CN110850003B - 琥珀酸亚铁中杂质丁二酸的分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种琥珀酸亚铁中杂质丁二酸的分离方法，该方法为采用高效液相色谱法，使用C18或C8色谱柱，用磷酸盐缓冲液、甲醇的混合液为流动相对供试品进行洗脱，该方法还包括供试品的配制方法，使用非质子溶剂提取琥珀酸亚铁中的丁二酸，挥干后用酸性水溶液作为稀释剂配制。使用该方法检测琥珀酸亚铁中的丁二酸快速、灵敏、准确率、精密度高，解决了使用现有技术检测结果虚高的问题。

Description

琥珀酸亚铁中杂质丁二酸的分离方法

技术领域

本发明属于医药分析领域，特别涉及一种琥珀酸亚铁中杂质丁二酸的检测方法。

背景技术

琥珀酸亚铁（Ferrous Succinate）主要成分为琥珀酸亚铁，主要用于缺铁性贫血的预防和治疗。琥珀酸亚铁铁元素含量高，接近硫酸亚铁的2倍，琥珀酸还能增高Fe²⁺的吸收率，所以铁的生物利用度高。琥珀酸亚铁片在胃肠道内释放较缓慢，对胃肠道刺激性小，副作用少而轻，是指南推荐口服铁剂一线用药。

丁二酸有名琥珀酸，琥珀酸亚铁的合成过程中会用到六水合丁二酸二钠，多余的六水合丁二酸二钠在水中会转化为丁二酸，是琥珀酸亚铁中的一个杂质。同时，琥珀酸亚铁在水存在的状态下也会少量水解产生丁二酸，因而在制备琥珀酸亚铁片的过程中，也有可能降解产生丁二酸。

所以需在琥珀酸亚铁原料药中检测丁二酸，考察该杂质在琥珀酸亚铁中的残留量。同时需在琥珀酸亚铁片中检测丁二酸，考察制剂工艺是否会降解产生丁二酸及监控丁二酸的水平。

琥珀酸亚铁在水或乙醇中几乎不溶，在稀盐酸中溶解，解离成琥珀酸根离子和亚铁离子。当采用液相色谱法测定丁二酸时，如存在丁二酸根离子，也会被检出，导致无法准确定量杂质丁二酸的含量，所以如何只检测到琥珀酸亚铁及制剂中本身存在的丁二酸，而非琥珀酸亚铁在检测过程中自行游离产生的丁二酸，而造成检测结果虚高的问题，是一个难题。

目前暂未见到有琥珀酸亚铁及制剂中丁二酸检测的报道。

专利CN109580821A报道了一种S-苄基琥珀酸中杂质丁二酸的检测方法，该方法采用高效液相色谱法，色谱柱为氰基柱，甲醇与0.1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱。该方法无法解决琥珀酸亚铁中丁二醇虚高的问题。

美国药典USP（40）和文献“HPLC法测定九节菖蒲中琥珀酸含量”中有关于丁二酸的检测方法， 参照USP（40）方法检测琥珀酸亚铁片中丁二酸，发现空白/样品处理过程中容易引入杂质峰干扰丁二酸的检测，尤其在琥珀酸亚铁供试品图谱中干扰严重，杂质峰与丁二酸达不到基线分离，丁二酸保留时间为6.249min，见附图3。参照文献方法，采用色谱柱C18（4.6*250mm，5μm）、流速为0.6ml/min、柱温为25℃，进行空白、丁二酸对照品和供试品检测，结果显示由空白/样品处理过程中偶尔引入的杂质峰与琥珀酸能达到基线分离，但是两个峰仍紧紧相邻，丁二酸峰保留时间为9.208min，见附图4。

因此研究出合适的方法能准确的检测和分离出琥珀酸亚铁中的丁二酸对琥珀酸亚铁的药品质量控制非常重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测和分离琥珀酸亚铁中的杂质丁二酸方法，该方法能对准确的检索琥珀酸亚铁中杂质丁二酸的含量，并能有效、快速的分离。

本发明的技术方案是：采用高效液相色谱法分离琥珀酸亚铁中杂质丁二酸，色谱柱为C18或C8色谱柱，用磷酸盐缓冲液、甲醇的混合液为流动相对供试品进行洗脱。

色谱条件如下表：

进一步，本发明还包括供试品的配制方法：

使用非质子溶剂提取琥珀酸亚铁中的丁二酸，挥干后，用酸性水溶液或水作为稀释剂配制供试品；

其中非质子溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和丙酮中的一种或几种，优选甲醇；

酸性水溶液为磷酸盐缓冲液溶液，优选为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠溶液中的一种或几种。

本发明的具体操作步骤如下：

1、供试品的配制：取琥珀酸亚铁200mg，精密称定，加适量甲醇浸泡数分钟，滤过，多次洗涤，滤过，滤液经浓缩至干，加水溶解残留物，多次洗涤，定量转移置10ml量瓶中，并用水稀释至刻度，摇匀；

