CN110772632A

CN110772632A - 神经导向因子semaphorin 3a在制备治疗骨关节炎药物中的用途

Info

Publication number: CN110772632A
Application number: CN201911138747.2A
Authority: CN
Inventors: 黄石书; 周宗科; 吴迪伟; 杨帆; 王立平; 高大双
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2019-11-19
Publication date: 2020-02-11
Anticipated expiration: 2039-11-19
Also published as: CN110772632B

Abstract

本发明提供了神经导向因子semaphorin 3a在制备治疗骨关节炎药物中的用途。本发明还提供了一种新的治疗骨关节炎药物，该药物以semaphorin 3a为活性成分。本发明可以提高关节炎部位的软骨比例，实现关节炎的有效治疗，且能逆转关节炎的进程。本发明具有十分良好的应用前景。

Description

神经导向因子semaphorin 3a在制备治疗骨关节炎药物中的用途

技术领域

本发明涉及骨关节炎药物制备领域。

背景技术

骨关节炎(OA)为一种退行性病变，系由于增龄、肥胖、劳损、创伤、关节先天性异常、关节畸形等诸多因素引起的关节软骨退化损伤、关节边缘和软骨下骨反应性增生，又称骨关节病、退行性关节炎、老年性关节炎、肥大性关节炎等。临床表现为缓慢发展的关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。

目前，治疗骨关节炎的药物主要包括口服和局部应用的非甾体抗炎药(NSAID)，以及关节腔内注射用的透明质酸和类固醇制剂。

然而，口服非甾体抗炎药(NSAID)经常会导致胃肠道问题(尤其是对于老年患者)，长期使用通常伴有肾脏、肝脏和其他功能异常。此外，尽管类固醇可迅速改善症状，但由于频繁使用类固醇可能损害关节，所以应慎重考虑类固醇注射治疗。透明质酸制剂，在中国销售的

关节腔内注射制剂含鸡冠花来源的透明质酸钠，平均分子量为800,000道尔顿。虽然具有缓解疼痛、抗炎特性、关节活动度(ROM)改善、暂无严重药物不良反应等效应，但却无法抑制OA进程且仅对早期OA有效。

神经导向因子Semaphorin(SEMA)是一大类分泌型或跨膜型糖蛋白分子，参与机体多项重要生理过程的调节。“类风湿性关节炎的免疫学指标的应用研究进展，广西医学，第40卷第12期，2018年6月”公开了Sema7A可以作为类风湿性关节炎的诊断指标；“Inflammatory milieu cultivated Sema3A signaling promotes chondrocyteapoptosis in knee osteoarthritis.J Cell Biochem.2018Mar；119(3)：2891-2899”公开了Sema3A信号通路会导致软骨细胞凋亡，并提示阻断Sema3A的信号通路可以延缓骨关节炎的进程。但是目前尚未见使用SEMA直接用于骨关节炎治疗的报道。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了semaphorin 3a在制备骨关节炎药物中的用途。

本发明的技术方案包括：

神经导向因子semaphorin 3a在制备治疗骨关节炎药物中的用途。

进一步地，所述药物是促进软骨增生的药物。

进一步地，所述药物是促进软骨间隙增加的药物。

进一步地，所述semaphorin 3a的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1如下：

一种治疗骨关节炎的药物，它是以神经导向因子semaphorin 3a为活性成分，加上药学上可接受的辅助性成分制备而成。

进一步地，所述药物是促进软骨增生的药物。

进一步地，所述药物是促进软骨间隙增加的药物。

进一步地，所述semaphorin 3a的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明具有如下有益效果：

本发明的semaphorin 3a可以明显减轻关节炎疼痛。

本发明的semaphorin 3a可以显著促进软骨增生和间隙增加，从根本上抑制骨关节炎的进程，具有良好的骨关节炎治疗作用。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1是热板实验中热板停留相对时间对比图。

