CZ299423B6 - Nové BPC peptidové sole s organo-protektivní aktivitou, proces jejich prípravy a jejich použití v lécbe - Google Patents

Abstract

Rešení se zabývá prípravou solí peptidu s organo-protektivní aktivitou. Sul je tvorena negativne nebitým peptidem BPC (Body Protection Compound) o velikosti 8 až 15 aminokyselinových zbytku a kationem organické nebo anorganické báze. Oproti samotnému BPC peptidu vykazují tyto sole vetší fyzikálne-chemickou stabilitu. Popsáno je také použití techtosolí pro prípravu farmaceutických prostredku pro lécení ruzných lidských nebo zvírecích onemocnení.

Description

Dr. Karel Čermák, Národní třída 32, Praha 1, 11000 (54) Název vynálezu:

Nové BPC peptidové sole s organo-protektivní aktivitou, proces jejich přípravy a jejich použití v léčbě (57) Anotace:

Řešení se zabývá přípravou solí peptidů s organo-protektivní aktivitou. Sůl je tvořena negativně nebitým peptidem BPC (Body Protection Compound) o velikosti 8 až 15 aminokyselinových zbytků a kationem organické nebo anorganické báze. Oproti samotnému BPC peptidu vykazují tyto sole větší fyzikálně-chemickou stabilitu. Popsáno je také použití těchto solí pro přípravu farmaceutických prostředků pro léčení různých lidských nebo zvířecích onemocnění.

O

Z 299423 B6

Nové BPC peptidové sole s organo-protektivní aktivitou, proces jejich přípravy a jejich použití v léčbě

Oblast techniky

Předkládaný vynález se vztahuje k novým aplikačním formám syntetických peptidů BPC (Body Protection Compound - sloučenina chránící orgány), skládající se z 8 až 15 aminokyselinových zbytků s molekulovou hmotností 900 až 1600 daltonů, které mají organo-protektivní aktivitu, k postupu pro jejich přípravu a jejich použití v diagnostice a léčbě.

Dosavadní stav techniky

Jsou známé proteiny a peptidy, které jsou užitelné pro léčbu různých onemocnění lidí a zvířat. Mnoho těchto látek je produkováno in vivo a můžou být pro přípravu farmaceutických směsí extrahovány ze zvířat nebo lidí. Příklady farmaceuticky užitečných proteinů jsou například inzulín, erythropoetin, různé BMP, interferony atd. Jiným příkladem je protein žaludeční šťávy s ochranou aktivitou vůči sliznicím, který byl nedávno izolován a pojmenován jako BPC.

WO 92/04368 se vztahuje k BPC, který vykazuje ochranou aktivitu pro orgány a má molekulovou hmotnost okolo 40 000 daltonů, kjeho přípravě a použití. WO 93/24521 a WO 94/11394 popisují BPC peptidy s organo-protektivní aktivitou stejného typu, jakou známe u rodičovského proteinu BPC. Sikiric et al. v: Digestive Diseases and Sciences, 41 (1996)7, 1518-1526, popisuje pentadekapeptid BPC 157, který vykazuje (je-li rozpuštěn ve vodě a fyziologickém roztoku) pro25 spěšné a profýlaktické účinky na akutní pankreatitidu a průvodní gastroduodenální leze u krys.

BPC peptidy jsou tedy známé pro širokou řadu farmaceutických aplikací. Fyzikálně chemická stabilita těchto peptidů je ale například v normálním fyziologickém roztoku nedostatečná. Kromě toho aplikace BPC peptidů, zejména v injekční formě vodného roztoku nebo fyziologického roz30 toku, způsobuje bolest a/nebo nekrózy.

Odborníkům jsou sole proteinů a peptidů dobře známé. Například z práce Bertrand, M. et al. v: Journal of Peptide Research, 49 (1997)3, 269-272 je známo, že účinek určitých solí na stabilitu a strukturu peptidů je velmi selektivní. Například přidání jednomocných kationů, jako NH₄₊ k roztoku peptidu (poly(Glu-Leu)) v konečné koncentraci 0,1 M, vyvolá přechod na ve vodě rozpustnou beta-strukturu. Naproti tomu nebyl pozorován žádný přechod při použití Li⁺, Na⁺ nebo Cs⁺ iontů.

Role povrchově přístupných iontových párů na stabilitu proteinu se zkoumala stanovením účinku přidaných solí (KC1, MgCf a LaCf) při neutrálním a kyselém pH na stabilitu de novo vytvořených dvouřetězcových navzájem ovinutých proteinů s alfa helikální konformací. Výsledky ukazují, že přidaná sůl může mít komplexní vliv na stabilitu proteinu, včetně účinků na stabilizaci a destabilizaci, kde čistý vliv závisí na povaze nabitých zbytků a iontových interakcích přítomných v proteinu (Kohn et al. v: Journal of Molecular Biology, 267 (1997)4, 1039-1052).

Předchozí studie modelových peptidů také ukázaly, že solné můstky rozložené v i,i +4 podél peptidového řetězce stabilizují více než v i,i +3, přičemž se spíše preferuje uspořádání kyselina-báze než báze-kyselina z N- k C- konci. V současnosti se ale neví, jestli mají povrchové solné můstky stabilizační vliv na přirozené struktury v proteinech (Berger et al. v: Journal of Biomolecular

Structure and Dynamics, 14 (1966)3, 285-291.

Vlastnosti peptidových solí s ohledem na jejich stabilitu, strukturu a funkci tak velmi závisí na určitých iontech účastnících se tvorby specifických solí a dále na dalších vnitřních a vnějších faktorech. V současnosti není možné říci předem, jaké vlastnosti by mohla mít určitá sůl nebo určitý peptid.

- 1 CZ 299423 B6

Podstata vynálezu

Zásadní technický úkol předkládaného vynálezu je snaha poskytnout BPC peptidy ve stabilnější formě a diagnostické a/nebo farmaceutické směsi obsahující BPC peptidy, které vykazují zlepše5 nou stabilitu a alespoň stejné farmaceutické vlastnosti, jako samotné BPC peptidy. Další technický úkol předkládaného vynálezu je snaha poskytnout farmaceutickou směs, která překoná nedostatky zmíněné výše, která umožní zejména bezbolestnou injekci BPC peptidů.

Předkládaný vynález řeší tyto problémy přípravou BPC peptidových solí a farmaceutických nebo diagnostických směsí obsahujících farmaceuticky nebo diagnosticky účinné množství solí BPC peptidů, kde je anion soli negativně nabitý peptid složený z 8 až 15 aminokyselin, s molekulovou hmotností 900 až 1600 daltonů a s obecným vzorcem (1) [Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala] ^{u nebo í2 )} (I) kde Xaa je neutrální alifatický aminokyselinový zbytek, zejména Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle nebo Nva,

Yaa je zásaditý aminokyselinový zbytek, zejména Lys, Arg, Orn nebo His a

Zaa je kyselý aminokyselinový zbytek, zejména Glu, Asp, Aad nebo Apm a kde kation soli je kation anorganické nebo organické, netoxické a farmaceuticky přijatelné báze. Kation soli je často alkalický kov nebo kov alkalických zemin, například Na⁺, K⁺, Li⁺, Cs⁺,

Ca²⁺ nebo jiný kov, jako např. Zn²⁺, nebo primární, sekundární nebo terciární amin, nebo organická sloučenina jako NH₄+, trietanolamin⁺, cyklohexylamin⁺, 2-AMP⁺ (2-amino-l-propanol) nebo TRIS⁺ (Tris-(hydroxymethyl)-aminometan) za předpokladu, že jsou tyto kationty fyziologicky akceptovatelné.

BPC peptidové sole předkládaného vynálezu překvapivě vykazují přinejmenším stejnou farmaceutickou aktivitu jako BPC peptidy a navíc významně zvýšenou fýzikálně chemickou stabilitu ve srovnání s volnými BPC peptidy nebo octany BPC peptidů. Kation použitý podle předkládaného vynálezu neovlivní aktivitu BPC peptidů, ale zvýší jejich stabilitu. BPC peptidové sole předkládaného vynálezu jsou například stabilnější než BPC peptidy nebo BPC peptidové octany v normálním fyziologickém roztoku nebo ve vodě. Kromě toho jsou sole předkládaného vynálezu vhodné pro perorální podávání a nevykazují žádné nežádoucí vedlejší účinky, jako je bolestivost nebo tvorba nekróz během nebo po aplikaci, zejména injekční aplikaci. BPC peptidové sole předkládaného vynálezu tedy umožňují zlepšenou enterální nebo parenterální aplikaci. Kromě toho jsou sole předkládaného vynálezu velmi vhodné vzhledem k absenci jakýchkoliv příznaků toxicity až do dávek 50 mg/kg tělesné hmotnosti.

Sole vynálezu se můžou získat rozpuštěním volného BPC peptidu ve vodném nebo vodném/alkoholovém rozpouštědle nebo v jiných vhodných rozpouštědlech s vhodnou bází a následnou izolací získané sole vynálezu odpařením roztoku, zmražením a lyofilizaci nebo přidáním dalšího rozpouštědla, např. dietyleteru k vodnému a/nebo alkoholovému roztoku BPC peptidové sole, čímž se vyvolá separace nerozpustné neupravené sole. Pro tvorbu sole se obvykle používají jeden nebo maximálně dva moly báze tj. kationu a jeden mol volného BPC peptidu. Pro přípravu alkalických peptidových BPC solí se přednostně používají uhličitany alkalických kovů nebo hydrogenuhličitany alkalických kovů. Připravené peptidové sole jsou volně rozpustné ve vodě. Před50 kládaný vynález se tak vztahuje také k procesu přípravy BPC peptidových solí.

V kontextu předkládaného vynálezu se za bázi pokládá látka schopná tvorby kationu v roztoku, zejména ve vodném a vodném/alkoholovém roztoku.

-2CZ 299423 B6

V kontextu předkládaného vynálezu farmaceutická aktivita zahrnuje profylaktické a terapeutické aktivity. Farmaceutické složení se tedy vztahuje ke směsím vykazujícím profylaktické a/nebo terapeutická působení.

Vynález se dále vztahuje k farmaceutické nebo diagnostické směsi obsahující BPC peptidové sole předkládaného vynálezu, někdy s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči a také postupy pro přípravu těchto sloučenin. Tyto směsi jsou vhodné pro místní nebo systémovou aplikaci například ve formě injekčních roztoků, tablet, past, kapslí, mastí, prostředků k omývání, cucacích pastilek atd. Dávkování se pohybuje přednostně v rozsahu od 10 ⁵ do 10 ² mg/kg tělesné ío hmotnosti aplikované systémově, nebo místěn ve vyšších koncentracích - mezi 0,1 a 0,5%.

Určení optimálního dávkování pro konkrétní léčbu bude na odbornících.

Předkládaný vynález se také vztahuje k farmaceutické nebo diagnostické směsi jak bylo pojednáno výše, která kromě jedné nebo více BPC peptidových solí předkládaného vynálezu obsahuje trehalózu, zvláště pro perorální použití a/nebo farmaceuticky nebo diagnosticky přijatelné nosiče, rozpouštědla a/nebo přísady.

Směs vynálezu (přednostně ve vodě rozpustná směs) kromě BPC peptidové sole dále může obsahovat ve vodě rozpustný protein vhodný pro injekci do tělních tekutin bez výraznější farmakolo20 gické aktivity v koncentraci použité pro jednu dávkovou jednotku předkládaného vynálezu (dále „ve vodě rozpustný protein“). Jako tento ve vodě rozpustný protein se preferuje sérový albumin, globulin, kolagen a/nebo želatina. Tento protein může být přidán v množstvích obecně používaných pro injekčně aplikované farmaceutické směsi. Pak je váhový poměr mezi ve vodě rozpustným proteinem a BPC peptidovou solí například v rozmezí 0,000:1 do 100:1, přednostně v rozmezí od 0,001:1 do 10:1, nebo ještě lépe v rozmezí od 0,01:1 do 1:1.

Vynález se také vztahuje k samotným dříve zmíněným BPC peptidovým solím a směsím, které je obsahují, zejména v sušené a/nebo čisté formě nebo ve vodných nebo vodných/alkoholových roztocích. pH roztoku připraveného z ve vodě rozpustné směsi nebo peptidové sole předkládané30 ho vynálezu by mělo být takové, aby dané pH nemělo nepříznivý vliv na aktivitu farmakologicky aktivního peptidu, ale bylo v obecně přijatelném rozsahu pro injekční aplikaci a dále aby dané pH nezpůsobovalo velké změny viskozity roztoku a nedovolovalo tvorbu precipitátu nebo podobných struktur. Roztok by tedy měl mít pH mezi 6 až 9, nejlépe mezi 6,5 a 7,5.

Když je ve vodě rozpustná směs vynálezu převedena na vodný roztok pro aplikaci, koncentrace farmakologicky aktivní peptidové sole v daném roztoku by měla být v rozsahu od 0,0000001 do 10% (hmotnost/objem), lépe v rozsahu od 0,000001 do 5% a nejlépe v rozsahu od asi 0,00001 do 1% (vždy hmotnost/objem).

Směs předkládaného vynálezu by měla přednostně mít dávkovou jednotku obsahující farmakologicky aktivní BPC peptidovou sůl vynálezu společně s (je-li to nutné) dalšími přísadami, jako je například výše uvedený ve vodě rozpustný protein. Tak mohou být například v ampuli nebo lahvičce dvě nebo tři výše zmíněné složky (po rozpuštění nebo suspendování ve sterilní vodě nebo sterilním fyziologickém roztoku). V tomto případě může metoda přípravy zahrnovat smísení roztoku farmakologicky aktivní BPC peptidové sole a dále, je-li to nezbytné, roztoku aditiva nebo přidání aditiva v práškové formě k roztoku farmakologicky aktivní BPC sole nebo jakoukoliv kombinaci vhodných postupů. Dávková forma se může také připravit přidáním sterilní vody nebo sterilního fyziologického roztoku k lyofílizovanému nebo pod vakuem sušenému prášku s BPC peptidovou solí a případně i další nezbytnou přísadou. Tato forma dávkové jednotky může obsahovat jednu nebo více dalších vhodných přísad, jako například látky upravující pH (např. glycin, kyselina chlorovodíková, hydroxid sodný), lokální anestetika (například xylokain hydrochlorid, chlorbutanol), osmotické látky (například chlorid sodný, manitol, sorbitol), emulzifikátory, inhibitory adsorpce (např. Tween® 60 nebo 80), talek, škrob, laktózu a tragant, stearát hořečnatý, glycerol, propylen glykol, ochranné látky, benzyl alkohol, metylhydroxy benzoát a/nebo

-3 CZ 299423 B6 oleum arachid hydrogen. Tato forma dávkové jednotky může dále obsahovat farmakologicky přijatelné inertní substance k přenosu látky jako například polyetylén glykol 400 nebo dextran.

Preferuje-li se, jsou-li ve vodě rozpustné směsi předkládaného vynálezu ve formě parenterálních přípravků. Nejlépe tedy jako roztoky pro injekce, roztoky pro transmukozální aplikaci, nasální roztoky a roztoky pro aplikaci do uší.

Mezi uvedené roztoky pro injekční aplikaci patří roztoky pro intravenózní aplikaci, subkutánní aplikaci, intraarteriální aplikaci, intramuskulámí aplikaci a intraokulámí aplikaci. Tyto dlouhoío době působící preparáty se snadno nasají z ampulí nebo lahviček do injekční stříkačky. Bubliny (dojde-li kjejich vytvoření při nasátí) se snadno odstraní pouhým krátkým ponecháním roztoku v klidu.

Směs předkládaného vynálezu může být jednak rozpuštěná ve vodě nebo v lyofilizované formě 15 s krystalizovanou rozpuštěnou látkou, jako je například manitol. Přidáním sterilní vody nebo sterilního fyziologického roztoku k lyofilizátu se získá vodný roztok.

