EA002058B1 - Новые соли врс-пептидов с органопротективной активностью, способ их получения и их использование в терапии - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к новым фармацевтическим композициям, пригодным для лечения различных заболеваний человека и животных. Эти фармацевтические композиции содержат один или несколько пептидов.

Description

Настоящее изобретение относится к новым формам для применения синтетических ВРС (соединение для защиты организма) пептидов, включающих от 8 до 15 аминокислотных остатков с молекулярной массой от 900 до 1600 Да, которые обладают органопротективной активностью, способам их получения и их применению в диагностике и терапии.

Известны белки и пептиды, которые пригодны для лечения различных заболеваний людей и животных. Многие из этих агентов образуются ίη νίνο, и их можно получать из тканей животных или людей для приготовления фармацевтических композиций. Примерами фармацевтически применимых белков и пептидов являются инсулин, эритропоэтин, ВМР, интерфероны и т.д. Другим примером является белок желудочного сока с защитной активностью по отношению к слизистой оболочке, который недавно выделили и назвали ВРС.

\νϋ 92/04368 относится к ВРС, которое обладает защитной для организма активностью и имеет молекулярную массу примерно 40000 Да, его получению и его применению. В νθ 93/24521 и νθ 94/11394 раскрываются ВРСпептиды, которые обладают органопротективной активностью аналогичного типа, которая известна для исходного ВРС-белка. 81кшс с1 а1. ίη: Ωίβοδίίνο И18еа8е8 апб 8аепсе5, 41 (1996)7, 1518-1526, описывают ВРС-пентадекапептид 157, который при растворении в воде и физиологическом растворе проявляет лечебное и профилактическое действие при остром панкреатите и сопутствующих поражениях желудка и двенадцатиперстной кишки у крыс.

Таким образом, ВРС-пептиды известны для широкого разнообразия фармацевтических применений. Однако физико-химическая стабильность этих пептидов, например, в физиологическом растворе является неудовлетворительной. Кроме того, применение ВРС-пептидов, особенно при инъекции в водном растворе или в физиологическом растворе вызывает боль и/или некроз.

В этой области хорошо известны соли белков пептидов. Например, Вейтапб М. е! а1. в: ''.Ιοιιηιαΐ ο£ Рерйбе Вевеатсй, 49 (1997)3, 269-272 сообщили, что действие конкретных солей очень избирательно в отношении стабильности и структуры пептидов. Например, добавление одновалентных катионов, таких как ΝΗ₄ ⁺, к конечному 0,1М раствору пептида (поли(61и-Ьеи)) приводит к превращению в водорастворимую бета-структуру. Напротив, при использовании ионов Ь1⁺, №1' или Св⁺ превращение не наблюдается.

Изучали роль поверхностно-доступных ионных пар для стабильности белка при определении влияния добавленных солей (КС1, МдС1₂ и ЬаС1₃) при нейтральном и кислом значении рН применительно к сконструированным ηονο двухцепочечным альфа-спиральным свернутым в спираль клубкам. Результаты показывают, что добавленные соли могут оказывать сложное действие на стабильность белка, включающее стабилизацию и дестабилизацию, посредством чего общий эффект зависит от природы заряженных остатков и ионных взаимодействий, присутствующих в белке (Κοίιη е! а1. в: «1оитиа1 о£ Μο^ϋ18Γ ВюШду», 267 (1997)4, 1039-1052).

В предыдущих исследованиях на модельных пептидах также было показано, что солевые мостики, расположенные ί,ί+4 вдоль пептидной цепи являются более стабилизирующими, чем таковые, расположенные ί,ί+3 с предпочтением для порядка кислота-основание по сравнению с таковым основание-кислота от Ν- к С-концу. Однако в настоящее время неизвестно, оказывают ли поверхностные солевые мостики сильное стабилизирующее действие на нативную структуру белков (Вегдег е! а1., в: ΙοιίΓπηΙ ο£ ΒίοιηοΚαιΙηΓ 81гис!иге апб Оупаткв, 14 (1996)3, 285-291).

Таким образом, свойства солей пептидов в отношении их стабильности, структуры и функции в очень многом зависят от конкретных ионов, участвующих в образовании конкретной соли, и других внутренних и внешних факторов. В настоящее время невозможно предвидеть, какие конкретные свойства может иметь конкретная соль конкретного пептида.

Технической проблемой, лежащей в основе настоящего изобретения, является обеспечение ВРС-пептидов в более стабильной форме и диагностическая и/или фармацевтическая композиция, включающая ВРС-пептиды, проявляющая улучшенную стабильность и, по меньшей мере, такую же фармацевтическую активность, как и сами ВРС-пептиды. Кроме того, технической проблемой, лежащей в основе настоящего изобретения, является обеспечение фармацевтической композиции, в которой преодолены вышеуказанные недостатки, в частности, позволяющей делать безболезненные инъекции ВРС-пептидов.

Настоящее изобретение позволяет решить указанные проблемы путем обеспечения солей ВРС-пептидов и фармацевтической или диагностической композиции, включающей фармацевтически или диагностически эффективное количество солей ВРС-пептидов, где анион соли является отрицательно заряженным пептидом, включающим от 8 до 15 аминокислот, имеющий молекулярную массу от 900 до 1600 Да и имеющий общую формулу (I) [Ζιι Рго Рго Рю Хаа Уаа Рго А1а] ^{(-)или(2-)} (I) где Хаа является остатком нейтральной алифатической аминокислоты, в частности, А1а, ЬА1а, Ьеи, 11е, О1у, Уа1, №1е или №уа,

Уаа является остатком основной аминокислоты, в частности, Ьув, Атд, Огп или Ηίβ и

Ζηη является остатком кислой аминокислоты, в частности, О1и, Авр, Лаб или Арт и где катион соли является катионом неорганического или органического нетоксичного и фармацевтически приемлемого основания. В частности, катион соли является щелочным металлом или щелочно-земельным металлом, например №ί. К⁺, Ь1⁺, С§⁺, Са²⁺, или другим металлом, например Ζη , или первичным, вторичным или третичным амином или органическим соединением, таким как ΝΗ₄ ⁺, триэтаноламин⁺, циклогексиламин⁺, 2-АМП' (2-амино-1 -пропанол) или Трис⁺ (Трис-(гидроксиметил) аминометан), при условии, что эти катионы являются физиологически приемлемыми.

Соли ВРС-пептидов по настоящему изобретению неожиданно проявляют, по меньшей мере, такую же фармацевтическую активность, как и ВРС-пептиды, и дополнительно значительно повышенную физиологическую стабильность по сравнению со свободными ВРСпептидами или ацетатами ВРС-пептидов. Примененный по настоящему изобретению катион не влияет на активность ВРС-пептидов, но увеличивает их стабильность. Соли ВРС-пептидов по настоящему изобретению являются, например, более стабильными, чем ВРС-пептиды или ацетаты ВРС-пептидов в физиологическом растворе или воде. Кроме того, соли по настоящему изобретению хорошо пригодны для перорального введения и не проявляют нежелательных побочных эффектов, таких как боль или некроз во время или после введения, в частности, путем инъекций. Следовательно, соли ВРС-пептидов по настоящему изобретению позволяют улучшить энтеральное или парентеральное введение. Кроме того, соли по настоящему изобретению чрезвычайно предпочтительны вследствие отсутствия каких-либо признаков токсичности до доз 50 мг/кг массы тела.

Соли по настоящему изобретению можно получить растворением свободного ВРСпептида в водном или водном/спиртовом растворителе или других пригодных растворителях с подходящим основанием и затем выделением полученной соли по изобретению путем выпаривания растворителя, замораживания и лиофилизации или добавления другого растворителя, например диэтилового эфира, к водному и/или спиртовому раствору соли ВРС-пептида, вызывая выделение нерастворимой сырой соли. Для получения соли обычно используют один или максимум два моля основания, т. е. катиона, и один моль свободного ВРС-пептида. Для получения основных солей ВРС-пептида предпочтительно используют карбонаты или бикарбонаты щелочных металлов. Полученные соли пептидов хорошо растворимы в воде. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способу получения солей ВРС-пептидов.

В контексте настоящего изобретения, основание рассматривается, как вещество, способное образовывать катион в растворе, особенно в водном и водном/спиртовом растворе.

В контексте настоящего изобретения, фармацевтическая активность включает профилактическую и терапевтическую активности. Соответственно, фармацевтическая композиция относится к композициям, обладающими профилактической и/или терапевтическими активностями.

Кроме того, изобретение относится к фармацевтической или диагностической композиции, включающей соли ВРС-пептидов по настоящему изобретению, необязательно в сочетании с одним или более фармацевтически приемлемым носителем, а также способам получения этих композиций. Эти композиции пригодны для местного и системного применения, например, в форме инъекционных растворов, таблеток, кремов, капсул, мазей, лосьонов, таблеток под язык и т. д. Предпочтительная доза находится в пределах от 10^-5 до 10^-2 мг/кг массы тела при системном введении или при местном в более высоких концентрациях между 0,1 и 0,5%. Установление оптимальных доз для конкретного вида лечения может быть проведено в соответствии с уровнем техники.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической или диагностической композиции согласно вышепредставленному, которая помимо одной или более солей ВРС-пептидов по настоящему изобретению включает трегалозу, особенно для перорального введения, и/или фармацевтически или диагностически приемлемые носители, разбавители и/или добавки.

Композиция, предпочтительно водорастворимая композиция, по изобретению в дополнение к соли ВРС-пептида дополнительно включает водорастворимый белок, инъецируемый в жидкости организма без проявления какой-либо значительной фармакологической активности в концентрации, примененной в одной цельной лекарственной форме по настоящему изобретению (в дальнейшем «водорастворимый белок»). В качестве подобного водорастворимо го белка предпочтительными являются сывороточный альбумин, глобулин, коллаген и/или желатин. Этот белок можно добавлять в количестве, обычно используемом в инъекционных фармацевтических композициях. Так, например, массовое соотношение между водорастворимым белком и солью ВРС-пептида равняется примерно от 0,0001:1 до 100:1, предпочтительно примерно от 0,001:1 до примерно 10:1 или более предпочтительно примерно от 0,01:1 до примерно 1:1.

Далее, изобретение также относится к самим вышеупомянутым солям ВРС-пептида и композициям, содержащим их, в частности, в сухой и/или цельной форме или в водном или водном/спиртовом растворе. Значение рН раствора, полученного из водорастворимой композиции или соли пептида по настоящему изобретению, должно быть таким, чтобы упомянутое значение рН не оказывало какое-либо побочное влияние на активность фармакологически активного пептида и находилось внутри приемлемых пределов для инъекций в целом и также таким, чтобы упомянутое значение рН не вызывало значительного изменения вязкости раствора и не давало образоваться осадку и тому подобное. Таким образом, раствор предпочтительно будет иметь рН примерно от 6 до 9, предпочтительно от 6,5 до 7,5.

Когда водорастворимую композицию по изобретению превращают в водный раствор для введения, концентрация фармакологически активной соли пептида в упомянутом растворе должна быть примерно от 0,0000001 до 10% (масса/объем), более предпочтительно примерно от 0,000001 до 5% (масса/объем) или наиболее предпочтительно примерно от 0,00001 до 1% (масса/объем).

Композиция по настоящему изобретению предпочтительно должна иметь разовую дозированную форму, содержащую фармакологически активную соль ВРС-пептида по изобретению и, если необходимо, вместе с дополнительными добавками, такими как вышеупомянутый водорастворимый белок. Таким образом, например, два из трех вышеупомянутых компонентов предназначены для помещения в ампулу или флакон при их растворении или суспендировании в стерильной воде или стерильном физиологическом растворе. В этом случае, способ получения может включать смешение раствора фармакологически активной соли ВРС-пептида и дополнительно, если необходимо, раствора добавки, или добавление добавки в форме порошка к раствору фармакологически активной соли ВРС-пептида, или другую комбинацию соответствующих процедур. Лекарственную форму можно также приготовить добавлением стерильной воды или стерильного физиологического раствора к лиофилизату или высушенному в вакууме порошку, в котором совместно присутствуют фармакологически активная соль ВРС-пептида и, если необходимо, добавка. Эта цельная лекарственная форма может содержать одну или более обычных добавок, таких как регуляторы рН (например, глицин, соляная кислота, гидроксид натрия), местные анестетики (например, ксилокаин гидрохлорид, хлорбутанол), изотонизирующие агенты (например, хлорид натрия, маннит, сорбит), эмульгаторы, ингибиторы адсорбции (например, Твин® 60 или 80), тальк, крахмал, лактоза и трагакант, стеарат магния, глицерин, пропиленгликоль, консерванты, бензиловый спирт, метилгидроксибензоат и/или арахисовое гидрогенизированное масло. Эта цельная лекарственная форма может дополнительно содержать фармакологически приемлемые наполнители, такие как полиэтиленгликоль 400 или декстран.

Водорастворимая композиция по настоящему изобретению предпочтительно имеет форму препарата для парентерального введения.

В качестве упомянутого препарата для парентерального введения предпочтительными являются инъекционные растворы, растворы для введения через слизистую оболочку, растворы для введения в нос и уши.

Упомянутые инъекционные растворы включают растворы для внутривенного введения, подкожного введения, внутриартериального введения, внутримышечного введения и внутриглазного введения. Эти длительно действующие препараты можно легко набрать из ампулы или флаконов в шприцы. Если при наборе образуются пузырьки, то от них можно легко избавиться при простом стоянии в течение короткого периода времени.

Композиции по настоящему изобретению могут быть в форме растворенной в воде, или в лиофилизированной форме с кристаллизующим растворенным веществом, таким как маннит. Добавление стерильной воды или стерильного фармакологического раствора к лиофилизату приводит к образованию водного раствора.

Тоничность водного раствора водорастворимой композиции по настоящему изобретению должна быть в пределах переносимости при введении и регулироваться, например, изотоническими агентами, такими как хлорид натрия и маннит. Тоничность предпочтительно от вполовину до двух раз выше таковой для физиологического раствора, более предпочтительно составляет от трех четвертей до полутора от таковой физиологического раствора.

Вязкость водного раствора водорастворимой композиции должна быть достаточно низкой для инъекционного введения. Вязкость предпочтительно составляет ниже 500 сПз, более предпочтительно ниже 400 сПз. Значения вязкости соответствуют таковым замеренным при использовании вискозиметра типа Е (ТОК1МЕС, Япония) с воронкой ЬБ при 25°С.

Когда композиция находится в форме лиофилизата, предпочтительно, чтобы вязкость, тоничность и концентрации компонентов в водном растворе, полученном из него, находились внутри соответствующих пределов, упомянутых выше.

Композицию по настоящему изобретению готовят смешением этих ингредиентов обычным способом. Цель смешения ингредиентов по настоящему изобретению должна быть такой, чтобы сохранялась активность фармакологически активной соли ВРС-пептида и образование пузырьков во время способа сводилось до минимума. Ингредиенты помещают в сосуд (например, бутыль или барабан) или в одно и то же время, или в любом порядке. Атмосферой в сосуде может быть, например, стерильный чистый воздух или стерильный чистый азот. Образовавшийся раствор можно перенести в небольшие флаконы или ампулы, и его можно затем подвергнуть лиофилизации.

