ITLO20130006A1 - Derivati carbossilati di glucosamminoglicani e loro uso come farmaci - Google Patents
Derivati carbossilati di glucosamminoglicani e loro uso come farmaciInfo
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Description
DERIVATI CARBOSSILATI DI GLUCOSAMMINOGLICANI
E LORO USO COME FARMACI
Sommario
[0001] L'invenzione riguarda derivati di glucosamminoglicani, dotati di attività inibitoria di eparanasi e attività antitumorale, recanti gruppi carbossilati nelle posizioni 2 e 3 di almeno parte dei residui di glucosamminoglicano, e il processo per preparare gli stessi.
[0002] I derivati di glucosamminoglicani della presente invenzione sono generati partendo da glucosamminoglicani naturali o sintetici, opzionalmente modificati chimicamente o enzimaticamente. In particolare, detti derivati di glucosamminoglicani sono ottenibili mediante due passaggi di ossidazione del glucosamminoglicano. Con la prima ossidazione (a), preferibilmente con periodato, i dioli adiacenti e opzionalmente gli OH/NH2 adiacenti dei residui di glucosamminoglicano sono convertiti in aldeidi e con la seconda ossidazione (b) dette dialdeidi sono convertite in gruppi carbossilati. Secondo la presente invenzione, preferibilmente dal 10% al 100%, più preferibilmente dal 25% al 100%, dei residui 2-O-non solfatati ed opzionalmente 2-N-, 3-0- non solfatati di un glucosamminoglicano sono ossidati nel primo passaggio di ossidazione (a) in condizioni efficaci a convertire i dioli adiacenti e opzionalmente gli OH/NH2 adiacenti in aldeidi.
[0003] La prima ossidazione preferibilmente porta al taglio del legame C2-C3 dell'anello dei residui ossidabili. Preferibilmente, il glucosamminoglicano è un glucosamminoglicano naturale 0 sintetico, opzionalmente 2-0 e/o 2-N- desolfatato, avente un grado di solfatazione (rapporto molare S03VC00") che va da 0,8 a 2,8, preferibilmente da 0,9 a 2,5. Il grado di solfatazione (rapporto molare S03"/C00") è qui inteso come determinato mediante titolazione conduttimetrica, secondo Casu B. e Gennaro U., 1975, Carbohydr Res 39, 168-176. I derivati di glucosamminoglicano di/tricarbossilati ottenibili mediante il processo inventivo divulgato sopra mostrano un incremento carbossilico che va da 1,2 a 2,2, in cui l'incremento carbossilico è calcolato come il rapporto tra il grado di solfatazione (rapporto molare S03"/C00") del materiale di partenza e il grado di solfatazione (rapporto molare S03"/C00") del derivato di/tricarbossilato, determinato mediante titolazione conduttimetrica come qui definito. Più specificamente, il grado di solfatazione del glucosamminoglicano di partenza è determinato su un campione dell'intermedio glucosamminoglicano ottenuto mediante il primo passaggio di ossidazione (a), dopo riduzione con NaBH4.
[0004] Preferibilmente, i derivati di glucosamminoglicano della presente invenzione sono ottenuti partendo da eparine naturali da qualsiasi fonte animale e organo, oppure da eparine sintetiche, opzionalmente modificate chimicamente 0 enzimaticamente. Più preferibilmente, il materiale di partenza è eparina non frazionata, eparina a basso peso molecolare (LMWH, avente peso molecolare che va da 3.500 a 8.000 Da), eparansolfato (HS) o derivati di essi. Maggiormente preferiti sono derivati di glucosamminoglicano ottenibili da eparine non frazionate o da LMWHs, opzionalmente 2-O- e/o 2-N- desolfatati.
[0005] L’invenzione riguarda inoltre un processo per la preparazione di detti derivati di glucosamminoglicano ed ulteriormente il loro utilizzo come principi attivi di un medicamento, opzionalmente in combinazione con farmaci o trattamenti noti affermati. In particolare, la presente invenzione è diretta a detti derivati di glucosamminoglicani per l’uso come medicamenti per il trattamento di condizioni patologiche, come il mieloma multiplo e altre neoplasie (cioè sarcomi, carcinomi, neoplasie ematologiche), incluse le loro forme metastatiche.
[0006] Inoltre, l’invenzione riguarda l’uso di detti derivati di glucosamminoglicani in ogni indicazione terapeutica ottenente beneficio dall’inibizione di eparanasi (nefropatia diabetica, malattia infiammatoria intestinale, coliti, artriti, psoriasi, sepsi, aterosclerosi). L’invenzione riguarda inoltre composizioni farmaceutiche comprendenti detti derivati di glucosamminoglicano di/tricarbossilati, in particolare composizioni farmaceutiche comprendenti derivati di eparina e di eparina a basso peso molecolare (LMWH) di/tricarbossilati, come principi attivi. Opzionalmente, dette composizioni farmaceutiche comprendono inoltre almeno un principio attivo differente, preferibilmente almeno un agente antitumorale differente.
Stato dell’arte
[0007] Il mieloma multiplo è la seconda neoplasia ematologica più comune, rappresentando più del 10% di tutte le neoplasie ematologiche negli Stati Uniti, con circa 20.000 nuovi casi ogni anno e una mortalità superiore al 50% (Graham-Rowe D., 2011, Multiple myeloma outlook. Nature 480, s34-s35).
[0008] Negli ultimi anni, sono state sviluppate terapie promettenti, tra cui la somministrazione di un inibitore del proteasoma (Velcade), bifosfonati, talidomide e altri. L’efficacia di questi agenti è, almeno in parte, dovuta al loro impatto sul microambiente tumorale del mieloma.
[0009] Nonostante l’efficacia di questi agenti contro il mieloma sia stata dimostrata, rimane la necessità di trovare nuovi e più efficaci farmaci per il suo trattamento e per il trattamento di altri tumori.
[0010] L’eparanasi è una endo-β-glucuronidasi che taglia l’eparansolfato (HS) dei proteoglicani (PG-HS), quali il sindecano-1, favorendo il rilascio di fattori di crescita associati allo HS.
