CN105744940A - 葡糖胺聚糖的羧基化衍生物以及作为药物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及葡糖胺聚糖衍生物，其具有类肝素酶抑制活性和抗肿瘤活性，其在至少部分葡糖胺聚糖残基的2和3位上具有羧基，并且涉及制备其的方法。本发明的葡糖胺聚糖衍生物由天然或合成的葡糖胺聚糖，优选肝素或低分子量肝素(其任选地为2?O?和2N?脱硫酸化的)开始通过两个氧化步骤产生。通过第一次氧化，所述葡糖胺聚糖残基的相邻的二醇和任选的相邻的OH/NH2被转化为醛，并且通过第二次氧化，所述二醛被转化为羧基。所述第一次氧化优选导致可氧化残基的环的C2?C3键的断裂。本发明还涉及制备所述葡糖胺聚糖衍生物的方法，并且还涉及它们作为药物的活性成分的用途。此外，本发明涉及药物组合物，其包含二/三羧基化肝素衍生物作为活性物质。

Description

葡糖胺聚糖的羧基化衍生物以及作为药物的用途
发明概述
本发明涉及葡糖胺聚糖衍生物，其具有类肝素酶抑制活性和抗肿瘤活性，其在至少部分葡糖胺聚糖残基的2和3位上具有羧基(carboxylate group)，并且涉及制备其的方法。
本发明的葡糖胺聚糖衍生物由天然或合成的葡糖胺聚糖(其任选地被化学或酶促修饰)开始生成。具体而言，所述葡糖胺聚糖衍生物可通过两个步骤的葡糖胺聚糖的氧化来获得。通过第一次氧化(a)(优选通过高碘酸盐)，所述葡糖胺聚糖残基的相邻的二醇和任选的相邻的OH/NH2被转化为醛，并且通过第二次氧化(b)，所述二醛被转化为羧基。根据本发明，葡糖胺聚糖的优选10％-100％，更优选25％-100％的2-O-非硫酸化残基以及任选的2N-,3-O-非硫酸化残基在第一个氧化步骤(a)中在将相邻的二醇和任选的相邻的OH/NH2有效转化为醛的条件下氧化。
第一次氧化优选导致可氧化残基的环的C2-C3键的断裂。优选地，所述葡糖胺聚糖为天然或合成的葡糖胺聚糖，其任选地2-O-和/或2-N-脱硫酸化，其具有0.8-2.8，优选0.9-2.5的硫酸化程度(SO3 -/COO-摩尔比率)。本文中的硫酸化程度(SO3 -/COO-摩尔比率)意在如通过根据Casu B.和Gennaro U.,1975,Carbohydr Res 39,168-176的电导滴定来测定。
可通过上文公开的本发明的方法获得的二/三羧基化葡糖胺聚糖衍生物表现出1.2-2.2的羧基增量，其中所述羧基增量以原料的硫酸化程度(SO3 -/COO-摩尔比率)与二/三羧基化衍生物的硫酸化程度(SO3 -/COO-摩尔比率)的比率的形式计算，所述硫酸化程度通过如本文中定义的电导滴定来测定。更具体地，起始葡糖胺聚糖的硫酸化程度在通过第一个氧化步骤(a)获得的葡糖胺聚糖中间体的样品上在通过NaBH4还原后测定。
优选地，本发明的葡糖胺聚糖衍生物由来自任意动物和器官来源的天然肝素，或者由合成肝素(其任选地被化学或酶促修饰)开始获得。更优选地，所述原料为未分级肝素、低分子量肝素(LMWH，其分子量为3,500-8,000Da)、硫酸类肝素(HS)或其衍生物。最优选的是可由未分级肝素或LMWH(任选地2-O-和/或2-N-脱硫酸化)获得的葡糖胺聚糖衍生物。
本发明还涉及制备所述葡糖胺聚糖衍生物的方法，并且还涉及它们作为药物的活性成分，任选地与已知的确定药物或治疗组合的用途。具体而言，本发明涉及所述葡糖胺聚糖衍生物，其用作用于治疗病理病况(诸如多发性骨髓瘤和其它瘤(即肉瘤、癌、血液恶性肿瘤)，包括其转移形式)的药物。
此外，本发明涉及所述葡糖胺聚糖衍生物在由类肝素酶的抑制获得益处的任意治疗适应症(即糖尿病肾病、炎性肠病、结肠炎、关节炎、银屑病、败血症、动脉粥样硬化)中的用途。本发明还涉及药物组合物，其包含所述二/三羧基化葡糖胺聚糖衍生物，特别是涉及药物组合物，其包含二/三羧基化肝素和低分子量肝素(LMWH)衍生物作为活性物质。任选地，所述药物组合物还包含至少一种不同的活性物质，优选至少一种不同的抗肿瘤剂。
发明背景
多发性骨髓瘤是第二大最流行的恶性血液病，并且占美国所有血液癌症的超过10％，每年大约20,000个新病例，并且死亡率高于50％(Graham-Rowe D.,2011,Multiplemyeloma outlook.Nature 480,s34-s35)。
在过去几年，已研发有前景的疗法，诸如给药蛋白酶体抑制剂(Velcade)、二磷酸盐和沙利度胺等。这些药剂的有效性至少部分由于它们对骨髓瘤肿瘤微环境的影响。
尽管已证实所述药剂针对骨髓瘤的功效，但仍然有对于用于治疗骨髓瘤和其它肿瘤的新的和改善的药物的需求。
类肝素酶是内-β-葡糖醛酸糖苷酶，其断裂HS-蛋白聚糖的硫酸类肝素(HS)，诸如多配体聚糖-1，从而释放HS-结合生长因子。
