CN100478685C

CN100478685C - 半夏水溶性指纹图谱的建立方法

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Publication number: CN100478685C
Application number: CNB2006102009203A
Authority: CN
Inventors: 周欣; 赵超; 陈华国; 汤洪波; 胡晓娜
Original assignee: Guizhou Education University
Current assignee: Guizhou Education University
Priority date: 2006-09-26
Filing date: 2006-09-26
Publication date: 2009-04-15
Anticipated expiration: 2026-09-26
Also published as: CN1932508A

Abstract

本发明提供了一种半夏水溶性指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱，包括供试品溶液的制备，对照品溶液的制备，用高效液相色谱仪测定，用指纹图谱软件对所得的数据和图谱进行处理，即得到半夏水溶性成分标准指纹图谱。与现有技术相比，本发明具有方法简便、稳定、精密度高以及重现性好等特点；水溶性成分的提取方法简单，时间短；所得水溶性指纹图谱的峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高，准确可靠；所建立的标准指纹图谱能有效地表征半夏药材的质量，为完整、准确评价半夏的质量提供了新的对照标准，为提高半夏及其成方制剂的质量和疗效做出贡献。

Description

半夏水溶性指纹图谱的建立方法

技术领域：

本发明涉及中药材的指纹图谱的建立方法，尤其是一种半夏水溶性高效液相色谱(HPLC)指纹图谱的建立方法，以及由此方法所得到的半夏水溶性成分标准指纹图谱。

背景技术：

我国传统的中药及其制剂大多缺乏严密的质量标准和科学的检测手段，难以有效的控制其内在质量，不能保证用药的安全、有效，也不符合国际医药市场的要求，严重制约了我国中药行业的发展。加强中药材质量控制研究是中药规范化、标准化的关键问题。只有对中药材进行科学的质量控制，才能保证中药质量，实现中药的“安全、有效、稳定、可控”。

半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit的干燥块茎，具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结之功。主产于四川、贵州、湖北、辽宁、河南、陕西、山西等地。半夏呈类球形，有的稍偏斜，直径1～1.5cm。表面白色或浅黄色，顶端有陷的茎痕，周围密布麻点状根痕；下面钝圆，较光滑。质坚实，断面洁白，富淀粉。气微、味辛辣、麻舌而刺喉。半夏中含有生物碱、甾醇类、氨基酸和无机元素等四类主要成分，但其含量均较低，其中甾醇类、氨基酸类和无机元素的测定对半夏药材质量控制的专属性差。生物碱、有机酸被认为是半夏中的主要有效成分。目前，对半夏及其复方制剂的鉴定，往往是通过测定鸟苷、总生物碱或总有机酸的含量来判定的。而已知的半夏的化学成分有很多种，包括生物碱、β-谷甾醇、葡萄糖苷、胡萝卜苷、草酸钙、半夏蛋白、氨基酸、脂肪酸、无机元素、半夏胰蛋白酶抑制物、胆碱等。研究表明，半夏的多种化学成分有各种具体的药理作用；如果用一、二种活性成分来鉴定半夏及其复方制剂的内在质量，具有一定的片面性，不能真实反映半夏药效的整体性。要全面有效地控制半夏及其成方制剂的质量，必须对它的物质群整体予以控制。

中药指纹图谱是指某种中药材或中成药中所共有的、具有特征性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。在现阶段中药的有效成分绝大多数没有明确的情况下，指纹图谱对于有效控制中药材或中成药的质量，具有重要的意义。日本汉方药主要生产企业在20世纪80年代就采用高效液相指纹图谱控制质量。德国、法国在对银杏叶提取物的质量控制中亦采用高效液相指纹图谱方法。美国FDA近几年制定的植物草药指南中已经明确把指纹图谱作为混合物质群的质量控制方法。指纹图谱作为中草药及其提取物质量控制方法，目前已成为国际共识。而关于半夏指纹图谱的建立方法还未曾见报道。为了有效控制半夏药材的质量，使其质量控制技术更加完善、科学，申请人对半夏的水溶性物质进行了指纹图谱研究，建立了半夏水溶性提取物的指纹图谱测定方法。

发明内容：

本发明的目的在于：提供一种半夏水溶性指纹图谱的建立方法及其标准指纹图谱。本发明通过对半夏水溶性提取物HPLC指纹图谱的研究，提供了一种更好的半夏质量控制方法，弥补了现有质量控制技术的不足，使半夏药材的质量控制技术更为完善、科学。

