CN104597160B

CN104597160B - 一种同时测定半夏中6种有机酸含量的hplc方法

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Publication number: CN104597160B
Application number: CN201510044750.3A
Authority: CN
Inventors: 何丹; 张景勍; 孙全; 杨林
Original assignee: Chongqing Medical University
Current assignee: Chongqing Medical University
Priority date: 2015-01-27
Filing date: 2015-01-27
Publication date: 2017-01-25
Anticipated expiration: 2035-01-27
Also published as: CN104597160A

Abstract

本发明涉及一种同时测定半夏中6种有机酸含量的方法，该方法包括以下步骤：(1)样品溶液制备(2)对照品溶液制备(3)高效液相色谱测定：取对照品溶液和样品溶液在以下色谱条件下进行测定分析，色谱柱为GL InterSustain‑C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为磷酸调节pH＝2.0的0.03mol·L^‑1(NH₄)H₂PO₄缓冲液和甲醇，体积比为97∶3，流速为0.8mL·min^‑1，柱温30℃，检测波长为210nm。在该方法条件下，半夏中草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸同时得到了有效分离，且方法学结果均符合分析测定要求。该方法相比以前电位滴定法测定总有机酸的含量更为明确和客观，能有效、快速的测定半夏中6种有机酸的含量，可更全面、更准确的用于半夏药材的质量控制。

Description

一种同时测定半夏中6种有机酸含量的HPLC方法

技术领域

本发明涉及一种中药测定方法，具体涉及一种利用HPLC同时测定半夏中6种有机酸含量的方法。

背景技术

半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata(thunb.)Breit.的干燥块茎，别名三叶半夏，三步跳，麻芋子，地雷公，半夏为多年生草本，块茎圆球形，主要分布于重庆、四川、湖北、河南和贵州等地。性辛，温，具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结之功效，临床用于痰多咳喘、痰饮眩悸、风痰眩晕、呕吐反胃、胸脘痞闷等症，用途广泛。半夏含有多种化学成分，主要包括有机酸类、生物碱类、半夏蛋白和酚类等。有研究报道运用小鼠镇咳祛痰药理模型评价了半夏镇咳祛痰的成分与效应之间的关系，发现有机酸与镇咳祛痰作用具有相关性，对氨水引咳的小鼠模型皆具有明显的止咳作用，同时还发现半夏有机酸对体外培养的胃癌细胞有明显的抑制作用，并呈现明显的量效关系。而半夏有机酸类成分中主要包括草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸。目前文献报道对半夏药材及其饮片中有机酸的测定主要采取电位滴定法，《中国药典》(2010年版)中也采用电位滴定法对半夏中总有机酸含量进行测定，以琥珀酸含量计算，进行质量控制。

电位滴定法测定半夏总有机酸的含量，结果以琥珀酸含量计，该方法只能粗略反映半夏中有机酸类成分的总量，不能反映半夏中各有机酸成分的具体情况，对含有有机酸的种类和各自含量高低无法测定出来，显然用该方法来评价半夏质量的真实性、优良性和稳定性存在缺陷，不够明确和科学。而且电位滴定法测定半夏总有机酸的方法专属性不强，易受到其他酸性物质以及操作条件的影响。目前还未见采用HPLC法对半夏药材中各种有机酸进行含量测定的文献研究。因此，建立一种同时测定半夏中6种有机酸含量的HPLC方法具有重要意义。本发明对半夏中的草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸进行测定，作为质量控制的指标更加明确，具体。该方法准确，简便，可以为半夏的质量控制提供参考。

发明内容

本发明的目的是提供一种灵敏度高，专属性强的同时测定半夏提取物中草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的方法，能够快速、准确的测定它们各自的含量。克服了现有电位滴定法测定半夏药材中总有机酸方法的缺陷。

本发明所述的一种同时测定半夏中6种有机酸含量的HPLC方法，按下列步骤进行：

(1)样品溶液制备：称取干燥的半夏药材粉末2.0g，精密称定，加入40mL水，称定重量，超声，300W，25kHz，提取2次，每次2h，放至室温，再称定重量，用水补足减失的重量，提取液用砂芯布什漏斗过滤，合并滤液置100mL容量瓶中，加水定容。精密量取滤液20mL于小烧杯中，滴加氨水调pH在11.5-12范围内，用提取液3倍量的乙酸乙酯萃取3次，收集碱水液，再滴加磷酸调pH在2.0-2.5范围内，以3倍量的乙酸乙酯萃取5次，收集乙酸乙酯，旋转蒸发挥干，加超纯水溶解并定容至25mL，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即为样品溶液。

