６個の炭素の
脂肪族側鎖基である〕 を有する。
【００２７】 本発明のさらに好ましい実施形態において、上記オリゴアミンは、スペルミン
及びその誘導体からなる群より選択される。
【００２８】 本発明のなおさらに好ましい実施形態において、上記オリゴアミンは、１０個
までのエチレンイミン単位を有する、線状及び分枝状のエチレンイミンオリゴマ
ーからなる群より選択される。
【００２９】 本発明のなおさらに好ましい実施形態において、上記オリゴアミンは、２０個
までのアミノ酸からなり、少なくとも５０％がカチオン性側鎖基（リジン、オル
ニチン及びジフタミックアシッド(diphthamic acid)を含む）を含む、ペプチド
からなる群より選択される。
【００３０】 本発明の好ましい実施形態において、上記両親媒性残基は、脂肪鎖、リン脂質
、コレステロール誘導体、エチレングリコールオリゴマー及びポリエチレングリ
コールオリゴマー〔ここで上記エチレン及びプロピレングリコールオリゴマーは
、一方の側に脂肪鎖ブロックを有する〕からなる群より選択される。
【００３１】 本発明のさらに好ましい実施形態において、上記両親媒性残基は、アミン、ア
ミド、イミン、エステル、エーテル、尿素、カルバメート及びカルボネートから
なる群より選択される結合によって上記ポリサッカリド鎖に連結される。
【００３２】 本発明のなおさらに好ましい実施形態において、上記両親媒性残基は、生体膜
を介するポリカチオンの横断を促進する。
【００３３】 本発明の好ましい実施形態において、上記ポリカチオン組成物は、有毒ではな
く、又は免疫原性でない。
【００３４】 なおさらに好ましい実施形態において、本発明の組成物はさらに、所定の型の
細胞又は組織への上記組成物の結合を促進するためのリガンドを含有する。
【００３５】 本発明のさらなる目的は、医薬的に許容可能なキャリアとともに、上記の組成
物を含有する医薬組成物を提供することである。
【００３６】 本発明のさらなる目的は、ヌクレオチド送達のために一般的に使用される両親
媒性カチオン性及び／又は非イオン性脂質並びにカチオン性及び非イオン性ポリ
マーとともに、上記組成物を含有する医薬組成物を提供することである。脂質の
例としては、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＧＡＰ−ＤＬＲＩＥ、ＤＯ
ＤＨＦ、アルキル化スペルミン、並びにG. Byk及びD. Scherman, Exp. Opin. Th
er. (1998) 8(9): 1125-1141; D. A. Treco及びR. F. Selden, 非ウイルス性遺
伝子治療, Molec. Med. Today, 1995, 1(7): 299-348に記載される他の誘導体が
挙げられる。
【００３７】 本発明は、高い生物学的効果のためにプラスミド及びアンチセンスを送達する
際に効果的である合成又は天然ポリサッカリドにグラフト化されたオリゴアミン
残基に基づく一定範囲の生分解性ポリカチオンを記載する。側鎖オリゴマーが線
状又は分枝状のいずれかの親水性ポリサッカリド骨格に付いているというグラフ
ト化の概念は、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ鎖に典型的なアニオン性表面領域との二
次元／三次元相互作用を可能にする。この型の可撓性カチオン性領域の適用範囲
は、非グラフト化ポリカチオン又は低分子量カチオンに関しては利用できない。
低分子量アミン及びそれらの脂質誘導体（例えば、リポフェクチン及びリポフェ
クトアミン）は、複合体化の程度が、これら低分子がアニオン性ＤＮＡのまわり
にどのように構成されるかに依存する、ＤＮＡに対する局在化効果を有する。各
分子は、トランスフェクション(transferction)プロセスの全ての時間で他の分
子と同調されなければならないが、オリゴアミンがポリマーにグラフト化される
場合には、それらは既に同調化され、各側鎖は他の側鎖が配置されることを補助
して、所定のＤＮＡのアニオン性表面を適合させる。官能基をグラフト化させる
ことにより、ポリマー鎖に沿う平均分布が互いの間で特定の距離になる（例えば
、１つ、２つ、３つ又は４つ毎のポリマー単位にオリゴアミン鎖をグラフトさせ
ることは、種々のＤＮＡとの最適な複合体化を提供する）。
【００３８】 生分解性カチオン性ポリオールキャリアの使用は、トランスフェクション及び
生物学的適用に特に適切である。なぜならそれらは、水溶性であり、かつ水性ビ
ヒクルに混和性だからである。得られたグラフトポリマーは、水溶性又は水に分
散性であり、それは、既知の生物学的プロセスによってインビボで細胞に容易に
輸送され得、そしてそれと複合体化した薬剤を輸送するための効果的なビヒクル
として作用する。
【００３９】 本発明の組成物は、グラフト化された複雑な官能基（即ち、少なくとも２個の
アミノ基を含有する脂肪族有機カチオン性残基）を有する天然又は合成ポリサッ
カリド骨格から構成される。アルキルアミノカチオン性残基は、最適なトランス
フェクションの結果のために多くのプラスミド又はオリゴヌクレオチドにあつら
われた最適な荷電分布で分布している。ポリマーは、トランスフェクションの為
に細胞へのポリマー−プラスミド複合体の侵入を可能にする疎水性／親水性側鎖
基を有する。
【００４０】 （本発明の詳細な説明） 本発明は、生物学的に活性な分子のインビトロ及びインビボの両方での導入に
使用され得る、新規クラスの非ウイルス性ポリマー性ベクターを提供する。詳細
には、これらのベクターは、遺伝子導入適用に使用され得る。本発明のポリカチ
オン性組成物は、市販のカチオン性リポソーム調製物よりも優れている、インビ
トロでの遺伝子導入効率を達成し得る。さらに、この組成物の低毒性であり血清
阻害がないことは、インビボでの使用に適切である。本発明は、ウイルスベクタ
ー系に比較して有利なインビボ遺伝子導入効率を達成し得るベクターを提供する
。本発明はさらに、沈殿することなく、又は細胞に対する毒性のイオン性効果を
もたらすことなく、溶液が核酸及びポリマー性ベクターの複合体を保有する能力
を増加させる方法を提供する。
【００４１】 さらに、このクラスのポリマー独特のポリカチオン性構造は、多くの適切な生
体活性分子（タンパク質、及び複数のアニオン性部分を保有する他の化合物を含
む）と会合する。ポリマーは、キャリアとして作用して、生体活性分子に対する
目的の細胞に、インビボ又はインビトロで会合した生体活性分子を送達し得る。
【００４２】 さらに、このクラスのポリマーの独特なポリカチオン性構造は、生分解性であ
り、そして投与後に身体から容易に除去される。
【００４３】 １つの局面において、本発明は、核酸及びトランスフェクション剤を含有する
複合体を提供し、ここで： ａ）トランスフェクション剤は、疎水性及び／又は両親媒性側鎖基を含むポリサ
ッカリドに短い脂肪族オリゴアミンをコンジュゲートさせ、細胞への侵入を可能
にすることによって得られる。 ｂ）ポリマーにコンジュゲートされた短い脂肪族オリゴアミンは、少なくとも２
つのアミノ基を含む。 ｃ）ポリマーに付いた疎水性及び／又は両親媒性部位は、例えば、細胞への侵入
を可能にする能力を備える、脂肪残基ブロックを有する又は有しない脂肪鎖、リ
ン脂質若しくはコレステロール誘導体又はエチレン若しくはプロピレングリコー
ルオリゴマーである。疎水性側鎖基の密度及び質は、インビトロ（細胞）及びイ
ンビボ（ヒト）の両方での最適なトランスフェクションを可能にするように選択
される。 ｄ）トランスフェクション剤は、細胞及び／又は核へと遺伝子、アンチセンス又
は核酸を送達し、活性形態でそれらを放出して、遺伝子又はアンチセンスによる
実質的な生物学的効果を可能にし、そして細胞又は身体から除去される非毒性フ
ラグメントへと生分解し得る。
【００４４】 本明細書中で使用される場合、用語「トランスフェクション剤」とは、真核生
物細胞への核酸の進入を促進し得る任意の化学剤を意味する。
【００４５】 本明細書中で使用される場合、用語「核酸」とは、ヌクレオチドのポリマーを
意味し、そして特に、プラスミド、コーディングＤＮＡ配列、ｍＲＮＡ、及びア
ンチセンスＲＮＡ分子を含む。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得る。核酸はま
た、１以上の置換性連結を含み得る。これらの置換性連結としては、従来の代替
的連結（例えば、ホスホロチオエート及びホスホルアミデート）が挙げられ、そ
して一般的に入手可能な文献に記載される通りに合成される。核酸としてはまた
、糖部分が例えば、ハロゲン、脂肪族基での１以上のヒドロキシル基の置換によ
って、又はエーテル、アミンのような官能基化によって、あるいはリボース若し
くはデオキシリボースが他の機能的に等価な構造で置換されているものによって
改変されているヌクレオチドが挙げられる。特に、糖−ホスフェート骨格は、非
炭水化物骨格（例えば、ペプチド又は他の型のポリマー）で置換されていてもよ
い。
【００４６】 本明細書中で使用される場合、用語「一級アミン」とは、１以上の一級アミン
官能基を保有する任意のアミンを意味する。
【００４７】 本明細書中で使用される場合、用語「二級アミン」としては、少なくとも２つ
の付属した炭化水素基を有するアミン部分が挙げられ、そしてまた、適切な状況
では、三級及び四級アミンを含む。
【００４８】 本明細書中で使用される場合、「ａ」は、それが使用される状況に応じて１以
上を意味する。
【００４９】 本明細書中で使用される場合、「脂肪族」及び「芳香族炭化水素」としては、
置換及び非置換の両方の化合物（ここで置換は、骨格又は炭化水素の付属基中に
生じ得る）が挙げられる。脂肪族化合物は、分枝鎖でも直鎖でもよい。
【００５０】 本明細書中で使用される場合、「ポリサッカリド」とは、線状、分枝状又は架
橋した天然又は化学的に改変されたポリサッカリドを意味する。それはまた、ポ
リマー骨格中に少なくとも４０％のサッカリド単位を有する合成コポリマーを含
む。特定の例は、アルカンジアミンを有するグルカル酸のポリアミドである。
【００５１】 本明細書で使用される場合、「オリゴアミン」とは、少なくとも２つのアミノ
基を含む線状、環状及び分枝状のアルカンアミンを意味する。このオリゴアミン
の分子量は、約２，０００ダルトンに制限される。
【００５２】 本発明は、効果的な核酸トランスフェクション特性及び生体活性剤送達性状を
有する、新規クラスのポリカチオン性ポリサッカリドに関する。このポリマーは
、ポリサッカリド鎖へのオリゴアミンのコンジュゲーションから得られる。ポリ
サッカリドキャリア、オリゴアミン及びグラフト比率結合型は、トランスフェク
ションの程度及び効率を増強するように選択される。例えば、ポリマーは、トラ
ンスフェクトされる核酸のアニオン性電荷分布、及び標的とされる細胞型のアニ
オン性電荷分布にあつらわれたトランスフェクション剤を得るために、ポリマー
上のカチオン性部位の密度及び分布に基づいて選択され得る。種々の置換基もま
た、ポリマーに取り込まれ得、そのトランスフェクション効率を改善することに
よって、ポリマーの特性に影響を与える。
【００５３】 本発明は、（１）ポリカチオン性ポリマーのクラス、（２）これらのポリマー
と核酸とを含有する複合体のクラス、（３）これらのポリマーとアニオン性に荷
電した適切な生体活性剤とを含有する複合体のクラスを提供する。ポリカチオン
性ポリマーのクラスとしては、適切なポリサッカリドへのオリゴアルカンアミン
のグラフト化によって得られる産物（ここでグラフト化されたオリゴアミンは、
少なくとも２つのアミンを含み、特に好ましい実施形態では、グラフト化された
一級アミンは、１つの一級アミンと３つの二級アミンとを有する）が挙げられる
。