Tonicita vodného roztoku ve vodě rozpustné směsi předkládaného vynálezu by měla být při podávání v přijatelných mezích a je možněji upravit například izotonickými činidly, jako je chlo20 rid sodný nebo manitol. Tonicita má přednostně poloviční až dvojnásobnou hodnotu jako fyziologický roztok, nebo lépe hodnotu odpovídající třem čtvrtinám až jedenapůlnásobku fyziologického roztoku.

Viskozita vodného roztoku ve vodě rozpustných sloučenin předkládaného vynálezu by měla být dostatečně nízká pro injekční aplikaci. Je dobré, když je viskozita nižší než 500 cP, nebo ještě lépe nižší než 400 cP. Hodnoty viskozity odpovídají hodnotám měřeným s použitím Cone LD ve viskozimetru typu E (Tokimec, Japonsko) při 25 °C.

Je-li směs ve formě lyofilizátu upřednostňuje se, když je viskozita, tonicita a koncentrace kom30 ponentů ve vodných roztocích z nich odvozených v mezích uvedených dříve.

Směs předkládaného vynálezu se připraví smísením těchto složek podle obecných metod. Cílem smíchání těchto složek předkládané směsi by mělo být zachování aktivity farmakologicky aktivní BPC sole a minimalizace tvorby bublin během celého procesu. Složky se dají do nádoby (napří35 klad do lahve nebo do válce), bud’ společně, nebo postupně v libovolném pořadí. Atmosféra v nádobě může být tvořena například sterilním čistým vzduchem nebo sterilním čistým dusíkem. Výsledný roztok může být přenesen do menších nádob nebo ampulí a lyofilizován.

Tekutá forma nebo lyofílizovaná prášková forma směsi předkládaného vynálezu může být roz40 puštěna nebo rozptýlena v roztoku polymeru schopného biodegradace, jako je například kopolymer kyseliny póly (mléčné-glykolové), póly (hydroxymáselné kyseliny), polymeru kyseliny póly (hydroxymáselné-glykolové) nebo jejich směsí a může se připravit například ve formě fdmů, mikrokapsulí (mikrokuliček) nebo nanokapsulí (nanokuliček), a zejména ve formě měkkých nebo tvrdých kapslí.

Směs předkládaného vynálezu se může také obalit lipozómy obsahující fosfolipidy, cholesterol nebo jejich deriváty a pak rozptýlit ve fyziologickém roztoku nebo v roztoku kyseliny hyaluronové rozpuštěné ve fyziologickém roztoku.

Měkké kapsle se můžou plnit tekutou formou směsi předkládaného vynálezu. Tvrdé kapsle se můžou plnit lyofilizovaným práškem směsi předkládaného vynálezu nebo může být lyofilizovaný prášek směsi předkládaného vynálezu slisován do tablet pro rektální aplikaci nebo orální podávání.

-4CZ 299423 B6

Směs předkládaného vynálezu se může pochopitelně také dodávat v předplněných injekčních stříkačkách pro vlastní aplikaci.

Směs předkládaného vynálezu se může uchovávat při normálních teplotách například mezi +10 a

30 °C nebo při teplotách běžných v lednici, nejlépe mezi +2 a +8 °C.

Vynález se také vztahuje k novému použití a metodám aplikace, které využívají výše uvedené sole a/nebo směsi zejména pokud jde o léčbu poruch spojených buď s tvorbou oxidu dusnatého (NO), nebo s narušenými funkcemi NO-systému, zejména hypertenzí, angínou, impotencí, oběio hovým a septickým šokem, mrtvicí, zánětem, syndromem respirační tísně, adhezí a agregací krevních destiček a leukocytů, endoteliální dysfunkcí, gastrointestinálními lézemi, porušením peristaltiky, diabetem, pankreatitidou, hypotenzí a Parkinsonovou nemocí; disfunkcí nebo hyperfunkcí somatosenzorických nervů, zejména senzorické neuropatie, postherpetické neuralgie, atopické dermatitidě, zhoršenou léčbou poraněných pletiv, získanou chladnou a teplou kopřivkou, lupénkou, bulózním pemfigoidem, ekzémem, fotodermatózou, chronickou artritidou, gastrointestinálními lézemi a specifickou nebo nespecifickou hyperaktivitou horní a dolní části respiračního traktu (astma, rinitida); poškozením endotelu; poraněních, vředech; pro léčbu stavů vztahujících se k akutním a/nebo chronickým zánětům, zejména chronické artritidě a poruch spojených s opožděnými typy hypersenzitivity a gastrointestinálními lézemi; pro léčbu jatemích poškození, orgánových lézí vyvolaných volnými radikály jako výsledek ozáření; potíží spojených s poruchami katecholaminergního systému, zejména schizofrenie, vliv amfetaminů, zneužití léčiv; stavů vyvolaných stresem; akutní pankreatitidy s dodatečným pozitivním dopadem na průvodní gastroduodenální patologii; srdečních poruch (zejména antiaritmická, antiangínová a kardioprotektivní léčba); depresivních chorob; Parkinsonovy choroby a patologie chorob podobných Parkinsonově chorobě; poruch teploty; kostních defektů; poškození různých orgánů vyvolané hypertenzí; poruch koagulace; bolestivých poruch; křečovitých poruch; poranění míchy; poškození alkoholem vyvolané jeho zneužitím nebo zvýšeným příjmem; mozkových ischemických potíží; poškození periferních nervů, kataleptických a neuroleptických poruch; poruch spojených s nenormálními nebo mutovanými lymfocyty; poruch plodů; vaginální atrofie a vývoje osteoporózy vyvolané podmínkami ovariektomie; tumorů; virových onemocnění, zejména AIDS nebo ARC; gastrointestinálních lézí; poruch rozpoznání; abstinenčních poruch; poruch ledvin a poruch buněčné imunitní odpovědi.

Předkládaný vynález se dále vztahuje k BPC peptidové soli nebo farmaceutické či diagnostické směsi podle předchozího výkladu, kde je obecný vzorec (II)

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa (II).

Předkládaný vynález se vztahuje zejména k BPC peptidové soli nebo farmaceutické nebo diag40 nostické směsi obsahující sůl BPC peptidu podle výše uvedeného vzorce (I), kde je peptid vybrán ze skupiny skládající se z:

-5CZ 299423 B6

Leu	Glu Pro Pro Pro Gly	Lys	Pro Ala Asp Asp Ala
Leu	Gly Val;
Gly	Glu Pro Pro Pro Gly	Lys	Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu
Val
(také nazývaný BPC157);
Leu	Glu Pro Pro Pro Leu	Lys	Pro Ala Asp Asp Ala
Leu	Gly Val;
Leu	Glu Pro Pro Pro Leu	Lys	Pro Ala Asp Ala Leu
Gly	Val;
Gly	Glu Pro Pro Pro Gly	Lys	Pro Ala Asp Ala Gly
Leu	Val;
Glu	Pro Pro Pro Leu Lys	Pro	Ala;
Asp	Pro Pro Pro Ile Arg	Pro	Ala Asp;
Glu	Pro Pro Pro Leu Lys	Pro	Ala Asp;
Leu	Glu Pro Pro Pro Leu	Lys	Pro Ala Asp Ala Leu
Gly	Val;
Gly a	Glu Pro Pro Pro Gly	Arg	Pro Ala Asp
Λ Glu	Pro Pro Pro Leu Lys	Pro	Ala Asn.

Tyto peptidy jsou známé z WO 94/11394 a WO 93/124521, jejichž obsahy jsou, pokud jde o přípravu a použití BPC peptidů, zahrnuté v předkládaném popisu.

Kromě toho můžou být peptidy připojeny k dalším funkčním a/nebo strukturním částem, jako jsou glycidy, tuky, proteiny nebo peptidy, protilátky, receptory, hormony, cytotoxické substance, značící substance, barviva, radioaktivní značky, imunomodulační činidla, léčiva, nosiče, cílové nebo signální substance atd.

Vynález se dále vztahuje k výše uvedeným BPC peptidovým solím a směsím, kde je peptid v lineární nebo cyklizované formě, zejména cyklizované amidovou vazbou mezi prvním a posledním aminokyselinovým zbytkem.

Přehled obrázků na výkresech

Vynález bude nyní vysvětlen podrobněji pomocí ilustrativních příkladů a doprovodných obrázků. Obrázky ukazují:

-6CZ 299423 B6

Obrázek 1 ukazuje IR spektrum NaBPC 157.

Obrázek 2 ukazuje IR spektrum Na₂BPCl 57.

Obrázek 3 ukazuje IR spektrum dicesiové sole BPC157 (Cs₂BPC157).

Obrázek 4 ukazuje IR spektrum TRIS sole BPC157 (TRIS-BPC157).

Obrázek 5 ukazuje IR spektrum di-TRIS sole BPC157 ((TRIS)₂BPC157).

Obrázek 6 ukazuje IR spektrum 2-aminopropanolové sole BPC157 (2-AMP-BPC157).

Obrázek 7 ukazuje IR spektrum triethanolaminové sole BPC157 (TEAM-BPC157).

ío Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava monosodné sole BPC157 (NaBPC 157).

0,5 g (0,35 mmol) pentadekapeptidu se sekvencí Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp

Ala Gly Leu Val (BPC157) se rozpustilo v 10 ml vody s 29,6 mg hydrouhličitanu sodného (0,35 mmol), sterilizovalo filtrací přes 0,2 μ filtr a sublimace vysušilo, čímž vzniklo 0,48 g našedlé sušiny.

Čistota získané sole: 99,4% (HPLC).

Hmotnostní spektrum (FAB): 1419, vyšší ionty při 1441 (IVfNa⁺)·

Analýza aminokyselin získané peptidové sole po 72 hodinách hydrolýzy pomocí 6N-HC1 v uzavřených zkumavkách při 110 °C dala hodnoty odpovídající složení: 3Gly, 4Pro; 2Ala, 2Asp, Glu, Leu, Val, Lys.

IR spectrum (KBr): Obrázek 1.

UV spectrum (H₂O): lambda max=190 nm, žádné jiné maximum.

Teplota tání: 288 až 290 °C (dekompozice).

Příklad 2: Příprava disodné sole BPC 157 (Na₂BPC157)

0,5 g (0,35 mmol) BPC157 se rozpustilo v 10 ml etanolu. Za mírného míchání se přidalo 1,4 ml 0,5 mol/1 metanolového roztoku hydroxidu sodného. Tento roztok se sterilizoval filtrací přes filtr 0,2 μ a pak se pomalu přidával za současného pomalého míchání k dietyletheru (50 ml). Oddělená bílá tuhá látka dvoj sodné sole po přefiltrování a promytí dietyleterem měla hmotnost 0,52 g.

Čistota získané sole: 99,4% (HPLC).

Hmotnostní spektrum (FAB): 1419, vyšší ionty při 1441 (MfNaŮ, 1464 (M⁺Na₂₊).

Analýza aminokyselin získané peptidové sole odpovídá složení: 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp, Glu, Leu, Val, Lys.

IR spektrum (KBr): Obrázek 2.

UV spektrum (H₂O): lambda max=190 nm, žádné jiné maximum.

Teplota tání: 275 až 277 °C.

Příklad 3: Příprava dicesné sole BPC157 (Cs₂BPC157)

0,5 g (0,35 mmol) BPC157 se rozpustilo v 8 ml vody obsahující 114 mg uhličitanu česného (0,70 mmol), sterilizovalo filtrací přes 0,2 μ filtr a zlyofilizovalo, čímž vzniklo 0,55 g šedobílé sušiny.

Čistota získané soli: 99,3% (HPLC).

-7CZ 299423 B6

Hmotnostní spektrum (FAB): 1419, vyšší ionty při 1551 (M⁺Cs⁺), 1684 (M⁺Cs₂₊).

Analýza aminokyselin u získané peptidové sole odpovídá složení: 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp, Glu, Feu, Val, Fys.

IR spektrum (KBr): Obrázek 3.

UV spektrum (H₂O): lambda max=190 nm.

Teplota tání: 268 °C

Příklad 4: Příprava TRIS sole BPC 157 (TRIS-BPC157)

0,5 g (0,35 mmol) BPC157 se rozpustilo v 10 ml metanolu s 42,6 mg (0,35 mmol) tris-(hydroxymethyl)aminometanu (TRIS), sterilizovalo filtraci přes 0,2 μ filtr a vysušilo odpařením metanolu pod vakuem při 40 °C. Tak se získalo 0,56 g bílé pevné látky.

Čistota získané soli: 99,5% (HPLC)

Hmotnostní spektrum (FAB): 1419 (MH⁺).

Analýza aminokyselin u získané peptidové sole odpovídá složení: 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp, Glu, Feu, Val, Fys.

IR spektrum (KBr): Obrázek 4.

UV spektrum (H₂O): lambda max=190 nm.

Teplota tání: 250 °C (dekompozice).

Příklad 5: Příprava di-TRIS sole BPC157 ((TRIS)₂BPC157)

Sloučenina se připravila stejným postupem jako v Příkladu 1 s tím rozdílem, že se použilo 85,2 mg (0,70 mmol) TRISu.

Čistota získané soli: 99,5% (HPFC)

Hmotnostní spektrum (FAB): 1419 (MH⁺).

Analýza aminokyselin u získané peptidové sole odpovídá složení: 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp, Glu,

Feu, Val, Fys.

IR spektrum (KBr): Obrázek 5.

UV spektrum (H₂O): lambda max=190 nm.

Teplota tání: 188 až 193 °C.

Příklad 6: Příprava 2-aminopropanolové sole BPC157 (2-AMP-BPC157)

Sloučenina se připravila postupem popsaným v Příkladu 1. Jako báze se použil 2-aminopropanol (2-AMP).

Čistota získané soli: 99,6% (HPFC)

Hmotnostní spektrum (FAB): 1419 (MH⁺).

Analýza aminokyselin u získané peptidové sole odpovídá složení: 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp, Glu, Feu, Val, Fys.

IR spektrum (KBr): Obrázek 6.

UV spektrum (H₂O): lambda max=190 nm.

Teplota tání: 158 °C (dekompozice).

-8CZ 299423 B6

Příklad 7: Příprava trietanolaminové sole BPC157 (TEAM-BPC157)

Sloučenina se připravila postupem popsaným v Příkladě 1. Jako báze se použil Trietanolamin (TEAM).

Čistota získané soli: 99,2% (HPLC)

Hmotnostní spektrum (FAB): 1419 (MH⁺).

Analýza aminokyselin u získané peptidové sole odpovídá složení: 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp, Glu, Leu, Val, Lys.

IR spektrum (KBr): Obrázek 7. ío UV spektrum (H₂O): lambda max=190 nm.

Teplota tání: 202 až 205 °C.

Příklad 8: Příprava tablet obsahujících TRIS-BPC157

Složení	mg/tabletu
TRIS-BPC157	0,5
trehalóza	20,0
laktóza	17,0
škrob	6,5
talek	3,0
tragant	2,5
magnesium stearát	0,5
	50,0 mg

TRIS-BPC157 (0,5 mg) a trehalóza (20 mg) se rozpustily v 1 ml vody a vysušily odpařením. Po vysušení byl zůstatek pro přípravu tablet smíchán s ostatními složkami.

Příklad 9: Příprava kapslí obsahujících NaBPC 157.

Složení	mg/kapsli
NaBPC157	0,5
trehalóza	60,0
laktóza	39,0
magnesium stearát	0,5
	100,0 mg

NaBPC157 (0,5 mg) a trehalóza (60 mg) se rozpustily v 1 ml vody a vysušily odpařením. Po vysušení byl zůstatek pro přípravu kapslí smíchán s ostatními složkami.

-9CZ 299423 B6

Příklad 10: Příprava roztoku obsahujícího NaBPCl 57

Složení	g/25 ml
NaBPC157	0,05
glycerol	15,00
oenzyl alkohol	0,01
pufr o pH 7,0 do	25 ml

Příklad 11: Příprava krému s TRIS-BPC157.

