TW202227815A - 一種用於檢測樣品中醣胺聚醣羧酸化衍生物含量的方法及其應用 - Google Patents

一種用於檢測樣品中醣胺聚醣羧酸化衍生物含量的方法及其應用 Download PDF

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Abstract

本發明係關於一種用於檢測樣品中醣胺聚醣羧酸化衍生物含量的方法及其應用，所記載之方法包含(1)將樣品進行水解，得到含有式(I)所示化合物的水解液；(2)採用液相色譜串聯質譜檢測水解液；(3)以醣胺聚醣羧酸化衍生物作為標準品，按照步驟(1)的方法水解其相異梯度濃度的溶液，按照步驟(2)的方法檢測相異濃度標準品溶液的水解液中式(I)所示化合物的質譜訊號峰面積，以質譜訊號峰面積對醣胺聚醣羧酸化衍生物標準品的量做標準曲線，根據該標準曲線，藉由步驟(2)測定的式(I)所示化合物的質譜峰面積計算樣品中醣胺聚醣羧酸化衍生物的含量。本發明所關於的方法藉由對醣胺聚醣羧酸化衍生物進行水解，可以穩定得到特定結構的水解產物，該結構可以藉由MS檢測到並選擇其中具有較高質譜豐度的水解產物，因此可以間接計算醣胺聚醣羧酸化衍生物的量。且該檢測方法的專一性強、準確度高、精密度好、定量限低、檢測限低。

Description

一種用於檢測樣品中醣胺聚醣羧酸化衍生物含量的方法及其應用
本發明屬於分析化學技術領域，具體而言係關於一種用於檢測樣品中醣胺聚醣羧酸化衍生物含量的方法及其應用，尤其關於一種專一性強、準確度高、精密度好、定量限低、檢測限低的用於檢測樣品中醣胺聚醣羧酸化衍生物含量的方法及其應用。
先前技術例如CN105744940A及CN111670038A兩篇專利揭示報導醣胺聚醣羧酸化衍生物作為藥物具有抗腫瘤及抗腫瘤轉移活性，具有廣泛的應用前景。醣胺聚醣羧酸化衍生物為未分級肝素(UFH)經過兩步氧化反應後得到的含有醣醛酸鄰二醇結構氧化開環的雙羧酸衍生物，即(1)醣胺聚醣中醣醛酸上相鄰的二醇被氧化開環形成二醛結構，(2)二醛結構進一步被氧化得到雙羧酸結構；其屬於肝素衍生物，係一種鏈狀、結構不均一的黏多醣物質。在藥物代謝研究中，必須測定生物樣品中藥物的含量以評價該藥物的藥物代謝動力學性質。在生物樣品中直接檢測完整的結構不容易實現，而且因生物樣品中存在多種內源性物質，例如蛋白質、磷脂等，常規的多醣測試方法易受到內源性物質的干擾而無法對醣胺聚醣羧酸化衍生物進行定量測定。因此，如何提供一種準確的醣胺聚醣羧酸化衍生物的檢測方法，成為了亟待解決的問題。 ［先前技術文獻］ ［專利文獻］
［專利文獻1］CN105744940A ［專利文獻2］CN111670038A
針對先前技術的不足，本發明係為提供一種用於檢測樣品中醣胺聚醣羧酸化衍生物含量的方法及其應用，尤其提供一種專一性強、準確度高、精密度好、定量限低、檢測限低的用於檢測樣品中醣胺聚醣羧酸化衍生物含量的方法及其應用。
為達到此發明目的，本發明採用下述技術手段： 第一態樣，本發明提供一種用於檢測樣品中醣胺聚醣羧酸化衍生物含量的方法，所記載之方法包含如下步驟： (1)將含醣胺聚醣羧酸化衍生物的樣品進行水解，得到含有式(I)所示化合物的水解液：
Figure 02_image001
其中，各R a獨立地為-SO 3H或-H，各R b獨立地為H、-SO 3H或-C(O)CH 3，各R c獨立地為-SO 3H或-H，n為0、1、2、3、4或5； (2)採用液相色譜串聯質譜檢測步驟(1)得到的水解液； (3)以醣胺聚醣羧酸化衍生物作為標準品，按照步驟(1)的方法水解其相異梯度濃度的溶液，按照步驟(2)的方法檢測相異濃度標準品溶液的水解液中式(I)所示化合物的質譜訊號峰面積，以質譜訊號峰面積對醣胺聚醣羧酸化衍生物標準品的量做標準曲線，根據該標準曲線，藉由步驟(2)測定的式(I)所示化合物的質譜峰面積計算樣品中醣胺聚醣羧酸化衍生物的含量； 所記載之醣胺聚醣羧酸化衍生物為包含式(II)所示結構單元及任意的式(III)所示結構單元的醣胺聚醣類化合物：
Figure 02_image003
，
Figure 02_image005
； 其中，各R a獨立地為-SO 3H或-H，R b獨立地為H、-SO 3H或-C(O)CH 3，R c獨立地為-SO 3H或-H。
理想地，所記載之醣胺聚醣為肝素或硫酸乙醯肝素；所記載之醣胺聚醣羧酸化衍生物經過兩步氧化反應獲得：(1)醣胺聚醣中醣醛酸上相鄰的二醇被氧化開環形成二醛結構，(2)二醛結構進一步被氧化得到雙羧酸結構。
理想地，所記載之式(I)所示化合物具有下述結構式中至少一種的結構：
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
或
Figure 02_image011
。
其中，化合物( a)的質譜訊號為MS(ESI,neg.ion)m/z: 432.0[M-H] -； 化合物( b)的質譜訊號為MS(ESI,neg.ion)m/z: 390.0[M-H] -； 化合物( c)的質譜訊號為MS(ESI,neg.ion)m/z: 522.98[M-2H] 2-。