[0011] Nell’uomo, si conosce un’unica forma funzionale dell’enzima eparanasi capace di tagliare lo HS. L’eparanasi è espressa da molti tumori umani, dove aumenta significativamente il potenziale sia angiogenico sia metastatico delle cellule tumorali. Elevati livelli di eparanasi,
sono stati correlati con la crescita elevata e la formazione di metastasi in molti tipi di tumori. Per esempio, un alto livello di eparanasi è associato a un più breve tempo di sopravvivenza post-operatorio dei pazienti. Un evidente ruolo dell’eparanasi nelle metastasi tumorali è stato dimostrato nei laboratori dei Prof. Vlodavsky e Sanderson, dove i nostri innovativi inibitori sono stati testati.
[0012] In aggiunta alle sue funzioni enzimatiche, che includono il rilascio di fattori di crescita associati allo HS e la degradazione della matrice extracellulare (ECM) ad opera delle cellule invasive, l’eparanasi ha anche una funzione non enzimatica che può avere un impatto sul comportamento del tumore e sul suo microambiente. Il gruppo di Sanderson ha aperto la strada dello studio dell’eparanasi e del sindecano-1 nel mieloma, stabilendo che l’eparanasi agisce come il regolatore principe del suo fenotipo tumorale aggressivo. Ciò avviene promuovendo la sovra espressione di VEGF e MMP-9, che insieme stimolano la crescita del tumore, la distruzione ossea metastatica e osteolitica. E’ stato infatti dimostrato in vivo che l’eparanasi favorisce la crescita di mielomi e la formazione di metastasi spontanee nelle ossa, e che l’espressione dell’eparanasi da parte delle cellule tumorali alimenta un’osteolisi aggressiva, almeno parzialmente dovuta all’aumento dell’espressione di RANKL. L’effetto dell’eparanasi nel favorire l’osteolisi può essere di grande importanza perché fattori di crescita associati all’osso sono rilasciati quando l’osso si degrada. In aggiunta, gli osteoclasti possono rilasciare fattori, come HGF, che favoriscono la crescita del tumore. Questi fattori insieme possono favorire la formazione di cavità nel midollo osseo che supportano l’impianto delle cellule tumorali e la loro successiva crescita (Fux, L., et al. 2009, Heparanase: busy at the cell surface. Trends Biochem Sci 34 (10): 511-519; Sanderson R.D., and Yang Y., 2008, Sndecan-1: a dynamic regulator of the myeloma microenvironment. Clin Exp Metastasis 25:149-59; Ilan N., et al. 2006. Regulation, function and clinical significance of heparanase in cancer metastasis and angiogenesis. Int. j. Biochem. Cell. Biol. 38: 2018-2039). L’inibizione dell’eparanasi è quindi un obiettivo realizzabile della terapia del mieloma, supportato dal fatto che esiste una unica eparanasi enzimaticamente attiva e che la sua espressione in tessuti normali è rara. Inoltre, è stato mostrato che i topi knock-out per eparanasi sono vitali e non mostrano disturbi visibili. Ciò indica che da una strategia di inibizione dell’eparanasi possono derivare solo piccoli o nessun effetto collaterale (Casu B., et al. 2008Non-anticoagulant heparins and inhibition of cancer. Pathophysiol Haemost Thromb. 36: 195-203; Vlodavsky I., et al. 2007. Heparanase: structure, biological functions, and inhibition by heparin-derived mimetics of heparan sulfate. Curr Pharm Des. 13: 2057-2073; Naggi A., et al. 2005. Modulation of the Heparanaseinhibiting Activity of Heparin through Selective Desulfation, Graded N-Acetylation, and Glycol Splitting. J. Biol. Chem. 280: 12.103-12.113).
[0013] L’eparina è un polisaccaride solfatato lineare polidisperso della famiglia dei glucosamminoglicani, dotato di attività anticoagulante e antitrombotica. Le catene saccaridiche
dell’eparina consistono di residui di acido uronico alternati a residui di D-glucosammina. L’unità ripetitiva prevalente è il disaccaride acido L-iduronico 2-O-solfatato (IdoA2S)α(1 → 4) e D-glucosammina N-, 6-O-solfatata (GlcN6S). Costituenti minori sono l’acido D-glucuronico e acido L-iduronico non solfatato, insieme a N-acetil D-glucosammina e D-glucosammina N-, 3-O-, 6-O-trisolfatata (Casu B., 2005. Structure and active domains of heparin. In: Chemistry and Biology of Heparin and Heparin Sulfate. Amsterdam: Elsevier. 1-28; Casu B. and Lindahl U. 2001, Structure and Biological Interactions of heparin and heparin sulfate. Adv Carbohydr Chem Biochem 57: 159-206). L’eparina, che strutturalmente è simile allo HS, è in grado di inibire efficacemente l’eparanasi, ma il suo utilizzo a dosi elevate, per una strategia di inibizione dell’eparanasi, è tuttavia improponibile a causa della sua attività anticoagulante.
[0014] E’ interessante osservare che eparine a basso peso molecolare (LMWHs), maggiormente biodisponibili e meno anticoagulanti dell’eparina, sembrano prolungare la sopravvivenza dei malati di cancro, probabilmente attraverso un effetto diretto sulla crescita del tumore e delle metastasi. Ciò può essere dovuto, almeno in parte, all’inibizione dell’attività enzimatica dell’eparanasi (Zacharski L.R., and Lee, A.Y. 2008, Heparin as an anticancer therapeutic. Expert Opin Investig Drugs 17: 1.029-1.037; Yang Y. et al., 2007, The syndecan-1 heparan sulfate proteoglycan is a viable target for myeloma therapy. Blood 110: 2.041-2.048).
[0015] Efficaci inibitori dell’attività enzimatica dell’eparanasi sono stati selezionati nell’arte precedente studiando l’inibizione dell’eparanasi con derivati di eparine non anticoagulanti, molte delle quali contengono residui di acido uronico non solfatato modificato mediante apertura dell’anello glucosidico attraverso il taglio del legame tra gli atomi di carbonio 2 e 3 di un residuo di glucosamminoglicano (glycol split t ing). Tali inibitori si differenziano per il grado di O-solfatazione, di Nacetilazione e di glycol split t ing sia dei residui di acido uronico non solfatato preesistenti che di quelli generati per 2-O-desolfatazione controllata (Naggi A., 2005, “Glycolsplitting as a device for modulation inhibition of growth factors and heparanase inhibition by heparin and heparin derivative.” In: Chemistry and Biology of Heparin and Heparane Sulfate. Amsterdam: Elsevier 461-481; Yang Y. et al., 2007, “The syndecan-1 heparan sulfate proteoglycan is a viable target for myeloma therapy”. Blood, 110:2.041-2.048).