Složení	g/25g
TRIS-BPC157	0,05
emulsifikační látka	2,80
oleum arachid hydrogen	7,08
Tween® 60	12,08
propylen glykol	3,00
metylhydroxy benzoát	0,07
	25,0 g

Příklad 12: Testy stability

Stabilita BPC peptidových solí se testovala inkubací solí po dobu 76 a 120 dní při teplotě 40 °C. Koncentrace BPC peptidových solí ve vodném roztoku byla 0,2% (hmotnost/objem). Stabilita se měřila pomocí HPLC: kolona Kromasil 100, 5μ, 150x4,6 mm, mobilní fáze 0,1 % kyselina trifluoroctová ve vodě/acetonitrilu (od 0 do 50 obj.%), eluční gradient v 25 minutách, průtok 1 ml/min, detekce: UV při 214 nm.

Pro srovnání se použily volné BPC peptidy a jejich monoacetáty.

- 10CZ 299423 B6

Tabulka 1. Stabilita BPC peptidových solí při 40 °C ve dnech 0, 76 a 120; % plochy v pokusu (HPLC).

Směs	pH-hodnota; 0,2% ve vodě	0 den	76 den	120 den
volný peptid BPC157	4,46	99,3	98,1	97,4
monoacetát peptidu BPC157	4,53	99,2	97,8	95,3
sodná sůl BPC157	6,51	99,4	99,5	99,4
dvoj sodná sůl BPC157	7,64	99,4	99,7	99,4
TRIS sůl BPC157	6,31	99,5	99,5	99,4
diTRIS sůl BPC157	8,24	99, 5	99,5	99,5
2-AMP sůl BPC157	8,20	99, 6	99,4	99,5
TEAM sůl BPC157	7,61	99,2	99,3	99,1

Data předkládaná v této tabulce zřetelně dokazují zvýšenou stabilitu BPC peptidových solí vyná5 lezu ve srovnání svolnými BPC peptidy nebo jejich monoacetáty. Kromě toho injekce těchto roztoků nejsou bolestivé a nezpůsobují nekrózy - pravděpodobně díky vysoké hodnotě pH roztoku BPC peptidové sole.

V jiném samostatném experimentu se pozorovalo po přidání trehalózy další zvýšení stability BPC ío peptidových solí předkládaného vynálezu v surové formě a v roztocích. Proto přidání trehalózy, jako farmaceuticky přijatelné přísady pro přípravu farmaceutických směsí, zejména ve formě tablet nebo kapslí, je další důležitou stránkou předkládaného vynálezu.

Následující příklady popisují experimenty demonstrující farmaceutické aktivity BPC peptidových solí předkládaného vynálezu. Tyto experimenty se uskutečnily s použitím různých modelů „in vitro“ a „in vivo“. Pokud není uvedeno jinak, použila se pro tyto experimenty (mono) sodná sůl BPC peptidu 157 (zkratka: NaBPC157). Ve všech experimentech se použili (není-li uvedeno jinak) samci krysy Wistar, vážící 250 až 28 g.

Příklad 13: NO SYSTÉM

Úvod:

Oxid dusnatý (NO) slouží jednak jako signální molekula v endoteliálních a nervových buňkách a jednak jako zabíječská molekula (killer molecule) aktivovaná imunitními buňkami. Nedávné výzkumy ukázaly, že se může využít jako lék při inhalaci. Obecně se zdá, že jak nadbytek, tak nedostatek NO způsobuje, nebo se účastní na řadě poruch, zejména hypertensi, angíně, impo-11 CZ 299423 B6 tenči, oběhovém šoku, septickém šoku, mrtvici, zánětu, syndromu respiračních potíží, plicní hypertenzi, adhesi a agregaci krevních destiček a leukocytů, diabetů, hypotenzi a Parkinsonově chorobě.

Materiál a metody:

U krys se testovaly některé z účinků NABPC157 (10 pg nebo lOng/kg), jako například prospěšné aktivity proti žaludečním lézím a aktivita NaBPC157 týkající se udržení krevního tlaku. Léze se vyvolaly jednohodinovou aplikací etanolu (96%, i.g. (intragastrikálně - nitrožaludečně)). ío Současně se aplikoval NaBPC157 (i.p. (intraperitoneálně)). Při experimentech s udržením krevního tlaku byl NaBPC157 podáván intravenózně (i.v.).

Také se zkoumala kombinovaná aplikace N^G-nitro-L-arginin metylesteru (L-NAME) (5mg/kg i.v.), kompetitivního inhibitoru tvorby endoteliálního oxidu dusnatého (NO), a NO prekurzoru L15 argininu (200 mg/kg i.v.) (D-arginin byl neúčinný). V pokusech s gastrickými lézemi se NO látky aplikovaly 5 minut před etanolovým poškozením a aplikací NaBPC 157.

Výsledky:

V etanolovém modelu měl samostatně podávaný NaBPC 157 protivředový účinek stejně jako Larginin. NaBPC 157 zabránil jinak vážným žaludečním lézím, které vznikly po působení etanolu u kontrolních krys. L-NAME neměl žádný vliv. L-NAME zcela potlačil aktivitu L-argininu, ale pouze zeslabil aktivitu NaBPC157. Po aplikaci kombinace L-NAME + L-argininu se aktivita NaBPC 157 dále zhoršila.

Ve studiích s krevním tlakem má NaBPC 157 (bez vlivu na základní normální hodnoty) ve srovnání s L-argininem jak maskující účinek (na porušený zvýšený krevní tlak působením L-NAME, je-li aplikován preventivně a snižuje hodnoty už zvýšené po aplikaci L-NAME, je-li podávaný v čase maximálního zvýšení krevního tlaku působením L-NAME (tj. 10 minut po L-NAME)) tak preventivní účinek (předběžným podáním NaBPC 157 se zabránilo nevelkému poklesu krevního tlaku vyvolaného L-argininem). Když se podal NaBPC 157 10 minut po aplikaci kombinace L-NAME + L—arginin (kombinace stále vedoucí ke zvýšení krevního tlaku), jeho jasný účinek (pozorovaný u krys, na které se působilo L-NAME) zmizel. V podmínkách in vitro (v homogenátu pletiva ze žaludeční sliznice krys) NaBPC157 podaný ve stejné dávce (100 μΜ) jako L35 arginin indukoval srovnatelnou tvorbu NO. Ale vliv NaBPC 157 nemohl být inhibován L-NAME dokonce ani desetinásobně (100 proti 1000 μΜ) vyšší dávkou než tou, kteráje nezbytná pro inhibici účinku L-argininu. Na druhé straně byla syntéza NO snížena při kombinaci NaBPC 157 a Largininu. Shrnuto, NaBPC 157 mohl určitým způsobem interferovat s účinkem NO jak na integritu žaludeční sliznice, tak na udržení krevního tlaku zejména v kombinaci s L-argininem, s tím, že má význačnější a/nebo zvlášť odlišný účinek na NO.

Díky tomu, že má NaBPC157 významnější účinek na NO než L-arginin, mohl by zabránit vedlejším účinkům spojeným s nadměrným tvořením NO (narušený účinek L-argininu (např. hypotense)). Tyto vedlejší účinky se vrátily k normálním hodnotám in vivo a zabránilo se nadměrné tvorbě NO in vitro. Navíc se odstranily negativní důsledky inhibice NO-systému (např. prevence zvýšení krevního tlaku po působení L-NAME a navrácení již zvýšeného tlaku po aplikaci LNAME).

Na základě blízké podobnosti NO testů v dalších pletivech (např. plíce, játra, cévy atd.) a rozma50 nitosti užitých modelů (žaludeční léze a udržení krevního tlaku) jsou uvedené prospěšné účinky NaBPC 157 zřejmé jak pokud jde o nadměrnou tvorbu NO, tak i narušené funkce NO systému. BPC peptidové sole předkládaného vynálezu jsou zejména užitečné pro léčení hypertenze, angíny, impotence, oběhového šoku, septického šoku, mrtvice, zánětů, syndromu respirační tísně, plicní hypertenze, pankreatitidy, adhese a agregace krevních destiček a leukocytů, endoteliálních disfunkcí a Parkinsonovy choroby.

-1?.

Příklad 14: Somatosenzorické neurony

Úvod:

Somatosenzorické neurony se obecně účastní řízení homeostáze, zejména u reakcí, které narušujících homeostázi. Tyto neurony můžou detekovat potenciální nebezpečí. Neurony jsou (skrze sebe, per se) schopné okamžitě iniciovat příslušné opatření pro zmírnění nebezpečí. Vazoaktivní aferentní neurony tedy představují systém první obrany proti traumatu. Obecně byly jejich ochranné schopnosti doloženy experimentálním poškozením kůže a gastrointestinální sliznice. Při io řadě potíží hrají roli buď disfunkce, nebo hyperfunkce, zejména u vrozené senzorické neuropatie, senzorické neuropatie vyvolané diabetem, herpes zoester, postherpetické neuralgie, atopické dermatitidy, zhoršeného hojení poraněných pletiv (např. přetrvávající poranění kůže, zhoršení kožních lézí vyvolaných kyselinami a tvorbě keratitidě podobných lézí na rohovce), získané chladné a teplé kopřivky, lupénky, ekzému, bulózního pemfigoidu fotodermatózy, poruch hor15 nich a dolních dýchacích cest, specifické a nespecifické hyperreaktivity, vázomotorické rýmy, astmatu, chronické artritidy a gastrointestinálních lézí.

Materiály a metody:

Zjišťoval se gastroprotektivní účinek NABPC157 na žaludeční léze (vyvolané u krys působením 96% etanolu, kontrolovaným stresem a aplikací indometacinu (indomethacin). Možný vliv smyslových neuronů na prospěšné účinky NaBPC157 (10 pg/kg, 10 ng/kg i.p.) se studoval s kapsaicinem, který má velmi zřetelné účinky na smyslové neurony: vysoká dávka podávaná dospělým zvířatům (125 mg/kg s.c., (subkutánně), stáří tři měsíce), nebo podávání (50 mg/kg

s.c.) novorozeným zvířatům (sedm dní starým) zničí smyslová vlákna, zatímco nízká dávka (500 pg/kg i.p.) aktivuje uvolnění neurotransmiteru a ochranné účinky na sliznice.

Výsledky:

(i) Při nepřítomnosti kapsaicinu NaBPC 157 ochraňoval žaludeční sliznice proti etanolu, kontro30 lovanému stresu a aplikaci indometacinu.

(ii) Při neurotoxických dávkách kapsaicinu je negativní účinek kapsaicinu na kontrolovaným stresem vyvolané, etanolové nebo indometacinové léze vždy ovlivněný prospěšnou aktivitou NaPBCl 57. Ochranný vliv NaBPC157 byl stále zřejmý u modelů ve všech pokusech, kde se použil kapsaicin (buď použitý u dospělých jedinců, nebo nově narozených mláďat). Po půso35 bení kapsaicinu na nově narozená mláďata se dosáhlo úplného zrušení gastroprotektivního účinku NaBPCl 57, jestliže byl tento aplikován jednotlivým ng-způsobem. Ochrana sliznic se plně obnovila, když se stejná dávka aplikovala denně.

(iii) Ve spojení s excitační dávkou kapsaicinu se prospěšný účinek NaBPCl 57 dále zvyšuje.

Celkově tyto údaje demonstrují komplexní synergickou interakci mezi prospěšnou aktivitou NaBPCl57 a peptidergickou senzorickou aferentní neuronovou aktivitou. Vezme-li se v úvahu značná podobnost účinku kapsaicinu u zvířat a lidí, může být NaBPCl57 použit (ve světle výše uvedených experimentů) pro léčení výše uvedených poruch.

Příklad 15: Ochrana endotelu

Úvod:

Je známé, že poranění cévního endotelu předchází vývoji a je nutným předpokladem pro vážná poškození orgánů. Ochrana endotelu by mohla omezit škodlivé následky ischémie na integritu sliznic. Jako užitečný model se široce používá aplikace Monastral Blue krysám krátce před aplikací nekrotizujícího činidla (např. do žaludku aplikovaný etanol) o kterém se ví, že vytváří velké léze.

- 13 CZ 299423 B6

Materiál a metody:

Všem krysám byl aplikován intravenózně (i.v.) Monastral Blue (MB) (Sigma Company, USA) (1 ml/kg tělesné hmotnosti) 3 minuty před působením etanolu. Krysy se pak usmrtily za 1 minutu po působení etanolu. NaBPC157 (10,0 pg/kg i.p.) nebo fyziologický roztok (5,0 ml/kg i.p.) se aplikovaly 1 hodinu před působením etanolu. Ihned po usmrcení se vyjmul žaludek a nezávislí pozorovatelé zhodnotili léze. Pro histologickou analýzu se dále zpracovaly reprezentativní části žaludku a dvanáctemíku.

ío Cévní poškození se hodnotilo také technikou využívající Monastral Blue (MB) v časných fázích experimentu (1 minutu po působení etanolu). Plošná hustota obarvené sliznice se hodnotila pomocí TEM.

Výsledky:

Opakovaně se pozorovala značná redukce obarvení MB u skupin, kde se aplikoval NaBPC157. Blízká podobnost použitých modelů s lidskými ukazuje možnost použít NaBPC157 pro léčení stavů spojených s poškozením endotelu při léčbě lidí.

Příklad 16: Angiogeneze

Úvod:

Angiogeneze má zásadní význam pro tvorbu granulační tkáně a léčbu zranění a/nebo vředů. S použitím všeobecně známých metod se studovaly angiogenní vlastnosti.

Materiál a metody:

Každé kryse byly implantovány subkutánně v oblasti beder dva sterilní tampóny (1 x 1 x 0,25 cm (V=0,25 ml)) se stejným množstvím NaBPC157 (roztok 50 pg, 10 pg a 10 ng/ml) nebo referenčních látek - cimetidin (10 mg, 100 mg, 500 mg/ml), ranitidin (2,5 mg, 25 mg, 250 mg/ml), famotidin (10 mg, 50 mg, 100 mg/ml) a sukralfát (1 mg, 5 mg, 10 mg/ml). Tampóny se odstranily za tři a za sedm dní. Po jejich fixaci ve formalinu následovalo zpracování pro histologické a histo35 chemické zhodnocení a morfometrickou analýzu. Používal se mikroskop DIAPLAN firmy Leitz, pro morfometrickou analýzu se použil program „SFORM“ vytvořený firmou VAMS (Záhřeb, Chorvatsko).

Výsledky:

Jako cenné kvantitativní měřítko reakce hostitele na cizí těleso (body) se běžně používá hodnocení nově vytvořeného granulačního pletiva okolo implantovaného tampónu. Experimenty s krysami usmrcenými tři dny po implantaci ukázaly toto: ve skupině zvířat ošetřených NaBPC157 bylo možné pozorovat podstatně více granulačního pletiva než v kontrolní skupině. Podobné výsledky se pozorovaly u krys ošetřených sukralfátem, a to u všech použitých koncentrací. Naproti tomu nebyl rozdíl mezi kontrolními a pokusnými hodnotami u všech tří skupin, kde se aplikovaly H2-blokátory. U zvířat analyzovaných sedm dní po implantaci se od kontrolní skupiny významně lišily jednak ty, kde byly aplikovány všechny tři koncentrace sukralfátu a pak ty, kde se použila nejvyšší koncentrace NaBPC157 (50 pg). Kontrolní hodnoty u obou zkoušených termínů se významně nelišily.

Uvnitř nově vytvořeného granulačního pletiva se spočítaly endoteliální prostory. V porovnání s kontrolními hodnotami (počet nově vytvořených endoteliálních prostorů u kontrolní skupiny tři dny po implantaci byl 7,94±1,23 a sedm dní po implantaci 14,8±3,12) všechny použité substance způsobily významné zvýšení hodnot u obou intervalů (třetí a sedmý den). Kromě důkazu, že

- 14CZ 299423 B6 různé protivředové látky mají stejné angiogenní vlastnosti, NaBPC157 také stimuluje (stejně jako sukralfát) granulaci. NaBPC157 se tak může použít pro vyvolání a podporu procesu hojení zejména poranění a/nebo při léčení vředů.

Příklad 17: Zánět

Úvod:

ίο V současnosti používané protizánětlivé látky jsou většinou hodnocené pomocí mnoha vhodných modelů, které věrně představují akutní a/nebo chronické zánětlivé poruchy u lidí. Jako vážný vedlejší efekt těchto látek se ale objevují vážné gastrointestinální léze.

