JP6843625B2 - 様々な疾患の処置のためのjnk阻害剤分子の新規使用 - Google Patents
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Description
第1の態様において、本発明は、療法によるヒト又は動物の身体の疾患の処置のため、特に、本明細書に開示される疾患/障害の処置のための方法における使用のための、
以下の一般式:
X1−X2−X3−R−X4−X5−X6−L−X7−L−X8(配列番号1)
(式中、
X1はアミノ酸R、P、Q及びrから選択されるアミノ酸であり、
X2はアミノ酸R、P、G及びrから選択されるアミノ酸であり、
X3はアミノ酸K、R、k及びrから選択されるアミノ酸であり、
X4はアミノ酸P及びKから選択されるアミノ酸であり、
X5はアミノ酸T、a、s、q、kから選択されるアミノ酸であるか、又は存在せず、
X6はアミノ酸T、D及びAから選択されるアミノ酸であり、
X7はアミノ酸N、n、r及びKから選択されるアミノ酸であり、
X8はF、f及びwから選択されるアミノ酸であるが、
但し、X1、X2、X3、X5、X7及びX8からなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個又は6個はD−アミノ酸である、好ましくは、X3、X5、X7及びX8からなる群から選択されるアミノ酸の少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個又は4個はD−アミノ酸である)
の阻害的(ポリ)ペプチド配列を含むJNK阻害剤に関する。
a)ヒトJNK1の阻害に関して3000nM未満、より好ましくは2000nM未満、更により好ましくは1000nM未満、更により好ましくは500nM未満、更により好ましくは250nM未満、更により好ましくは200nM未満、更により好ましくは150nM未満、最も好ましくは100nM未満、
b)ヒトJNK2の阻害に関して3000nM未満、より好ましくは2000nM未満、更により好ましくは1000nM未満、更により好ましくは500nM未満、更により好ましくは250nM未満、更により好ましくは200nM未満、更により好ましくは150nM未満、最も好ましくは100nM未満、及び/又は
c)ヒトJNK3の阻害に関して3000nM未満、より好ましくは2000nM未満、更により好ましくは1000nM未満、更により好ましくは500nM未満、更により好ましくは250nM未満、更により好ましくは200nM未満、更により好ましくは150nM未満、最も好ましくは100nM未満
のIC50値を示す。
a)4位のL−アルギニン(R)残基を維持する、
b)8位及び10位(配列番号25〜27に関しては7位及び9位)の2個のL−ロイシン(L)残基を維持する、
c)配列番号1のX1、X2、X3、X5、X7及びX8からなる群から選択されるアミノ酸に対応するそれぞれの位置並びに配列番号2〜27中のそれぞれの位置に1、2、3、4、5又は6個のD−アミノ酸を示す、より好ましくは、配列番号1のX3、X5、X7及びX8からなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置並びに配列番号2〜27中のそれぞれの位置に1、2、3又は4個のD−アミノ酸を示す、並びに
d)JNK活性を依然として阻害する(すなわち、本明細書に定義されるJNK阻害剤である)。
a)配列番号1のX1、X2、X3、X4、X5、X6、X7及び/又はX8の1つ、2つ又はそれ以上若しくは配列番号2〜27から選択されるそれぞれの配列内の対応する位置がA又はaに置換される;
b)配列番号1のX1若しくはX8又は配列番号2〜27から選択されるそれぞれの配列内の対応する位置が欠失される;
c)配列番号1のX5又は配列番号2〜27から選択されるそれぞれの配列内の対応する位置がE、Y、L、V、F又はKである;
d)配列番号1のX5又は配列番号2〜27から選択されるそれぞれの配列内の対応する位置がE、L、V、F又はKである;又は
e)配列番号1のX1、X2、X3の1、2若しくは3つ又は配列番号2〜27から選択されるそれぞれの配列内の対応する位置が天然アミノ酸である。
dlLLLxdmLLLydn(配列番号28);
dLLLd(LLLd)a(配列番号29);及び/又は
dLLLdLLLd(配列番号30);
(式中、
dはD−アミノ酸であり;
LはL−アミノ酸であり;
aは0〜3、好ましくは0〜2、より好ましくは0、1、2又は3、更により好ましくは0、1、又は2、最も好ましくは1であり;
l、m及びnは互いに独立に1又は2、好ましくは1であり;
x及びyは互いに独立に0、1又は2、好ましくは1である)。
(式中、
rはD−鏡像異性アルギニンであり;
Xは任意のL−アミノ酸(グリシンを含む)であり;
それぞれのXは個別に、また配列番号31内の他の任意のXとは独立に選択してもよい)
に記載の少なくとも1つの配列を含んでもよい。好ましくは、配列番号31内の前記6個のXのL−アミノ酸のうちの少なくとも4個は、K又はRである。別の実施形態においては、本発明によるJNK阻害剤は、トランスポーター配列rX1X2X3rX4X5X6r(配列番号32)(式中、X1はKであり、X2はKであり、X3はRであり、X4、X5及びX6は互いに独立に選択される任意のL−アミノ酸(グリシンを含む)である)を含む。同様に、本発明によるJNK阻害剤のトランスポーター配列は、配列rX1X2X3rX4X5X6r(配列番号33)(式中、X4はQであり、X5はRであり、X6はRであり、X1、X2及びX3は互いに独立に選択される任意のL−アミノ酸(グリシンを含む)である)を含んでもよい。本発明のJNK阻害剤はまた、配列rX1X2X3rX4X5X6r(配列番号34)(式中、1、2、3、4、5又は6個のXアミノ酸残基は、X1がKであり、X2がKであり、X3がRであり、X4がQであり、X5がRであり、X6がRである、からなる群から選択されるが、上記の基から選択されなかった残りのXアミノ酸残基は任意のL−アミノ酸(グリシンを含む)であってもよく、互いに独立に選択される。X1は、次いで、好ましくはYであり、及び/又はX4は好ましくはK若しくはRである。
a)阻害的(ポリ)ペプチド配列内の4位にL−アルギニン(R)残基を維持する、
b)阻害的(ポリ)ペプチド配列内の8位及び10位(配列番号25〜27に関しては7位及び9位)に2個のL−ロイシン(L)残基を維持する、
c)配列番号1のX1、X2、X3、X5、X7及び/又はX8からなる群から選択されるアミノ酸に対応するそれぞれの位置及び配列番号2〜27中のそれぞれの位置で少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個又は6個のD−アミノ酸を示す、より好ましくは、配列番号1のX3、X5、X7及びX8からなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置及び配列番号2〜27中のそれぞれの位置で少なくとも1個、少なくとも2個、少なくとも3個又は4個のD−アミノ酸を示す、並びに
d)JNK活性を阻害する(すなわち、本明細書で定義されるJNK阻害剤である)、
配列同一性を有する。
a)RPTTLNLF(配列番号191)、KRPTTLNLF(配列番号192)、RRPTTLNLF及び/又はRPKRPTTLNLF(配列番号193)からなる配列群から選択される配列を含む阻害的(ポリ)ペプチドと、
b)トランスポーター配列、好ましくは、表2に開示されたトランスポーター配列又はそのバリアント/断片から選択される、更により好ましくは、配列番号31〜34及び配列番号46〜151又はそのそれぞれのバリアント若しくは断片から選択されるトランスポーター配列と
を含むJNK阻害剤に関する。
(i)放射性標識、すなわち、放射性リン酸化又は硫黄、水素、炭素、窒素などを用いる放射性標識;
(ii)有色色素(例えば、ジゴキシゲニンなど);
(iii)蛍光基(例えば、フルオレセインなど);
(iv)化学発光基;
(v)固相上への固定のための基(例えば、His−タグ、ビオチン、ストレプタグ、フラッグタグ、抗体、エピトープなど);
(vi)PEG化;
(vii)グリコシル化;
(viii)ヘシル化;
(ix)プロテアーゼ切断部位(例えば、JNK阻害剤の制御放出のため);
(x)ペプチド主鎖改変(例えば、(ΨCH2−NH)結合);
(xi)アミノ酸側鎖残基の保護;
(xii)N−及び/又はC−末端の保護(例えば、N末端アミド化又はC末端アセチル化);
(xiii)(i)〜(xii)の下で記載された2つ以上の要素の組合せ
からなる群の項目(i)〜(xiii)の1つ又は複数から選択することができる。
本発明に従って定義されたJNK阻害剤を、本明細書に定義される任意の疾患の予防又は治療において適用することができる医薬組成物に製剤化することができる。典型的には、本発明に従って使用されるそのような医薬組成物は、活性成分として、本明細書に定義されるJNK阻害剤、特に、本明細書に定義される、配列番号1による阻害的(ポリ)ペプチド配列を含むか、又はそれからなるJNK阻害剤を含む。好ましくは、活性化合物は、任意選択で、任意の好適なトランスポーター配列との(共有的)コンジュゲーション(リンカー配列を介する、又はそれを用いない)にある、配列番号2〜27のいずれか1つの阻害的(ポリ)ペプチド配列を含むか、又はそれからなるJNK阻害剤である;トランスポーター配列が結合される場合、配列番号171〜190のいずれか1つに記載の配列のいずれか、又は本明細書で定義されるそのバリアント、好ましくは、配列番号172の配列、又は本明細書で定義されるそのバリアントを選択することができる。
本発明は、療法によるヒト又は動物の身体、特に、ヒト身体の処置のための方法における、上記に開示されたJNK阻害剤又はそれを含有する医薬組成物の特異的使用(又は使用方法)に関する。上記のように、JNKシグナリングは、多くの多様な疾患状態及び障害に関与し、前記シグナリングの阻害はこれらの多くについて提唱され、成功裏に試験されてきた。本発明者らは、本明細書に開示されるJNK阻害剤が、以下に開示される疾患の処置のための有効なJNK阻害剤であることを見出した。
別の態様によれば、本発明は、移植前の組織又は臓器移植片の(in vitroでの)処置のための本明細書に定義されるJNK阻害剤を提供する。用語「移植前」は、単離の時間及びかん流/輸送の時間を含む。したがって、「移植前」の組織又は臓器移植片の処置は、例えば、単離中及び/又はかん流中及び/又は輸送中の処置を指す。特に、組織又は臓器移植片の単離に使用される溶液並びに組織又は臓器移植片のかん流、輸送及び/又はさもなければ処置に使用される溶液は、好ましくは、本発明によるJNK阻害剤を含有することができる。
例示的な実施例として、配列番号172を有するJNK阻害剤の合成を以下に示す。当業者には、前記合成がまた、本発明による任意の他のJNK阻害剤の合成について用いられ、かつ容易に適合され得ることは公知である。
注記した場合以外は、製造は、空気濾過環境中、室温(22℃±7℃)で行った。合成の規模は、約1gという精製されたペプチドの期待収率について、樹脂に対して0.7ミリモルの出発アミノ酸であった。合成は、機械的撹拌及び/又は窒素バブリングを用いるガラス濾板(fritted disk)を装備した30〜50mLのリアクター中で、手動で行った。