2、对照品的配制：取丁二酸对照品适量，精密称定，用水定量稀释制成每1ml中约含丁二酸20μg的溶液，作为对照品溶液；

3、取步骤1和步骤2的供试品和对照品进行高效液相色谱法检测，检测条件为本发明色谱条件。

4、按照外标法，以峰面积计算丁二酸的含量。

本发明所述的琥珀酸亚铁包括琥珀酸亚铁原料药和琥珀酸亚铁制剂，琥珀酸亚铁制剂优选片剂、胶囊剂、颗粒剂、干混悬剂和缓释片剂。

采用本发明检测和分离琥珀酸亚铁中的杂质丁二酸有如下优势：

1、按照本发明方法配制的供试品既没让琥珀酸亚铁解离，又能溶解供试品中可能存在的丁二酸或丁二酸二钠，解决了检测结果虚高的问题；

2、按照本发明方法检测琥珀酸亚铁中的杂质丁二酸分离度好、灵敏度、精确度高；

3、琥珀酸亚铁为治疗缺铁性贫血的常用药物，使用人群广泛，本发明首次建立了琥珀酸亚铁中杂质丁二酸的检测方法，对琥珀酸亚铁的质量控制和用药安全非常重要。

附图说明

图1为实施例1供试品①色谱图；

图2为实施例1供试品②色谱图；

图3为实施例2供试品溶液色谱图；

图4为实施例3供试品溶液色谱图；

图5为实施例4供试品溶液色谱图；

图6为实施例5供试品溶液色谱图；

图7为实施例6供试品溶液色谱图；

图8为实施例7供试品溶液色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

本发明所用的试剂和原料均市售可得。

实施例1供试品溶液配制方法研究

供试品溶液①：精密称取琥珀酸亚铁原料药约10mg置10ml量瓶中，用pH3.0磷酸溶液（在1000ml水中加磷酸0.7ml，用0.42%氢氧化钠溶液调节pH值至3.0）-甲醇（95:5）稀释至刻度，摇匀，0.45μm滤膜过滤即得。

供试品溶液②：精密称取琥珀酸亚铁原料药约10mg置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45μm滤膜过滤即得。

取供试品溶液①和②按照以下色谱条件进样，记录色谱图。

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（250mm×4. 6mm，5μm)；以磷酸溶液（在1000ml水中加磷酸0.7ml，用0.42%氢氧化钠溶液调节p H 值至3 .0 )为流动相A；甲醇为流动相B； 流速为每分钟1.2ml；检测波长为210mn；进样量为10μl。按下表进行梯度洗脱。

实验结果可知供试品溶液①图谱中丁二酸（即琥珀酸）峰较大，而供试品溶液②图谱中丁二酸峰几乎未检出。结合琥珀酸亚铁的分子式及结构可知，琥珀酸亚铁由琥珀酸根离子与亚铁离子组合而成，在水溶液中容易解离为琥珀酸根离子和亚铁离子，从而导致琥珀酸检测值虚高。故提取琥珀酸亚铁中游离丁二酸的溶剂优选不能让琥珀酸亚铁解离的非质子溶剂。

实施例2：参照美国药典USP（40）方法检测琥珀酸亚铁中丁二酸

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（250mm×4. 6mm，5μm)；以0.025M磷酸二氢钾缓冲溶液（在2000ml水中加磷酸二氢钾6.8g，用磷酸调节p H 值至2.3 )-甲醇（92:8）为流动相； 流速为每分钟1.0ml；检测波长为210mn；进样量为20μl。

供试品溶液：取琥珀酸亚铁200mg，精密称定，加适量甲醇浸泡数分钟，滤过，多次洗涤，滤过，滤液经浓缩至干，加水溶解残留物，多次洗涤，定量转移置10ml量瓶中，并用水稀释至刻度，摇匀；

采用该方法检测，发现空白/样品处理过程中容易引入杂质峰干扰琥珀酸的检测，尤其在琥珀酸亚铁供试品图谱中干扰严重，杂质峰与丁二酸达不到基线分离，丁二酸保留时间为6.249min，参见附图3。

实施例3：参照文献“HPLC法测定九节菖蒲中琥珀酸含量”方法检测琥珀酸亚铁中丁二酸

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（250mm×4. 6mm，5μm)；以0.02M磷酸二氢钾缓冲溶液（在1000ml水中加磷酸二氢钾2.72g，用磷酸调节p H 值至2.5 )-甲醇（95:5）为流动相； 流速为每分钟0.6ml；检测波长为210mn；进样量为10μl。

供试品溶液：取琥珀酸亚铁200mg，精密称定，加适量甲醇浸泡数分钟，滤过，多次洗涤，滤过，滤液经浓缩至干，加水溶解残留物，多次洗涤，定量转移置10ml量瓶中，并用水稀释至刻度，摇匀；

采用该方法检测，发现空白/样品处理过程中偶尔引入的杂质峰与琥珀酸能达到基线分离，但是两个峰仍紧紧相邻，丁二酸峰保留时间为9.208min，参见附图4。

实施例4 本发明方法检测琥珀酸亚铁原料药中丁二酸

色谱条件：

色谱仪：岛津LC20AT高效液相色谱仪 色谱柱：InertSustain C18（4.6×250mm，5μm）、流动相：磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钾2.72g，加水溶解并稀释至1000ml，用磷酸调节pH值至2.8）－甲醇（95∶5）、柱温：25℃；检测波长：210nm；流速：0.6ml/min；进样量：20μl；采集时间：20min