本发明是这样实现的：半夏水溶性指纹图谱的建立方法包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取半夏药材粉碎，过筛，称取样品粉末，置磨口具塞三角瓶中，加水超声提取2～4次，离心，倾出上清液；合并上清液，水浴浓缩，定容，过滤，滤液作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：取对照品适量，加水制成对照品溶液；

(3)色谱条件：色谱柱为Agilent Technologies：Zorbax SB-C184.6×250mm，5μm，PN：880975-902；流动相为0.01％CH₃COOH溶液-CH₃OH，采用梯度洗脱；检测波长：254nm、286nm、296nm；

(4)测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，用高效液相色谱仪测定；将半夏供试品溶液注入高效液相色谱仪进行梯度洗脱，洗脱液进入DAD紫外检测器，检测器采集70min的检测数据；用指纹图谱软件对所得的数据和图谱进行处理，即得到半夏水溶性成分标准指纹图谱。

其中，供试品溶液的制备过程为：取半夏药材粉碎过40目筛，精密称取样品粉末约1.00g，置50mL磨口具塞三角瓶中，超声提取3次，每次加水10.00mL，超声提取10min，于3500r/min离心5min，倾出上清液；合并三次超声提取的上清液，水浴浓缩，定容至10.00mL容量瓶中，过0.45um滤膜，即得。

对照品溶液的制备为：精确称取鸟苷对照品，加入蒸馏水制成每1ml含10ug的对照品溶液。

步骤(4)中分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10uL。

按照上述半夏水溶性指纹图谱的建立方法得到的半夏水溶性成分标准指纹图谱。

所述标准指纹图谱中的共用峰不得少于11个。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明以半夏水溶性提取物建立起来的HPLC指纹图谱，代表着半夏大部分药理活性，能有效地表征半夏药材的质量。提供了一种半夏药材的科学评价方法，可作为半夏药材质量检测和质量控制的标准指标之一。

2.将半夏指纹图谱作为一个整体看待，注重其整体面貌特征，既避免了只测定一、二个化学成分来判定半夏整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性。本发明为完整、准确评价半夏的质量提供了新的对照标准，为提高半夏及其成方制剂的质量和疗效做出贡献。

3.本发明具有方法简便、稳定、精密度高以及重现性好等特点。由于指纹图谱不是为了测定某个成分的精确含量，而是要充分反映化学成分的信息。因此，本发明同时在254nm、286nm、296nm三个波长处进行测定，其出峰较多，反映的信息较完全。这是与现有方法的不同之处。