p−メチルベンズヒドリルアミド樹脂(MBHA−樹脂)を最初に、ジクロロメタン/ジメチルホルムアミド/ジイソプロピルエチルアミン(diisoproplyethylamine)を用いて窒素下で洗浄した。次いでその洗浄された樹脂を、PyBOB(ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート)/ジイソプロピル−エチルアミン/1−ヒドロキシベンゾトリアゾール中で、Rinkアミドリンカー(p−[Fmox−2,4−ジメトキシベンジル]−フェノキシ酢酸)にカップリングして、Fmoc−Rinkアミド−MBHA樹脂を得た。
アミノ酸を、以下のサイクルを用いて樹脂にカップリングした:
Fmoc−Rinkアミド−MBHA樹脂を、35%(v/v)ピペリジン/ジメチルホルムアミド中で、続いてジメチルホルムアミドで洗浄することによって脱保護した。その脱保護反応は、約16分かかった。Fmoc−脱保護のアミノ酸(例えば、ジメチルホルムアミド/ジクロロメタン(50/50)中の2当量のアミノ酸及びHOBt(1−ヒドロキシベンゾトリアゾール)をその樹脂に添加し、続いて、2当量のカップリング剤ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を添加した。カップリング反応は、添加されるそれぞれのアミノ酸に応じて、1時間から一晩かかった。容積は、各サイクル後に、0.5mL/100mgのペプチド樹脂を基準に算出し、調節した。カップリング後、その樹脂を、DMFを用いて3回洗浄した。カップリングの完了は、一級アミンに対してニンヒドリン試験(又はKaiser試験1)及び二級アミンに対してクロラニル試験2によって試験した。いくつかの場合には、クロラニル試験は、安全性の対照としてニンヒドリン試験を伴ってもよい。カップリング試験が反応の不完全性を示した場合、ジメチルホルムアミド/ジクロロメタン及びジイソプロピルエチルアミン中の、過剰量未満(0.5〜1当量)のアミノ酸、PYBOP、HOBTを用いて、カップリングを繰り返した。樹脂の官能性を、測定し、一般には、樹脂のもともとのローディング次第で、0.6〜0.2meq/gであった。最後のアミノ酸がカップリングした後、ペプチド樹脂を、通常どおり脱保護し、次いで、DCMを用いて5回洗浄した後に、30℃、減圧下で、オーブン中で乾燥した。そのペプチド樹脂を乾燥した後、固相合成の収率を、樹脂の最初のローディングから算出した理論上の重量増大と比較した、ペプチド樹脂の重量増大の比として算出した。その収率は、100%に近い場合がある。
ペプチドを、室温で4時間、TFA/K試薬とも呼ばれる、トリフルオロ酢酸/1,2−エタンジチオール(ethanedthiol)/チオアニソール/水/フェノール(88/2.2/4.4/4.4/7(v/v))の混合物中で樹脂から切断した。その反応容積は、ペプチド樹脂100mgあたり1mLであった。この試薬への樹脂の添加の間、その混合温度を30℃未満に維持するように調節した。
ペプチドを、ガラス濾板(fritted disc)を通した濾過によって樹脂から抽出した。ロータリーエバポレーター(rotavapor)でその容積の1/3まで濃縮した後、そのペプチドを、冷t−ブチルメチルエーテルで沈殿させ、濾過した。次いで、その粗ペプチドを、30℃、減圧下で乾燥した。
次いで、粗ペプチドを、逆相HPLCによって、≧95%の純度に精製した。その精製された画分を、ロータリーエバポレーター(rotavaporator)で濃縮し、凍結乾燥した。
配列番号172の配列を有する、精製されたペプチドの濃縮された凍結乾燥のプールを、水中に溶解し、Dowexアセテート、50〜100メッシュ樹脂上でのイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
以下では、本発明によるJNK阻害剤の阻害有効性をどのように測定したかを記述する標準的な操作手順を示す。この方法によって、in vitroで、非放射性標準化アッセイにおいて、候補化合物がJNKによるc−Jun特異的基質のリン酸化を低下させる能力を測定することが可能になる。更に、阻害性効果(IC50)及びJNKの選択化合物のKiを決定する方法が図示される。この方法は、候補化合物が、JNK活性を阻害するか否かを確証するために適切である。そして当業者は、その具体的な目的及び必要性のために以下の方法を適合する方法を確実に理解する。
アルファスクリーン(AlphaScreen)試薬及びプレート:
− His−JNK1(ref 14−327、Upstate、100μl中に10μg:濃度:2.2μM)最終5nM
− His−JNK2(ref 14−329、Upstate、100μl中に10μg:濃度:2μM)最終5nM
− His−JNK3(ref 14−501、Upstate、100μl中に10μg:濃度:1.88μM)最終5nM
− 抗ホスホ−cJun(ref 06−828、Upstate、ロットDAM1503356、濃度:44.5μM)最終10nM
− ビオチン−cJun(29−67):
配列:ビオチン−SNPKILKQSMTLNLADPVGSLKPHLRAKNSDLLTSPDVG(配列番号198)、ロット100509(mw4382.11、P 99.28%)H2O中に溶解、濃度:10mM)最終30nM
− ATP(ref AS001A、Invitrogen、ロット50860B、濃度100mM)最終5μM
− SADビーズ(ref 6760617M、PerkinElmer、ロット540−460−A、濃度5mg/ml)最終20μg/ml
− AprotAビーズ(ref 6760617M、PerkinElmer、ロット540−460−A、濃度5mg/ml)最終20μg/ml
− Optiplate 384ウェルホワイトプレート(ref 6007299、PerkinElmer、ロット654280/2008)
− ペプチド希釈のための96ウェルプレート(ref 82.1581、Sarstedt)
− TopSeals−A(ref 6005185、Perkin Elmer、ロット65673)
− 生物発光エネルギー移動読み取り
− 生物発光エネルギー移動は、Fusion Alphaプレートリーダー(Perkin Elmer)で読み取った。
− 電子EDP3ピペット20−300(Ref 17007243;Rainin)を用いて、プレート中に酵素抗体混合物(Enzme−Antibody mix)、基質ATP混合物(Subtrate−ATP mix)及びビーズを充填した。
− PIPETMAN(登録商標)Ultraマルチチャネル8X20(Ref 21040;Gilson)を用いて、プレート中に、阻害性化合物を充填した。
− キナーゼバッファー:20mM Tris−base pH7.4、10mM MgCl2、1mM DTT、100μM Na3VO4、0.01%Tween、(1%DMSO)
− 停止バッファー:20mM Tris−base pH7.4、200mM NaCl、80mM EDTA−K(NaOHの代わりにKOHを用いてpH8)、0.3%BSA
− JNK希釈キナーゼバッファー:50mM Tris−base pH7.4、150mM NaCl、0.1mM EGTA、0.03%Brij−35、270mM スクロース、0.1%β−メルカプトエタノール。
ペプチドの阻害性効果を評価するために、標準のAlphaScreenアッセイ(例えば、Guenaら、J Biomol Screen、2006;11:1015〜1026頁を参照のこと)を行った。異なる成分を調製し、引き続き示したとおり混合した。そのプレートを密閉して、以下のとおりインキュベートした:
5μl JNK+抗体
5μl TPキナーゼ±阻害剤 プレインキュベーション 30分
5μl ビオチン−cJun+ATP インキュベーション 24℃で60分
10μl ビーズSAD+AプロテインA インキュベーション 24℃暗野で60分
JNK1、JNK2及びJNK3 5nM
Biotin−cJun 30nM
ATP 5μM;抗ホスホ−cJun(S63)10nM
Bille SAD/AプロテインA 20μg/ml
検出部分:[混合物]×5(25μlの最終容積中で5μl)
[ストック]=44.5μM(ref 06−828、Upstate、ロットDAM1503356)
10nM→キナーゼバッファー中で50nM
反応部分:[混合物]×3(15μlの最終容積中で5μl)
[ストック]=JNK1について2.2μM(ref 14−327、Upstate、ロットD7KN022CU)
JNK2について2.0μM(ref 14−329、Upstate、ロット33221CU)
JNK3について1.88μM(ref 14−501、Upstate、ロットD7CN041CU)
5nM→抗体バッファー中で15nM
反応部分:[混合物]×3(15μlの最終容積中で5μl)
[ストック]=10mM
100μM→キナーゼバッファー中で300μM
30μM→キナーゼバッファー中で90μM
10μM→キナーゼバッファー中で30μM
・・・
0.03nM→キナーゼバッファー中で0.09nM
及び0nM→キナーゼバッファー
反応時間:[混合物]×3(15μlの最終容積中で5μl)
[ストック]=100mM(ref AS001A、Invitrogen、ロット50860B)
5μM→キナーゼバッファー中で15μM
反応部分:[混合物]×3(15μlの最終容積中で5μl)
[ストック]=10mM
30nM→ATPバッファー中で30nM
検出部分:[混合物]×2.5(25μlの最終容積中で10μl)
[ストック]=5mg/ml→20μg/ml 停止バッファー中で50μg/ml
暗屋(緑色の光)の中、又は暗野中の混合物。
この分析は、以下の式を用いて、GraphPad Prism4ソフトウェアによって行った:
S字形用量応答(制約なし)。
Y=ボトム+(トップ−ボトム)/(1+10^((LogEC50−X)))
この分析は、以下の検定を用いるGraphPad Prism4ソフトウェアによって行った:一元ANOVA検定の後に、テューキー多重比較検定を続けた。P<0.05を、有意とみなした。
3.1 取り込み実験の材料及び方法
a)細胞株:
この実験に用いた細胞株は、HL−60(Ref CCL−240、ATCC、ロット116523)であった。
RPMI(Ref 21875−091、Invitrogen、ロット8296)又はDMEM(Ref 41965、Invitrogen、ロット13481)に以下を補充した:
10%FBS(Ref A64906−0098、PAA、ロットA15−151):2008年4月4日に、56℃で、30分非動化。
1mMのピルビン酸ナトリウム(RefS8636、Sigma、ロット56K2386)
ペニシリン(100単位/ml)/ストレプトマイシン(100μg/ml)(Ref P4333、Sigma、ロット106K2321)
PBS 10X(Ref 70011、Invitrogen、ロット8277):無菌H2Oで1×希釈
トリプシン−0.05%EDTA(Ref L−11660、PAA、ロットL66007−1194)
6ウェルの培養プレート(Ref 140675、Nunc、ロット102613)
24ウェル培養プレート(Ref 142475、Nunc、ロット095849)
96ウェル培養プレート(Ref 167008、Nunc、ロット083310)
タンパク質用量決定用の96ウェルプレート(Ref 82.1581、Sarstedt)
蛍光測定のための96ウェルプレート(Ref 6005279、Perkin Elmer)
ポリ−D−リシンコーティング溶液(Sigma P9011 ロット095K5104):1×PBS中で25μg/mlの最終希釈