U NaBPC157 byla zaznamenána akutní protizánětlivá a analgetická aktivita (např. terpentýnem, karagninem, kyselinou octovou nebo MgSO₄ vyvolané kroucení v ((prostaglandin-dependentních nebo prostaglandin nedependentních) testech bodnutí do ocasu) společně s antipiretickým účinkem (pokles kvasinkami indukované horečky (4000 mg/kg s.c.)). Následovně byly současně sledovány u krys jeho známé prospěšné účinky na gastrointestinální léze, jeho vliv na chronické zánětlivé léze jako je adjuvanční artritida ajeho vliv jako nesteroidního protizánětlivého činidla u

NSA1A indukovaných gastrointestinálních lézí.

Materiál a metody:

U studií gastrointestinálních lézí (indometacin (30 mg/kg s.c.), aspirin (400 mg/kg i.g.) a diklofe25 nak (125 mg/kg i.p.)) byl NaBPC157 (10 pg nebo 10 ng/kg i.p.) podáván pravidelně buď současně s a/nebo jednu hodinu před podáním látky (indometacin). U studií adjuvanční artritidy (aplikace 0,2 ml Freundova adjuvans do ocasu) (14 dní, 30 dní, 1 rok) se NaBPC157 (10 pg nebo 10 ng/kg i.p.) podal při jedné aplikaci (buď 1 hodinu před nebo po aplikaci Freundova adjuvans) nebo v režimu jedenkrát denně (0 až 14 den, 14 až 30 den a 14 den až 1 rok).

Výsledky:

Byl-li podávaný společně se zkoumaným NSAIA, omezil NaBPC157 pravidelně jinak významné léze v žaludku u kontrolních krys a také léze v tenkém střevě u indometacinových skupin. Při studiích artritidy vyvolané adjuvans byl vývoj lézí značně omezen po jedné aplikaci NaBPC157 a ještě více omeze nu krys, kterým byl NaBPC157 podáván denně. Při terapii již vzniklé adjuvanční artritidy se prospěšný vliv NaBPC157 trvale objevoval po pouhých 2 týdnech léčení a byl zcela zřejmý po jednom roce aplikace. Tato data ukazují protizánětlivý a ochranný účinek NaBPC157 na integritu sliznice.

Je známé, že se na zprostředkování adjuvanční artritidy podílí dva odlišné mechanismy - zánět a opožděná hypersenzitivita. NaBPC157 má pozitivní vliv na oba dva. Při porovnání s referenčními standardy (např. aspirin, indometacin) byl NaBPC157 účinný ve značně nižších dávkách (pg a ng/kg oproti mg/kg). Tato počáteční účinnost v prevenci adjuvanční artritidy je ještě výraznější při denním podávání. Vyšší dávka (10 pg/kg) byla účinná jak při jednorázovém tak při denním podávání, zatímco nižší dávky (10 ng/kg), které byly neúčinné při jednorázové aplikaci, se ukázaly jako účinné při denním podávání. Toto zjištění (ve spojení s terapeutickým účinkem NaBPC157 na plně rozvinutou artritidou) ukazuje na užitečnost aplikace během celého průběhu adjuvanční artritidy. Zaznamenaná účinnost NaBPC157 na adjuvanční artritidu (profylaktic50 ký/terapeutický účinek, rozvinutá/nerozvinutá adjuvanční artritida) nebyla pozorována u v současnosti používaných terapeutických látek. Glukokortikoidy jsou účinné pro prevenci adjuvanční artritidy jenom jsou-li aplikované denně, ale ne při krátkodobém léčení. Imunosupresanty (ve vysokých dávkách) a nesteroidní analgetika jsou účinné pouze při předběžném podávání nebo následném podávání.

- 15 CZ 299423 B6

Je tedy zřejmé (na základě blízké příbuznosti mezi použitým modelem a odpovídajícími lidskými poruchami), že NaBPC157 se svým ochranným účinkem na sliznice se může použít pro působení při situacích vztahujících se k akutnímu zánětu a chronické artritidě. Navíc se NaBPC157 může použít pro léčení potíží spojených s zpožděným typem hypersenzitivních poruch a gastrointesti5 nálními lézemi indukovanými v různých částech gastrointestinálního traktu, zejména takových, jaké indukují činidla jako například NSA1A.

Příklad 18: Efekt akceptoru volného radikálu io

Materiál a metody:

Hodnotil se hepatoprotektivní účinek NaBPC157 v porovnání s referenčními standardy, jako je například bromokriptin, amantadin a somatostatin v různých experimentálních modelech poško15 zení jater u krys: 24-hodinové podvázání žlučovodu a jatemí tepny, 48 hodinový kontrolovaný stres a aplikace CCI4 (látka indukující volné radikály). NaBPC157 se aplikoval buď do žaludku (intragastricky), nebo intraperitoneálně.

Výsledky:

NaBPC157 významně zabraňoval vývoji nekrózy jater nebo tukovým změnám u krys, kterým byl podvázán na 24 hodin žlučovod nebo jatemí tepna, nebo které se podrobily 48 hodinovému kontrolovanému stresu nebo aplikaci CC1₄ (1 ml/kg i.p., usmrcení po 48 hodinách). Ostatní referenční látky měly v těchto pokusech buďto malý, nebo žádný protektivní účinek. Laboratorní testy bili25 rubínu ukázaly, že se SGOT a SGPT plně shodovaly s makro/mikroskopickými nálezy. NaBPC157 se tedy může použít pro léčení jatemích onemocnění. Kromě toho je reprodukovatelným modelem pro studium dynamiky normalizace hematopoetických elementů myelosuprese způsobená ozářením. NaBPC157 vykazuje prospěšné vlivy na poškození kostní dřeně indukované subletálním ozářením. NaBPC157 se tak může použít k léčení kostní dřeně poškozené radiací.

Vzhledem k obecně známému vlivu CC1₄ na vznik volných radikálů a tvorbou lézí, lze také očekávat přínosný efekt aplikace NaBPC157 na léze na orgánech vyvolané dalšími volnými radikály, zvláště ozářením.

Příklad 19: Katecholaminergní systém Úvod:

Nepřímo působící sympatomimetické látky, jako amfetaminy, mají společné vlastnosti, mezi které patří jak indukce zvýšené produkce katecholaminu, tak inhibice nového příjmu katecholaminu (především dopaminu) v nervových zakončeních centrální nervové soustavy (CNS). Zdá se, že výsledkem aktivace dopaminergického systému v corpus striatum je stereotypní chování. Obecně se předpokládá, že zvýšené šplhavé chování vyvolané amfetaminem je důsledkem zvýšené hladiny receptoru striatálního dopaminu po aplikaci haloperidolu, který je antagonistou dopa45 minu. To následně vyvolává zvýšenou citlivost na amfetamin. Aplikace NaBPC157 neovlivňuje základní chování ani nevyvolává stereotypy.

Materiál a metody:

Studoval se vliv NaBPC157 na doplňkové působení dopaminu na amfetaminové (10 mg/kg) stereotypy a dráždivost. NaBPC157 se aplikoval buď v rámci společného profylaktického ošetření, nebo v prospěšném terapeutickém režimu (10 pg nebo 10 ng/kg i.p.). Stereotypní chování a dráždivost byly vyvolávány u krys.

- 16CZ 299423 B6

Výsledky:

Pravidelně se zaznamenalo zmírnění a změna (aplikace při maximálním amfetaminovém rozrušení) stereotypního chování a zvýšené dráždivosti (např. náhlé silné záškuby, panické vyskakování a útěk).

Pozornost se dále zaměřila na sledování účinků NaBPCl57 na zvýšené šplhavé chování myší. Myši byly předem ošetřeny, antagonistou dopaminu, haloperidolem (5,0 mg/kg i.p.) a následně se aplikoval amfetamin (20 mg/kg i.p. 1,2, 4 a 10 dní po aplikaci haloperidolu), což je běžný postup ío při studiu stimulačního účinku amfetaminu na supersenzitivitu v chování. Pokud by se tedy ukázalo, že potlačení amfetaminového stereotypního chování je způsobeno antagonní aktivitou (přímou nebo nepřímou) testovaného NaBPCl 57 na dopamin, bylo by možné očekávat, že haloperidol vyvolá zvýšené amfetaminové šplhání. Když však byl NaBPCl57 podán společně s haloperidolem, bylo zaznamenáno téměř úplné potlačení. Uvedené výsledky dokazují interakci

NaBPCl57 s dopaminovým systémem. Navíc interakce NaBPCl57 s centrálním dopaminovým systémem se prokázala i u dalších experimentálních modelů (např. při ochraně proti stresovým vředům). Interakce s dopaminovým systémem byla zjištěna již dříve u mnoha známých peptidů (neurotensin, CCK, atd.). Aplikace NaBPCl57 také ruší změny v chování vyvolaném LSD (např. 0,3 mg/kg i.p.). NaBPCl57 má schopnost vyvolávat změny dopaminového systému. V podmín20 kách zvýšeného uvolňování a syntetizování dopaminu indukovaném amfetaminem, by NaBPCl 57 mohl jak předcházet, tak bránit následnému rozrušení změnám chování (např. stereotypnímu chování). NaBPCl57 by také mohl výrazně oslabit následky blokace receptorů dopaminu haloperidolem. To svědčí o tom, že účinek NaBPCl57 zahrnuje také nahrazení jinak zcela nedostatečného dopaminového systému. Tím je zabráněno následné supersenzitivitě dopa25 minových receptorů a zvýšenému amfetaminovému rozrušení.

NaBPCl 57 je tedy užitečný prostředek pro léčení schizofrenie, vlivu amfetaminu (schizofrenních forem psychózy) a zneužívání drog.

Příklad 20: Stres

Úvod:

Stres je definován jako nespecifický jev, který vede k poškození různých orgánů. Stresová reakce je definována jako odezva namířená proti různým poškozujícím vlivům. Jedním z nejčastěji používaných zvířecích stresových modelů je stres způsobený omezením vedoucí k závažným stresovým gastritickým lézím u krys. Poškozeny mohou být i další orgány.

Materiál, metody a výsledky:

Pokud byl NaBPCl57 aplikován v dávce 10 pg nebo lOng/kg těl.hm., i.p. nebo i.g. 1 hodinu před vyvoláním stresu, bránil NaBPCl57 výrazně jinak nevyhnutelné tvorbě těžkých gastritických lézí. Byla-li doba mezi aplikací látky snižující stres a indukcí stresu (dále jen „perioda“) prodloužena, byly standardně používané protivředové látky prakticky neúčinné, narozdíl od jasného pozitivního účinku testovaného NaBPC157. NaBPC157 si zachoval tuto léčebnou aktivitu i při extrémně prodloužené periodě na 48 hodin. Ochranný účinek NaBPCl 57 zahrnoval zeslabení lézí, které se jinak pravidelně objevují na dalších orgánech (např. játrech, nadledvinkách, ledvinách, varlatech, srdci, slinivce, slezině). Protože i další obecně známé stresové parametry jsou méně narušeny (tj. thymolymfatická involuce a kortikální hypertrofie nadledvinek), je zjevné, že NaBPCl57 by mohl být aplikován při různých stresových podmínkách. NaBPCl57 má pozitivní léčivý účinek na léze objevující se na různých orgánech souvisejících s nespecifickou stresovou patologií. Vzhledem k podobným řetězovým událostem u lidí jako u použitého modeluje efekt ještě mnohem výraznější, protože NaBPCl57 má léčebný účinek dokonce je-li aplikován při pokročilé stresové patologii (např. 24 hodin po indukci stresu).

- 17CZ 299423 B6

Příklad 21: Ukázka cytoprotektivního účinku

Úvod:

Cytoprotekce byla původně definována jako schopnost chránit buňky před různými škodlivými látkami, tento efekt nezávislý na žaludeční kyselině byl zjištěn u žaludeční sliznice. Později byla tato definice rozšířena o ochranný účinek mimo gastrointestinální trakt zahrnující léze na různých orgánech (cytoprotekce-organoprotekce). Pro hodnocení pozitivního cytoprotektivního účinku NaBPC 157 byl zvolen původní Robertsův model používaný při testování cytoprotektivních látek ío na gastritických lézích vyvolaných etanolem.

Materiál, metody a výsledky:

NaBPC 157 (10 pg nebo 10 ng/kg i.p.) měl profylaktický účinek (pokud byl aplikován 1 hodinu před nebo současně s 96 % etanolem (1 ml/krysa i.g.) a léčebný efekt (byl-li aplikován 1 hodinu po aplikaci etanolu v době maximální tvorby lézí).

Aby bylo vytvořeno prostředí prosté kyselin pro cytoprotektivní studie, byla provedena celková gastrektomie 24 hodin před indukcí vředů. Škodlivé účinky cysteaminu (400 mg/kg s.c., usmrce20 ní po 24 hodinách), který je dosud považován za kyselý duodenální ulcerogen, a cytoprotektivní účinek NaBPC 157 (10 pg nebo 10 ng/kg i.p.) a dalších referenčních cytoprotektivních látek (citimedin (50), ranitidin (10), omeprazol (10), bromocriptin (10) a atropin (10) (hodnoty uvádějí mg/kg i.p., 1 hodinu před cysteaminem), byly hodnoceny za nepřítomnosti žaludku a žaludečních kyselin. U neošetřených krys s intaktním žaludkem měly všechny použité látky přínosný efekt. U zvířat s odstraněným žaludkem aplikace sledovaných látek (např. NaBPC 157 nebo referenční látky použité před aplikací cysteaminu) významně bránily vývoji jinak těžkých duodenálních lézí, které byly zaznamenány u kontrolních cysteaminových krys s odstraněným žaludkem. U skupin, kterým nebyl podán cysteamin, nebyl výskyt lézí zjištěn (laparotomie a gasteroktomie pouze 24 hodin nebo 48 hodin po chirurgickém zákroku), ani nebyl zjištěn sklon k tvorbě lézí u laparotomických zvířat, kterým byl cysteamin aplikován. Tyto výsledky (stejné poškození cysteaminem, stejný ochranný účinek NaBPC 157 a referenčních látek u krys po gastrektomii s intaktním žaludkem a bez žaludku, poškozující nebo ochranný účinek nezávisí na sekreci žaludečních kyselin) svědčí o cytoprotektivním účinku. Lze předpokládat analogii (léze nesouvisející se žaludeční kyselinou) mezi gastritickými (např. etanol) a cysteaminovými duodenálními poškoze35 nimi. Vysoká „cytoprotektivní kapacita“, zjevně nezávislá na kyselině, byla společná pro všechny testované látky, ale nejmarkantněji se projevila u NaBPC 157.

Protože se účinek NaBPC 157 projevil už při mnohem nižších dávkách než u ostatních látek (např. pg nebo ng/kg vs. mg/kg), jeho účinnost (a terapeutické použití) může být rozšířeno i na léze na dalších orgánech. Účinnost jiných látek v jiných orgánech je způsobena taktéž jejich cytoprotektivním účinkem (např. somatostatin: léze na nadledvinkách, slinivce, játrech, plicích a gastrointestinálním traktu).

Příklad 22: Ukázka organoprotektivního účinku Úvod:

Pro rozšíření „cytoprotektivního“ účinku na účinek „organoprotektívní“ je obecně akceptováno hodnocení ochrany endotelu. Jasným indikátorem poškození žaludeční sliznice způsobeného etanolem u krys je studium pomocí Monastral Blue. Toto poškození je dobře rozpoznatelné díky schopnosti Monastral Blue vázat se na poškozený endotel.

- 18CZ 299423 B6

Materiál a metody:

Všem krysám byl podán Monastral Blue (MB) (Sigma Company, USA) (1,0 ml/kg těl.hm., i.v.) 3 minuty před etanolem a zvířata byla usmrcena 1 min po podání etanolu. 1 hodinu před aplikací etanolu byl zvířatům podán NaBPC157 (10 pg/kg i.p.) nebo fyziologický roztok (5,0 ml/kg i.p.). Ihned po usmrcení byl žaludek vyjmut a tvorba lézí hodnocena nezávislým pozorovatelem, jak již bylo dříve popsáno. Reprezentativní části žaludku a dvanáctemíku byly připraveny pro další histologickou analýzu. Vaskulární poranění v časném období (1 minutu po aplikaci etanolu) bylo stanoveno pomocí Monastral Blue. Plocha obarvené sliznice byla zjištěna pomocí TEM.