在人中，似乎有能够断裂HS的单一的主导功能性类肝素酶。类肝素酶大部分在人肿瘤中表达，在所述人肿瘤中，其显著增加肿瘤细胞的生成血管和转移能力。实际上，已将升高的类肝素酶水平与许多肿瘤类型的晚期进展和转移相关。例如，高水平的类肝素酶与患者较短的手术后存活时间相关。在Vlodavsky和Sanderson的实验室已证明类肝素酶在肿瘤转移中的直接作用，在所述实验室测试了我们的新型抑制剂。
除了其酶促功能(包括释放HS结合的生长因子和细胞外基质(ECM)的降解)，类肝素酶还具有非酶促功能，其可影响肿瘤行为及微环境。Sanderson的课题组率先开始了类肝素酶和多配体聚糖-1在骨髓瘤中的研究，证明类肝素酶在骨髓瘤的侵略性肿瘤表型中起主要调节剂的作用。这通过促进VEGF和MMP-9(其共同刺激肿瘤生长、转移和溶骨性骨破坏)向上调节来进行。实际上，这表明在体内类肝素酶促进骨髓瘤肿瘤的生长和向骨的自发性转移，并且通过肿瘤细胞表达的类肝素酶推动了激烈的骨质溶解，这至少部分由于RANKL表达的向上调节。所述类肝素酶的骨质溶解促进作用可能是非常重要的，因为当骨退化时释放骨结合生长因子。此外，破骨细胞可释放肿瘤生长促进因子，诸如HGF。这些因子一起可有助于建立骨髓中的合适环境(niche)，其支持肿瘤细胞寻靶和随后的生长(Fux,L.等人,2009,“Heparanase:busy at the cell surface.”Trends Biochem Sci,34(10):511-519；Sanderson R.D.和Yang Y.,2008,“Syndecan-1:a dynamic regulator of the myelomamicroenvironment.”Clin Exp Metastasis 25:149-59；Ilan N.等人,2006,“Regulation,function and clinical significance of heparanase in cancer metastasis andangiogenesis.”Int J Biochem Cell Biol,38:2018-2039)。因此，类肝素酶的抑制是骨髓瘤疗法的可行靶点，这由以下事实支持：在人中具有单一的酶促活性类肝素酶，并且其在正常组织中的表达稀少。此外，已表明类肝素酶敲除小鼠可存活，并且未表现可见病症。这表明源自类肝素酶抑制策略可有较小或无副作用(Casu B.等人2008.Non-anticoagulantheparins and inhibition of cancer.Pathophysiol Haemost Thromb.36:195-203；Vlodavsky I.等人2007.Heparanase:structure,biological functions,and inhibitionby heparin-derived mimetics of heparan sulfate.Curr Pharm Des.13:2057-2073；Naggi A.等人2005.Modulation of the Heparanase-inhibiting Activity of Heparinthrough Selective Desulfation,Graded N-Acetylation,and GlycolSplitting.J.Biol.Chem.280:12103-12113)。
肝素是葡糖胺聚糖家族的线性多分散硫酸化多糖，其具有抗凝血和抗血栓形成活性。肝素的糖链由交替的糖醛酸和D-葡糖胺组成。主要的重复单元是2-O-硫酸化L-艾杜糖醛酸(IdoA2S)α(1→4)和N-,6-O-二硫酸化D-葡糖胺(GlcN6S)。较少组分是非硫酸化L-艾杜糖醛酸和D-葡糖醛酸，以及N-乙酰基D-葡糖胺和N-,3-O-,6-O-三硫酸化D-葡糖胺(CasuB.,2005.“Structure and active domains of heparin.”In:Chemistry and biology ofheparin and heparan sulfate.Amsterdam:Elsevier.1-28；Casu B.和Lindahl U.,2001,“Structure and biological interactions of heparin and heparan sulfate.”AdvCarbohydr Chem Biochem,57:159-206)。与HS结构类似的肝素可有效地抑制类肝素酶，但是在类肝素酶抑制策略中，由于其抗凝血活性，将肝素以高剂量使用是不可能的。