酸性洗浄バッファー:0.2Mのグリシン、0.15MのNaCl、pH3.0
Ripa溶解バッファー:10mMのNaH2PO4 pH7.2、150mMのNaCl、1%Triton X−100、1mMのEDTA pH8.0、200μMのNa3VO2、0.1%SDS、1×プロテアーゼ阻害剤カクテル(Ref 11873580001、Roche、ロット13732700)
細胞は、倒立顕微鏡(Axiovert 40 CFL;Zeiss;20X)を用いて観察しカウントした。
蛍光は、Fusion Alphaプレートリーダー(Perkin Elmer)を用いて読み取った。
FITC標識されたペプチド内在化は、懸濁細胞で調べた。細胞は、ポリ−DL−リシンコーティングしたディッシュ中に、1×106細胞/mlの濃度でプレーティングした。次いでプレートを、37℃、5%CO2及び100%の相対湿度で24時間インキュベートした後に、既知濃度のペプチドを添加した。ペプチド添加後、その細胞を、37℃、5%CO2及び100%の相対湿度で、30分、1時間、6時間又は24時間インキュベートした。次いで、細胞を酢酸バッファー(0.2M グリシン、0.15M NaCl、pH3.0)を用いて2回洗浄して、細胞表面吸着ペプチドを除去した(Kameyamaら、(2007)、Biopolymers、88、98〜107頁を参照のこと)。酸性バッファーを用いたのは、塩基性アミノ酸が豊富なペプチドは細胞表面上に強力に吸着し、内在化されたペプチドの過大評価につながる場合が多いからである。こうして、酸性バッファーを用いる細胞洗浄を使用して、細胞表面に吸着されたペプチドを除去した。
したがってこのステップは以下の通りである:1.細胞培養
2.酸性洗浄及び細胞抽出物
3.蛍光プレートリーダーによるペプチド内在化の分析
6ウェル培養プレートは、3mlのポリ−D−Lys(Sigma P9011;PBS中に25μg/ml)を用いて、24ウェルプレートは、600μlを用いて、及び96ウェルプレートは、125μlを用いてコーティングし、37℃、5%CO2及び100%の相対湿度で、4時間インキュベートした。
抽出物を氷上で冷却した。
細胞を「ファルコン15ml」に移行する。最大の細胞を回収するために、ディッシュを1mlのPBSで洗浄する。
最大2400rpmで2分細胞を回収する。
1mlの冷PBS中に細胞を懸濁する。
細胞をコーティングした「エッペンドルフチューブ」(1mlのポリD−Lysで4時間コーティングし、1mlのPBSで2回洗浄した)に移す。
1mlの冷酸性洗浄バッファーを用いて3回洗浄し、最大2400rpmで2分間遠心分離する。
「エッペンドルフ」中の細胞の広がりに注意する。
1mlの冷PBSで2回洗浄して、中和する。
50μlの溶解RIPAバッファーを添加する。
かき混ぜながら氷上で30分〜1時間インキュベートする。
3ml、1ml又は200μl(それぞれ、6、24又は96ウェルプレートについて)の冷酸性洗浄バッファーを用いて3回洗浄する。ディッシュからはがれる細胞に注意する。
1mlの冷PBS(それぞれ、6、24又は96ウェルプレートについて)を用いて2回洗浄して、中和する。
50μlの溶解RIPAバッファーを添加する。
かき混ぜながら氷上で30分〜1時間インキュベートする。
冷スクラッパーを用いて細胞をスクラップする。24及び96ウェルのプレートを、4000rpmで4°で15分間、直接遠心分離して細胞破片を除去した。次いで、上清(24又は96ウェルのプレートについてそれぞれ、100又は50ml)を、直接、ダーク96ウェルプレートに移した。そのプレートを、蛍光プレートリーダー(Fusion Alpha、Perkin Elmer)で読み取った。
溶解液を、コーティングした「エッペンドルフ」(1mlのポリD−Lysで4時間コーティングし、1mlのPBSで2回洗浄した)に移す。
次いで、溶解した細胞を4℃で、10000gで30分間遠心分離して、細胞破片を除去した。上清を除去して、−80℃で、コーティングした「エッペンドルフチューブ」(1mlのポリD−Lysで4時間コーティングし、1mlのPBSで2回洗浄した)に保存した。
各々のタンパク質抽出物の含量を、製造業者の指示に従って、標準BCAアッセイ(Kit N°23225、Pierce)によって決定した。
各々の試料の相対的な蛍光を、各試料の10μlを、蛍光プレートリーダー(Fusion Alpha、Perkin Elmer)での読み取り、バックグラウンドの差引き、及びタンパク質濃度による正規化の後に決定する。
HL−60細胞株の細胞へのFITC−標識TAT由来トランスポーター構築物の時間依存性の内在化(取り込み)は、配列番号52〜96、43及び45〜47の配列トランスポーターペプチドを用いて上記のとおり行った。これらの配列は、表4に以下に列挙する。
・ 24時間インキュベーション後、コンセンサス配列rXXXrXXXr(配列番号31)を有する全てのトランスポーター(可能性のある配列の選択については表2を参照のこと)は、L−TATトランスポーター(配列番号43)よりも高い内在化能力を示した(図6)。これらの結果によって、コンセンサス配列rXXXrXXXr(配列番号31)が完全に確証される。
・ 1つの位置は、最高のトランスポーター活性に関して重要である(図6):2位のY(配列番号14に対応する配列91)。
以下では、ヒト細胞(血液、WBC、PBMC、精製された初代リンパ球、細胞株、・・・)からのリガンド誘発性分泌後、いくつかのヒトサイトカインの放出量をどのように測定したかを記述する手順を示す。
・ 96ウェルプレート:
上清収集のため(Ref 82.1581、Sarstedt)
ELISAのため(F96 maxisorp、Ref 442404、Nunc)
・ TopSeal−A:96ウェルマイクロプレートシール(Ref 600585、PerkinElmer)。
・ ELISA試薬
コーティングバッファーELISA:0.1M 炭酸ナトリウム(NaCarbonate)pH9.5(=1リットルのH2O中、7.13gのNaHCO3(ref 71627、Fluka)+1.59gのNa2CO3(ref 71345、Fluka)、濃縮NaOHを用いてpH9.5に)
洗浄バッファー ELISA:1×PBS +0.01%Tween20。1リットルの1×PBS(PBS10×:ref 70011、GIBCO)を調製し、100ulのTween20(ref P1379、Sigma)を、磁気撹拌装置で混合しながらゆっくり添加する)
アッセイ希釈液:1×PBS+10%FBS(Ref A15−151、PAA、56℃で、30分非動化)
DAKO TMB(ref S1599、DAKO):市販の基質溶液
停止溶液:1M H3PO4(→200mlについて=177mlのH2O+23mlのH3PO4 85%(ref 345245、Aldrich)。
・ ELISAキット(20プレートについての試薬)
IFN−γ:ヒトIFN−γELISAセット、BD OptEIA(商標)(ref 555142、DB)。
IL−1β:ヒトIL−1β ELISAセットII、BD OptEIA(商標)(ref 557953、BD)
IL−10:ヒトIL−10 ELISAセットII、BD OptEIA(商標)(ref 555157、DB)。
IL−12:ヒトIL−12(p70)ELISAセット、BD OptEIA(商標)(ref 555183、DB)。
IL−15:ヒトIL−15 ELISAセット、BD OptEIA(商標)(ref 559268、DB)。
IL−2:ヒトIL−2 ELISAセット、BD OptEIA(商標)(ref 555190、DB)。
IL−4:ヒトIL−4 ELISAセット、BD OptEIA(商標)(ref 555194、DB)。
IL−5:ヒトIL−5 ELISAセット、BD OptEIA(商標)(ref 555202、DB)。
IL−6:ヒトIL−6 ELISAセットI、BD OptEIA(商標)(ref 555220、DB)。
IL−8:ヒトIL−8 ELISAセット、BD OptEIA(商標)(ref 555244、DB)。
MCP−1:ヒトMCP−1 ELISAセット、BD OptEIA(商標)(ref 555179、BD)
TNF−α:キットヒトTNF ELISAセット、BD OptEIA(商標)(ref 555212、DB)。
・ 吸光度読み取り:吸光度は、Fusion Alphaプレートリーダー(Perkin Elmer)で読み取った。
・ リピート式ピペット、デジタルピペット又はマルチチャネルピペット。
試料の調製
この試料は、培養されたヒト細胞(典型的には、全血、WBC、PBMC、WBCの精製されたサブタイプ、癌性細胞株)由来の培養培地上清である。遠心分離(400g 5分 4℃)によって粒子状物質を除去し、直ちにアッセイするか、又は試料を−20℃で保管する。凍結解凍サイクルの反復は避ける。
凍結乾燥した標準を室温に温めた後、バイアルを注意深く開けて、材料の喪失を回避する。提唱される容積の脱イオン水を有する凍結乾燥された標準を再構成して、ストック標準を得る。この標準を、希釈する前に、少なくとも15分間平衡にさせる。穏やかにボルテックスして混合する。再構成後、1バイアルあたり50μlでポリプロピレンバイアル中に標準のストックを直ちにアリコートし、−20℃で最大6カ月間凍結する。必要な場合は、アリコートにする前/凍結する前に最大8時間、2〜8℃で保管する。再構成された標準は室温に置かない。
使用直前に、試薬希釈液中で2倍階段希釈を用いて10点の標準曲線を調製する。4000pg/mlという高い標準が推奨される。
ビオチン/SAv試薬の一工程インキュベーション。必要な容積の検出抗体をアッセイ希釈液に添加する。使用前15分以内に、必要な量の酵素試薬を添加し、ボルテックスするか、又はよく混合する。推奨される希釈については、ロットに特定の指示/分析証明書を参照のこと。使用後に残りの作業用検出物を廃棄する。
1.コーティングバッファー中で希釈した1ウェルあたり100μLの捕捉抗体を用いてPVCマイクロタイタープレートのウェルをコーティングする。推奨される抗体コーティング希釈については、ロットに特定の指示/分析証明書を参照のこと。
2.プレートを接着性プラスチックでカバーし、4℃で一晩インキュベートする。
3.コーティング溶液を除去し、ウェルを150μlの洗浄バッファーで充填することによってプレートを洗浄する。
4.溶液又は洗浄液を、シンク上でプレートをはじく(flicking)ことによって除去する。
5.そのプロセスを2回繰り返し、合計3回洗浄する。
6.最終の洗浄後、ペーパータオル上でプレートを叩くことによって残りの洗浄バッファーを除去する。
7.コーティングされたウェル中の残りのタンパク質結合部位を、1ウェルあたり100μlの試薬希釈液を添加することによってブロックする。
8.プレートを接着性プラスチックでカバーし、室温で1時間インキュベートする。
9.インキュベーションの間、標準の調製を開始する。
10.ステップ3のとおり、150μlの洗浄バッファーを用いて1回洗浄する。プレートはこれで試料添加のために準備される。
11.アッセイ希釈における50μlの適切に希釈された試料を、各々のウェルに添加する。正確な定量的結果のために、常に、未知の試料のシグナルを標準曲線のものに対して比較する。標準(三連)及びブランクを、正確性を保証するために各々のサイトカインで試行しなければならない。
12.プレートを接着性プラスチックでカバーし、室温で2時間インキュベートする。