【００５４】 適切なポリサッカリドの例としては、例えば、デキストラン、アラビノガラク
タン、プルラン、セルロース、キトサン、イヌリン、ヒアルロン酸、及び２〜２
，０００個のサッカリド単位を有するアルギネートが挙げられる。他のクラスの
ポリサッカリドは、ポリ尿素、又は脂肪族ジアミンと多縮合(polycondence)した
アルダル酸（例えば、ムチン酸、グルカル酸、ガラクタル酸、キシラル酸(xylar
ic acid)及びそれらの種々の異性体）のポリアミドである。コモノマーのコポリ
マー化は、一般的に、当該分野で公知の方法（縮合反応を含む）によって行なわ
れ得る。適切な多縮合技術の例は、Kieleyら, J. American Chemical Society,
116, 571-578 (1994), Kieleyら, 米国特許第３，２２５，０１２号；同第５，
４３４，２３３号；同第５，３１２，９６７号；同第５，４７３，０３５号；同
第５，８３３，２３０号；及び同第５，３２９，０４４号；並びにDewarらに詳
細に記載されている。
【００５５】 ポリマー／核酸電荷のイオン性会合は、核酸のアニオン性電荷を中和し、複合
体が負に荷電した細胞表面とより好ましく相互作用及び結合することを可能にす
る。過剰（すなわち、核酸のアニオン性電荷を中和するに必要とされるよりも多
く）のカチオン性部位がポリマー上に存在する場合、これらの過剰なカチオン性
電荷は、細胞のイオン的に荷電した表面への複合体の誘引を促進し得、それによ
り細胞中への複合体の進入を促進する。このポリマーはまた、複合体化の際に核
酸をコンパクトにする。これは、進入の可能性をさらに増強させる。
【００５６】 本発明は、グラフト化されたオリゴアルキルアミンに制限されるが、種々の置
換基がポリマーキャリア中に組み込まれ得る。例えば、モノサッカリドの脂肪族
鎖上のヒドロキシル基は、脂肪族炭化水素、アミド、アゾ、カルバメート、カル
ボン酸エステル、エーテル、チオエーテル、チオール、蛍光誘導体、及びスルホ
ン酸で置換され得る。しばしば、二級アミンを長鎖炭化水素でアルキル化するこ
とによって、ポリマーの疎水性を増大させ得ることができる（疎水性が所望され
る場合）。あるいは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖を付けることによっ
て両親媒性を増大させてもよい。
【００５７】 ポリマーの構造はまた、その標的の生理学的及び生物学的特徴に基づいて、各
細胞標的に対するポリマーのトランスフェクション及び送達効率を最適化するよ
うに、既知の技術によって変更され得る。例えば、細胞への遺伝子送達の効率は
、シミアンウイルス４０の核標的化シグナルを有するペプチドをポリマーに付加
することによって増強され得る。ポリマーと共有結合され、次いでリガンド−核
酸複合体に取り込まれ得る、いくつかのタンパク質リガンドもまた公知である。
得られた複合体は、標的細胞上の同族レセプターと特異的に相互作用するそれら
の能力を保持している。
【００５８】 遺伝子送達の効率を改善するための別の方法は、ＤＮＡが細胞に進入した後に
、エンドソームからのＤＮＡの放出を増強させることである。アデノウイルス粒
子は、この効率を増大させるためにポリマーにカップリングされ得る。合成ペプ
チドもまた、エンドソーム放出を増強するために、設計され、そしてポリマーへ
と組み込まれ得る。
【００５９】 本発明の生分解性ポリカチオン組成物は、細胞型及び核酸又は生体活性剤のサ
イズの両方についていえば、遺伝子導入及び生体活性剤送達に一般的に有用であ
る。なぜなら、このトランスフェクションはイオン性相互作用によって駆動され
るからである。核酸のトランスフェクション又は生体活性剤の送達（トランスフ
ェクション若しくは他の手段を介する）が有用である任意の選択された細胞は、
当該分野で公知のような、組成物を選択された細胞と接触させるような適切なや
り方で組成物を投与することによって、標的化され得る。細胞は、組織又は器官
内のものであり得、例えば、組成物が投与される血管によって供給され得る。本
発明の組成物は、血液系又は一般的な生体活性分子に関する文献で公知のような
特定の部位への遺伝子複合体の標的化及び／又は長期放出の制御を可能にするた
めに、生分解性成分（例えば、生分解性ポリマー又は脂肪）から構成されるスラ
ブ、ペレット、ミクロスフェア及びナノスフェアへと製剤化され得る。あるいは
、例えば、組成物は、標的組織又は器官に直接的に注射され得る。さらなる例と
しては、肺が、複合体又はこの複合体を含有する粒子の吸入又は気管内注射によ
って標的化され得る。本発明は、全ての真核生物細胞に対する適用を有する；そ
れは、哺乳動物細胞及び被験体（例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ラ
ット及びマウス）に対して特に使用され得る。本発明の組成物によって標的とさ
れ得る細胞のいくつかの例としては、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、血液細
胞及び腫瘍細胞が挙げられる。
【００６０】 本発明の１つの実施形態に従うポリオール骨格が、生分解性であり、かつ通常
の生合成プロセスの一部として生細胞中に規則的に運び込まれるという事実に起
因して、トランスフェクション剤として使用される場合に、それは非毒性及び非
免疫原性であり、これにより、ウイルス性ベクターに対して異なる利点が提供さ
れる。同様に、ポリオールは、一般的に、血清に対する天然の結合部位を含まな
いので、ポリオール骨格は、血清タンパク質（例えば、ヘパリン及びアルブミン
）を循環させることによって負に影響されない。従って、ポリマーで形成された
複合体は、天然の全身的な血清によって実質的に影響されているポリカチオン性
脂質とは対照的に、血清により有意に阻害されずに、標的とされる細胞にインタ
クトなまま達する。
【００６１】 溶液中で運搬されるＤＮＡの量もまた、組成物のトランスフェクションの程度
に影響を与え得る。溶液中のＤＮＡの濃度は、しばしば、より高い濃度で沈殿す
るその傾向によって制限される。いくつかの適用において、溶液中のＤＮＡ濃度
は、約１．０ｇ／ｌに制限される。溶液中の沈殿しないＤＮＡ−ポリマーの量の
増加は、適切な調製法並びに最適なポリマー対ＤＮＡ比及びポリマー構造が使用
される場合に達成され得る。このような調製において、溶液１リットルあたり２
０グラムのＤＮＡを含む溶液を得ることが可能であり得る。
【００６２】 適切な送達及びトランスフェクション条件は、細胞及び組成物の温度が約１８
℃〜約４２℃の間、好ましくは、温度が約２２℃〜約３７℃の間にある場合であ
る。被験体中の細胞への投与に関して、この複合体は、一旦被験体に入ると、も
ちろん被験体の体温にあわせられる。エキソビボ投与について、この複合体は、
細胞の生存率を維持する任意の標準的な方法によって（例えば、この複合体を（
標的細胞に適切な）培養培地に添加し、そしてこの培地を細胞に直接的に添加す
ることによって）投与され得る。本方法に使用される培地は、細胞が生存不可能
とならないように、水性かつ非毒性であるべきである。さらに、この培地は、所
望される場合、細胞の生存率を維持するために栄養分を含み得る。
【００６３】 この組成物は、非経口投与（例えば、静脈内注射（標的細胞を有する組織又は
器官を供給する血管を介する局所灌流を含む））によってインビボで投与され得
る。注射剤は、従来の形態（例えば、液体の液剤、懸濁剤又は乳剤）に調製され
得る。緩徐（ｓｌｏｗ）放出又は持続性放出系もまた使用され、一定の投薬レベ
ルの維持を可能にし得る。
【００６４】 投与の他の手段としては、エアロゾルの吸入、皮下注射、腹腔内注射若しくは
筋肉内注射、局所投与（例えば、皮膚創傷及び病変への）、直接的なトランスフ
ェクション（例えば、移植のために調製され、そして被験体にその後移植される
骨髄細胞への）、並びに被験体にその後移植される器官への直接的なトランスフ
ェクションが挙げられ得る。さらなる投与方法としては、特にこの複合体がカプ
セル化される場合には経口投与、又は特にこの複合体が坐剤形態である場合には
直腸投与が挙げられ得る。
【００６５】 本発明の医薬組成物は、組成物、及び選択された投与様式に適切な医薬的に許
容可能なキャリアを含有し得る。医薬的に許容可能なキャリアとしては、任意の
所望されない生物学的効果、又は生物学的宿主と、若しくは医薬組成物内の成分
と有害な様式の相互作用を引き起こさない任意の物質が挙げられる。医薬組成物
はさらに、他の薬剤、医薬剤、アジュバント、希釈剤、安定化剤等を、それらが
この組成物の作用と干渉しない限り含有し得る。このような投薬形態を調製する
実際の方法は、公知であるか、又は当業者に明らかである(例えば、 Martin, E.
W. Remingtons's Pharmaceutical Sciences, 最新版, Mack Publishing Co., Ea
ston, PA.)。
【００６６】 本発明のプラスミド：ポリカチオン複合体、並びに種々のカチオン性、アニオ
ン性及び両親媒性ポリマー及び分子の組み合わせを使用するトランスフェクショ
ン。プラスミドｄｎａ複合体は、プラスミドｄｎａ、オリゴアミンポリサッカリ
ド縮合剤及びペプチド（米国特許出願番号０７／９１３，６６９（１９９２年７
月１４日出願）に記載されるペプチド）からなっていた。両親媒性ポリマー：ポ
リエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）及びＰ
ＥＧ−ＰＰＧコポリマー、ホスファチジルコリン、コレステロール誘導体、及び
非イオン性界面活性剤の添加、プラスミドｄｎａ複合体のトランスフェクション
効率はプラスミドｄｎａ複合体単独又はポリマー単独に対して有意に増強された
。アニオン性ポリマー又は脂質の添加は、その負の電荷により、正味の正に荷電
したプラスミドｄｎａ複合体の脱安定化を生じ得、それにより、核にプラスミド
をより良好に放出し得るか、あるいは一方、プラスミドを脱複合体化させ得、そ
してその活性が低減され得る。両親媒性ポリマーのいくつかの作用機構が以下の
ことを説明するかもしれない：コーティングに起因するプラスミドｄｎａ複合体
の安定化；細胞膜の透過性が増大することにより、細胞を介するプラスミドｄｎ
ａ複合体のより容易な通過が可能になること；細胞表面でのプラスミドｄｎａ複
合体の濃度を増大する、膜及び／又は容積排除。
【００６７】 本発明の別の目的は、組織又は細胞中で生物学的に活性なｄｎａと、生体高分
子（ＤＮＡ、アンチセンス、及びタンパク質若しくはポリサッカリド（ヘパリン
））を徐々に脱複合体化し、そして放出する本発明のポリカチオンとを複合体化
することによって、あるいは数週間及び数ヶ月の期間で挿入部位にＤＮＡ又はＤ
ＮＡ複合体を放出するであろう生分解性マトリクス中にこの複合体を取り込ませ
ることによって、これらの制御された放出を提供することである。
【００６８】 以下のポリマー、油及び界面活性剤は、遺伝子トランスフェクションを増強す
る、及び／又は核酸の局在化されたバイオアベイラビリティを延長させる化合物
としての使用に適切であり得る:ヒアルロネートの塩；アルギネートの塩；ヘテ
ロポリサッカリド（ペクチン）；ポロキサマー（プルロニック）；ポロキサミン
（テトロニック(tetronic)）；ポリエチレングリコール；デキストラン；ポリビ
ニルピロリドン；キトサン；ポリビニルアルコール；プロピレングリコール；ホ
スファチジルコリン（レシチン）；キサンタンゴム、ポリエチレングリコール−
ポリ乳酸−グリコール酸（ＰＥＧ−ＰＬＡ）、ポリエチレングリコール−ポリヒ
ドロキシ酪酸（ＰＥＧ−ＰＨＢ）、脂肪酸及びアルコール並びにそれらのエステ
