CN105381458A

CN105381458A - 阳离子聚合物作为疫苗佐剂的应用

Info

Publication number: CN105381458A
Application number: CN201510971054.7A
Authority: CN
Inventors: 陈欢; 陈晓茜; 王玉连; 张玉彬
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2015-12-22
Filing date: 2015-12-22
Publication date: 2016-03-09

Abstract

本发明涉及一种阳离子聚合物作为疫苗佐剂的应用、相应的疫苗佐剂以及相应的疫苗组合物。该阳离子聚合物的制备方法为：将聚合物加入无水二甲亚砜中，加热搅拌溶解后冷却至25℃±5℃；加入N，N＇－羰基二咪唑进行反应以活化聚合物的羟基后，加入过量乙二胺进行反应；将反应混合物经纯化所得乙二胺偶联聚合物即为目标产物。该阳离子聚合物能显著提高抗原的免疫效应，适宜作为疫苗佐剂。

Description

阳离子聚合物作为疫苗佐剂的应用

技术领域

本发明涉及一种阳离子聚合物作为疫苗佐剂的应用，属于免疫学技术领域。

背景技术

据发明人所知，疫苗不仅是惠及世界范围的有效预防疾病的方法，也为某些慢性疾病如肿瘤、疟疾、乙型肝炎等提供了一种新型治疗策略。疫苗主要包括抗原(免疫原)和佐剂。根据作用机制的不同，疫苗佐剂通常可分为两类：第一类是免疫刺激剂，直接作用于免疫系统，通过激活免疫系统来增加和扩大对抗原免疫应答的效应，例如toll－likereceptor(TLR)配体，细胞因子等；第二类是作为有效的抗原输送系统，保护抗原免受降解，形成抗原储备库，有利于抗原的缓慢释放，并能被免疫细胞高效摄取，从而提高抗原的特异性免疫。

作为更安全的新型疫苗，如DNA疫苗、重组蛋白或多肽类疫苗等，由于分子量小，免疫原性比较弱，无法引起有效的免疫应答，尤其需要佐剂来增强其免疫原性或者增强宿主对抗原的保护性应答。

铝佐剂包括铝盐和氢氧化铝，它是第一个被美国FDA组织批准的用于人类的佐剂，已经广泛使用了八十多年；但它只能激发B细胞介导的体液免疫，不能引起T细胞介导的细胞免疫，而细胞免疫对肿瘤、疟疾、乙型肝炎等慢性疾病的防治尤为重要。

现有研究表明，TLR配体作为病原相关分子模式的识别分子，能被TLR识别并结合，将TLR配体与疫苗(抗原)组合后共同免疫，可显著提高疫苗的免疫效力，因此，TLR配体已成为疫苗研究的候选佐剂。现有研究还表明，由TLR－4诱导产生的IL－12是诱导Th1型免疫反应的主要细胞因子，细胞因子IL－12具有免疫佐剂功能，同核酸疫苗协同使用可明显增强体液及细胞免疫应答，但是细胞因子IL－12生产成本较高，作为佐剂难以得到广泛应用。此外，脂多糖是TLR－4的经典配体，但它会引起强烈的炎症反应和严重的毒副作用，因而不能作为一种安全有效的佐剂。

因此开发毒性低、免疫增强效应显著、安全有效且经济实惠的佐剂对疫苗的发展具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：克服现有技术存在的问题，提供一种阳离子聚合物作为疫苗佐剂的应用，能显著提高抗原的免疫效应。

本发明的主要技术构思如下：发明人经调研得知，阳离子聚合物是一类由富含氨基基团的结构单元重复聚合而成的大分子物质；这类聚合物溶于水后，氨基基团被质子化而使聚合物带正电；由于阳离子聚合物能与带负电的核酸相互作用，因此现有技术将其广泛用于核酸药物的传输。发明人经实践研究发现，有的阳离子聚合物具有免疫刺激效应，具备作为疫苗佐剂的前景。发明人经进一步深入地实践研究后终于得出了相应的技术方案。