(2)对照品溶液制备：分别精密称取草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸对照品适量，加水溶解，制得含有草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的混合对照品溶液。

(3)高效液相色谱测定：将对照品溶液和样品溶液进行高效液相色谱测定，色谱柱为GL InterSustain-C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为磷酸调节pH＝2.0的0.03mol·L^-1(NH₄)H₂PO₄缓冲液和甲醇，体积比为97∶3，流速为0.8mL·min^-1，柱温30℃，检测波长210nm，对照品溶液和样品溶液各进样20μL，采用标准曲线法定量，色谱图记录与处理由工作站完成，理论塔板数按草酸峰计算不低于3000。

本发明采用HPLC法同时测定半夏中草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的含量，结果这6种有机酸在15分钟内达到基线分离，且分离度均大于1.5，理论塔板数按草酸峰计算不低于3000，6种有机酸成分在各自浓度范围内线性良好，相关系数r≥0.9999，回收率在96.80％-100.8％之间。本方法可用于半夏中6种有机酸成分的质量分析，该方法准确度和灵敏度高，重现性好。

附图说明

图1混合对照品溶液色谱图(1.草酸，2.甲酸，3.苹果酸，4.乙酸，5.柠檬酸，6.琥珀酸)

图2半夏药材提取物色谱图(1.草酸，2.甲酸，3.苹果酸，4.乙酸，5.柠檬酸，6.琥珀酸)

具体实施方式

通过以下实施例，进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1

1仪器与试剂：

岛津LC-15C型液相色谱仪，LabSolutions LC工作站(日本岛津公司)；AG135型电子分析天平(瑞士Mettler toledo公司)；KQ2200B型超声波清洗器(昆山市超声仪有限公司)；RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；PHS-3C pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)；

10个不同产地半夏药材，经重庆太极集团质检部鉴定为天南星科植物半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit的干燥块茎；草酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100328-201010)；甲酸(含量≥98.0％，重庆川东化工有限公司)；乙酸(含量≥99.5％，重庆川东化工有限公司)；柠檬酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111598-200904)；苹果酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110736-201129)；琥珀酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：100525-201102)；甲醇为色谱纯(美国天地试剂公司)，实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1色谱条件：色谱柱为GL InterSustain-C₁₈(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为磷酸调节pH＝2.0的0.03mol·L^-1(NH₄)H₂PO₄的缓冲液和甲醇，体积比为97∶3，流速0.8mL·min^-1，柱温30℃，检测波长210nm，进样量20μL，理论塔板数按草酸峰计算不低于3000。

2.2对照品溶液制备：分别精密称取草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸对照品适量，加水溶解，制得含有草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的混合对照品溶液。

2.3样品溶液制备：分别取10个不同产地干燥的半夏药材粉末2.0g，精密称定，加入40mL水，称定重量，超声，300W，25kHz，提取2次，每次2h，放至室温，再称定重量，用水补足减失的重量，提取液用砂芯布什漏斗过滤，合并滤液置100mL容量瓶中，加水定容，精密量取滤液20mL于小烧杯中，滴加氨水调pH为11.5，用提取液3倍量的乙酸乙酯萃取3次，收集碱水液，再滴加磷酸调pH为2.5，以3倍量的乙酸乙酯萃取5次，收集乙酸乙酯，旋转蒸发挥干，加超纯水溶解并定容至25mL，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即为10个不同产地的半夏样品溶液。

2.4线性关系考察：取对混合照品溶液，逐级稀释得系列混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样20μL测定，以峰面积为纵坐标，分别以6种有机酸对照品溶液的浓度(μg·mL^-1)为横坐标，绘制标准曲线，6种有机酸的线性回归方程，相关系数，浓度线性范围见表1。

表1 6种有机酸的线性回归方程、相关系数及线性范围

2.5精密度试验：取混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积。结果草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的RSD分别为0.47％，0.34％，0.39％，0.56％，0.49％，0.43％，结果表明该方法精密度良好。