本發明所關於的醣胺聚醣羧酸化衍生物包含如上所記載之式(II)所示的結構單元及任意的式(III)所示的結構單元，即醣胺聚醣化合物中己醣醛酸結構部分或全部開環。
本發明所關於的醣胺聚醣羧酸化衍生物經過水解後可以得到式(I)所示化合物，反應機理如手段1及2所示，其中，各R a獨立地為-SO 3H或-H，各R b獨立地為H、-SO 3H或-C(O)CH 3，各R c獨立地為-SO 3H或-H，n為0、1、2、3、4或5： 手段1：
Figure 02_image013
手段2：
Figure 02_image015
。
在本發明所關於的醣胺聚醣羧酸化衍生物的每條多醣鏈中，各雙醣結構單元以任意順序排列。
理想地，所記載之醣胺聚醣羧酸化衍生物的重量平均分子量為3000~20000 Da，例如3000 Da、5000 Da、7000 Da、8000 Da、9000 Da、10000 Da、11000 Da、12000 Da、13000 Da、13500 Da、14000 Da、16000 Da、18000 Da或20000 Da等，該數值範圍內的其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。理想為7000~14000 Da，進一步理想為8000~13500 Da。
所記載之醣胺聚醣羧酸化衍生物的開環度為10~100%，例如10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%等，該數值範圍內的其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。理想為25~80%，進一步理想為25~60%。
本發明中的術語「開環度」係指開環的醣醛酸殘基數量與總的醣醛酸殘基數量之比，其檢測及計算參考文獻Guerrini, M.,Guglieri,S, Naggi, A, Sasisekharan, R, (2007). Low molecular weight heparins:Structural differentiation by bidimentional nuclear magnetic resonance spectroscopy. Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 33, 478~487中的核磁方法進行。
理想地，步驟(1)所記載之將含醣胺聚醣羧酸化衍生物的樣品進行水解的處理方式為加熱。
理想地，所記載之加熱的溫度為70~100℃，例如70℃、75℃、80℃、82℃、85℃、87℃、95℃或100℃等，該數值範圍內的其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。理想為85~95℃。
理想地，所記載之加熱的時間為12~168 小時，例如12小時、16小時、24小時、36小時、48 小時、55 小時、60 小時、70 小時、72 小時、75 小時、78 小時、80 小時、90 小時、96 小時、120 小時、144 小時或168 小時等，該數值範圍內的其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。理想為12~120 小時。
在上述加熱溫度及加熱時間的條件下，本發明所關於的醣胺聚醣羧酸化衍生物水解可以得到質譜豐度較高的化合物(a)、化合物(b)或化合物(c)，綜合考慮檢測效率、檢測準確度精密度等選擇反應的溫度及時間。
當所記載之含醣胺聚醣羧酸化衍生物的樣品為生物樣品(如血液、尿液)時，必須對步驟(1)得到的水解液進行檢測預處理，所記載之預處理包含：將水解液與三氟乙酸溶液及乙腈-甲醇溶液混合，之後靜置、離心，取上清液乾燥後再用水複溶。
理想地，所記載之三氟乙酸溶液的加入量以體積計為水解液的0.5~1.5%，例如0.5%、0.8%、1.0%、1.2%或1.5%等，該數值範圍內的其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。
理想地，所記載之三氟乙酸溶液的濃度為4~6%，例如4%、5%或6%等，該數值範圍內的其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。
理想地，所記載之乙腈-甲醇溶液的加入量以體積計為水解液體積的1~5倍，例如1倍、1.5倍、1.8倍、2.0倍、2.2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍等，該數值範圍內的其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。理想地為1~3倍，更理想地為1.5~2.5倍。
