CN116710772A - 一种用于检测样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物含量的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及一种用于检测样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物含量的方法及其应用，所述方法包括(1)将样品进行水解，得到含有式(I)所示化合物的水解液；(2)采用液相色谱串联质谱检测水解液；(3)以糖胺聚糖羧酸化衍生物作为标准品，按照步骤(1)的方法水解其不同梯度浓度的溶液，按照步骤(2)的方法检测不同浓度标准品溶液的水解液中式(I)所示化合物的质谱信号峰面积，以质谱信号峰面积对糖胺聚糖羧酸化衍生物标准品的量做标准曲线，根据该标准曲线，通过步骤(2)测定的式(I)所示化合物的质谱峰面积计算样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物的含量。本申请所涉及的方法通过对糖胺聚糖羧酸化衍生物进行水解，可以稳定得到特定结构的水解产物，该结构可以通过MS检测到并选择其中具有较高质谱丰度的水解产物，因此可以间接计算糖胺聚糖羧酸化衍生物的量。且该检测方法的专属性强、准确度高、精密度好、定量限低、检测限低。
Description
本申请属于分析化学技术领域，具体涉及一种用于检测样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物含量的方法及其应用，尤其涉及一种专属性强、准确度高、精密度好、定量限低、检测限低的用于检测样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物含量的方法及其应用。
现有技术例如CN105744940A和CN111670038A两篇专利公开报道了糖胺聚糖羧酸化衍生物作为药物具有抗肿瘤及抗肿瘤转移活性，具有广泛的应用前景。糖胺聚糖羧酸化衍生物为未分级肝素(UFH)经过两步氧化反应后得到的含有糖醛酸邻二醇结构氧化开环的双羧酸衍生物，即(1)糖胺聚糖中糖醛酸上相邻的二醇被氧化开环形成二醛结构，(2)二醛结构进一步被氧化得到双羧酸结构；其属于肝素衍生物，是一种链状、结构不均一的粘多糖物质。在药物代谢研究中，需要测定生物样品中药物的含量以评价该药物的药物代谢动力学性质。在生物样品中直接检测完整的结构不容易实现，而且由于生物样品中存在多种内源性物质，例如蛋白、磷脂等，常规的多糖测试方法易受到内源性物质的干扰而无法对糖胺聚糖羧酸化衍生物进行定量测定。因此，如何提供一种准确的糖胺聚糖羧酸化衍生物的检测方法，成为了亟待解决的问题。
发明内容
以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制权利要求的保护范围。
针对现有技术的不足，本申请的目的在于提供一种用于检测样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物含量的方法及其应用，尤其提供一种专属性强、准确度高、精密度好、定量限低、检测限低的用于检测样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物含量的方法及其应用。
为达到此目的，本申请采用以下技术方案：
第一方面，本申请提供一种用于检测样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物含量的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)将含糖胺聚糖羧酸化衍生物的样品进行水解，得到含有式(I)所示化合物的水解液：
其中，各R
a独立地为-SO
3H或-H，各R
b独立地为H、-SO
3H或-C(O)CH
3，各R
c独立地为-SO
3H或-H，n为0、1、2、3、4或5；
(2)采用液相色谱串联质谱检测步骤(1)得到的水解液；
(3)以糖胺聚糖羧酸化衍生物作为标准品，按照步骤(1)的方法水解其不同梯度浓度的溶液，按照步骤(2)的方法检测不同浓度标准品溶液的水解液中式(I)所示化合物的质谱信号峰面积，以质谱信号峰面积对糖胺聚糖羧酸化衍生物标准品的量做标准曲线，根据该标准曲线，通过步骤(2)测定的式(I)所示化合物的质谱峰面积计算样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物的含量；
所述糖胺聚糖羧酸化衍生物为包含式(II)所示结构单元和任选的式(III)所示结构单元的糖胺聚糖类化合物：
其中，各R
a独立地为-SO
3H或-H，R
b独立地为H、-SO