有趣的是，比肝素更可被生物利用的且较低抗凝血活性的低分子量肝素(LMWH)似乎可能通过对肿瘤生长和转移的直接作用延长患有癌症的患者的存活。这可能至少部分由于对类肝素酶活性的抑制(Zacharski L.R.和Lee,A.Y.2008.Heparin as an anticancertherapeutic.Expert Opin Investig Drugs 17:1029-1037)。
在现有技术中已通过研究由非抗凝血肝素(其大部分包含通过葡糖胺聚糖残基的碳2和3之间的键的断裂(二醇裂解(splitting)的糖苷环打开修饰的非硫酸化糖醛酸残基)的类肝素酶抑制来选择类肝素酶的酶促活性的有效抑制剂。所述抑制剂区别在于之前存在的非硫酸化糖醛酸残基和通过分级2-O-脱硫酸化生成的那些的O-硫酸化模式、N-乙酰化程度和二醇裂解(Naggi A.,2005.“Glycol-splitting as a device for modulatinginhibition of growth factors and heparanase inhibition by heparin and heparinderivative.”In:Chemistry and Biology of Heparin and HeparanSulfate.Amsterdam:Elsevier461-481；Yang Y.等人,2007,“The syndecan-1heparansulfate proteoglycan is a viable target for myeloma therapy.”Blood,110:2041-2048)。
具体而言，术语“二醇裂解(glycol split)”(gs)通常是指存在由于两个相邻碳(各自具有羟基)之间的一个键的断裂(二醇裂解)的一些单糖残基的打开的多糖。由未修饰的多硫酸化嵌段(偶尔被二醇裂解残基间断，对应于原始链上存在的非硫酸化葡糖醛酸/艾杜糖醛酸残基)组成的第一代二醇裂解肝素(即所谓的“还原氧化肝素”(RO-肝素))首先氧化为二醛，然后还原为醇(Naggi A.,2005,“Glycol-splitting as a device formodulating inhibition of growth factors and heparanase inhibition by heparinand heparin derivative.”In:Chemistry and Biology of Heparin and HeparanSulfate.Amsterdam:Elsevier461-481)。
WO 01/55221公开了2-O-脱硫酸化程度不大于60％的总糖醛酸单元的葡糖胺聚糖。所述葡糖胺聚糖无抗凝血活性，并且表现出基于FGF抑制的抗血管生成活性。未预料到其对类肝素酶的抑制活性。
US 2008/0051567公开了对应于100％N-乙酰化和25％二醇裂解肝素的化合物，其产生较少或无抗凝血活性或者由细胞外基质的生长因子的释放。发现所述化合物在实验动物模型(包括骨髓瘤的Sanderson模型)中抑制类肝素酶、肿瘤生长、血管发生和炎症(YangY.,等人2007.The syndecan-1 heparan sulfate proteoglycan is a viable targetfor myeloma therapy.Blood110:2041-2048)。
尽管如此，仍然有对于提供具有更高的类肝素酶亲和性、更高的选择性和改善的生物利用度，适合用于治疗类肝素酶相关病理(例如骨髓瘤和其它肿瘤)的改善的化合物的需求。
附图简述
图1：通过本发明的方法生成的普遍结构。(1)包含一个糖醛酸(艾杜糖醛酸和/或葡糖醛酸)和一个葡糖胺(2-N-乙酰化、2-N-未取代的和/或2-N-硫酸化)的葡糖胺聚糖聚合物的二糖单元，其中羟基(R3和R4)可各自或均被硫酸根基团取代或未被取代。(2、3、4)通过2-非硫酸化肝素残基的环的氧化性裂解，然后通过进一步氧化为三或二-羧基化残基生成的代表性结构(新实体)。
图2：用MS检测获得的色谱图的一个实例。对应于包含糖醛酸二或三-羧基化残基(通过分子量的测量值归属)的峰的存在各自通过代号“+carbox2”或“+carbox3”在图中强调。
图3：用MS检测获得的色谱图的一个实例。对应于包含糖醛酸二或三-羧基化残基(通过分子量的测量值归属)的峰的存在各自通过代号“+carbox2”或“+carbox3”在图中强调。
发明描述
本发明涉及具有类肝素酶抑制活性的新一类化学修饰的葡糖胺聚糖衍生物。具体而言，其涉及羧基化葡糖胺聚糖衍生物，其中至少部分残基为具有三个羧基的裂解的残基(或者如果所述裂解的残基为葡糖胺，则为两个)。