理想地，所記載之乙腈-甲醇溶液中乙腈與甲醇的體積比為1:0.5~1:1.5，例如1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.2或1:1.5等，該數值範圍內的其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。
理想地，所記載之靜置的溫度為-25~-15℃，例如-25℃、-20℃、-15℃等；時間為15~25 分鐘，例如15 分鐘、18 分鐘、20 分鐘、22 分鐘、25 分鐘等，上述各項數值範圍內的其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。
理想地，所記載之液相色譜為反相色譜、尺寸排阻色譜或親水色譜。
理想地，所記載之液相色譜的流動相為流動相A及流動相B；所記載之流動相A為六氟異丙醇及戊胺的水溶液；所記載之流動相B為六氟異丙醇及戊胺的乙腈-水溶液； 所記載之流動相A為含有45~55 mM(例如45 mM、48 mM、50 mM、52 mM、55 mM等)六氟異丙醇及13~17 mM(例如13 mM、15 mM、17 mM等)戊胺的水溶液；所記載之流動相B為含有45~55 mM(例如45 mM、48 mM、50 mM、52 mM、55 mM等)六氟異丙醇及13~17 mM(例如13 mM、15 mM、17 mM等)戊胺的乙腈-水溶液；所記載之流動相B中乙腈與水的體積比為70:30~80:20(例如70:30、75:25、80:20等)。上述各項數值範圍內的其他具體點值均可選擇，在此便不再一一贅述。
進一步理想地，所記載之液相色譜的流動相為流動相A及流動相B，具體如下表所示。
流動相A 50 mM六氟異丙醇，15mM戊胺，H 2O
流動相B 50 mM六氟異丙醇，15mM戊胺，乙腈/H 2O(75/25,v/v)
理想地，所記載之液相色譜的洗脫流程如下表所示：
時間(分鐘) 流速(mL/分鐘) %A %B 曲線
初始 0.36 98.0 2.0 初始
3.00 0.36 98.0 2.0 6
10.00 0.36 80.0 20.0 6
15.00 0.36 60.0 40.0 6
15.10 0.36 10.0 90.0 6
18.00 0.36 10.0 90.0 6
18.10 0.36 98.0 2.0 6
22.00 0.36 98.0 2.0 6
在本發明中，所記載之質譜條件示例性地可以選擇如下條件內容：
條件內容 名稱 / 指標
質譜儀 Waters Xevo G2-S QTOF
模式 Negative Resolution Mode [負離子分辨率模式]
設定品質 432.0 Da
毛細管電壓 1.5 kV
取樣椎 25 V
源補償電壓 80 V
源溫度 120 ℃
脫溶劑溫度 500 ℃
錐孔氣流 50 L/小時
脫溶劑氣流 800 L/小時
採集起始分子量 200
採集終止分子量 2000
採集起始時間 1.20 分鐘
採集終止時間 6.0 分鐘
基於第一態樣的內容，本發明進一步提供一種全新的化合物，具體內容如下：
第二態樣，本發明提供一種化合物，所記載之化合物的結構如式(I)所示：
Figure 02_image001
其中，各R a獨立地為-SO 3H或-H，各R b獨立地為H、-SO 3H或-C(O)CH 3，各R c獨立地為-SO 3H或-H，n為0、1、2、3、4或5。
理想地，所記載之化合物具有下述其中之一的結構：
Figure 02_image007
、
Figure 02_image009
及
Figure 02_image011
。
第三態樣，本發明提供一種如第一方面所記載之的醣胺聚醣羧酸化衍生物的檢測方法在醣胺聚醣羧酸化衍生物的藥代動力學研究中的應用。
第四態樣，本發明提供一種如第一態樣所記載之的醣胺聚醣羧酸化衍生物的檢測方法在醣胺聚醣羧酸化衍生物藥物製劑品質檢測中的應用。
相對於先前技術，本發明具有下述功效： 因醣胺聚醣羧酸化衍生物為非均一物質，在生物樣品中直接檢測完整的結構不容易實現，本申請發明人發現醣胺聚醣羧酸化衍生物經過水解可以穩定地得到如上所記載之特定結構的水解產物化合物(a)、化合物(b)或化合物(c)，此類化合物可以藉由質譜檢測到。藉由測定化合物(a)、化合物(b)或化合物(c)，將相異濃度的醣胺聚醣羧酸化衍生物標準品對化合物(a)、化合物(b)或化合物(c)的質譜峰面積建立標準曲線；再藉由水解樣品中醣胺聚醣羧酸化衍生物並檢測化合物(a)、化合物(b)或化合物(c)的質譜峰面積；含醣胺聚醣羧酸化衍生物的樣品經過水解後用液相質譜測定化合物(a)、化合物(b)或化合物(c)的質譜峰面積，根據標準曲線可以間接計算出樣品中醣胺聚醣羧酸化衍生物的量。該檢測方法的專一性強、準確度高、精密度好、定量限低、檢測限低。
下面藉由具體實施方式來進一步說明本發明的技術手段。所屬技術領域中具有通常知識者應該明瞭，所記載之實施例僅僅是幫助理解本發明，不應視為對本發明的具體限制。
下述實施例所關於的SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。