Výsledky:

U skupin ošetřených NaBPC157 byla shodně zaznamenána silná redukce MB-obarvení. Navíc při aplikaci NaBPC157 nebyly zaznamenány žádné negativní účinky, žádný vliv na různé základní parametry ani toxicita, a to ani při vysokých dávkách (např. g/kg těl. hm., i.p.).

Vzhledem k velkému rozšíření endotelových vaskulámích tkání v těle a zásadnímu významu ochrany endotelu při organoprotekci, může být NaBPC157 použit jako organoprotektivní látka u různých orgánových lézí.

Příklad 23: Akutní pankreatitida

Materiál a metody:

NaBPC157 byl testován na krysách jako ochranná nebo terapeutická látka při akutní pankreatitidě (vyvolané podvázáním žlučovodu). Ve stejnou dobu byl sledován efekt NaBPC157 na vznik průvodních žaludečních a dvanáctemíkových lézí.

NaBPC157 (10 pg nebo 10 ng/kg b.w., i.p., i.g.) byl podáván proiylakticky 1 hodinu před podvázáním, zatímco terapie byla prováděna denní aplikací 1 den po podvázání (poslední aplikace 24 hodin před usmrcením). Účinek byl hodnocen v denních intervalech až do konce pátého dne po podvázání.

Výsledky:

Při předběžném ošetření bylo docíleno silné ochrany pankreatu. Zjevný léčebný efekt byl opakovaně zaznamenán, byla-li látka aplikována již v době silně rozvinuté pankreatitidy. U krys ošetřených NaBPC157 se hodnotil vznik nekrózy, otoku, neutrofilů a monocytů. Bylo zjištěno zjevně méně nekrózy, otoku a neutrofilů, ale více monocytů. Při hodnocení obsahu amylas v séru byl zjištěn jejich výrazně nižší nárůst (při předběžné aplikaci NaBPC157) v porovnání s kontrolou nebo pokles původně zvýšených hodnot (při terapii pomocí NaBPC157). Současně s příznivým působením na pankreatitidu, byl u krys s podvázaným žlučovodem zaznamenám pozitivní vliv NaBPC157 na průběh tvorby žaludečních a dvanáctemíkových lézí, jak při předběžné tak při následné aplikaci látky. Celkově vzato může být NaBPC157 použit pro ošetření akutní pankreatitidy se současným pozitivním účinkem na gastroduodenální patologii.

Příklad 24: Účinek na kardiotoxicitu

Materiál a metody:

Experimenty byly prováděny na krysách Albino Wistar a morčatech Hartley. Kardiotoxicita byla vyvolána pomocí roztoku chloridu barnatého (10 mg/kg těl. hm.), desipraminu (10 mg/kg), digi55 talis (celková dávka 6,5 mg/kg) a isoprenalinu (15 mg/kg) aplikovaného kanylou do krční žíly.

- 19CZ 299423 B6

Navíc byla u zvířat indukována kardiomyopatie podáním doxorubicinu v několika dávkách (3 mg/kg, i.v., jednou týdně po dobu 13 týdnů) a jednorázově (7 mg/kg). Kardiotoxicita byla také vyvolána imobilizačním stresem jako nefarmakologické poškození myokardu. NaBPC157 byl aplikován, jakje níže popsáno:

1. Chlorid bamatý

a) předběžné ošetření (1 hodinu předem): NaBPC157 50 pg/kg, 10 pg/kg a 10 ng/kg, intraperitoneálně;

b) následné ošetření (po 60 sekundách): NaBPC157 10 pg/kg a 10 ng/kg, intravenozně; ío 2. Desipramin: NaBPCl 57 50 pg/kg a 50 ng/kg, intraperitoneálně 1 hodinu předem;

3. Digitalis: NaBPCl57 50 pg/kg a 50 ng/kg, intravenozně v intervalech 15 minut;

4. Isoprenalin: NaBPCl57 50 pg/kg a 50 ng/kg intravenozně 15 minut předem;

5. Imobilizační stres: NaBPC157 10 pg/kg a 10 ng/kg, intraperitoneálně, jednu hodinu před a bezprostředně po spoutání a po 24 a 48 hodinách imobilizace;

6, (a) chronická doxorubicinová toxicita: NaBPC157 10 pg/kg a 10 ng/kg, intraperitoneálně současně s doxorubicinem;

(b) akutní doxorubicinová toxicita: NaBPC157 10 pg/kg a 10 ng/kg, intraperitoneálně, 1 hodinu před doxorubicinem.

Při sledování arytmie byl u zvířat pod anestézií průběžně zaznamenáván elektrokardiogram. Každých 15 sekund nebo při poruchách rytmu, byly prováděny rozsáhlé záznamy při 50 mm/s nebo 100 mm/s. U dalších modelů byl zaznamenáván elektrokardiogram jednorázově nebo opakovaně se zvířaty pod krátkodobou anestézií při rychlosti posunu papíru 50 mm/s. Toxicita doxorubicinu byla hodnocena u srdce a dalších orgánů makroskopickým a mikroskopickým pozorováním a biochemickými metodami. Podobný postup byl použit při hodnocení imobilizačních testů. Výsledky:

V modelových studiích sledujících vliv NaBPCl 57 na arytmie vyvolané chloridem barnatým, byl zaznamenán protiarytmický efekt látky. Byl-li NaBPCl 57 aplikován předem, zpomaloval a bránil vzniku arytmií a také snižoval nebo bránil vzniku ischemie. V experimentech, ve kterých byl NaBPCl57 aplikován až po indukci, způsoboval NaBPCl57 rychlý návrat k sinusovému rytmu a bránil vzniku arytmie.

NaBPCl57 úplně zabránil poklesu tepové frekvence a poruchám vodivosti indukovaných desipraminem (PQ prodloužení a QRS rozšíření). NaBPCl57 také bránil ventrikulámí tachykardii související s proarytmickým účinkem desipraminu a těžkou atrioventrikulámí blokací. Tento účinek závisí na použité dávce.

NaBPCl57 má navíc selektivní účinek u kardiotoxicity indukované digitalis. NaBPC157 pozitivně působil při náhlé změně tepové frekvence a poruchách rytmu (ventrikulámí extrasystola, ventrikulámí tachykardie a atrioventrikulámí blokace) tím, že těmto projevům předcházel neboje oslaboval. Vliv NaBPCl57 v ng dávkách na zpomalení vodivosti vyvolané toxickými dávkami digitalis, nebyl významný. Účinek byl více patrný při mikrogramových dávkách NaBPCl57.

NaBPCl 57 jasně bránil vzniku ischemie a infarktu myokardu. Účinek byl více patrný při mikrogramových dávkách. Jednorázová intraperitoneální aplikace NaBPCl57 formou předběžného ošetření zamezovala vzniku elektrokardiograficky prokazatelné ischémie a histologickému poškození myokardu v imobilizačních testech. Ischémii mírnili i následné podání NaBPC157 při zjevných elektrokardiografických změnách. Mikrogramové dávky NaBPCl57 zvyšovaly napětí QRS komplexu, a to zvláště byly-li podány předem.

-20CZ 299423 B6

Aplikace NaBPC 157 vede k významnému snížení patomorfologického nálezu při kardiomyopatii (těžké poškození myocytů a cévních stěn, a vakuolizace) vyvolané antracyklinem při jednorázové a, ve větším rozsahu, opakované, aplikaci doxorubicinu. Aktivita LDH je významně snížena, přestože jsou výrazně zvýšeny absolutní hodnoty.

Uvedené výsledky indikují, že NaBPC157 je prospěšnou antiarytmickou, antianginální a kardioprotektivní látkou.

ío Příklad 25: Antidepresivní aktivita Materiál a metody:

Různé antidepresivní látky mají také antiulcerózní aktivitu a modely, běžně používané při výz15 kumu vředů a depresí, jsou do značné míry shodné. Možnost účinného ovlivnění depresivního poškození primárně antiulcerózní látkou s cyto-/organo-protektivním účinkem jako je NaBPC 157 byla sledována u dvou způsobů indukce depresí: test nuceného plavání (postup podle Porsolta) a metoda chronického nepředvídatelného stresu (po pěti dnech nepředvídatelného stresu podle protokolu, jednorázová denní aplikace látky během stresovacího postupu a vyhodnocení pomocí imobilizačního testu v otevřeném poli čtvrtý a šestý den medikace).

Výsledky:

V testu nuceného plavání byla doba imobilizace krys ošetřených NaBPC 157 (10 pg, 10 ng, lOpg/kg, i.p.) srovnatelná s aktivitou zvířat ošetřených 15 mg nebo 40 mg (i.p.) konvenčních antidepresiv, imipraminem nebo nialamidem. Po dalším ztížení experimentálních podmínek při testu chronického nepředvídatelného stresu nebyl imipramin účinný, zatímco NaBPC 157 (10 pg, 10 ng) zlepšoval mobilitu chronicky stresovaných krys v závislosti na výši podané dávky.

Příklad 26: Model Parkinsonovy choroby Materiál a metody:

V experimentu byly aplikovány látky vyvolávající Parkinsonovu chorobu, 1-methy M-fenyl1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) (známý destrukcí dopamin nigrostriatálního systému produkcí volných radikálů) (30,0 mg/kg těl. hm., i.p. jednou denně po dobu šesti dnů a dále čtyři dny jedenkrát 50,0 mg/kg těl. hm., i.p.) nebo reserpin (látka vyčerpávající katecholaminové vezikula) (5,0 mg/kg těl. hm., i.p.). NaBPC157 (1,50 pg nebo 15 ng/kg těl. hm., i.p.) byl aplikován

15 minut před nebo 15 minut po podání MPTP. V pokusech s reserpinem byl NaBPC 157 (10 pg nebo 10 ng/kg těl. hm., i.p.) podán 15 minut před reserpinem nebo, v případě již vzniklé úplné katalepsie, 24 hodin poté.

Výsledky:

NaBPC 157 výrazně zlepšoval narušenou somatosenzorickou orientaci vyvolanou pomocí MPTP a snižoval hyperaktivitu indukovanou MPTP. Dále také NaB PC 157 snižoval motorické abnormality (třes, akinezii, katalepsii, které byly jinak zcela nápadné u kontrol ošetřených pouze fyziologickým roztokem), které téměř zcela odstranil, zatímco u kontrol mělo ošetření MPTP letální průběh. V experimentech s reserpinem bránil NaBPC157 silně rozvoji jinak velmi výrazných projevů katalepsie. Pokud byl NaBPC 157 aplikován 24 hodin poté, zvrátil průběh již vzniklé katalepsie. Kromě těchto hlavních účinků NaBPC 157, bylo také zaznamenáno snížení reserpinové hypotermie (při předběžném ošetření NaBPCl 57) a zabránění dalšímu teplotnímu poklesu (při následné aplikaci NaBPC 157).

-21 CZ 299423 B6

Je známo, že oba výše zmíněné běžně používané zvířecí modely odpovídají lidským poruchám a jejich léčení. NaBPC157 prokázal vysokou účinnost byl-li aplikován jak předběžně tak následně v pg a ng dávkách, a proto se zdá být vhodnou látkou pro léčení Parkinsonovy choroby a dalších patologií podobných Parkinsonově chorobě. Navíc, pozorovaný účinek na reserpinovou hypo5 termii opravňuje k závěru, že NaBPC 157 je vhodnou látkou pro léčení poruch teploty.

Příklad 27: Působení na hojení kostních defektů ío Materiál a metody:

Osteogenní působení kostní dřeně a TRIS-BPC157 na hojení segmentálních kostních narušení, byl sledován u 42 králíků po dobu šesti týdnů po operaci. Po poranění (byl vytvořen 0,8 cm osteoperiosteální defekt uprostřed obou radií) byl experiment s použitím kostní dřeně a TRIS15 BPC 157 (6 králíků v každé skupině) proveden následujícím způsobem: jako kontrola byla použita zvířata ošetřená pouze fyziologickým roztokem (2 ml intramuskulámě a 2 ml lokálně do každého kostního defektu) (skupina 1). U druhé a třetí skupiny byl každý kostní defekt ošetřen lokálně buď 2 ml vlastní kostní dřeně (7. den po operaci), nebo TRIS-BPC157 (10 Fg/kg těl. hm., 7. a 14. den po operaci). U čtvrté, páté a šesté skupiny byl TRIS-BPC157 aplikován intra20 muskulámě (i.m.) buď 7., 9., 14. a 16. den po operaci (10 pg/kg těl. hm.), nebo jednou denně 7. až 21. den po operaci (10 pg nebo 10 ng/kg těl. hm.). Jako standardní ošetření bylo v sedmé skupině použito vyplnění kostního defektu autologním kortikálním transplantátem ihned po jeho vzniku.

Všechna experimentální zvířata byla usmrcena šestý týden po operaci. Hojení segmentálních kostních defektů bylo hodnoceno dvakrát týdně radiograficky a histologickými zkouškami. Výsledky:

Paralelní porovnávání radiografů provedených ve čtyřech časových obdobích (povrch kalusu, mikrofotodensitometrie kostního defektu) a kvantitativní histomorfometrie ukázaly, že kostní dřeň injikovaná do kostního defektu a intramuskulámí aplikace TRIS-BPC157 (zvláště při denní dávce 10 pg/kg těl. hm. v průběhu 14 dní) významně zvyšovala hojení kostí (p<0,001). Tento účinek se shodoval s efektem autologního kortikálního transplantátu.

Z klinického hlediska je závažné, že kostní dřeň a TRIS-BPC157 (zvláště při denní dávce 10 pg/kg těl. hm. v průběhu 14 dní) vyvolávaly hojení kostních defektů. Vzhledem k jednoduché aplikaci a nízkému riziku komplikací je lokálně aplikovaná autologní kostní dřeň a zvláště intramuskulámě podaná osteogenní látka, jako např. TRIS-BPC157, mnohem výhodnější, než jiné komplexnější chirurgické metody (např. kostní transplantáty, vaskularizované kostní transplantáty, Ilizarova metoda) používané k ošetření takových poškození u lidí.

Příklad 28: Působení na hojení zranění

Materiál a metody:

NaBPC 157 byl použit pro hodnocení jeho vlivu na různé prvky procesu hojení. Za prvky důležité v procesu hojení jsou vznik granulovaných tkání, angiogeneze a produkce kolagenu. Působení

NaBPC 157 na vznik granulované tkáně, tvorba kolagenu a angiogeneze, stejně jako síla v tahu, byl testován u tří krysích modelů: 1) kožní řezná poranění, 2) anastomóza tračníku a 3) esofagoduodenální anastomóza. Ve vzorcích byl histologicky testován kolagen, reticulin a krevní vlásečnice pomocí počítání a morfometrickými metodami.

-22CZ 299423 B6

Výsledky:

Ve všech experimentech byl zjištěn významný rozdíl mezi krysami ošetřenými NaBPC157 a kontrolami. Experimenty ukazují velmi přínosný účinek NaBPC 157 v procesu hojení. Tohoto účinku bylo docíleno při různých způsobech aplikace, včetně aplikace ingastrické a lokální. U krys ošetřených NaBPCl 57 byla také zjištěna větší síla v tahu.

Vzhledem k blízké příbuznosti zvířecího modelu s odpovídajícími poškozeními u člověka a vysokému stupni podobnosti hojivého procesu u krys a u lidí, může být NaBPC 157 použit při hojení ío poranění u lidí.

Příklad 29: Působení na respirační poškození

Materiál a metody:

V experimentech byla použita morčata (Hartley, obou pohlaví, 500-700 g těl. hm.), u kterých byla prováděna pletizmografie celého těla při anestezii urethanem (1,5 g/kg i.p.), řízeném dýchání pod konstantním tlakem (0,98 kPa) a při uvolnění kosterní muskulatury suxamethoniem (0,2 mg/kg i.v.). Celkový objem vdechnutého vzduchu (mm, průměr ± SD) byl stanoven před a po aplikaci spasmogenních látek (histaminu, serotoninu, acetylcholinu, bradykininu, i.v.) nebo NaBPCl57 (10 minut před opakovanou aplikací spasmogenu, i.v.).