本发明的葡糖胺聚糖衍生物优选为肝素衍生物，其命名为“二/三羧基化肝素”，其强烈地抑制类肝素酶的硫酸类肝素降解活性。对肝素进行的化学修饰(修饰ATIII的结合位点中所包含的葡糖醛酸的残基)去除了肝素的抗凝血活性，能够以高剂量使用。
本发明的葡糖胺聚糖衍生物可通过葡糖胺聚糖的2-非硫酸化残基在将葡糖胺聚糖的相邻的二醇和任选的相邻的OH/NH2有效转化为醛的条件氧化(优选通过高碘酸盐进行)，随后通过氧化的葡糖胺聚糖在将所述二醛转化为羧基的条件下氧化来获得。具体而言，本发明的葡糖胺聚糖衍生物可优选由硫酸化程度(SO3 -/COO-摩尔比率)为0.8-2.8，优选0.9-2.5的葡糖胺聚糖开始获得。本文中的硫酸化程度(SO3 -/COO-摩尔比率)意在如通过根据Casu B.和Gennaro U.,1975,Carbohydr Res 39,168-176的电导滴定来测定。
可通过上文公开的本发明的方法获得的二/三羧基化葡糖胺聚糖衍生物表现出1.2-2.2的羧基增量，其中所述羧基增量以原料的硫酸化程度(SO3 -/COO-摩尔比率)在第一个氧化步骤后与二/三羧基化衍生物的硫酸化程度(SO3 -/COO-摩尔比率)的比率的形式计算，所述硫酸化程度通过如本文中定义的电导滴定来测定。更具体地，所述原料在第一个氧化步骤后的硫酸化程度在通过第一个氧化步骤(a)获得的葡糖胺聚糖中间体的样品上在通过NaBH4还原后测定。
优选地，本发明的葡糖胺聚糖衍生物得自天然或合成的(化学或酶促获得的)葡糖胺聚糖，更优选得自2-O-和/或2-N-脱硫酸化葡糖胺聚糖。在优选的实施方案中，所述天然或合成的葡糖胺聚糖是未分级肝素、LMWH或硫酸类肝素，其任选地被2-O-和/或2-N-脱硫酸化。
更优选地，所述葡糖胺聚糖衍生物得自天然或合成的肝素或LMWH，其为2-O-和任选地2-N-脱硫酸化的。
作为一个实例，肝素链可天然地包含约5％至35％的2-O-非硫酸化糖醛酸残基、0％至50％的N-乙酰化葡糖胺残基和约0％-6％的N-未取代的(既未N-硫酸化也未N-乙酰化)葡糖胺残基。不同的硫酸化程度取决于肝素来源(动物种类、器官来源)以及提取操作。葡糖胺聚糖的每个2-O-或2N-非硫酸化残基(不具有3-O-硫酸根取代基)易于进行开环(裂解)下的氧化以及邻位的二醇和OH/NH2向醛的转化。任选地，起始葡糖胺聚糖的分级2-O-脱硫酸化允许调节葡糖胺/糖醛酸裂解残基的比率。
本发明还涉及制备所述羧基化葡糖胺聚糖衍生物的方法，并且还涉及其作为用于治疗的病理病况的药物的活性成分(作为单一的活性成分，或者与其它药物组合)的用途。所述病理病况包括多发性骨髓瘤和其它肿瘤性疾病，包括其转移形式。此外，本发明涉及所述羧基化葡糖胺聚糖衍生物，其用于由类肝素酶的抑制获得益处的任意治疗适应症。本发明还涉及药物组合物，其包含所述羧基化葡糖胺聚糖衍生物，其任选地与至少一种其它活性成分组合。
用于制备本发明的羧基化葡糖胺聚糖衍生物的方法包括：葡糖胺聚糖的敏感非硫酸化残基在将相邻的二醇和任选的相邻的OH/NH2有效转化为醛的条件下氧化(优选通过高碘酸盐进行，或者通过使用具有相似反应性的氧化试剂)，随后通过由第一次氧化得到的葡糖胺聚糖在由相应的醛基获得两个新羧基的条件下氧化。
因此，本发明的方法包括葡糖胺聚糖的10％-100％，优选25％-100％的2-O-和任选的2-N-,3-O-非硫酸化残基在将相邻的二醇和任选的相邻的OH/NH2有效转化为醛的条件下氧化(优选通过高碘酸盐进行)；然后其包括所述氧化的葡糖胺聚糖在将所述二醛有效转化为羧基的条件下氧化。
优选地，所述起始葡糖胺聚糖是天然或合成的葡糖胺聚糖；更优选地，其选自肝素、低分子量肝素或硫酸类肝素；最优选地，其选自肝素和LMWH，其为2-O和任选地2-N-脱硫酸化的。
优选地，所述起始葡糖胺聚糖的硫酸化程度(SO3 -/COO-)为0.8-2.8，更优选为0.9-2.5(通过如本文中定义的电导滴定)。
本发明的方法的第一次氧化优选在3-10的pH下，更优选在4.5-8的pH下进行。在优选的实施方案中，本发明的方法的第一次氧化在3-5的pH下进行，以仅断裂非硫酸化糖醛酸残基的C2-C3键，以避免副反应。在另一优选的实施方案中，本发明的方法的第一次氧化在5.5-10的pH下进行，以断裂2-O-非硫酸化糖醛酸和N-非硫酸化葡糖胺残基的C2-C3键。
在优选的实施方案中，所述第一次氧化在断裂2-O-非硫酸化糖醛酸以及2-N-,3-O-非硫酸化葡糖胺的C2和C3之间的键的条件下进行。