3H或-C(O)CH
3，R
c独立地为-SO
3H或-H。
优选地，所述糖胺聚糖为肝素或硫酸乙酰肝素；所述糖胺聚糖羧酸化衍生物经过两步氧化反应获得：(1)糖胺聚糖中糖醛酸上相邻的二醇被氧化开环形成二醛结构，(2)二醛结构进一步被氧化得到双羧酸结构。
优选地，所述式(I)所示化合物具有以下结构式中至少一种的结构：
其中，化合物(a)的质谱信号为MS(ESI,neg.ion)m/z:432.0[M-H]
-；
化合物(b)的质谱信号为MS(ESI,neg.ion)m/z:390.0[M-H]
-；
化合物(c)的质谱信号为MS(ESI,neg.ion)m/z:522.98[M-2H]
2-。
本申请所涉及的糖胺聚糖羧酸化衍生物包含如上所述式(II)所示的结构单元和任选的式(III)所示的结构单元，即糖胺聚糖化合物中己糖醛酸结构部分或全部开环。
本申请所涉及的糖胺聚糖羧酸化衍生物经过水解后可以得到式(I)所示化合物，反应机理如方案1和2所示，其中，各R
a独立地为-SO
3H或-H，各R
b独立地为H、-SO
3H或-C(O)CH
3，各R
c独立地为-SO
3H或-H，n为0、1、2、3、4或5：
方案1：
方案2：
在本申请所涉及的糖胺聚糖羧酸化衍生物的每条多糖链中，各双糖结构单元以任意顺序排列。
优选地，所述糖胺聚糖羧酸化衍生物的重均分子量为3000-20000Da，例如3000Da、5000Da、7000Da、8000Da、9000Da、10000Da、11000Da、12000Da、13000Da、13500Da、14000Da、16000Da、18000Da或20000Da等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。优选7000-14000Da，进一步优选8000-13500Da。
所述糖胺聚糖羧酸化衍生物的开环度为10-100％，例如10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。优选25-80％，进一步优选25-60％。
本申请中的术语“开环度”是指开环的糖醛酸残基数量与总的糖醛酸残基数量之比，其检测和计算参考文献Guerrini,M.,Guglieri,S,Naggi,A,Sasisekharan,R,(2007).Low molecular weight heparins:Structural differentiation by bidimentional nuclear magnetic resonance spectroscopy.Seminars in Thrombosis and Hemostasis,33,478-487中的核磁方法进行。
优选地，步骤(1)所述将含糖胺聚糖羧酸化衍生物的样品进行水解的处理方式为加热。
优选地，所述加热的温度为70-100℃，例如70℃、75℃、80℃、82℃、85℃、87℃、95℃或100℃等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。优选85-95℃。
优选地，所述加热的时间为12-168h，例如12h、16h、24h、36h、48h、55h、60h、70h、72h、75h、78h、80h、90h、96h、120h、144h或168h等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。优选12-120h。
在上述加热温度和加热时间的条件下，本申请所涉及的糖胺聚糖羧酸化衍生物水解可以得到质谱丰度较高的化合物(a)、化合物(b)或化合物(c)，综合考虑检测效率、检测准确度精密度等选择反应的温度和时间。
当所述含糖胺聚糖羧酸化衍生物的样品为生物样品(如血液、尿液)时，需要对步骤(1)得到的水解液进行检测预处理，所述预处理包括：将水解液与三氟乙酸溶液和乙腈-甲醇溶液混合，之后静置、离心，取上清液干燥后再用水复溶。
优选地，所述三氟乙酸溶液的加入量以体积计为水解液的0.5-1.5％，例如0.5％、0.8％、1.0％、1.2％或1.5％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述三氟乙酸溶液的浓度为4-6％，例如4％、5％或6％等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述乙腈-甲醇溶液的加入量以体积计为水解液体积的1-5倍，例如1倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。优选地为1-3倍，更优选地为1.5-2.5倍。