2.6稳定性试验：取半夏样品溶液，室温下放置0，2，4，6，8，12，24小时，按2.1项下色谱条件分别进样测定峰面积。结果草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的RSD分别为0.81％，0.78％，0.58％，1.03％，1.07％，0.79％，结果表明样品溶液24小时基本稳定，符合分析试验要求。

2.7重复性试验：按样品溶液配制方法平行配制6份，按2.1项下色谱条件进样分析，计算峰面积。草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的RSD分别为0.57％，0.65％，0.52％，0.94％，0.89％，0.54％。结果表明该方法具有良好重复性。

2.8加样回收率试验：称取已知含量的半夏药材粉末9份，每份约1.0g，分别精密加入半夏粉末中草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸含量的约80％、100％和120％的各有机酸单体对照品溶液，按样品溶液制备方法制备，按2.1项下色谱条件进样分析，草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的平均回收率分别为98.00％，97.88％，96.80％，97.46％，99.90％和100.8％，RSD分别为1.09％，0.78％，0.82％，0.93％，1.17％和1.08％。结果表明该方法具有良好的可靠性和准确性。

2.9 10个不同产地半夏药材含量测定：取10个不同产地半夏样品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，代入标准曲线计算含量，结果草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的平均含量(μg/g)见表2。

3讨论

3.1半夏样品制备提取条件考察

半夏药材粉末经水超声提取后，先滴加氨水碱化水提液，用乙酸乙酯萃取除去碱性杂质，再滴加磷酸酸化碱水液，用乙酸乙酯提取出有机酸类物质，作者对碱化和酸化条件进行考察，考察不同pH值对有机酸测定的影响。结果发现碱化时调节pH在11.5-12.0范围内能很好的去除碱性杂质，碱性过低时杂质去除不完全，碱性过高氨水消耗过多。酸化碱液时调节pH在2.0-2.5范围内能很好的萃取出有机酸类成分，酸度过低，有机酸类成分提取不完全，酸度过高，磷酸消耗过多。

3.2流动相pH值的选择

考察了流动相pH值在3.2，2.8，2.4，2.0时对混合对照品和半夏样品中各有机酸分离情况的影响，结果表明：当流动相pH值为较高时，各种有机酸之间的分离度不够理想，影响测定的准确度，随着pH值的降低，当调节流动相的pH值为2.0时，各种有机酸之间能够得到理想的分离，且在色谱柱允许的酸性范围内。

3.3流动相中缓冲液种类的选择

分别选择(NH₄)H₂PO₄，KH₂PO₄作为流动相中的缓冲盐，考察不同种类的缓冲盐对各种各有机酸分离度的影响，结果表明：当选择KH₂PO₄作为缓冲盐时，色谱峰出现拖尾峰，宽峰，当选择(NH₄)H₂PO₄作为缓冲盐时，各种有机酸的峰形较好，分离度较好。

3.4流动相中甲醇比例的选择

在其他色谱条件保持不变的情况下，分别选择流动相中甲醇的比例为2％，2.5％，3％，3.5％，4％，结果表明，当甲醇比例为3％时，有机酸，特别是琥珀酸，苹果酸能够与样品中的其他物质得到较好的分离。

实施例2

2.3样品溶液制备：称取干燥的半夏药材粉末2.0g，精密称定，加入40mL水，称定重量，超声，300W，25kHz，提取2次，每次2h，放至室温，再称定重量，用水补足减失的重量，提取液用砂芯布什漏斗过滤，合并滤液置100mL容量瓶中，加水定容，精密量取滤液20mL于小烧杯中，滴加氨水调pH为11.5，用提取液3倍量的乙酸乙酯萃取3次，收集碱水液，再滴加磷酸调pH为2.0，以3倍量的乙酸乙酯萃取5次，收集乙酸乙酯，旋转蒸发挥干，加超纯水溶解并定容至25mL，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即为样品溶液。

2.5精密度试验：草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的RSD分别为0.56％，0.41％，0.58％，0.39％，0.44％，0.65％，结果表明该方法精密度良好。

2.6稳定性试验：草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的RSD分别为0.76％，0.82％，0.74％，1.08％，0.96％，1.11％，结果表明样品溶液24小时基本稳定，符合分析试验要求。