[0016] In particolare, Il termine “glycol split” (gs) si riferisce convenzionalmente a polisaccaridi che presentano l’apertura di alcuni residui monosaccaridici dovuta alla rottura (glycol split t ing) di un legame tra due atomi di carbonio adiacenti, ognuno dei quali recante un gruppo idrossilico. La prima generazione di glycol split eparine, cioè le cosiddette “ossieparine ridotte” (eparine RO), consisteva largamente di blocchi polisolfatati non modificati, occasionalmente interrotti da residui glycol split corrispondenti a residui di acido glucuronico/iduronico non solfatati che erano presenti nelle catene originali, prima ossidati in dialdeidi e poi ridotti in alcool (Naggi A., 2005, “Glycol splitting as a device for modulating inhibition of growth factors and
heparanase inhibition by heparin and heparin derivative.” In: Chemistry and Biology of Heparin and Heparan Sulfate. Amsterdam: Elsevier 461-481).
[0017] WO 01/55221 riporta glucosamminoglicani con un grado di 2-Odesolfatazione non superiore al 60% delle unità di acido uronico totale. Detti glucosamminoglicani sono privi di attività anticoagulante e mostrano attività antiangiogenica basata sull’inibizione di FGF. Nessuna attività è prevista per l’inibizione di eparanasi.
[0018] US 2008/0051567 riporta un composto corrispondente a una eparina 100% N-acilata e 25% glycol split , che esercita una piccola o nessuna attività anticoagulante e un basso rilascio di fattori di crescita dalla matrice extracellulare. Detto composto è stato scoperto in grado di inibire l’eparanasi, la crescita tumorale, l’angiogenesi e l’infiammazione in modelli sperimentali animali, inclusi i modelli di mieloma di Sanderson. (Yang Y. et al., 2007, “The syndecan-1 heparan sulfate proteoglycan is a viable target for myeloma therapy”. Blood, 110:2.041-2.048).
[0019] Nonostante questo, rimane la necessità di fornire composti migliorati in termini di attività inibente dell’eparanasi, selettività, biodisponibilità, ed efficacia nel trattamento di patologie legate all’eparanasi, come mieloma e altri tumori.
Breve descrizione delle figure
[0020] Figura 1: Strutture prevalenti generate mediante il processo della presente invenzione. (1 ) unità disaccaridica di un polimero glucosamminoglicano comprendente un acido uronico (iduronico e/o glucuronico) e una glucosammina (2-N-acetilata, 2-N-non sostituita e/o 2-N-solfatata); il cui i gruppi idrossile (R3ed R4) possono essere ognuno o entrambi sostituiti da un gruppo solfato o non sostituiti. (2 , 3 , 4 ) strutture rappresentative (nuove entità) generate mediante taglio ossidativo dell’anello dei residui di eparina 2-non solfatati, seguito da ulteriore ossidazione in residui tri- o di-carbossilati.
[0021] Figura 2: esempio di cromatogramma ottenuto con rilevamento MS. La presenza di picchi corrispondenti agli oligosaccaridi contenenti residui di acido uronico di- o tri-carbossilati, attribuiti mediante i valori misurati di peso molecolare, sono evidenziati rispettivamente col codice “+carbox2” o “+carbox3” nel grafico.
[0022] Figura 3: esempio di cromatogramma ottenuto con rilevamento MS. La presenza di picchi corrispondenti agli oligosaccaridi contenenti residui di acido uronico di- o tri-carbossilati, attribuiti mediante i valori misurati di peso molecolare, sono evidenziati rispettivamente col codice “+carbox2” o “+carbox3” nel grafico.
Descrizione dell’invenzione
[0023] La presente invenzione riguarda una classe innovativa di derivati chimicamente modificati di glucosamminoglicano, dotati di attività inibitoria dell’eparanasi. In particolare,
essa riguarda derivati di glucosamminoglicano carbossilati, in cui almeno parte dei residui sono residui aperti recanti tre gruppi carbossilati (o due, se il residuo aperto è una glucosammina).
[0024] I derivati di glucosamminoglicano della presente invenzione sono preferibilmente derivati di eparina, designati come "eparine di/tricarbossilate", i quali inibiscono fortemente l'attività dell'eparanasi di degradazione dell'eparansolfato. Le modifiche chimiche fatte all'eparina, modificando il residuo di acido glucuronico incluso nel sito di legame per ATIII, aboliscono l'attività anticoagulante dell'eparina, consentendone l'uso ad alte dosi.
[0025] I derivati di glucosamminoglicano della presente invenzione sono ottenibili attraverso ossidazione, preferibilmente con periodato, dei residui 2- non solfatati di un glucosamminoglicano, in condizioni atte a convertire i dioli adiacenti e opzionalmente gli OH/NH2adiacenti del glucosamminoglicano in aldeidi, seguita da ossidazione del glucosamminoglicano ossidato in condizioni atte a convertire dette dialdeidi in gruppi carbossilati. In particolare, i derivati di glucosamminoglicano della presente invenzione sono preferibilmente ottenibili da un glucosamminoglicano avente un grado di solfatazione (rapporto molare S03<">/C00<">) da 0,8 a 2,8, preferibilmente da 0,9 a 2,5. Il grado di solfatazione (rapporto molare S037C00<">) è qui inteso come determinato mediante titolazione conduttimetrica, secondo Casu B. e Gennaro U., 1975, Carbohydr Res, 39, 168-176. I derivati di glucosamminoglicano di/tricarbossilati ottenibili mediante il processo inventivo divulgato sopra mostrano un incremento carbossilico che va da 1,2 a 2,2, dove l'incremento carbossilico è calcolato come il rapporto tra il grado di solfatazione (rapporto molare S03<">/COO<">) del materiale di partenza ed il grado di solfatazione (rapporto molare S03<">/COO<">) del derivato di/tricarbossilato, determinato mediante titolazione conduttimetrica come qui definito. Più specificamente, il grado di solfatazione del materiale di partenza è determinato su un campione dell'intermedio glucosamminoglicano ottenuto mediante il primo passaggio di ossidazione (a), dopo riduzione con NaBH4.