图2是OA模型关节面的番红固绿染色图。

图3是SEMA治疗后关节面的番红固绿染色图。

图4是SEMA治疗后关节面的HE染色图。

图5是OA模型关节面的HE染色图。

图6是SEMA治疗前关节面的microCT图。

图7是SEMA治疗后关节面的microCT图。

具体实施方式

注：未经特别说明，具体实施方式中的SEMA均指代神经导向因子semaphorin 3a。

实验例1SEMA对小鼠膝关节炎的治疗作用

1.实验方法

1.1膝关节炎模型

动物：8周龄C57小鼠。

右腿ACLT：前十字交叉韧带切断术。

实验器材及试剂：动物实验用手术器械(眼科剪、镊子等)，动物实验板，1％戊巴比妥钠，碘伏，生理盐水，75％酒精，纱布。

实验原理：模拟创伤性膝关节炎。

实验步骤：按0.3-0.6ml/100g的剂量对小鼠腹腔注射戊巴比妥钠麻醉小鼠，安抚小鼠后放回笼位，待其失去知觉后(刺激足底无反应)，将小鼠前后脚固定在实验平板上，右腿不固定。在右腿膝关节处碘伏消毒后，小心剪开并暴露出关节处，于髌韧带下方找到前十字交叉韧带，用剪刀剪断。碘伏消毒，仔细处理伤口流血较多位置，缝合伤口。术后将小鼠放置在保温台上，待其苏醒后放回笼位，每隔三天观察并记录一次体重变化，并通过拍CT判断造模是否成功。

1.2膝关节炎治疗

待1.1节所述模型长至12周龄，通过膝关节腔穿刺技术，向小鼠关节内注射semaphorine 3a蛋白，注射浓度为1mg/ml，注射量5ul；左腿对应位置注射等量生理盐水。

1.3热板实验

当1.2节所述小鼠长至16～17周龄，置于热板仪(设定温度55℃)，观察其反应，记录其停留时间。另取造模但未接受治疗(左右腿都注射生理盐水)的16～17周龄小鼠，也置于热板仪(设定温度55℃)，记录其停留时间。

1.4micro CT

热板实验完成后，使用micro CT检测造模位置的骨小梁占骨组织体积比(BV/TV)。

1.5病理实验

当1.3节所述小鼠长至18周龄，牺牲小鼠，取小鼠后肢膝盖，制作石蜡切片。进行如下病理实验。

A.HE染色

1)石蜡切片常规脱蜡至水，

2)苏木素染5分钟，

3)流水冲洗，去余色，

4)1％盐酸乙醇分化数秒钟，

5)流水冲洗，切片变蓝约5分钟，

6)70％乙醇30秒钟，

7)酒精性伊红染30秒，

8)100％乙醇I 30秒钟，

9)100％乙醇II 30秒钟，

10)二甲苯I 10分钟，

11)二甲苯II 10分钟，

12)中性树胶封片。

B.番红固绿染色

1)标本的处理：10％福尔马林固定、脱钙、石蜡切片。

2)常规脱蜡至水。

3)入新鲜配制的Weigert染液染色3-5min。

4)酸性乙醇分化液分化15s。

5)蒸馏水洗1min。

6)在固绿染色液内浸染5min，蒸馏水洗1min

7)入SafraninOstain内浸染1-2min，蒸馏水洗1min。

8)用乙酸溶液洗涤切片1-2min，以便去除残留的固绿，蒸馏水洗

1min。9、分别用95％乙醇、无水乙醇脱水。

2.实验结果

2.1热板实验结果

在热板上停留时间越长，表示关节炎疼痛更严重，因此对热板敏感度降低，关节炎减轻后，热板敏感度增高，热板停留时间减少。

热板上，造模小鼠接受SEMA治疗后，相比关节炎小鼠(未治疗)，在热板上停留时间缩短(图1)。表明治疗有效。

2.2番红固绿染色结果

图2显示了未治疗的骨关节炎组织，图3显示了经SEMA治疗后的关节炎组织，图中黄色箭头表示软骨，黑色尖头表示软骨固化，软骨增多，说明治疗有效；且软骨间隙也有所增加，说明治疗有效。