优选地，所述乙腈-甲醇溶液中乙腈与甲醇的体积比为1:0.5-1:1.5，例如1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.2或1:1.5等，该数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述静置的温度为-25～-15℃，例如-25℃、-20℃、-15℃等；时间为15-25min，例如15min、18min、20min、22min、25min等，上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述液相色谱为反相色谱、尺寸排阻色谱或亲水色谱。
优选地，所述液相色谱的流动相为流动相A和流动相B；所述流动相A为六氟异丙醇和戊胺的水溶液；所述流动相B为六氟异丙醇和戊胺的乙腈-水溶液；
所述流动相A为含有45-55mM(例如45mM、48mM、50mM、52mM、55mM等)六氟异丙醇和13-17mM(例如13mM、15mM、17mM等)戊胺的水溶液；所述流动相B为含有45-55mM(例如45mM、48mM、50mM、52mM、55mM等)六氟异丙醇和13-17mM(例如13mM、15mM、17mM等)戊胺的乙腈-水溶液；所述流动相B中乙腈与水的体积比为70:30-80:20(例如70:30、75:25、80:20等)。上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
进一步优选地，所述液相色谱的流动相为流动相A和流动相B，具体如下表所示。
| 流动相A | 50mM六氟异丙醇，15mM戊胺，H 2O |
| 流动相B | 50mM六氟异丙醇，15mM戊胺，乙腈/H 2O(75/25,v/v) |
优选地，所述液相色谱的洗脱流程如下表所示：
| 时间(min) | 流速(mL/min) | ％A | ％B | 曲线 |
| 初始 | 0.36 | 98.0 | 2.0 | 初始 |
| 3.00 | 0.36 | 98.0 | 2.0 | 6 |
| 10.00 | 0.36 | 80.0 | 20.0 | 6 |
| 15.00 | 0.36 | 60.0 | 40.0 | 6 |
| 15.10 | 0.36 | 10.0 | 90.0 | 6 |
| 18.00 | 0.36 | 10.0 | 90.0 | 6 |
| 18.10 | 0.36 | 98.0 | 2.0 | 6 |
| 22.00 | 0.36 | 98.0 | 2.0 | 6 |
在本申请中，所述质谱条件示例性地可以选择如下条件内容：
| 条件内容 | 名称/指标 |
| 质谱仪 | Waters Xevo G2-S QTOF |
| 模式 | Negative Resolution Mode[负离子分辨率模式] |
| 设定质量 | 432.0Da |
| 毛细管电压 | 1.5kV |
| 取样椎 | 25V |
| 源补偿电压 | 80V |
| 源温度 | 120℃ |
| 脱溶剂温度 | 500℃ |
| 锥孔气流 | 50L/Hr |
| 脱溶剂气流 | 800L/Hr |
| 采集起始分子量 | 200 |
| 采集终止分子量 | 2000 |
| 采集起始时间 | 1.20mins |
| 采集终止时间 | 6.0mins |
基于第一方面的内容，本申请还提供了一种全新的化合物，具体内容如下：
第二方面，本申请提供一种化合物，所述化合物的结构如式(I)所示：
其中，各R
a独立地为-SO
3H或-H，各R
b独立地为H、-SO
3H或-C(O)CH
3，各R
c独立地为-SO
3H或-H，n为0、1、2、3、4或5。
优选地，所述化合物具有以下其中之一的结构：
第三方面，本申请提供一种如第一方面所述的糖胺聚糖羧酸化衍生物的检测方法在糖胺聚糖羧酸化衍生物的药代动力学研究中的应用。
第四方面，本申请提供一种如第一方面所述的糖胺聚糖羧酸化衍生物的检测方法在糖胺聚糖羧酸化衍生物药物制剂质量检测中的应用。
相对于现有技术，本申请具有以下有益效果：
由于糖胺聚糖羧酸化衍生物为非均一物质，在生物样品中直接检测完整的结构不容易实现，本申请发明人发现糖胺聚糖羧酸化衍生物经过水解可以稳定地得到如上所述特定结构的水解产物化合物(a)、化合物(b)或化合物(c)，此类化合物可以通过质谱检测到。通过测定化合物(a)、化合物(b)或化合物(c)，将不同浓度的糖胺聚糖羧酸化衍生物标准品对化合物(a)、化合物(b)或化合物(c)的质谱峰面积建立标准曲线；再通过水解样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物并检测化合物(a)、化合物(b)或化合物(c)的质谱峰面积；含糖胺聚糖羧酸化衍生物的样品经过水解后用液相质谱测定化合物(a)、化合物(b)或化合物(c)的质谱峰面积，根据标准曲线可以间接计算出样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物的量。该检测方 法的专属性强、准确度高、精密度好、定量限低、检测限低。