[0026] Preferibilmente, i derivati di glucosamminoglicano della presente invenzione derivano da glucosamminoglicani naturali o sintetici (ottenuti chimicamente o enzimaticamente), più preferibilmente da glucosamminoglicani 2-0- e/o 2-N- desolfatati. In un metodo di realizzazione preferito, detto glucosamminoglicano naturale o sintetico è eparina non frazionata, LMWH o eparansolfato, opzionalmente 2-0- e/o 2-N-desolfatati.
[0027] Più preferibilmente i derivati di glucosamminoglicano derivano da eparine o LMWHs naturali o sintetiche, 2-0- e opzionalmente 2-N- desolfatate.
[0028] Come esempio, le catene di eparina possono naturalmente comprendere da circa 5% a 35% di residui di acido uronico 2-0- non solfatato, da 0% a 50% di residui di glucosammina N-acetilata e da circa 0% a 6% di residui di glucosammina N- non-sostituita (né N-solfatata, né N-acetilata). Differenti gradi di solfatazione dipendono dalla fonte di eparina (specie animali, tipo di organi) e dalle procedure di estrazione. Ogni residuo di glucosamminoglicano 2-O- o 2-N- non solfatato, non recante sostituenti 3-O-solfati, è suscettibile di ossidazione con apertura (split) dell’anello e conversione dei dioli vicinali e degli OH/NH2vicinali in aldeidi. Opzionalmente, una 2-O- desolfatazione controllata dei glucosamminoglicani di partenza permette di modulare il rapporto tra residui aperti di glucosammina/acido uronico.
[0029] L’invenzione riguarda inoltre il processo per preparare detti derivati carbossilati di glucosamminoglicani ed ulteriormente il loro utilizzo come principi attivi in medicamenti per il trattamento di condizioni patologiche, sia come singolo principio attivo sia in combinazione con altri medicamenti. Dette condizioni patologiche comprendono il mieloma multiplo e altre malattie neoplastiche, incluse le loro forme metastatiche. Inoltre, l’invenzione riguarda detti derivati carbossilati di glucosamminoglicani per l’uso in qualsiasi indicazione terapeutica che ottiene beneficio dall’inibizione di eparanasi. L’invenzione riguarda anche le composizioni farmaceutiche contenenti detti derivati carbossilati di glucosamminoglicani, opzionalmente in combinazione con almeno un ulteriore principio attivo.
[0030] Il processo per preparare i derivati carbossilati di glucosamminoglicani dell’invenzione comprende: ossidazione, preferibilmente con periodato (o mediante l’uso di reagenti ossidativi aventi reattività simile), dei residui non solfatati suscettibili di un glucosamminoglicano, in condizioni atte a convertire i dioli adiacenti e gli OH/NH2adiacenti in aldeidi, seguita da ossidazione dei glucosamminoglicani ottenuti dalla prima ossidazione, in condizioni atte ad ottenere due nuovi gruppi carbossilati dai corrispondenti gruppi aldeidici.
[0031] Il processo della presente invenzione comprende quindi l’ossidazione, preferibilmente con periodato, dal 10% al 100%, preferibilmente dal 25% al 100%, dei residui di un glucosamminoglicano 2-O- e opzionalmente 2-N-, 3-O- non solfatati, in condizioni efficaci a convertire i dioli adiacenti e gli OH/NH2adiacenti in aldeidi; quindi comprende l’ossidazione del glucosamminoglicano ossidato, in condizioni efficaci a convertire dette dialdeidi in gruppi carbossilati.
[0032] Preferibilmente, il glucosamminoglicano di partenza è un glucosamminoglicano naturale o sintetico; più preferibilmente è selezionato tra eparina, eparine a basso peso molecolare o eparansolfato; ancor più preferibilmente è selezionato tra eparina e LMWH, 2-O ed opzionalmente 2-N- desolfatata.
[0033] Preferibilmente, il glucosamminoglicano di partenza ha un grado di solfatazione (SO3-/COO-) da 0,8 a 2,8, preferibilmente da 0,9 a 2,5, mediante titolazione conduttimetrica, come qui definito.
[0034] La prima ossidazione del processo inventivo è preferibilmente eseguita ad un pH compreso tra 3 e 10, più preferibilmente ad un pH compreso tra 4.5 e 8. In un metodo di realizzazione preferito, la prima ossidazione del processo inventivo è eseguita ad un pH
compreso tra 3 e 5, in modo da tagliare solo il legame C2-C3dei residui di acido uronico non solfatati, evitando reazioni collaterali. In un altro metodo di realizzazione preferito, la prima ossidazione del processo inventivo è eseguita ad un pH compreso tra 5.5 e 10, in modo da tagliare il legame C2-C3di entrambi i residui di acido uronico 2-O-non solfatato e di glucosammina non solfatata.
[0035] In un metodo di realizzazione preferito, la prima ossidazione è eseguita in condizioni tali da tagliare il legame tra il C2e il C3di entrambi gli acidi uronici 2-O-non solfatati e le glucosammine 2-N-, 3-O-non solfatate.
[0036] Opzionalmente il processo inventivo viene eseguito in presenza di NTA (acido nitrilotriacetico), un agente chelante e sequestrante usato per ridurre la depolimerizzazione, in presenza di NaHCO3o piridina, per alcalinizzare la soluzione di reazione, o in presenza di MnCl2con o senza NTA. L’ulteriore ossidazione delle aldeidi è preferibilmente eseguita usando NaClO2, o mediante l’utilizzo di agenti con proprietà ossidative confrontabili, come TEMPO (2,2,6,6 Tetrametil-1-piperidinil-ossi).
[0037] Preferibilmente, i residui carbossilati di acido uronico nei derivati di glucosamminoglicani della presente invenzione vanno dal 25% al 100%, più preferibilmente dal 50% al 100%, ancor più preferibilmente dal 60% al 90%, dei residui carbossilati totali del glucosamminoglicano.