ル、グリコフロール(glycofurol)、クレモホール(cremophors)、及び油性混合物
。これらの物質は、溶液、懸濁液、ゲル、水／油（ｗ／ｏ）、水／油／水（ｗ／
ｏ／ｗ）、油／水（ｏ／ｗ）若しくは油／水／油（ｏ／ｗ／ｏ）型のエマルジョ
ン又はマイクロエマルジョンとして調製され得る。凍結乾燥された核酸（例えば
、プラスミドＤＮＡ）の油性懸濁液が利用され得る。これらの油性懸濁液に対す
るキャリアとしては、ゴマ油、綿実油、ダイズ油、レシチン、トゥイーン、スパ
ン及びミグリオールが挙げられるがこれらに限定されない。「溶液」とは、核酸
を含有する水溶性ポリマー及び／又は界面活性剤の溶液を意味する。「懸濁液」
とは、懸濁された核酸を含有する、水に不溶性の油を意味する。「ゲル」とは、
核酸を含有する高粘度のポリマーを意味する。「エマルジョン」とは、少なくと
も２つの混和しない液体相を含む分散系を意味する。エマルジョンは、通常、０
．０２〜１００ミクロンの範囲の分散された粒子を有する。水相中の核酸は、ｗ
／ｏエマルジョンを作製するために油中に分散され得る。このｗ／ｏエマルジョ
ンは、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンを得るために、別々の水相中に分散され得る。あ
るいは、適切な油が、ｏ／ｗエマルジョンを形成するために水相中に分散され得
る。「マイクロエマルジョン」は、ミセルとエマルジョンとの中間の性質を有し
、そしてそれらは、均質、透明かつ熱力学的に安定であるという点で特徴付けら
れる。それらは、油、水、界面活性剤及びコサーファクタント(cosurfactant)が
一緒に混合される場合に自発的に形成する。代表的には、分散相の直径は、０．
０１〜０．１ミクロン（通常、ｗ／ｏ及びｏ／ｗ型）である。
【００６９】 核酸のバイオアベイラビリティを延長する化合物もまた、分子間力及び/又は
原子価結合（例えば、ファンデルワールス力、イオン双極子相互作用、イオン誘
導性双極子相互作用、水素結合、又はイオン結合）によって核酸と相互作用又は
会合し得る。これらの相互作用は、以下の機能を果たし得る：（１）遮蔽(shiel
ding)によりヌクレアーゼから核酸を立体選択的に保護する；（２）エンドサイ
トーシスにより核酸の細胞性取り込みを促進する。示される所望の効果を達成す
るために、核酸のバイオアベイラビリティを延長させる化合物が両親媒性特性を
有する（即ち、親水性領域及び疎水性領域の両方を有する）ことが所望されるが
、必ずしも必要とされない。化合物の親水性領域は、核酸の大きなイオン性及び
親水性領域と会合し得、一方、この化合物の疎水性領域は、核酸の拡散を遅延さ
せ、かつヌクレアーゼから核酸を保護するように作用し得る。さらに、疎水性領
域は、細胞膜と特異的に相互作用し得、おそらく、化合物のエンドサイトーシス
を促進し、それによりこの化合物と会合している核酸のエンドサイトーシスを促
進する。このプロセスは、核酸の細胞周囲の濃度を増加させ得る。両親媒性特性
を有し得、かつ医薬的に許容可能と一般にみなされる薬剤は、以下である：メチ
ルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセル
ロース；ヘテロポリサッカリド（ペクチン）；ポロキサマー（プルロニック）；
ポロキサミン（テトロニック）；エチレンビニルアセテート；ポリエチレングリ
コール；ポリビニルピロリドン；キトサン；ポリビニルアルコール；ポリビニル
アセテート；ホスファチジルコリン（レシチン）；プロピレングリコール；ミグ
リオール；ポリ乳酸；ポリヒドロキシ酪酸；キサンタンゴム。また、コポリマー
系（例えば、ポリエチレングリコール−ポリ乳酸（ＰＥＧ−ＰＬＡ）、ポリエチ
レングリコール−ポリヒドロキシ酪酸（ＰＥＧ−ＰＨＢ）、ポリビニルピロリド
ン−ポリビニルアルコール（ＰＶＰ−ＰＶＡ）、及び誘導体化コポリマー（例え
ば、ｎ−ビニルプリン（又はピリミジン）誘導体及びｎ−ビニルピロリドンのコ
ポリマー。
【００７０】 核酸は、核酸又は複合体の溶液中に膨張可能なヒドロゲル系を置くことによっ
て、生分解性ヒドロゲル（例えば、架橋したポリサッカリド）、及びＰＥＧベー
スのゲル中にロードされ得る。膨張可能なヒドロゲルとしては、ポリアミンと架
橋した酸化アラビノガラクタン及びデキストラン；カルシウム架橋したアルギネ
ート、ポロキサミン（テトロニック）及びポロキサマー（プルロニック）が挙げ
られるがこれらに限定されない。
【００７１】 本発明は、ここで、以下の実施例における特定の好ましい実施形態に関して詳
細に記載されていることにより、その局面がより十分に理解及び認識されるが、
これらの特定の実施形態に本発明を制限するように意図されない。対照的に、添
付の特許請求の範囲により定義されるような本発明の範囲内に含まれ得るような
、全ての代替物、改変及び等価物を含むことが意図される。従って、好ましい実
施形態を含む以下の実施例は、本発明の実施を例示するために提供され、示され
る特定のものは、本発明の好ましい実施形態の例のため、及び例示的な議論を目
的とするのみであり、処方手順並びに本発明の原則及び着想の局面の最も有用か
つ容易に理解される記述であると考えられるものを提供するために提示されてい
る。
【００７２】 ここで図を詳細に特に参照すると、示される特定のものは、例としてであり、
かつ本発明の好ましい実施形態の例示的な議論を目的とするのみであり、本発明
の原則及び着想の局面の最も有用かつ容易に理解される記述であると考えられる
ものを提供するために提示されている。これに関して、本発明の基本的な理解に
必要とされるよりも詳細に本発明の構造的な詳細を示す試みはなされていない。
本発明のいくつかの形態が実施においてどのように具体化され得るかは、図面及
び記述を参考にすることにより当業者に明らかである。
【００７３】 （実施例１：ポリサッカリドへのオリゴアミンのグラフト化及びその生物学的試
験） アラビノガラクタン（ＡＧ，分枝ポリサッカリド，ＭＷ＝２５，０００）、デ
キストラン（Ｄｅｘ，線状１，６−ポリグルコース，ＭＷ＝３０，０００）又は
プルラン（Ｐｏｌ，線状１，４−ポリグルコース，ＭＷ＝５０，０００）にコン
ジュゲートされた、一定範囲のポリエチレンイミン（ＰＥＩ，ＭＷ＝６００）、
スペルミン（４つのアミン）及びスペルミジン（３つのアミン）を調製した。ポ
リサッカリドのポリアルデヒドへの酸化後に、このオリゴアミンをアミン又はイ
ミン結合によってグラフト化した。生物学的活性について試験したポリマー間の
差異は、以下であった： １．用いたオリゴアミン（ＰＥＩ、スペルミン又はスペルミジンのいずれか）；
２．ポリサッカリドの型（ＡＧ、プルラン又はＤｅｘ）； ３．結合の型（アミン又はイミン）； ４．サッカリド単位あたりのオリゴアミンの含量； 全てのポリマーは、ポリマーキャリア中の約４％のサッカリド単位にグラフト化
されたＴｒｉｔｏｎ１００残基を含んだ。このグラフト化は、以下、及びJ. Pit
haら (ポリサッカリドに連結したデタージェント：膜及び細胞上での調製及び効
果, Eur. J. Biochem. 94, 11-18, 1979)に記載されるように、Ｔｒｉｔｏｎの
エポキシド又はカルボン酸誘導体とポリサッカリドとを、ＤＭＦ：水の混合液中
で反応させることによってポリサッカリドに適用された。
【００７４】 以下の物質を調製し、そして種々のグラフトの合成において使用した： ―ＡＧ（１：１）：１モルのサッカリド単位と１モルの過ヨウ素酸塩とを反応さ
せることによって産生された酸化アラビノガラクタン（３５％のサッカリド単位
を、ジアルデヒドに変換した）。 ―ＡＧ（１：５）：１モルのサッカリド単位と０．２モルの過ヨウ素酸塩とを反
応させることによって産生された酸化アラビノガラクタン（８％のサッカリド単
位を、ジアルデヒドに変換した）。 ―Ｄｅｘ（１：１）：１モルのサッカリドと１モルの過ヨウ素酸塩とを反応させ
ることによって産生された酸化デキストラン（５０％のサッカリド単位を、ジア
ルデヒドに変換した）。 ―Ｐｏｌ（１：１）：１モルのサッカリド単位と１モルの過ヨウ素酸塩とを反応
させることによって産生された酸化プルラン（酸化の程度を決定しなかった）。
―ＰＥＩ：ポリエチレンイミン（Ｍｗ＝６００）。 ―Ｒｅｄ：還元されたコンジュゲート（アミン結合）。 ―Ｕｎｒｅｄ：還元されていないコンジュゲート（イミン結合）。 ―Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００は、以下の構造の両親媒性分子である ： Ｃ8Ｈ17−Ｃ6Ｈ4−（Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ2）9〜10−ＯＨ
【００７５】 コンジュゲーションに用いたアミノ化合物の構造
【００７６】
【化１】
【００７７】 ポリサッカリドの酸化（Ｉ）及び酸化ポリサッカリドとポリアミンとの間の典 型的な反応（ＩＩ）を、以下の式により示す：
【００７８】
【化２】
【００７９】 （疎水性又は両親媒性残基のグラフト化） 疎水性又は両親媒性残基の付着は、文献（例えば、Y. Takakuraら, デキスト
ランとのコンジュゲーションによる大豆チロシンインヒビターの薬学的特性の制
御 Ｉ：合成と同定, J. Pharm. Sci. 78, 117-121, 1989年; G. H. Hermanson,
バイオコンジュゲート技術, Academic Press, 1996年）から採用される種々の
方法によって実行され得る。本発明者らは、以下の方法を使用した。
【００８０】 コンジュゲートされる成分上の官能基のアベイラビリティに依存して、疎水性
残基を、エステル、アミド、イミン、アミン、ウレタン又はカルボネート結合に
より一般的にコンジュゲートさせた。例えば、水性媒体により適切である、活性
化された酸（例えば、無水物若しくは酸クロリド誘導体）又は活性化剤（例えば
、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）及びその誘導体）を使用して、脂
肪酸（例えば、ヘキサン酸又はオレイン酸）をポリマーキャリア上のヒドロキシ
ル又はアミン基に結合させる。あるいは、ホスゲン誘導体を使用して、カルボネ
ート又はウレタン結合を介して、ヘキシル又はオレイルアルコール又はアミンを
コンジュゲートした。ヒドロキシル端を直接的に介して、あるいはカルボン酸に
ヒドロキシル端基を変換することによって（コハク酸、グルタル酸若しくはマレ
イン酸無水物とアルコールとを反応させることによって）、又は反応性エポキシ
ド基にヒドロキシル端基を変換することによって（エピクロルヒドリンと反応さ
せることによって）のいずれかで、ポリエチレングリコールオリゴマー及び誘導
体をコンジュゲートした。このコンジュゲーション反応を、親水性溶液（これに
ポリマーキャリアが可溶性であるか、又は大きな表面積を有する微細な粒子で少
なくとも分散している）中で行なう。典型的な媒体は、ジメチルホルムアミド（
ＤＭＦ）、Ｎ−メチルピロリジン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）及び水と
のそれらの混合液である。
【００８１】 細胞侵入及びトランスフェクションに適切なグラフト量は、ポリマーキャリア
を構築する１〜１０％の範囲の反復単位（即ち、サッカリド単位）である。この
量は、付いている基の性質、最終生成物及びポリマーキャリアの性質に依存する
。
【００８２】 代表的な実験において、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（７ｇ、１０ｍｍｏｌ）を、
トルエンとの共沸蒸留によって乾燥させた。溶媒の留去後に、ＳｎＣｌ４（５
１．４ｇ、１５ｍｍｏｌ）及びこの混合液を、１００℃で一晩維持した。この溶