本发明解决其技术问题的技术方案如下：

一种阳离子聚合物作为疫苗佐剂的应用，其特征是，所述阳离子聚合物由以下方法制得：将聚合物加入无水二甲亚砜中，加热搅拌溶解后冷却至25℃±5℃；加入N，N＇－羰基二咪唑进行反应以活化聚合物的羟基后，加入过量乙二胺进行反应；将反应混合物经纯化所得乙二胺偶联聚合物即为目标产物。

本发明还提供：

一种疫苗佐剂，其特征是，所述疫苗佐剂为阳离子聚合物；所述阳离子聚合物由以下方法制得：将聚合物加入无水二甲亚砜中，加热搅拌溶解后冷却至25℃±5℃；加入N，N＇－羰基二咪唑进行反应以活化聚合物的羟基后，加入过量乙二胺进行反应；将反应混合物经纯化所得乙二胺偶联聚合物即为目标产物。

优选地，加入无水二甲亚砜的聚合物为多糖；所述乙二胺偶联聚合物的元素分析结果中，N元素含量为至少5％。

更优选地，所述多糖选自葡聚糖，β－1，3－葡聚糖，琼脂糖，魔芋多糖。

优选地，加入N，N＇－羰基二咪唑后反应至少1小时；加入过量乙二胺后反应至少12小时。

优选地，反应产物的纯化方式为先透析或层析，再经冻干后将所得目标产物保存备用。

本发明还提供：

一种疫苗组合物，其特征是，由抗原和上述疫苗佐剂组成。

本发明还提供：

一种疫苗组合物的制备方法，其特征是，包括以下步骤：将抗原、上述疫苗佐剂分别溶解于缓冲液，将两者按预定比例混合均匀后，于4℃±3℃静置预定时间、使其充分复合，即得。

优选地，所述疫苗佐剂与抗原的重量比为(0.5－20)：1或(1－10)：1；所述预定比例为体积比(0.5－5)：1；所述预定时间为至少15分钟。

优选地，所述抗原为细菌性抗原或病毒性抗原；或者，所述抗原为肿瘤抗原；或者，所述抗原为卵清蛋白；或者，所述抗原为乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原或艾滋病毒抗原。

发明人在实践研究中发现，属于阳离子聚合物的乙二胺偶联聚合物，尤其是乙二胺偶联多糖，特别是乙二胺偶联的葡聚糖、β－1，3－葡聚糖、琼脂糖、魔芋多糖，均能有效激活细胞免疫反应、提高抗原的免疫效应、提高抗原特异性抗体的表达，显示出佐剂效应；通过简单混合即可与抗原复合，易操作；适用于多种给药方式(如腹腔注射、肌肉注射和皮下注射等)。同时，乙二胺偶联聚合物的制备方法简便可控，产物性质稳定，成本低廉；乙二胺偶联聚合物作为佐剂，生物相容性好，对抗原的免疫增强效应显著。

发明人经深入研究后认为，乙二胺偶联聚合物所带正电荷一方面能有效吸附蛋白类或DNA类抗原，保护抗原不被降解，另一方面还能刺激抗原提呈细胞(如树突状细胞)，通过有效激活细胞免疫反应来显著增强机体对抗原的免疫应答，从而实现佐剂效应。

附图说明

图1至图4分别为本发明实施例2中不同含N量的乙二胺偶联葡聚糖(70kDa)复合OVA分别经腹腔注射、皮下注射、肌肉注射三种给药方式对小鼠免疫后抗体滴度检测结果图。其中，图1为腹腔注射方式免疫小鼠的抗体滴度；图2为皮下注射方式免疫小鼠的抗体滴度；图3为肌肉注射方式免疫小鼠的抗体滴度；图4为皮下注射方式免疫小鼠IgG1与IgG2a抗体滴度比值

图5为本发明实施例2中不同分子量(10kDa，20kDa，40kDa，70kDa)的乙二胺偶联葡聚糖复合OVA经皮下注射对小鼠免疫后抗体滴度检测结果图。

图6、图7分别为本发明实施例2中乙二胺偶联葡聚糖(70kDa)经皮下注射免疫后小鼠体重变化。其中，图6为第一次免疫后三天中小鼠体重变化曲线；图7为第二次免疫后三天中小鼠体重变化曲线。