Жидкую форму или лиофилизированную порошковую форму композиции по настоящему изобретению можно растворить или диспергировать в растворе биодеградируемого полимера, такого как сополимер поли(молочнойгликолевой) кислоты, поли(оксимасляная кислота), сополимер (полиоксимасляной-гликолевой) кислоты или их смеси, и затем можно ввести, например, в пленки, микрокапсулы (сферические микрогранулы) или нанокапсулы (сферические наногранулы), особенно в форме мягких или жестких капсул.

Кроме того, композицию по настоящему изобретению, включенную в липосомы, включающие фосфолипиды, холестерин или их производные, можно дополнительно диспергировать в физиологическом растворе и растворе гиалуроновой кислоты, растворенной в физиологическом растворе.

Мягкую капсулу можно заполнить жидкой формой композиции по настоящему изобретению. Твердые капсулы можно заполнить лиофилизированным порошком композиции по настоящему изобретению или лиофилизированный порошок по настоящему изобретению можно спрессовать в таблетки соответственно для ректального назначения или перорального введения.

Конечно, композицию по настоящему изобретению можно поставлять в предварительно наполненном шприце для самовведения.

Композицию по настоящему изобретению можно хранить при обычной температуре, такой как от +10 до +30°С или в пределах обычного охлаждения, предпочтительно примерно от +2 до +8°С.

Изобретение также относится к новым областям применения и способам лечения с применением вышеупомянутых солей и/или композиций, особенно в отношении лечения нарушений, связанных либо с образованием оксида азота (N0), либо с ослаблением функций N0системы, в частности, гипертензии, стенокардии, импотенции, циркуляторного и септического шока, инсульта, воспаления, респираторного дистресс-синдрома, адгезии и агрегации тромбоцитов и лейкоцитов, дисфункции эндотелия, поражений желудочно-кишечного тракта, нарушений перистальтики, сахарного диабета, панкреатита, гипотензии и болезни Паркинсона; дисфункций или гиперфункций соматосенсорных нервов, в частности, сенсорной невропатии, постгерпетической невралгии, атопического дерматита, слабого заживления травмированной ткани, приобретенной крапивницы на холод и тепло, псориаза, буллезного пемфигоида, экземы, фотодерматозов, хронического артрита и специфической и неспецифической гиперреактивности верхнего и нижнего отделов дыхательных путей (бронхиальной астмы, ринита); нарушений функции эндотелия; ран, язв; состояний, связанных с острыми/или хроническим воспалением, в частности, хронического артрита и заболеваний, связанных с гиперчувствительностью замедленного типа, и поражений желудочно-кишечного тракта; заболеваний печени, поражений органов, индуцированных свободными радикалами, особенно, вызванных облучением; заболеваний, связанных с нарушениями катехоламинергической системы, в частности, шизофрении, эффектов, вызванных амфетамином, злоупотребления наркотиками; состояний, связанных со стрессом; острого панкреатита с дополнительным стимулирующим влиянием на сопутствующую патологию желудка и двенадцатиперстной кишки; сердечных нарушений, в частности, антиаритмического, антиангинального и кардиопротективного лечения; депрессивных расстройств; болезни Паркинсона и патологии, подобной болезни Паркинсона; температурных нарушений; повреждений костей; повреждений различных органов, индуцированных гипертензией; нарушений коагуляции; болевых нарушений; судорог; травмы спинного мозга; алкогольных повреждений, индуцированных злоупотреблением алкоголем или повышенным потреблением алкоголя; ишемических нарушений мозга; повреждений периферических нервов; каталептических заболеваний и нейролептических расстройств; заболеваний, связанных с аномальными или мутантными лимфоцитами; нарушений у плодов; атрофии влагалища и развития остеопороза, вызванных удалением яичников; опухолей; вирусных заболеваний, в частности, СПИД или СПИДассоциированного комплекса; нарушений познавательной способности; нарушений отмены; нарушений почек и нарушений клеточной иммунной ответной реакции.

Кроме того, настоящее изобретение относится к соли ВРС-пептида или фармацевтической или диагностической композиции согласно вышеописанному, где общий формулой (II) является

Хаа 2аа Рго Рго Рго Хаа Уаа Рго А1а Акр 2аа А1а Хаа Хаа Хаа (II)

Настоящее изобретение относится, в частности, к соли ВРС-пептида или фармакологической или диагностической композиции, включающей соль ВРС-пептида вышепредставленной общей формулы (I), где пептид выбирается из группы, состоящей из

Ьеи 61и Рго Рго Рго 61у Ьук Рго А1а Акр Акр А1а Ьеи 61у Уа1;

61у 61и Рго Рго Рго 61у Ьук Рго А1а Акр Акр А1а 61у Ьеи Уа1 (также названный ВРС157):

Ьеи	С1и	Рго	Рго	Рго	Ьеи	Ьуз	Рго	А1а	Азр	Азр	А1а
Ьеи	С1у	Уа1;
Ьеи	С1и	Рго	Рго	Рго	Ьеи	Ьуз	Рго	А1а	Азр	А1а	Ьеи
С1у	Уа1;
С1у	61и	Рго	Рго	Рго	С1у	Ьуз	Рго	А1а	Азр	А1а	С1у
Ьеи	Уа1;
С1и	Рго	Рго	Рго	Ьеи	Ьуз	Рго	А1а;
Азр	Рго	Рго	Рго	Не	Агд	Рго	А1а	Азр;
С1и	Рго	Рго	Рго	Ьеи	Ьуз	Рго	А1а	Азр;
Ьеи	<31и	Рго	Рго	Рго	Ьеи	Ьуз	Рго	А1а	Азр	А1а	Ьеи
С1у	Уа1;
61у	С1и	Рго	Рго	Рго	С1у	Агд	Рго	А1а	Азр
С1и	Рго	Рго	Рго	Ьеи	Ьуз	Рго	А1а	Азп.

Эти пептиды известны из АО 94/11394 и АО 93/24521, содержание которых включено в настоящее раскрытие в отношении приготовления и использования ВРС-пептидов.

Кроме того, пептиды можно присоединить к другим функциональным и/или структурным частям, таким как углеводороды, жиры, белки или пептиды, антитела, рецепторы, гормоны, цитотоксические вещества, маркеры, краски, радиоактивные метки, иммуномодуляторы, лекарственные препараты, носители, мишеневые или сигнальные вещества и т.п.

Кроме того, изобретение относится к вышеупомянутым солям ВРС-пептидов и композициям, где пептид находится в линейной или циклической форме, в частности, циклизован амидной связью между первым и последним аминокислотным остатком.

Изобретение будет объяснено более подробно с помощью пояснительных примеров и сопровождающих фигур.

На фигурах показано на фиг. 1 - ИК-спектр ЫаВРС157; на фиг. 2 - ИК-спектр Ыа₂ВРС157;

на фиг. 3 - ИК-спектр дицезиевой соли ВРС157 (С§₂ВРС157);

на фиг. 4 - ПК-спектр Трис-соли ВРС157 (Трис-ВРС157);

на фиг. 5 - ИК-спектр ди-Трис-соли

ВРС157 ((Трис)2ВРС157);

на фиг. 6 - ИК-спектр 2-аминопропаноловой соли ВРС157(2-АМП-ВРС157);

на фиг. 7 - ИК-спектр триэтаноламиновой соли ВРС157(ТЭАМ-ВРС157).

Пример 1. Получение мононатриевой соли ВРС157 (ЫаВРС157).

0,5 г (0,35 ммоль) пентадекапептида с последовательностью СИ у 01 и Рго Рго Рго 01 у Ьу8 Рго А1а А§р А§р А1а О1у Ьеи Уа1 (ВРС157) растворяли в 10 мл воды, содержащей 29,6 мг бикарбоната натрия (0,35 ммоль), стерилизовали, пропустив через 0,2 μ фильтр и сушили сублимационной сушкой для получения 0,48 г не совсем белого твердого вещества.

Чистота полученной соли: 99,4% (ВЭЖХ).

Масс-спектр (РАВ): 1419, более высокие ионы при 1141 (М⁺Ыа⁺).

Аминокислотный анализ полученной соли пептида после гидролиза 6Н НС1 в течение 72 ч в запаянной пробирке при 110°С давал значения, соответствующие составу: 3С1у, 4Рго, 2А1а, 2А§р, С1и, Ьеи, Уа1, Ьу8.

ИК-спектр (КВг): фиг. 1.

УФ-спектр (Н2О): Х_Макс = 190 нм, других максимумов нет.

Т.пл.: 288-290°С (разложение).

Пример 2. Получение динатриевой соли ВРС157 (Ыа₂ВРС157).

0,5 г (0,35 ммоль) ВРС157 растворяли в 10 мл этанола. Добавляли 1,4 мл 0,5 моль/л метанольного раствора гидроксида натрия при умеренном перемешивании. Этот раствор стерилизовали, пропуская через 0,2 μ фильтр, и медленно добавляли при перемешивании к диэтиловому эфиру (50 мл). Отделенное белое твердое вещество фильтровали и промывали диэтиловым эфиром для получения 0,52 г динатриевой соли.

Чистота полученной соли: 99,4% (ВЭЖХ).

Масс-спектр (РАВ): 1419, более высокие ионы при 1141 (М⁺Ыа⁺), 1464 (М⁺Ыа₂ ⁺).

Данные аминокислотного анализа полученной соли пептида соответствуют составу: 361у, 4Рго, 2А1а, 2Азр, С1и, Ьеи, Уа1, Ьу8.

ИК-спектр (КВг): фиг. 2.

УФ-спектр (Н2О): Х_Макс = 190 нм, других максимумов нет.

Т. пл.: 275-277°С.

Пример 3. Получение дицезиевой соли ВРС157 (С8₂ВРС157).

0,5 г (0,35 ммоль) ВРС157 растворяли в 8 мл воды, содержащей 114 мг карбоната цезия (0,70 ммоль), стерилизовали, пропуская через 0,2 μ фильтр, и лиофилизовали для получения 0,55 г не совсем белого твердого вещества.

Чистота полученной соли: 99,3% (ВЭЖХ).

Масс-спектр (РАВ): 1419, более высокие ионы при 1551 (М⁺С8⁺), 1684 (М⁺С8₂ ⁺).

Данные аминокислотного анализа полученной соли пептида соответствуют составу: 3С1у, 4Рго, 2А1а, 2А8р, С1и, Ьеи, Уа1, Ьу8.

ИК-спектр (КВг): фиг. 3.

УФ-спектр (Н₂О): Х_макс = 190 нм.

Т.пл.: 268°С.

Пример 4. Получение Трис-соли ВРС157 (Трис-ВРС157).

0,5 г (0,35 ммоль) ВРС157 растворяли в 10 мл метанола, содержащего 42,6 мг (0,35 ммоль) трис-(гидроксиметил)-аминометана (Трис), стерилизовали, пропустив через 0,2 μ фильтр и сушили при выпаривании метанола в вакууме при 40°С для получения 0,56 г белого твердого вещества.

Чистота полученной соли: 99,5% (ВЭЖХ).

Масс-спектр (РАВ): 1419 (МН⁺).

Данные аминокислотного анализа полученной соли пептида соответствуют составу: 3С1у, 4Рго, 2А1а, 2А8р, С1и, Ьеи, Уа1, Ьу8.

ИК-спектр (КВг): фиг. 4.

УФ-спектр (Н₂О): = 190 нм.

Т. пл.: 250°С (разложение).

Пример 5. Получение ди-Трис-соли

ВРС157 ((Трис)₂ВРС157).

Соединение готовили способом, описанным в примере 1, за исключением того, что использовали 85,2 мг (0,70 ммоль) Трис.

Чистота полученной соли: 99,5% (ВЭЖХ).

Масс-спектр (ЕАВ): 1419 (МН⁺).

Данные аминокислотного анализа полученной соли пептида соответствуют составу: 361у, 4Рго, 2А1а, 2Акр, 61и, Ьеи, Уа1, Ьук.

ИК-спектр (КВг): фиг. 5.

УФ-спектр (Н₂О): λ^ = 190 нм.

Т. пл.: 188-193°С.

Пример 6. Получение 2-аминопропаноловой соли ВРС157 (2-АМП-ВРС157).

Соединение готовили способом, описанным в примере 1. В качестве основания использовали 2-аминопропанол (2-АМП).

Чистота полученной соли: 96,6% (ВЭЖХ). Масс-спектр (ЕАВ): 1419 (МН⁺).

Данные аминокислотного анализа полученной соли пептида соответствуют составу: 361у, 4Рго, 2А1а, 2Акр, 61и, Ьеи, Уа1, Ьук.

ИК-спектр (КВг): фиг. 6.

УФ-спектр (Н₂О): λ^ = 190 нм.

Т. пл.: 158°С (разложение).

Пример 7. Получение триэтаноламиновой соли ВРС157 (ТЭАМ-ВРС157).

Соединение получали способом, описанным в примере 1. В качестве основания использовали триэтаноламин (ТЭАМ).

Чистота полученной соли: 99,2% (ВЭЖХ). Масс-спектр (ЕАБ): 1419 (МН⁴).

Данные аминокислотного анализа полученной соли пептида соответствуют составу: 361у, 4Рго, 2А1а, 2Акр, 61и, Ьеи, Уа1, Ьук.

ИК-спектр (КВг): фиг. 7.

УФ-спектр (Н₂О): λ^ = 190 нм.

Т. пл.: 202-205°С.

Пример 8. Получение таблеток, содержащих Трис-ВРС157.

Состав	мг/таблетку
Трис-ВРС157	0,5
Трегалоза	20,0
Лактоза	17,0
Крахмал	6,5
Тальк	3,0
Трагакант	2,5
Магний стеарат	0,5
	50,0 мг

Трис-ВРС157 (0,5 мг) и трегалозу (20 мг) растворяли в 1 мл воды и сушили при выпаривании. После высушивания сырой остаток смешивали с другими ингредиентами для приготовления таблеток.

Пример 9. Получение капсул, содержащих ЫаВРС157.

Состав	мг/капсулу
ЫаВРС157	0,5
Трегалоза	60,0
Лактоза	39,0
Магний стеарат	0,5
	100,0 мг

№1ВРС157 (0,5 мг) и трегалозу растворяли в 1 мл воды и сушили при выпаривании растворителя. Сырой остаток смешивали с другими ингредиентами для получения капсул.

Пример 10. Получение раствора, содержащего ЫаВРС157.

Состав	г/25 мл
ЫаВРС157	0,05
Г лицерин	15,00
Бензиловый спирт	0,01
Буфер рН 7,0, добавленный до	25 мл

Пример 11. Получение крема, содержащего Трис-ВРС157.

Состав	г/25 г
Трис-ВРС157	0,05
Эмульгатор	2,80
Арахисовое гидрогенизированное масло	7,08
Твин® 60	12,08
Пропиленгликоль	3,00
Метилгидроксибензоат	0,07
	25,00 г

Пример 12. Тесты по стабильности.

Стабильность солей ВРС-пептида тестировали при инкубации солей в течение 76 и 120 дней при 40°С. Концентрация солей ВРСпептида в водном растворе равнялась 0,2% (масса/объем). Стабильность определяли, используя ВЭЖХ: колонка с Кготакй 100,5 μ, 150 х 4,6 мм, подвижная фаза 0,1% трифторуксусная кислота в воде/ацетонитриле (от 0 до 50 об.%), градиентное элюирование в течение 25 мин, скорость потока 1 мл/мин, детектирование: УФ при 214 нм.

Для сравнения использовали свободный ВРС-пептид и его моноацетат.