试验方法：

供试品溶液配制：取琥珀酸亚铁原料药约200mg，精密称定，加适量甲醇浸泡数分钟，滤过，多次洗涤，滤过，滤液经浓缩至干，加水溶解残留物，多次洗涤，定量转移置10ml量瓶中，并用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

对照品溶液配制：取丁二酸对照品适量，精密称定，用水定量稀释制成每1ml中约含丁二酸20μg的溶液，作为对照品溶液。

照上述色谱条件用高效液相色谱法（中国药典2015年版四部通则0512）测定。记录色谱图得附图5。

根据附图5可知，保留时间12.078min的峰为丁二酸，杂质丁二酸分离度好。

实施例5本发明方法检测琥珀酸亚铁片中丁二酸

色谱条件：与实施例4色谱条件一致，色谱柱为WondaSil C18（4.6×250mm，5μm）

试验方法：

供试品溶液配制：取琥珀酸亚铁片20片，除去薄膜衣，精密称定，研细，取适量（相当于琥珀酸原料药约200mg），精密称定，置小瓶中，用5ml乙腈提取，提取液经0.45μm滤头过滤，用乙腈多次洗涤样品及容器，过滤，合并滤液挥干，用磷酸氢二钠水溶解残留物并多次洗涤，定量转移至10ml量瓶中，用磷酸氢二钠水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

对照品溶液配制：取丁二酸对照品适量，精密称定，用磷酸氢二钠水定量稀释制成每1ml中约含丁二酸20μg的溶液，作为对照品溶液。

照上述色谱条件用高效液相色谱法（中国药典2015年版四部通则0512）测定。记录色谱图得附图6。

根据附图6可知，保留时间10.576min的峰为丁二酸，杂质丁二酸分离度好。

实施例6：本发明方法检测琥珀酸亚铁胶囊中丁二酸

色谱条件：与实施例4色谱条件一致

试验方法：

供试品溶液配制：取琥珀酸亚铁胶囊20颗，取内容物，研细，取适量（相当于琥珀酸原料药约200mg），精密称定，置小瓶中，用5ml丙酮提取，提取液经0.45μm滤头过滤，用丙酮多次洗涤样品及容器，过滤，合并滤液挥干，用磷酸二氢钾水溶解残留物并多次洗涤，定量转移至10ml量瓶中，用磷酸二氢钾水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

对照品溶液配制：取丁二酸对照品适量，精密称定，用磷酸二氢钾水定量稀释制成每1ml中约含丁二酸20μg的溶液，作为对照品溶液。

照上述色谱条件用高效液相色谱法（中国药典2015年版四部通则0512）测定。记录色谱图得附图7。

根据附图7可知，保留时间11.875min的峰为丁二酸，杂质丁二酸分离度好。

实施例7：本发明方法检测琥珀酸亚铁缓释片中丁二酸

色谱条件：与实施例4色谱条件一致

试验方法：

供试品溶液配制：取琥珀酸亚铁缓释片20片，精密称定，研细，取适量（相当于琥珀酸原料药约200mg），精密称定，置小瓶中，用5ml异丙醇提取，提取液经0.45μm滤头过滤，用异丙醇多次洗涤样品及容器，过滤，合并滤液挥干，用水溶解残留物并多次洗涤，定量转移至10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

对照品溶液配制：取丁二酸对照品适量，精密称定，用水定量稀释制成每1ml中约含丁二酸20μg的溶液，作为对照品溶液。

照上述色谱条件用高效液相色谱法（中国药典2015年版四部通则0512）测定。记录色谱图得附图8。

根据附图8可知，保留时间12.691min的峰为丁二酸，杂质丁二酸分离度好。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims (7)

1.一种高效液相色谱法分离琥珀酸亚铁中杂质丁二酸的方法，其特征在于，色谱柱为C18或C8色谱柱，用磷酸盐缓冲液、甲醇的混合液为流动相对供试品进行洗脱；

所述供试品的配制方法为：使用非质子溶剂提取琥珀酸亚铁中的丁二酸，挥干后，用酸性水溶液或水作为稀释剂配制供试品；

所述非质子溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈和丙酮中的一种或几种；

所述酸性水溶液为磷酸盐缓冲液溶液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相磷酸盐缓冲液和甲醇的体积比为95-90∶5-10，磷酸盐缓冲液pH值为2.7-2.9。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液溶液为磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠溶液中的一种或几种。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述琥珀酸亚铁包括琥珀酸亚铁原料药和琥珀酸亚铁制剂。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述琥珀酸亚铁制剂包括琥珀酸亚铁片、琥珀酸亚铁颗粒、琥珀酸亚铁缓释片。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，检测柱温为25-30℃，流速为0.5～1.0ml/min。

7.如权利要求1～6任一项所述的方法在药物杂质检测当中的应用。

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