[0038] I derivati carbossilati di glucosamminoglicano ottenibili mediante il processo sopra descritto hanno preferibilmente un peso molecolare da 800 a 30.000 Da, a seconda delle condizioni di processo e dal glucosamminoglicano di partenza impiegato. In un metodo di realizzazione preferito, più preferibilmente quando eparina non frazionata viene impiegata come glucosamminoglicano di partenza, il derivato carbossilato di glucosamminoglicano ottenibile mediante i processi sopra descritti ha un peso molecolare da 3.000 a 20.000 Da, preferibilmente da 3.500 a 12.000 Da.
[0039] I nuovi derivati di glucosamminoglicani ottenibili mediante il processo della presente invenzione rappresentano una nuova classe di polisaccaridi simili a eparina, caratterizzati dalla presenza di residui aperti, ognuno recante due gruppi carbossilati addizionali. Si noti che i residui recanti un gruppo carbossilato naturale sono convertiti in residui tricarbossilati mediante il processo della presente invenzione. Detti nuovi derivati di/tricarbossolati di glucosamminoglicano hanno inaspettatamente mostrato di essere forti inibitori di eparanasi in vit ro e di inibire il mieloma in modelli animali.
[0040] I derivati di glucosamminoglicani comprendenti residui recanti due o tre gruppi carbossilati, essendo anche meno solfatati rispetto ai glucosamminoglicani di partenza, mostrano una farmacocinetica più favorevole rispetto ai loro analoghi recanti meno gruppi carbossilati.
[0041] La presente invenzione riguarda inoltre i composti ottenibili mediante i processi sopra descritti per l'uso come medicamenti.
[0042] In particolare, la presente invenzione riguarda i composti ottenibili mediante i processi sopra descritti per l'uso come antitumorali, preferibilmente per l'uso come medicamenti antimieloma, sia da soli sia in combinazione con almeno un ulteriore principio attivo.
[0043] Derivati di eparina e di eparina a basso peso molecolare preparati secondo la presente invenzione hanno mostrato una effettiva inibizione dell'attività dell'eparanasi, sia in vitro che in vivo in un modello sperimentale di mieloma multiplo.
Esempi
[0044] Preparazione dei composti
Campioni di eparine frazionate e non frazionate, con differenti gradi di solfatazione (S03<">/COO<">) mediante titolazione conduttimetrica, sono stati sottoposti ad ossidazione con periodato (per dare unità dialdeidiche aperte), eseguita mediante modifica di metodi noti. Una 2-0-desolfatazione controllata di eparine non frazionate (UFH) è stata eseguita seguendo modifiche di metodi noti (Jaseja M. et al., 1989, "Novel regio- and stereo-selective modifications of heparin in alkaline Solutions. Nuclear magnetic resonance spectroscopic evidence." Canad J Chem, 67, 1.449-1.455; R.N. Rej and A.S. Perlin, 1990, "Base-catalyzed conversion of thè a-L-iduronic acid 2-sulfate unit of heparin into a unit of α-galacturonic acid and related reactions." Carbohydr. Res. 200, 25, 437-447; Casu B. et al., 2004, "Undersulfated and Glycol-Split Heparins Endowed with Antiangiogenic Activity." J. Med. Chem., 47, 838-848). In condizioni basiche, unità 2-O-desolfatate (naturalmente o chimicamente indotte) di acido L-iduronico sono convertite in derivati 2,3-epossi e infine in unità di acido L-galatturonico. Le dialdeidi originate dalle unità di acido uronico, ed opzionalmente da glucosammine, sono preferibilmente, ed entro un breve margine di tempo, ulteriormente ossidate in dicarbossilati.
[0045] Analisi in vitro
Sulla base di studi precedenti di Bisio et al. (Bisio A. et al. 2007, High-performance liquid chromatographic /mass spectrometric studies on thè susceptibility of heparin specie to cleavage by heparanase. Sem Thromb hemost 33 488-495), l'attività inibitoria di eparanasi è stata determinata in vitro dal gruppo del Prof. Vlodavsky all'Università di Haifa, Israele, secondo il metodo descritto da Hammond et al. (Hammond et al. 2010, Development of a colorimetrie assay for heparanase activity suitable for kinetic analysis and inhibitor screening. Anal Biochem. 396, 112-6). In breve, l'eparanasi può tagliare il pentasaccaride sintetico Fondaparinux, che è un farmaco antitrombotico, strutturalmente corrispondente al sito di legame dell'eparina per l'antitrombina. Dopo il taglio dell'eparanasi, un trisaccaride ed un disaccaride riducente sono ottenuti. Quest'ultimo può essere facilmente quantificato in modo da stabilire l'attività dell'eparanasi. Nei presenti esempi, la soluzione saggio (100 pi) comprende 40 mM di buffer di acetato di sodio pH 5.0 e 100 mM di Fondaparinux (GlaxoSmithKline), con o senza campione inibitore. Eparanasi è stata aggiunta alla concentrazione finale di 140 pM per avviare il saggio. Le piastre sono state sigillate con nastro adesivo ed incubate a 37°C per 2-24 ore. I test sono stati fermati mediante aggiunta di 100μL di una soluzione di 1,69 mM di 4-[3-(4-iodofenil)-1H-5 tetrazolio]-1,3-benzene disulfonato (WST-1, Aspep, Melbourne, Australia) in NaOH 0,1M. Le piastre sono state risigillate con nastro adesivo e sviluppate a 60°C per 60 minuti. L’assorbanza è stata misurata a 584 nm (Fluostar, BMG, Labtech). In ogni piastra, una curva costruita con D-galattosio come zucchero riducente standard è stata preparata nello stesso tampone e volume, a concentrazioni comprese tra 2 e 100 µM. Il valore di IC50è stato determinato. Dato che questo saggio ha un substrato omogeneo con un singolo punto di taglio, i parametri cinetici e biochimici dell’enzima possono essere determinati in modo affidabile. I risultati ottenuti utilizzando il sopra descritto test colorimetrico sono stati validati usando un diverso test che utilizza una matrice extracellulare (ECM) marcata con solfato radioattivo come substrato dell’eparanasi. In breve, il substrato ECM è depositato mediante cellule endoteliali corneali coltivate e quindi molto somigliante alla membrana basale subendoteliale nella sua composizione, funzione biologica e proprietà barriera. Informazioni dettagliate riguardo la preparazione di ECM marcate con solfato e il loro uso per il saggio di eparanasi possono essere trovate in: Vlodavsky, I., Current Protocols in Cell Biology, Chapter 10: Unit 10.4, 2001. Il saggio è altamente sensibile, rispecchia meglio le condizioni in vivo, ma, a causa della sua natura biologica, è semiquantitativo e limitato in termini di parametri biochimici.