Таблица 1

Стабильность солей ВРС-пептида при 40°С на 0; 76 и 120 дни; анализ в % площади (ВЭЖХ)

Соединение	Значение рН; 0,2% в воде	0 день	76 дней	120 дней
Свободный пептид ВРС157	4,46	99,3	98,1	97,4
Пептид ВРС157 моноацетат	4,53	99,2	97,8	95,3
Натриевая соль ВРС157	6,51	99,4	99,5	99,4
Динатриевая соль ВРС157	7,64	99,4	99,7	99,4
Трис-соль ВРС157	6,31	99,5	99,5	99,4
диТрис-соль ВРС157	8,24	99,5	99,5	99,5
2-АМП-соль ВРС157	8,20	99,6	99,4	99,5
ТЭАМ-соль ВРС157	7,61	99,2	99,3	99,1

Данные, представленные в этой таблице, четко показывают повышенную стабильность солей ВРС-пептида по настоящему изобретению в противоположность свободному ВРС-пептиду или его моноацетату. Кроме того, возможно, вследствие высокого значения рН раствора солей ВРС-пептида, инъекционное введение этих растворов не вызывает какой-либо боли или некроза.

В другом отдельном опыте дополнительное улучшение стабильности солей ВРСпептида по настоящему изобретению в сырой форме и в растворе наблюдали после добавления трегалозы. Следовательно, добавление трегалозы в качестве фармацевтически приемлемой добавки для приготовления фармацевтической композиции, в частности, в форме таблеток или капсул, является другим важным аспектом настоящего изобретения.

Следующие примеры описывают опыты, показывающие фармацевтические активности солей ВРС-пептида по настоящему изобретению. Эти опыты провели, используя различные обычные модели в условиях «ίη νίΐτο» и «ίη νίνο». Для опытов использовали мононатриевую соль ВРС-пептида 157 (сокращ.: ЫаВРС157), если не указано особо. Во всех опытах использовали крыс-самцов Вистар с массой тела 250280 г, если не указано особо.

Пример 13. ΝΟ-система.

Введение.

Оксид натрия (ΝΟ) действует в качестве сигнальной молекулы в эндотелиальных и нервных клетках и в качестве молекул-киллеров, активируемых клетками иммунной системы. Недавно проведенные исследования показали, что ее можно использовать в качестве лекарственного препарата при ингаляции. Оказалось, что в основном, или при избытке, или при ослаблении, ΝΟ вызывает или вносит свой вклад в развитие различных нарушений, в частности, гипертензии, стенокардии, импотенции, циркуляторного шока, септического шока, инсульта, воспаления, респираторного дистресс-синдрома, легочной гипертензии, адгезии и агрегации тромбоцитов и лейкоцитов, сахарного диабета, гипотензии и болезни Паркинсона.

Материалы и методы.

Некоторые из эффектов №1ВРС157 (10 мкг или 10 нг/кг), такие как целебную активность при поражениях желудка и активность №1ВРС157 в отношении поддержания кровяного давления, воспроизводили на крысах. Патологические изменения желудка вызывали обработкой этанолом в течение 1 ч (96% в/ж (внутрижелудочно)). Одновременно вводили №1ВРС157 (в/б (внутрибрюшинно)). В опыте по поддержанию кровяного давления №1ВРС157 вводили внутривенно (в/в).

Также оценивали совместное введение метилового эфира ΝΟ-нитро-Ь-аргинина (ЬΝΑΜΕ) (5 мг/кг в/в), конкурентного ингибитора образования окиси азота (ΝΟ) в эндотелии и предшественника ΝΟ Ь-аргинина (200 мг/кг в/в) (Ό-аргинин был не эффективен). В опытах с поражениями желудка ΝΟ-агенты вводили за 5 мин до воздействия этанола и лечения ΝαΒΡΟ57.

Результаты.

На модели с этанолом введенный один №1ВРС157 обладает противоязвенным действием, как и Ь-аргинин. №1ВРС157 предупреждал в противном случае сильные патологические изменения желудка, наблюдаемые у обработанных этанолом крыс. Ь-ΝΑΜΕ не оказывал эффекта. Ь-ΝΑΜΕ полностью снимал активность Ьаргинина, но только ослаблял активность №1ВРС157. После применения комбинации ЬΝΆΜΕ+Ь-аргинина, активность №1ВРС157 дополнительно ослаблялась.

В опытах по кровяному давлению №1ВРС157 (без действия на основные нормальные значения) в сравнении с Ь-аргинином оказывал как подобное действие (уменьшал подъем кровяного давления под действием Ь-ΝΑΜΕ при профилактическом применении и снижал уже высокие значения под действием Ь-ΝΑΜΕ при введении на фоне максимального подъема давления под действием Ь-ΝΑΜΕ (т.е. через 10 мин после Ь-ΝΑΜΕ)), так и профилактическое действие (умеренное снижение кровяного давления под действием Ь-аргинина предотвращалось №1ВРС157 перед введением первого). Когда №1ВРС157 вводили через 10 мин после применения комбинации Ε-ΝΑΜΕ+Ь-аргинина (также приводящей к повышению кровяного давления), его четкий эффект (отмеченный на обработанных Ь-ΝΆΜΕ крысах) исчез. В условиях ίη νίίτο, в гомогенатах слизистой желудка крыс №1ВРС157. использованный в той же дозе (100 мкМ). что и Ь-аргинин, индуцировал сравнимое образование ΝΟ. Но действие №1ВРС157 не ингибировалось Ь-ΝΛΜΕ даже в десятикратной (100 против 1000 мкМ) дозе, которая необходима для ингибирования эффекта Ь-аргинина. С другой стороны, синтез ΝΟ снижался при совместном введении №1ВРС157 и Ь-аргинина. В итоге, ΝαΒΡΟ57 может особым способом оказывать действие на эффекты ΝΟ как в отношении целостности слизистой желудка, так и поддержания кровяного давления особенно в сочетании с Ь-аргинином, имея более выраженное и/или совершенное отличное действие на эффекты ΝΟ.

Обладая более выраженным действием на ΝΟ, чем это делает Ь-аргинин, ΝηΒΡί'Ί 57 может предупреждать избыточное образование ΝΟ. связанное с побочными эффектами (нарушенное действие Ь-аргинина (например, гипотензия)). Эти побочные эффекты в условиях ίη νίνο имеют обратное развитие к нормальным значениям, и в условиях ίη νίίτο предотвращается избыточное образование ΝΟ. Кроме того, устраняются отрицательные последствия ингибирования ΝΟсистемы (например, предупреждение индуцированного Ь-ΝΆΜΕ повышения кровяного давления и обратное развитие уже возникшей под действием Ь-ΝΛΜΕ гипертензии).

Основываясь на близком сходстве ΝΟтестов для других тканей (например, легких, печени, кровеносных сосудов и т. д.) и различий использованных моделей (поражения желудка и поддержание кровяного давления). является очевидным отмеченное положительное действие №1ВРС157 в отношении как избыточного образования ΝΟ, так и ослабленных функций ΝΟ-системы. В частности, соли ВРС-пептидов по настоящему изобретению полезны для лечения гипертензии, стенокардии, импотенции, циркуляторного шока, септического шока, инсульта, воспаления, респираторного дистресссиндрома, легочной гипертензии, панкреатита, адгезии и агрегации тромбоцитов и лейкоцитов, дисфункции эндотелия и болезни Паркинсона.

Пример 14. Соматосенсорные нейроны. Введение.

Соматосенсорные нейтроны в основном участвуют в регуляции гомеостаза, особенно в реакции на изменения гомеостаза. Эти нейроны могут сигнализировать о потенциальной опасности. Нейроны, сами по себе, способны сразу же инициировать соответствующие действия для смягчения опасности. Таким образом, вазоактивные афферентные нейроны представляют систему защиты первой линии от травмы. В основном эту защитную способность наблюдали при экспериментальном повреждении кожи и слизистой желудочно-кишечного тракта. В раз витии самых разнообразных заболеваний участвуют как дисфункции, так и гиперфункции, в частности, врожденная сенсорная невропатия. сенсорная невропатия, возникающие при диабете, опоясывающем лишае, невралгии после опоясывающего лишая, атоническом дерматите, слабом заживлении травмированной ткани (например, стойкие кожные ранения, ухудшения поражений кожи, возникшие под действием кислоты и образование кератитоподобных патологических состояний роговицы), приобретенной крапивнице на холод и тепло, псориазе, буллезном пемфигоиде, экземе, фотодерматозах, нарушениях верхних и нижних отделов дыхательных путей, специфической и неспецифической гиперреактивности, вазомоторном рините, астме, хроническом артрите и поражениях желудочно-кишечного тракта.

Материалы и методы.

Изучали гастропротективное действие №1ВРС157 на участках поражения желудка (воспроизведены на крысах обработкой 96% этанолом, стрессом и обработкой индометацином). Оценивали возможное участие сенсорных нейронов в лечебных эффектах Ν;·ιΒΡί'.Ί57 (10 мкг/кг, 10 нг/кг, в/б) с капсаицином, который имеет совершенно противоположное действие на сенсорные нейроны: введение взрослым животным в высоких дозах (125 мг/кг, п/к (подкожно) в возрасте 3 месяцев) и назначение (50 мг/кг, п/к) новорожденным (в возрасте 7 дней) разрушает волокна сенсорных нервов, в то время как низкие дозы (500 мкг/кг в/б) активируют высвобождение нейропередатчика и обладают защитным действием для слизистой.

Результаты.

ί) В отсутствии капсаицина Ν;·ιΒΡί'.Ί57 защищал слизистую желудка от этанола, стресса и введения индометацина.

ίί) В присутствии нейротоксических доз капсаицина отрицательное влияние капсаицина на неподавляемый стресс, участки поражения под действием этанола или индометацина последовательно отрицательно повлияло на целебную активность ЫаВРС157. Защитное действие №1ВРС 157 было по-прежнему очевидным на моделях, обработанных капсаицином (как на обработанных взрослых крысах, так и новорожденных) во всех этих тестах. После обработки капсаицином новорожденных животных было отмечено полное устранение защиты желудка под действием ЫаВРС157. если ЫаВРС157 вводили однократно в нг-дозах. Защитное действие полностью восстанавливалось, когда препарат вводили в той же дозе ежедневно.

ϊϊΐ) В сочетании с возбуждающей дозой капсаицина, полезная активность ЫаВРС157 дополнительно повышалась.

При совместном рассмотрении эти данные показывают сложное синергитическое взаимодействие между полезной активностью №1ВРС157 и активностью пептицергетических сенсорных афферентных нейронов. Принимая во внимание близкое сходство действия капсаицина у животных и людей и вышеописанный опыт, №1ВРС157 можно использовать для лечения вышеупомянутых нарушений.

Пример 15. Защита эндотелия.

Введение.

Известно, что повреждения сосудистого эндотелия предшествуют развитию и являются существенными предрасполагающими факторами для крупных повреждений органов. Защита эндотелия может уменьшить повреждающее влияние ишемии на целостность слизистой. В качестве пригодной модели широко принято использование монастрала синего на крысах незадолго перед применением некротизирующих агентов (например, внутрижелудочно используемый этанол), известных как приводящие к большим повреждениям.

Материал и методы.

Всем крысам вводили в/в монастрал синий (МВ) (81дта Со трапу, США) (1,0 мл/кг массы тела) за 3 мин до введения этанола. Крыс умерщвляли через 1 мин после применения этанола. За 1 ч перед обработкой этанолом вводили №1ВРС157 (10,0 мкг/кг, в/б) или физиологический раствор (5,0 мл/кг, в/б). Сразу же после забоя извлекали желудок, и незаинтересованные наблюдатели оценивали участки поражения. Характерные участки желудка и двенадцатиперстной кишки обрабатывали для последующего гистологического анализа.

Повреждение сосудов оценивали в раннем периоде (1 мин после обработки этанолом), используя метод с монастралем синим (МВ). Ареальную плотность окрашенной слизистой исследовали ТЭМ.

Результаты.

Сильное снижение окрашивания МВ было последовательно отмечено в группах, обработанных ИаВРС157. Близкое сходство использованных моделей с заболеваниями человека демонстрирует применение ИаВРС157 для лечения заболеваний, связанных с нарушениями эндотелия в медицине.

Пример 16. Ангиогенез.

Введение.

Ангиогенез имеет решающее значение для образования грануляционной ткани и заживления ран и/или язв. Используя хорошо известный метод, оценивали ангиогенные свойства.

Материалы и методы.

Каждой крысе в поясничной области подкожно имплантировали два стерильных тампона (1 см х 1 см х 0,25 см (V = 0,25 мл)) с одинаковыми количествами №ВРС 157 (раствор 50 мкг, 10 мкг, 10 нг/мл) или стандартных агентов, циметидина (10 мг, 100 мг, 500 мг/мл), ранитидина (2,5 мг, 25 мг, 250 мг/мл), фамотидина (10 мг, 50 мг, 100 мг/мл) и сукралфата (1 мг, 5 мг, 10 мг/мл). Тампоны удаляли через три и семь дней. Затем их фиксировали в формалине и обрабаты вали для гистологической и гистохимической оценки и морфометрии. Использованный микроскоп был: Бей/. ΌΙΑΡΕΑΝ; для морфометрического анализа применяли программу «8ОВМ» УАМ8. Загреб, СгоаНа.

Результаты.

Вновь образованную грануляционную ткань вокруг имплантированного тампона постоянно использовали в качестве ценного количественного определения реакции хозяина на инородное тело. Опыты на крысах, убитых через три дня после имплантации, показали следующее: в группах животных, обработанных NаВΡС157, было обнаружено значительно больше грануляционной ткани по сравнению с контрольными значениями. Аналогичные результаты были обнаружены у крыс, обработанных сукралфатом при всех использованных дозировках. В противоположность этому, не наблюдали различия между контрольными значениями и анализируемым агентом в группах, обработанных всеми тремя Н₂-блокаторами. Животные, убитые через семь дней после имплантации, при обработке сукралфатом во всех трех дозах и при обработке NаВΡС157 в самой высокой дозе (50 мкг) достоверно отличались по сравнению с контрольной группой. Контрольные значения значительно не различались по показателям между двумя сроками убоя.

Во вновь образовавшейся грануляционной ткани подсчитывали количество эндотелиальных пространств. По сравнению с контрольными значениями (число вновь образованных эндотелиальных пространств в контрольной группе через три дня после имплантации составило 7,94±1,23 и через семь дней после имплантации 14,8±3,12), все использованные вещества приводили к достоверному повышению показателей на оба интервала (третий и седьмой день).

В дополнении к доказательству того, что различные противоязвенные препараты обладают ангиогенными свойствами, NаВΡС157 также стимулировал образование грануляционной ткани, как это делает сукралфат. Следовательно, NаВΡС157 можно использовать для инициации и поддержания процессов заживления, в частности, заживления ран и/или язв.

Пример 17. Воспаление.

Введение.

Использующиеся в настоящее время противовоспалительные препараты обычно оценивают на многих пригодных моделях, близко представляющих острые и/или хронические воспалительные нарушения у людей. Однако оказалось, что тяжелые поражения желудочнокишечного тракта являются основным побочным эффектом этих агентов.