任选地，本发明的方法在用于降低解聚的NTA(次氮基三乙酸)、螯合剂和多价螯合剂的存在下，在用于碱化反应溶液的NaHCO3或吡啶的存在下，或者在含或不含NTA的MnCl2的存在下进行。进一步的二醛氧化优选使用NaClO2进行，或者通过使用具有相当的氧化性质的物质(诸如TEMPO(2,2,6,6四甲基-1-哌啶基-氧化物))进行。
优选地，本发明的葡糖胺聚糖衍生物中的羧基化糖醛酸残基为所述葡糖胺聚糖的总羧基化残基的总残基的25％-100％，更优选50％-100％，最优选60％-90％。
可通过上述方法获得的羧基化葡糖胺聚糖衍生物的分子量优选为8000-30,000Da，其取决于所述方法的条件和所使用的起始葡糖胺聚糖。在优选的实施方案中，更优选地，当未分级肝素用作起始葡糖胺聚糖时，可通过上述方法获得的羧基化葡糖胺聚糖衍生物的分子量优选为3,000-20,000Da，优选为3,500-12,000Da。
可通过本发明的方法获得的新型葡糖胺聚糖衍生物代表了新一类肝素样多糖，其特征在于存在各自具有两个另外的羧基的裂解的残基。注意，通过本发明的方法，将具有一个天然羧基的残基转化为三羧基化残基。出乎预料地表明所述新型二/三羧基化葡糖胺聚糖衍生物为体外强类肝素酶抑制剂，并在动物模型中抑制骨髓瘤。
包含具有两个或三个羧基的残基，还比母体葡糖胺聚糖较少地硫酸化的葡糖胺聚糖衍生物表现出比它们的具有较少羧基的类似物更有益的药动学。
本发明还涉及可通过上述方法获得的化合物，其用作药物。
具体而言，本发明涉及可通过上述方法获得的化合物，其单独地或者与至少一种其它活性成分组合地用作抗肿瘤药，优选用作抗骨髓瘤药物。
根据本发明制备的肝素和低分子量肝素衍生物在体外和在体内多发性骨髓瘤实验模型中表现出对类肝素酶活性的有效抑制。
实施例
化合物制备
将具有不同程度的硫酸化(SO3 -/COO-)(通过电导滴定进行)的未分级或分级肝素的样品通过已知方法的修改进行高碘酸盐氧化(以得到裂解的二醛单元)。未分级肝素(UFH)的分级2-O-脱硫酸化根据已知方法(Jaseja M.等人1989,“Novel regio-andstereo-selective modifications of heparin in alkalinesolution.Nuclearmagnetic resonance spectroscopic evidence.”Canad J Chem,67,1449-1455；R.N.Rej和A.S.Perlin,1990,“Base-catalyzed conversion of theα-L-iduronic acid 2-sulfate unit of heparin into a unit of α-L-galacturonic acid and relatedreactions.”Carbohydr.Res.200,25,437–447；Casu B.等人,2004,“Undersulfated andGlycol-Split Heparins Endowed with Antiangiogenic Activity.”J.Med.Chem.,47,838-848)的修改进行。在碱性条件下，将2-O-脱硫酸化(天然或化学诱导的)L-艾杜糖醛酸单元转化为2,3-环氧衍生物，并最终转化为L-半乳糖醛酸单元。由所述糖醛酸单元以及任选地由葡糖胺生成的二醛优选地，并且在短时间内进一步氧化为二羧化物。
体外测试
基于Bisio等人之前的研究(Bisio A.等人2007,High-performance liquidchromatographic/mass spectrometric studies on the susceptibility of heparinspecie to cleavage by heparanase.Sem Thromb hemost 33 488-495)，由以色列的University of Haifa的Vlodavsky教授课题组，根据Hammond等人描述的方法(Hammond等人2010,Development of a colorimetric assay for heparanase activity suitablefor kinetic analysis and inhibitor screening.Anal Biochem.396,112-6)体外测定类肝素酶抑制活性。简言之，类肝素酶可裂解合成的戊多糖磺达肝素(Fondaparinux)，其为抗血栓形成药物，其结构上对应于肝素的抗凝血酶结合位点。在类肝素酶裂解后，获得三糖和还原二糖。可将后者容易地定量，以评价类肝素酶活性。在本实施例中，测定溶液(100μl)包含40mM乙酸钠缓冲液pH 5.0和100mM磺达肝素(GlaxoSmithKline)，其含有或不含有抑制剂样品。加入类肝素酶至140pM的终浓度以开始所述测定。