13.ステップ3と同様に150μlの洗浄バッファーを用いてプレートを4回洗浄する。
14.推奨される希釈で(ロットに特定の指示/分析証明書を参照のこと)で各々のウェルに50μlの検出混合物(アッセイ希釈液中の検出抗体+二次ストレプトアビジン−HRP抗体)を添加する。
15.接着性プラスチックでプレートをカバーし、室温で、光防御して1時間インキュベートする。
16.ステップ3のとおり150μlの洗浄バッファーを用いてプレートを6回洗浄する。
17.各々のウェルに50μlのDAKO TMB溶液を添加し、密閉せずに、暗所で、室温で、15〜20分間、インキュベートする。
18.各々のウェルに50μlの停止溶液を添加する。プレートを穏やかにタップして、徹底的な混合を保証する。
19.プレートミキサーで、500rpmで5分間、プレートを混合する。
20.450nmで光学密度を読み取る。(プログラム:Cytokine_ELISA、FusionAlphaプレートリーダー)。
各々の標準の対照及び各々の試料についての三連の読み取りを平均する。平均ゼロ標準光学密度(O.D.)を差引きする。O.Dの対数に対してサイトカイン濃度の対数をプロットする標準曲線を作成し、最良適合線を、回帰分析によって決定してもよい。試料を希釈した場合、標準曲線からの濃度読み取りには、希釈係数を掛けなければならない。標準曲線は、アッセイした試料の各々のセットについて作成すべきである。異常値のデータは、グラブス検定を用いて回避した。次いで、SDの2倍のインターバルになかったデータは破棄した。陽性対照が、以前に観察されたデータを示した場合、独立した実験を考慮する。独立した実験をプールする(N>3)。
データは、阻害剤処理なしで、誘発した条件と比較して、pg/mlのサイトカイン放出又は%で示す。
以下では、LPSによって6時間チャレンジされたヒトのPMA分化したTHP1細胞からのサイトカイン産生をどのように誘発して、本発明のJNK阻害剤、特に配列番号172を有するJNK阻害剤が刺激誘発性のサイトカイン放出を低下する能力を試験したかを記述する手順を示す。THP1細胞を、サイトカイン放出の読み出しのために異なるリガンドによってex−vivoで刺激した。非毒性用量では、JNK阻害剤有効性は、非処理試料と比較したサイトカインレベルの低下で示され、ELISAでモニターされる。化合物の毒性は、紫色を生じるテトラゾリウム(tretazolium)塩(MTS)のホルマザンへの還元によって評価する。
a.材料
・ 細胞株:THP−1(Ref TIB−202、ATCC、ロット57731475)
・ 培養培地、試薬及びプレート
RPMI(Ref 21875−091、Invitrogen)以下を補充:
10%FBS(Ref A15−151、PAA):56℃で30分非動化した。
10mM Hepes(Ref H0887、Sigma)
50M β−メルカプトエタノール(Ref 63690、Fluka:14.3Mでストックする):−20℃でストックされた、PBS中50mM アリコートを560μl添加
1mM ピルビン酸ナトリウム(Ref S8636、Sigma)
ペニシリン(100単位/ml)/ストレプトマイシン(100μg/ml)(Ref P4333、Sigma)
次いで、RPMI培地を、0.22Mのフィルター(Ref SCGPU05RE、Millipore)で濾過する。
PBS 10×(Ref 70011、Invitrogen):無菌H2Oで1×希釈した
DMSO:Ref 41444、Fluka
PMA(ホルボール12−ミリステート13−アセテート、Ref P1585、Sigma、濃度1mM=−20℃でDMSO中で616.8ug/ml)。RPMI中で最終濃度の100nMで直接用いる(10mlの培地中で1ul)。
LPSウルトラピュア(Lipopolysaccharide、Ref tlrl−eklps、Invivogen、濃度5mg/ml):LPSのストック溶液:4℃で、PBS中で3μg/ml。直接用いて、RPMI培地中で40ng/mlの4×濃縮溶液を調製する(分1800μl/プレート;5プレート:125μlのLPS3g/ml+9250μlのRPMI)。
96ウェルプレート:
接着細胞培養のため(Ref 167008、Nunc)
上清を収集するため(Ref 82.1581、Sarstedt)
ELISAのため(F96 maxisorp、Ref 442404、Nunc)
コーティング溶液:ポリ−D−リシン(Ref P9011、Sigma):1×PBS中で25μg/mlに最終希釈
コーティングバッファーELISA:0.1M 炭酸ナトリウムpH9.5(=1リットルのH2O中、7.13gのNaHCO3(ref 71627、Fluka)+1.59gのNa2CO3(ref 71345、Fluka)、濃縮NaOHを用いてpH9.5に)
洗浄バッファーELISA:1×PBS+0.01%Tween20(ref P1379、Sigma、ロット094K0052)(=1リットルの1×PBSを調製し、磁気攪拌機で混合しながら、100ulのTween20をゆっくり添加する)
アッセイ希釈:1×PBS+10%FBS(Ref A15−151、PAA、56℃で、30分、非動化)。
DAKO TMB(ref S1599、DAKO):市販の基質溶液
停止溶液:1M H3PO4(→200mlのために=177mlのH2O+23mlの85%H3PO4(ref 345245、Aldrich)。
TNF−:KitヒトTNF ELISAセット、BD OptEIA(ref 555212、DB)。
・ 細胞毒性測定:CellTiter96試薬(ref G3581、Promega)
・ 対照化合物:SP600125(ref ALX−270−339−M025、Alexis、濃度:20mM DMSO)
・ 吸光度読み取り:吸光度は、FusionAlphaプレートリーダー(Perkin Elmer)で読み取った。
・ リピート式ピペット、デジタルピペット、又はマルチチャネルピペット。
・ TopSeal−A:96ウェルマイクロプレートシール(Ref 600585、PerkinElmer)。
ウェルのコーティング
プレートを、200μlのポリD−リシン(1×)でコーティングし、37℃、5%CO2及び100%の相対湿度で2時間インキュベートした。
2時間後、ウェルを、200lの1×PBSを用いて2回洗浄した(直ちに用いるか、又は使用するまで37℃で200lの1×PBSとともに置いておく、ただし3日以下)。
細胞をカウントした。所望の数の細胞を採取し、必要な量の培地に再懸濁して、1’000’000細胞/mlの希釈を得た。100nM PMAを添加して、懸濁単球から接着マクロファージへのTHP1の分化を誘発した。その細胞を、100lの培地中で、100’000細胞/ウェルのプレーティング密度でウェルにプレーティングした。接種後、プレートを、37℃、5%CO2及び100%の相対湿度で3日間インキュベートして、それらを分化させた後に、実験薬物を添加した。
3日後、接着細胞を顕微鏡で観察した。PMAを含有する培地を吸引し、PMAなしの100lの新鮮なRPMI培地で置き換えた(1×PBSによる洗浄工程なし)。
6時間後、100lの上清を、新しい96ウェルプレートに移した。これらのプレートを密閉し、−20°でサイトカインの分泌のELISAによる分析まで−20°で保管した(例えば、実施例4を参照のこと)。
データの分析は、ELISAで示したとおり行った(実施例4を参照のこと)。要するに、ELISAに関して:各々の標準の対照及び各々の試料について三連の読み取りを平均する。平均ゼロ標準光学密度(O.D)を差引きする。O.Dの対数に対してサイトカイン濃度の対数をプロットする標準曲線を作成し、最良適合線を、回帰分析によって決定してもよい。試料を希釈した場合、標準曲線からの濃度読み取りには、希釈係数を掛けなければならない。標準曲線は、アッセイした試料の各セットについて作成しなければならない。異常値データは、グラブス検定を用いて回避した。次いで、SDの2倍のインターバルになかったデータを破棄した。陽性対照が以前に観察されたデータを示した場合、独立した実験を考慮する。独立した実験をプールする(N>3)。
全血は、クエン酸ナトリウムを含む事前標識した真空チューブに接続した静脈穿刺を用いて、麻酔したラット又はヒト健常ボランティアから収集する。チューブを、7〜8回反転させて穏やかに混合し;次いで刺激するまでRTで保持する。配列番号172のJNK阻害剤を調製して、PBS中で6倍濃縮し、30μl/ウェルの混合物を96ウェルプレートに添加する。全血をPBS中で1:2に希釈し、120μlの希釈した血液を、PBS単独か又は配列番号172のJNK阻害剤を事前に添加したかのいずれかの各々のウェルに添加する。全血を37℃;85rpm(Stuart OrbitalインキュベーターSI500)で60分間インキュベートする。活性化因子(LPS)を調製し、30μl/ウェルのLPSを6倍濃縮する。60分のインキュベーション後、LPSを血液に添加し、血液をピペットで上下して混合し、次いでかき混ぜながら(85rpm)、37℃で4時間保持する。4時間のインキュベーション後、このプレートを、約770g、4℃で、事前に冷却した遠心分離器中で15分間遠心分離する。上清を最終的に収集し、サイトカイン測定まで−20℃で保持する。次いで、サイトカイン(IL−6、IL−2、IFNγ及びTNFα)を、標準的なElisaキット(例えば、R&D Systems製:DuoSet Elisas;又はBD Biosciences製:BD Opteia Set Elisa)を用いて測定した。結果は、測定したサイトカインの上清のpg/mlとして表す。
配列番号196、197、及び172の配列を有するJNK阻害剤(0.1mMの最終濃度)をヒト血清(1×PBS中で10%及び50%)中で消化した。その実験は、Tugyiら(Proc Natl Acad Sci USA、2005、413〜418頁)に記載のとおり行った。残りのインタクトなペプチドは、UPLC−MSによって定量した。安定性は、配列番号196、197、及び172について同じく、ただし2つの別のアッセイで評価した。配列番号196を有するJNK阻害剤は、6時間内にアミノ酸残基に完全に分解されたが、配列番号172を有するJNK阻害剤は、14日後にのみ完全に分解された。配列番号197を有するJNK阻害剤は、30日後まだ安定であった。
対照動物を屠殺し、リンパ節(LN)を回収して、完全なRPMI培地中で保持した。LNを、5mlピストンを用いて70μmフィルター上で完全なRPMIでスマッシュした。数滴の培地を添加して、濾過器を湿潤に維持した。細胞を450g、4℃で7分間、遠心分離した。ペレットを、5mlの新鮮な培地中に再懸濁した。細胞を、細胞濾過器を再度通過させた。細胞のアリコートをカウントし、一方では、細胞を1400rpm、4℃で再度10分間遠心分離した。細胞を、MACSバッファー中に再懸濁した(107個の細胞あたり、80μlのMACSバッファー)。一千万個の細胞あたり、10μlの抗ラットMHCマイクロビーズを添加し、細胞を、4°〜8℃で15分間インキュベートした。細胞を、15mlのMACSバッファーで洗浄し、700g、4℃で7分間遠心分離した。ペレットを、108個の細胞あたり500μlのMACSバッファー中に再懸濁した。動物1匹あたり1つのLSカラムを、MACSセパレーターの磁場に置いた。カラムを最初に、3mlのMACSバッファーですすいだ。1つのチューブを、氷中でカラムの下に置いて、細胞=T細胞を収集した(ネガティブ選択、それによって、我々は、溶出されるものを収集する)。細胞懸濁物を添加して、溶出物を氷上に収集した。カラムを、3mLのMACSバッファーを用いて3回洗浄した。溶出したT細胞を、700g、4℃で7分間遠心分離した。再懸濁した細胞をカウントし、100μlの完全培地中で200000細胞/ウェルの密度でプレーティングした。プレートを、2μg/mLのCD3抗体を用いて実験前日にプレコーティングし、実験日、プレートを、PBSを用いて3回洗浄した。細胞を、100μlの(ポリ)ペプチドJNK阻害剤(配列番号172)を用いて処理して、1時間、2倍濃縮した後に、リガンド活性化した。(ポリ)ペプチドJNK阻害剤(配列番号172)による予備処理の1時間後、次いで細胞を、24時間、2μg/mLの抗CD28抗体で刺激した。刺激の24時間後、上清を収集し、分析するまで−20℃で保管した。次いで、サイトカインを、標準的なElisaキットを用いて測定した。結果は、測定されたサイトカインの上清のpg/mlとして表す。