Для NаВΡС157 была отмечена активность против острого воспаления и болеутоляющая активность (например, при воздействии турпентином, каррагинином, уксусной кислотой или Мд§О₄ (зависимое от простагландинов, незави симое от простагландинов, опыты со сдавливанием хвоста) наряду с жаропонижающим эффектом (снижение вызванной дрожжами лихорадки (4000 мг/кг, п/к)). Следовательно, одновременно на крысах оценивали его лечебное действие на поражения желудочно-кишечного тракта, его действие на хроническое воспаление такое, как адъювантный артрит; его действие в качестве нестероидного противовоспалительного агента при поражениях желудочнокишечного тракта, возникших под действием НСПВС.

Материалы и методы.

В опытах с поражениями желудочнокишечного тракта (индометацин (30 мг/кг, п/к), аспирин (400 мг/кг, в/ж) и диклофенак (125 мг/кг, в/б)) ЫаВРС157 (10 мкг или 10 нг/кг, в/б) вводили соответственно или одновременно и/или за 1 ч до введения препарата (индометацин). В случае адъювантного артрита (на хвост наносили по 0,2 мл адъюванта Фрейнда) (14 дней, 30 дней, один год), ЫаВРС157 (10 мкг или 10 нг/кг, в/б) применяли в виде однократного введения (за 1 ч до или после нанесения адъюванта Фрейнда или один раз в день в течение периода 0-14-й день, 14-30-й день и 14-й день один год).

Результаты.

При совместном введении с тестируемым НСПВС №1ВРС157 последовательно уменьшал в противном случае выраженные участки поражения в желудке контрольных крыс, а также участки поражения в тонком кишечнике в группах животных, обработанных индометацином. В опытах с адъювантным артритом, развитие поражений было значительно снижено после однократного введения ЫаВРС157 и еще более ослаблялось у крыс при ежедневном применении №1ВРС157. При лечении уже возникшего адъювантного артрита целебный эффект №1ВРС157 последовательно появился только через две недели введения, и он четко был очевиден через один год применения. Эти данные показывают противовоспалительное и защитное действие ЫаВРС157 в отношении целостности слизистой.

Известно, что в развитии адъювантного артрита участвуют два различных механизма, воспаление и гиперчувствительность замедленного типа. ИаВРС157 положительно влияет на оба. По сравнению со стандартами (т.е. аспирин, индометацин) ИаВРС157 был эффективен в значительно более низких дозах (мкг или нг/кг против мг/кг). Эта первоначальная эффективность в предупреждении адъвантного артрита еще более усиливается при ежедневном введении. Более высокая дозировка (10 мкг/день) была эффективной как при однократном, так и ежедневном введении, в то время как более низкая дозировка (10 нг/кг), ранее неэффективная при однократном введении, становится эффективной при ежедневной схеме применения. Об наружение этого факта наряду с терапевтической эффективностью ИаВРС157 на фоне полностью возникшего артрита свидетельствует о его полезном применении в течение всего периода протекания адъювантного артрита. Отмеченную эффективность ИаВРС157 при адъювантном артрите (профилактический эффект, невозникший/возникший адъвантный артрит) не отмечали для использующихся в настоящее время терапевтических средств. Глюкокортикоиды являются эффективными в предупреждении адъвантного артрита при ежедневном введении, но не при кратковременном курсе лечения. Иммуносупрессоры (в высоких дозах) и нестероидные анальгетики являются эффективными соответственно до и после обработки.

Таким образом, основываясь на близком сходстве использованной модели и соответствующих расстройств у человека, является очевидным, что ИаВРС157 с его защитными для слизистой свойствами можно использовать для лечения заболеваний, связанных с острым воспалением и хроническим артритом. Кроме того, ИаВРС157 можно использовать для лечения заболеваний, связанных с нарушениями гиперчувствительности замедленного типа и поражений желудочно-кишечного тракта, возникших в различных частях желудочно-кишечного тракта, особенно индуцированных агентами, такими как ΝδΆΙΆκ.

Пример 18. Эффект удаления свободных радикалов.

Материалы и методы.

Гепатопротективное действие NаВРС157 в сравнении со стандартами, такими как бромкриптин, амантадин и соматостатин, оценивали на различных экспериментальных моделях повреждения печени на крысах: 24-часовое наложение лигатуры на желчный проток и печеночную артерию, 48-часовой подавляемый стресс и введение СС14 (агент, индуцирующий образование свободных радикалов). NаВРС157 вводили или внутрижелудочно, или внутрибрюшинно.

Результаты.

NаВРС157 в значительной мере предупреждал развитие некроза печени или жировых изменений у крыс, подвергнутых 24-часовому наложению лигатуры на желчный проток или печеночную артерию, 48-часовому подавлению стресса и обработке СС1₄ (1 мл/кг в/б, забой через 48 ч). Другие стандартные препараты имели либо небольшое, либо защитное действие на этих моделях вовсе отсутствовало. Лабораторные анализы на билирубин показали, что ЗСОТ и ЗСРТ полностью коррелировали с макро/микроскопическими данными. Таким образом, NаВРС157 можно использовать для лечения заболеваний печени. Кроме того, миелосупрессия, вызываемая облучением, является воспроизводимой моделью для изучения динамики восстановления гематопоэтических элементов.

ЫаВРС157 показывает положительное действие на повреждения костного мозга, индуцируемые облучением в сублетальных дозах.

Таким образом, ЫаБРС157 можно использовать для лечения повреждений костного мозга, индуцированных облучением. Принимая во внимание в целом признаваемую взаимосвязь СС1₄ с образованием свободных радикалов и развитием патологических состояний, оказалось, что положительные эффекты №1ВРС157 можно также использовать в отношении других поражений органов, индуцированных свободными радикалами, в частности, при облучении.

Пример 19. Катехоламинергическая система.

Введение.

Действующие опосредованно, симпатомиметические лекарственные препараты, такие как амфетамины, имеют общие свойства, такие как способность вызывать повышенное высвобождение катехоламинов и ингибирование повторного захвата катехоламинов (в основном дофамина) в нервных окончаниях в центральной нервной системе (ЦНС). Оказалось, что стереотипное поведение является результатом активации дофаминергической системы в полосатом теле. В основном полагается, что усиленное «лазанье» под действием амфетамина является результатом возбуждения полосковых дофаминовых рецепторов после введения антагониста дофамина галоперидола. Это затем вызывает развитие суперчувствительности к амфетамину. Применение ЫаВРС157 не влияет на общее поведение и не индуцирует появление стереотипов.

Материалы и методы.

Изучали влияние ЫаВРС157 на стереотипы, вызываемые агонистом дофамина амфетамином (10 мг/кг, в/б) и на возбудимость. ИаВРС157 вводили в виде профилактической совместной обработки или по терапевтической целительной схеме (10 мкг или 10 нг/кг, в/б). У крыс было индуцировано стереотипное поведение и возбудимость.

Результаты.

Постоянно отмечали заметное ослабление и обратное развитие (лечение в максимуме нарушений, индуцированных амфетамином) как стереотипного поведения, так и повышенной возбудимости (т.е. более сильные и яростные судороги, паническое прыгание и беготня).

Затем внимание было сосредоточено на влияние ЫаВРС157 на «лазанье» у мышей. Мышей предварительно обработали антагонистом дофамина галоперидолом (5,0 мг/кг, в/б) и затем обработали амфетамином (20 мг/кг в/б на 1, 2, 4 и 10 день после предварительной обработки галоперидолом), который обычно используется для изучения поведенческой суперчувствительности в ответ на стимулирующее действие амфетамина. Таким образом, если появился бы антагонизм стереотипов под действием амфета мина, как результат антагонистической в отношении дофамина активности (прямой или опосредованной) тестируемого ИаВРС157, то можно было ожидать усиления увеличивающего действия галоперидола на «лазанье» под влиянием амфетамина. В противоположность этому, при совместном введении ИаВРС157 с галоперидолом была отмечена почти полная нейтрализация действия. При совместном рассмотрении, эти данные предоставляют доказательство наличия взаимодействия ИаВРС157 с дофаминовой системой. Кроме того, взаимодействие ИаВРС157 с центральной дофаминовой системой (например, защита от стрессовых язв) было показано на других экспериментальных моделях. Для многих известных пептидов (нейротензин, ССК и т.д.) уже было отмечено взаимодействие с дофаминовой системой. Кроме того, использование ИаВРС157 также дает обратное развитие поведенческим нарушениям, индуцированным ЬБЭ (например, 0,3 мг/кг, в/б). ИаВРС157 имеет модулирующий эффект на дофаминовую систему. В условиях повышенного высвобождения синтеза и дофамина, индуцированных амфетамином, ИаВРС157 может как предотвращать, так и направлять в обратную сторону развитие последующих нарушений (т.е. стереотипное поведение). Подобным образом, №1ВРС157 может заметно ослаблять последствия блокирования дофаминовых рецепторов галоперидолом. На основании этого можно предположить, что модулирующее действие №1ВРС157 вовлекает также замещение в противном случае заметной неполной дофаминовой системы. Это позволяет избежать последующей суперчувствительности дофаминовых рецепторов и нарушений, возникающих под действием амфетамина нарушений.

Таким образом, ЫаВРС157 является полезным агентом для лечения шизофрении, индуцированных амфетамином эффектов (шизофреническая форма психоза) и злоупотребления наркотиками.

Пример 20. Стресс.

Введение.

Стресс определяется, как неспецифическое явление, приводящее к нарушениям в различных органах. Ответная стрессовая реакция определяется, как ответная реакция, направленная против различных вредных явлений. Одной из наиболее часто применяемых моделей стресса на животных является модель подавляемого стресса, приводящего к тяжелым стрессовым поражениям желудка у крыс. Могут поражаться также другие органы.

Материалы, методы и результаты.

Введенный в дозе 10 мкг или 10 нг/кг массы тела, в/б или в/ж за час до индукции стресса, №1ВРС157 в сильной степени предотвращал в противном случае неизбежное развитие тяжелых поражений желудка. Если время между применением снижающих стресс агентов и ин дукцией стресса (в последующем тексте обозначается как «период») удлиняется, стандартные противоязвенные агенты становятся практически неэффективными, в сильной степени контрастируя с отчетливой эффективностью тестированного ИаВРС157. ИаВРС157 сохранял свою целебную активность даже после очень длительного периода в 48 ч. Защитное действие, проявляемое ИаВРС157, включает ослабление развития поражений в противном случае постоянно появляющихся в других органах (например, печени, надпочечниках, почках, семенниках, сердце, поджелудочной железе, селезенке). Таким образом, поскольку другие обычно известные стрессовые параметры, очевидно, в меньшей степени подвергаются нарушению (т.е. тимуслимфатическая инволюция и гипертрофия коркового слоя надпочечников), является очевидным, что №ВРС157 можно использовать при различных стрессовых заболеваниях. №1ВРС157 имеет положительное целебное воздействие на различные участки поражения в других органах, постоянно связанных со неспецифической стрессовой патологией. Принимая во внимание такую же цепь событий у людей, как и на использованных моделях, этому придается еще большее значение, поскольку №1ВРС157 имеет целебное действие даже, если используется, когда стрессовая патология уже развивалась (например, через 24 ч после индукции стресса).

Пример 21. Демонстрация цитопротективного действия.

Введение.

Цитопротективное действие первоначально определялось, как свойство защищать клетки от различных вредных агентов, действие, показанное в слизистой оболочке желудка, как независимый от желудочной кислоты эффект. Позднее, это определение было расширено с включением в значительной мере сходных защитных эффектов вне желудочно-кишечного тракта, включая патологические состояния различных органов (цитопротективное действие/органопротективное действие). Изучали возможные цитопротективные эффекты при использовании №1ВРС157. основываясь на его действии на первоначальной модели Робертса для скрининга цитопротективных агентов при поражениях желудка, индуцированных этанолом.

Материал, методы и результаты.

ИаВРС157 (10 мкг или 10 нг/кг, в/б) имел профилактический эффект (примененной или за 1 ч до или одновременно с 96% этанолом (1 мл/крысу, в/ж)) и целебное действие (примененный через 1 ч после этанола в максимуме развития поражения).

В целях создания свободной от кислоты окружающей среды для изучения цитопротективного действия за 24 ч до вызывающей язву процедуры была проведена гастрэктомия. В отсутствии желудка и желудочной кислоты, затем оценивали повреждающее действие цистеамина (400 мг/кг п/к, забой через 24 ч после введения), который, как полагают, является препаратом, вызывающим язвы двенадцатиперстной кишки, действие которого связано с кислотой, и цитопротективное действие ИаВРС157 (10 мкг или 10 нг/кг, в/б) в сравнении со стандартными веществами (циметидин (50), ранитидин (10), омепразол (10), бромкриптин (10) и атропин (10) (значения даны в мг/кг, в/б, за 1 ч перед введением цистеамина)), известными, как так же обладающие цитопротективным эффектом. У простых крыс с интактным желудком все примененные вещества оказывали сильное положительное действие. У животных с удаленным желудком применение изучаемых препаратов (т.е. №1ВРС157 или стандартных агентов перед введением цистеамина) в значительной мере предупреждало развитие в противном случае тяжелых поражений двенадцатиперстной кишки, отмеченных у контрольных крыс с удаленным желудком и обработанных цистеамином. В группах животных, не обработанных цистеамином, не было отмечено поражений (лапаротомия и гастроэктомия только через 24 или 48 ч после операции), не наблюдали усиления патологического состояния у обработанных цистеамином, подвергнутых лапаротомии мышей. Обнаружение этих фактов (одинаковый повреждающий эффект цистеамина, одинаковое защитное действие ИаВРС157 и стандартов у крыс с удаленным интактным желудком и без желудка, повреждающий или защитный эффект не связан с секрецией желудочной кислоты) указывает на протективное действие. Можно отчетливо предположить о наличии аналогии (поражения не связаны с желудочной кислотой) между травмированным желудком (например, этанолом) и двенадцатиперстной кишки под действием цистеамина. Очевидна высокая «цитопротективная способность», вероятно, независимая от кислоты, общая для всех тестируемых соединений, но более выраженная для ИаВРС157.

Вследствие того, что ИаВРС157 был эффективен в значительно меньших дозах, чем другие соединения (т.е. мкг или нг/кг против мг/кг), его эффективность (и терапевтическое применение) можно распространить на поражения других органов. Это является следствием того факта, что эффективность других соединений в других органах также является результатом их «цитопротективного действия» (например, соматостатин: патологические состояния надпочечников, поджелудочной железы, печени, легких и желудочно-кишечного тракта).

Пример 22. Демонстрация органопротективного действия.

Введение.

В целях полезного расширения «цитопротективного» действия в «органопротективное» действие в основном принято исследование за щитного действия на эндотелий. Широко признается в качестве отчетливого указания использовать тесты со слизистой оболочкой желудка крыс после повреждающего действия этанола, при окрашивании монастралем синим вследствие способности монастрала синего связываться с поврежденным эндотелием.

Материалы и методы.

Всем крысам вводили монастрал синий (МВ) (81дта Со трапу, США) (1,0 мл/кг массы тела, в/в) за 3 мин до этанола, и животных умерщвляли через 1 мин после обработки этанолом. За 1 ч до этанола вводили ЫаВРС157 (10,0 мкг/кг, в/б) или физиологический раствор (5,0 мл/кг, в/б). Сразу же после забоя извлекали желудок, и незаинтересованные наблюдатели оценивали участки поражения желудка, как описано ранее. Характерные участки желудка и двенадцатиперстной кишки обрабатывали для дальнейшего гистологического анализа. Повреждение сосудов оценивали в раннем периоде (через 1 мин после обработки этанолом), используя метод с моностралем синим. Ареальную плотность окрашенной слизистой оценивали ТЭМ.

