SI24318A - Nove stabilne soli pentadekapeptida, postopek za njihovo pripravo, njihova uporaba za izdelavo farmacevtskih pripravkov in njihova uporaba v terapiji - Google Patents

Abstract

Predloženi izum opisuje nove stabilne soli pentadekapeptida s formulo: Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val . n BAA, SEQ ID NO 1, kjer BAA pomeni bazično amino kislino in n pomeni 1, 2 ali 3. Izum opisuje tudi postopek za njihovo pripravo, postopek za njihovo uporabo za pripravo farmacevtskih formulacij v tekoči in trdni obliki ter njihovo uporabo za preventivo, zaščito in zdravljenje bolezni in bolezenskih stanj ter prehranskih dodatkov.

Description

kjer n pomeni 1,2 ali 3, ter BAA pomeni bazično amino kislino, postopek za njihovo pripravo, njihovo uporabo za izdelavo farmacevtskih pripravkov in njihovo uporabo v terapiji.

Tehnični problem

Številne farmakološke raziskave so dokazale zaščitno, regenerativno in terapevtsko delovanje pentadekapeptida (okr. BPC-157 ali bepecin) z aminokislinsko sekvenco GlyGluProProProGlyLysProAlaAspAspAlaGlyLeuVal (SEQ ID NO. 1) na človeški in živalski organizem. Do sedaj je bil ta peptid vedno uporabljan bodisi v prosti obliki, ali kot acetat ali kot sol z bazami, na primer natrijeva sol. Značilno za vse te oblike je bila zelo slaba stabilnost v želodčnem soku, kar zelo omejuje zlasti peroralno uporabo teh spojin in hkrati zmanjšuje njihovo terapevtsko vrednost. Zato je bilo nujno potrebno izdelati ta pentadekapeptid v obliki, ki je bistveno bolj stabilna tako v želodčnem soku kot pri povišani temperaturi okolja. V taki obliki bi se preparat lahko bolj uspešno uporabljal predvsem pri peroralnem vnosu v organizem.

Zaradi večje stabilnosti bi bila pričakovana tudi v celoti večja učinkovitost.

Stanje tehnike

Pentadekapeptid BPC 157 ali bepecin (okr. za:Body Protecting Compound) ima naslednjo peptidno sekvenco: GlyGluProProProGlyLysProAlaAspAspAlaGlyLeuVal in je N-terminalni del naravnega proteina BPC, ki se sicer nahaja v želodčnem soku sesalcev. Naravni protein BPC se pridobiva iz človeškega ali živalskega želodčnega soka s kompliciranimi biokemijskimi metodami (US patent 5,288.708). Ta način dobivanja je ne glede na zahtevno delo tudi z ozirom na negotov vir surovine in možno kontaminacijo z virusi neprimeren. Zato je bil s kemijsko sintezo (P.Sikirič, R.Ručman, B.Ručman, M.Petek, Peptides 1998, Proceed. of 25th EPS, Budapest 1998, str. 814; Z. Pflaum in R.Ručman, Acta Chim.Slov., 2005, 52, 34-39) pripravljen samo Nterminalni del z zgoraj navedeno sekvenco. Presenetljivo je bilo dognanje, da ima ta fragment ohranjene praktično vse učinke naravnega proteina BPC (EP 0572688 in US patent 6,268 346). Izgleda torej, da je za biološko delovanje celega proteina v največji meri odgovoren prav N-terminalni del z zaporedjem 15 amino kislin. Z medicinskega stališča je spojina zelo zanimiva, ker deluje skoraj na vse organe v izjemno nizkih koncentracijah (v območju ng do mg in več/kg telesne teže) in to brez kakršnih koli toksičnih oziroma stranskih učinkov.

S farmakološkimi raziskavami je bilo ugotovljeno, da ima pentadekapeptid bepecin (SEQ ID NO. 1) vnesen v organizem naslednje učinke:

- na ulkuse (razjede) v katerem koli delu gastrointestinalnega trakta (P.Sikirič in dr., Life Sci., 1994;54, PL63-68); (P.Sikirič in dr., Exp.Clin.Gastroenterol., 1991,1,17-20).