[0046] Attività in vivo
L’attività antimieloma in vivo è stata testata seguendo sostanzialmente la procedura descritta da Yang Y. et al. (Yang Y., et al., 2007, “The syndecan-1 heparan sulfate proteoglycan is a viable target for myeloma therapy.” Blood, 110, 2.041-2.048). In breve, topi CB17 scid/scid di 5-6 settimane di vita sono stati ottenuti da Arlan (Indianapolis, IN) o Charles River Laboratories (USA). I topi sono stati stabulati e monitorati nello stabulario dell’Università dell’Alabama a Birmingham. Tutte le procedure e i protocolli sperimentali sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee. 1x10<6>cellule di mieloma CAG esprimenti eparanasi (ad alta o bassa espressione) sono state iniettate sottocute nel fianco sinistro di ogni topo. Dieci giorni dopo l’iniezione delle cellule tumorali, ai topi sono state impiantate delle pompe osmotiche Alzet (Durect Corporation, Cupertino, CA) sul fianco destro. Le pompe contenevano una soluzione dei composti da testare (nuovi derivati di eparina) o PBS come controllo. La soluzione è stata somministrata in modo continuativo per 14 giorni. Dopo 14 giorni, gli animali sono stati sacrificati e il peso umido dei tumori sottocutanei e il livello medio di kappa nel siero sono stati valutati e confrontati tra i gruppi sperimentali mediante test logrank (p<0,05 è stato considerato statisticamente significativo).
[0047] L'immagine settimanale di bioluminescenza della luciferasi fornisce dati quantitativi sui tumori primari ed evidenzia le metastasi all'interno delle ossa così come nei tessuti molli. Va notato che, il modello SCID-hu è unico poiché le cellule tumorali umane sono iniettate direttamente in piccoli frammenti di osso fetale umano successivamente impiantati sottocute in topi SCID, quindi riproducendo strettamente il mieloma umano.
[0048] Procedura generale delle analisi NMR
Gli spettri sono stati registrati a 25°C con uno spettrometro Bruker Avance 500 (Karlsruhe, Germany) munito di criosonda TCI da 5 mm o di sonda BBO da 10 mm. L'integrazione dei volumi dei picchi nello spettro è stata fatta utilizzando un software standard Bruker TopSpin 2.0. La struttura dei residui dicarbossilati di acido uronico è stata determinata mediante esperimenti eteronucleari a due dimensioni che hanno confermato la presenza dei residui tricarbossilati e hanno permesso l'identificazione del loro spostamento chimico ( Chemical shift). Nella tabella sotto sono riportati gli spostamenti chimici assegnati del protone e degli atomi di carbonio in posizione 1, 4, 5 dei residui dicarbossilati, della glucosammina e dell' acido iduronico 2-O-solfatato.
[0049] Procedura generale per il calcolo dell'incremento dei gruppi carbossilici
L'incremento dei gruppi carbossilici nei residui di acido uronico di derivati di eparina dicarbossilata è stato calcolato partendo dai rispettivi valori di rapporto molare S037C00<">del materiale di partenza (eparina non frazionata o eparine e LMWHs almeno parzialmente desolfatate) e dei derivati dicarbossilati, valutati mediante titolazione conduttimetrica, secondo Casu B. and Gennaro U., 1975, Carbohydr Res 39, 168-176. In particolare, il grado di solfatazione del materiale di partenza è determinato dopo il primo passaggio di ossidazione, su un campione ridotto dell'intermedio ossidato di glucosamminoglicano (vedere esempi 4-7), mentre il grado di solfatazione del derivato carbossilato di glucosamminoglicano finale è determinato dopo il secondo passaggio di ossidazione (vedere esempi 8-11, 13-14).
S03yC02<'>= A (rapporto nei materiali di partenza) S03<">= A / C02<">
S03<">/ C02<">= B (rapporto nei derivati dicarbossilati) S03<">= B / C02<">
Dato che il numero di gruppi solfati non cambia durante i due passaggi di ossidazione, si può
Concludere che I incremento dei gruppi carbossilici (C02(derivati dicarbossilati)/ C02(materiali di partenza) ® equivalente al rapporto tra i rapporti molari individuali A e B.
Incremento carbossilico (C.I.) = A/B= C02(derivati dicarbossilati) / C02(materiali di partenza)·
[0050] Taglio enzimatico di eparine e loro derivati carbossilati ed analisi HPLC/MS
Il substrato (2-3 mg) è stato sciolto in una miscela 1: 1 (v/v) 100 mM di buffer di acetato di sodio (pH 7.0) e 10 mM di acetato di calcio per ottenere una soluzione di 7.7 mg/ml. Per effettuare il taglio enzimatico 144 pi della miscela di acetato di sodio 100 mM e acetato di calcio 10 mM (1: 1) e 3 pi di miscela di eparanasi (eparina Nasi I, II e III) (1 pi di ogni Nasi, 2mU/pl soluzione enzima) sono stati aggiunti a 13 pi della soluzione di eparina. La miscela di reazione è stata agitata a 37°C (Thermo-Shaker TS-100 Biosan) per 24 ore. La reazione è stata fermata aggiungendo 3 pi di 3% HCOOH. Ogni campione è stato diluito due volte con acqua e analizzato mediante IPRP-HPLC/ESI-TOF (micrOTOF-Q, Bruker). Un kinetex C18 ed un gradiente (0'-17% B, 15'-20% B, 55'-40% B, 100' 50% B, 115' 90% B) che utilizza fase A (pH 6.25) e B (pH 7.95) con 10 mM DBA-CH3COOH sono stati usati con una portata di 100 pl/min.