媒を留去し、エーテルと混合し、冷１Ｎ ＮａＯＨで抽出した。エーテル層を、
ＭｇＳＯ４で乾燥させ、留去することで乾燥させ、エポキシ末端化Ｔｒｉｔｏｎ
（収率７０％）を得た。この生成物を、ＴＬＣ（シリカ，トルエン：クロロホル
ム）及びＨ ＮＭＲ（芳香族プロトン ５．９〜６．７ｐｐｍ）により同定した
。
【００８３】 あるいは、乾燥Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を、還流下でトルエン中コハク酸無水
物と一晩反応させ（１：１．１モル比）、Ｈ−ＮＭＲ、ＩＲ及び滴定により決定
されるように対応するコハク酸誘導体を得た。
【００８４】 既知の手順を使用して、ヒドロキシル末端とジホスゲンとの反応からＴｒｉｔ
ｏｎのクロロホルメート誘導体を調製した。これらの官能基化付与されたＴｒｉ
ｔｏｎのグラフト化を、適切な条件下で、ＤＭＦ又はＤＭＦ：水溶液中で行なっ
た。例えば、エポキシド末端化Ｔｒｉｔｏｎ（０．５ｇ）を、１Ｎ ＮａＯＨ（
１０ｍｌ）中でデキストラン（２ｇ）と室温で一晩反応させた。このポリマーを
水に対する透析により精製して、そして凍結乾燥した。誘導体化率は、サッカリ
ド基のうち約５％であった。
【００８５】 水溶性ＤＣＣを使用して、カルボン酸Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を、ＤＭＦ及び
水の混合液中でアラビノガラクタンと反応させた。クロロホルメートＴｒｉｔｏ
ｎを、乾燥ＤＭＦ中でポリサッカリド懸濁液と室温で３日間反応させた。Ｔｒｉ
ｔｏｎをサッカリド基に対し過剰で反応させ、５％コンジュゲートを得た。
【００８６】 同様の手順を、メトキシ−ＰＥＧ−ＯＨ又はＬｉｐｏ−ＰＥＧのコンジュゲー
ト（（ＰＥＧ）10〜100を有する脂肪酸（例えば、ステアリル、オレイル又はヘ
キサノイル基）のジブロックポリマー）に適用した。
【００８７】 親水性ポリサッカリドへの高度に疎水性の残基（例えば、脂肪酸及びコレステ
ロール）のコンジュゲーションを、有機溶媒（ＤＭＦ又はＤＭＳＯ）中で行い、
コンジュゲートの収率は低かったが（１〜５％のサッカリド単位）、遺伝子処方
物に適切であった。
【００８８】 疎水性又は両親媒性残基を、酸化されたポリサッカリドにアミン又はイミン結
合を介してコンジュゲートした。この場合において、ポリサッカリドのアミン化
について以下に記載されるように、グリシン若しくはアラニンでのエステル化に
よって、又はトシレート／アンモニア手順を使用してヒドロキシル基をアミンに
置換することによって、Ｔｒｉｔｏｎ及びＰＥＧ誘導体のヒドロキシル末端をア
ミノ末端に変換した。
【００８９】 スペルミンのグラフト化について使用された手順と同様に、アミン末端化ＰＥ
Ｇ誘導体、コレステリルアミン又は脂肪アミンを、塩基性緩衝溶液（ｐＨ９〜１
１）又はＤＭＦと水との混合液中で一晩、酸化されたポリサッカリドと反応させ
た。反応混合液にオリゴアミン及び両親媒性誘導体の両方を添加することにより
、グラフト化をオリゴアミンのコンジュゲーションの間に行ない得る。ＮａＢＨ
４水を使用して、イミン誘導体に室温で２４時間水素付加反応を行い、対応する
アミン結合を得た。
【００９０】 （オリゴアミングラフトポリマーの合成）１）イミン及びアミン結合を介したＡＧ−ＰＥＩ（１単位あたり１．２５） ０．５ｇの酸化されたアラビノガラクタン（１：５、〜０．５ｍｍｏｌのアル
デヒド）及び０．１８ｇのＰＥＩ（０．６２５ｍｍｏｌ）を２０ｍｌのホウ酸緩
衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝１１）中に溶解した。この溶液を室温で４８時間混合し
た。１２，０００カットオフ（ｃｕｔ−ｏｆｆ）セルロースチューブを使用して
溶液の半分（１０ｍｌ）をＤＤＷに対し透析し、凍結乾燥して、水に不溶性であ
るイミンコンジュゲートを得た。残りの半分を過剰のホウ化水素ナトリウムと室
温で一晩反応させ、ＤＤＷに対し透析し、凍結乾燥して、水溶性のアミンコンジ
ュゲートを得た。 アルデヒド／ＰＥＩ（１：１．２５，モル比）
【００９１】２）イミン及びアミン結合を介したＤｅｘ−ＰＥＩ（ＰＥＩ低含量、１対７．５ 単位） ０．３ｇの酸化されたデキストラン（１：１、１．８７５ｍｍｏｌのアルデヒ
ド）及び０．１５ｇのＰＥＩ（０．２５ｍｍｏｌ）を２０ｍｌのホウ酸緩衝液（
０．１Ｍ、ｐＨ＝１１）中に溶解し、室温で４８時間混合した。この溶液を上記
のように処理して、純粋なイミン及びアミンコンジュゲートを得た。 アルデヒド／ＰＥＩ（７．５：１，モル比）
【００９２】３．イミン及びアミン結合を介したＡＧ−スペルミン（わずかな酸化、スペルミ ン低含量） ０．５ｇの酸化されたＡＧ（１：５、０．３７５ｍｍｏｌアルデヒド）及び０
．０８ｇのスペルミン（０．３８ｍｍｏｌ）を２０ｍｌホウ酸緩衝液（０．１Ｍ
、ｐＨ＝１１）中に溶解し、室温で４８時間混合した。この溶液を上記のように
処理し、純粋なイミン及びアミンコンジュゲートを得た。 アルデヒド／スペルミン（１：１，モル比）
【００９３】４）イミン及びアミン結合を介したＤｅｘ−スペルミン ０．２５ｇの酸化されたデキストラン（１：１、１．５６ｍｍｏｌアルデヒド
）及び０．１ｇのスペルミン（０．５ｍｍｏｌ）を２０ｍｌホウ酸緩衝液（０．
１Ｍ、ｐＨ＝１１）中に溶解し、室温で４８時間混合した。この溶液を上記のよ
うに処理し、純粋なイミン及びアミンコンジュゲートを得た。 アルデヒド／スペルミン（３：１，モル比）
【００９４】５）イミンおよびアミン結合を介したＤｅｘ−スペルミジン ０．５ｇの酸化デキストラン（１：１、３．１２５ｍｍｏｌのアルデヒド）お
よび０．２ｇのスペルミジン（１．３７ｍｍｏｌｅ）を２０ｍｌのホウ酸緩衝液
（０．１＜、ｐＨ＝１１）中に溶解し、室温で４８時間混合した。溶液を上記の
ように処理して、純粋なイミンおよびアミンのコンジュゲートを得た。 アルデヒド／スペルミジン（２：１、モル比）。
【００９５】６）デキストランのアミノ化 １０ｇの酸化デキストラン（１：１、６．２５ｍｍｏｌｅのアルデヒド）を１
００ｍｌの濃縮した水酸化アンモニウム（２５％アンモニア）中に溶解した。溶
液を２日間室温で混合し、過剰の水素化ホウ素ナトリウムを添加し、溶液を同一
条件下でさらに２４時間攪拌した。過剰のアンモニアをエバポレートし、ポリマ
ー溶液をＤＤＷで透析し、乾固するまで凍結乾燥した。
【００９６】７）高希釈（high dilution）によって得られる、イミンおよびアミン結合を介
したＤｅｘ−スペルミン ２００ｍｌのホウ酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝１１）中の０．２ｇの酸化デキ
ストラン（１：１、１．２５ｍｍｏｌｅのアルデヒド）および０．２ｇのスペル
ミン（１．０ｍｍｏｌｅ）を３日間室温で混合し、次いで、過剰のリジン（０．
５ｇ）を添加して過剰のアルデヒドを飽和させ、混合物をさらに２４時間同一条
件下でさらに混合した。溶液を上記のように処理して純粋なイミンおよびアミン
のコンジュゲートを得た。 アルデヒド／スペルミン（１．２５：１ モル比）。
【００９７】８）高希釈によって得られる、イミンおよびアミン結合を介したＤｅｘ−スペル ミジン スペルミンの代わりにスペルミジンを使用する以外は、（７）と同一の手順お
よび量を使用した。得られたイミンおよびアミンのコンジュゲートは水に可溶性
であった。 アルデヒド／スペルミジン（１：１、モル比）
【００９８】９）高希釈によって得られる、イミンおよびアミン結合を介したＡＧ−ＰＥＩ ０．５ｇの酸化ＡＧ（１：１、１．８７５ｍｍｏｌｅのアルデヒド）および１
．２ｇのＰＥＩ（２ｍｍｏｌ）を１．０リットルのホウ酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐ
Ｈ＝１１）中に溶解し、３日間室温で混合した。過剰のリジン（１．０ｇ）を溶
液に添加し、過剰の未反応のアルデヒドを飽和させ、さらに２４時間同一条件下
でさらに混合した。溶液を上記のように処理して純粋なイミンおよびアミンのコ
ンジュゲートを得た。 アルデヒド／ＰＥＩ（約１：１、モル比）。
【００９９】１０）イミンおよびアミン結合を介したＤｅｘ−スペルミン（高酸化および高ス ペルミン含量） ０．５ｇのデキストラン（１：１、３．１２５ｍｍｏｌｅのアルデヒド）およ
び０．２５ｇのスペルミン（１．２５ｍｍｏｌｅ）を４０ｍｌのホウ酸緩衝液（
０．１Ｍ、ｐＨ＝１１）中に溶解し、２日間室温で混合した。溶液を上記のよう
に処理して純粋なイミンおよびアミンのコンジュゲートを得た。 アルデヒド／スペルミン（２．５：１、モル比）。
【０１００】１１）イミンおよびアミン結合を介したＡＧ−スペルミン ０．５ｇのＡＧ（１．５、０．３７５ｍｍｏｌｅのアルデヒド）および０．２
５ｇのスペルミン（１．２５ｍｍｏｌｅ）を４０ｍｌのホウ酸緩衝液（０．１Ｍ
、ｐＨ＝１１）中に溶解し、２日間室温で混合した。溶液を上記のように処理し
て純粋なイミンおよびアミンのコンジュゲートを得た。 アルデヒド／スペルミン（３．３：１ モル比）。
【０１０１】１２）イミンおよびアミン結合を介したプルラン−スペルミン（高酸化および高 スペルミン含量） ０．５ｇの酸化プルラン（１：１、５０％酸化を想定して３．１２５ｍｍｏｌ
ｅ）および０．２５ｇのスペルミン（１．２５ｍｍｏｌｅ）を４０ｍｌのホウ酸
緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝１１）中に溶解し、２日間室温で混合した。溶液を上
記のように処理して純粋なイミンおよびアミンのコンジュゲートを得た。 アルデヒド／スペルミン（２．５：１、モル比）。
【０１０２】１３）アミン結合を介したＰＵＬ−スペルミン ０．２５ｇの酸化プルラン（１：１、５０％の酸化を想定して１．５６ｍｍｏ
ｌｅのアルデヒド）および０．２５ｇのスペルミン（１．２５ｍｍｏｌｅ）を４
０ｍｌのホウ酸緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ＝１１）中に溶解し、４８時間室温で混
合した。過剰の水素化ホウ素を添加し、さらに２４時間同一条件下でさらに混合
した。溶液を上記のように処理して純粋なイミンおよびアミンのコンジュゲート
を得た。 アルデヒド／スペルミン（約１：１、モル比）。
【０１０３】生物学的な試験、ポリマーのトランスフェクション特性の評価 培養物中の哺乳動物のＨＥＫ−２９３細胞株へのＧＦＰおよびルシフェラーゼ
レポーター遺伝子の送達を用いて、遺伝子キャリアとしてポリマー−ＤＮＡ複合
体の効果を評価した。
【０１０４】 遺伝子導入効率をトランスフェクトされた細胞におけるレポーターの発現レベ
ルを測定することによって決定した。定量的なトランスフェクションアッセイを
用いて、ポリマー−ＤＮＡ複合体の組成の迅速な最適化を達成する。ＧＦＰの使
用によって、効率の直視化および発現時間の最適化が可能となる。ＤＮＡおよび
ポリマーの連続希釈を９６ウェルプレートで別個に行い、合わせて、ポリマー−
ＤＮＡ複合体の様々な製剤を得る。ＨＥＫ−２９３細胞を使用した。なぜならこ
れらの細胞株は、多くの市販され使用されている導入剤に対して様々な効率レベ
ルを示すからである。９６ウェルプレート中に接種した細胞を種々の複合体組成
物と共に数時間インキュベートする。ＥＬＩＳＡリーダーにおいて、光信号の生
成によってルシフェラーゼ活性をアッセイした。約３０％のトランスフェクショ
ン率は、リン酸カルシウム溶液によって得られる、この種の細胞としては最大の
率であると考えられる。本明細書中以下の表１に報告される結果（０−トランス
フェクションなし、＋＋＋＋高トランスフェクション）は、最大率（３０％）に
対応している。