ヒト健常ボランティア由来の全血を、クエン酸ナトリウムを含有する事前標識した真空チューブに接続した静脈穿刺を用いて収集した。そのチューブを7〜8回反転させて穏やかに混合する;次いで、刺激するまでRTで保持する。350μlのRPMI+P/Sを1,2ml−96−ウェルプレートに添加した。10倍濃縮の配列番号172を、RPMI+P/S(1ウェルあたり50μl)中に調製した。50μlを、1.2ml−96ウェルプレートに添加した。次いで、50μlの全血を、培地単独又はJNK阻害剤のいずれかを以前に添加した各々のウェルに添加した。全血を、37℃、5%CO2で60分間インキュベートした。RPMI+P/S中に希釈した50μl/ウェルのリガンドを、10倍濃縮した最終希釈に対応して調製した。インキュベーションの60分後、リガンドを添加し;次いで、血液をピペットで上下することによってウェルを混合した。全血を、37℃で3日間インキュベートした(1日1回、各々のウェルをピペットで上下することによってウェルを混合した)。インキュベーションの終わりに、プレートを混合し、次いで、事前に冷却した遠心分離器中で2500rpm、4℃で15分間遠心分離した。次いで、サイトカインを、標準的なElisaキットを用いて測定した。結果は、測定したサイトカインの上清のpg/mlとして表す。
配列番号172のJNK阻害剤の抗炎症性力価を、静脈内投与後にアルビノラットで試験した(EIU/LPSモデル)。この研究の目的は、エンドトキシン誘発性ブドウ膜炎アルビノラットモデルにおける炎症性応答に対する配列番号172の単回静脈内注射(0.015、0.18、及び1.80mg/kg)の効果を決定して、先行技術の配列番号197のJNK阻害剤(2mg/kg)で得たものに対するそれらの影響を比較することであった。更に対照として、リン酸デキサメタゾンナトリウム(phosphate sodic dexamethasone)(「参照」)及びビヒクル(0.9%NaCl)を使用した。
等級0 炎症なし
等級1 わずかな光彩及び結膜の血管拡張
等級2 フレアを伴う軽度の光彩及び結膜の血管拡張
等級3 フレアを伴う強度の光彩及び結膜の血管拡張
等級4 強度の炎症反応
(+1)フィブリン形成及び瞳孔閉鎖
ラットコラーゲン関節炎は、前臨床若しくは臨床研究のいずれかのもとにあるか、又はこの疾患の治療剤として現在用いられている、多くの抗関節炎剤の前臨床試験のために広く用いられている、多発性関節炎の実験モデルである。このモデルの特徴は、信頼できる発病及び頑強な進行、容易に測定可能な多関節炎症、パンヌス形成に関連する顕著な軟骨破壊、並びに軽度から中度の骨再吸収及び骨膜の骨増殖である。
0 正常
0.5 最小限局性炎症
1 滑膜/関節周囲組織における炎症性細胞の最小湿潤
2 軽度湿潤
3 中度浮腫を伴う中度湿潤
4 顕著な浮腫を伴う顕著な湿潤
5 重度の浮腫を伴う重度の湿潤
0 正常
0.5 軟骨及び軟骨下骨におけるパンヌスの最小浸潤、辺縁領域にのみ影響し、かつ少数の関節にのみ影響する
1 軟骨及び軟骨下骨におけるパンヌスの最小浸潤、主に辺縁領域に影響する
2 軽度湿潤(辺縁領域の脛骨又は足根骨の1/4未満)
3 中度湿潤(辺縁領域で罹患した脛骨又は小さい足根骨の1/4〜1/3)
4 顕著な浸潤(辺縁領域で罹患した脛骨又は足根骨の1/2〜3/4)
5 重度の浸潤(辺縁領域で罹患した脛骨又は足根骨の3/4超、全体的な構造の重度の変形)
0 正常
0.5 軟骨及び軟骨下骨におけるパンヌスの最小浸潤、辺縁領域にのみ影響し、かつ少数の関節にのみ影響する
1 軟骨及び軟骨下骨におけるパンヌスの最小浸潤、約1〜10%の軟骨表面又は軟骨下骨が罹患する
2 軽度炎症(脛骨又は大腿骨の表面又は軟骨下領域の最大1/4にわたって広がる)、約11〜25%の軟骨表面又は軟骨下骨が罹患する
3 中度浸潤(脛骨又は大腿骨の表面又は軟骨下領域のうち1/4を超えて、ただし1/2未満まで広がる)、約26〜50%の軟骨表面又は軟骨下骨が罹患する
4 顕著な浸潤(脛骨又は大腿骨の表面のうち1/2〜3/4まで広がる)、約51〜75%の軟骨表面又は軟骨下骨が罹患する
5 重度の浸潤 約76〜100%の軟骨表面又は軟骨下骨が罹患する
0 正常
0.5 Tブルー染色の最小の低下、辺縁領域にのみ影響し、かつ少数の関節にのみ影響する
1 最小=トルイジンブルー染色の最小から軽度の損失で、明白な軟骨細胞喪失もコラーゲン崩壊もない
2 軽度=トルイジンブルー染色の軽度の喪失で、限局性の軽度(表層性)軟骨細胞喪失及び/又はコラーゲン崩壊を伴う
3 中度=トルイジンブルー染色の中度の喪失で、多巣性の中度(中間領域までの深さ)軟骨細胞喪失及び/又はコラーゲン崩壊を伴い、より小さい足根骨が、1/2〜3/4の深さまで罹患し、全層喪失はまれな領域である
4 顕著=トルイジンブルー染色の顕著な喪失で、多巣性の顕著な(深部領域までの深さ)軟骨細胞喪失及び/又はコラーゲン崩壊を伴い、1又は2つの小さい足根骨表面が、軟骨の全層喪失を有する
5 重度=トルイジンブルー染色の重度の拡散喪失で、多巣性の重度の(潮汐点までの深さ)軟骨細胞喪失及び/又はコラーゲン崩壊を伴い、2つを超える軟骨表面が罹患する。
0 正常
0.5 Tブルー染色の最小の低下、辺縁領域にのみ影響する
1 最小=トルイジンブルー染色の最小から軽度の損失で、明白な軟骨細胞喪失もコラーゲン崩壊もない
2 軽度=トルイジンブルー染色の軽度の喪失で、限局性の軽度(表層性)軟骨細胞喪失及び/又はコラーゲン崩壊を伴い、罹患した軟骨の50%の深さのわずかな小さい領域がある場合がある
3 中度=トルイジンブルー染色の中度の喪失で、多巣性から散在性であって中度(中間領域までの深さ)軟骨細胞喪失及び/又はコラーゲン崩壊を伴い、1〜2の小さい領域の全層喪失がある場合があり、表面の全幅の1/4未満であって、かつ全表面の全幅の25%以下に罹患している
4 顕著=トルイジンブルー染色の顕著な喪失で、多巣性から拡散であって、顕著な(深部領域までの深さ)軟骨細胞喪失及び/又はコラーゲン崩壊を伴うか、又は1表面でのほぼ全層喪失及び他での部分喪失を伴い、合わせて全表面の幅の50%未満の全層喪失がある。
5 重度=トルイジンブルー染色の重度の散在で、多巣性の重篤な(潮汐点までの深さ)軟骨細胞喪失及び/又はコラーゲン崩壊を、大腿骨及び/又は脛骨の両方で伴い、合わせて全表面の幅のうち50%よりも大きい全層喪失がある。
0 正常
0.5 最小の再吸収は、辺縁領域にのみ罹患し、少数の関節にのみ罹患する
1 最小=再吸収の小領域、低倍率では容易に明らかにならず、破骨細胞はまれ
2 軽度=再吸収の領域がより多く、低倍率では容易に明らかにならず、破骨細胞はより多く、辺縁領域では脛骨又は足根骨の1/4未満が再吸収される
3 中度=皮質で全層欠損のない髄質小柱及び皮質骨の明白な再吸収、ある程度の髄質小柱の喪失、低倍率で明白な病変、破骨細胞がより多く、脛骨又は足根骨のうち1/4〜1/3が辺縁領域で罹患
4 顕著=全層が、皮質骨で欠損しており、残りの皮質表面の輪郭のゆがみを伴う場合が多く、髄様骨の顕著な喪失、多数の破骨細胞、脛骨又は足根骨のうち1/2〜3/4が辺縁領域で罹患
5 重度=全層が、皮質骨で欠損しており、残りの皮質表面の輪郭のゆがみを伴う場合が多く、髄様骨の顕著な喪失、多数の破骨細胞、脛骨又は足根骨のうち3/4超が辺縁領域で罹患、全体的な構造の重度のゆがみ
0 正常
0.5 最小の再吸収は、辺縁領域にのみ影響する
1 最小=再吸収の小領域、低倍率では容易に明らかにならず、軟骨下骨の総関節幅のうち約1〜10%が罹患
2 軽度=再吸収の領域がより多く、軟骨下骨の明確な喪失、軟骨下骨の総関節幅のうち約11〜25%が罹患
3 中度=軟骨下骨の明白な再吸収、軟骨下骨の総関節幅のうち約26〜50%が罹患
4 顕著=軟骨下骨の明白な再吸収、軟骨下骨の総関節幅のうち約51〜75%が罹患
5 重度=破壊に起因する全関節のゆがみ、軟骨下骨の総関節幅のうち約76〜100%が罹患
疾患対照群における疾患の重症度は、第1〜5日で増大し、第4〜5日では、一日の増大が最大であった。次いで、漸増的な増大は、より小さく、第7日にピークであった。そのポイントから前へ、急性の腫脹は一般には低下し、キャリパーの測定は低下した。処置群は、この一般的なパターンに同様に従った。
研究の概念
この研究の目的は、2つの異なる化合物である、配列番号197の全−D−レトロ−インベルソJNK阻害剤(ポリ)ペプチド及び配列番号172のJNK阻害剤(ポリ)ペプチドの、スコポラミン誘発性ドライアイのマウスモデルにおける3つの用量レベルでの効果を評価することであった。
1.用量調製
配列番号197の(ポリ)ペプチドは、Polypeptide Laboratories(フランス)から、300.65mgの乾燥粉末を含有する1.5mLの透明なプラスチックのマイクロフュージバイアルとして入手した。
研究に入る前に、各々の動物に、SLE及び間接的な眼科検査を、局所適用フルオレセインを用いて実施した。眼科的知見は、ドレイズスケール眼科スコアリングを用いて記録した。SLE及びドレイズスコアリングは、生存中の期間中、1週間に3回繰り返した。
TBUT試験は、角膜へのフルオレセインの適用後の完全なまばたきと、涙液層中の第一のランダムな乾燥スポットの出現との間の時間経過の秒数を測定することによって毎週3回行った。TBUTを行うために、0.1%液体ナトリウムフルオレセインを、結膜嚢に滴下し、眼瞼を手技的に3回閉じ、次いで、角膜を覆う連続のフルオレセイン含有涙液層を開いたまま保持し、層が破壊する(乾燥スポット又はストリークの出現)のに必要な時間(秒)を記録した。少なくとも90秒後、0.1%フルオレセインの滴を角膜に更に再滴下した後、角膜上皮の損傷を、コバルトブルーフィルターを有する細隙灯を用いて等級付けし;次いで角膜をドレイズ眼スケールについてスコア付けした。
涙液生成を、PRTT試験ストリップ(Zone−Quick;メニコン、日本、名古屋)を用いて、両眼で週に3回測定した。その日の最初の処置の前に、細隙灯生体顕微鏡のもとで30秒間各々の眼の結膜円蓋の外眼角に糸を適用した。トレッドの上の涙移動(すなわち、濡れた綿の糸の長さ)は、ミリメートルのスケールを用いて測定した。