图8至图10为本发明实施例3中受免疫小鼠脾细胞增殖和细胞因子表达变化示意图。其中，图8为乙二胺偶联葡聚糖对受免疫小鼠脾细胞增殖的作用示意图；图9为OVA体外再刺激受免疫小鼠的脾细胞分泌IFN－γ的变化示意图；图10为OVA体外再刺激受免疫小鼠的脾细胞分泌IL－4的变化示意图。

图11、图12分别为本发明实施例4中乙二胺偶联葡聚糖体外对树突状细胞和脾细胞的刺激效应示意图。其中，图11为乙二胺偶联葡聚糖体外刺激树突状细胞分泌IL－12的变化示意图；图12为乙二胺偶联葡聚糖体外刺激树突状细胞分泌IFN－γ的变化示意图。

图13为本发明实施例5中乙二胺偶联的β－1，3－葡聚糖，乙二胺偶联的琼脂糖和乙二胺偶联的魔芋多糖复合OVA经皮下注射对小鼠免疫后抗体滴度检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法；试剂和材料，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。

实施例1制备乙二胺偶联葡聚糖

称取500mg葡聚糖(购自BioBasicInc公司，加拿大)，溶于25ml无水二甲亚砜(购自Sigma公司，美国)，加热搅拌溶解后冷却至25℃±5℃，即制得葡聚糖的二甲亚砜溶液；加入N，N＇－羰基二咪唑(CDI，购自Sigma公司，美国)搅拌反应至少1小时，以活化葡聚糖的羟基；加入2.5ml的无水乙二胺(购自Sigma公司，美国)，搅拌反应至少12小时；将反应混合物先经透析或层析、再经冻干后将所得乙二胺偶联葡聚糖保存备用；通过元素分析来检测乙二胺偶联葡聚糖中的含N量，含N量多少代表阳离子修饰程度高低。

其中，选择透析时，将反应混合物转入透析袋中，以双蒸水透析3天，每天换水2次。选择层析时，可采用凝胶柱层析。

具体试验案例如下表所示：

序号	葡聚糖分子量	CDI加入量	含N量％
				1	10kDa	1.0g	5.38
2	20kDa	1.0g	6.21
				3	40kDa	1.0g	5.77
4	70kDa	0.5g	2.21
				5	70kDa	1.0g	6.90
6	70kDa	2.0g	7.75

实施例2乙二胺偶联葡聚糖复合卵清蛋白对小鼠免疫后抗体滴度检测

1)试样及对照品与卵清蛋白的复合：

将乙二胺偶联葡聚糖(C－Dextran，C－Dex)、未修饰的葡聚糖(Dextran，Dex)、卵清蛋白(OVA，购自Sigma公司，美国)分别以PBS制成2mg/ml的溶液。然后，将乙二胺偶联葡聚糖溶液、未修饰的葡聚糖溶液、以及作为阳性对照的佐剂QuickAntibody(QA，购自北京博枫科生物科技有限公司)分别与卵清蛋白溶液等体积混合后，于4℃条件下静置15min，备用。

2)动物免疫：

选用6－8周龄的C57BL/6雌性小鼠，每组五只，分为以下多个实验组：PBS正常对照组，单独OVA阴性对照组(即PBS+OVA阴性对照组)，QA+OVA阳性对照组，C－Dex+OVA(不同分子量，不同阳离子修饰度)实验组以及Dex+OVA对照组。

选用腹腔注射、皮下注射、肌肉注射三种注射方式。

除PBS正常对照组外，每组的OVA注射剂量保持为100μg/只，每组注射体积均为100μl/只。一共免疫两次，每次间隔两周，定期观测小鼠体重变化。

3)抗体滴度测定：

第二次免疫2周后，眼眶取血，8000rpm，离心5min，获得血清，并梯度稀释后，用ELISA法测定特异性抗OVA的IgG，IgG2a和IgG1抗体滴度，抗体滴度定义为，各实验组与PBS正常对照组的ELISAOD比值≥2的最大稀释倍数。