Výsledky:

NaBPCl57 inhiboval pokles objemu vdechnutého vzduchu vyvolaný serotoninem, histaminem, acetylcholinem, a bradykininem (10 pg/kg těl. hm., i.v. nebo 10 ng/kg těl. hm., i.v.).

Na základě zjištěného léčivého účinku NaBPCl57 na bronchokonstrikci indukovanou spasmo30 genními látkami a známé podobnosti mezi použitým modelem a těmito stavy u člověka, je možné usoudit, že aplikace NaBPC 157 bude úspěšná při léčení různých poškození souvisejících s bronchokonstrikcí a poškozeními dýchacího traktu.

Příklad 30: Vliv na syndrom plicní hypertenze Materiál a metody:

Současné pokusy popisují působení agonistů a antagonistů oxidu dusnatého (NO) a působení

NaBPCl57 na rozvoj syndromu plicní hypertenze a vznik tkáňových lézí u kuřat. Byly provedeny experimenty sledující akutní toxicitu. V těchto pokusech bylo jednorázovou aplikací podáno: fyziologický roztok (1 ml/kg, i.p.), NaBPC157 (10 pg/kg těl. hm.), L-NAME (NE - antagonistická / v dávkách 50, 100, 150 mg/kg těl. hm.) a L-arginin (NE-agonistická / 100 mg/kg těl. hm./ s jejich kombinací (L-NAME + NaBPCl57, L-NAME + L—arginin)). Byl proveden histo45 patologický rozbor sleziny, srdce, jater a ledvin a hematologická analýza. Dále byly provedeny experimenty sledující chronickou toxicitu. Zvířata byla ošetřena denně po dobu pěti týdnů pomocí L-NAME (10 mg/kg těl. hm.), L-argininem (100 mg/kg těl. hm.), NaBPC157 (10 pg/kg těl. hm.) a jejich kombinací (L-NAME + NaBPC 157, L-NAME + L-arginin) intraperitoneálně. Z každé skupiny, včetně kontrol (fyziologický roztok 1 ml i.p.), bylo každý týden usmrceno sedm zvířat.

Výsledky:

Aplikace L-NAME vyvolala u ošetřených kuřat PHS. Tomuto efektu bylo zabráněno při součas55 né aplikaci L-argininu a NaBPC 157. Při histopatologickém vyšetření jak akutní tak chronické

-23CZ 299423 B6 toxicity bylo zjištěno, že L-NAME působil těžké poškození tkání (nekrózy srdečních a jatemích buněk, nekrózy lymfatických buněk sleziny) zatímco L-arginin vyvolával převážně kongesce, otoky a hemoragii ve všech orgánech. Hematologická analýza prokázala významné snížení množství hemoglobinu a počtu leukocytů ve skupinách kuřat ošetřených L-NAME. Účinky L5 NAME byly úspěšně inhibovány aplikací L-argininu a NaBPC157. NaBPC157 nevyvolával žádná poškození tkání ani orgánů.

Vezmeme-li v úvahu podobnost výše použitého zvířecího modelu s obdobnými poškozeními u člověka, může být NaBPC 157 použit při léčení syndromu plicní hypertenze. Navíc je zřejmé, že ío jej lze s výhodou použít v komerčních chovech.

Příklad 31: Experimentální hypertenze

Materiál, metody a výsledky:

U hypertonických (Goldblattova hypertenze) zvířat se dvěma ledvinami (2K1C) nebo jednou ledvinou (1K1C), snižoval NaBPC157 rychle krevní tlak (např. 5 nebo 10 minut po injekci). Tento účinek trval 20 minut u 1K1C krys nebo 12 hodin u zvířat 2K1C. Tento účinek byl opako20 vaně zjištěn po druhé nebo třetí aplikaci po 24 až 48 hodinách. Podobně také u krys krmených delší dobu stravou s vysokým obsahem fruktózy (80 %) nebo soli (15 %), NaBPC 157 výrazně snižoval krevní tlak na normální hodnotu. Tento terapeutický účinek je dlouhodobý a nevytvořila se k němu tolerance ani po šestiměsíčním užívání. Nebyl zaznamenán žádný vliv NaBPC 157 na hodnotu bazálního krevního tlaku.

Kromě snížení jinak zvýšeného krevního tlaku, NaBPC 157 výrazně zeslaboval nebo dokonce odstranil léze a poškození, které se za normálních podmínek objevují na různých orgánech, jako byly (po třítýdenním krmení zvířat stravou se zvýšeným obsahem soli): velmi těžká hyalinní degenerace s výraznými parenchymovými hemoragiemi, degenerace stěn artérií, vakuolizace srdečních buněk, těžké kongesce (zvláště medulámí) v nadledvinkách, těžké kongesce, parenchymatické hemoragie s hematurií v ledvinách a hemosideróza a erytrocytofagie ve slezině. U krys ošetřených NaBPC157 byly cévy mnohem méně poškozeny a také byla zjištěna menší vakuolizace stěn a nepřítomnost hemoragii. Navíc byla také u krys ošetřených NaBPC 157 jasně potvrzena ochrana proti poškození fundu.

Při použití různých modelů hypertenze u zvířat byly v případě NaBPC 157 (v dávce 10 pg nebo 10 ng/kg těl. hm., i.v., i.p. nebo i.g.) dosaženy shodné výsledky v různých režimech.

Vezmeme-li v úvahu podobnost výše použitého zvířecího modelu s obdobnými poškozeními u člověka, může být NaBPC 157 použit při léčení hypertenze a různých poškození orgánů způsobených hypertenzí.

Příklad 32: Vliv na délku krvácení

Materiál a metody:

Byl hodnocen efekt 2-AMP-BPC157 na délku krvácení u myší a krys (s nebo bez předběžného ošetřením heparinem) v souvislosti s jeho in vitro aktivitou na parametry krevní srážlivosti lidské krve.

Výsledky:

V základních podmínkách (2-AMP-BPC157, 10 pg, lOng, lOpg, 1 pg, lOfg/kg těl. hm., i.p.

současně s ustřižením ocasu) byla jasně prokázána redukce délky krvácení u myší a krys a její

-24CZ 299423 B6 úroveň závisela na použité dávce látky. V experimentech, ve kterých byl použit heparin (1000 IU/kg i.p.) (2 hodiny před začátkem krvácení) k předběžnému ošetření, bylo pravidelně zjišťováno výrazné snížení doby krvácení u zvířat, jimž byl podán 2-AMP-BPC157 (10 pg nebo 10 ng/kg těl. hm., i.p.). V in vitro experimentech s lidskou krví nebyl zaznamenán žádný vliv látky (2-AMP-BPC157 v koncentraci 10 pg/ml, inkubace 1 hodinu) na parametry krevní srážlivosti. Lze tudíž očekávat působení na vrstvu endotelu.

Vezmeme-li v úvahu blízkou podobnost mechanizmů krvácení u lidí a zvířat a obecně uznávaný význam modelů použitých pro testování látky, může být 2-AMP-BPC157 použit k ošetření ío poruch koagulace (např. heparinizace).

Příklad 33: Působení na experimentální diabetes

Materiál, metody a výsledky:

Experimenty na krysách prokázaly, že intraperitoneálně podaný NaBPC157 (i.e. 10 pg/kg těl. hm.) bránil rozvoji diabetů indukovaného alloxanem nebo streptozotocinem. V průběhu čtrnácti dní byla zjištěna snížená glykosurie a méně ostrůvkových lézí. V našich předběžných pokusech jsme zjistili, že byl NaBPC157 účinný i v případě, byl-li aplikován v době již vzniklých čtrnáctidenních lézí vyvolaných alloxanem. V dalších experimentech bylo studium antidiabetického účinku NaBPC157 změřeno na aktivitu látky při intragastrické aplikaci. NaBPC157 (v dávkách 10 pg a 10 ng/kg těl. hm.) byl kombinován s aplikací alloxanu v dávce 300 mg/kg s.c. nebo 200 mg/kg těl. hm., s.c., předem (24 hodin nebo 1 hodinu před alloxanem, současně nebo po (48 hodin po aplikaci alloxanu). NaBPC157 obecně snižoval zvýšený obsah glukózy v séru a významně zvyšoval přežívání zvířat ošetřených alloxanem (tento efekt byl zvlášť patrný při vyšších dávkách alloxanu). Je zajímavé, že kromě zvýšené hladiny glukózy v séru u zvířat, kterým byl aplikován alloxan, byl zaznamenán zvýšený výskyt lézí v žaludku u kontrolních diabetických krys. NaBPC157 významně snižoval u všech variant závažnost vředů nezávisle na způsobu ošet30 ření. U myší byly získány v podstatě stejné výsledky.

Vzhledem k podobnosti lidské patologie a uvedených modelů ajejich širokému použití při testování aktivity látek, může býtNaBPC157 použit při léčení diabetů.

Příklad 34: Působení proti bolesti

Materiál a hodnoty:

Působení NaBPC157 proti bolesti bylo hodnoceno porovnáním s referenčními standardy aspirinem a morfínem u různých experimentálních modelů přímé nebo nepřímé bolesti a neurotoxicity: svíjení zvířat (kyselina octová/síran manganatý), štípnutí do ocasu, horká deska a aplikace kapsacinu.

Výsledky:

NaBPC157 (v dávce pohybující se v ng nebo pg/kg, i.p.) významně redukoval svíjení (zánětlivé a nezánětlivé), závislé a nezávislé na prostaglandinu) a na testování štípáním do ocasu. Při testech na horké desce, neměl NaBPC157, narozdíl od morfinu, žádný vliv u normálních zvířat.

NaBPC157 byl podáván formou předběžného ošetření nebo jednou denně po dobu 14 dní po injekci kapsaicinu. V těchto experimentech NaBPC157 silně snižoval capsaicin-allodynia. Toto snížení účinku kapsaicinu nenastalo, pokud byl NaBPCl 57 aplikován po vznik somatosenzorické degeneraci neuronů způsobené kapsaicinem (aplikace pouze 14. den po kapsaicinu). Pokud tedy lze denní aplikací NaBPCl57 zcela zamezit, jinak nevyhnutelnému somatoneuron depletion vyvolanému kapsaicinem, je také možné, že by účinky NaBPCl57 mohly specificky souviset

-25CZ 299423 B6 s celistvostí somatosenzorických neuronů citlivých na kapsaicin ajejich ochranou (tj. primárně aferentní neurony s malým průměrem a unmyelinated (C-) nebo slabě myelinated (A-8) vlákny.

Vzhledem k tomu, že kapsaicin může vyvolávat v podstatě stejná poškození jak u lidí, tak u zví5 řat, může být NaBPCl 57 použit při léčení různých bolestivých stavů a také v případech provázených oslabením somatosenzorické funkce neuronů.

Příklad 3 5: Působení na křeče io

Materiál a metody:

Účinek KBPC157 byl sledován při křečích vyvolaných bicculinem, picrotoxinem, strychninem a isoniazidem. KBPC157 (100 pg, 10 pg nebo 10 ng/kg těl. hm.) byl aplikován (i.p.) současně nebo 15 minut před aplikací látek vyvolávajících křeče (mg/kg těl. hm., i.p.): picrotoxinu (3), strychninu (6, 3 nebo 1,5), bicucullinu (2,5) a isoniazidu (800 mg).

Výsledky:

KBPC157 opakovaně pozitivně působil proti křečím, vyvolaným všemi použitými látkami (v závislosti na čase a dávce). Vzhledem k podobnosti těchto použitých modelů s podmínkami u člověka, může být KBPC157 použit při ošetření křečových stavů.

Příklad 36: Poškození páteře Materiál a metody:

Poškození páteře bylo způsobeno u samců krys Albino Wistar řízeným tlakem (vaskulárním klip30 sem Aesulap 0,10-0,15 N) na odkryté páteři (na úrovni Thl2) po dobu 30 sekund. Zvířata byla ošetřena pomocí KBPC157 (10 pg, 10 ng/kg těl. hm., i.p.) nebo fyziologickým roztokem ihned po poranění a pak jednou denně až do desátého dne po poranění. Zvířata byla usmrcena 24 hodin po poslední dávce.

Výsledky:

Experimenty byly hodnoceny pomocí podrobné klinické (hodnoceny denně, bodovým hodnocením 1 až 5) a mikroskopické analýzy. Při vyhodnocení bylo zjištěno výrazné zeslabení jinak přetrvávající paralýzy (u kontrolních krys) u krys ošetřených NaBPCl57. Uvážíme-li podobnost těchto použitých modelů s podmínkami u člověka, může být NaBPCl57 použit při terapii poškození páteře.

Příklad 37: Chronická intoxikace alkoholem

Materiál a metody:

Byl zkoumán vliv NaBPCl57 na chronickou intoxikaci alkoholem. V pokusech byli použiti krysí samci Albino Wistar. Krysám byl podáván po tři měsíce alkohol, a to buď komerční whiska, nebo etanol (10 až 20% vodný roztok). Podávání NaBPC157 (10 pg, lOng/kg brutto váhy), propranololu (lOmg/kg brutto váhy) a ranitidinu (10 mg/kg brutto váhy), (kontrolním krysám byl podáván stejný objem fyziologického roztoku (5.0 ml/kg)), se dělo buď přímo do žaludku, nebo intraperitoneálně. Podávání přípravků sloužilo buď jako profylaxe (bylo podáno 10 dní před začátkem podávání alkoholu), nebo jako léčivo současně s podáváním alkoholu, či jako léčivo,

-26CZ 299423 B6 kdy podávání začalo po skončení dvouměsíční periody, to znamená v průběhu posledního měsíce pokusu.

Výsledky:

Přímé stanovení krevního tlaku ve vrátnici jasně ukázalo, že NaBPCl57, stejně tak propranolol (podávané v jakémkoli výše zmíněném uspořádání) prokazatelně zabraňují, nebo dokonce snižují zvýšení krevního tlaku, který se zvýšil u kontrolních krys. Naopak ranitidinová terapie vedla dokonce k většímu zvýšení krevního tlaku v žilách, než tomu bylo u kontrolních zvířat. Mimoto, ío podávání NaBPCl57, více než tomu bylo u propranololu, je schopno značně zmírnit výskyt vývinu poškození žaludku u krys, kterým byl podáván alkohol. Podobný prospěšný vliv byl pozorován také u poškození dalších orgánů, to je například u ledvin a srdce.

Vezmeme-li v úvahu tyto existující pozitivní vlivy a všeobecně známý fakt, že zvýšený příjem alkoholu se projevuje podobnými změnami také u lidí, je zřejmé, že podávání NaBPCl 57 je užitečné v léčení poškození vyvolaných příjmem alkoholu.

Příklad 38: Vlivy na mozkové ischemické poruchy

Materiál a metody.

Aplikovalo se NaBPC157 (10 pg nebo lOng/kg brutto váhy, i.p.) nebo fyziologický roztok (5.0 ml/kg, brutto váhy, i.p.), a to jednu hodinu před nebo jednu hodinu po tom, co byly obě arte25 rie (karotidy) u krys podvázány na dobu 3 až 6 hodin.

Výsledky:

Byl patrný silný pozitivní vliv podávání NaBPCl57, a to u obou uspořádání pokusu, to znamená jak při podávání u krys jednu hodinu před podvázáním, tak u podávání jednu hodinu po podvázání. Toto pozitivní působení bylo patrné ve všech uspořádáních pokusu, jak u pg tak ng množstvích, jak u tříhodinové, tak i šestihodinové studie. Bez použití daných preparátů, byly nejčastějšími charakteristickými pozorováními vážné perivaskulámí a mozkové tkáňové otoky s mozkovými kongescemi. Také byly pozorovány oblasti s demyelinizací, obzvláště v oblasti malého mozku. Všechny tyto projevy se vyskytovaly ve značně menší míře u skupin zvířat ošetřených NaBPC 157, a to bez ohledu na podmínky léčení.