第22日の剖検では、眼球、涙腺、眼瞼、及び結膜を含む各々の動物由来の両眼を切除した。右眼及び関連の組織を、改変ダビッドソン溶液中への浸漬、続いて、10%中性緩衝化ホルマリン(NBF)へ移すことによって固定した。この右眼の固定した組織を、脱水し、パラフィンに包埋し、3〜5μmの厚みで切片にし、スライドに装填した組織をヘマトキシリン及びエオシン(H&E)で染色した。染色したスライドを、光学顕微鏡で評価した。詳細かつ完全な組織病理学的評価を、眼の全部分で行い、少なくとも2つの切片のレベルを、各々の右眼について組織病理学的に検査した。角膜、結膜及び角膜の上皮(杯状細胞を含む)、並びに涙腺には特に注意を払った。これらの組織は、0〜4のスケールに基づいて損傷についてスコア付けし、ここで0は正常、1は最小、2は軽度、3は中度、4は重度であった。各々の角膜について、スコアは、角膜の上皮の厚み及び角膜炎症に基づいた。結膜を侵食及び炎症について、並びに杯状細胞の有無についてスコア付けした。
スコポラミン(0.5mg/用量)の毎日4回のSC投与は、雌性C57BL/6マウスで、水性涙液生成容積の低下及び涙の物理化学的特性の変化で特徴付けられる、ドライアイ症候群を誘発し、それらのマウスは、眼を効果的に潤滑にして保護することを可能にする安定な涙液層を維持することが難しくなった。
涙液層破壊時間試験(TBUT)は、ドライアイの誘発の前、並びにドライアイ誘発後第2、4、7、9、11、14、16、18及び21日に再度行った。スコポラミンの投与(ドライアイ誘発)の開始後、TBUT平均値は、全ての動物で低下し始めたが、第6群(配列番号172の中間用量)ではより緩徐に低下するようであった。第5、6、7群(配列番号172のペプチドの低用量、中用量及び高用量)及び第8群(シクロスポリン)のTBUTの平均最下点は、第7日に生じ、同様の値に達した(それぞれ、6.6±0.4、6.7±0.4、6.7±0.3、及び6.4±0.4s)。その後、これらの群のTBUT平均は、第9日にピークまで増大した。第6群及び第7群(配列番号172の中用量及び高用量群)のTBUT平均は、第8群、シクロスポリン群(8.5±0.3s)よりも高い値まで上昇した(それぞれ、10.0±0.7s及び9.9±0.8s)が、第5群、配列番号172の低用量のピークTBUT平均(8.0±0.4s)は、第8群(シクロスポリン)のものよりわずかに低かった。中用量及び高用量の配列番号197処置動物、第3群及び第4群のTBUT平均は、投与の開始後に低下し続けて、第9日に最下点に達したが、低用量の第2群は、第9日に増大した。配列番号172処置動物の低用量、中用量及び高用量(それぞれ、第2群、第3群及び第4群)のTBUT平均は、ビヒクル群を上回り、一般には、配列番号172処置動物の低用量、中用量及び高用量の平均より下であった。
PRTT試験は、ドライアイの誘発前、並びに第2、4、7、9、11、14、16、18及び21日に再度行った。第0日から第4日のPRTT値は、ドライアイを誘発させた全てのマウスで低下し、このことは、スコポラミンの投与及びブロワーで生み出された気流の増大した乾燥環境への曝露後に、涙液の生成が低下したことを示している。ほとんどの群でのPRTTの最下点は、ほぼ第7日に生じた。PRTTは、ビヒクル対照群(第1群)で低下を続け、第14日に最下点に達した。最下点の後、全てのドライアイ群で増大があった。これらの知見によって、化合物処置の開始より1日早いスコポラミン処置の開始は、ドライアイ症候群に関連する眼の生理学的変化を開始するのに十分であったことが示される。シクロスポリン処置群がほぼ第7日にまたがって他の群と同様のPRTTの低下を示した場合でさえも、次いで第11〜14日にはピークまで増大し、その後わずかに低下した。最終のPRTT試験(第21日)では、シクロスポリン(第8群)、並びに第6群及び第7群は全て、同様のPRTT値を有し、これによって、中用量及び高用量の配列番号172のペプチドの処置の両方とも、このマウスドライアイモデルで水性涙液生成の増大においてシクロスポリンと同様の治療効果を有することが示唆される。
ここでは、組織学的変化は、一般に角膜に限定された。角膜における知見は、角膜の上皮表面の角質化、角膜上皮の肥厚、角膜上皮の細胞充実度の増大、上皮細胞代謝回転と一致した基底上皮層の有糸分裂の軽度の頻度増大から構成された。これらの知見は、角膜乾燥及び角膜表面刺激作用に対する生理学的適応応答の指標である。表面潰瘍化、角膜実質浮腫及び角膜への炎症性浸潤は、この研究では見られなかった。第9群、未処置群(正常なマウス、スコポラミン処置なし)における眼は、正常限界内であった。全ての群にまたがって散らばった眼瞼のある程度の最小の非化膿性炎症があったが、眼の結膜、網膜、涙腺及び他の部分は、正常な限界内であった。杯状細胞は、全ての群で限界内であると思われた。杯状細胞は、涙がより強く、より粘着性の膜を形成することを助ける、ムチンの主なプロデューサーである。
アドリアマイシン処置は、ラット及びマウスにおいて糸球体疾患を誘発し、ヒト巣状分節状糸球体硬化症(FSGS)を模倣する。このモデルでは、管状及び間質性の炎症病変が、部分的には重度のタンパク尿に起因して、疾患経過の間に生じる。治療がなければ、腎臓疾患は、8週間以内に末期腎不全に進行する。有足細胞損傷は、糸球体硬化症につながるシークエンスの最初の段階の1つである。この研究の目的は、JNK阻害剤が、腎の病変及び腎不全の発達を防げるか否かを検討することであった。
30例の雄性Sprague−Dawleyラット(Charles River)をこの研究で用いた(10匹のラットの3つの群に分けた)。腎症は、第0日のアドリアマイシン10mg/kgの単回静脈内注射によって誘発された。配列番号172のJNK阻害剤(2mg/kg;0.9%NaCl中)又はビヒクルを、第0日に尾静脈に静脈内投与した。投与容積は0.2mlであった。
結果:
疾患の進行中の腎機能に対する配列番号172のJNK阻害剤の効果:尿及びクレアチニン血清レベルを測定して、腎臓疾患の経過の間の腎機能を研究した。クレアチニンは、熱量測定の量を邪魔するので、腎機能の繊細な指標である尿素のみを分析した。尿の血清レベルは未処置のラットでは顕著に安定であるが(5mmol/l未満)、ADRは尿素レベルの進行性の増大を誘発し、これは第28日から第41日の25mmol/lまで、次いで第56日の48mmol/lまで急激に上昇し、これは末期腎不全を反映している(図38B)。他方では、配列番号172のJNK阻害剤で処置したラットは、疾患の経過にまたがって10mmol/l未満の尿血清レベルを示した(図38B)。これらの結果によって、配列番号172のJNK阻害剤は、腎臓疾患及び腎不全の進行を防ぐことが示唆される。
ADR誘発性の構造変化を、光学顕微鏡下で評価した。生理食塩水処置した対照のラットは、形態学的に正常な糸球体及び小管を示した。第8日に、光学顕微鏡の検査によって、ADRネフローゼ群における巣状分節状糸球体硬化及びタンパク性円柱を有するいくつかの領域が示された。対照的に、いくつかの小管は、配列番号172のJNK阻害剤で処置したラットではタンパク質で充填され、糸球体は、メサンギウム細胞過多がないか又は離散している正常な構造を示したが、小管構造及び間質は、病理学的変化を示さなかった(図39)。第14日までに、ADR処置ラットは、進行性の糸球体硬化症、ヒアリン沈着、管拡張及び円柱形成を示した。糸球体硬化症の程度は、この群では劇的に悪化して、第29日及び第41日までにほとんどの糸球体で、重度の尿細管萎縮及び間質性線維症に関連する、糸球体房とボーマン腔との間の明らかな接着をともなうびまん性になった。第56日に、びまん性糸球体硬化が、全ての糸球体で観察された(図40)。しかし、配列番号172のJNK阻害剤処置したラットは、第8日に相対的に正常な外観を有し、ADR処置ラットと比較して第56日に、少数の限局性かつ部分的な糸球体硬化症及び尿細管間質性線維症を発症した。全体として、これらの結果によって、配列番号172のJNK阻害剤が糸球体及び尿細管間質性の線維症の発症を防ぎ、かつこの群における腎機能の保存を説明し得ることが強く示唆される。
TLR7及びTLR8のリガンドであるイミキモド(IMQ)は、免疫応答の強力な修飾因子である。イミキモドは、多くの動物モデルで強力な抗ウイルス及び抗腫瘍効果が実証されている。Van der Fitsら(The Journal of Immunology 2009、182、5836〜5845頁)によって、BALB/cマウスにおけるIMQの局所適用が、乾癬を誘発し、ヒト乾癬病変とよく似ていることが実証された。
雌性BALB/cAnNCrlマウス(Charles River、研究開始時に8〜10週齢)を以下の群(処置スケジュール)に割り当てた:
1=MI=最小
2=SL=わずか
3=MO=中度
4=MA=顕著
5=SE=重度
配列番号172のJNK阻害剤中用量群(統計学的に有意)及び配列番号172のJNK阻害剤高用量群は、ビヒクル−IMQ投与群と比較して耳の炎症が低下していた(図41)。また、陽性対照群、すなわち、プレドニゾロン群及びデキサメタゾン群は、ビヒクル−IMQ投与群と比較して耳の炎症の低下を示した(両方とも統計学的に有意、図41)。一般には、真皮に存在した炎症は、より少ない好中球と混合されたリンパ球及びマクロファージから構成された。表皮中の炎症はそれほど一般的でなく、主に好中球であって、角膜内の層(正常角化層)に、及び表皮内にマンロー微小膿瘍(Munro’s microabscesses)として存在した。炎症はナイーブな群には存在しなかった。
腎虚血/再かん流(腎I/R)障害は、急性腎不全としても公知の、急性腎障害(AKI)の一般的に使用されるモデルである。急性腎障害に対する腎I/R障害を試験する研究の臨床関連性に加えて、実験的な腎I/R障害はまた、腎移植を受けている患者で生じる状態を評価するために用いられる重要なモデルでもある。ドナー次第で、移植された腎臓は、移植前の種々の時間の間、血液をかん流されない。AKIは、患者でこのような深刻な影響を有し、全ての移植された腎臓は、腎I/R障害をある程度まで経験するので、ヒトの健康に対するこの種の研究の臨床的な関連性及び移行の重要性は極めて高い。したがって、この研究の目的は、ラットにおける実験的な腎虚血/再かん流に対して配列番号172のJNK阻害剤の影響を検討することである。
この研究の目的は、ラットにおける歯周炎モデルで誘発された炎症に対する配列番号172のJNK阻害剤の影響を検討することである。
24(18)の雌性Lewisラット(36の眼)を無作為に、各々3匹の動物の6つの群に分けた。EIUを、200μgのLPS(サルモネラ・ティフィムリウム(Salmonella typhimurium)由来のリポポリサッカライド、Sigma−Aldrich、France)(2mg/ml)を含有する100μlの滅菌の発熱性物質なしの生理食塩水の単回足蹠注射によって誘発した。
等級0:炎症なし、
等級1:最小の虹彩及び結膜の血管拡張があるが、前眼房(AC)ではフレアも細胞も観察されない、
等級2:中度の虹彩及び結膜の血管拡張があるが、ACではフレアも細胞も証拠がない、
等級3:強度の虹彩の血管拡張の存在、フレア及び細隙灯あたり10未満の細胞、ACの領域、
等級4:等級3より重度の臨床徴候の存在、ACで10を超える細胞が、前房蓄膿の形成の有無を伴う、
等級5:強度の炎症反応の存在、ACにおけるフィブリン形成及び瞳孔の完全な閉鎖。
腎虚血/再かん流(腎I/R)障害は、急性腎不全としても知られる、急性腎障害(AKI)の一般的に使用されるモデルである。急性腎障害に対して腎I/R障害を検査する研究の臨床関連性に加えて、実験的な腎I/R障害はまた、腎移植を受けている患者で生じる状態を評価するために用いられる重要なモデルでもある。ドナー次第で、移植された腎臓は、移植前に種々の時間の間、血液をかん流されない。AKIは、患者でこのような深刻な影響を有し、全ての移植された腎臓は、腎I/R障害をある程度まで経験するので、ヒトの健康状態に対するこの種の研究の臨床的な関連及び移行の重要性は極めて高い。したがって、この研究の目的は、ラットにおける実験的な腎虚血/再かん流に対する配列番号172によるJNK阻害剤(「XG−104」)の影響を検討することである。