在阅读并理解了详细描述后，可以明白其他方面。
图1是化合物(a)的质谱图；
图2是化合物(a)的二级质谱图；
图3是化合物(a)的氢谱图；
图4是化合物(a)的碳谱图；
图5是化合物(a)的
13C DEPT 135°谱图；
图6是化合物(a)的
1H-
1H COSY谱图；
图7是化合物(a)的TOCSY谱图；
图8是化合物(a)的HSQC谱图；
图9是化合物(a)的HMBC谱图；
图10是化合物(c)的质谱图；
图11是化合物(c)的二级质谱图；
图12是化合物(c)的氢谱图；
图13是化合物(c)的碳谱图；
图14是化合物(c)的
13C DEPT 135°谱图；
图15是化合物(c)的
1H-
1H COSY谱图；
图16是化合物(c)的TOCSY谱图；
图17是化合物(c)的ROESY谱图；
图18是化合物(c)的HSQC谱图；
图19是化合物(c)的HMBC谱图。
下面通过具体实施方式来进一步说明本申请的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本申请，不应视为对本申请的具体限制。
下述实施例所涉及的SD大鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
下述实施例所涉及的糖胺聚糖羧酸化衍生物H1011由专利CN111670038A中实施例3公开的制备方法制备得到，其重均分子量为9161Da，开环度为43.1％。
实施例1
化合物(a)、化合物(b)和化合物(c)的制备：
称取H1011(400mg)溶于水(4.0mL)中，将H1011水溶液加热至85℃反应72h，然后冷却至25℃；反应产物通过色谱技术分离纯化(色谱柱为Dionex IonPac AS11-HC，洗脱液M和N(具体组分见表1))，然后脱盐冻干得到化合物(a)、化合物(b)和化合物(c)。
表1
富集得到的化合物(a)、化合物(b)和化合物(c)通过质谱和核磁共振波谱法(一维
1H-NMR、一维
13CNMR、
13C DEPT 135°、
1H-
1H COSY、二维TOCSY、HSQC、HMBC、二维DOSY)鉴定结构。
其中化合物(a)的表征数据如下：
MS(ESI,neg.ion)m/z:432.0[M-H]
-；
1H NMR(600MHz,D
2O):δ4.87(d,J＝3.5Hz,1H),4.34(dd,J＝11.2,3.7Hz,1H),4.29(d,J＝4.6Hz,1H),4.27(dd,J＝11.0,2.1Hz,1H),4.20(d,J＝4.6Hz,1H),4.05(ddd,J＝10.1,3.7,2.2Hz,1H),3.96(dd,J＝10.6,3.5Hz,1H),3.81(dd,J＝10.5,9.2Hz,1H),3.59(dd,J＝10.1,9.2Hz,1H),2.07(s,3H).
13C NMR(151MHz,D
2O):δ24.79,56.23,69.39,71.95,73.04,74.14,76.51,83.25,99.56,177.34,178.79,179.99.
化合物(a)的表征图谱如图1-图9所示。
其中化合物(b)的表征数据如下：
MS(ESI,neg.ion)m/z:390.0[M-H]
-；
其中化合物(c)的表征数据如下：
MS(ESI,neg.ion)m/z:522.98[M-2H]
2-；
1H NMR(600MHz,D
2O):δ5.37(d,J＝3.5Hz,1H),5.25–5.23(m,1H),5.16(d,J＝3.6Hz,1H),5.15–5.12(m,1H),4.38–4.28(m,5H),4.23(dd,J＝11.4,2.1Hz,1H),4.19(dd,J＝11.1,2.1Hz,1H),4.13(dd,J＝2.9Hz,1H),3.87(dt,J＝9.7,2.7Hz,1H),3.84(dt,J＝9.9,2.6Hz,1H),3.78–3.70(m,2H),3.64(q,J＝7.1Hz,1H),3.60(dd,J＝9.9Hz,1H),3.56(dd,J＝9.5Hz,1H),3.25(dd,J＝10.1,3.5Hz,3H).
13C NMR(151MHz,D
2O):δ60.45,60.63,68.92,69.10,70.44,70.60,71.82,72.44,72.80,73.05,73.50,74.54,77.54,78.74,79.51,81.24,100.90,101.38,101.69,175.69,176.18,177.23.