下述實施例所關於的醣胺聚醣羧酸化衍生物H1011由專利CN111670038A中實施例3揭示的製備方法製備得到，其重量平均分子量為9161 Da，開環度為43.1%。 ［實施例1］
化合物(a)、化合物(b)及化合物(c)的製備： 秤取H1011(400 mg)溶於水(4.0 mL)中，將H1011水溶液加熱至85℃反應72 小時，接著冷卻至25℃；反應產物藉由色譜技術分離純化(色譜柱為Dionex IonPac AS11-HC，洗脫液M及N(具體組分見表1))，接著脫鹽乾燥得到化合物(a)、化合物(b)及化合物(c)。
Figure 02_image021
、
Figure 02_image023
、
Figure 02_image025
表1
時間(分鐘) 洗脫液M(%) (2.33 mM磷酸二氫鈉) 洗脫液N(%) (2.33 mM磷酸二氫鈉，1.14 M高氯酸鈉)
0 97 3
8 91 9
20 72 28
25 0 100
25.1 97 3
30 97 3
富集得到的化合物( a)、化合物( b)及化合物( c)藉由質譜及核磁共振波譜法(一維 1H-NMR、一維 13CNMR、 13C DEPT 135°、 1H- 1H COSY、二維TOCSY、HSQC、HMBC、二維DOSY)鑑定結構。
其中化合物(a)的表徵數據如下： MS(ESI,neg.ion)m/z: 432.0[M-H] -； 1H NMR (600 MHz, D 2O): δ 4.87 (d, J= 3.5 Hz, 1H), 4.34 (dd, J= 11.2, 3.7 Hz, 1H), 4.29 (d, J= 4.6 Hz, 1H), 4.27 (dd, J= 11.0, 2.1 Hz, 1H), 4.20 (d, J= 4.6 Hz, 1H), 4.05 (ddd, J= 10.1, 3.7, 2.2 Hz, 1H), 3.96 (dd, J= 10.6, 3.5 Hz, 1H), 3.81 (dd, J= 10.5, 9.2 Hz, 1H), 3.59 (dd, J= 10.1, 9.2 Hz, 1H), 2.07 (s, 3H). 13C NMR (151 MHz, D 2O): δ 24.79, 56.23, 69.39, 71.95, 73.04, 74.14, 76.51, 83.25, 99.56, 177.34, 178.79, 179.99. 化合物(a)的表徵圖譜如圖1至圖9所示。
其中化合物(b)的表徵數據如下： MS(ESI,neg.ion)m/z: 390.0[M-H] -；
其中化合物( c)的表徵數據如下： MS(ESI,neg.ion)m/z: 522.98[M-2H] 2-； 1H NMR (600 MHz, D 2O): δ 5.37 (d, J= 3.5 Hz, 1H), 5.25 – 5.23 (m, 1H), 5.16 (d, J= 3.6 Hz, 1H), 5.15 – 5.12 (m, 1H), 4.38 – 4.28 (m, 5H), 4.23 (dd, J= 11.4, 2.1 Hz, 1H), 4.19 (dd, J= 11.1, 2.1 Hz, 1H), 4.13 (dd, J= 2.9 Hz, 1H), 3.87 (dt, J= 9.7, 2.7 Hz, 1H), 3.84 (dt, J= 9.9, 2.6 Hz, 1H), 3.78 – 3.70 (m, 2H), 3.64 (q, J= 7.1 Hz, 1H), 3.60 (dd, J= 9.9 Hz, 1H), 3.56 (dd, J= 9.5 Hz, 1H), 3.25 (dd, J= 10.1, 3.5 Hz, 3H). 13C NMR (151 MHz, D 2O): δ 60.45, 60.63, 68.92, 69.10, 70.44, 70.60, 71.82, 72.44, 72.80, 73.05, 73.50, 74.54, 77.54, 78.74, 79.51, 81.24, 100.90, 101.38, 101.69, 175.69, 176.18, 177.23. 化合物(c)的表徵圖譜如圖10至圖19所示。 〔實施例2〕
本實施例將本發明所關於的醣胺聚醣羧酸化衍生物的檢測方法應用於藥代動力學研究(以化合物(a)作為檢測對象)，具體內容如下： (1)試驗方法 (1.1)實驗動物：健康成年雄性SD大鼠6隻，其中3隻用於取空白血漿製作標準曲線，3隻用於進行大鼠單次給藥後血藥濃度檢測。
(1.2)藥物配製：秤取醣胺聚醣羧酸化衍生物H1011用水配置60 mg/kg的藥物溶液。
(1.3)給藥及樣品採集：皮下注射給藥60 mg/kg後，分別在時間點0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24 小時採血，採集全血後置於K2EDTA抗凝試管中，隨後離心15分鐘，分離得到血漿樣品。