4.以往为测定半夏中某种化学成分的含量，往往要对样品进行较复杂的处理，而本发明选用超声提取其水溶性成分，提取方法简单，时间短，节约了检验的成本和时间。

5.本发明方法所得水溶性指纹图谱的峰多，峰形好，易于鉴别，相似性高，准确可靠。

下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明。

附图说明：

图1是以CH₃OH-H₂O为流动相的色谱图。

图2是以CH₃CN-H₂O为流动相的色谱图。

图3是以CH₃CN-0.01％H₃PO₄为流动相的色谱图。

图4是以CH₃OH-0.01％CH₃COOH为流动相的色谱图。

图5是用色谱柱①Spherisorb C18，PN：14201030得到的色谱图。

图6是用色谱柱②Hypersil ODS2，PN：13120520183得到的色谱图。

图7是用色谱柱③Zorbax SB-C18，PN：880975-902得到的色谱图。

图8是用色谱柱④Zorbax RX-C18，PN：88097-902得到的色谱图。

图9是254nm波长进行测定的色谱图。

图10是286nm波长进行测定的色谱图。

图11是296nm波长进行测定的色谱图。

图12是340nm波长进行测定的色谱图。

图13是360nm波长进行测定的色谱图。

图14是半夏水溶性成分的DAD全扫描3D图。

图15是半夏水溶性成分(254nm)HPLC指纹图谱。

图16是半夏水溶性成分(286nm)HPLC指纹图谱。

图17是半夏水溶性成分(296nm)HPLC指纹图谱。

图18是半夏水溶性成分精密度试验指纹图谱的叠加图。

图19是半夏水溶性成分稳定性试验指纹图谱的叠加图。

图20是半夏水溶性成分重现性试验指纹图谱的叠加图。

图21是254nm波长下的共有模式图(上图取均值的共有模式图，下图取中位值的共有模式图)。

图22是286nm波长下的共有模式图(上图取均值的共有模式图，下图取中位值的共有模式图)。

图23是296nm波长下的共有模式图(上图取均值的共有模式图，下图取中位值的共有模式图)。

具体实施方式：

本发明的实施例：半夏水溶性HPLC指纹图谱的建立方法及半夏水溶性成分标准指纹图谱

1.仪器与试药

1.1仪器

安捷伦1100高效液相色谱仪；安捷伦DAD检测器；安捷伦色谱工作站。

1.2试药

鸟苷对照品，购于中国药品生物制品鉴定所；乙腈，色谱纯；蒸馏水；针筒式微孔滤膜过滤器，直径13mm，0.45um；半夏药材

2.方法与结果

2.1提取方法和色谱条件的选择

2.1.1提取方法的选择

为了获得半夏水溶性部分的最佳条件，申请人对半夏水溶性部分的提取方法进行了正交实验。对半夏粉末粒径、加入溶剂体积、提取次数以及提取时间四个因素进行考察，以得到最佳的提取条件，正交实验因素水平表见表1。

表1正交实验因素水平表

序号	A单次超声提取时间(min)	B提取次数(次)	C每次加入溶剂体积(mL)	D半夏生药粒径(目)
序号	A单次超声提取时间(min)	B提取次数(次)	C每次加入溶剂体积(mL)	D半夏生药粒径(目)	1	10	1	10	60
2	20	2	20	40	1	10	1	10	60
2	20	2	20	40	3	30	3	30	20

按表1中的A、B、C、D四个考察因素，各取4个水平，按照L9(34)正交表安排试验。称取半夏粉末1.00g，超声提取，并检测提取液的鸟苷的含量。正交实验及数据结果见表2，方差分析见表3。

表2正交表L9(34)

RD＞RB＞RC＞RA，最佳提取条件为A1、B3、C1、D2。

表3方差分析表

B、C、D均有显著性差异。

采用鸟苷的含量作为考察指标，对影响半夏水溶性部分提取的因素进行了分析。通过对表2中的R值分析得知，4个因素对提取效率的影响次序为D＞B＞C＞A。而通过表3方差分析结果表明，提取次数、加入溶剂、半夏粒径对提取液中的鸟苷含量影响较大。通过正交实验可以确定半夏水溶性部分的提取条件为：A1、B3、C1、D2，即药材粉碎为40目，用10倍量的水，每次超声提取10分钟，共提取3次。

2.1.2流动相的确定

色谱指纹图谱试验条件应能满足指纹图谱的需要，不宜简单套用含量测定用的试验条件，流动相至少用三种不同组成进行比较，并从中选取最合适的色谱条件。为获取足以代表半夏水溶性成分特征的指纹图谱，共对以下四组流动相系统进行了选择。

第一组：CH₃OH-H₂O按不同梯度进行。

第二组：CH₃CN-H₂O按不同梯度进行。

第三组：CH₃CN-0.01％H₃PO₄按不同梯度进行。

第四组：CH₃OH-0.01％CH₃COOH按不同梯度进行。

所得结果见附图1、图2、图3和图4。由图1～图4可见，第四组流动相的分离效果最好，故选择CH₃OH-0.01％CH₃COOH作为流动相。

2.1.3色谱柱的选择

指纹图谱的研究一般需用三根以上不同生产厂家的柱子进行比较，经比较试验后应固定色谱柱来源与规格。实验过程中申请人采用四根不同厂家的柱子：①江苏汉邦科技有限公司：Spherisorb C18(4.0×250mm，5μm，PN：14201030)；②大连依利特科学仪器有限公司：Hypersil ODS2(4.6×250mm，5μm，PN：13120520183)；③Agilent Technologies：Zorbax SB-C18(4.6×250mm，5μm，PN：880975-902)；④Agilent Technologies：ZorbaxRX-C18(5μm，4.6×250mm，PN：88097-902)，在所选定的色谱条件下进行测定，结果表明柱③的分离效果最好，柱效较高，故选择柱③进行半夏药材水溶性成分指纹图谱的检测。以254nm波长下检测的色谱图进行比较，见附图5、图6、图7和图8。比较发现，柱③的色谱图中各峰分离较好；峰形尖锐，对称性好。故选择③号柱。

2.1.4检测波长的确定

进行指纹图谱研究的检测波长不是为了测定某一特定成分含量，所以单一的波长并不一定完全适合指纹图谱的需要，为了获取多层次的信息，在检测波长的确定过程中选择了254nm、286nm、296nm、340nm、360nm五个波长同时进行测定，色谱图见附图9、图10、图11、图12和图13。