化合物(c)的表征图谱如图10-图19所示。
实施例2
本实施例将本申请所涉及的糖胺聚糖羧酸化衍生物的检测方法应用于药代动力学研究(以化合物(a)作为检测对象)，具体内容如下：
(1)试验方法
(1.1)实验动物：健康成年雄性SD大鼠6只，其中3只用于取空白血浆制作标准曲线，3只用于进行大鼠单次给药后血药浓度检测。
(1.2)药物配制：称取糖胺聚糖羧酸化衍生物H1011用水配置60mg/kg的药物溶液。
(1.3)给药和样品采集：皮下注射给药60mg/kg后，分别在时间点0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24h采血，采集全血后置于K2EDTA抗凝试管中，随后离心15min，分离得到血浆样品。
(1.4)标准曲线的绘制：
(1.4.1)称取糖胺聚糖羧酸化衍生物H1011并将其配成1mg/mL的水溶液，以上述空白血浆作为稀释液逐级稀释H1011水溶液，配置2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、 64μg/mL、128μg/mL、256μg/mL的标准溶液，在85℃条件下水解72h；
(1.4.2)水解后的标准溶液进行检测前处理，向水解后的标准溶液中加入百分之一体积比的三氟乙酸(5％，v/v)和两倍体积的乙腈/甲醇(v/v，50/50)，混匀，然后置于-20℃静置20min，离心；取上清液干燥后再用超纯水复溶；
(1.4.3)进行液相色谱串联质谱检测，测得谱图，色谱条件如表2所示，质谱条件如表3所示：
表2
表3
| 条件内容 | 名称/指标 |
| 质谱仪 | Waters Xevo G2-S QTOF |
| 条件内容 | 名称/指标 |
| 模式 | Negative Resolution Mode[负离子分辨率模式] |
| 设置分子量 | 432.0Da |
| 毛细管电压 | 1.5kV |
| 取样椎 | 25V |
| 源补偿电压 | 80V |
| 源温度 | 120℃ |
| 脱溶剂温度 | 500℃ |
| 锥孔气流 | 50L/Hr |
| 脱溶剂气流 | 800L/Hr |
| 采集起始分子量 | 200 |
| 采集终止分子量 | 2000 |
| 采集起始时间 | 1.20mins |
| 采集终止时间 | 7.0mins |
(1.4.4)以H1011标准溶液与化合物(a)质谱峰面积线性关系作标准曲线，化合物(a)质谱信号为MS(ESI,neg.ion)m/z:432.0[M-H]
-；线性方程为：y＝36.2154x-0.3216；相关系数为：R
2＝0.9987，其中，y为质谱峰面积，x为标准溶液浓度。
(1.5)检测血浆样品中H1011的含量：
(1.5.1)将步骤(1.3)获得的血浆样品在85℃条件下水解72h，然后向其中加入百分之一体积比的三氟乙酸(5％，v/v)和两倍体积的乙腈/甲醇(v/v，50/50)，混匀，然后置于-20℃静置20min，离心；取上清液干燥后再用超纯水复溶；
(1.5.2)进行液相色谱串联质谱检测，测得化合物(a)质谱峰面积，色谱条件如上表2所示，质谱条件如上表3所示；
(1.5.3)根据化合物(a)质谱峰面积结合步骤(1.4)中绘制的标准曲线，计算得到各时间点血浆样品中H1011的浓度，并根据药物浓度-时间曲线计算药代动力学参数。
(2)试验结果如表4所示：
表4
| 给药途径 | 剂量 | AUC 0-24(h*μg/ml) | T 1/2(h) | CL(ml/min/kg) |
| i.h. | 60mg/kg | 537.47 | 3.75 | 0.110 |
(3)方法学验证
(3.1)专属性
配制超纯水对照溶液和空白血浆对照溶液，经过与上述相同的高温水解、前处理过程，然后经过上述相同条件的液相色谱串联质谱检测，在超纯水对照和血浆对照溶液中未检测到432.0Da的信号峰，即化合物(a)的质谱信号峰，表明超纯水和空白血浆对检测无干扰，本检测方法专属性强。
(3.2)定量限和检测限
经计算，本方法的定量限为0.8μg/mL，检测限为0.2μg/mL。
(3.3)准确度
设置1μg/mL、50μg/mL、120μg/mL三个浓度，测试H1011血浆样品，经计算回收率为82.6％-110.8％，且各个浓度6次实验结果的RSD值依次为4.2％、2.2％和1.3％。
(3.4)精密度