結果を図42に示す。血清クレアチニン及び尿素は、虚血なしのビヒクル処置対照ラット(G1)と比較して、虚血24時間後にビヒクル処置した虚血ラット(G2)では増大した。他方では、配列番号172によるJNK阻害剤で処置された虚血性ラット(G3)は、未処置の虚血性ラット(G2)に対して、低い血清クレアチニン及び低い尿素を示した。これらの結果によって、配列番号172によるJNK阻害剤(「XG−104」)は、虚血誘発性腎不全を防ぎ得ることが示唆される。
この研究の目的は、MTSアッセイを用いて、ヒト肝細胞癌及びヒト肝癌細胞株に対して配列番号172によるJNK阻害剤(「XG−104」)の細胞毒性活性を決定することである。
IC=(OD薬物−曝露されたウェル/ODビヒクル−曝露されたウェル)×100
ここで、IC50とは、細胞増殖の50%阻害を得るための薬物濃度を指す。IC50は、50%の細胞の細胞傷害性を得るのに必要な薬物濃度である。薬物応答曲線は、XLFit5(IDBS、英国)を用いてプロットし、示される。IC50決定値は、片対数曲線からXLFit5ソフトウェアを用いて算出される。各々の個々のIC50決定値、同様に平均±SD IC50値も示す。
この研究の目的は、乾癬のBK5.STAT3Cマウスモデルにおける、配列番号172によるJNK阻害剤(「XG−104」)の効果を評価することである。このモデルは、そのケラチン生成細胞が、Stat3の構成的に活性な形態を発現する、ヘテロ接合性のトランスジェニックマウスを用いる。
ビヒクル(0.9%NaCl)を、第0日〜第5日に腹腔内注射によって、1日1回(QD)与える。
配列番号172によるJNK阻害剤(「XG−104」)を、第0日〜第5日に腹腔内注射によって1日1回(QD)与える。
ビヒクル(0.9%NaCl)を、第0日〜第5日に腹腔内注射によって1日1回(QD)与える。
動物を第0日に1回秤量する。全ての動物は、この研究を通じて、毎日、病気健康の徴候を観察する。第5日に研究が終わった後、約1cm2の皮膚生検(病変)を、各々のマウスの背中に収集して、最適切断温度(OCT)含有モジュールで包埋し、ドライアイス上で凍結し、クリオトームを用いて6μmのスライスに切片にし、H&Eで染色する。表皮厚(表皮肥厚症)は、2つの独立した実験によって盲検で組織学的に測定する。1匹のマウスについて1つのスライド及び10の異なる領域の切片を測定する。
この研究の主な目的は、健常な男性ボランティアにおけるXG−104(配列番号172によるJNK阻害剤)の昇順の用量の単回及び反復の滴下の耐容性及び安全性の決定を評価することであった。この研究の二次的な目的は、健常な男性ボランティアにおけるXG−104の昇順の用量の単回及び反復の滴下の全身的な薬物動態を評価することであった。
1.薬物動態学的結果:
この研究では、600個のヒト血漿試料を分析して、XG−104を定量した。全ての標準的な試料、QC試料及び検量線パラメータは、合格基準を満たした。しかし、標品試料中で測定した全ての濃度は、LLOQ(定量化の下限:<40ng/mL)未満であった。
2.1 単一投与部分
全研究期間の間、28名の対象のうち15名が、34例の有害事象の出現を報告した。これらのうち32例は、処置時に発現した有害事象(TEAE)であり、2例が非突発的(血液クレアチニンホスホキナーゼ上昇及び首の疼痛)であった。TAEAのうちでも、21例は、XG−104投与後、11例は、プラシーボ投与後に経験された。全てが軽度の強度であった。最も報告されたTEAEは、眼の障害であった:17例が右眼(処置された)で報告され、13例が左眼(処置なし)で報告された。右眼で報告されたTEAEのうち、3例はおそらく治験薬物投与(結膜炎(2)及び結膜の充血(1))に関連しており(全て、XG−104 0.8mg(1.6%)群)、14例は無関係(点状角膜炎(12):5例がプラシーボ群、2例がXG−104 0.1mg(0.2%)群、2例がXG−104 0.2mg(0.4%)群、2例が、XG−104 0.4mg(0.8%)群、1例がXG−104 0.8mg(1.6%)群;及び0.1mg(0.2%)で眼の掻痒(1)、及び0.2mg(0.4%)群で結膜の充血(1))であった。左眼で報告された全てのTEAEは、治験薬投与とは無関係であった(点状角膜炎(12)、結膜の充血(1))。この研究中に深刻な有害事象は報告されなかった。臨床的に関連する知見は、臨床検査、バイタルサイン又はECGパラメータでは観察されなかった。
全研究期間の間、21名の対象のうち17名が、66例の有害事象の出現を報告した。これらのうち65例は、処置時に発現した有害事象(TEAE)であり、1例は、非突発的(点状角膜炎)であった。TEAEのうちでも、61例は、XG−104投与後、4例は、プラシーボ投与後に経験された。全てが軽度から中度の強度であった。最も報告されたTEAEは、眼の障害であった:44例が、右眼(処置された)で報告され、18例が左眼(処置なし)で報告された。右眼で報告されたTEAEのうち、3例はおそらく治験薬物投与に関連しており(XG−104 0.1mg(0.2%)群で結膜炎(2)、及びXG−104 0.2mg(0.4%)群で眼瞼の刺激(1))、39例は関係しないようであり(結膜の充血(21):6例がXG−104 0.1mg(0.2%)群、5例がXG−104 0.2mg(0.4%)群、及び10例がXG−104 0.4mg(0.8%)群;点状角膜炎(17):6例がXG−104 0.1mg(0.2%)群、6例がXG−104 0.2mg(0.4%)群、及び5例がXG−104 0.4mg(0.8%)群;XG−104 0.4mg(0.8%)群で結膜炎(1));2例は、無関係(点状角膜炎(2):1例がプラシーボ群、及び1例がXG−104 0.2mg(0.4%)群)であった。左眼で報告されたTEAEのうち、12例は、治験薬投与とは関係しないようであり(結膜充血(7):2例がXG−104 0.1mg(0.2%)群、3例がXG−104 0.2mg(0.4%)群、及び2例がXG−104 0.4mg(0.8%)群;点状角膜炎(5):2例がXG−104 0.1mg(0.2%)群、1例がXG−104 0.2mg(0.4%)群、及び2例がXG−104 0.4mg(0.8%)群);6例は、治験投与とは無関係であった(点状角膜炎(6):1例がプラシーボ群、1例がXG−104 0.1mg(0.2%)群、及び4例がXG−104 0.2mg(0.4%)群)。眼科的検査によって、全体的な投与効果が確認され(プラシーボ群では、異常な検査はより低い)、第3日〜第20日の間で増大していた。
多施設、無作為化、二重盲検、プラシーボ対照の、臨床第II相試験を行って、ドライアイの治療のための制御有害環境(CAESM)モデルにおいて、環境中で、及びャレンジの間、配列番号172によるJNK阻害剤(「XG−104」)の点眼液の有効性及び安全性を評価した。この研究の目的は、4週のTID処置期間の後、ドライアイの徴候及び症状の治療についてプラシーボと比較して、配列番号172によるJNK阻害剤の点眼液の有効性及び安全性を評価することである。
この研究は、腎虚血/再かん流におけるXG−104の先行研究(実施例15)に基づく。この研究の目的は、腎臓の両側虚血再かん流のラットモデルにおける組織学的損傷に対するXG−104の効果を評価することであった。
尿細管の損傷スコアは、変性/壊死、尿細管上皮空胞形成、再生(塩基性尿細管)、及び尿細管円柱のいずれかから構成された:
0:尿細管の罹患が5%未満(バックグラウンド)
1:罹患した尿細管が5〜20%
2:罹患した尿細管が21〜40%
3:罹患した尿細管が41〜75%
4:罹患した尿細管が75%超
本研究の目的は、雌性Sprague−Dawleyラットにおいて、急性のCYP誘発性膀胱炎における膀胱の疼痛及び炎症に対するXG−104(50mg/mL)での膀胱内処置の効果を評価することであった。この前臨床モデルは、間質性膀胱炎/膀胱痛症候群(IC/PBS)の治療のための治療アプローチを試験するためによく用いられる。
固定した時刻(行動の応答における潜在的な概日変動を最小限にするために午前)、及び全動物の単一実験者試験を含む標準化された条件を適用して、行動に基づく疼痛の試験の変動性を最小限にした。異痛症及び痛覚過敏症を含む内臓痛を、膀胱付近の下腹部に、5秒の刺激間隔で漸増する力(1、2、4、6、8、10、26及び60g)の1セットの8つの較正したフォン・フレイフィラメントを適用することによって評価した。試験前に、各々の動物の機械的刺激のために設計した腹部領域を剃毛した。次いで、動物を、個々の透明なPlexiglasボックスの下の高くなったワイヤメッシュの床に置いて、フォン・フレイ試験を開始する前に少なくとも30分間慣れさせた。次いでフィラメントを、フィラメントがわずかに屈曲するのに十分な力でメッシュの床を通じて1〜2秒適用した。各々のフィラメントを3回試験した。注意を払って、膀胱の近辺で下腹部領域内の異なる領域を刺激して、脱感作を回避した。
・ D−1に、ラットを個々のPlexiglasボックスに最短30分間、及びフォン・フレイフィラメント適用に慣れさせて、新しい環境によるストレスのレベルを低下させた。
・ D0に、フォン・フレイ試験をCYP又は生理食塩水注射の15分前に行って、基礎の値(D0、T=−15分)を得た。
・ D1に、フォン・フレイ試験をCYP又は生理食塩水注射の24時間後に行って、CYP誘発性の内臓痛に対する試験化合物の効果を分析した(D1、T=+24h)。
・ フォン・フレイ試験(+24h)の直後に、ラットを血液試料収集のために麻酔し、次いで以下に記載のとおり屠殺して、膀胱を収集した。
CYP注射の前に、侵害受容パラメータにおいて、3つの異なるCYP注射の群の間で観察された有意な相違はなかった。CYP誘発性内臓痛に対するXG−104の効果を分析するために、侵害受容パラメータを、ビヒクル処置群とXG−104処置群との間で比較した。CYP注射の24時間後、侵害受容の閾値は、ビヒクルと比較してXG−104処置では有意に増大した(p<0.01、図51A)。XG−104処置はまた、ビヒクルと比較してCYP注射ラットで侵害受容スコアを有意に低下した(p<0.001、図51B)。更に、AUC1−8gは、ビヒクルと比較してXG−104処置によって有意に低下された(p<0.001、図51C)。同様に、AUC8−60gは、ビヒクルと比較してXG−104処置によって低下された(p<0.01、図51D)。CYP誘発性内臓痛に対するイププロフェンの効果を分析するために、侵害受容パラメータをビヒクル処置群とイブプロフェン処置群との間で比較した。侵害受容の閾値は、CYP注射ラットにおいてビヒクルと比較した場合、イブプロフェン処置によって有意に増大した(p<0.01、図51A)。同様に、イブプロフェン群では、侵害受容スコアの有意な低下が、ビヒクルと比較した場合観察された(p<0.01、図51B)。更に、AUC1−8g及びAUC8−60gは、ビヒクルと比較した場合、イブプロフェン処置によって有意に低下した(それぞれ、p<0.001及びp<0.05、図51C及び図51D)。
本研究の目的は、雌性Sprague−Dawleyラットにおいて、急性のCYP誘発性膀胱炎における膀胱疼痛に対するXG−104(2mg/kg)での静脈内処置の効果を評価することであった。この前臨床モデルは、間質性膀胱炎/膀胱痛症候群(IC/PBS)の治療のための治療アプローチを試験するためによく用いられる。