[0051] ESEMPIO 1 (G7669)
Un campione di UFH (2,5g di lot. G5842) in NaOH 1M (32 mi) è stato scaldato a 60°C per 30 minuti. Dopo raffreddamento a temperatura ambiente e neutralizzazione con HCI 2N, la soluzione è stata dializzata a temperatura ambiente per 3 giorni contro acqua distillata in membrane (cut-off: 3.500 Da). Concentrazione a pressione ridotta e liofilizzazione davano: 2,15 g (resa= 80% w/w) di un intermedio con 13% dei residui di acido uronico totali recanti gruppi epossidici, come determinato mediante<13>C-NMR. Il campione è stato poi sciolto in acqua (32 mi) e mantenuto sotto agitazione a 70°C per 2 giorni, in modo da idrolizzare i gruppi epossidici. Dopo concentrazione e liofilizzazione, è stato ottenuto G7669.
[0052] ESEMPIO 2 (G8661)
Un campione di UFH (2,11 g di lot. G3378) in 27 mi di NaOH IN è stato agitato a 60°C per 30 minuti. Neutralizzazione, raffreddamento a temperatura ambiente e dialisi, concentrazione e liofilizzazione (come descritto nell'Esempio 1) davano l'intermedio G8637 (1,5 g). Dato che il suo spettro<13>C-NMR indicava la presenza di gruppi epossidici, G8637 (1,5 g) è stato sciolto in acqua (32 mi) e mantenuto sotto agitazione a 70°C per 2 giorni, in modo da idrolizzare i gruppi epossidici. Dopo concentrazione e liofilizzazione, è stato ottenuto G8661 (1,5 g).
[0053] ESEMPIO 3 (G8699)
Un campione di UFH (2,01 g di lot. G3378) è stato processato come descritto nell'Esempio 2 per dare il derivato intermedio contenente epossidici G8638. Un campione di G8638 (1,4 g) è stato sciolto in acqua (32 mi) e scaldato per agitazione a 70°C per 24 ore, per dare, dopo concentrazione e liofilizzazione, 1,3 g di G8699.
OSSIDAZIONE CON PERIODATO DI EPARINA NON FRAZIONATA E DERIVATI 2-O-DESOLFATATI
[0054] ESEMPIO 4 (G7731)
Partendo da un campione G7669 dell'Esempio 1 (1,8 g, 13% di 2-O-desolfatazione) in acqua (52 mi), la soluzione è stata raffreddata a 4°C, agitata al buio e sono stati aggiunti 52 mi di NaI040,2M. Dopo 16 ore, l'eccesso di periodato è stato eliminato aggiungendo etilenglicolo (5,2 mi) e dopo 1 ora a 4°C la miscela di reazione è stata dissalata mediante dialisi a 4°C per 16 ore. Dopo concentrazione a pressione ridotta e liofilizzazione, G7731 recante dialdeidi è stato ottenuto (1,5 g), resa= 83% w/w. Una piccola porzione di campione è stata ridotta con NaBH4 per misurare MW= 8.242 Da e S037C00<">=2,46 mediante titolazione conduttimetrica.
[0055] ESEMPIO 5 IG8425I
Partendo da un campione di UFH (0,25 g, lot. G3378) e seguendo la stessa procedura descritta nell'Esempio 4, G8425 recante dialdeidi è stato ottenuto (0,24 g), resa= 96% w/w.
[0056] ESEMPIO 6 IG8678I
Partendo da un campione di G8661 dell'Esempio 2 (1,5 g) e seguendo la stessa procedura descritta nell'Esempio 4, G8678 recante dialdeidi è stato ottenuto (1,5 g). Una piccola porzione di campione è stata ridotta con NaBH4per misurare S03VCOO<">= 1,96 mediante titolazione conduttimetrica.
[0057] ESEMPIO 7 (G8710)
Partendo da un campione di G8699 dell'Esempio 3 (0,56 g) e seguendo la stessa procedura descritta nell'Esempio 4, G8710 recante dialdeidi è stato ottenuto (0,56 g). Una piccola porzione di campione è stata ridotta con NaBH4per misurare S03<">/COO<">= 1,51 mediante titolazione conduttimetrica.
OSSIDAZIONE DEGLI INTERMEDI DIALDEICI DI ACIDO URONICO NEI CORRISPONDENTI DICARBQSSILATI
[0058] ESEMPIO 8 (G7927)
Un campione di G7731 dell'Esempio 4 (0,3 g) sciolto in acqua (29 mi) è stato raffreddato a 0°C in un pallone a fondo rotondo a due colli e, sotto agitazione in atmosfera di azoto, è stato trattato con una soluzione acquosa (6 mi) contenente NaCI02(0,362 g). Dopo un'aggiunta goccia a goccia di acido acetico glaciale (0,118 mi) fino al raggiungimento di un pH pari a 4.0, la miscela di reazione è stata agitata a temperatura ambiente per 24 ore. Dopo altre 3 ulteriori ore di agitazione a temperatura ambiente, in un flusso di azoto, è stata ottenuta una soluzione incolore. La miscela di reazione è stata neutralizzata con NaOH 0,5N e dissalata mediante dialisi come descritto nell'Esempio 4. Concentrazione e liofilizzazione davano G7927 (0,228 g), resa= 76% w/w, avente:
MW= 6.450 Da;
S03VC00-= 1,23;
incremento carbossilico (C.I.)= 2.
L'analisi in vitro di inibizione di eparanasi ha dato: IC50= 10 ng/ml.
[0059] ESEMPIO 9 (G8437)
Partendo da un campione di G8425 dell'Esempio 5 (0,25 g) in cui solo gli acidi uronici non solfatati naturalmente presenti nella catena di eparina (18%) sono stati ossidati seguendo la stessa procedura descritta nell'Esempio 8, G8437 (0,21 g) è stato ottenuto riducendo a 1,5 ore il flusso di azoto prima della neutralizzazione della miscela di reazione, avente:
MW=12.100 Da;
S03<'>/COO-= 1,62;
incremento carbossilico (C.I.) = 1,43.