结果如下：

如图1至图5所示，乙二胺偶联葡聚糖与OVA的复合物经腹腔注射、皮下注射、肌肉注射后，均能显著地提高免疫小鼠血清中OVA特异性抗体IgG的表达，且在一定范围内阳离子化程度越高，佐剂效应越明显。同时，该结果也显示，乙二胺偶联葡聚糖能使IgG1与IgG2a的抗体滴度比值下降，即乙二胺偶联葡聚糖能更显著地促进Th1型IgG2a亚型抗体的表达。当含N比例在5％以上时，不同分子量(包括10kDa，20kDa，40kDa，70kDa)的乙二胺偶联葡聚糖均能提高小鼠血清中OVA特异性抗体IgG的表达，显示出良好的佐剂效应。同时，如图6、图7所示，受免疫小鼠经注射免疫后，体重增长和PBS正常对照组无差别，初步表明乙二胺偶联葡聚糖在动物体内是低毒，安全的。

实施例3受免疫小鼠脾细胞增殖和细胞因子表达变化的测定

1)乙二胺偶联葡聚糖对受免疫小鼠脾细胞增殖的作用：

受免疫小鼠第二次免疫5天后，提取脾细胞进行培养，同时用5μg/mL刀豆蛋白(ConcanavalinA，ConA，购自Sigma公司，美国)刺激，并设置PBS空白对照组，刺激48h后，加MTT(购自Sigma公司，美国)继续培养4h。3000rpm，离心15min，弃去上清，每孔加入二甲亚砜150μL，暗处充分震荡，在570nm用酶标仪测定吸收值。

淋巴细胞刺激指数(Stimulationindex，SI)按下列公式计算，SI＝(实验组或阴性对照组OD₅₇₀－空白孔OD₅₇₀)/(空白对照组OD₅₇₀－空白孔OD₅₇₀)。

由图8可见，与单独OVA免疫的阴性对照组相比较，乙二胺偶联葡聚糖能显著促进ConA诱导的OVA受免疫小鼠的T淋巴细胞增殖反应。

2)OVA体外再刺激受免疫小鼠的脾细胞分泌细胞因子的测定：

受免疫小鼠第二次免疫5天后，提取脾细胞进行培养，同时用OVA(100μg/ml或200μg/ml)刺激，96小时后，收集细胞培养液，用ELISA方法测定IFN－γ和IL－4含量。如图9和图10所示，乙二胺偶联葡聚糖能促进0VA受免疫小鼠脾细胞分泌IFN－γ，而不影响其脾细胞分泌IL－4。

实施例4乙二胺偶联葡聚糖体外刺激树突状细胞和脾细胞

1)乙二胺偶联葡聚糖体外刺激树突状细胞：

提取小鼠骨髓干细胞，并进行富集培养。7天后，用流式细胞仪检测CD11c+比例，当CD11c+比例超过50％，说明树突状细胞诱导成功。然后将富集培养成功的树突状细胞分为三组，加入实施例1案例5的乙二胺偶联葡聚糖(C－dextran)或未修饰葡聚糖(Dex)的PBS溶液进行刺激，刺激浓度为25μg/ml或50μg/ml，并设置PBS阴性对照组，刺激4h后，收集细胞上清，ELISA法检测细胞因子IL－12。如图11所示，乙二胺偶联葡聚糖均能有效促进树突状细胞分泌IL－12，说明乙二胺偶联葡聚糖能刺激抗原提呈细胞，从而增强机体对抗原的免疫应答。

2)乙二胺偶联葡聚糖体外刺激脾细胞：

取上述制备好的脾细胞悬液(5×10⁶个/mL)加入24孔细胞培养板内，每孔500μl，同时加入实施例1案例5的乙二胺偶联葡聚糖(C－dextran)或未修饰葡聚糖(Dex)的PBS溶液进行刺激，刺激浓度为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml，并设置PBS阴性对照组，刺激48h后，收集细胞上清，用ELISA方法检测IFN－γ。如图12所示，乙二胺偶联葡聚糖能显著促进脾细胞分泌IFN－γ。IFN－γ是Th1型细胞因子，能够激活B细胞产生Th1型抗体，使得小鼠体内的IgG2a表达量升高。

实施例5制备乙二胺偶联的β－1，3－葡聚糖、乙二胺偶联的琼脂糖、乙二胺偶联的魔芋多糖，并检测其复合卵清蛋白对小鼠免疫后的抗体滴度

按照实施例1试验案例1的制备方法，将β－1，3－葡聚糖(β－1，3－Glucan，Glucan，购自sigma公司，美国)、琼脂糖(Agarose，购自BioBasicInc公司，加拿大)、魔芋多糖(KonjacGlucomannan，购自Megazyme公司，爱尔兰)分别制成乙二胺偶联的β－1，3－葡聚糖(C－Glucan)、乙二胺偶联的琼脂糖(C－Agarose)、乙二胺偶联的魔芋多糖(C－KonjacGlucomannan)。