2.3HE染色结果

图4为经过治疗的小鼠，关节间隙更大，关节面更完整。图5为未经过治疗的小鼠关节间隙狭窄，关节面已被破坏。

2.4micro CT结果

图6为SEMA治疗前的关节microCT检测图，图7为SEMA治疗后的关节microCT检测图。可以看出，相较图6，图7骨赘减少、关节间隙增加，表明SEMA治疗逆转了骨关节炎的进程，治疗效果显著。

综上，本发明的SEMA可以减轻骨关节炎疼痛(通过热板试验确定)，增加软骨组织和软骨间隙(通过病理染色和microCT确定)，减少骨赘(通过microCT确定))，显著逆转骨关节炎发展的进程，在骨关节炎药物制备中极具引用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川大学华西医院

<120> 神经导向因子 semaphorin 3a 在制备治疗骨关节炎药物中的用途

<130> GYKH1094-2019P017774CC

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 771

<212> PRT

<213> 人类(homo sapiens)

<400> 1

Met Gly Trp Leu Thr Arg Ile Val Cys Leu Phe Trp Gly Val Leu Leu

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ala Asn Tyr Gln Asn Gly Lys Asn Asn Val Pro Arg Leu

20 25 30

Lys Leu Ser Tyr Lys Glu Met Leu Glu Ser Asn Asn Val Ile Thr Phe

35 40 45

Asn Gly Leu Ala Asn Ser Ser Ser Tyr His Thr Phe Leu Leu Asp Glu

50 55 60

Glu Arg Ser Arg Leu Tyr Val Gly Ala Lys Asp His Ile Phe Ser Phe

65 70 75 80

Asp Leu Val Asn Ile Lys Asp Phe Gln Lys Ile Val Trp Pro Val Ser

85 90 95

Tyr Thr Arg Arg Asp Glu Cys Lys Trp Ala Gly Lys Asp Ile Leu Lys

100 105 110

Glu Cys Ala Asn Phe Ile Lys Val Leu Lys Ala Tyr Asn Gln Thr His

115 120 125

Leu Tyr Ala Cys Gly Thr Gly Ala Phe His Pro Ile Cys Thr Tyr Ile

130 135 140

Glu Ile Gly His His Pro Glu Asp Asn Ile Phe Lys Leu Glu Asn Ser

145 150 155 160

His Phe Glu Asn Gly Arg Gly Lys Ser Pro Tyr Asp Pro Lys Leu Leu

165 170 175

Thr Ala Ser Leu Leu Ile Asp Gly Glu Leu Tyr Ser Gly Thr Ala Ala

180 185 190

Asp Phe Met Gly Arg Asp Phe Ala Ile Phe Arg Thr Leu Gly His His

195 200 205

His Pro Ile Arg Thr Glu Gln His Asp Ser Arg Trp Leu Asn Asp Pro

210 215 220

Lys Phe Ile Ser Ala His Leu Ile Ser Glu Ser Asp Asn Pro Glu Asp

225 230 235 240

Asp Lys Val Tyr Phe Phe Phe Arg Glu Asn Ala Ile Asp Gly Glu His

245 250 255

Ser Gly Lys Ala Thr His Ala Arg Ile Gly Gln Ile Cys Lys Asn Asp

260 265 270

Phe Gly Gly His Arg Ser Leu Val Asn Lys Trp Thr Thr Phe Leu Lys

275 280 285

Ala Arg Leu Ile Cys Ser Val Pro Gly Pro Asn Gly Ile Asp Thr His

290 295 300

Phe Asp Glu Leu Gln Asp Val Phe Leu Met Asn Phe Lys Asp Pro Lys

305 310 315 320

Asn Pro Val Val Tyr Gly Val Phe Thr Thr Ser Ser Asn Ile Phe Lys

325 330 335

Gly Ser Ala Val Cys Met Tyr Ser Met Ser Asp Val Arg Arg Val Phe

340 345 350

Leu Gly Pro Tyr Ala His Arg Asp Gly Pro Asn Tyr Gln Trp Val Pro

355 360 365

Tyr Gln Gly Arg Val Pro Tyr Pro Arg Pro Gly Thr Cys Pro Ser Lys

370 375 380

Thr Phe Gly Gly Phe Asp Ser Thr Lys Asp Leu Pro Asp Asp Val Ile

385 390 395 400