2.7重复性试验：草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的RSD分别为0.77％，0.68％，0.65％，0.88％，0.91％，0.82％。结果表明该方法具有良好重复性。

其余操作同实施例1。

实施例3

2.3样品溶液制备：称取干燥的半夏药材粉末2.0g，精密称定，加入40mL水，称定重量，超声，300W，25kHz，提取2次，每次2h，放至室温，再称定重量，用水补足减失的重量，提取液用砂芯布什漏斗过滤，合并滤液置100mL容量瓶中，加水定容，精密量取滤液20mL于小烧杯中，滴加氨水调pH为12.0，用提取液3倍量的乙酸乙酯萃取3次，收集碱水液，再滴加磷酸调pH为2.0，以3倍量的乙酸乙酯萃取5次，收集乙酸乙酯，旋转蒸发挥干，加超纯水溶解并定容至25mL，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即为样品溶液。

2.5精密度试验：草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的RSD分别为0.48％，0.39％，0.44％，0.51％，0.38％，0.55％，结果表明该方法精密度良好。

2.6稳定性试验：草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的RSD分别为0.88％，0.79％，1.03％，1.21％，1.33％，1.09％，结果表明样品溶液24小时基本稳定，符合分析试验要求。

2.7重复性试验：结果草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的RSD分别为0.87％，0.75％，0.84％，0.91％，0.79％，0.88％。结果表明该方法具有良好重复性。

其余操作同实施例1。

实施例4

2.4样品溶液制备：称取干燥的半夏药材粉末2.0g，精密称定，加入40mL水，称定重量，超声，300W，25kHz，提取2次，每次2h，放至室温，再称定重量，用水补足减失的重量，提取液用砂芯布什漏斗过滤，合并滤液置100mL容量瓶中，加水定容，精密量取滤液20mL于小烧杯中，滴加氨水调pH为12.0，用提取液3倍量的乙酸乙酯萃取3次，收集碱水液，再滴加磷酸调pH为2.5，以3倍量的乙酸乙酯萃取5次，收集乙酸乙酯，旋转蒸发挥干，加超纯水溶解并定容至25mL，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即为样品溶液。

2.5精密度试验：草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的RSD分别为0.33％，0.55％，0.49％，0.77％，0.41％，0.61％，结果表明该方法精密度良好。

2.6稳定性试验：草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的RSD分别为1.01％，0.98％，0.79％，1.09％，1.19％，0.88％，结果表明样品溶液24小时基本稳定，符合分析试验要求。

2.7重复性试验：草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的RSD分别为1.03％，0.94％，0.89％，0.84％，0.77％，0.69％。结果表明该方法具有良好重复性。

其余操作同实施例1。

Claims

1.一种同时测定半夏中6种有机酸含量的HPLC方法，其特征在于以下步骤：

(1)样品溶液的制备：称取干燥的半夏药材粉末2.0g，精密称定，加入40mL水，称定重量，超声，300W，25kHz，提取2次，每次2h，放至室温，再称定重量，用水补足减失的重量，提取液用砂芯布什漏斗过滤，合并滤液置100mL容量瓶中，加水定容，精密量取滤液20mL于小烧杯中，滴加氨水调pH在11.5-12范围内，每次用提取液3倍量的乙酸乙酯萃取，共萃取3次，收集碱水液，再滴加磷酸调pH在2.0-2.5范围内，每次用碱水液3倍量的乙酸乙酯萃取，共萃取5次，收集乙酸乙酯，旋转蒸发挥干，加超纯水溶解并定容至25mL，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液，即为样品溶液；

(2)对照品溶液的制备：分别精密称取草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸对照品适量，加水溶解，制得含有草酸、甲酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸的混合对照品溶液；

(3)高效液相色谱测定：将对照品溶液和样品溶液进行高效液相色谱测定，色谱柱为GLInterSustain-C₁₈，流动相为磷酸调节pH为2.0的0.03mol·L^-1(NH₄)H₂PO₄缓冲液和甲醇，体积比为97∶3，流速0.8mL·min^-1，柱温30℃，检测波长210nm，对照品溶液和样品溶液各进样20μL，采用标准曲线法定量，色谱图记录与处理由工作站完成，理论塔板数按草酸峰计算不低于3000。