(1.4)標準曲線的繪製： (1.4.1)秤取醣胺聚醣羧酸化衍生物H1011並將其配成1 mg/mL的水溶液，以上述空白血漿作為稀釋液逐級稀釋H1011水溶液，配置2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL、64 μg/mL、128 μg/mL、256 μg/mL的標準溶液，在85℃條件下水解72小時； (1.4.2)水解後的標準溶液進行檢測前處理，向水解後的標準溶液中加入百分之一體積比的三氟乙酸(5%，v/v)及兩倍體積的乙腈/甲醇(v/v，50/50)，混勻，接著置於-20℃靜置20分鐘，離心；取上清液乾燥後再用超純水複溶； (1.4.3)進行液相色譜串聯質譜檢測，測得譜圖，色譜條件如表2所示，質譜條件如表3所示： 表2
條件內容 名稱/指標
超高效液相色譜儀 Waters ACQUITY UPLC
檢測器/檢測波長 Waters TUV檢測器/232nm
色譜柱 Waters Acquity UPLC BEH C18 1.7um(2.1mm×150mm)
流動相 流動相A: 50mM HFIP (六氟異丙醇), 15 mM PTA (戊胺), H 2O； 流動相B: 50mM HFIP (六氟異丙醇), 15 mM PTA (戊胺), 乙腈/H 2O (75/25, v/v)；
流動相梯度
Figure 02_image027
進樣量 5 µL
採集時間 22分鐘
工作站 MassLynx v4.1
表3
條件內容 名稱/指標
質譜儀 Waters Xevo G2-S QTOF
模式 Negative Resolution Mode [負離子分辨率模式]
設置分子量 432.0 Da
毛細管電壓 1.5 kV
取樣椎 25 V
源補償電壓 80 V
源溫度 120 ℃
脫溶劑溫度 500 ℃
錐孔氣流 50 L/小時
脫溶劑氣流 800 L/小時
採集起始分子量 200
採集終止分子量 2000
採集起始時間 1.20分鐘
採集終止時間 7.0 分鐘
(1.4.4)以H1011標準溶液與化合物(a)質譜峰面積線性關係作標準曲線，化合物(a)質譜訊號為MS(ESI,neg.ion)m/z: 432.0[M-H] -；線性方程為：y=36.2154x-0.3216；相關係數為：R 2=0.9987，其中，y為質譜峰面積，x為標準溶液濃度。
(1.5)檢測血漿樣品中H1011的含量： (1.5.1)將步驟(1.3)獲得的血漿樣品在85℃條件下水解72小時，接著向其中加入百分之一體積比的三氟乙酸(5%，v/v)及兩倍體積的乙腈/甲醇(v/v，50/50)，混勻，接著置於-20℃靜置20分鐘，離心；取上清液乾燥後再用超純水複溶； (1.5.2)進行液相色譜串聯質譜檢測，測得化合物(a)質譜峰面積，色譜條件如上表2所示，質譜條件如上表3所示； (1.5.3)根據化合物(a)質譜峰面積結合步驟(1.4)中繪製的標準曲線，計算得到各時間點血漿樣品中H1011的濃度，並如藥物濃度-時間曲線計算藥代動力學參數。
(2)試驗結果如表4所示： 表4
給藥途徑 劑量 AUC 0-24(小時*μg/ml) T 1/2(小時) CL (ml/分鐘/kg)
i.h. 60 mg/kg 537.47 3.75 0.110
(3)方法學驗證 (3.1)專一性 配製超純水對照溶液及空白血漿對照溶液，經過與上述相同的高溫水解、前處理過程，接著經過上述相同條件的液相色譜串聯質譜檢測，在超純水對照及血漿對照溶液中未檢測到432.0 Da的訊號峰，即化合物(a)的質譜訊號峰，表明超純水及空白血漿對檢測無干擾，本檢測方法專一性強。
(3.2)定量限及檢測限 經計算，本方法的定量限為0.8 μg/mL，檢測限為0.2 μg /mL。
(3.3)準確度 設置1 μg/mL、50 μg/mL、120 μg/mL三個濃度，測試H1011血漿樣品，經計算回收率為82.6%~110.8%，且各個濃度6次實驗結果的RSD值依次為4.2%、2.2%及1.3%。
(3.4)精密度 選取50 μg/mL H1011血漿溶液，由兩名不同檢測員各檢測6次，第一名檢驗員6次實驗結果的RSD為2.0%，第二名檢驗員6次實驗結果的RSD為1.8%，兩名檢驗員12次實驗結果的RSD為2.1%，均滿足≤10.0%的可接受標準。方法精密度良好。
(3.5)溶液穩定性 選取50 μg/mL H1011血漿溶液，水解並進行前處理，樣品溶液第5天的檢測結果為0時間的97.2%，符合標準。 ［實施例3］
本實施例將本發明所關於的醣胺聚醣羧酸化衍生物的檢測方法應用於藥代動力學研究(以化合物(b)作為檢測對象)，具體內容如下： (1)試驗方法 (1.1)實驗動物：健康成年雄性SD大鼠6隻，其中3隻用於取空白血漿製作標準曲線，3隻用於進行大鼠單次給藥後血藥濃度檢測。
(1.2)藥物配製：秤取醣胺聚醣羧酸化衍生物H1011用水配置60 mg/kg的藥物溶液。