选取50μg/mL H1011血浆溶液，由两名不同检测员各检测6次，第一名检验员6次实验结果的RSD为2.0％，第二名检验员6次实验结果的RSD为1.8％，两名检验员12次实验结果的RSD为2.1％，均满足≤10.0％的可接受标准。方法精密度良好。
(3.5)溶液稳定性
选取50μg/mL H1011血浆溶液，水解并进行前处理，样品溶液第5天的检测结果为0时间的97.2％，符合标准。
实施例3
本实施例将本申请所涉及的糖胺聚糖羧酸化衍生物的检测方法应用于药代动力学研究(以化合物(b)作为检测对象)，具体内容如下：
(1)试验方法
(1.1)实验动物：健康成年雄性SD大鼠6只，其中3只用于取空白血浆制作标准曲线，3只用于进行大鼠单次给药后血药浓度检测。
(1.2)药物配制：称取糖胺聚糖羧酸化衍生物H1011用水配置60mg/kg的药物溶液。
(1.3)给药和样品采集：皮下注射给药60mg/kg后，分别在时间点0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24h采血，采集全血后置于K2EDTA抗凝试管中，随后离心15min，分离得到血浆样品。
(1.4)标准曲线的绘制：
(1.4.1)称取糖胺聚糖羧酸化衍生物H1011并将其配成1mg/mL的水溶液，以上述空白血浆作为稀释液逐级稀释H1011水溶液，配置2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL、128μg/mL、256μg/mL的标准溶液，在90℃条件下水解48h；
(1.4.2)水解后的标准溶液进行检测前处理，向水解后的标准溶液中加入百分之一体积比的三氟乙酸(5％，v/v)和两倍体积的乙腈/甲醇(v/v，50/50)，混匀，然后置于-20℃静置20min，离心；取上清液干燥后再用超纯水复溶；
(1.4.3)进行液相色谱串联质谱检测，测得谱图，色谱条件如上表2所示，质谱条件如上表3所示，设置分子量为390.0Da；
(1.4.4)以H1011标准溶液与化合物(b)质谱峰面积线性关系作标准曲线，化合物(b)质谱信号为MS(ESI,neg.ion)m/z:390.0[M-H]
-；做出线性方程为：y＝26.0235x；相关系数为0.9981，其中，y为质谱峰面积，x为标准溶液浓度。
(1.5)检测血浆样品中H1011的含量：
(1.5.1)将步骤(1.3)获得的血浆样品在90℃条件下水解48h，然后向其中加入百分之一体积比的三氟乙酸(5％，v/v)和两倍体积的乙腈/甲醇(v/v，50/50)，混匀，然后置于-20℃静置20min，离心；取上清液干燥后再用超纯水复溶；
(1.5.2)进行液相色谱串联质谱检测，测得化合物(b)质谱峰面积，色谱条件如上表2所示，质谱条件如上表3所示，设置分子量为390.0Da；
(1.5.3)根据化合物(b)质谱峰面积结合步骤(1.4)中绘制的标准曲线，计算得到各时间点血浆样品中H1011的浓度，并根据药物浓度-时间曲线计算药代动力学参数。
(2)试验结果如表5所示：
表5
| 给药途径 | 剂量 | AUC 0-24(h*μg/ml) | T 1/2(h) | CL(ml/min/kg) |
| i.h. | 60mg/kg | 483.87 | 3.04 | 0.089 |
(3)方法学验证
(3.1)专属性
配制超纯水对照溶液和空白血浆对照溶液，经过与上述相同的高温水解、前处理过程，然后经过上述相同条件的液相色谱串联质谱检测，在超纯水对照和血浆对照溶液中未检测到 390.0Da的信号峰，即化合物(b)的质谱信号峰，表明超纯水和空白血浆对检测无干扰，本检测方法专属性强。
(3.2)定量限和检测限
经计算，本方法的定量限为1.1μg/mL，检测限为0.55μg/mL。
(3.3)准确度
设置1μg/mL、50μg/mL、120μg/mL三个浓度，测试H1011血浆样品，经计算回收率为81.2％-115.8％，且各个浓度6次实验结果的RSD值依次为5.4％、1.8％和2.0％。
(3.4)精密度
选取50μg/mL H1011血浆溶液，由两名不同检测员各检测6次，第一名检验员6次实验结果的RSD为1.6％，第二名检验员6次实验结果的RSD为2.6％，两名检验员12次实验结果的RSD为2.2％，均满足≤10.0％的可接受标准。方法精密度良好。
(3.5)溶液稳定性
选取50μg/mL H1011血浆溶液，水解并进行前处理，样品溶液第5天的检测结果为0时间的97.8％，符合标准。