【０１０５】 発現ベクター：（大半の細胞において高効率で発現する）ＣＭＶプロモーター
、または調節されたレベルの産物を得るのにより適したプロモーター（例えば、
ｂ−アクチンプロモーターおよびＰＧＫプロモーター）を有するプラスミドを使
用した。これらのクローンのセットを全て、レポーター遺伝子、ＧＦＰ（遺伝子
蛍光タンパク質）およびルシフェラーゼとともに使用した。（他の同様のＣＡＴ
またはｂ ｇａｌとは対照的に）両レポーターの利点は、ルシフェラーゼのアッ
セイの非常に高い感度およびＧＦＰ発現を伴う非常に早期の段階で発現を検出す
る機会である。
【０１０６】 ルシフェラーゼのアッセイは、ｆｍｏｌｅの範囲での検出が可能なＡＴＰ／ル
シフェラーゼキットによって使用された。ＧＦＰ発現のアッセイは、蛍光顕微鏡
下での可視化、ならびにトランスフェクションの有効性と発現レベルのモニタリ
ングに依る。
【０１０７】 使用する２つのベクターは以下である： １．ＰＥＧＨ−Ｎ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）：ｗｉｅｌｄタイプＧＦＰよりも３５
倍の蛍光強度を生じるＰＣＭＶプロモーター下での哺乳動物の発現に有用である
。 ２．ＰＧＬ２−ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）：ルシフェラーゼ遺伝子を有する
ＳＶ４０プロモ−ター下での発現に有用である。 ルシフェラーゼアッセイをＰｒｏｍｅｇａキット（１０−２０ｍｏｌｅの感度
）のように行った。ルシフェラーゼの検出を、ｋｉｖｖｅｔｅｓまたは９６ウェ
ルプレートフォーマットを用いたルミノメーターによって行った。極端に感度の
高い測定は、インビボ（動物組織）実験の検出プローブとして非常に有用であっ
た。最新のマイクロプレート ルミノメーターは、２０ａｍｏｌ未満のＡＴＰの
検出限界ならびに７桁の直線性を有するダイナミックレンジを可能にする。
【０１０８】 プラスミドＤＮＡと複合体を形成するポリマーの能力をゲル遅延測定法によっ
て評価した。ベータガラクトシダーゼプラスミドのサンプルを様々な量のポリマ
ーと共にインキュベートした。インキュベーション後、サンプルを、アガロース
ゲルを通して電気泳動し、エチジウムブロマイドで染色し、複合体化したＤＮＡ
の電気泳動移動度におけるシフトを視覚化した。遺伝子の複合体化についてＤＳ
Ｃ分析を用いた。
【０１０９】 本発明者らは、多くのポリマーがＤＮＡと複合体を形成し（表１）、いくつか
のポリマーが、細胞内での有意な発現を細胞への毒性の兆候なく示すことを発見
した。
【０１１０】 典型的な実験を以下のように行った：ＨＥＫ細胞およびＣＯＳ細胞（２５，０
００／ｃｍ2または５×１０5細胞／６０ｍｍ培養皿）を実験の１日前にプレート
に培養した。細胞を無血清培地で緩やかに洗浄し、皿あたり０．５ｍｌの無血清
培地を添加した。プラスミドＤＮＡ（５００ｍｌの血清フリーの滅菌チューブ中
に５ｍｇ）を１時間置いたままにした。複合体化用のポリマー試薬をプラスミド
溶液に添加し、十分に混合し、細胞に添加し（６０ｍｍのプレートに全体で１．
５ｍｌ）、約４時間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、
血清を含む完全培地を４ｍｌ用いて細胞を緩やかに３７℃で覆った。細胞の混合
物を（ルシフェラーゼおよびベータガラクトシダーゼについて）約４８〜７２時
間インキュベートした。ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を有するトランスフェク
トされた細胞を計数することによって、トランスフェクション効率を決定した。
【０１１１】
【表１】
【０１１２】* 分子量をＧＰＣによって決定した。ＦＩＴＣプローブと全てのポリアミンを
反応させた後、ＵＶランプを用いて４５４ｎｍで検出を行った。標準の保持時間
を屈折率検出器で決定した。Ｄｅｘ＝デキストラン、ＡＧ＝アラビノガラクタン
、Ｐｕｌ＝プルラン。ポリマーコードは実験の説明に対応し、ａを付したサンプ
ル（例えば２ａ）は、未還元誘導体のアミン誘導体である。トランスフェクショ
ンの効率を以下のように等級分けした：０−活性なし；＋／−痕跡程度の活性；
＋少しの活性；＋＋、＋＋＋および＋＋＋＋は活性の増加を示す（＋＋＋＋はＣ
ａホスフェートトランスフェクションに近い活性を示す） 上記の実験からの結論： １．最も活性なグラフトは、アミン結合によって結合されたスペルミンであった
。イミン結合誘導体は、グラフト化されたオリゴアミンをわずか３つの有効なア
ミン基を有するままにしておく、イミン結合に使用される１つのアミン基の損失
のせいで低活性であった。２． グラフト化した（３つのアミンを含む）スペルミジンは、アミンまたはイミ
ンのコンジュゲーション結合のいずれの場合も低活性であった。３． 濃縮溶液で調製されたスペルミングラフトは、低トランスフェクションをも
たらす、低一級アミン含量を残す両一級アミンの結合をいくらか生じた。４． グラフト化されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、有効であったが、スペ
ルミンより低かった。５． 全ての３つのポリサッカリド、デキストラン、アラビノガラクタンおよびプ
ルランは、生物分解性キャリアとして有効であった。６． 両親媒性または疎水性の側鎖基を有するオリゴアミングラフトポリマーは容
易に細胞に侵入した。
【０１１３】 （実施例２：二級アミンを介したスペルミンのコンジュゲーション） 一級アミンをインタクトなままで残しておく一方で、二級アミンを介してスペ
ルミンおよび同様のオリゴマーをグラフト化させるために、以下の戦略を使用し
た。穏やかに活性なカルボベンゾキシ−イミダゾールを使用して一級アミンをカ
ルボベンゾキシ基で特異的に保護した。次いで、トシル化またはメシル化された
ポリサッカリド誘導体と試薬を反応させることによって、保護されたオリゴアミ
ンをデキストランまたはアラビノガラクタン上にグラフト化した。次いで、アミ
ノ酸を保護するのに使用する一般的な手順によって保護基を除去した。ポリマー
中の一級アミンの量をフルオレスカミンまたはＴＮＢＳ法によって決定した。
【０１１４】Ｎ1−Ｎ12−ジカルボベンゾキシスペルミンの合成 １）カルボベンゾキシイミダゾールの合成
【０１１５】
【化３】
【０１１６】 乾燥ＤＣＭ中のクロロギ酸ベンジル（１０．０ｇ、５８．６６ｍｍｏｌ．）を
０℃（氷浴）に冷却し、９０．０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中のイミダゾール（８．０ｇ
、１１７．５ｍｍｏｌ．）の溶液を窒素雰囲気下で滴加した。反応混合物を室温
まで昇温し、さらに３０分間攪拌した。反応混合物をＤＣＭを用いて希釈し、１
０％のクエン酸で３回洗浄した（３×１００ｍｌ）。有機層を分離し、ＭｇＳＯ 4 で乾燥し、濾過し、エバポレートして無色油状物を得た。収率は９０％であっ
た。1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：５．３８（ｓ,２Ｈ）および７．００−８．２６（
ｍ,８Ｈ）ｐｐｍ。
【０１１７】 ２）Ｎ1−Ｎ12−ジカルボベンゾキシスペルミンの合成
【０１１８】
【化４】
【０１１９】 ５．０ｍｌの無水ＤＣＭ中の２００．０ｍｇのカルボベンゾキシイミダゾール
および２０．０ｍｇのＤＭＡＰを窒素雰囲気下で０℃に冷却した。２００．０ｍ
ｇのスペルミンを５．０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中に滴加した。溶液を０℃で１時間、
室温で一晩攪拌した。溶媒を真空下でエバポレートし、２０．０ｍｌの酢酸エチ
ル中に再溶解し、１０％クエン酸で２回洗浄し（２×１０ｍｌ）、ＤＤＷで２回
洗浄した（２×１０ｍｌ）。有機層を分離し、ＭｇＳＯ4で乾燥し、濾過し、乾
固するまでエバポレートし、無色固体を得た。この固体をｎ−へキサンに懸濁し
、濾過し、ｎ−へキサン（２０ｍｌ）で洗浄し、Ｐ2Ｏ5を用い真空下で一晩乾燥
させた。収率は６０％であった。1 Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：１．４−１．７（ｍ,２０Ｈ；スペルミンの水素）
、５．１３２（ｓ,４Ｈ；ベンジルのメチレン基）および７．２−７．４（ｍ,１
０Ｈ；ベンジル基の芳香族水素）ｐｐｍ。
【０１２０】１）アミン形成を介した、デキストラン／ＡＧへのＮ1−Ｎ12−ジカルボベンゾ
キシスペルミンのコンジュゲーション：
【０１２１】
【化５】
【０１２２】 トシル化されたポリマーおよび保護されたスペルミンをＤＭＦ中に溶解し、塩
基性条件下（過剰のトリエチルアミン）、２日間室温で混合して、グラフト重合
ポリマーを得た。保護基を酢酸中のＨＢｒ中で除去した。
【０１２３】２）Ｎ1−Ｎ12−ビス（トリフルオロアセチル（trifluroacetyl））スペルミン
の合成：
【０１２４】
【化６】
【０１２５】 アセトニトリル（１５ｍｌ）中のスペルミン（５ｍｍｏｌｅ）にトリフルオロ
酢酸エチル（２５ｍｍｏｌｅ）および水（１２ｍｍｏｌｅ）を添加した。溶液を
一晩還流し、溶媒を除去して、淡黄褐色の固体を得た。この固体をＤＣＭで洗浄
し、良好な収率（９５％）で帯淡黄色の固体としてＮ1，Ｎ12−ビストリフルオ
ロアセチルスペルミンを得た。固体を酢酸エチルから再結晶して白色固体を得た
。
【０１２６】 先に記載したように、保護されたスペルミンをトシル化されたポリサッカリド
に付け、トリフルオロアセチル基をメタノール性溶液中の濃アンモニア中で除去
した。
【０１２７】３）モノ−（トリフルオロアセチル）スペルミンの合成： トリエチルフルオロアセテート（triethyl fluroacetate）との反応（１．０
当量、ＭｅＯＨ、−７８℃で１時間、次いで０°で１時間）によって、スペルミ
ンを一級アミノ官能基上で選択的に保護して、主としてモノ−トリフルオロアセ
タミド（mono-trifluroacetamide）を含むが、ジ−トリフルオロアセタミドをも
含む混合物を得た。二つ保護されたスペルミン（di-protected spermine）から
一つ保護されたスペルミン（mono-protected spermine）をシリカゲルでのカラ
ムクロマトグラフィー（ＤＣＭ−ＭｅＯＨ−濃ＮＨ4ＯＨ ７０：１０：１〜５
０：１：１ ｖ／ｖ／ｖ）によって精製した。次いで、溶媒として穏やかな塩基
性の緩衝液（ｐＨ＝８）を用いて一つ保護されたアミンをジアルデヒドポリサッ
カリドに付着させた。得られたイミンコンジュゲートを水素化ホウ素で還元し、
濃アンモニアを用いてＴｆａ保護基を除去した。得られたコンジュゲートをＤＤ
Ｗに対して１２,０００のカットオフセルロースチューブを用いた透析によって
精製し、乾固するまで凍結乾燥した。この方法は、ポリマー鎖間の架橋および分
枝を最小にし、フリーのアミン官能基の最大限の濃度を生じた。
【０１２８】 （実施例３：アミド結合を介したポリサッカリドへのスペルミンのコンジュゲー
ション） ジ−アルデヒドポリサッカリドを塩化ナトリウム（sodium chlorite）で一晩
処理し、陰イオン交換クロマトグラフィー（ＤＯＷＥＸ−５０）によって精製し
てジカルボキシレート形態を得た。カルボキシレート含量を滴定によって決定し
、４０％（サッカリド単位）であることが分かった。ポリマーを凍結乾燥して良
好な収率で白色固体を得た。
【０１２９】 １．０当量の無水ポリマーおよびスペルミンの各々を乾燥ＤＭＦ中に溶解し、
触媒量のＤＭＡＰ（０．１当量）を添加した。ポリマー溶液を０℃に冷却し、１
．５当量のＥＤＣを添加した。混合物を窒素雰囲気下で一晩攪拌し、ＤＭＦを真