将板用黏带密封，并在37℃下孵育2-24小时。通过加入100μL的1.69mM4-[3-(4-碘苯基)-1H-5四唑]-1,3-苯二磺酸盐(WST-1,Aspep,Melbourne,澳大利亚)在0.1M NaOH中的溶液来停止测定。将板用黏带再密封，并在60℃下显影60分钟。在584nm下测量吸光度(Fluostar,BMG,Labtech)。在各板中，在相同的缓冲液和体积下，在2-100uM的范围下制备用D-半乳糖作为还原糖标准物构建的标准曲线。测定IC50值。由于该测定具有含单个裂解位点的均匀底物，可可靠地表征酶的动力学和生物化学参数。使用硫酸根标记的细胞外基质(ECM)作为底物来验证使用上述比色测定获得的结果。简言之，通过培养的角膜内皮细胞沉积ECM底物，因此，其与内皮下基底膜在组成、生物学功能和屏障性质上非常像。关于硫酸根标记的ECM的制备及其用于类肝素酶测定的用途的详细信息可参见：Vlodavsky,I.,Current Protocols in Cell Biology,Chapter10:Unit 10.4,2001。所述测定高度敏感，与体内条件更类似，但是由于其生物学本质，其为半定量的，并且就生物化学参数而言是有限的。
体内测试
基本上按照Yang Y等人中记载的操作(Yang Y.等人2007,The syndecan-1heparan sulfate proteoglycan is a viable target for myeloma therapy.Blood110:2041-2048)测试体内抗骨髓瘤活性。简言之，5-6周大的CB17 scid/scid小鼠由Arlan(Indianopolis,IN)或Charles River Laboratories(USA)获得。在伯明翰的Universityof Alabama的动物设施中收容小鼠，并对其进行监测。所有的实验操作和方案由Institutional Animal Care and Use Committee批准。将1x106个表达类肝素酶的CAG骨髓瘤细胞(高或低表达)皮下注射入各小鼠的左胁腹。注射肿瘤细胞10天后，在小鼠的右胁腹植入Alzet渗透泵(Durect Corporation,Cupertino,CA)。泵包含测试化合物(新肝素衍生物)的溶液或者PBS作为对照。将溶液连续递送14天。14天后，将动物处死，测定皮下肿瘤的湿重和平均血清kappa水平，并且通过时序检验(log-rank test)在实验组中比较(将p<0.05认为是统计学显著的)。
每周的荧光素酶生物发光成像提供原发性肿瘤的定量数据，并追踪骨和软组织中的转移。值得注意的，SCID-hu模型的独特性在于将人肿瘤细胞直接注射入皮下植入SCID小鼠的人胎儿骨的小段中，由此紧密地重演人骨髓瘤。
NMR分析的一般操作
在25℃下，于配备有5-mm TCI冷冻探头或10mm BBO探头的Bruker Avance 500波谱测定仪(Karlsruhe,德国)上记录波谱。使用标准Bruker TopSpin 2.0软件进行波谱的峰大小的积分。二羧基化糖醛酸残基的结构通过确证三羧基化残基的存在并能够鉴定其化学位移的二维异核实验来测定。在下表中报道葡糖胺和2-O-硫酸化艾杜糖醛酸的1、4、5位上质子和碳的归属的化学位移。
对应于残基位置的信号 1H ppm 13C ppm
C5-糖醛酸gsox 4.97 81.65
C4-糖醛酸gsox 4.59 81.22
C1-糖醛酸gsox 5.01 103.71
C4 3.63 79.14
C1-葡糖胺NS(ANS) 5.40 99.17
C1-ANS连接至(gsox) 5.03 100.19
C1-艾杜糖醛酸2S 5.17 102.11
用于计算羧基增量的一般操作
二羧基化肝素衍生物的糖醛酸残基中羧基的增加由原料(未分级肝素或至少部分脱硫酸化肝素和LMWH)和二羧基化衍生物的摩尔比率SO3 -/COO-(通过电导滴定评估(CasuB.和Gennaro U.,1975,Carbohydr Res 39,168-176))的各个值开始计算。具体而言，原料的硫酸化程度在第一个氧化步骤后基于葡糖胺聚糖氧化的中间体的还原的样品测定(参见实施例4-7)，而最终的葡糖胺聚糖羧基化衍生物的硫酸化程度在第二个氧化步骤后测定(参见实施例8-11、13-14)。
SO3 -/CO2 -＝A(原料中的比率) SO3 -＝A/CO2 -
SO3 -/CO2 -＝B(二羧基化衍生物的比率) SO3 -＝B/CO2 -
考虑到在氧化的两个步骤期间硫酸根基团的数目不改变，可推断羧基的增加等于单个摩尔比率A和B的比率。
肝素及其羧基化衍生物的酶促裂解和HPLC/MS分析