Co se týká vážných ischemických poškození, které byly zaznamenány u kontrol a dále zjevných podobností mezi ischemickými poruchami vyskytujících se u krys a lidí, není pochyb o výhodách aplikace NaBPCl 57 pro léčení poškození mozku u lidí.

Příklad 39: Vliv na poranění nervu

Materiál a metody:

Zkoumal se vliv NaBPC 157 na regeneraci periferálních nervů. U krysích samců Wistar (225 až 250g) v anestezi byl odhalen pravý sedací nerv, očištěn od zbytků vodivého pletiva a přerušen 5 cm distálně od ischiatické incizury. K anastomóze byly použity tři perineurální stehy (10.0 Ethilon, Ethicon), tak aby byla obnovena správná funkce svalu. Zvířata byla ošetřena dávkou 1 ml (2 pg/ml nebo 2 ng/ml) NaBPCl57, buď lokálně v místě anastomózy, nebo do žaludku či intraperitoneálně (10 pg nebo 10 ng/kg brutto váhy) ihned po provedení anastomózy. Kontroly obdržely stejný objem fyziologického roztoku. V určený den po provedení chirurgického zákroku (3, 6, 9, 12 a 30 den) byly provedeny testy na funkčnost. Testy obsahovaly test na horkou vodu (60 °C), studenou vodu (2 °C), analýzu dráhy, kterou krysy ušly, EMG-distální latenci a ampli-27CZ 299423 B6 tudu CMAP. Také byly zahrnuty histologické a morfometrické analýzy. V dalších pokusech za použití stejných chirurgických metod a toho samého nervu, bylo způsobeno zranění mačkáním pomocí chirurgických pinzet po dobu 60 sekund a NaBPC157 bylo aplikováno lokálně. Posouzení výsledků bylo provedeno po 2, 7, 10, 50 a 100 dnech.

Výsledky:

Aplikace NaBPC157 byla posouzena buď klinicky, nebo mikroskopicky a zvláště aplikace v raném stadiu se projevila zlepšením zdravotního stavu krys.

Z dokázané podobnosti mezi poškozením zvířat a lidí se ukazuje, že léčení aplikací NaBPC 157 se jeví být použitelné pro poranění periferních nervů.

Příklad 40: Vliv na neuroleptické poruchy

Byl zkoumán vliv NaBPC 157 na poruchy vyvolané neuroleptiky.

Materiál, metody a výsledky:

Aplikace NaBPC157 (10 pg nebo lOng/kg brutto váhy, i.p.) zásadně zeslabila chorobnou strnulost svalů (katalepsii) vyvolanou oběma neuroleptiky podávanými v malých následných dávkách, to je haloperidolu a fluphenazinu (haloperidol 0.625, 1.25, 2.5, 5.0 a 10.0 mg/kg brutto váhy, i.p.; fluphenazin 0.3125, 0.625, 1.25, 2.5 a 5.0 mg/kg brutto váhy, i.p. (4ml/kg). Kromě tohoto blaho25 dámého působení při nízkých dávkách neuroleptik, se projevil silný prospěšný antikataleptický efekt NaBPC 157 také s vyššími dávkami obou neuroleptik, a to jak u pg, tak u ng dávek NaBPC 157. Tento blahodárný vliv byl zaznamenán také na somatosenzorickou orientaci u zvířat, kterým byl podáván sulpirid v dávkách (20, 40, 80 a 160 mg/kg brutto váhy, i.p.), avšak u kontrolní skupiny myší, kterým byl podáván sulpirid, nebyla pozorována katalepsie.

Je zřejmé, že aplikace NaBPC 157 má velmi blahodárný vliv na léčení potíží spojených s dopaminovými systémy, kataleptickými potížemi a neuroleptickými poruchami.

Příklad 41: Aplikace při léčení šoku Materiál a metody:

Byl zkoumán hemoragický šok u uspaných krys (kanyla byla zavedena do krkavice a krční žíly).

Byly prováděny kontrolní odběry krve buď až do smrti zvířete, nebo až bylo dosaženo stabilizované nízké hodnoty tlaku krve (30 až 35mm Hg). V těchto pokusech byl podáván CaBPC157 (10 pg nebo 1 Ong/kg brutto váhy) nebo u kontrol intraperitoneálně fyziologický roztok (5.0 ml/kg brutto váhy), a to 15 minut před vykrvením nebo intravenózně (3.0 ml/kg) v pětiminutových intervalech od dosažení nízké stabilní hodnoty tlaku krve.

Výsledky:

V porovnání s kontrolami, u krys ošetřených CaBPC157 mohly být odsáty podstatně vyšší objemy krve (které byly závislé na dávce podaného preparátu) než nastala smrt zvířete. U zvířat, kte50 rým byl odsát určitý objem krve a také u zvířat s nízkým krevním tlakem, kterým byl podán CaBPC157, se ihned projevilo trvalé podstatné zvýšení tlaku krve a nedošlo k smrti zvířete. Tento poznatek jev rozporu s pozorováním krátkodobého zvýšení slabého krevního tlaku v experimentální periodě 45 minut před smrtí u 75 % krys z kontrolní skupiny.

-28CZ 299423 B6

U krys, které byly podrobeny pouze chirurgickému výkonu v narkóze a nebyla jim odebírána krev, podání CaBPC157 (i.p. nebo i.v.) nemělo po 65 minutové stabilizační periodě významný vliv na hodnoty tepenného krevního tlaku, který byl měřen po stejnou dobu po podání. Získané výsledky naznačují, že CaBPC157 by mohl být účinný při zlepšení následků ztráty krve.

Z dokázané podobnosti mezi použitým zvířecím modelem a poškozením u lidí se ukazuje, že aplikace CaBPC157 se jeví být použitelná pro léčení šokových stavů.

ío Příklad 42: Vliv na abnormální lymfocyty Materiál, metody a výsledky:

Byly zkoumány imunologické nálezy u dvou pacientek ženského pohlaví trpících vzácně se vys15 kytující klinickou formou dědičné eosinofilie spojené s intraepidermální puchýřkovou dermatitidou a subakutní sklerotizující panencefalitidou. Byl zkoumán vliv NaBPC157 (in vitro) na chromozómové aberace lymfocytů a proliferaci T buněk. NaBPC157 významně snižuje vážné chromozómové aberace (to znamená, že lymfocytové nálezy se normalizují) a je prokázán stimulační vliv na mitotické cykly

Příklad 43: Vliv na malformace

Materiál a metody:

Byl zkoumán vliv NaBPC157 na malformace vyvolané u myší vitamínem A.

Byl podáván NaBPC157 (10 pg nebo lOng/kg brutto váhy, i.p.) nebo fyziologický roztok (5ml/kg brutto váhy, i..p.) společně s vitamínem A (15,700 IU/kg, brutto váhy, i.m.) desátý den těhotenství. Jako kontroly sloužily myši, kterým nebyl podáván vitamín A, ale které obdržely stejnou dávku fyziologického roztoku ve stejnou dobu.

Výsledky:

Vitamínem A se indukoval určitý počet malformací. Toto množství bylo výrazně sníženo ve skupině myší, kterým byl podán NaBPC157. Je zřejmé, že aplikace NaBPC157 má blahodárný vliv na léčení poškození plodu.

Příklad 44: Chirurgické odnětí vaječníků Materiál a metody:

Ovariektomie byla provedena obvyklým způsobem. NaBPC157 byl aplikován v dávkách 10 pg nebo 1 Ong/kg brutto váhy, i.p., a to buď jednou denně po dobu 28 dnů, či jednou denně po dobu 14 dnů; začátek podávání přípravku byl v tomto případě 15 den po ovariektomii. V těchto dlouhých pokusech byla poslední dávka podána 24 hodin před usmrcením. Další skupina obdržela jednu pg dávku 15 den po ovariektomii. Jako kontrola bylo použito pět skupin zvířat: 2 skupiny byly podrobeny ovariektomii, byl jim podán fyziologický roztok. Zvířata byla usmrcena buď

15, nebo 28 den po ovariektomii. Jedna skupina nebyla podrobena ovariektomii, ale byla ošetřena fyziologickým roztokem, dvě skupiny nebyly podrobeny ovariektomii, ale byly ošetřeny NaBPC157 (10 pg nebo lOng/kg brutto váhy, i.p.) po dobu 28 dní. Každému zvířeti byly 5 minut před chirurgickým zákrokem odebrány vaginální stěry, a to 9,14 a 28 den pokusu a tyto byly obarveny Pap na histologické ohodnocení. Stupeň zralosti vaginálního epitelu byl vyjádřen

-29CZ 299423 B6 pomocí hodnot maturace. Po usmrcení se z každého zvířete odebralo maximální množství kostí, které sloužilo k biomechanickému testování, které je popsáno dále.

Biomechanické testování:

Všechny kosti byly zkontrolovány z hlediska různých momentů ohýbání (jednobodový ohyb) (moment ohybu=Nm) v různých směrech, dopředu, dozadu a do stran. K těmto pokusům byly použity kosti stehenní a holenní. Tyto kosti byly upevněny kostním cementem (Palacos) do 1 cm dlouhých kovových trubiček. Kovové trubičky byly upevněny v zatěžovacím zařízení. Kosti byly ío kontinuálně udržovány ve vlhkém stavu. Měřila se délka volných částí kostí, to znamená délka od bodu uchycení k bodu natažení. Pokus byl prováděn podle principu ohybu kostí upevněných v jednom bodě až do bodu hraniční elasticity. Zatížen bylo 0.1, 0.2, 0.5, 0.7 a 1.0 N. Deformita, neboli úhel ohybu byl měřen jako úhel ohybu laserového paprsku, který byl odražen malým zrcadlem upevněným na konci kosti.Váha zrcadla byla připočtena k aplikované ohybové síle.

Milimetrový papír, na který byl laserový paprsek naměřen, byl vzdálen asi 1.5 až 1.8 m od kosti s upevněným malým zrcadlem. Úhel ohybu byl stanoven pomocí trigonometrických metod, a to během každého jednotlivého zatížení, následné deformace (a následného vrácení do původní polohy). Po přerušení zatížení se kost vrátila do své původní startovní polohy, což je důkaz, že nenastaly žádné strukturální změny kosti a že zatížení se provádí v rozsahu limitu elasticity daném Hookovým diagramem. Pozorování prokázala, že každou kost můžeme natáhnout dvakrát v různém směru, aniž by se změnila její struktura. Nebyla-li během dvou následujících minut sledována další deformace, nebo nebylo-li dosaženo vrácení do původního stavu, byl tento bod považován za konečný (obecně se časy měření pohybovaly v rozmezí 30 sekund u kontrol po ovariektomii nebo 16 minut u zdravých zvířat). Úhlová deformita kosti (zatížení a návratnost po zatížení) byla vyjádřena v mm/sec.

Výsledky:

Denní podávání dvou dávek NaBPCl57 se projevilo významným zvýšením hodnoty maturace v porovnání s atroficky sníženou hodnotou maturace u neléčených krys. Z tohoto pozorování vyplývá, že Na BPC 157 je schopen zabránit vaginální atrofii způsobené kastrací u krys.

U kontrolních skupin krys podrobených ovariektomii byla pozorována nejnižší amplituda ohýbání v nejkratším čase, stejně tak nejnižší amplituda navrácení do původního stavu. Stejně nízké hodnoty byly získány u obou kontrolních skupin usmrcených buď 15, nebo 28 den. Toto pozorování bylo uskutečněno u obou krys podrobených ovariektomii, kterým byl podáván fyziologický roztok, které byly usmrceny buď 15, nebo 28 den po odejmutí vaječníků. Pozitivní tendence byla pozorována ve skupině, která obdržela jednu dávku NaBPCl 57 (mikrogramové množství) 15 den po odejmutí vaječníků. Srovnatelně lepších výsledků bylo dosaženo ve všech dalších skupinách ošetřených NaBPCl57, a to jak v nano, tak mikrogramových množstvích. Nejlepších výsledků bylo dosaženo ve skupině, která obdržela denně NaBPCl57 v mikrogramových množstvích po dobu 28 dnů. Všechny parametry sledované u krys podrobených ovariektomii byly výrazně lepší a hladiny zlepšení měly tendenci dosáhnout parametrů získaných u skupiny zdravých zvířat. Žádné rozdíly nebyly zaznamenány mezi skupinami zdravých krys bez ohledu na to, zda byly ošetřeny fyziologickým roztokem, nebo NaBPC 157 (pg nebo ng dávky).

Vezmeme-li v úvahu obecně přijímaný význam tohoto zvířecího modelu pro podmínky provedení ovariektomie u lidí, obě pozorování, která mají vliv na atrofii pochvy a vývoj osteoporosy, dokazují, že NaBPCl 57 by mohl být prospěšný v léčení stavů spojených s odejmutím vaječníků.

Příklad 45: Nádory Materiál, metody a výsledky:

-30CZ 299423 B6

Jeden z běžně používaných modelů experimentálních tumorů zahrnuje určení počtu metastáz karcinomu a melanomu B-16 u myší. Stejně jako je tomu u dalších experimentálních nádorů, tyto tumory sdílejí mnoho podobností svých projevů s projevy poškození u lidských pacientů. Byl-li podle různých protokolů podáván NaBPC157, došlo u léčených myší v porovnání s odpovídající5 mi kontrolami ke snížení počtu metastáz, Ehrlichův ascitický tumor (EAT) je nádor, který může růst ve všech kmenech myší. Může růst v ascitické nebo pevné formě, což záleží na způsobu podání nádorových buněk. Ačkoli obecně řečeno, zvířecí nádory sdílejí jen některé rysy s nádory lidskými, použití tohoto modelu nalezlo velkou odezvu díky snadnému aplikování v protinádorovém výzkumu.

Přežití (dny) myší, kterým byly injekčně aplikovány buňky Ehrlichova ascitického nádoru, se pohybovalo ve většině případů pod hranicí méně než 25 dnů. Předcházející inkubace nádorových buněk s NaBPC 157 (2 pg/ml) vedla k prodloužení života zvířat, kterým byly tyto buňky injekčně aplikovány. Více než 90 % zvířat se dožilo konce sledovaného období 45 dnů. Navíc, většina cytostatických léčiv indukuje, jak u pokusných zvířat, tak u lidských pacientů neutropenii. K. vyvolání neutropenie se běžně používá cyklofosfamid. Při aplikaci fosfamidu v dávce 180mg/kg, i.p. bylo nalezeno prokazatelné poškození. NaBPCl57 chrání před neutropenii, a to tím, že snižuje hladinu retikulocytů a zlepšuje hladiny hemoglobinu.

Lze tedy dojít k závěru, že proti nádorová aktivita NaBPC 157 je zřejmá. Vezmeme-li v úvahu podobnosti mezi zvířecím modelem a lidským organizmem a dále prospěšný vliv přípravku v podmínkách in vivo, ale také in vitro, ukazuje se možné použití NaBPC 157 v proti nádorové terapii. NaBPC 157 je vhodný pro zeslabení škodlivých projevů cytostatik.

Příklad 46: Protivirová aktivita

Materiál a metody:

ARBO viry (virus encefalitidy přenášené klíšťaty (TBE), Bhania virus, Denguel,2,3,4, Sinbis, west Nile, Ealovo), virus hepatitidy A, lymfatické choriomeningitidy (LCM) a Herpes virus 1 byly aplikovány buď i.c., nebo p.o. (post operačně) - virus hepatitidy A jako virová suspenze, v ředění 10 ² (0.02ml/myš). NaBPC 157 (20 pg/kg brutto váhy) nebo 0.9% NaCl (0.02ml/myš) byly aplikovány buď i.c., nebo i.p., a to následovně:

před aplikací viru současně s aplikací viru dny po projevení infekčních příznaků odpovídajících dané nemoci.

Výsledky:

Při simultánní aplikaci NaBPC 157 a virů se projevilo zpoždění příznaků nemoci a z nich vyplývající smrti (u kontrolních zvířat se příznaky projevily 4 až 5 den po infekci). Byl-li přípravek podán až při projevu vážných příznaků infekce, výsledky potvrdily prodloužení času přežití. Prokazatelné bylo při a aplikaci NaBPC 157 před infekcí kompletní neprojevení se příznaků nebo úmrtí.