Результаты.

В группах крыс, обработанных ЫаВРС157, последовательно отмечали сильное снижение МВ-окрашивания. Кроме того, при использовании ЫаВРС157 не было отмечено негативных эффектов. Не наблюдали влияния на различные основные параметры и токсичности, за исключением высоких доз (например, г/кг массы тела, в/б).

Принимая во внимание широкое распространение эндотелиальной сосудистой ткани в организме и решающую роль защиты эндотелия для органопротективного действия, ЫаВРС157 можно использовать в качестве органопротективного агента при поражениях различных органов.

Пример 23. Острый панкреатит.

Материалы и методы.

ЫаВРС157 тестировали на крысах в качестве защитного или лечебного агента при остром панкреатите (индуцированном наложением лигатуры на желчный проток). Одновременно изучали влияние ЫаВРС157 на сопутствующие развившиеся поражения желудка и двенадцатиперстной кишки.

ЫаВРС157 (10 мкг или 10 нг/кг массы тела, в/б, в/ж) вводили в профилактических целях за 1 ч до наложения лигатуры, в то время для лечения препарат применяли ежедневно, начиная через 1 день после наложения лигатуры (последнее введение за 24 ч до забоя). Действие оценивали через суточные интервалы вплоть до конца пятых суток после наложения лигатуры.

Результаты.

При введении перед обработкой было получено сильное защитное действие в отношении поджелудочной железы. Очевидный целебный эффект последовательно отмечался при введении препарата на фоне уже возникшего тяжелого острого панкреатита. Оценивая появление некроза, отека, нейтрофилов и одноядерных клеток, у крыс, обработанных ЫаВРС157, последовательно отмечали меньшее развитие некроза, отека и меньшее число нейрофилов, но было большее количество одноядерных клеток. При определении уровня сывороточной амилазы по сравнению с контрольными значениями было отмечено значительно меньшее повышение (ЫаВРС157 ввели перед обработкой), а также снижение уже повышенных уровней (ЫаВРС157 вводили в лечебных целях). Наряду с этим положительным воздействием на панкреатит, было отмечено положительное влияние ЫаВРС157 на участки поражения желудка и двенадцатиперстной кишки у крыс с перевязанным желчным протоком, как при введении до обработки, так и после обработки. При совместном рассмотрении данных: ЫаВРС157 можно использовать для лечения острого панкреатита с дополнительным положительным воздействием на сопутствующую патологию желудка и двенадцатиперстной кишки.

Пример 24. Влияние на кардиотоксичность.

Материалы и методы.

Опыты проводили на крысах Албино Вистар и морских свинках Хартли. Кардиотоксичность индуцировали назначением раствора хлорида бария (10 мг/кг массы тела), десипрамина (10 мг/кг), дигиталиса (общая доза 6,5 мг/кг) и изопреналина (15 мг/кг) через канюлю в яремной вене. Кроме того, вводили доксорубицин многократно (3 мг/кг, п/к, один раз в неделю в течение 13 недель) и однократно (7 мг/кг, в/в) и провоцировали кардиомиопатию. Кардиотоксичность также индуцировали иммобилизационным стрессом, как повреждение миокарда нефармакологического характера. ЫаВРС157 вводили, как указано ниже.

1. Хлорид бария

a) перед обработкой (за 1 ч до) : ЫаВРС157 50 мкг/кг, 10 мкг/кг и 10 нг/кг, внутрибрюшинно;

b) после обработки (через 60 с): ЫаВРС157 10 мкг/кг и 10 нг/кг, внутривенно.

2. Десипрамин: ЫаВРС157 50 мкг/кг и 50 нг/кг, внутрибрюшинно за 1 ч до обработки.

3. Дигиталис: ЫаВРС157 50 мкг/кг и 50 нг/кг, внутривенно с 15-минутными интервалами.

4. Изопрепалин: ЫаВРС157 50 мкг/кг и 50 нг/кг, внутривенно за 15 мин до обработки.

5. Иммобилизационный стресс: ЫаВРС157 10 мкг/кг и 10 нг/кг, внутрибрюшинно за 1 ч до и сразу же после фиксации и при 24- и 48часовой иммобилизации.

6. а) Хроническая токсичность под действием доксорубицина: ЫаВРС157 10 мкг/кг и 10 нг/кг, внутрибрюшинно одновременно с доксорубицином;

Ь) острая токсичность под действием доксорубицина: ЫаВРС157 10 мкг/кг и 10 нг/кг, внутрибрюшинно за 1 ч до введения доксорубицина.

На моделях с аритмией, у анестезированных животных постоянно записывали электрокардиограмму. Каждые 15 с или при нарушении ритма проводили протянутые записи при 50 мм/с или 100 мм/с. На других моделях электрокардиограммы записывали один раз или повторно у животных при непродолжительной анестезии со скоростью бумаги 50 мм/с при протянутых записях. Токсичность под воздействием доксорубицина оценивали при макроскопическом и микроскопическом обследовании сердца и других органов биохимическими анализами. Аналогичную процедуру проводили в опытах с иммобилизационным стрессом.

Результаты.

Было отмечено антиаритмическое действие №1ВРС157 на модели с индуцированной хлоридом бария аритмией. При предварительном введении перед обработкой №1ВРС157 снижал и предупреждал появление аритмии и уменьшал и/или предотвращал развитие ишемии. В опытах с введением после обработки №1ВРС157 вызывал быстрое превращение в синусовый ритм и предотвращал повторное появление аритмии.

№1ВРС157 полностью предотвращал внезапное уменьшение числа ударов сердца в минуту и нарушения проводимости, индуцированные десипрамином (удлинение РО и расширение РР8). ЫаВРС157 также предотвращал развитие вентрикулярной тахикардии, связанной с проаритмическим действием десипрамина, и тяжелый атриовентрикулярный блок. Действие зависело от дозы.

Кроме того, ЫаВРС157 обладает селективным действием на индуцированную дигиталисом кардиотоксичность. ЫаВРС157 проявлял положительные эффекты на внезапное снижение числа ударов сердца в минуту и нарушения ритма (вентрикулярную экстрасистолу, вентрикулярную тахикардию и атриовентрикулярный блок) в виде их предупреждения или ослабления. Действие ЫаВРС157 в нг-дозах на замедление проводимости, индуцированной токсической дозой дигисталиса, было незначительным. Эффект был более выраженным с мкг-дозами ЫаВРС157.

ЫаВРС157 отчетливо предотвращал ишемию и инфаркт миокарда. Действие было более выраженным с мкг-дозами. Однократное внутрибрюшинное введение ЫаВРС157 перед обработкой привело к предупреждению ишемии, что было показано на электрокардиограммах, и повреждений миокарда, детектируемых гистологически в опытах с иммобилизационным стрессом. Введение ЫаВРС157 после обработки уже при наличии регистрируемых электрокардиографических изменений также привело к ослаблению ишемии. Мкг-дозы ЫаВРС157 вызывали увеличение напряжения комплекса ОР8. особенно при предварительном введении.

Введение ЫаВРС157 приводит к значительно более меньшим патоморфологическим изменениям, наблюдаемым при кардиомиопатии, индуцированной антрациклином (тяжелое повреждение миоцитов и стенок сосудов и вакулизация) после однократного и в большей степени после многократного назначения доксорубицина. Активность БОН значительно снижается, несмотря на заметно повышенные абсолютные значения.

Суммируя, №1ВРС157 показал себя пригодным для использования в качестве антиаритмического, антиангинального и кардиопротективного агента.

Пример 25. Антидепрессантная активность.

Материалы и методы.

Различные антидепрессанты обладают противоязвенной активностью, и модели, используемые в настоящее время при исследовании язв и депрессии, в значительной степени сходны. Следовательно, исследовали возможность того, что первоначально противоязвенный агент с цито-/органопротективной активностью, такой как ЫаВРС157, будет эффективно воздействовать на депрессивные расстройства, в двух тестах по депрессии на крысах: тест с принудительным плаванием (процедура Порсолта) и метод хронического непредсказуемого стресса (через 5 дней после проведения процедуры непредсказуемого стресса, введение препарата один раз в день во время стрессовой процедуры и оценка неподвижности в открытом тесте на четвертый и шестой дни лечения).

Результаты.

В опыте с принудительным плаванием отмечали снижение времени неподвижности крыс, обработанных ЫаВРС157 (10 мкг/кг, 10 нг, 10 пг/кг, в/б), по сравнению с активностью у животных, обработанных обычными антидепрессантами, имипрамином или ниаламидом, соответственно в дозах 15 мг или 40 мг (в/б). Дополнительное ужесточение условий опыта в процедурах хронического непредсказуемого стресса привело к потере активности имипрамина (30 мл), в то время как введение ЫаВРС157 (10 мкг/кг, 10 нг) приводило к улучшению мобильности крыс с хроническим стрессом в зависимости от дозы.

Пример 26. Модели болезни Паркинсона.

Материалы и методы.

Вводили паркинсонгенные агенты, 1метил-4 -фенил- 1,2,3,6-тетрагидролиридин (МРТР) (известен как препарат разрушающий дофаминовую систему черных полосок путем образования свободных радикалов) (30 мг/кг массы тела, в/б, один раз в день в течение 6 дней и через 4 дня однократно в дозе 50,0 мг/Κί массы тела, в/б) или резерпин (вызывает выделение катехоламиновых пузырьков) (5,0 мг/кг массы тела, в/б). ЫаБРС157 (1,50 мкг/кг или 15,0 нг/кг массы тела, в/б) применяли за 15 мин до или альтернативно через 15 мин после каждого назначения МРТР. В опытах с резерпином ЫаБРС157 (10,0 мкг/кг или 10,0 нг/кг массы тела, в/б) вводили за 15 мин до резерпина или через 24 ч на фоне уже возникшей полной каталепсии.

Результаты.

ЫаБРС157 в значительной степени улучшал нарушенную МРТР соматосенсорную ориентацию и уменьшал индуцированную МРТР гиперактивность. Кроме того, ЫаБРС157 уменьшал МРТР-моторные аномалии (тремор, акинезия, каталепсия, в противном случае очень выраженные в регуляции соли), приводя к почти полному устранению обычно летального курса введения МРТР для контрольных животных. В опытах с резерпином ЫаБРС157 в значительной степени предотвращал развитие в противном случае очень выраженной каталепсии. При введении через 24 ч после обработки №1ВРС157 давал обратный ход уже возникшей каталепсии. В поддержку этого, последовательно наблюдали уменьшение индуцированной резерпином гипотермии (№1ВРС157 вводили до обработки) и обратное развитие последующего выраженного падения температуры (№1ВРС157 вводили после обработки).

Обе вышеуказанные обычно используемые модели на животных известны, как показывающие нарушения у людей и их лечение. Вследствие того факта, что была продемонстрирована высокая эффективность при введении до и после обработки в мкг- и нг-дозах, оказалось, что №1ВРС157 хорошо пригоден для использования в лечении болезни Паркинсона и патологий, подобных болезни Паркинсона.

Кроме того, наблюдаемый эффект при гипотермии, индуцированной резерпином, позволяет прийти к выводу, что МаБРС157 хорошо пригоден для лечения температурных нарушений.

Пример 27. Влияние на заживление костных дефектов.

Материал и методы.

На 42 кроликах в течение 6 недель после операции изучали остеогенное действие костного мозга и Трис-ВРС157 на заживление сегментальных костных дефектов. После индукции травмы (в центре обеих лучевых костей сделали 0,8-сантиметровый остеопериоститный дефект), опыты с использованием костного мозга и ТрисВРС157 (6 кроликов в группе) выполняли следующим образом: обработанных физиологическим раствором (2 мл внутримышечно и 2 мл местно в каждый из костных дефектов), травмированных животных использовали в качестве контроля (группа 1). У животных во второй и третьей группе каждый из костных дефектов местно обработали либо 2 мл аутологичного костного мозга (7-й день после операции) или Трис-ВРС157 (10 мкг/кг массы тела 7-й и 14-й дни после операции). Животным четвертой, пятой и шестой групп Трис-ВРС157 вводили внутримышечно (в/м) или на 7-й, 9-й, 14-й и 16-й дни после операции (10 мкг/кг массы тела), или один раз в день в период между 7-21 днями после операции (10 мкг или 10 нг/кг массы тела). В качестве стандартной обработки сразу же после образования костные дефекты у животных седьмой группы были заполнены аутологичным костным трансплантатом.

Всех животных умерщвляли на 6 неделе после операции. Заживление сегментальных дефектов оценивали дважды в неделю рентгенологически и гистологически.

Результаты.

Параллельное сравнение рентгенограмм, сделанных на четыре временных интервала (поверхностная костная мозоль, микрофотоденситометрия костного дефекта), и данных количественной гистоморфометрии выявило, что костным мозг, введенный местно в костный дефект, и Трис-ВРС157, введенный внутримышечно (особенно в суточной дозе 10 мкг/кг массы тела в течение 14 дней), достоверно улучшали заживление кости (р <0,001). Действие соответствовало действию аутологичного костного трансплантата.

Принимая во внимание клиническое значение этого опыта, костный мозг и ТрисВРС157 (особенно в ежедневной дозе 10 мкг/кг массы тела в течение 14 суток) приводят к заживлению костных дефектов. Ввиду их простого введения и низкого риска осложнений, аутологичный костный мозг, примененный местно, и в особенности введенные внутримышечно остеогенные вещества, такие как Трис-ВРС157, имеют преимущества перед другими более сложными хирургическими способами (т.е. костные имплантаты, костные имплантаты с сосудами, метод Илизарова) для лечения заживления травм у людей.

Пример 28. Влияние на заживление ран. Материалы и методы.

№1ВРС157 использовали для того, чтобы установить его влияние на различные элементы, связанные с процессом заживления. Полагают, что элементами, имеющими значение для процесса заживления, являются образование грануляционной ткани, ангиогенез и продукция коллагена. Влияние №1ВРС 15751 на образование грануляционной ткани, продукцию коллагена и ангиогенез, а также развитие силы натяжения тестировали, используя три экспериментальные модели на крысах: 1) кожные раны в виде насечек; 2) анастомозы толстая кишка - толстая кишка и 3) анастомозы пищевод - двенадцатиперстная кишка. Образцы гистологически оце нивали на коллаген и кровеносные сосуды, используя оценочную систему в баллах и морфометрию.

Результаты.

Во всех опытах были установлены достоверные различия между крысами, обработанными ΝαΒΡΟ57, и контрольными животными. Опыты показали сильное стимулирующее влияние ΝαΒΡΟ57 на процесс заживления. Эти эффекты достигались при различных путях введения, включая внутрижелудочное и местное применение. Кроме того, оценка силы натяжения выявила повышенные значения для обработанных Ν;·ιΒΡΟΊ57 крыс.

Основываясь на близком сходстве между моделями на животных и соответствующими нарушениями у людей и высокую степень близости между процессами заживления у крыс и людей, Ν;·ιΒΡΟ157 можно использовать для лечения заживления ран у людей.

Пример 29. Влияние на нарушения дыхания.

Материалы и методы.