Thr Phe Ala Arg Ser His Pro Ala Met Tyr Asn Pro Val Phe Pro Met

405 410 415

Asn Asn Arg Pro Ile Val Ile Lys Thr Asp Val Asn Tyr Gln Phe Thr

420 425 430

Gln Ile Val Val Asp Arg Val Asp Ala Glu Asp Gly Gln Tyr Asp Val

435 440 445

Met Phe Ile Gly Thr Asp Val Gly Thr Val Leu Lys Val Val Ser Ile

450 455 460

Pro Lys Glu Thr Trp Tyr Asp Leu Glu Glu Val Leu Leu Glu Glu Met

465 470 475 480

Thr Val Phe Arg Glu Pro Thr Ala Ile Ser Ala Met Glu Leu Ser Thr

485 490 495

Lys Gln Gln Gln Leu Tyr Ile Gly Ser Thr Ala Gly Val Ala Gln Leu

500 505 510

Pro Leu His Arg Cys Asp Ile Tyr Gly Lys Ala Cys Ala Glu Cys Cys

515 520 525

Leu Ala Arg Asp Pro Tyr Cys Ala Trp Asp Gly Ser Ala Cys Ser Arg

530 535 540

Tyr Phe Pro Thr Ala Lys Arg Arg Thr Arg Arg Gln Asp Ile Arg Asn

545 550 555 560

Gly Asp Pro Leu Thr His Cys Ser Asp Leu His His Asp Asn His His

565 570 575

Gly His Ser Pro Glu Glu Arg Ile Ile Tyr Gly Val Glu Asn Ser Ser

580 585 590

Thr Phe Leu Glu Cys Ser Pro Lys Ser Gln Arg Ala Leu Val Tyr Trp

595 600 605

Gln Phe Gln Arg Arg Asn Glu Glu Arg Lys Glu Glu Ile Arg Val Asp

610 615 620

Asp His Ile Ile Arg Thr Asp Gln Gly Leu Leu Leu Arg Ser Leu Gln

625 630 635 640

Gln Lys Asp Ser Gly Asn Tyr Leu Cys His Ala Val Glu His Gly Phe

645 650 655

Ile Gln Thr Leu Leu Lys Val Thr Leu Glu Val Ile Asp Thr Glu His

660 665 670

Leu Glu Glu Leu Leu His Lys Asp Asp Asp Gly Asp Gly Ser Lys Thr

675 680 685

Lys Glu Met Ser Asn Ser Met Thr Pro Ser Gln Lys Val Trp Tyr Arg

690 695 700

Asp Phe Met Gln Leu Ile Asn His Pro Asn Leu Asn Thr Met Asp Glu

705 710 715 720

Phe Cys Glu Gln Val Trp Lys Arg Asp Arg Lys Gln Arg Arg Gln Arg

725 730 735

Pro Gly His Thr Pro Gly Asn Ser Asn Lys Trp Lys His Leu Gln Glu

740 745 750

Asn Lys Lys Gly Arg Asn Arg Arg Thr His Glu Phe Glu Arg Ala Pro

755 760 765

Arg Ser Val

770

Claims

1.神经导向因子semaphorin 3a在制备治疗骨关节炎药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是促进软骨增生的药物。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是促进软骨间隙增加的药物。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物是减轻骨关节炎疼痛的药物。

5.如权利要求1-4任一所述的用途，其特征在于，所述semaphorin 3a的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.一种治疗骨关节炎的药物，其特征在于，它是以神经导向因子semaphorin 3a为活性成分，加上药学上可接受的辅助性成分制备而成。

7.如权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物是促进软骨增生的药物。

8.如权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物是促进软骨间隙增加的药物。

9.如权利要求6所述的药物，其特征在于，所述药物是减轻骨关节炎疼痛的药物。

10.如权利要求6-9所述的药物，其特征在于，所述semaphorin 3a的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。