将底物(2-3mg)在100mM乙酸钠缓冲液(pH 7.0)和10mM乙酸钙的1:1(v/v)混合物中溶解，以得到7.7mg/ml溶液。为了进行酶促裂解，将144μl的100mM乙酸钠和10mM乙酸钙(1:1)的混合物与3μl类肝素酶混合物(肝素裂合酶I、II和III)(1μl各裂合酶,2mU/μl酶溶液)加入至13μl的肝素溶液。将反应混合物在37℃下搅拌(Thermo-Shaker TS-100,Biosan)24小时。通过加入3μl的3％HCOOH停止反应。将各样品用水稀释两次，并将其通过IPRP-HPLC/ESI-TOF(micrOTOF-Q,Bruker)分析。使用C18 kinetex和用A相(pH 6.25)和具有10mMDBA-CH3COOH的B(pH 7.95)的梯度(0’-17％B,15’-20％B,55’-40％B,100’50％B,115’90％B)，流速100μL/min。
实施例1(G7669)
将UFH(2.5g，批号G5842)在1M NaOH(32ml)中的样品在60℃下加热30分钟。在室温下冷却并用2N HCl中和后，将溶液在膜(截留：3500Da)中相对于蒸馏水在室温下透析3天。在减压下浓缩并冻干得到：2.15g(收率＝80％w/w)中间体，通过13C-NMR测定，具有13％的带有环氧化物基团的总糖醛酸残基。然后将样品在水(32ml)中溶解，并保持在70℃下搅拌2天，以水解环氧基团。浓缩并冻干后，得到G7669。
实施例2(G8661)
将UFH(2.11g，批号G3378)在27ml 1N NaOH中的样品在60℃下搅拌30分钟。中和、在室温下冷却并透析，浓缩并冻干(如在实施例1中所述)得到中间体G8637(1.5g)。由于其13C-NMR波谱表明存在环氧基团，将G8637(1.5g)在水(32ml)中溶解，并保持在70℃下搅拌2天，以将所述环氧基团水解。浓缩并冻干后，得到G8661(1.5g)。
实施例3(G8699)
将UFH(2.01g，批号G3378)的样品如实施例2中所述进行处理，以得到包含环氧基的中间体衍生物G8638。将G8638(1.4g)的样品在水(32ml)中溶解，并于搅拌下在70℃下加热24小时，以在浓缩和冻干后得到1.3gG8699。
未分级肝素和2-O-脱硫酸化衍生物的高碘酸盐氧化
实施例4(G7731)
由在水(52ml)中的实施例1的样品G7669(1.8g,13％2-O-脱硫酸化)开始，将溶液在4℃下冷却，在暗处搅拌，并加入52ml 0.2M NaIO4。16小时后，将过量的高碘酸盐通过加入乙二醇(5.2ml)猝灭；并在1小时后于4℃下，将反应混合物通过在4℃下透析16小时来脱盐。在减压下浓缩并冻干后，获得具有二醛的G7731(1.5g)，收率＝83％。将少部分的样品用NaBH4还原，以测量MW＝8,242Da并且SO3 -/COO-＝2.46(通过电导滴定进行)。
实施例5(G8425)
由UFH(0.25g,批号G3378)的样品开始，并依照实施例4中描述的相同操作，获得具有二醛的G8425(0.24g)，收率＝96％w/w。
实施例6(G8678)
由实施例2的G8661样品(1.5g)开始，并实施实施例4中描述的相同操作，获得具有二醛的G8678(1.5g)。将少部分的样品用NaBH4还原，以测量SO3 -/COO-＝1.96(通过电导滴定进行)。
实施例7(G8710)
由实施例3的G8699样品(0.56g)开始，并依照实施例4中描述的相同操作，获得具有二醛的G8710(0.56g)。将少部分的样品用NaBH4还原，以测量SO3 -/COO-＝1.51(通过电导滴定进行)。
二醛糖醛酸中间体氧化为相应的二羧化物
实施例8(G7927)
将实施例4的G7731样品(0.3g)在水(29ml)中溶解，在0℃下于双颈圆底烧瓶中冷却下并在氮气气氛中搅拌下，将其用包含NaClO2(0.362g)的水溶液(6ml)处理。滴加冰醋酸(0.118ml)至达到pH 4.0后，将反应混合物在室温下搅拌24小时。在室温下通过流动的N2搅拌另外3小时后，获得无色溶液。将反应混合物用0.5N NaOH中和，并通过如实施例4中所述透析来脱盐。浓缩并冻干得到G7927(0.228g)，收率＝76％w/w，其具有：
MW＝6,450Da；
SO3 -/COO-＝1.23；
羧基增量(C.I.)＝2
体外类肝素酶抑制分析得到：IC50＝10ng/ml。
实施例9(G8437)
由实施例5的G8425样品(0.25g)开始，其中仅肝素的链中天然存在的非硫酸化糖醛酸(18％)依照实施例8中所述的相同操作进行氧化，在反应混合物的中和之前，通过在N2流下还原1.5小时，获得G8437(0.21g)，其具有：