В настоящих исследованиях использовали морских свинок (Хартли, обоего пола, с массой тела 500-700 г) с плетизмографией всего тела, уретановой анестезией (1,5 г/кг, в/б), искусственной вентиляцией при постоянном давлении (0,98 кРа) и релаксацией скелетной мускулатуры под действием суксаметония (0,2 мг/кг массы тела, в/в). Оценивали объем наполнения (мм, среднее значение ± стандартное отклонение) до и после применения спазмогенов (гистамин, серотонин, ацетилхолин, брадикинин, в/в) или Ν;·ιΒΡΟΊ57 (за 10 мин до повторного введения спазмогена, в/в).

Результаты.

Индуцируемое под действием серотонина, гистамина, ацетилхолина и брадикинина снижение объема наполнения ингибировалось Ν;·ιΒΡΟΊ57 (10 мкг/кг массы тела, в/в и/или 10 нг/кг массы тела, в/в).

Основываясь на наблюдаемом целительном действии Ν;·ιΒΡΟ157 на сужение бронхов, индуцируемое различными спазмогенами, и известной близости между использованной моделью и заболеваниями человека, является очевидным успешное использование Ν;·ιΒΡΟ157 для лечения различных нарушений, связанных с сужением бронхов и/или нарушениями дыхательных путей.

Пример 30. Воздействие на синдром легочной гипертонии.

Материалы и методы.

Настоящие опыты описывают эффекты агонистов и антагонистов окиси азота (ΝΟ) и влияние Ν;·ιΒΡΟ157 на развитие синдрома легочной гипертонии (ΡΗ8) и тканевые поражения у цыплят. Проводили опыты по установлению острой токсичности. Они включали однократное введение физиологического раствора (1 мл, в/б), Ν;·ιΒΡΟΊ57 (10 мкг/кг массы тела), Ь-ΝΆΜΕ (ан тагонист ΝΟ/дозы 50, 100, 150 мг/кг массы тела) и Ь-аргинин (агонист ΝΟ/Ι 00 мг/кг массы тела) с их комбинациями (Ь-ΝΆΜΕ + ΝαΒΡΟ57, ЬΝΑΜΕ + Ь-аргинин). Проводили патологические исследования селезенки, сердца, печени и легких и гематологические анализы. Кроме того, поставили опыты по хронической токсичности. Животных обрабатывали ежедневно в течение пяти недель Ь-ΝΑΜΕ (10 мг/кг массы тела), Ь-аргинином (100 мг/кг массы тела), Ν;·ιΒΡΟΊ57 (10 мкг/кг массы тела) и их комбинациями (ЬΝΑΜΕ + ΝαΒΡΟ57, Ь-ΝΑΜΕ + Ь-аргинин) внутрибрюшинно. По семь животных из каждой группы, включая контрольных (физиологический раствор 1 мл, в/б) умерщвляли каждую неделю.

Результаты.

Применение Ь-ΝΑΜΕ вызвало ΡΗ8 у обработанных цыплят. Это действие предотвращалось при одновременном введении Ьаргинина и Ν;·ιΒΡΟ157. При патогистологическом исследовании острой и хронической токсичности было выявлено, что Ь-ΝΑΜΕ вызвал сильные тканевые повреждения (некроз клеток миокарда и печени и некроз лимфоидных клеток в селезенке), в то время как Ь-аргинин в основном вызывал гиперемию, отек и кровоизлияния во всех органах. Гематологические анализы показали достоверное снижение уровня гемоглобина и числа лейкоцитов в группах цыплят, обработанных Ь-ΝΑΜΕ. Воздействие Ь-ΝΑΜΕ успешно ингибировалось применением Ьаргинина и Ν;·ιΒΡΟΊ57. Ν;·ιΒΡΟΊ57 не вызывал никакого повреждения ткани или органа.

Принимая во внимание сходство между вышеуказанными моделями на животных и соответствующими нарушениями у людей, Ν;·ιΒΡΟ157 можно применять для лечения синдрома легочной гипертонии. Кроме того, является очевидным его полезное применение в коммерческом разведении.

Пример 31. Экспериментальная гипертензия.

Материалы, методы и результаты.

У животных с гипертензией (гипертензия Голдблатта) с двумя почками (2К1С) и с одной почкой (1К1С) Ν;·ιΒΡΟΊ57 быстро снижали кровяное давление (например, через 5 или 10 мин после инъекции). Это действие продолжалось 20 мин у крыс 1К1С или, по меньшей мере, 12 ч у животных 2К1С. Действие неоднократно достигалось после второго или третьего введения через 24-48 ч. Подобным образом у крыс, которые в течение длительного периода времени находились на рационе с высоким уровнем фруктозы (80%) или высоким содержанием соли (15%), Ν;·ιΒΡΟ157 заметно снижали в противном случае последовательно повышенные значения кровяного давления до нормальных показателей. Лечебный эффект продолжался долго, и толерантность не развивалась даже после шестимесячного периода. Не было отмечено влияния

NаΒРС157 на основные показатели кровяного давления.

В дополнение к снижению в противном случае повышенных значений кровяного давления NаΒРС157 также вызывал заметное ослабление или даже устранение поражений и нарушений, обычно появляющихся в различных органах, которыми были (через три недели после скармливания рациона с высоким содержанием соли в контроле): очень сильная гиалиновая дегенерация с выраженными паренхиматозными кровоизлияниями, дегенерация стенок артерий, вакуолизация клеток сердца, сильная гиперемия (особенно в мозговом слое) надпочечников, сильная гиперемия, паренхиматозные кровоизлияния с гематурией в почках и гемосидероз и эритроцитофагия в селезенке. Сосуды были менее поражены у крыс, обработанных NаΒРС157, в дополнении к меньшей вакуолизации стенок и отсутствию кровотечения. Кроме того, у крыс при обработке NаΒРС157 последовательно наблюдалось отчетливое защитное действие в отношении повреждения глазного дна.

Используя различные модели гипертонии на животных, при введении NаΒРС157 в дозах 10 мкг или 10 нг/кг массы тела в/в, в/б или в/ж, достигались последовательные результаты при различных схемах применения. Принимая во внимание явное сходство этих моделей и соответствующих заболеваний у человека, NаΒРС157 можно использовать для лечения гипертензии и повреждений различных органов, вызванных гипертензией.

Пример 32. Влияние на время кровотечения.

Материалы и методы.

Изучали влияние 2-АМР-ВРС157 на время кровотечения у мышей и крыс (с и без предварительной обработки гепарином) в сочетании с оценкой активности в условиях ίη уОго на параметры свертывания человеческой крови.

Результаты.

При основных условиях (2-АМР-ВРС157, 10 мкг, 10 нг, 10 пг, 1 пг, 10 нг/кг массы тела, в/б одновременно с обрезанием хвоста) у мышей и крыс было последовательно показано значительное снижение времени кровотечения, которое зависело от дозы. В опытах с предварительной обработкой гепарином (1000 МЕ/кг в/б) (за 2 ч до начала кровотечения) у животных, обработанных 2-АРМ-ВРС157 в дозе 10 мкг или 10 нг/кг массы тела, постоянно отмечали значительное снижение в противном случае в сильной степени повышенного времени кровотечения. В условиях ίη уОго не было показано влияния (2-АРМ-ВРС157 в концентрации 10 мкг/кг, время инкубации 1 ч) на параметры свертывания человеческой крови. Таким образом, предполагается воздействие на эндотелиальный слой.

Принимая во внимание сходство в механизме кровотечения у людей и животных и ши роко признаваемое значение моделей, использованных для скрининга агентов, 2-АРМ-ВРС157 можно применять для лечения нарушенной коагуляции (например, гепаринизации).

Пример 33. Влияние на экспериментальный диабет.

Материалы, методы и результаты.

При внутрибрюшинном введении (т.е. 10 мкг/кг массы тела) было показано, что NаΒРС157 предотвращает развитие диабета у крыс, индуцированного аллоксаном, а также стрептозотоцином. В течение 14 дней была установлена пониженная гликозурия и меньшее поражение островков. В предварительных опытах авторов NаΒРС157 был также эффективным при введении на фоне уже имеющихся 14дневных поражений под действием аллоксана. В последующих опытах антидиабетические эффекты NаΒРС157 затем изучались при особой концентрации внимания на его возможной активности при внутрижелудочном введении. Применение NаΒРС157 (доза 10 мкг и 10 нг/кг живой массы) скомбинировали с введением аллоксана в дозе 300 мг/кг, п/к или 200 мг/кг массы тела, п/к перед (за 24 ч или за 1 ч до введения аллоксана), совместно и после (через 48 ч после введения аллоксана) обработки. В основном NаΒРС157 снижал повышенные уровни глюкозы в сыворотке крови и значительно повышал выживаемость обработанных аллоксаном животных (действие было особенно очевидным в группах крыс, обработанных более высокими дозами аллоксана). Интересно, что в дополнение к повышенным уровням глюкозы в сыворотке крови животных, которым вводили аллоксан, отмечалось повышенное появление участков поражения желудка у контрольных диабетических крыс. NаΒРС157 при каждой схеме введения достоверно уменьшалась тяжесть язв независимо от условий обработки. Важно, что такие же результаты получали на мышах.

Принимая во внимание сходство между патологией у человека и использованными моделями и в свете их широкого использования для скрининга активности соединений, NаΒРС157 можно применять для лечения сахарного диабета.

Пример 34. Антиноцицептивные эффекты.

Материалы и методы.

Антиноцицептивные эффекты NаΒРС157 оценивали в сравнении со стандартными соединениями аспирином или морфином на различных экспериментальных моделях опосредованного/прямого восприятия боли и нейротоксичности: болевые судороги (уксусная кислота/сульфат магния), сдавливание хвоста, горячая пластина и введение капсаицина.

Результаты.

NаΒРС157 (введенный или в дозах нг, или мкг/кг, в/б) достоверно понижал реакции при болевых судорогах (воспалительных и невоспалительных, зависимых от простагландинов и независимых) и в тестах со сдавливанием хвоста. В тестах с горячей пластиной №аВРС157, в отличие от морфина, не оказывал действия на нормальных животных. Кроме того, №аВРС157 назначали в виде предварительной обработки и один раз в день в течение 14 дней после инъекции капсаицина. В опытах №аВРС157 в сильной степени понижал индуцированную капсаицином аллодинию. Это снижение эффекта капсаицина невозможно было получить при введении №аВРС157 на фоне уже возникшей под действием капсаицина дегенерации соматосенсорных нейронов (введение только на 14-й день после капсаицина). Таким образом, поскольку в противном случае неизбежное истощение соматонейронов после введения капсаицина, можно полностью устранить при ежедневном введении №аВРС157, возможно, что действие №аВРС157 можно специфически отнести к целостности чувствительных соматосенсорных нейронов, подвергшихся воздействию капсаицина, и их защите (т.е. основных афферентных нейронов, имеющих маленький диаметр тела и непокрытые миелиновой оболочкой (С-) или покрытые тонкой миелиновой оболочкой (А-8) волокна).

Принимая во внимание, что капсаицин индуцирует в основном одинаковые нарушения у людей и животных, №аВРС157 можно использовать для лечения различных болевых расстройств, а также заболеваний, возникших в результате ослабления функций соматосенсорных нейронов.

Пример 35. Влияние на судороги. Материалы и методы.

Изучали действие КВРС157 на судороги, индуцированные бикуккулином, пикротоксином, стрихнином и изониазидом. КВРС157 (100 мкг, 10 мкг или 10 нг/кг живой массы) вводили (в/б) одновременно или за 15 мин до применения агентов, вызывающих судороги (мг/кг массы тела, в/б), пикротоксина (3), стрихнина (6, 3 или 1,5), букуккулина (2,5) и изониазида (800 мг).

Результаты.

КВРС157 привел к последовательно положительному (зависимому от дозы и времени) противосудорожному эффекту на фоне всех использованных агентов, вызывающих судороги. Принимая во внимание сходство использованных моделей и заболеваний человека, КВРС157 можно использовать для лечения судорог.

Пример 36. Травма спинного мозга. Материалы и методы.

Травму спинного мозга индуцировали на крысах-самцах Албино Вистар при регулируемом давлении (зажим для сосудов Ае§и1ар 0,100,15 Ν) на обнаженном спинном мозге на уровне Т1112) в течение 30 с. Животных обрабатывали №аВРС157 (10 мкг, 10 нг/кг массы тела, в/б) или физиологическим раствором сразу же после травмы и один раз в день до 10-го дня после травмы. Животных умерщвляли через 24 ч после последнего введения.

Результаты.

Тщательное обследование было проведено клинически (оценивали ежедневно в баллах 1-5) и микроскопически. Оно выявило у крыс, обработанных №аВРС157, значительное ослабление в противном случае устойчивого паралича (у контрольных крыс). Принимая во внимание сходство использованных моделей с заболеваниями человека, №аВРС157 можно использовать для лечения травмы спинного мозга.

Пример 37. Хроническая алкогольная интоксикация.

Материалы и методы.

Изучали влияние №аВРС157 на хроническую алкогольную интоксикацию. Для этих опытов использовали крыс-самцов Албино Вистар. Крысам спаивали либо имеющиеся в продаже виски, либо этанол (10-20% водный раствор) в течение трех месяцев. Введение №аВРС157 (10 мкг, 10 нг/кг массы тела), пропранолола (10 мг/кг массы тела) и ранитидина (10 мг/кг массы тела) (контрольные крысы получали равный объем физиологического раствора 5,0 мл/кг) внутрижелудочно или внутрибрюшинно проводили в профилактических целях (за 10 дней перед началом введения алкоголя) или совместно с алкоголем или в терапевтических целях (начиная с конца двухмесячного периода, т.е. в течение последнего месяца эксперимента).

Результаты.

Прямое измерение кровяного давления в портальной вене отчетливо показало, что №аВРС157, а также пропранолол (при всех схемах введения) заметно предотвращали и/или уменьшали в противном случае повышенные значения портального кровяного давления у контрольных крыс. В противоположность этому лечение ранитидином привело даже к более высоким значениям портального давления, чем имевшиеся у контрольных животных. Кроме того, в большей степени, чем пропранолол, №аВРС157 был способен заметно ослаблять в противном случае выраженные поражения в желудке крыс, получивших алкоголь. Подобный целебный эффект был также отмечен при поражениях других органов (т.е. почек, сердца).

Принимая во внимание эти последовательные положительные эффекты и общеизвестное доказательство того, что повышенное потребление алкоголя приводит к аналогичным изменениям у людей, является очевидным, что №аВРС157 полезен для лечения нарушений, возникших под действием алкоголя.

Пример 38. Влияние на ишемические нарушения в мозге.

Материалы и методы.

№аВРС157 (10 мкг или 10 нг/кг массы тела, в/б) или физиологический раствор (5,0 мл/кг массы тела, в/б) вводили или за 1 ч до, или через 1 ч после наложения лигатуры на обе сонные артерии на период продолжительностью 3 или 6 ч у крыс.

Результаты.

Является очевидным сильное положительное действие ЫаВРС157 при введении как до обработки (за 1 ч до наложения лигатуры), так и после обработки (через 1 ч после наложения лигатуры). Это было в мкг- и нг-дозах и в опытах продолжительностью 3 или 6 ч. Помимо бальных значений, наиболее отчетливыми и характерными обнаруженными фактами было наличие сильного периваскулярного отека и отека мозговой ткани наряду с гиперемией мозга. Также были отмечены зоны демиелинизации, особенно в мозжечке. Все эти признаки были значительно менее выражены в группах животных, обработанных ЫаБРС157, независимо от условий обработки.