按照实施例2方法，将乙二胺偶联的β－1，3－葡聚糖、乙二胺偶联的琼脂糖、乙二胺偶联的魔芋多糖分别复合卵清蛋白对小鼠经皮下注射方式免疫后，进行抗体滴度检测。如图13所示，这三种乙二胺偶联聚合物都能提高小鼠血清中OVA特异性抗体IgG的表达，具有佐剂效应。

除以上实施例外，本发明在具体实施时还涉及了其它实施条件，如：采用其他多糖进行乙二胺偶联，且保持元素分析含N量在5％以上；作为疫苗佐剂的乙二胺偶联聚合物在与抗原复合时，疫苗佐剂与抗原的重量比为(0.5－20)：1且优选(1－10)：1，抗原、疫苗佐剂缓冲液按体积比(0.5－5)：1混合均匀，于4℃±3℃静置至少15分钟；抗原除卵清蛋白外，还采用了肿瘤抗原、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、艾滋病毒抗原、以及其它的细菌性抗原或病毒性抗原。此处受篇幅所限，未列出上述其它实施条件下的具体试验数据。发明人根据以上所有具体实施方式的结果进行总结后认为：乙二胺偶联聚合物，尤其是乙二胺偶联多糖，保持元素分析含N量在5％以上，就能起到有效的佐剂效应，也即能作为疫苗佐剂来使用。

本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims

1.一种阳离子聚合物作为疫苗佐剂的应用，其特征是，所述阳离子聚合物由以下方法制得：将聚合物加入无水二甲亚砜中，加热搅拌溶解后冷却至25℃±5℃；加入N，N＇－羰基二咪唑进行反应以活化聚合物的羟基后，加入过量乙二胺进行反应；将反应混合物经纯化所得乙二胺偶联聚合物即为目标产物。

2.一种疫苗佐剂，其特征是，所述疫苗佐剂为阳离子聚合物；所述阳离子聚合物由以下方法制得：将聚合物加入无水二甲亚砜中，加热搅拌溶解后冷却至25℃±5℃；加入N，N＇－羰基二咪唑进行反应以活化聚合物的羟基后，加入过量乙二胺进行反应；将反应混合物经纯化所得乙二胺偶联聚合物即为目标产物。

3.根据权利要求2所述疫苗佐剂，其特征是，加入无水二甲亚砜的聚合物为多糖；所述乙二胺偶联聚合物的元素分析结果中，N元素含量为至少5％。

4.根据权利要求3所述疫苗佐剂，其特征是，所述多糖选自葡聚糖，β－1，3－葡聚糖，琼脂糖，魔芋多糖。

5.根据权利要求2所述疫苗佐剂，其特征是，加入N，N＇－羰基二咪唑后反应至少1小时；加入过量乙二胺后反应至少12小时。

6.根据权利要求2所述疫苗佐剂，其特征是，反应产物的纯化方式为先透析或层析，再经冻干后将所得目标产物保存备用。

7.一种疫苗组合物，其特征是，由抗原和权利要求2至6任一项所述疫苗佐剂组成。

8.一种疫苗组合物的制备方法，其特征是，包括以下步骤：将抗原、权利要求2至6任一项所述疫苗佐剂分别溶解于缓冲液，将两者按预定比例混合均匀后，于4℃±3℃静置预定时间、使其充分复合，即得。

9.根据权利要求8所述疫苗组合物的制备方法，其特征是，所述疫苗佐剂与抗原的重量比为(0.5－20)：1或(1－10)：1；所述预定比例为体积比(0.5－5)：1；所述预定时间为至少15分钟。

10.根据权利要求8所述疫苗组合物的制备方法，其特征是，所述抗原为细菌性抗原或病毒性抗原；或者，所述抗原为肿瘤抗原；或者，所述抗原为卵清蛋白；或者，所述抗原为乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原或艾滋病毒抗原。