(1.3)給藥及樣品採集：皮下注射給藥60 mg/kg後，分別在時間點0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24小時採血，採集全血後置於K2EDTA抗凝試管中，隨後離心15分鐘，分離得到血漿樣品。
(1.4)標準曲線的繪製： (1.4.1)秤取醣胺聚醣羧酸化衍生物H1011並將其配成1 mg/mL的水溶液，以上述空白血漿作為稀釋液逐級稀釋H1011水溶液，配置2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL、64 μg/mL、128 μg/mL、256 μg/mL的標準溶液，在90℃條件下水解48小時； (1.4.2)水解後的標準溶液進行檢測前處理，向水解後的標準溶液中加入百分之一體積比的三氟乙酸(5%，v/v)及兩倍體積的乙腈/甲醇(v/v，50/50)，混勻，接著置於-20℃靜置20分鐘，離心；取上清液乾燥後再用超純水複溶； (1.4.3)進行液相色譜串聯質譜檢測，測得譜圖，色譜條件如上表2所示，質譜條件如上表3所示，設置分子量為390.0 Da； (1.4.4)以H1011標準溶液與化合物( b)質譜峰面積線性關係作標準曲線，化合物( b)質譜訊號為MS(ESI,neg.ion)m/z: 390.0[M-H] -；做出線性方程為：y=26.0235x；相關係數為0.9981，其中，y為峰面積，x為標準溶液濃度。
(1.5)檢測血漿樣品中H1011的含量： (1.5.1)將步驟(1.3)獲得的血漿樣品在90℃條件下水解48小時，接著向其中加入百分之一體積比的三氟乙酸(5%，v/v)及兩倍體積的乙腈/甲醇(v/v，50/50)，混勻，接著置於-20℃靜置20分鐘，離心；取上清液乾燥後再用超純水複溶； (1.5.2)進行液相色譜串聯質譜檢測，測得化合物( b)質譜峰面積，色譜條件如上表2所示，質譜條件如上表3所示，設置分子量為390.0 Da； (1.5.3)如化合物( b)質譜峰面積結合步驟(1.4)中繪製的標準曲線，計算得到各時間點血漿樣品中H1011的濃度，並如藥物濃度-時間曲線計算藥代動力學參數。
(2)試驗結果如表5所示： 表5
給藥途徑 劑量 AUC 0-24(小時*μg/ml) T 1/2(小時) CL (ml/分鐘/kg)
i.h. 60 mg/kg 483.87 3.04 0.089
(3)方法學驗證 (3.1)專一性 配製超純水對照溶液及空白血漿對照溶液，經過與上述相同的高溫水解、前處理過程，接著經過上述相同條件的液相色譜串聯質譜檢測，在超純水對照及血漿對照溶液中未檢測到390.0 Da的訊號峰，即化合物( b)的質譜訊號峰，表明超純水及空白血漿對檢測無干擾，本檢測方法專一性強。
(3.2)定量限及檢測限 經計算，本方法的定量限為1.1 μg/mL，檢測限為0.55 μg /mL。
(3.3)準確度 設置1 μg/mL、50 μg/mL、120 μg/mL三個濃度，測試H1011血漿樣品，經計算回收率為81.2%~115.8%，且各個濃度6次實驗結果的RSD值依次為5.4%、1.8%及2.0%。
(3.4)精密度 選取50 μg/mL H1011血漿溶液，由兩名不同檢測員各檢測6次，第一名檢驗員6次實驗結果的RSD為1.6%，第二名檢驗員6次實驗結果的RSD為2.6%，兩名檢驗員12次實驗結果的RSD為2.2%，均滿足≤10.0%的可接受標準。方法精密度良好。
(3.5)溶液穩定性 選取50 μg/mL H1011血漿溶液，水解並進行前處理，樣品溶液第5天的檢測結果為0時間的97.8%，符合標準。 ［實施例4］
本實施例將本發明所關於的醣胺聚醣羧酸化衍生物的檢測方法應用於藥代動力學研究(以化合物( c)作為檢測對象)，具體內容如下： (1)試驗方法 (1.1)實驗動物：健康成年雄性SD大鼠6隻，其中3隻用於取空白血漿製作標準曲線，3隻用於進行大鼠單次給藥後血藥濃度檢測。
(1.2)藥物配製：秤取醣胺聚醣羧酸化衍生物H1011用水配置20 mg/kg的藥物溶液。
(1.3)給藥及樣品採集：皮下注射給藥20 mg/kg後，分別在時間點0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24 小時採血，採集全血後置於K2EDTA抗凝試管中，隨後離心15分鐘，分離得到血漿樣品。
(1.4)標準曲線的繪製： (1.4.1)秤取醣胺聚醣羧酸化衍生物H1011並將其配成1 mg/mL的水溶液，以上述空白血漿作為稀釋液逐級稀釋H1011水溶液，配置2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL、64 μg/mL、128 μg/mL、256 μg/mL的標準溶液，在90℃條件下水解36小時； (1.4.2)水解後的標準溶液進行檢測前處理，向水解後的標準溶液中加入百分之一體積比的三氟乙酸(5%，v/v)及兩倍體積的乙腈/甲醇(v/v，50/50)，混勻，接著置於-20℃靜置20分鐘，離心；取上清液乾燥後再用超純水複溶； (1.4.3)進行液相色譜串聯質譜檢測，測得譜圖，色譜條件如上表2所示，質譜條件如上表3所示，設置分子量為522.98 Da； (1.4.4)以H1011標準溶液與化合物( c)質譜峰面積線性關係作標準曲線，化合物( c)質譜訊號為MS(ESI,neg.ion)m/z: 522.98[M-2H] 2-；做出線性方程為：y=23.6225x；相關係數為0.9986，其中，y為質譜峰面積，x為標準溶液濃度。