空中で除去した。残渣を水中に再溶解し、透析によって精製し、乾固するまで凍
結乾燥した。ポリマーに付いているスペルミンの含量を窒素の元素分析によって
決定した。
【０１３０】 （実施例４：ジカルボキシレートポリサッカリドへの一つ保護されたスペルミン
のコンジュゲーション） １．０当量のジカルボキシレートポリサッカリドおよびモノトリフルオロアセ
タミドスペルミンの各々を触媒量のＤＭＡＰ（０．１当量）を含む乾燥ＤＭＦ中
に溶解した。混合物を０℃に冷却し、１．５当量のＥＤＣを添加した。混合物を
窒素雰囲気下で一晩攪拌し、ＤＭＦを真空下で除去した。過剰量のＥＤＣを壊す
ために少量の水を添加し、そして溶液を濃アンモニア溶液で処理することによっ
て保護基（トリフルオロアセテート）を除去した。過剰のアンモニアを真空中で
除去し、混合物をＤＤＷに対して透析し、乾固するまで凍結乾燥した。スペルミ
ン含量を窒素の元素分析およびＴＮＢＳ法によって決定した。
【０１３１】 （実施例５：ポリカチオンの合成） 公知の還元的アミノ化合成によって、一級アミンとアルデヒドとの間にポリカ
チオンを調製した。簡潔には、ｄｄｗに溶解した所望のポリサッカリドの１．０
当量のアルデヒドを、ホウ酸緩衝液（０．１ｍ、ｐｈ＝１１．０）中に溶解した
１．１当モルのオリゴアミン［スペルミン、スペルミジン、オリゴエチレンイミ
ン（ｍｗ＝６００）、オリゴリジン（ｍｗ＝１０００）、エタンジアミン、ブタ
ンジアミン、ならびにリジンおよびオルニチンのアルキルエステル］を含む攪拌
溶液に滴加した。分枝を最小にし、ポリマー骨格へのオリゴアミン鎖のグラフト
化を容易にするために、添加速度を５．０ｍｌ／ｈを越えないようにした。オリ
ゴアミンの酸化を最小にするために、このコンジュゲーション反応を窒素雰囲気
下で実施した。混合物を２４時間攪拌し、次いで、過剰の水素化ホウ素ナトリウ
ム（開始アルデヒド含量に対して１当モル）を添加し、同一条件下でさらに２４
時間さらに攪拌した。次いで、コンジュゲート混合物を再蒸留水（ＤＤＷ、３．
５ｋ ＭＷＣＯ）に対して４℃で一晩透析し、減圧下で乾固するまで凍結乾燥し
た。セファデックスｇ−１０架橋ビーズおよび溶出液(eleunt)として再蒸留水（
ＤＤＷ）を使用したカラムクロマトグラフィーによって、還元されたコンジュゲ
ートの粉末をさらに脱塩した。生成物を含む画分（ニンヒドリン試験によって示
された）を回収し、さらに凍結乾燥して、帯黄色の最終形態生成物を全体収率６
０％で得た。上記の手順によって調製された種々のポリカチオンを、窒素の元素
分析、ＴＮＢＳ法による一級アミンの定量測定およびゲル浸透クロマトグラフィ
ー（ＧＰＣ）を用いたコンジュゲートの分子量によって特徴付けた。ほぼ１００
種類のポリカチオンを調製し、分析した。表２は、様々なポリサッカリドおよび
オリゴアミンから調製された代表的なポリカチオンを概要する：
【０１３２】
【表２】
【０１３３】トランスフェクションの有効性： １）ヒト成長ホルモンを用いたＮＩＨ−３Ｔ３細胞のトランスフェクション プラスミド（ＰＨＧＨ−ＣＭＶ）： トランスフェクション研究のために、我々はＮＩＨ−３ｔ３細胞を使用した。
簡単には、完全培地ｄｍｅｄ中の１．０ｍｌの細胞を培養プレート内の各ウェル
（培養プレートにつき６ウェル）に別個に添加した。各ウェルは、約１．２５×
１０5細胞を含む。トランスフェクションの前に細胞を２４時間予めインキュベ
ートした。ポリマー（表１）をＤＤＷ中に別個に溶解し、５ｍｍの濃度のアミン
（窒素の元素分析によって決定した）を得た。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて
各ポリカチオンの母液を希釈することで１ｍｍ溶液を調製した。
【０１３４】 ＤＮＡ（ＰＨＧＨ−ＣＭＶ）および様々な電荷率（０．０２５〜２、−／＋）
のポリカチオンの溶液を混合し、ＰＢＳで最終容量１８０μｌに希釈し、少なく
とも３０分間室温で放置した。
【０１３５】 次いで培地をウェルから除去し、１．０ｍｌの無血清培地を添加した。その後
、５０μｌの複合体（ＤＮＡ−ポリカチオン）を各ウェルに別個に添加した（５
０μｌ＝５ｎｍｏｌｅホスフェート、ウェルあたり１．６２μｇのプラスミドに
相当する）。次いで、培養物を４時間インキュベートし、無血清培地を新鮮な完
全培地に換え、２０時間インキュベートした。次いで、ウェルの上清を別個に回
収し、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）タンパク質（ＨＧＨイライザキット）につい
てアッセイした。ＤＯＴＡＰ：ｃｈｏｌ（１：１）、市販のカチオン脂質を参照
として使用した。
【０１３６】 約１００種類のポリカチオン（表２に記載のポリマーを含む）を様々な電荷率
でＮＩＨ−３ｔ３細胞中で別個に試験した。大半のポリカチオンがいくらかの活
性を示し、他方、デキストランおよびスペルミンから調製したポリカチオン（表
２、*を付したもの）は、最大活性であった。これらのユニークなポリカチオン
は、デキストラン（５０％酸化、開始ポリアルデヒドの分子量２７，５００）と
、グラフト化されるオリゴアミンとしてのスペルミンから調製された。２つの最
も活性なポリカチオン（ＴＡ−１−１２９ａおよびＧ１−ＴＡ−６）のトランス
フェクションの有効性は、２５および２８ｎｇ／ｍｌの成長ホルモンを放出し、
対して、参照である脂質、ｄｏｔａｐ−コレステロールは、１７ｎｇ／ｍｌのＨ
ＧＨを放出した。
【０１３７】 これらのポリカチオン（ＴＡ１−１２９ａおよびＧ１−ＴＡ−６）は、過剰の
陽電荷率（０．１〜０．０５−／＋）と共に使用される場合、ほとんどが活性で
あることが発見された。大過剰の陽電荷が必要である理由は、おそらく、ポリカ
チオンの構造に関連する。元素分析およびｔｎｂｓの両方で活性ポリカチオンの
スペルミン含量を比較すると（表２）、これらの構造が非常に分枝しており、か
つ約５０％のオリゴアミン分子が両側からポリマー鎖に付着されていることを示
した。この分枝が、二級アミンの高い割合を引き起こす。二級アミンは、生理学
的な条件下では全体的に荷電されていない。従って、ポリヌクレオチドとの複合
体化は、一級アミンとホスフェート基との間で最も生じるだろう。
【０１３８】ＧＦＰプラスミドを用いたＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション 本研究には、ＨＥＫ細胞を使用した。簡潔に言えば、２４ウェルをポリエチレ
ンイミン（ＰＥＩ）アルコール溶液でカバーした。トランスフェクション前日、
細胞をウェルに配置し、カウントした（１ウェルあたりおよそ１×１０5細胞）
。ＤＮＡ／ポリマー複合体を５つの異なるモル電荷比（０．５〜０．０５，−／
＋）で調製した。調製したすべての複合体において、一定量のＤＮＡ（０．５μ
ｇ）をＤＤＷ中０．３２２ｍｇ／ｍｌのストック溶液から使用した。すべての複
合体をグリセロールの存在下および非存在下でウェルに加えた。グリセロールは
、細胞膜を介した複合体の取り込みを促進するのに有用な試薬である。コントロ
ール実験には、リン酸カルシウムおよび市販のＴＲＡＮＳＦＡＳＴ（登録商標；
ｐｒｏｍｅｇａ）カチオン性リポソームを使用した。複合体およびコントロール
を細胞とともに７２時間インキュベートし、次いで、倒立蛍光顕微鏡により可視
化し、緑色の細胞の数を数え、コントロールと比較した。
【０１３９】 ポリマー ％トランスフェクション ポリエチレンイミン ｍｗ＝３０，０００ ４ ポリエチレンイミン ｍｗ＝６００，０００ ２ デキストラン−スペルミン アミン結合 １２ デキストラン−スペルミン アミン結合 １５ デキストラン−スペルミン アミン−ｔａ１−１２９ａ ４５ デキストラン−スペルミン アミン−ｈｅ−１００ ４５ デキストラン−スペルミン アミン−ｔａ１−２００ ３５ プルラン-スペルミン−アミン結合 １０ プルラン-スペルミン−イミン結合 ２ デキストラン−スペルミン イミン結合 １ リン酸カルシウム（参照） ４８
【０１４０】 表２からわかるように、コンジュゲートｔａ１−１２９ａ（デキストラン−ス
ペルミン）が最も活性であった（およそ４５％の細胞がトランスフェクトされた
）。アラビノガラクタンおよびプルランから構成されるコンジュゲート（ＡＧ−
スペルミンおよびＰＵＬ−スペルミン）もまた活性であったがより少ない程度で
あった（＜１５％）。ＰＥＩオリゴアミンおよび還元されていないもの（イミン
結合）から構成されるコンジュゲートはさらに活性が少なかった。
【０１４１】 最も活性なコンジュゲート（ＴＡ１−１２９ａ）を同じインビトロ系で再試験
し、グリセロールショックなしでさえ活性であることがわかった。
【０１４２】 異なるポリカチオンを様々なポリサッカリドおよびオリゴアミンから開始して
調製した。本研究で使用したポリサッカリドは、分枝アラビノガラクタン（２０
ｋｄ）、線状プルラン（約５０ｋｄ）および分子量９．３、１８．０、４０、７
４および５００ｋｄのデキストランであった。使用したオリゴアミンは主に、ス
ペルミンおよびスペルミジン、さらに合成オリゴアミン（すなわち、ポリエチレ
ンイミンおよび異なる長さの様々なジアミン）であった。これらのコンジュゲー
トのほとんどが濁度試験により測定されるように様々なプラスミドと安定な複合
体を形成したが（データ示さず）、少数のポリカチオンのみが細胞をトランスフ
ェクトするのに非常に活性であることがわかった。以下の条件で良好なトランス
フェクションが得られた。
【０１４３】 −還元デキストラン-スペルミンから構成されるコンジュゲートは、アラビノガ
ラクタンおよびプルランから同様な条件下で調製されるポリカチオンに比較して
、最も活性なポリカチオンであることがわかった。 −他のオリゴアミン（スペルミジン、ポリエチレンイミンおよび様々なジアミン
）を含むデキストランのコンジュゲートは細胞をトランスフェクトするのにより
活性が低かった。 −非還元コンジュゲート（すなわちイミン結合連結）は、すべての電荷比および
ポリマー組成物においてより活性が低いことがわかった。 −最大トランスフェクションは、０．０５〜０．５の電荷比（−／＋）で得られ
た。 −すべての活性なポリカチオンの分子量は、ＧＰＣにより測定した場合、６〜１
０ｋｄの間であった。 −より大きな分子量（＞１５ｋｄ）のコンジュゲートは、すべての電荷比でより
低い活性であることを示した。より大きな分子量は、ポリカチオンを中程度の条
件（すなわち４℃）で調製した場合に得られた。 −活性ポリカチオンの窒素含量は、窒素の元素分析で測定した場合、９．０〜１
２．０％（ｗ／ｗ）の間であった。
【０１４４】 活性ポリカチオンの遊離アミノ基は、スペルミンを標準として使用したＴＮＢ
Ｓ法により測定した場合、コンジュゲート１ｍｇあたり、８００〜１５００ｎｍ
ｏｌｅの間であった。
【０１４５】 （実施例６：ポリカチオン修飾） 最適なポリカチオンを、血清溶液中において良好なトランスフェクション効率
およびより良好な安定性を達成するために化学的に修飾した。 １）血清タンパク質および分解酵素に対してポリカチオン-ＤＮＡ複合体を保護
するための、ポリカチオン骨格上へのＰＥＧ鎖の固定。 ２）細胞への複合体取り込みを増加させるための、ポリカチオン骨格への疎水性
部分の固定。 ３）小さく均質な粒子（ｌｉｐｏ−ｐｏｌｙｐｌｅｘ）を得るための、脂質ベー
スのトランスファクタントとのポリカチオン-ＤＮＡ複合体の物理的混合。
【０１４６】 修飾したポリカチオンは、以下の式によって図示することができる。 これらの最適なポリカチオンは、より良好な組織特異性のため、さらに修飾さ
れている。これらの修飾には、肝組織に標的化するための、マンノース、グルコ
ースまたはガラクトースの付着が挙げられる。表３はまた、細胞標的化のために
可能なリガンド連結の概要を記載している。