实施例4
本实施例将本申请所涉及的糖胺聚糖羧酸化衍生物的检测方法应用于药代动力学研究(以化合物(c)作为检测对象)，具体内容如下：
(1)试验方法
(1.1)实验动物：健康成年雄性SD大鼠6只，其中3只用于取空白血浆制作标准曲线，3只用于进行大鼠单次给药后血药浓度检测。
(1.2)药物配制：称取糖胺聚糖羧酸化衍生物H1011用水配置20mg/kg的药物溶液。
(1.3)给药和样品采集：皮下注射给药20mg/kg后，分别在时间点0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24h采血，采集全血后置于K2EDTA抗凝试管中，随后离心15min，分离得到血浆样品。
(1.4)标准曲线的绘制：
(1.4.1)称取糖胺聚糖羧酸化衍生物H1011并将其配成1mg/mL的水溶液，以上述空白血浆作为稀释液逐级稀释H1011水溶液，配置2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL、128μg/mL、256μg/mL的标准溶液，在90℃条件下水解36h；
(1.4.2)水解后的标准溶液进行检测前处理，向水解后的标准溶液中加入百分之一体积比的三氟乙酸(5％，v/v)和两倍体积的乙腈/甲醇(v/v，50/50)，混匀，然后置于-20℃静置20min，离心；取上清液干燥后再用超纯水复溶；
(1.4.3)进行液相色谱串联质谱检测，测得谱图，色谱条件如上表2所示，质谱条件如上表3所示，设置分子量为522.98Da；
(1.4.4)以H1011标准溶液与化合物(c)质谱峰面积线性关系作标准曲线，化合物(c)质谱信号为MS(ESI,neg.ion)m/z:522.98[M-2H]
2-；做出线性方程为：y＝23.6225x；相关系数为0.9986，其中，y为质谱峰面积，x为标准溶液浓度。。
(1.5)检测血浆样品中H1011的含量：
(1.5.1)将步骤(1.3)获得的血浆样品在90℃条件下水解36h，然后向其中加入百分之一体积比的三氟乙酸(5％，v/v)和两倍体积的乙腈/甲醇(v/v，50/50)，混匀，然后置于-20℃静置20min，离心；取上清液干燥后再用超纯水复溶；
(1.5.2)进行液相色谱串联质谱检测，测得化合物(c)质谱峰面积，色谱条件如上表2所示，质谱条件如上表3所示；
(1.5.3)根据化合物(c)质谱峰面积结合步骤(1.4)中绘制的标准曲线，计算得到各时间点血浆样品中H1011的浓度，并根据药物浓度-时间曲线计算药代动力学参数。
(2)试验结果如表6所示：
表6
| 给药途径 | 剂量 | AUC 0-24(h*μg/ml) | T 1/2(h) | CL(ml/min/kg) |
| i.h. | 20mg/kg | 237.44 | 4.04 | 0.073 |
(3)方法学验证
(3.1)专属性
配制超纯水对照溶液和空白血浆对照溶液，经过与上述相同的高温水解、前处理过程，然后经过上述相同条件的液相色谱串联质谱检测，在超纯水对照和血浆对照溶液中未检测到522.98Da的信号峰，即化合物(c)的质谱信号峰，表明超纯水和空白血浆对检测无干扰，本检测方法专属性强。
(3.2)定量限和检测限
经计算，本方法的定量限为2.0μg/mL，检测限为1.0μg/mL。
(3.3)准确度
设置2μg/mL、50μg/mL、120μg/mL三个浓度，测试H1011血浆样品，经计算回收率为80.3％-108.8％，且各个浓度6次实验结果的RSD值依次为8.9％、6.5％和5.4％。
(3.4)精密度
选取50μg/mL H1011血浆溶液，由两名不同检测员各检测6次，第一名检验员6次实验结果的RSD为6.5％，第二名检验员6次实验结果的RSD为7.2％，两名检验员12次实验结果的RSD为7.4％，均满足≤10.0％的可接受标准。方法精密度良好。
(3.5)溶液稳定性
选取50μg/mL H1011血浆溶液，水解并进行前处理，样品溶液第5天的检测结果为0时间的90.2％，符合标准。
Claims (11)