同时还利用DAD二极管阵列检测器的全波长扫描功能对半夏药材水溶性成分的最大吸收波长进行选择，见附图14。结果在波长254nm、286nm、296nm下出现的色谱峰最多，且基线平稳，故选择这三个波长作为半夏药材水溶性成分HPLC指纹图谱的检测波长。

经过反复考察和实验，最终确定了水溶性成分指纹图谱的HPLC条件是：色谱柱ZorbaxSB-C18，PN：880975-902；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；DAD检测器波长：254nm、286nm、296nm三个波长；流动相梯度洗脱程序如表4。

表4流动相梯度洗脱程序

Time(min)	MeOH％	0.01％CH<sub>3</sub>COOH
Time(min)	MeOH％	0.01％CH<sub>3</sub>COOH	00	3	97
18	3	97	00	3	97
18	3	97	30	40	60
40	50	50	30	40	60
40	50	50	60	95	5
70	95	5	60	95	5

2.2供试品溶液的制备：

取半夏药材粉碎过40目筛，精密称取各样品粉末约1.00g，置50mL磨口具塞三角瓶中，分别加水10.00mL，超声提取10min，于3500r/min离心5min，倾出上清液；残渣加水10.00mL，超声10min，同上离心，倾出上清液；残渣继续加水10.00mL，超声10min，同上离心，倾出上清液。合并三次超声提取的上清液，水浴浓缩，定容至10.00mL容量瓶中，过0.45um滤膜，备用。

2.3检测得到的色谱图

供试品溶液用高效液相色谱仪进行检测，得到254nm、286nm、296nm三个波长的典型的HPLC色谱图，见附图15、图16和图17。其中，通过对照品溶液(测定条件与供试品溶液相同)在高效液相色谱仪中的测定，确定了对照品鸟苷在指纹图谱中的位置，如附图15、图16和图17中所标记的1号峰就是对照品鸟苷在指纹图谱中的位置。

2.4精密度考察

取四川遂宁的生半夏粉末1.00g制备样品溶液，连续进样6次，测定半夏水溶性成分的精密度。检测指纹图谱见附图18。

采用国家食品药品监督管理局推荐的中药色谱指纹图谱的相似度计算软件进行计算得六张图谱的共有模式，各指纹图谱的相关系数(均值或中位数)和相关系数(均值或中位数)均为0.90以上，结果见表5。相似度计算结果显示精密度良好。

表5半夏水溶性成分精密度试验的相似性分析结果

样品来源	相关系数(中位数)	相关系数(均值)	相关系数(中位数)	相关系数(均值)
样品来源	相关系数(中位数)	相关系数(均值)	相关系数(中位数)	相关系数(均值)	四川遂宁	0.9988	0.9893	0.9872	0.9996
四川遂宁	0.9882	0.9991	0.9991	0.9798	四川遂宁	0.9988	0.9893	0.9872	0.9996
四川遂宁	0.9882	0.9991	0.9991	0.9798	四川遂宁	0.9946	0.9939	0.9956	0.9965
四川遂宁	0.9970	0.9966	0.9985	0.9948	四川遂宁	0.9946	0.9939	0.9956	0.9965
四川遂宁	0.9970	0.9966	0.9985	0.9948	四川遂宁	0.9990	0.9994	0.9965	0.9977
四川遂宁	0.9987	0.9991	0.9986	0.9991	四川遂宁	0.9990	0.9994	0.9965	0.9977

2.5稳定性考察

取四川遂宁的生半夏粉末1.00g制备样品溶液按3.4.3建立的方法进行测定，分别在0h，2h，4h，6h，8h，10h，12h后进样，检测指纹图谱，见附图19。

采用国家食品药品监督管理局推荐的中药色谱指纹图谱的相似度计算软件进行计算得七张图谱的共有模式，相似度计算结果见表6。

表6半夏水溶性成分稳定性试验的相似性分析结果

样品来源	相关系数(中位数)	相关系数(均值)	相关系数(中位数)	相关系数(均值)
样品来源	相关系数(中位数)	相关系数(均值)	相关系数(中位数)	相关系数(均值)	四川遂宁	0.9995	0.9993	0.9990	0.9995
四川遂宁	0.9985	0.9986	0.9988	0.9978	四川遂宁	0.9995	0.9993	0.9990	0.9995
四川遂宁	0.9985	0.9986	0.9988	0.9978	四川遂宁	0.9981	0.9982	0.9982	0.9954
四川遂宁	0.9948	0.9955	0.9978	0.9951	四川遂宁	0.9981	0.9982	0.9982	0.9954
四川遂宁	0.9948	0.9955	0.9978	0.9951	四川遂宁	0.9941	0.9947	0.9956	0.9927
四川遂宁	0.9936	0.9944	0.9913	0.9910	四川遂宁	0.9941	0.9947	0.9956	0.9927
四川遂宁	0.9936	0.9944	0.9913	0.9910	四川遂宁	0.9916	0.9928	0.9875	0.9851