Принимая во внимание тяжелые ишемические поражения, отмеченные в контроле и явное сходство между ишемическими нарушениями у крыс и людей, является очевидным благоприятное применение ЫаБРС157 для лечения ишемических нарушений мозга.

Пример 39. Влияние на повреждение нерва.

Материалы и методы.

Изучали влияние ЫаБРС157 на регенерацию периферических нервов. У взрослых крыссамцов Вистар (225-250 г) под анестезией обнажали правый седалищный нерв, освобождали от соединительной ткани и делали поперечный разрез на 5 см дистальнее от седалищной вырезки. Делали три периневрильных шва (10,0 ΕΐΐιίΙοη, Εΐΐιίοοη) для анастомоза в целях гарантии правильного совпадения пучков. Животных обрабатывали местно в месте анастомоза и виде ванночки из 1 мл раствора ЫаБРС157 (2 мкг/кг или 2 нг/мл), внутрижелудочно или внутрибрюшинно (10 мкг или 10 нг/кг массы тела) сразу же после образования анастомоза. Контрольные животные получали равный объем физиологического раствора. В указанные дни после операции (3, 6, 9, 12 и 30 дней) ставили функциональные тесты. Эти тесты включали тест с горячей водой (60°С), тест с холодной водой (2°С), тест с прослеживанием движения, ЕМСдистальную латенцию и амплитуду СМ АР. Также отбирали образцы для гистологического и морфометрического анализов. В других опытах с использованием той же хирургической процедуры и того же места в нерве микрохирургическим пинцетом в течение 60 с проводили травматическое сдавливание и ЫаБРС157 применили местно. Оценку проводили через 2, 7, 10, 50 и 100 дней.

Результаты.

При оценке клинически или микроскопически, особенно в раннем периоде, применение №1ВРС157 заметно улучшало заживление у травмированных крыс.

Принимая во внимание близкое сходство травмы у животных и заболеваниями у человека, ЫаБРС157 можно использовать для лечения повреждений периферических нервов.

Пример 40. Влияние на нейролептические расстройства.

Оценивали влияние ЫаБРС157 на различные индуцированные нейролептические расстройства.

Материалы, методы и результаты.

Введение ЫаВРС157 (10 мкг или 10 нг/кг массы тела, в/б) последовательно ослабляло каталепсию, возникшую под действием галоперидола и флуфеназина (галоперидол 0,625, 1,25, 2,5, 5,0 и 10,0 мг/кг массы тела, в/б, флуфеназин 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5 и 5,0 мг/кг массы тела, в/б (4,0 мл/кг)), при более низких дозах обоих нейролептиков в последующие интервалы времени. В пополнении к целебному действию на фоне более низких доз нейролептиков, даже более сильный полезный антикаталептический эффект ЫаВРС157 был отмечен при более высоких дозах обоих нейролептиков, наблюдаемый как в мкг-, так и нг-дозах ЫаВРС157. Это действие было также отмечено при соматосенсорной ориентации у животных, обработанных сульпиридом (20, 40, 80 и 160 мг/кг массы тела, в/б), несмотря на то, что у контрольных мышей при обработке сульпиридом каталепсия не наблюдалась.

Является очевидным положительное использование ЫаВРС157 при лечении нарушений, связанных с дофаминовыми системами, каталептическими нарушениями и нейролептическими расстройствами.

Пример 41. Применение для лечения шока.

Материалы и методы.

Изучали экспериментальный геморрагический шок у крыс под анестезией (канюли в общей сонной артерии и яремной вене). Контролируемое удаление объема крови проводили до падежа или стабильного низкого кровяного давления (30-35 мм Нд). В этих опытах СаВРС157 (10 мкг или 10 нг/кг массы тела) или физиологический раствор вводили внутрибрюшинно (5,0 мл/кг) за 15 мин до кровотечения или внутривенно (3,0 мл/кг) после 5-минутного периода стабильного низкого кровяного давления.

Результаты.

По сравнению с контрольными значениями достоверно более высокая потеря объема крови, поддерживаемая до падежа (зависимая от дозы), была последовательно отмечена у крыс, обработанных СаВРС157. У животных с пониженным объемом крови и гипотензией, обработанных СаВРС157, было показано немедленное и длительно продолжающееся повышение кровяного давления при отсутствии падежа. Это контрастировало с коротким и слабым подъемом кровяного давления и падежом 75% животных к концу 45-минутного опытного периода в контрольной группе. У крыс, подвергнутых только операции после анестезии, но не эксангуации, СаВРС157 (в/б или в/в), введенный после 65минутного периода стабилизации, не влиял достоверно на показатели артериального давления в течение такого же периода времени после обработки. На основании этих данных предполагается, что СаВРС157 может быть эффективным в смягчении последствий острой потери крови. Принимая во внимание явное сходство между использованными моделями на животных и нарушениями у людей, СаВРС157 можно использовать для лечения шока.

Пример 42. Влияние на аномальные лимфоциты.

Материалы, методы и результаты.

Изучали иммунологические показатели у двух пациенток, страдающих редким клиническим заболеванием - наследственной эозинофилией, связанной с интраэпидермальным буллезным дерматитом и подострым склерозирующим паненцифалитом. Исследовали действие №1ВРС157 (ίη уйго) на хромосомные аберрации в лимфоцитах и пролиферацию Т-клеток. №1ВРС157 индуцировал достоверное снижение хромосомных аберраций грубых типов (т.е. нормализовал лимфоцитарные показатели) и проявил стимулирующий эффект на митоз.

Пример 43. Влияние на аномалии развития.

Материалы и методы.

Изучали влияние ЫаВРС157 на возникновение аномалий развития у мышей, индуцированных витамином А. ЫаВРС157 (10 нг/кг массы тела или 10 мкг/кг массы тела, в/б) или физиологический раствор (5 мл/кг массы тела, в/б) вводили одновременно с витамином А (15700 МЕ/кг массы тела, 66 в/м) на 10-й день беременности. В качестве контроля использовали мышей, обработанных витамином А, но получивших в той же дозе и в то же время физиологический раствор.

Результаты.

При введении витамина А был индуцирован ряд аномалий развития. В группах мышей, обработанных ЫаВРС157, было отмечено достоверное снижение количества аномалий развития. Является очевидным полезное применение №1ВРС157 при лечении нарушений у плодов.

Пример 44. Овариоэктомия.

Материалы и методы.

Проводили обычную овариоэктомию. №1ВРС157 вводили (10 мкг или 10 нг/кг массы тела, в/б) или один раз в день в течение 28 дней, или один раз в день в течение 14 дней, начиная с 1 5-го дня после овариоэктомии. Постоянно при продолжительной схеме введения последнее применение было за 24 ч до забоя. Животные других групп получали однократную мкг-дозу препарата на 15-й день после овариоэктомии. Пять групп использовали в качестве контроля: животным двух групп проводили овариоэктомию, обрабатывали физиологическим раство ром и умерщвляли на 15-й и 28-й дни после удаления яичников, животным одной группы не была проведена овариоэктомия, но их обрабатывали физиологическим раствором, и животные двух групп без овариоэктомии были обработаны ЫаВРС157 (10 мкг или 10 нг/кг живой массы, в/б) один раз в день в течение 28 дней. От каждого животного брали влагалищные мазки за 5 мин до операции и на 9, 14 и 28 дни эксперимента и их окрашивали Рар для цитологического анализа. Степень созревания влагалищного эпителия выражали с помощью показателей созревания. После забоя отбирали дистальные концы костей от каждого животного для проведения биомеханического тестирования, как кратко описано ниже.

Биомеханическое тестирование.

Все кости проверили в зависимости от различных моментов сгибания (одна точка сгибания) (момент сгибания = Ыт) в различных направлениях, передне-заднем и латеролатеральном. В этом опыте использовали бедренную и большеберцовую кости. Дистальные части костей фиксировали костным цементом (Ра1асок) в металлических трубках длиной 1 см. Металлические трубки фиксировали в системе для нагрузки. Кости постоянно держали влажными. Измеряли свободную часть кости, а также длину от фиксирующей части до точки нагрузки. Эксперимент проводили соответственно принципу сгибания палки, фиксированной в одной точке, в пределах эластичности. Нагрузка составляла 0,1, 0,2, 0,5, 0,7, 1,0 N. Деформацию или угол сгибания определяли, как угол отклонения лазерного луча, который отражался от небольшого зеркала, зафиксированного на конце кости. Массу зеркала добавляли к приложенной силе сгибания. Миллиметровая бумага, на которую направляли лазерный луч, была удалена на 1,5-1,8 см от кости с небольшим зеркалом, установленным на ней. Угол деформации определяли, используя тригонометрический метод. При каждой отдельной нагрузке замеряли продолжительность деформации (и последующего восстановления.). После снятия нагрузки кость вернулась в ее исходное положение, что свидетельствует о том, что структурные изменения в кости отсутствовали, и что нагрузка была обеспечена пределами эластичности по диаграмме Хука. Это наблюдение показало, что было возможным нагружать одну и ту же кость дважды в различном направлении без изменения ее структуры. Если не наблюдали дополнительную деформацию в течение двух последующих минут или если достигалось дополнительное восстановление, эти точки устанавливались как конечные (в основном время измерения составляло примерно 30 с (контроль с овариоэктомией) или 16 мин (здоровые животные)). Костную угловую деформацию (нагрузка и восстановление после нагрузки) выражали в мм/с.

Результаты.

Ежедневное введение ИаВРС157 в обеих дозах привело к заметно повышенному значению показателей созревания по сравнению с атрофичными пониженными показателями созревания у необработанных контрольных крыс. Таким образом, предполагается, что ИаВРС157 способен предотвращать атрофию влагалища у крыс, вызванную кастрацией.

У животных контрольных групп при проведении овариоэктомии наблюдали самую низкую амплитуду сгибания с самым коротким временем, а также самую низкую амплитуду возвращения в исходное состояние. Одинаково низкие значения были получены в обеих контрольных группах крыс, умерщвленных через 15 или 28 дней. Это было отмечено в обеих группах животных с удаленными яичниками, обработанных физиологическим раствором (забиты или на 15-й, или 28-й дни). Положительную тенденцию наблюдали в группе, получившей ИаВРС157 в мкг-дозах на 15-й день после овариоэктомии. Достоверно лучшие результаты получили во всех других группах, обработанных ИаВРС157 в нг- или мкг-дозах. Наилучшие результаты были получены в группе животных, которые ежедневно получали ИаВРС157 в мкг дозах в течение 28 дней. Все параметры у животных с удаленными яичниками заметно улучшились и степень улучшения имела тенденцию к достижению значении, отмеченных в группах здоровых крыс. Не было отмечено различия между здоровыми крысами, независимо от того, были они обработаны физиологическим раствором или ИаВРС157 (мкг- или нг-дозы).

Принимая во внимание общепринятое значение этих моделей на животных для заболеваний, связанных с овариоэктомией у людей, как в отношении атрофии влагалища, так развития остеопороза, является очевидным, что №1ВРС157 можно использовать для лечения овариоэктомии.

Пример 45. Опухоли.

Материалы, методы и результаты.

Одной из наиболее используемых моделей экспериментальных опухолей является оценка числа метастазов карциномы и меланомы В-16 у мышей. Подобно разнообразным моделям экспериментальных опухолей, эти экспериментальные модели разделяют значительное сходство с нарушениями, наблюдаемыми у людей. Было показано, что ИаВРС157, примененный в различных схемах, снижает число метастазов у обработанных мышей по сравнению с соответствующими контрольными значениями. Асцитная опухоль Эрлиха (ЕАТ) является опухолью, которая может расти у мышей всех штаммов. Она может расти в асцитной или солидной форме в зависимости от пути введения опухолевых клеток. Несмотря на то, что обычно опухолевые модели на животных только частично разделяют сходство с болезнями у людей, применение этой модели достигло общего признания вследствие ее пригодности для изучения противоопухолевых препаратов.

Выживаемость (дни) у мышей, которым ввели асцитные опухолевые клетки Эрлиха, в основном сводится к периоду менее чем 25 дней. Предварительная инкубация опухолевых клеток с №1ВРС157 (2 мкг/мл) привела к увеличению продолжительности жизни у животных, которым ввели упомянутые опухолевые клетки. Более 90% животных выжило до конца 45дневного периода наблюдений. Кроме того, различные цитостатические препараты индуцировали нейтропению у пациентов, а также на экспериментальных моделях. Циклофосфамид является общепринятым используемым препаратом для индукции нейтропении. Использование циклофосфамида (180 мг/кг, в/б) индуцировало достоверные нарушения. ИаВРС157 предупреждал нейтропению, уменьшал количество ретикулоцитов и улучшал показатели по гемоглобину.

Следовательно, является очевидной противоопухолевое действие ИаВРС157. Принимая во внимание очевидное сходство моделей на животных и заболеваний у человека и положительные эффекты, полученные как в опытах ίη νίνο, так и ίη νίίτο, ИаВРС157 является полезным для противоопухолевой терапии. №1ВРС157 является пригодным для ослабления вредных эффектов от применения цитостатиков.

Пример 46. Антивирусная активность.

Материалы и методы.

АКВО-вирусы (клещевой энцефалит (ТВЕ), ВЕаша, Эстще I, 2, 3, 4, 8тЬй, ХУеД №1е, Ε;·ι1ονο). гепатит А, лимфатический хориоменингит (ЬСМ) и герпес тип 1 вводили в/к (или п.о. (после операции) - гепатит А) в виде вирусных суспензий, в разведении 10'² (0,02 мл/мышь). ИаВРС157 (20 мкг/кг массы тела) или 0,9% №1С1 (0,02 мл/мышь) вводили в/к или в/б а) перед обработкой, Ь) одновременно с введением вируса или с) через 4 дня после заражения на фоне уже возникших симптомов заболевания.

Результаты.

После одновременного введения №1ВРС157 с вирусами было отмечено значительное замедление в появлении симптомов заболевания и последующего падежа (в противном случае постоянно имевшего место на 4-й и 5-й дни после заражения у контрольных животных). При введении на фоне тяжелой картины заболевания, последовательно отмечали достоверное увеличение выживаемости. При введении №1ВРС157 перед обработкой вирусом очевидным было полное отсутствие либо симптомов, либо последующего падежа животных.

В целях проверки полученных результатов тестировали также вирулентность использованных вирусных суспензий (зараженные АКВО вирусами) путем заражения суспензиями мозговой ткани, приготовленными от мышей, которым ранее ввели ЫаВРС157 или физиологический раствор, и соответственно которые выжили (ЫаВРС157) (несмотря на введение вируса) или пали спонтанно (физиологический раствор). В отличие от мышей, зараженных суспензией мозговой ткани с обработкой физиологическим раствором (которые не отличались от мышей, которых заразили вирусной суспензией и обработали физиологическим раствором) симптомы заболевания или падеж не наблюдали у мышей, которых заразили суспензией мозговой ткани при обработке ЫаВРС157. После введения суспензии мозговой ткани мышей наблюдали в течение 50 дней.

Положительные эффекты ЫаВРС157 сохранялись при инкубации при повышенной температуре (56°С в течение 30 мин).