- 一种用于检测样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)将含糖胺聚糖羧酸化衍生物的样品进行水解，得到含有式(I)所示化合物的水解液：其中，各R a独立地为-SO 3H或-H，各R b独立地为H、-SO 3H或-C(O)CH 3，各R c独立地为-SO 3H或-H，n为0、1、2、3、4或5；(2)采用液相色谱串联质谱检测步骤(1)得到的水解液；(3)以糖胺聚糖羧酸化衍生物作为标准品，按照步骤(1)的方法水解其不同梯度浓度的溶液，按照步骤(2)的方法检测不同浓度标准品溶液的水解液中式(I)所示化合物的质谱信号峰面积，以质谱信号峰面积对糖胺聚糖羧酸化衍生物标准品的量做标准曲线，根据该标准曲线，通过步骤(2)测定的式(I)所示化合物的质谱峰面积计算样品中糖胺聚糖羧酸化衍生物的含量；所述糖胺聚糖羧酸化衍生物为包含式(II)所示结构单元和任选的式(III)所示结构单元的糖胺聚糖类化合物：其中，各R a独立地为-SO 3H或-H，R b独立地为H、-SO 3H或-C(O)CH 3，R c独立地为-SO 3H或-H。
- 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖胺聚糖为肝素或硫酸乙酰肝素；所述糖胺聚糖羧酸化衍生物经过两步氧化反应获得：(1)糖胺聚糖中糖醛酸上相邻的二醇被氧化开环形成二醛结构，(2)二醛结构进一步被氧化得到双羧酸结构。
- 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述式(I)所示化合物具有以下结构式中至少一种的结构：
- 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述糖胺聚糖羧酸化衍生物的重均分子量为3000-20000Da，优选7000-14000Da，进一步优选8000-13500Da；所述糖胺聚糖羧酸化衍生物的开环度为10-100％，优选25-80％，进一步优选25-60％。
- 如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述将含糖胺聚糖羧酸化衍生物的样品进行水解的处理方式为加热；优选地，所述加热的温度为70-100℃，优选85-95℃；优选地，所述加热的时间为12-168h，优选12-120h；
- 如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述液相色谱为反相色谱、尺寸排阻色谱或亲水色谱；优选地，所述液相色谱的流动相为流动相A和流动相B；所述流动相A为六氟异丙醇和戊胺的水溶液；所述流动相B为六氟异丙醇和戊胺的乙腈-水溶液；优选地，所述流动相A为含有45-55mM六氟异丙醇和13-17mM戊胺的水溶液；所述流动相B为含有45-55mM六氟异丙醇和13-17mM戊胺的乙腈-水溶液；所述流动相B中乙腈与水的体积比为70:30-80:20；优选地，所述液相色谱的流动相为流动相A和流动相B，具体如下表所示。
流动相A 50mM六氟异丙醇，15mM戊胺，H 2O 流动相B 50mM六氟异丙醇，15mM戊胺，乙腈/H 2O(75/25,v/v) - 如权利要求1-6中任一项所述的方法，当所述含糖胺聚糖羧酸化衍生物的样品为生物样品时，需对步骤(1)得到的水解液进行检测预处理；所述预处理包括：将水解液与三氟乙酸溶液和乙腈-甲醇溶液混合，之后静置、离心，取上清液干燥后再用水复溶；优选地，所述生物样品包括血液、尿液；优选地，所述三氟乙酸溶液的加入量以体积计为水解液体积的0.5-1.5％；优选地，所述三氟乙酸溶液的浓度为4-6％；优选地，所述乙腈-甲醇溶液的加入量以体积计为水解液体积的1-5倍，优选地为1-3倍，更优选地为1.5-2.5倍；优选地，所述乙腈-甲醇溶液中乙腈与甲醇的体积比为1:0.5-1:1.5；优选地，所述静置的温度为-25～-15℃，时间为15-25min。
- 一种化合物，其特征在于，所述化合物的结构如式(I)所示：其中，各R a独立地为-SO 3H或-H，各R b独立地为H、-SO 3H或-C(O)CH 3，各R c独立地为-SO 3H或-H，n为0、1、2、3、4或5。
- 如权利要求8所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有以下其中之一的结构：
- 如权利要求1-7中任一项所述的糖胺聚糖羧酸化衍生物的检测方法在糖胺聚糖羧酸化衍生物的药代动力学研究中的应用。
- 如权利要求1-6中任一项所述的糖胺聚糖羧酸化衍生物的检测方法在糖胺聚糖羧酸化衍生物药物制剂质量检测中的应用。
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