(1.5)檢測血漿樣品中H1011的含量： (1.5.1)將步驟(1.3)獲得的血漿樣品在90℃條件下水解36 小時，接著向其中加入百分之一體積比的三氟乙酸(5%，v/v)及兩倍體積的乙腈/甲醇(v/v，50/50)，混勻，接著置於-20℃靜置20 分鐘，離心；取上清液乾燥後再用超純水複溶； (1.5.2)進行液相色譜串聯質譜檢測，測得化合物(c)質譜峰面積，色譜條件如上表2所示，質譜條件如上表3所示； (1.5.3)根據化合物(c)質譜峰面積結合步驟(1.4)中繪製的標準曲線，計算得到各時間點血漿樣品中H1011的濃度，並如藥物濃度-時間曲線計算藥代動力學參數。
(2)試驗結果如表6所示： 表6
給藥途徑 劑量 AUC 0-24(小時*μg/ml) T 1/2(小時) CL (ml/分鐘/kg)
i.h. 20 mg/kg 237.44 4.04 0.073
(3)方法學驗證 (3.1)專一性 配製超純水對照溶液及空白血漿對照溶液，經過與上述相同的高溫水解、前處理過程，接著經過上述相同條件的液相色譜串聯質譜檢測，在超純水對照及血漿對照溶液中未檢測到522.98 Da的訊號峰，即化合物( c)的質譜訊號峰，表明超純水及空白血漿對檢測無干擾，本檢測方法專一性強。
(3.2)定量限及檢測限 經計算，本方法的定量限為2.0 μg/mL，檢測限為1.0 μg /mL。
(3.3)準確度 設置2 μg/mL、50 μg/mL、120 μg/mL三個濃度，測試H1011血漿樣品，經計算回收率為80.3%~108.8%，且各個濃度6次實驗結果的RSD值依次為8.9%、6.5%及5.4%。
(3.4)精密度 選取50 μg/mL H1011血漿溶液，由兩名不同檢測員各檢測6次，第一名檢驗員6次實驗結果的RSD為6.5%，第二名檢驗員6次實驗結果的RSD為7.2%，兩名檢驗員12次實驗結果的RSD為7.4%，均滿足≤10.0%的可接受標準。方法精密度良好。
(3.5)溶液穩定性 選取50 μg/mL H1011血漿溶液，水解並進行前處理，樣品溶液第5天的檢測結果為0時間的90.2%，符合標準。
發明人聲明，本發明藉由上述實施例來說明本發明的一種用於檢測樣品中醣胺聚醣羧酸化衍生物含量的方法及其應用，但本發明並不侷限於上述實施例，即不意味著本發明必須依賴上述實施例才能實施。所屬技術領域中具有通常知識者應該明瞭，對本發明的任何改進，對本發明產品各原料的均等替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護範圍及揭示範圍之內。
以上詳細描述本發明的理想實施方式，但是，本發明並不限於上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術手段進行多種簡單變型，此等簡單變型均屬於本發明的保護範圍。
又必須說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以藉由任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重複，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。
〔圖1〕係化合物(a)的質譜圖。 〔圖2〕係化合物(a)的二級質譜圖。 〔圖3〕係化合物(a)的氫譜圖。 〔圖4〕係化合物(a)的碳譜圖。 〔圖5〕係化合物(a)的 13C DEPT 135°譜圖。 〔圖6〕係化合物(a)的 1H- 1H COSY譜圖。 〔圖7〕係化合物(a)的TOCSY譜圖。 〔圖8〕係化合物(a)的HSQC譜圖。 〔圖9〕係化合物(a)的HMBC譜圖。 〔圖10〕係化合物(c)的質譜圖。 〔圖11〕係化合物(c)的二級質譜圖。 〔圖12〕係化合物(c)的氫譜圖。 〔圖13〕係化合物(c)的碳譜圖。 〔圖14〕係化合物(c)的 13C DEPT 135°譜圖。 〔圖15〕係化合物(c)的 1H- 1H COSY譜圖。 〔圖16〕係化合物(c)的TOCSY譜圖。 〔圖17〕係化合物(c)的ROESY譜圖。 〔圖18〕係化合物(c)的HSQC譜圖。 〔圖19〕係化合物(c)的HMBC譜圖。

Claims (15)

  1. 一種用於檢測樣品中醣胺聚醣羧酸化衍生物含量之方法，其特徵係，該方法包含如下步驟： (1)將含醣胺聚醣羧酸化衍生物的樣品進行水解，得到含有式(I)所示化合物的水解液：
    Figure 03_image001