L'analisi in vitro di inibizione di eparanasi ha dato: IC50= 10 ng/ml.
[0060] ESEMPIO 10 (G8767)
Partendo da un campione di G8678 dell'Esempio 6 (1 g) e seguendo la procedura descritta nell'Esempio 8, è stato ottenuto G8767 (1,05 g), avente:
MW= 8.800 Da;
S03/COO = 1,27;
incremento carbossilico (C.I.) = 1,55.
L'analisi di attività antimieloma in vivo (60 mg/kg al giorno per 14 giorni) ha dato: 52% inibizione tumore e 20% inibizione K serica.
[0061] ESEMPIO 11 (G8733)
Partendo da un campione di G8710 dell'Esempio 7 (0,56 g) e seguendo la procedura descritta nell'Esempio 8, è stato ottenuto G8733 (0,453 g), resa= 80% w/w, avente:
MW= 5.540 Da;
S03yC00<">= 0,97;
Incremento carbossilico (C.I.) = 1,56.
L'analisi di attività antimieloma in vivo (60 mg/kg al giorno per 14 giorni) ha dato: 53% inibizione tumore.
[0062] ESEMPIO 12 (G9685)
Partendo da un campione di UFH (lot. G3378) e seguendo la procedura descritta nell'Esempio 4, sono stati ottenuti i derivati dialdeidici. I derivati dialdeidici sono stati ulteriormente ossidati in presenza di cloruro di sodio, seguendo la procedura dell'Esempio 8, ottenendo il derivato carbossilato G9685, avente MW= 11.700 Da.
L'analisi in vitro di inibizione di eparanasi ha dato: IC50= 10 ng/ml;
L'analisi di attività antimieloma in vivo (60 mg/kg al giorno per 14 giorni) ha dato: 68% inibizione tumore.
[0063] ESEMPIO 13 (G7897)
Un campione di G7731 dell'Esempio 4 (0,3 g) è stato sciolto in acqua (3 mi) e trattato con 1,36 mi di NaCI02fino ad un pH di 8.2-8.5 con HCI 4%. Poi 1 mg di TEMPO è stato aggiunto e il pH è stato mantenuto a 7-7.5 con NaOH 1M per 24 ore. La miscela di reazione è stata dissalata mediante dialisi, concentrata e liofilizzata per dare G7897 (0,190 g), resa= 63% w/w, avente:
S03<'>/COO-= 1,92;
incremento carbossilico (C.I.) = 1,28.
[0064] ESEMPIO 14 (G9585)
Partendo da un campione di eparina 2-O-desolfatata (G9416, S03"/COO"= 1,39), seguendo la procedura descritta nell'Esempio 4, i derivati dialdeidici G9577 sono stati ottenuti. Un campione di G9577 (0,242 g) sciolto in acqua (21 mi) è stato raffreddato a 0°C in un pallone a fondo tondo a due colli e, sotto agitazione in atmosfera di azoto, è stato trattato con una soluzione acquosa (1 mi) contenente NaCI02(0,128 g). Dopo un'aggiunta goccia a goccia di acido acetico glaciale (0,084 mi) fino al raggiungimento di un pH pari a 4.0, la miscela di reazione è stata agitata a temperatura ambiente per 24 ore. Dopo altre 3 ulteriori ore di agitazione a temperatura ambiente, con un flusso di azoto, una soluzione incolore è stata ottenuta. La miscela di reazione è stata neutralizzata con NaOH 0,5N e dissalata mediante dialisi come descritto nell'Esempio 4. Concentrazione e liofilizzazione davano G9585 (0,148 g), resa= 61% w/w, avente:
MW= 4.700 Da;
S03yC00<">= 0,82;
incremento carbossilico (C.I.) = 1,69.
L'analisi in vitro di inibizione di eparanasi ha dato: IC50= 44 ng/ml.
Claims (10)
- Rivendicazioni 1. Processo per la preparazione di un derivato di un glucosamm inoglicano inibente eparanasi comprendente: a) ossidazione, prefer ibilm ente con periodato, dal 10% al 100% , preferibilm ente dal 25% al 100% , dei residui di un glucosamminoglicano 2-O- ed opzionalmente 2N- , 3-O- , non solfatat i, in condizioni at te a convert ire i dioli adiacent i ed opzionalmente gli OH/ NH2adiacent i in dialdeidi; b) ossidazione del glucosamminoglicano ossidato in condizioni at te a convert ire det te dialdeidi in gruppi carbossilat i.
- 2. I l processo della r ivendicazione 1, in cui il glucosamm inoglicano è un glucosamminoglicano naturale o sintet ico, prefer ibilmente selezionato t ra eparina, eparina a basso peso molecolare (LMWH), eparansolfato, opzionalmente 2-O- e/ o 2-N-desolfatat i, più preferibilm ente selezionato t ra eparina non frazionata o LMWH, opzionalm ente 2-O- e/ o 2-N-desolfatate.
- 3. I l processo delle r ivendicazioni 1 e 2 in cui il glucosam minoglicano ha un grado di solfatazione (SO3-/ COO-) , determ inato mediante t itolazione condut t imet r ica com e definito qui, compreso t ra 0,8 e 2,8, preferibilmente compreso t ra 0,9 e 2,5.
- 4. I l processo di una qualsiasi delle r ivendicazioni precedent i, in cui i derivat i di glucosamminoglicano hanno un incremento carbossilico, com e definito qui, compreso t ra 1,2 e 2,2.
- 5. Compost i ot tenibili mediante il processo di una qualsiasi delle r ivendicazioni precedent i.
- 6. I com post i della r ivendicazione 5 avent i un peso molecolare compreso t ra 3.000 e 20.000 Da, preferibilmente t ra 3.500 e 12.000 Da.
- 7. Compost i oligosaccaridi ot tenibili mediante parziale depolimerizzazione enzimat ica o chim ica dei compost i delle r ivendicazioni 5-6.
- 8. I com post i di una qualsiasi delle r ivendicazioni 5-7 per l’uso com e medicam ent i.
- 9. I com post i della rivendicazione 8 per l’uso come farmaci antimetastatici o antitumorali.
- 10. I compost i dellarivendicazione 8 per l’uso com e farmaciantimieloma.
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