【０１４７】
【化７】
【０１４８】
【表３】
【０１４９】
【化８】
【０１５０】 （実施例７：アルダル酸をベースとするポリサッカリドへのオリゴアミンのグラ
フト化） スペルミンおよびＰＥＩオリゴアミンを、先の実施例に記載した手順を用いて
、ポリ（アルキル−グルカラミド）にグラフト化した。ポリ（アルキル−Ｄ−グ
ルカラミド）一般構造 （ここでＲは、アルキル、エチレングリコールオリゴマー、またはアルキルアミ
ンオリゴマーである） をＡｖａｎｔｉ（Albaster, AL, USA）から得、Keilyら（単純な縮合反応による
非保護エステル化Ｄ−グルカル酸をベースとするヒドロキシル化ナイロン, J. A
mer. Chem. Soc. 116, 571-578, 1994）に記載の手順によって合成した。このポ
リマーへのオリゴアミンのグラフト化は、テッセレーション法(tessellation me
thod)により行った。代表的な実験では、５０ｍｇのポリ（エチレン−Ｄ−グル
カラミド）を、１９５ｍｇのトリエチルアミンを含有する４ｍｌのＤＭＦに溶解
した。トシルクロライド（１２２ｍｇ）の２ｍｌ ＤＭＦ溶液を混合物に添加し
た。溶液をアルゴン下一晩放置した。ＤＭＦをエバポレートし、残渣をジクロロ
メタン溶液からエーテル中沈殿することによって精製する。Ｈ ＮＭＲ分析は、
１モノマー単位あたり、平均０．８トシル単位を示した。このトシル化ポリマー
を、ｐＨ９のホウ酸緩衝液の希釈溶液中、２当量のスペルミンと室温で３日間反
応させ、元素分析およびＴＮＢＳ法によって決定されたように、スペルミン基に
よるトシル基の置換を得た。
【０１５１】 （実施例８：生分解性ポリマーへのＤＮＡ−ポリカチオン複合体のカプセル化） 実施例３のプラスミド−ポリカチオンを、体内の特定部位でのプラスミド複合
体の制御放出のため、生分解性ミクロスフェアにカプセル化した。カプセル化に
使用したポリマーは、ラクチドおよびグリコリドならびにポリ無水物(polyanhyd
ride)をベースとするポリマーであった。コアセルベーションおよび溶媒エバポ
レーションといった公知のカプセル化プロセスを使用した。生理活性化合物のカ
プセル化の方法は、文献、例えば、ナノスフェア送達システム, S. Benita編, M
arcel Dekker, 1996、薬物送達のための微粒子システム, H. BersteinおよびS.
Cohen編, Marcel Dekker, 1996に記載されている。
【０１５２】 上記表１（７ａ）に記載したプラスミド複合体を、凍結乾燥により水溶液から
単離し、その粉体を、以下のような溶媒エバポレーションプロセスを用いるカプ
セル化に使用した：ＰＬＡ（ＭＷ２５００）溶液（０．５ｍｌジクロロメタン中
１００ｍｇ）に、凍結乾燥したプラスミド複合体を超音波処理器を使用して分散
させた。この分散液を、水中２％のポリビニルアルコール（ＰＶＡ）約１ｍｌ中
に乳化した。濃縮した分散液を０．２％ＰＶＡ溶液１０ｍｌに添加し、混合物を
室温で約５時間激しく混合した（ここで、ミクロスフェアが形成された）。粒子
をろ過して単離し、水洗して、乾燥した。インビトロ放出をリン酸緩衝液（ｐＨ
７．４）中で行った。
【０１５３】 （実施例９：四級アンモニウムアルカンアミンおよびスペルミンのポリサッカリ
ドへのコンジュゲーション） モノ四級アンモニウムアルカンジアミンおよびスペルミンの合成をスキームａ
およびｂに記載する。本方法は、天然または修飾ポリサッカリドを含むカルボン
酸（ヒアルロン酸、カルボキシメチルセルロース、および超酸化(super oxidize
d)ポリサッカリド）へのアミド化を含む他の結合によるコンジュゲーション、あ
るいはイミン(inime)またはアミン結合を介した酸化ポリサッカリドへのコンジ
ュゲーションのための、単一四級化および第一級アミンの残存を保証するための
、他のアミンの選択的保護および脱保護を含む。これらのモノ第一級アミン誘導
体を一方の側からのみポリサッカリドに結合することで、２つの第一級アミノ部
分とともにオリゴアミンを使用する場合に一般に見出されていた分岐または架橋
の可能性を防止する。
【０１５４】 この保護−脱保護法を用いて、オリゴアミンを、１つの第一級アミンのみがコ
ンジュゲーション時にコンジュゲート可能であり、コンジュゲーション後、遊離
の第一級アミンを形成するように保護基が遊離されるように最小限の分枝でもっ
てポリサッカリドにコンジュゲートした。
【０１５５】 （実施例１０：オリゴアミンのキトサンへのコンジュゲーション） キトサンは、１，４グリコシド結合により連結されたグルコースアミン鎖をベ
ースとする半天然のポリサッカリドである。コンジュゲーションは、キトサンの
グルコースアミン単位のアミノ基上のオリゴアミンのブロモアルキル誘導体間の
反応により行った。
【０１５６】
【化９】
【０１５７】
【化１０】
【０１５８】 （実施例１１：ポリサッカリド上の選択的に酸化された第一級アルコール基への
オリゴアミンのコンジュゲーション） デキストランおよびアラビノガラクタンを、公知の手順に従い酵素により脂肪
族ヒドロキシル（６位）上で特異的に酸化した（ｗｏ９３／２５２３９, 1993年
12月、x.c. liuおよびj.s. dordick, jacs 1999, 121, 466-467）。代表的な実
験では、アラビノガラクタン（１０ｇ）を０．１ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．０，
５０ｍｌ）に溶解する。得られる溶液に、同じ緩衝液約２ｍｌに溶解したガラク
トースオキシダーゼ（２２５ユニット）を添加する。酵素的酸化中に生成される
過酸化水素を取り除くために、ウシカタラーゼを添加する。タンパク質をニンヒ
ドリン試験によりモニターしながら、反応混合物をＭＢ−１樹脂を通してタンパ
ク質を取り除いた。生成物を冷無水エタノールからの沈殿により単離した。沈殿
物をろ過して単離した。この反応で形成されるアルデヒド基をスペルミンおよび
他のオリゴアミンと反応させ、それぞれのポリカチオンを得た。
【０１５９】
【化１１】
【０１６０】 （実施例１２：過酸化ポリサッカリドへのオリゴアミンのコンジュゲーション） デキストランを２回酸化した（１回はアルデヒド基を形成するためにＫＩＯ4
と、続いては、ポリカルボン酸を形成するために塩素酸塩を用いて酸化）。ポリ
カルボン酸を、ＤＣＣおよび他のカップリング剤を使用して、アミド結合を介し
オリゴアミン(ologoamine)によりコンジュゲートした。
【０１６１】
【化１２】
【０１６２】 （実施例１３） オリゴアミンを、トシル化によるヒドロキシル基の活性化を介した直接アミノ
化によりポリサッカリドに連結した。デキストラン水溶液（ｐＨ８．０）とトシ
ルクロライドのクロロホルム溶液(chloroformic solution)との反応および急速
混合により、デキストランをトシル化した。トシル化の程度は、ポリマー中のト
シルクロライドおよびヒドロキシル基の比により調整した。溶媒のエバポレーシ
ョンおよびトシレート誘導体(deribvative)の水・アルコール混合物での抽出に
より、生成物を単離した。ヒドロキシル基の最大約２０％までのトシレート誘導
体は水に(is water)可溶であり、一方、４０％のトシル化がＤＭＳＯおよびＤＭ
Ｆに可溶な水に不溶の化合物を形成した。スペルミン等のオリゴアミンのコンジ
ュゲーションは、オリゴアミンとトシル化ポリサッカリドを適当な溶媒中室温で
３日間反応させて行った。
【０１６３】 このプロセスを、デキストランおよびヒドロキシルへの還元後の酸化デキスト
ランに用いた。この誘導体は、部分的に酸化されているので、加水分解性の分解
をする疑い(susseptible)がより大きい。同様な手順を、アラビノガラクタン、
プルランおよびキトサンの誘導化に適用した。 反応を以下に記載する。
【０１６４】
【化１３】
【０１６５】
【化１４】
【０１６６】 （実施例１４：モノ四級スペルミンの酸化デキストランへのコンジュゲーション
） モノ四級アミンを、保護・脱保護法および第一級アミンのヨウ化メチルとの反
応によって調製した。第一級アミンを、以下に示す還元的アミノ化により、酸化
ポリサッカリドに連結した。
【０１６７】
【化１５】
【０１６８】 （実施例１５） 実施例１に記載のトランスフェクション実験を、両親媒性脂質またはポリマー
をトランスフェクションの向上のために使用することの有効性を示すために、本
実施例において使用した。
【０１６９】 代表的な実験は以下のように行った。ＨＥＫ細胞およびＣＯＳ細胞（２５，０
００／ｃｍ2または５×１０5細胞／６０ｍｍ培養皿）を実験の一日前にプレート
した。細胞を無血清培地で穏やかに洗浄し、一皿あたり０．５ｍｌの無血清培地
を添加した。プラスミドＤＮＡ（５００ｍｌの血清フリー滅菌チューブ中５ｍｇ
）を１時間放置した。表２の活性ポリカチオン試薬をＴｒａｎｓｆａｓｔ（複合
体形成用脂質ポリカチオン）の量を増やしながら混合し、プラスミド溶液に添加
し、よく混合し、細胞に添加し（６０ｍｍのプレートに計１．５ｍｌ）、約４時
間インキュベートした。インキュベーション期間の終わりに、３７℃で、血清を
含む完全培地（４ｍｌ）で細胞を穏やかに覆った。細胞混合物を約４８〜７２時
間（ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼのために）インキュベートした
。トランスフェクション効率を、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）を有するトラン
スフェクトされた細胞をカウントすることで決定した。トランスフェクション収
率における有意な増加（細胞の約２０％から約４０％まで）がカチオン混合物に
ついて観察された。同様な実験では、細胞への添加前に、増加量のポリエチレン
グリコール（ＭＷ４００）をプラスミド複合体に添加した。トランスフェクショ
ン収率に増加が観察された。効果における増加が、両親媒性の添加物が体液の干
渉から複合体を保護し得る動物での研究でより顕著であろうことが期待される。
【０１７０】 本発明が前述の例示的な実施例の詳細に限定されないことおよび本発明がその
本質的特性から逸脱することなく他の特定の形態で具体化され得ることは当業者
に明らかであり、従って、本実施態様および実施例はすべての点で例示的であり
制限的でない、前述の説明よりも添付の特許請求の範囲へなされる参考として考
えられることが望ましく、従って、特許請求の範囲の等価の意味および範囲内に
あたるすべての変更は、これに包含されることが意図される。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年１０月４日（２００１．１０．４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】 従って、本発明によれば、以下を含有する、アニオン性高分子（該高分子はプ
ラスミド、オリゴヌクレオチド、アンチセンス、ペプチド、タンパク質、アニオ
ン性ポリサッカリド及びそれらの組み合わせからなる群より選択される）を付随
した生分解性ポリカチオン組成物が提供される： ａ）２〜２００００の範囲の量のサッカリド単位を有するポリサッカリド鎖； ｂ）５個のサッカリド単位あたり少なくとも１個グラフト化されたオリゴアミン （上記オリゴアミンは、少なくとも２個のアミノ基を有する、線状、分枝状及び
環状アルキルアミンからなる群より選択され、分子量は２０００ダルトンまでで
ある）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】削除
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】 本発明のさらなる目的は、ヌクレオチド送達トランスフェクションのために一