固定した時刻(行動の応答における潜在的な概日変動を最小限にするために午前)、及び全動物の単一実験者試験を含む標準化された条件を適用して、行動に基づく疼痛の試験の変動性を最小限にした。異痛症及び痛覚過敏症を含む内臓痛を、膀胱付近の下腹部に、5秒の刺激感覚で漸増する力(1、2、4、6、8、10、26及び60g)の1セットの8つの較正したフォン・フレイフィラメントを適用することによって評価した。試験前に、各々の動物の機械的刺激のために設計した腹部領域を剃毛した。次いで、動物を、個々の透明なPlexiglasボックスの下の高くなったワイヤメッシュの床に置いて、フォン・フレイ試験を開始する前に少なくとも30分間慣れさせた。次いでフィラメントを、フィラメントがわずかに屈曲するのに十分な力でメッシュの床を通じて1〜2秒適用した。各々のフィラメントを3回試験した。注意を払って、膀胱の近辺で下腹部領域内の異なる領域を刺激して、脱感作を回避した。
・ D−1に、ラットを個々のPlexiglasボックスに最短30分間、及びフォン・フレイフィラメント適用に慣れさせて、新しい環境によるストレスのレベルを低下させた。
・ D0に、フォン・フレイ試験をCYP又は生理食塩水注射の15分前に行って、基礎の値(D0、T=−15分)を得た。
・ D1に、フォン・フレイ試験をCYP又は生理食塩水注射の24時間後に行って、CYP誘発性の内臓痛に対する試験化合物の効果を分析した(D1、T=+24h)。
・ フォン・フレイ試験(+24h)の直後に、ラットを血液試料収集のために麻酔し、次いで下に記載のとおり屠殺して、膀胱を収集した。
CYP注射の前に、侵害受容パラメータにおいて、3つの異なるCYP注射の群の間で観察された有意な相違はなかった(p>0.05)。CYP誘発性内臓痛に対するXG−104の効果を分析するために、侵害受容パラメータを、独立して、ビヒクル処置群とXG−104処置群との間で比較した。CYP注射の24時間後、侵害受容の閾値は、ビヒクルと比較してXG−104処置では有意に増大した(p<0.01、図53A)。XG−104処置は、ビヒクルと比較してCYP注射ラットで侵害受容スコアを有意に低下した(p<0.001、図53B)。更に、AUC1−8gは、ビヒクルと比較してXG−104処置によって有意に低下された(p<0.001、図53C)。同様に、AUC8−60gは、ビヒクルと比較してXG−104処置によって有意に低下された(p<0.01、図53D)。
この研究では、JNK活性化に対する、及びAβ42細胞ストレス後のニューロンアポトーシスに対するJNK阻害剤XG−104の効果を決定した。
初代皮質ニューロン培養を得るために、E15.5マウス胚をPBS(リン酸緩衝化生理食塩水)6%グルコース中で、氷上で解剖した。胚の皮質を小片に刻んで、PBSグルコーストリプシン(Sigma Aldrich、Saint−Louis、USA)を用いて20分間37℃で処理した。解離した皮質細胞を、B27、Glutamax及びペニシリン−ストレプトマイシン(Gibco)を補充したNeurobasal培地中で培養した。ニューロンを37℃、5%CO2で、ポリ−L−リシン(Sigma Aldrich)でプレコーティングしたペトリ皿上で、培養した。ニューロンを培養して、使用前に(7日)成熟させた。
Aβ42ストレスのWT及びPKR−/−ニューロンにおけるXG−104でのJNK及びc−JNK活性の低下
Aβ42ペプチドによってストレスを受けたニューロン培養物中で、XG−104の有効性を検討した。XG−104を、10μMで用い、Aβ42ストレスの誘発の1時間前に細胞培地に添加した。WTニューロンでは、JNK活性化は、Aβ42ストレスの培養物中で、XG−104への曝露後に低下する(−60%、図55A)。XG−104は、ペプチドなしでのストレスのWTニューロンと比較して、c−Junリン酸化を低下するために−29%の有効性(図55C)、及びc−Jun発現を低下するために−62%の有効性(図55D)を示した。PKR−/−ニューロンでは、JNK活性化は、Aβ42ストレスの培養物中で、XG−104によって低下される(−60%、図55A)。PKR−/−培養物中では、XG−104の使用は、c−Jun活性化を改変しないが(図55C)、XG−104の使用は、Aβ42ストレスの誘発後のc−Junタンパク質発現の62%の低下を示した(図55D)。
Aβ42ペプチドで処理したWTニューロンニューロンの培養物中では、XG−104の使用は、アポトーシスを低下した。XG−104を用いて、Aβ42処理のWTニューロンと比較して、切断されたカスパーゼ3発現レベルの61%低下(図55E)、カスパーゼ3活性の78%低下(図55F)、及び切断されたPARP発現レベルの77%低下(図55G)が注目された。
Aβ42及びXG−104によって処理されたPKR−/−ニューロンでは、PKR及びJNKの二重阻害の有効性を、ニューロンのアポトーシスについて評価した。Aβ42ストレスのPKR−/−ニューロンに対するXG−104の使用によって、Aβ42処理したPKR−/−ニューロンと比較して、切断されたカスパーゼ3の発現レベルの42%低下(図55E)、カスパーゼ3活性の61%低下(図55F)、及び切断されたPARP発現レベルの86%低下(図55G)が示された。PKR及びJNKについて二重に阻害されたニューロンでは、切断されたカスパーゼ3、カスパーゼ3活性及びPARP発現レベルは、処理されたWTニューロンと比較して、それぞれ83%、87%及び93%低下した。
Claims (20)
- 配列番号172に記載のアミノ酸配列を含むペプチドであるJNK阻害剤を有効成分とする医薬組成物であって、間質性膀胱炎/膀胱痛症候群(IC/PBS)の予防又は処置用、IC/PBSに関連する症状の軽減用、又は、IC/PBSの進行の遅延用医薬組成物。
- 前記JNK阻害剤が、配列番号172に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項1に記載の、間質性膀胱炎/膀胱痛症候群(IC/PBS)の予防又は処置用、IC/PBSに関連する症状の軽減用、又は、IC/PBSの進行の遅延用医薬組成物。
- 薬学的に許容される担体を含む、請求項1又は2に記載の、間質性膀胱炎/膀胱痛症候群(IC/PBS)の予防又は処置用、IC/PBSに関連する症状の軽減用、又はIC/PBSの進行の遅延用医薬組成物。
- 間質性膀胱炎の予防又は処置、間質性膀胱炎に関連する症状の軽減、又は間質性膀胱炎の進行の遅延に使用される、請求項1から3のいずれかに記載の、間質性膀胱炎/膀胱痛症候群(IC/PBS)の予防又は処置用、IC/PBSに関連する症状の軽減用、又は、IC/PBSの進行の遅延用医薬組成物。
- 膀胱痛症候群の予防又は処置、膀胱痛症候群に関連する症状の軽減、又は膀胱痛症候群の進行の遅延に使用される、請求項1から3のいずれかに記載の、間質性膀胱炎/膀胱痛症候群(IC/PBS)の予防又は処置用、IC/PBSに関連する症状の軽減用、又は、IC/PBSの進行の遅延用医薬組成物。
- 膀胱内投与される、請求項1から5のいずれかに記載の、間質性膀胱炎/膀胱痛症候群(IC/PBS)の予防又は処置用、IC/PBSに関連する症状の軽減用、又は、IC/PBSの進行の遅延用医薬組成物。
- 配列番号172に記載のアミノ酸配列を含むペプチドであるJNK阻害剤を有効成分とする医薬組成物であって、膀胱炎の予防又は処置用、膀胱炎に関連する症状の軽減用、又は、膀胱炎の進行の遅延用医薬組成物。
- 前記JNK阻害剤が、配列番号172に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項7に記載の、膀胱炎の予防又は処置用、膀胱炎に関連する症状の軽減用、又は、膀胱炎の進行の遅延用医薬組成物。
- 薬学的に許容される担体を含む、請求項7又は8に記載の、膀胱炎の予防又は処置用、膀胱炎に関連する症状の軽減用、又は膀胱炎の進行の遅延用医薬組成物。
- 急性膀胱炎の予防又は処置、急性膀胱炎に関連する症状の軽減、又は急性膀胱炎の進行の遅延において使用される、請求項7から9のいずれかに記載の、膀胱炎の予防又は処置用、膀胱炎に関連する症状の軽減用、又は、膀胱炎の進行の遅延用医薬組成物。
- 出血性膀胱炎の予防又は処置、出血性膀胱炎に関連する症状の軽減、又は出血性膀胱炎の進行の遅延において使用される、請求項7から9のいずれかに記載の、膀胱炎の予防又は処置用、膀胱炎に関連する症状の軽減用、又は、膀胱炎の進行の遅延用医薬組成物。
- 膀胱内投与される、請求項7から11のいずれかに記載の、膀胱炎の予防又は処置用、膀胱炎に関連する症状の軽減用、又は、膀胱炎の進行の遅延用医薬組成物。
- 配列番号172に記載のアミノ酸配列を含むペプチドであるJNK阻害剤を有効成分とする医薬組成物であって、膀胱感染の予防又は処置用、膀胱感染に関連する症状の軽減用、又は、膀胱感染の進行の遅延用医薬組成物。
- 前記JNK阻害剤が、配列番号172に記載のアミノ酸配列からなるペプチドである、請求項13に記載の、膀胱感染の予防又は処置用、膀胱感染に関連する症状の軽減用、又は、膀胱感染の進行の遅延用医薬組成物。
- 薬学的に許容される担体を含む、請求項13又は14に記載の、膀胱感染の予防又は処置用、膀胱感染に関連する症状の軽減用、又は膀胱感染の進行の遅延用医薬組成物。
- 膀胱内投与される、請求項13から15のいずれかに記載の、膀胱感染の予防又は処置用、膀胱感染に関連する症状の軽減用、又は膀胱感染の進行の遅延用医薬組成物。
- 反復投与される、請求項1から16のいずれかに記載の、間質性膀胱炎/膀胱痛症候群(IC/PBS)の予防又は処置用、IC/PBSに関連する症状の軽減用、IC/PBSの進行の遅延用、膀胱炎の予防又は処置用、膀胱炎に関連する症状の軽減用、膀胱炎の進行の遅延用、膀胱感染の予防又は処置用、膀胱感染に関連する症状の軽減用、又は、膀胱感染の進行の遅延用医薬組成物。
- 毎日、2又は3日ごと、若しくは毎週、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10週間にわたって投与される、請求項17に記載の、間質性膀胱炎/膀胱痛症候群(IC/PBS)の予防又は処置用、IC/PBSに関連する症状の軽減用、IC/PBSの進行の遅延用、膀胱炎の予防又は処置用、膀胱炎に関連する症状の軽減用、膀胱炎の進行の遅延用、膀胱感染の予防又は処置用、膀胱感染に関連する症状の軽減用、又は、膀胱感染の進行の遅延用医薬組成物。
- 単回投与される、請求項1から16のいずれいずれかに記載の、間質性膀胱炎/膀胱痛症候群(IC/PBS)の予防又は処置用、IC/PBSに関連する症状の軽減用、IC/PBSの進行の遅延用、膀胱炎の予防又は処置用、膀胱炎に関連する症状の軽減用、膀胱炎の進行の遅延用、膀胱感染の予防又は処置用、膀胱感染に関連する症状の軽減用、又は、膀胱感染の進行の遅延用医薬組成物。
- 膀胱内輸注により投与される、請求項1から19のいずれかに記載の、間質性膀胱炎/膀胱痛症候群(IC/PBS)の予防又は処置用、IC/PBSに関連する症状の軽減用、IC/PBSの進行の遅延用、膀胱炎の予防又は処置用、膀胱炎に関連する症状の軽減用、膀胱炎の進行の遅延用、膀胱感染の予防又は処置用、膀胱感染に関連する症状の軽減用、又は、膀胱感染の進行の遅延用医薬組成物。
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