    其中，各R a獨立地為-SO 3H或-H，各R b獨立地為H、-SO 3H或-C(O)CH 3，各R c獨立地為-SO 3H或-H，n為0、1、2、3、4或5； (2)採用液相色譜串聯質譜檢測步驟(1)得到的水解液； (3)以醣胺聚醣羧酸化衍生物作為標準品，按照步驟(1)的方法水解其相異梯度濃度的溶液，按照步驟(2)的方法檢測相異濃度標準品溶液的水解液中式(I)所示化合物的質譜訊號峰面積，以質譜訊號峰面積對醣胺聚醣羧酸化衍生物標準品的量做標準曲線，根據該標準曲線，藉由步驟(2)測定的式(I)所示化合物的質譜峰面積計算樣品中醣胺聚醣羧酸化衍生物的含量； 該醣胺聚醣羧酸化衍生物為包含式(II)所示結構單元的醣胺聚醣類化合物：
    Figure 03_image003
    ； 其中，各R a獨立地為-SO 3H或-H，R b獨立地為H、-SO 3H或-C(O)CH 3。
  2. 如請求項1所述之方法，其中，該醣胺聚醣羧酸化衍生物進一步包含式(III)所示的結構單元：
    Figure 03_image005
    ，其中，各R a獨立地為-SO 3H或-H，R b獨立地為H、-SO 3H或-C(O)CH 3，R c獨立地為-SO 3H或-H。
  3. 如請求項1所述之方法，其中，該醣胺聚醣為肝素或硫酸乙醯肝素； 該醣胺聚醣羧酸化衍生物經過兩步氧化反應獲得：(1)醣胺聚醣中醣醛酸上相鄰的二醇被氧化開環形成二醛結構，(2)二醛結構進一步被氧化得到雙羧酸結構。
  4. 如請求項1所述之方法，其中，該式(I)所示化合物具有下述結構式中至少一種的結構：
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    或
    Figure 03_image011
    。
  5. 如請求項1所述之方法，其中，該醣胺聚醣羧酸化衍生物的重量平均分子量為3000~20000 Da； 該醣胺聚醣羧酸化衍生物的開環度為10~100%。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中，步驟(1)所述將含醣胺聚醣羧酸化衍生物的樣品進行水解的處理方式為加熱； 該加熱的溫度為70~100℃； 該加熱的時間為12~168小時。
  7. 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中，該液相色譜為反相色譜、尺寸排阻色譜或親水色譜； 該液相色譜的流動相為流動相A及流動相B；該流動相A為六氟異丙醇及戊胺的水溶液；該流動相B為六氟異丙醇及戊胺的乙腈-水溶液。
  8. 如請求項7所述之方法，其中，該流動相A為含有45~55 mM六氟異丙醇及13~17 mM戊胺的水溶液；該流動相B為含有45~55 mM六氟異丙醇及13~17 mM戊胺的乙腈-水溶液；該流動相B中乙腈與水的體積比為70:30~80:20。
  9. 如請求項8所述之方法，其中，該液相色譜的流動相為流動相A及流動相B，具體如下表所示。 流動相A 50 mM六氟異丙醇，15mM戊胺，H 2O 流動相B 50 mM六氟異丙醇，15mM戊胺，乙腈/H 2O(75/25,v/v)
  10. 如請求項1至5中任一項所述之方法，其中，當該含醣胺聚醣羧酸化衍生物的樣品為生物樣品時，需對步驟(1)得到的水解液進行檢測預處理；該預處理包含：將水解液與三氟乙酸溶液及乙腈-甲醇溶液混合，之後靜置、離心，取上清液乾燥後再用水複溶。
  11. 如請求項10所述之方法，其中，該生物樣品包含血液、尿液； 該三氟乙酸溶液的加入量以體積計為水解液體積的0.5~1.5%； 該三氟乙酸溶液的濃度為4~6%； 該乙腈-甲醇溶液的加入量以體積計為水解液體積的1~5倍； 該乙腈-甲醇溶液中乙腈與甲醇的體積比為1:0.5~1:1.5； 該靜置的溫度為-25~-15℃，時間為15~25分鐘。
  12. 一種化合物，其特徵係，該化合物的結構如式(I)所示：
    Figure 03_image001
    其中，各R a獨立地為-SO 3H或-H，各R b獨立地為H、-SO 3H或-C(O)CH 3，各R c獨立地為-SO 3H或-H，n為0、1、2、3、4或5。
  13. 如請求項12所述之化合物，其中，該化合物具有下述其中之一的結構：
    Figure 03_image007
    、
    Figure 03_image009
    及
    Figure 03_image011
    。
  14. 如請求項1至11中任一項所述之醣胺聚醣羧酸化衍生物的檢測方法，其中，在醣胺聚醣羧酸化衍生物的藥代動力學研究中的應用。
  15. 如請求項1至9中任一項所述之醣胺聚醣羧酸化衍生物的檢測方法，其中，在醣胺聚醣羧酸化衍生物藥物製劑品質檢測中的應用。
TW110149700A 2020-12-31 2021-12-30 一種用於檢測樣品中醣胺聚醣羧酸化衍生物含量的方法及其應用 TWI807565B (zh)

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