K. potvrzení získaných výsledků se zkoumala virulence použitých virových suspenzí (ARBO virů) testováním pomocí ošetřeny NaBPC 157 nebo roztokem soli a přežily pokus (NaBPC 157) (i přes aplikaci virů) nebo spontánně zemřely (i když byly ošetřeny fyziologickým roztokem). Na rozdíl od mozkových suspenzí z myší ošetřených fyziologickým roztokem (které se nelišily od virových suspenzí myší inokulovaných fyziologickým roztokem), ve skupině myší inokulovaných mozkovými suspenzemi připravenými z myší ošetřených NaBPC 157 se neprojevily žádné příznaky nemoci ani úmrtí. Myši byly sledovány 50 dní po provedení inokulace mozkovými suspenzemi.

-31 CZ 299423 B6

Prospěšný vliv NaBPC 157 byl nezávislý na zvýšení teploty během inkubace (56 °C po dobu 30 minut).

Vezmeme-li v úvahu, že tyto viry vyvolávají podobné příznaky i u lidí, NaBPC 157 by mohl být použit v léčbě těchto virových onemocnění, zejména v těch terapiích, kdy je obecně kondice pacienta oslabena (to znamená při AIDS nebo AIDS- podobných podmínkách).

Příklad 47: Zažívací poruchy

Materiál a metody:

U krys byl zkoumán vliv NaBPCl 57 (10 pg nebo lOng/kg brutto váhy, i.p., i.g.) v porovnání s referenčními standardy v experimentálních modelech žaludečních vředů: (48 hodin trvající stres, cysteamin subkutánně, intragastrické testy na žaludeční vředy využívající 96% alkoholu, NAIA-léze, DNFB (dinitrofluorbenzén), jícnový reflux následující po spojení jícnu a lačníku pomocí anastomózy) (vše při podání přípravku před, společně a po zákrocích).

Výsledky:

Jen u testovaných modelů, které zahrnovaly aplikaci NaBPCl 57, se projevil kladný vliv na průběh nemoci.

Přípravky bromocrriptin, amatidin, cimetidin a somatostatin byly zcela neúčinné (odstranění stresu) nebo jen částečně účinné (bromocriptin, DNFB- intestiální lézel; sucralfát, ranitidin, cholestyramin- jícnový reflux). Co se týká referenčních peptidů, ochrana nastala v závislosti na dávkování (cysteamin) a částečný pozitivní vliv (závisející na podmínkách léčení) (etanol) byl získán s glukagonem, NPY a sekretinem, zatímco CCK/26-30/ byl neaktivní.

Vzhledem k tomu, že se všechny tyto modely běžně používají pro výzkum léčení gastrointestinálních poruch, tak se aplikace NaBPC 157 jeví prospěšná pro léčení poruch celého intestinálního traktu.

Příklad 48: Vliv na poruchy vnímání Materiál a metody:

Aplikace anticholinergních přípravků (scopolamin, atropin, 11 mg/kg brutto váhy, i.p.) vedla k průkaznému deficitu vnímání u krys, pozorování úspěšně reprodukovala odhad chování zvířat po delší dobu uzavřených ve vodním T-labyrintu.

Výsledky:

V porovnání s kontrolou, vedla aplikace scopolaminu a atropinu k pozorování zvýšeného počtu chyb u pozorovaných krys. Tento deficit ve vnímání byl zcela zrušen (získané hodnoty byly rovny kontrolním hodnotám) pomocí následného podávání NaBPC 157 (10 pg nebo lOng/kg brutto váhy, i.p.).

Vzhledem k významu těchto velmi hojně používaných modelů pro výzkum poruch funkcí vnímání u lidí se jeví terapie pomocí NaBPCl 57 použitelná pro léčbu poruch vnímání.

-32CZ 299423 B6

Příklad 49: Vliv na abstinenční poruchy

Materiál, metody a výsledky:

NaBPC157 vykazuje protikřečové účinky interakcí s GABAergickým systémem a zlepšuje účinnost diazepamu, je-li podáván v dávkách (10 μg nebo lOng/kg brutto váhy, i.p.) současně sdiazepamem (5.0mg/kg, i.p., dvakrát denně po 10 dní). NaBPC157 zeslabuje toleranci diazepamu a oddaluje abstinenční poruchy a fyzickou závislost. V kvalitativních rozborech tolerance měřených 42 hodin byla po navykací životosprávě při léčbě isoniazidem (800mg/kg i.p.) pozoroio vána kratší prekonvulzivní latence než u zdravých myší, byl-li myším dříve léčeným pouze diazepamem znovu podáván diazepam (5.0mg/kg i.p.). Tento stav nenastal u zvířat léčených NaBPC157 (obě dávky) a diazepamem. V měřeních fyzické závislosti (prováděných 6,14,42 a 72 hodin po navykacím ošetření) byly pozorovány kratší prekonvulzivní latence u myší navyklých na diazepam, kterým byl následně podán isoniazid, a to 24 a 72 hodin po zvykací léčbě, než u nenavyklých zdravých myší. Léčba NaBPC 157 (dávka 10 yig/kg) kombinovaná sdiazepamem oddaluje tento vliv až do konce sledovaného intervalu. V této skupině po šestihodinových intervalech, na rozdíl od myší, kterým byl podáván diazepam, isoniazidové prekonvulzivní latence byly dokonce delší než u odpovídajících kontrol. NaBPC 157 nevyvolává žádný návykový efekt.

Vezmeme-li v úvahu význam těchto modelů pro výzkum v oblasti lidské medicíny, je jasné že NaBPC 157 je použitelný v léčení abstinenčních poruch.

Příklad 50: Vliv na poruchy ledvin

Materiál a metody:

Podávání chloridu rtuťnatého (1 mg/ml i.v.) nebo cysplatiny (lOmg/kg s.c.) vyvolává u pokusných zvířat akutní selhání ledvin. Je-li toto selhání ledvin indukováno u zvířat tímto způsobem, silně koreluje s odpovídajícím lidským poškozením. Následkem toho, poškození indukované u krys vykazuje velký stupeň podobnosti s odpovídajícím poškozením u lidských pacientů.

Výsledky:

NaBPCl 57 významně zeslabuje poškození krys, a to jak při podání před i po léčbě. Unilaterální nefrektomie (chirurgické odnětí ledviny) se projevuje funkčním přetížením a funkční hypertrofií zbylé ledviny. Léčení NaBPC 157 zvyšuje vylučování moči ledvinou u zvířat s odňatou ledvinou a snižuje hypertrofií zbývající ledviny. Tudíž vyjádřeno pomocí termínů funkční teorie kompenzační renální hypertrofie, tyto nálezy zdůrazňují zlepšenou funkci zbylé ledviny. Je to také potvr40 zeno dodatečnými biochemickými výsledky. Co více, tato data jsou v úplném souladu s vlivy pozorovanými u hypertenzních krys s renálním chorobným zúžením arterie nebo s unilaterální nefrektomií. Je zřejmé, že aplikace NaBPCl 57 v léčení poruch ledvin je prospěšná

Příklad 51: Buněčná imunitní odpověď periferních leukocytů v krvi

Sledovala se buněčná imunitní odpověď periferních leukocytů v krvi na BPC u kontrol a u pacientů s různými nemocemi vyjmenovanými v tabulce 2. Odpověď periferních T buněk na BPC byla testována metodou popsanou deSmetem a dalšími (deSmet MD a další: v .Cellular immune responces of patients with uveitis to retnal antigens and their fragments. Am. J. Ophtal., 110:135-142,990) v sedmidenních kulturách. Buňky byly inkubovány bez antigenu a s antigenem (BPC 157 pentadekapeptid) v koncentraci 20 pg/ml. pro každého pacienta byl vypočítán stimulační index dělením průměrného počtu antigenem stimulovaných kultur a průměrného počtu kontrolních buněčných kultur bez přidaného antigenu, to znamená BPC 157 pentadekapeptidu.

Tyto výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

-33 CZ 299423 B6

Kontrolní hodnoty menší než 2 měřené u kontrolních subjektů (tabulka 2) odpovídají hodnotám naměřeným jinými pracovníky pro peptidy s odpovídající molekulovou hmotností, to znamená, že nebyla shledána žádná citlivost periferních lymfocytů v krvi k BPC 157 pentadekapeptidu. U pacientů trpících různými nemocemi je patrná buněčná odpověď vyvolaná BPC (tabulka 2), která se projevuje senzibilizací systémových lymfocytů vyvolanou tímto peptidem z žaludeční šťávy. Získaná data jasně demonstrují přítomnost BPC-podobných poškození u pacientů trpících různými nemocemi. Z těchto poznatků vyplývá možnost aplikace BPC-podobných látek (to znamená například solí pentadekapeptidu BPC157) v imunomodulační terapii odpovídajících poruch.

Tabulka 2:

Zvýšená stimulace indexu periferálních krevních T buněk u 11 pacientů trpících různými nemo15 cemi

NEMOC	POHLAVÍ	INDEX STIMULACE
PEPTICKÝ VŘED	Ž	kontrol, hodnoty <2 26.82
ROZTROUŠENÁ SKLEROSA	Ž	13.80
SUBAKUTNÍ SKLEROTIZACE	Ž	2.54
PANENCEFALITIDA OPTICKÁ NEURITIDA	M	3.54
OPTICKÁ NEURITIDA	Ž	9.53
UVEITIDA	Ž	16.87
UVEITIDA	M	15.21
UVEITIDA	Ž	22.30
SERONEGATIVNÍ	Ž	4.99
S PONDYLOARTHROPATIE DĚDIČNÁ EOSINOFILIE A	Ž	2.70
PUCHÝŘUJÍCÍ DERMATITIDA UVEITIDA	Ž	4.75

Výsledky výše popsaných farmakologických výzkumů ukazují výhodnou aktivitu solí BPC pep20 tidů při ochraně organismu proti stresu a nemocím, obecně v normalizaci funkce organismu. Soli peptidů podle vynálezu jsou také účinné v prevenci a terapii několika lidských či zvířecích chorob a poruch.

-34CZ 299423 B6

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (14)

1. Sůl peptidu BPC, Body Protection Compound, skládající se z 8 až 15 aminokyselinových zbytků, kde je anion této soli negativně nabitý peptid obsahující sekvenci osmi aminokyselinových zbytků obecného vzorce ío [Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala]^! ’^{nebo (2_)}, kde

Xaa je neutrální zbytek alifatické aminokyseliny,

Yaa je zbytek bazické aminokyseliny a Zaa je zbytek kyselé aminokyseliny

20 a kde kation sole je kation anorganické nebo organické netoxické báze.

2. Sůl podle nároku 1, kde je kation vybrán ze skupiny sestávající se z alkalických kovů, kovů alkalických zemin, Zn²⁺, primárních, sekundárních a terciárních aminů, zvláště pak Na⁺, K⁺, Li⁺, Cs⁺, Ca²⁺, NH₄₊, triethanolaminu⁺, cyklohexylaminu⁺, 2-AMP⁺ (což je 2-amino-l-propanol) a

25 TRIS⁺ (což je Tris-(hydroxymetyl)-aminometan).

3. Sůl podle nároků 1 a 2, ve které

Xaa je Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle nebo Nva,

Yaa je Lys, Arg, Om nebo His a

Zaa je Glu, Asp, Aad nebo Apm.

35

4. Sůl podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 s peptidovou sekvencí obecného vzorce

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa 5 10

Aía Xaa Xaa Xaa 15

5. Sůl podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde peptid je vybrán ze skupiny skládající se z

-35 CZ 299423 B6

ajSU A*.a Glu Leu Pro Gly ?2TO Pxo 5 Val; 15 Gly Lys Pro Aua Asp 10 Asp Giv Glu Pro Pro Pro 5 Gly Lys Pro Ala Asp 10 Asp Ala Gi y Leu Val; 3. o Leu Si u Pro Pro Pro 5 Leu iyS Pro Ala Asp 10 Asp A-a Leu Gly Val ; 15 Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala 5 10 Leu Gly Val; 14 Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala 5 10 Gly Leu Val; 14

-36CZ 299423 B6

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala;

ó 8 ksp Pro Pro Pro lis Arg Prc· Ala Asp;

5 S

Glu Pro Pro Prc Leu Lys Pro Ala .Asp;

C o

Leu Glu Pro Pro Prc Leu Lys Pro Ale Asp Ala

O «u v

Leu Giy Val;

•Gly Glu Pro Pro Pro Giy Arg Pro Ala Asp a = 10

Giu Pro Pro Pro Leu Lys Prc .Ala -Asn.

5 2

6. Sůl podle kteréhokoli z předchozích nároků, kde je peptid cyklizován, zvláště pak amidickou vazbou mezi prvním a posledním aminokyselinovým zbytkem.

5

7. Sůl podle kteréhokoliv z předchozích nároků, která je rozpuštěná ve vodném roztoku, nebo v roztoku voda/alkohol, nejlépe spH v rozmezí od 6,0 do 8,5.

8. Farmaceutická směs, stabilní při skladování, vyznačující se tím, že obsahuje farmaceuticky účinné množství soli BPC peptidu podle kteréhokoliv z předchozích nároků a

10 případně íyziologicky přijatelný nosič.

9. Farmaceutická směs podle nároku 8 pro perorální podávání, vyznačující se tím, že jako fyziologicky přijatelný nosič obsahuje trehalózu.

15 10. Diagnostická směs, stabilní při skladování, vy z n a č uj í c í se t í m , že obsahuje diagnosticky účinné množství soli BPC peptidu podle kteréhokoliv z předchozích nároků.

11. Použití solí BPC peptidu podle kteréhokoli znároků 1 až 7 pro přípravu farmaceutické směsi, stabilní při skladování, podle nároku 8, pro léčení:

20 poruch spojených buď s tvorbou oxidu dusnatého (NO), nebo s narušením funkcí systému NO, zvláště pak hypertenze, angíny, impotence, oběhového a septického šoku, mrtvice, zánětu, syndromu respirační tísně, adheze a agregace krevních destiček a leukocytů, endotelové dysfunkce, gastrointestinálních lézí, poruch peristaltiky, pankreatické cukrovky, hypotenzí a Parkinsonovy nemoci;

25 dysfunkce či hyperfunkce somatosenzorických nervů, zvlášť pak senzorické neuropatie, postherpetické neuralgie, atopické dermatitidy, k zhoršenému hojení poraněných pletiv, získané chladné či teplé kopřivky, lupénky, bulózního pemfigoidu, ekzémů, fotodermatózy, chronické artritidy,

-37CZ 299423 B6 gastrointestinálních poškození a specifické a nespecifické hyperreaktivity horních a dolních cest dýchacích, astma, rýma; poškození endotelu; poranění, vředů;

5 podmínek vztahujících se k akutnímu či chronickému zánětu, zvláště pak chronické artritidy a poškození vyskytujících se u opožděného typu hypersenzitivity a gastrointestinálních lézí; poškození jater, orgánové léze způsobeného volnými radikály specificky vyvolanými zářením;

poškození spojená s poruchou katecholaminergního systému, zvláště pak schizofrenie, vlivů vyvolaných amfetaminem, při zneužívání léků;

10 podmínek souvisejících se stresem;

akutní pankreatitidy; zvláště pak s průvodními gastroduodenální patologií; srdečních poruch;

depreseivních stavů;

Parkinsonovy nemoci a patologických projevů podobných Parkinsonově nemoci;

15 poruch teploty; poškození kosti;

poškození různých orgánů vyvolaného hypertenzí; poruch koagulace; bolestivých poruch;

20 křečovitých poruch; zranění míchy;

poškození alkoholem, která jsou způsobena zneužitím alkoholu, nebo jeho zvýšeným příjmem; mozkových ischemických poruch; poškození periferních nervů;

25 kataleptických potíží a neuroleptických poruch;

poruch spojených s abnormálními či mutantními lymfocyty; poškození plodu;

vaginální atrofie a vývoj osteoporózy způsobené ovariektomií; tumorů;

30 virových onemocnění, zvláště pak AIDS nebo ARC;