Принимая во внимание, что эти вирусы индуцируют аналогичные нарушения у людей, №1ВРС157 можно использовать для лечения вирусных заболеваний, особенно лечения в тех случаях, когда заметно ослаблено общее состояние (например, СПИД или связанные со СПИДом заболевания).

Пример 47. Поражения кишечника.

Материалы и методы.

Изучали эффекты ЫаВРС157 (10 мкг или 10 нг/кг, в/б, в/ж) на крысах в сравнении с несколькими стандартными веществами на нескольких экспериментальных моделях язвы (48часовой подавляемый стресс, тесты с язвой при подкожном введении цистеамина, внутрижелудочном введении 96% этанола, участки поражения под действием ΝδΆΣΆδ. ΌΝΤΈ (динитрофторбензола). рефлюкс пищевода с последующим концевым-латеральным анастомозом между пищеводом и тощей кишкой) (перед/ совместно/после обработки).

Результаты.

Только введение ЫаВРС157 было последовательно эффективным на всех тестированных моделях. Бромкриптин, аматадин, фамотидин, циметидин и соматостатин были неэффективными (подавляемый стресс) или были только частично эффективными (бромкриптин, поражения кишечника под действием ЭИРВ; сукралфат, ранитидин, холестирамин, рефлюкс пищевода). Рассматривая результаты по стандартным пептидам, защитное действие, зависимое от дозы (цистеамин) и/или частичный положительный эффект (связанный с условиями обработки) (этанол) получили с глюкагоном, №У и секретином, в то время как ССК/26-30/ был неэффективен.

Принимая во внимание, что все эти модели использовались для скрининга препаратов, используемых в настоящее время для лечения поражений желудочно-кишечного тракта и последовательные положительные эффекты №1ВРС157. является очевидным его полезное применение для лечения поражений всего кишечного тракта.

Пример 48. Влияние на расстройства познавательной способности.

Материалы и методы.

Использование антихолинергетических препаратов (скополамина, атропина, 10 мг/кг массы тела, в/б) приводило к значительному дефициту познавательной способности у крыс, что успешно воспроизводится при оценке поведения животных в водяном Т-лабиринте в течение продолжительного периода времени.

Результаты.

По сравнению с контролем у крыс, обработанных скополамином и атропином, можно было четко увидеть повышенное количество ошибок. Этот дефицит познавательной способности устранялся (полученные значения были равны контрольным значениям) при последующем совместном введении с ЫаВРС157 (10 мкг или 10 нг/кг массы тела, в/б).

Принимая во внимание большое значение этих моделей для расстройств познавательной способности у человека, является очевидным, что ЫаВРС157 полезен для лечения нарушений познавательной способности.

Пример 49. Влияние на нарушения отмены.

Материалы, методы и результаты.

№1ВРС157 проявил противосудорожное действие, взаимодействуя с ГАМК-ергической системой, и повышал эффективность диазепама при совместном введении (10 мкг/кг, 10 нг/кг, в/б) с диазепамом (5.0 мг/кг, в/б, дважды в день в течение 10 дней). ЫаВРС157 ослаблял толерантность к диазепаму и отдалял эффекты отмены и физическую зависимость. В тестах по толерантности через 42 ч после кондиционной схемы введения, наблюдали более короткие перед судорогами латентные периоды, чем у здоровых мышей после введения изониазида (800 мг/кг, в/б). если диазепам (5.0 мг/кг, в/б) давали вновь мышам, ранее кондиционно обработанных одним диазепамом. В тесте физической зависимости (оценивали через 6. 14. 42 и 72 ч после кондиционной обработки) были отмечены более короткие перед судорогами латентные периоды у мышей, кондиционированных диазепамом по сравнению с некондиционированными здоровыми мышами после обработки изониазидом через 42 и 72 ч после периода кондиционирования. ЫаВРС157 (в дозе 10 мкг/кг) в сочетании с диазепамом отдалял этот эффект до последнего срока наблюдений. В этой группе на шесть часовых интервалов, в отличие от мышей, кондиционированных диазепамом, латентные периоды перед судорогами после введения изониазида были по-прежнему длиннее, чем у соответствующего контроля. ЫаВРС157 не вызывал какой-либо толерантности.

Принимая во внимание значение этих моделей для заболеваний человека, является оче видным, что Ν;·ιΒΡΟ157 пригоден для лечения нарушений отмены.

Пример 50. Влияние на нарушение почек.

Материалы и методы.

Введение хлорида ртути (1 мг/кг, в/в) или цисплатины (10 мг/кг, п/к) приводит к острой почечной недостаточности у экспериментальных животных. При воспроизведении таким образом почечная недостаточность тесно коррелирует с соответствующим расстройством у человека. Следовательно, поражения, индуцированные у крыс, в значительно высокой степени разделяют сходство с соответствующими поражениями у людей.

Результаты.

Ν;·ιΒΡΟ157 заметно ослаблял поражения у крыс при введении как до обработки, так и после обработки. Односторонняя нефрэктомия создала заметную функциональную перегрузку и функциональную гипертрофию оставшейся почки. Введение NаВΡС157 увеличило диурез у животных после односторонней нефрэктомии и снизило гипертрофию оставшейся почки. Таким образом, в понятиях функциональной теории о компенсаторной почечной гипертрофии, эти обнаруженные факты подчеркивают улучшенную функцию оставшейся почки. Это также подтверждается дополнительными биохимическими данными. Кроме того, эти данные полностью согласуются с эффектами, полученными на крысах с гипертонией со стенозом почечной артерии и/или после односторонней нефрэктомии. Является очевидным полезное применение NаВΡС157 для лечения почечных нарушений.

Пример 51. Клеточные иммунные ответные реакции лимфоцитов периферической крови.

Данные по изучению клеточных иммунных ответных реакции лимфоцитов периферической крови на ВРС в контроле и у пациентов с различными заболеваниями представлены в табл. 2. Ответные реакции Т-клеток периферической крови на ВРС тестировали с помощью метода, описанного бе8те! е! а1. (бе8те! ΜΌ е! а1. в «Се11и1аг 1ттипе гекропзек оГ райеп18 \νί!1ι иуеШк 1о ге1па1 апйдепк апб 1Не1г ГгадтепБ». Ат 1.Орй1йа1, 110: 135-142, 1990) с 7-дневными клеточными культурами. Клетки инкубировали без антигена и с 20 нг/л антигена (ВРС157пентадекапептида). Для каждого пациента высчитали индекс стимуляции делением среднего числа стимулированных антигеном культур на среднее число контрольных клеточных культур без добавления антигена, т.е. ВРС157пентадекапептида. Результаты представлены в табл. 2.

Контрольные значения <2, определенные у контрольных субъектов (таблица 2), соответствовали значениям, полученным другими исследователями для пептидов сходной молекулярной массы, т.е. у контрольных субъектов отсутствовала сенсибилизация лимфоцитов перифе рической крови на ВРС157-пентадекапептид. У пациентов с различными заболеваниями заметные клеточные ответные реакции на ВРС, представленные в табл. 2, указывают о системной сенсибилизации лимфоцитов на этот пептид желудочного сока. Эти данные четко указывают на наличие ВРС-связанных нарушений у пациентов, страдающих явно от других заболеваний. На основании этого можно предположить о применении ВРС-связанных агентов (например, солей ВРС157-пентадекапептида) в иммуномодулярной терапии соответствующих заболеваний.

Таблица 2 Повышенные индексы стимуляции Т-клеток периферической крови у 11 пациентов с различными заболеваниями

Заболевание	Пол	Индекс стимуляции Контрольные значения <2
Пептическая язва	Ж	26,82
Множественный склероз	Ж	13, 80
Подострый склероз Пансенцефалит	Ж	2,54
Глазной неврит	М	3,54
Глазной неврит	Ж	9,53
Увеит	Ж	16, 87
Увеит	М	15,21
Увеит	Ж	22,30
Сероотрицательная спондилоартропатия	Ж	4,99
Наследственная эозинофилия и буллезный дерматит	Ж	2,70
Увеит	Ж	4,75

Результаты вышеописанных фармакологических исследований демонстрируют полезную активность солей ВРС-пептидов для защиты организмов от стресса и заболеваний и, в целом, нормализации функций организма. Соли пептидов по настоящему изобретению также эффективны для профилактики и лечения некоторых заболеваний и нарушений у человека и/или животных.

Claims (15)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соль ВРС (соединение для защиты организма) пептида, включающего 8 аминокислотных остатков, где анионом соли является отрицательно заряженный пептид, имеющий общую формулу [2аа Рго Рго Рго Хаа Уаа Рго А1а] ^{(-) или (2-)} где Хаа является остатком нейтральной алифатической аминокислоты,

   Уаа является остатком основной аминокислоты и

   Ζηη является остатком кислой аминокислоты и где катион соли является катионом неорганического или органического нетоксичного основания.
2. 2. Соль по п.1, где катион выбирается из группы, состоящей из щелочных металлов, щелочно-земельных металлов, Ζη , первичных, вторичных и третичных аминов, в частности, №', К⁺, Ь1⁺, Сз⁺, Са²⁺, ΝΗ₄ ⁺, триэтаноламин⁺, циклогексиламин⁺, 2-АМР⁺ (2-амино-1-пропанол) и Трис⁺(Трис-(гидроксиметил)аминометан).
3. 3. Соль по п.1 или 2, где

   Хаа является А1а, ЬА1а, Ьеи, 11е, О1у, Уа1, Ν1β или Хуа,

   Уаа является Ьуз, Агд, Огп или ΗΪ8 и /аа является О1ц, Азр, Лад или Арт.
4. 4. Соль по любому из предшествующих пунктов, которая дополнительно включает фармацевтически или диагностически приемлемый носитель.
5. 5. Соль по любому из предшествующих пунктов, которая дополнительно включает трегалозу.
6. 6. Соль по любому из предшествующих пунктов, где общей формулой является

   Хаа йаа Рго Рго Рго Хаа Уаа Рго А1а Азр йаа

   5 10

   А1а Хаа Хаа Хаа.
7. 7. Соль по любому из предшествующих пунктов, где пептид выбран из группы, состоящей из

   Ьеи С1и Рго Рго Рго 5 С1у Ьуз Рго А1а Азр 10 Азр А1а Ьеи С1у Уа1; 15 С1у С1и Рго Рго Рго С1у Ьуз Рго А_1а Азр Азр 5 10 А1а 61у Ьеи Уа1 ; 15 Ьеи С1и Рго Рго Рго Ьеи Ьуз Рго А1а Азр Азр 5 10 А1а Ьеи С1у Уа1; 15 Ьеи С1и Рго Рго Рго Ьеи Ьуз Рго А1а Азр А1а 5 10 Ьеи С1у Уа1; 14 С1у С1и Рго Рго Рго С1у Ьуз Рго А1а Азр А1а 5 10 С1у Ьеи Уа1; 14 С1и Рго Рго Рго Ьеи Ьуз Рго А1а; 5 8 Азр Рго Рго Рго Не Агд Рго А1а Азр, 5 9 61и Рго Рго Рго Ьеи Ьуз Рго А1а Азр, 5 9 Ьеи С1и Рго Рго Рго Ьеи Ьуз Рго А1а Азр А1а 5 10

   Ьеи С1у Уа1;

   С1у С1и Рго Рго Рго С1у Агд Рго А1а Азр и

   5 10

   61и Рго Рго Рго Ьеи Ьуз Рго А1а Азп.

   5 9
8. 8. Соль по любому из предшествующих пунктов, где пептид циклизован, в частности, амидной связью между первым и последним аминокислотным остатком.
9. 9. Соль по любому из предшествующих пунктов, где соль растворяется в водном или водном/спиртовом растворе предпочтительно при рН от 6,0 до 8,5.
10. 10. Совместимая стабильная при хранении фармацевтическая композиция, включающая фармацевтически эффективное количество соли ВРС-пептида, охарактеризованной в любом из предшествующих пунктов, и необязательно физиологически приемлемый носитель.
11. 11. Фармацевтическая композиция по п.10 для перорального применения, смешанная с трегалозой.
12. 12. Диагностическая стабильная при хранении композиция, включающая диагностически эффективное количество соли ВРС-пептида, охарактеризованной в любом из предшествующих пунктов.
13. 13. Применение соли ВРС-пептида, охарактеризованной в любом из пп.1-9, для получения совместимой стабильной при хранении фармацевтической композиции, охарактеризованной в п.10, для лечения нарушений, связанных либо с образованием оксида азота (ΝΟ), либо с ослаблением функций ΝΟ-системы, в частности, гипертензии, стенокардии, импотенции, циркуляторного и септического шока, инсульта, воспаления, респираторного дистресс-синдрома, адгезии и агрегации тромбоцитов и лейкоцитов, дисфункции эндотелия, поражений желудочнокишечного тракта, нарушения перистальтики, сахарного диабета, панкреатита, гипотензии и болезни Паркинсона;

    дисфункций или гиперфункций соматосенсорных нервов, в частности, сенсорной невропатии, постеристической невралгии, атопического дерматита, слабого заживления травмированной ткани, приобретенной крапивницы на холод и тепло, псориаза, буллезного пемфигоида, экземы, фотодерматозов, хронического артрита, поражений желудочно-кишечного тракта или специфической и неспецифической гиперреактивности верхнего и нижнего отделов дыхательных путей, бронхиальной астмы, ринита;

    нарушений функции эндотелия;

    ран, язв;

    заболеваний, связанных с острым и/или хроническим воспалением, в частности, хронического артрита и заболеваний, связанных с ги перчувствительностью замедленного типа и поражений желудочно-кишечного тракта;

    заболеваний печени, поражений органов, вызванных свободными радикалами, особенно вызванных облучением;

    заболеваний, связанных с нарушениями катехоламинергической системы, в частности шизофрении, эффектов, вызванных амфетамином, злоупотребления наркотиками;

    состояний, связанных со стрессом;

    острого панкреатита, особенно с сопутствующей патологией желудка и двенадцатиперстной кишки;

    сердечных нарушений;

    депрессивных расстройств;

    болезни Паркинсона и патологии, подобной болезни Паркинсона;

    температурных нарушений; повреждений костей;

    повреждений различных органов, вызванных гипертензией;

    нарушений коагуляции;

    болевых нарушений;

    судорог;

    травмы спинного мозга;

    алкогольных повреждений, вызванных злоупотреблением алкоголем или повышенным потреблением алкоголя;

    ишемических нарушений головного мозга; повреждений периферических нервов;

    Фиг. 1 каталептических заболеваний и нейролептических расстройств;

    заболеваний, связанных с аномальными или мутантными лимфоцитами;

    нарушений у плодов;

    атрофии влагалища и развития остеопороза, вызванных удалением яичников;

    опухолей;

    вирусных заболеваний, в частности, СПИД или СПИД-ассоциированного комплекса;

    поражений желудочно-кишечного тракта; нарушений познавательной способности; синдрома отмены;

    почечных нарушений и нарушений клеточного иммунного ответа.
14. 14. Применение соли ВРС-пептида, охарактеризованной в любом из пп.1-9, для получения совместимой стабильной при хранении фармацевтической композиции, охарактеризованной в п.10, в качестве цитопротективного и органопротективного средства.
15. 15. Способ получения соли ВРС-пептида, охарактеризованной в любом из пп.1-9, путем смешения, по меньшей мере, одного ВРСпептида в водном или водно-спиртовом растворителе с одним или несколькими основаниями и получения соли ВРС-пептида, где катион соли является катионом неорганического или органического нетоксичного основания.