MW＝12,100Da；
SO3 -/COO-＝1.62；
羧基增量(C.I.)：1.43。
体外类肝素酶抑制分析得到：IC50＝10ng/ml。
实施例10(G8767)
由实施例6的G8678样品(1g)开始，并依照实施例8中描述的操作，获得G8767(1.05g)，其具有：
MW＝8,800Da；
SO3 -/COO-＝1.27；
羧基增量(C.I.)＝1.55。
体内抗骨髓瘤活性分析(60mg/kg天持续14天)得到：52％肿瘤抑制和20％血清K抑制。
实施例11(G8733)
由实施例7的样品G8710(0.56g)开始，并依照实施例8中描述的相同操作，获得G8733(0.453g)，收率＝80％w/w，其具有：
MW＝5,540Da；
SO3 -/COO-＝0.97；
羧基增量(C.I.)＝1.56。
体内抗骨髓瘤活性分析(60mg/kg天持续14天)得到：53％肿瘤抑制。
实施例12(G9685)
由UFH(批号G3378)开始，并依照实施例4中描述的操作，获得二醛衍生物。将二醛衍生物在亚氯酸钠的存在下依照实施例8中的操作进一步氧化，获得羧基化衍生物G9685，MW＝11,700Da。
体外类肝素酶抑制分析得到：IC50＝10ng/ml；
体内抗骨髓瘤活性分析(60mg/kg天持续14天)得到：68％肿瘤抑制。
实施例13(G7897)
将实施例4的G7731样品(0.3g)在水(3ml)中溶解，并用1.36ml NaClO2处理(用HCl4％调节至pH 8.2-8.5)。然后加入1mg TEMPO，并用NaOH 1M将pH保持在7-7.5，持续24h。将反应混合物通过透析脱盐，浓缩并冻干以得到G7897(0.190g)，收率＝63％w/w，其具有：
SO3 -/COO-＝1.92；
羧基增量(C.I.)＝1.28。
实施例14(G9585)
由2-O-脱硫酸化肝素的样品(G9416,SO3 -/COO-＝1.39)开始，依照实施例4中所述的操作，获得二醛衍生物G9577。将在水(21ml)中溶解的G9577样品(0.242g)在于氮气气氛中搅拌下，在0℃下于双颈圆底烧瓶中冷却，将其用包含NaClO2(0.128g)的水溶液(1ml)处理。滴加冰醋酸(0.084ml)至达到pH 4.0后，将反应混合物在室温下搅拌24小时。在室温下通过流动的N2搅拌另外3小时后，获得无色溶液。将反应混合物用0.5N NaOH中和，并通过如实施例4中所述透析来脱盐。浓缩并冻干得到G9585(0.148g)，收率＝61％w/w，其具有
MW＝4,700Da；
SO3 -/COO-＝0.82；
羧基增量(C.I.)＝1.69。
体外类肝素酶抑制分析得到：IC50＝44ng/ml。

Claims (14)

1.制备抑制类肝素酶的葡糖胺聚糖衍生物的方法，其包括：
a)葡糖胺聚糖的10％-100％的2-O-和任选的2N-,3-O-非硫酸化残基在将相邻的二醇和任选的相邻的OH/NH2有效转化为二醛的条件下的氧化；
b)所述氧化的葡糖胺聚糖在将所述二醛有效转化为羧基的条件下的氧化。
2.权利要求1的方法，其中所述葡糖胺聚糖是天然或合成的葡糖胺聚糖，其优选选自肝素、低分子量肝素、硫酸类肝素，其任选地为2-O-和/或2-N-脱硫酸化的，更优选选自未分级肝素或LMWH，其任选地为2-O-和/或2-N-脱硫酸化的。
3.权利要求1和2的方法，其中所述葡糖胺聚糖的通过如本文中定义的电导滴定测定的硫酸化程度(SO3 -/COO-)为0.8-2.8。
4.权利要求3的方法，其中所述葡糖胺聚糖的通过如本文中定义的电导滴定测定的硫酸化程度(SO3 -/COO-)为0.9-2.5。
5.之前权利要求中任一项的方法，其中所述葡糖胺聚糖衍生物的如本文中所定义的羧基增量为1.2-2.2。
6.权利要求1-5的方法，其中在步骤a)中，所述氧化通过高碘酸盐进行。
7.权利要求1-6的方法，其中在步骤a)中，葡糖胺聚糖的25％-100％的2-O-和任选的2N-,3-O-非硫酸化残基被氧化。
8.化合物，其可通过之前权利要求中任一项的方法获得。
9.权利要求8的化合物，其分子量为3000-20000Da。
10.权利要求8的化合物，其分子量为3500-12000Da。
11.寡糖化合物，其可通过权利要求8-10的化合物的酶促或化学部分解聚获得。
12.权利要求8-11的化合物，其用作药物。
13.权利要求8-11的化合物，其用作抗转移药物或抗肿瘤药物。
14.权利要求8-11的化合物，其用作抗骨髓瘤药物。
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