对照共有模式，各指纹图谱的相关系数(均值或中位数)和相关系数(均值或中位数)均为0.90以上，结果显示半夏水溶性成分稳定性结果在12h内比较稳定。这也要求处理样品后要在12h内进行测试。

2.6重现性考察

取四川遂宁的生半夏粉末1.0g平行制备5份溶液按3.4.3建立的方法进行测定，测定半夏水溶性成分的重现性。检测指纹图谱，见附图20。

采用国家食品药品监督管理局推荐的中药色谱指纹图谱的相似度计算软件计算得5张图谱的共有模式，相似度计算结果见表7。

表7半夏水溶性成分重现性试验的相似性分析结果

产地	相关系数(中位数)	相关系数(均值)	相合系数(中位数)	相合系数(均值)
产地	相关系数(中位数)	相关系数(均值)	相合系数(中位数)	相合系数(均值)	四川遂宁	0.9983	0.9989	0.9978	0.9989
四川遂宁	0.9992	0.9987	0.9992	0.9988	四川遂宁	0.9983	0.9989	0.9978	0.9989
四川遂宁	0.9992	0.9987	0.9992	0.9988	四川遂宁	0.9994	0.9992	0.9990	0.9981
四川遂宁	0.9989	0.9988	0.9986	0.9978	四川遂宁	0.9994	0.9992	0.9990	0.9981
四川遂宁	0.9989	0.9988	0.9986	0.9978	四川遂宁	0.9955	0.9970	0.9917	0.9948

对照共有模式，各自的相关系数(均值或中位数)和相似系数(均值或中位数)均在0.9以上，结果显示本实验重现性良好。

3.以上实验结果表明，应用该方法对半夏水溶性成分进行测定，方法简单可靠。建立的指纹图谱，峰形好，分离效果好，峰面积较大。可作为半夏水溶性成分的标准图谱。对半夏种植、生产的质量控制和半夏的鉴别提供了一个很好的方法。

4.同时，申请人还对12个不同产地的药材进行了指纹图谱的研究，经过软件的处理，得出了半夏水溶性指纹图谱在三个波长下的共有模式。见附图21、图22、图23。

Claims

1.一种半夏水溶性成分指纹图谱的建立方法，其特征在于：它包括以下步骤：

(2)对照品溶液的制备：取鸟苷对照品适量，加水制成对照品溶液；

(3)色谱条件：色谱柱为Agilent Technologies：Zorbax SB-C18 4.6×250mm，5μm，PN：880975-902；流动相为0.01％CH₃COOH溶液-CH₃OH，采用梯度洗脱；检测波长：254nm、286nm和296nm；

(4)测定：分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，用高效液相色谱仪测定；将半夏供试品溶液注入高效液相色谱仪进行梯度洗脱，梯度洗脱程序为：开始时，0.01％CH₃COOH相97％，CH₃OH相3％，稳定18min；到第30min时，0.01％CH₃COOH相60％，CH₃OH相40％；到第40min时，0.01％CH₃COOH相50％，CH₃OH相50％；到第60min时，0.01％CH₃COOH相5％，CH₃OH相95％，稳定10min；洗脱液进入DAD紫外检测器，检测器采集70min的检测数据；用指纹图谱软件对所得的数据和图谱进行处理，即得到半夏水溶性成分标准指纹图谱。

2.按照权利要求1所述半夏水溶性成分指纹图谱的建立方法，其特征在于：供试品溶液的制备过程为：取半夏药材粉碎过40目筛，精密称取样品粉末约1.00g，置50mL磨口具塞三角瓶中，超声提取3次，每次加水10.00mL，超声提取10min，于3500r/min离心5min，倾出上清液；合并三次超声提取的上清液，水浴浓缩，定容至10.00mL容量瓶中，过0.45μm滤膜，即得。

3.按照权利要求1所述半夏水溶性成分指纹图谱的建立方法，其特征在于：对照品溶液的制备为：精确称取鸟苷对照品，加入蒸馏水制成每1ml含10μg的对照品溶液。

4.按照权利要求1所述半夏水溶性成分指纹图谱的建立方法，其特征在于：步骤(4)中分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10μL。