般的に使用される両親媒性カチオン性及び／又は非イオン性脂質並びにカチオン
性及び非イオン性ポリマーとともに、上記組成物を含有する医薬組成物を提供す
ることである。脂質の例としては、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＲＩＥ、ＧＡ
Ｐ−ＤＬＲＩＥ、ＤＯＤＨＦ、アルキル化スペルミン、並びにG. Byk及びD. Sch
erman, Exp. Opin. Ther. (1998) 8(9): 1125-1141; D. A. Treco及びR. F. Sel
den, 非ウイルス性遺伝子治療, Molec. Med. Today, 1995, 1(7): 299-348に記
載される他の誘導体が挙げられる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】 本発明は、高い生物学的効果のためにプラスミド及びアンチセンスを送達する
際に効果的である合成又は天然ポリサッカリドにグラフト化されたオリゴアミン
残基に基づく一定範囲の生分解性ポリカチオンを記載する。側鎖オリゴマーが線
状又は分枝状のいずれかの親水性ポリサッカリド骨格に付いているというグラフ
ト化の概念は、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡ鎖に典型的なアニオン性表面領域との二
次元／三次元相互作用を可能にする。この型の可撓性カチオン性領域の適用範囲
は、非グラフト化ポリカチオン又は低分子量カチオンに関しては利用できない。
低分子量アミン及びそれらの脂質誘導体（例えば、リポフェクチン及びリポフェ
クトアミン）は、複合体化の程度が、これら低分子がアニオン性ＤＮＡのまわり
にどのように構成されるかに依存する、ＤＮＡに対する局在化効果を有する。各
分子は、トランスフェクション(transferction)プロセスの全ての時間で他の分
子と同調されなければならないが、オリゴアミンがポリマーにグラフト化される
場合には、それらは既に同調化され、各側鎖は他の側鎖が配置されることを補助
して、所定のＤＮＡのアニオン性表面を適合させる。官能基をグラフト化させる
ことにより、ポリマー鎖に沿う平均分布が互いの間で特定の距離になる（例えば
、１つ、２つ、３つ又は４つ毎のポリマー単位にオリゴアミン鎖をグラフトさせ
ることは、種々のＤＮＡとの最適な複合体化を提供する）。 ＵＳ４，１４６，５１５（Ｄ４）には、澱粉の産業上の特性を改善するための
、澱粉の酸化及びバルク中での澱粉とエピクロルヒドリン−ジメチルアミンまた
はアンモニアとの反応について記載されている。この生成物はカチオン性である
がポリサッカリドにコンジュゲートしたグラフト化オリゴアミンではない。 Advanced MagneticsのＷＯ９３／２５２３９（Ｄ３）には、ある範囲のアラビ
ノガラクタン(arabinogalactran)誘導体について記載されている。第１９頁実施
例１０に、ガラクトースオキシダーゼ(oxiddase)（ＧＯ）を用いたＡＧの処理に
ついて記載されている。この反応の詳細は精製過程と形成されたアルデヒド基の
数の決定を含めて説明される。酵素を用いた酸化は、室温で行われる（収率は０
．３４ミリ当量アルデヒド）。これは、ＡＧの酸化の代替的な方法であり、ポリ
サッカリドにコンジュゲートされたオリゴアミンとは関連はない。 該公報の第１７頁実施例６には、還元剤としてのシアノボロヒドリドの存在中
、ポリリジンとアラビノガラクタン（ＡＧ）との間の５００ｍｇのポリリジンと
１００ｍｇのＡＧという割合での反応について記載されている。得られた生成物
収量は３０ｍｇで、これは収率５％を表している。この生成物がアミンおよびサ
ッカリドを含み分子量が２５，０００であるというコメントがあること以外には
この生成物の分析におけるデータは何も与えられていない。ＡＧが酸化されてお
らず、ネイティブなＡＧが使用されたこれらの反応条件下では、還元的アミノ化
を可能にするＡＧ上のアルデヒド基は存在しないかあるいはほんの僅かでありポ
リリジンとＡＧとの間での化学的なコンジュゲーションの機会は極めて低い。実
際、生成物が同定されておらず、とるにたりない５％という収率は、この反応で
得られたものはおそらく何もなく、単離された５％の物質は、ＡＧに混入してい
るポリリジン、あるいはポリリジンに混入しているＡＧのいずれかであったとい
うことを示している。ネイティブなＡＧの分子量は２５，０００であるので、後
者のことはよりありそうに思われる。すなわち、この実施例は、当業者に、ポリ
サッカリドにコンジュゲートされたオリゴアミンの形成について教示も示唆もし
ていない。 ＷＯ９８０１１６２（Ｄ１）には、ネイティブなキトサンのカチオン性基と複
合体化したＤＮＡを含有するキトサンナノスフェアの形成について記載されてい
る。第１７頁と図７及び８に、ＤＮＡを積み込んだキトサンナノスフェアの形成
について詳細に記載されている。グルコースアミンのポリマーなので、キトサン
はサッカリド単位あたり１個のアミノ基を含む。このポリマーはポリサッカリド
にコンジュゲートしたオリゴアミンではなくアミノ側基を１つ有するポリサッカ
リドである。 ＲＵ２，０２７，１９０（Ｄ２）には、ポリサッカリド抗原と、連鎖球菌感染
及び肺炎球菌感染を検出する為の免疫吸着剤としてのポリエチレンイミンとのコ
ンジュゲートについて記載されている。すなわち、該参考文献はスペーサー（こ
れはポリエチレンイミンである）を介してポリサッカリドに化学的に結合してい
る抗原を教示するものであり、ポリサッカリドにコンジュゲートされたオリゴア
ミンを教示も示唆もしていない。 ＵＳ５，５６７，６８５には、種々の酸化可能な薬剤(oxidizable agent)のポ
リサッカリドへのコンジュゲーションについて記載されているが、ポリサッカリ
ドにコンジュゲートされたオリゴアミンを教示あるいは示唆するものではない。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年１月３０日（２００２．１．３０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１８】 医薬的に許容可能なキャリアとともに、請求項１に記載の組
成物を含有する、医薬組成物。
【請求項１９】 医薬的に許容可能なキャリアがヌクレオチド送達に通常使用
される、両親媒性カチオン性及び／または非イオン性脂質、及びカチオン性及び
非イオン性ポリマーである、請求項１８に記載の医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
【化７】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アニオン性高分子の送達のための生分解性ポリカチオン組成
    物であって、以下： ａ）２〜２０００の範囲の量のサッカリド単位を有するポリサッカリド鎖； ｂ）５個のサッカリド単位あたり少なくとも１個のグラフト化されたオリゴア
    ミン〔ここで該オリゴアミンは、少なくとも２個のアミノ基を有する、線状、分
    枝状及び環状アルキルアミンからなる群より選択される〕、 を含有する、生分解性ポリカチオン組成物。
  2. 【請求項２】 前記アニオン性高分子が、プラスミド、オリゴヌクレオチド
    、アンチセンス、ペプチド、タンパク質、ポリサッカリド及びそれらの組み合わ
    せからなる群より選択される、請求項１に記載の生分解性ポリカチオン組成物。
  3. 【請求項３】 前記ポリサッカリド鎖が、デキストラン、アラビノガラクタ
    ン、プルラン、セルロース、セロビオース、イヌリン、キトサン、アルギネート
    及びヒアルロン酸からなる群より選択される、請求項１に記載の生分解性ポリカ
    チオン組成物。
  4. 【請求項４】 前記サッカリド単位が、アセタール、ヘミアセタール、ケタ
    ール、オルトエステル、アミド、エステル、カルボネート及びカルバメートから
    なる群より選択される結合によって連結されている、請求項１に記載の生分解性
    ポリカチオン組成物。
  5. 【請求項５】 前記ポリサッカリドが、アルダル酸とジアミノアルカンとの
    縮合から形成された合成ポリサッカリドである、請求項１に記載の生分解性ポリ
    カチオン組成物。
  6. 【請求項６】 前記グラフト化されたオリゴアミンが、アミン結合、アミド
    結合及びカルバメート結合からなる群より選択される結合によって前記ポリサッ
    カリド鎖にグラフト化されている、請求項１に記載の生分解性ポリカチオン組成
    物。
  7. 【請求項７】 前記オリゴアミンが、式： ＮＨ2−［ＣＨ2）x−Ｎ−（Ｒ）−ＣＨ2）y−Ｎ−（Ｒ’）−（ＣＨ2）z−］n −ＮＨ2 〔式中、ｘ、ｙ、ｚは０〜４の整数であり、ｘ＋ｙ＋ｚ＋は、１〜４の間であり
    、ｎは、ｘ＋ｙ＋ｚ＝２以上の場合には少なくとも１であるか、またはｘ＋ｙ＋
    ｚ＝１の場合には少なくとも２であり、Ｒ及びＲ’基は、Ｈ又は１〜６個の炭素
    の脂肪族側鎖基である〕 を有する、請求項１に記載の生分解性ポリカチオン組成物。
  8. 【請求項８】 前記オリゴアミンが、２０個までのアミノ酸からなるペプチ
    ドであり、ここで該アミノ酸のうち少なくとも５０％が、リジン、オルニチン及
    びアルギニンを含むカチオン性である、請求項１に記載の生分解性ポリカチオン
    組成物。
  9. 【請求項９】 前記オリゴアミンが、スペルミン及びその誘導体からなる群
    より選択される、請求項１に記載の生分解性ポリカチオン組成物。
  10. 【請求項１０】 前記オリゴアミンが、１０個までのエチレンイミン単位を
    有する線状及び分枝状エチレンイミンオリゴマーからなる群より選択される、請
    求項１に記載の生分解性ポリカチオン組成物。
  11. 【請求項１１】 脂肪鎖、リン脂質、コレステロール誘導体、エチレングリ
    コールオリゴマー及びプロピレングリコールオリゴマーからなる群より選択され
    る両親媒性残基を有する、請求項１に記載の生分解性ポリカチオン組成物。
  12. 【請求項１２】 前記エチレン及びプロピレングリコールオリゴマーが、一
    方の側に脂肪鎖ブロックを有する、請求項１１に記載の生分解性ポリカチオン組
    成物。
  13. 【請求項１３】 前記両親媒性残基が、アミン、アミド、イミン、エステル
    、エーテル、尿素、カルバメート及びカルボネートからなる群より選択される結
    合によって前記ポリサッカリド鎖に連結されている、請求項１１に記載の生分解
    性ポリカチオン組成物。
  14. 【請求項１４】 前記両親媒性残基が生体膜を介するポリカチオンの横断を
    促進する、請求項１１に記載の生分解性ポリカチオン組成物。
  15. 【請求項１５】 前記ポリカチオン組成物が有毒でも免疫原性でもない、請
    求項１に記載の生分解性ポリカチオン組成物。
  16. 【請求項１６】 前記組成物が、所定の型の細胞又は組織への該組成物の結
    合を促進するためのリガンドをさらに含有する、請求項１に記載の生分解性ポリ
    カチオン組成物。
  17. 【請求項１７】 細胞トランスフェクションの増強のためにカチオン性及び
    非イオン性脂質又はポリマーと組み合わされた、請求項１を含む生分解性組成物
    。
  18. 【請求項１８】 医薬的に許容可能なキャリアとともに、請求項１に記載の
    組成物を含有する、医薬組成物。
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