- antiinflamatorno ne glede na etiologijo, (P.Sikirič in dr.,J.Physiol.lParis/, 1997,91,113122);

- proti vnetni bolezni gastrointestinalnega trakta - Chronova bolezen (Sikirič in dr., J. Physiol./Paris/, 2001,95,295-301);

- zaščitno na jetra in pankreas (Prkačin in dr., J.Physiol. /Pariš/, 2001, 95, 315-324);

- pospešuje celjenje opeklin (D.Mikuš, P.Sikirič in dr., Burns 2003, 29, 323-334; Burns, 2001, 127.817-827);

- pospešuje celjenje ran (S.Seiwerth, P.Sikirič, J. Physiol./Pariš/, 1997, 91, 173-178;

- zaščitno proti radioaktivnemu sevanju (P.Sikirič, M.Petek,R.Ručman, J.Physiol./Paris/ 1993,87,313-327);

- pospešuje celjenje kostnih prelomov (B. Sebečič, in dr., Bone, 1999 ,24,195-202);

- v interakciji z adrenergičnimi in dopaminergičnimi sistemi ščiti sluznice v stresnih pogojih (P.Sikirič in dr., Dig. Dis. Sci., 1997,42,661-671);

- antitumorski učinek pri nekaterih vrstah tumorjev (Ascites, melanom) (P.Sikirič,

M.Petek, R.Ručman, J.Physiol./Paris/,1993, 87. 313-327: S.Radeljak, S.Seivvert,

P. Sikirič, Melanoma Research, 2004,14(4),A14-A15);

- antivirusni učinek na viruse herpesa HSV-1 in HSV-2, viruse , LCM, CMV, virus influence A in klopovega encefalitisa (P. Sikirič, R. Ručman, M. Petek, J.Physiol./Paris/1993,87,313-327);

- pospešuje regeneracijo pretrganih živčnih povezav (P. Sikirič et al, Dig.Dis. Sci., 41, 1604-1614; M. Gjurašin et al, Dig. Dis. Sci., 2003, 48, 1879);

- pospešuje celjenje pretrgane Ahilove tetive (M. Starešinič, P.Sikirič in dr., J.Orthoped. Res.,2003, 21, 976-983);

- odpravlja organske motnje povezane s tvorbo NO (P.Sikirič in dr., Eur.J.Pharm.,1997, 332, 23- 33);

Peptid bepecin kot sestavni del živemu organizmu lastne snovi ne kaže nobenih znakov toksičnosti. Poskusi določitve LD₅₀ na miših in z namenom dobiti podatke o akutni, subkronični in kronični toksičnosti niso bili uspešni, ker ta peptid v širokem območju doz od 10 ng do 100 mg/kg telesne teže, apliciran intravenozno, peroralno ali intraperitonealno, ne povzroča nobenih toksičnih sprememb.

Prav tako pri preiskavi na teratogenost in genotoksičnost (Salmonela mikrosomski test) ni nobenih znakov tozadevnega učinkovanja.

Soli sintetskega pentadekapeptida BPC-157 so opisane tudi v patentih EP 0983300 in US 6,288028. Te soli so nekoliko boljše od prvotne oblike, to je od proste kisline oziroma acetata, vendar še nimajo zadovoljive stabilnosti v želodčnem soku.

Rešitev tehničnega problema

Osnoven problem, ki ga moramo rešiti je stabilnost spojine pri povišani temperaturi, predvsem pa stabilnost v želodčnem soku. Predloženi izum obravnava nove soli pentadecapeptida z bazičnimi amino kislinami, ki imajo znatno izboljšano termično stabilnost ter tudi stabilnost v želodčnem soku.

Želodčni sok je kompleksna mešanica različnih spojin, glavne sestavine so: voda, natrijev klorid, klorvodikova kislina, mucini, encimi, predvsem pepsin in drugo. Želodčni sok je sicer pretežno kisel, pH vrednost varira od 1 do 7, izjemoma lahko tudi več. Običajne vrednosti pH so v območju od 2 do 5, to je tudi območje največje aktivnosti pepsina, ki razkraja polipeptide, peptide in proteine.

Izum obravnava nove stabilne soli pentadekapeptida s formulo (I):

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val . nBAA

5 10 15

SEQ ID NO 1 kjer n pomeni 1, 2 ali 3, ter BAA pomeni bazično amino kislino, kot na primer: arginin, lizin, ornitin in druge, lahko v L-, D- ali DL-obliki, prednostno L-arginin.

Izum se nanaša tudi na postopek za pripravo soli pentadekapeptida s formulo (I), kjer pentadekapeptid s sekvenco (SEQ ID NO.1) reagira z bazično amino kislino BAA:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val + n BAA 15 10 15

SEQ ID NO 1

I

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val . nBAA 15 10 15

SEQ ID NO 1 v molskem razmerju od 1 do 3 mole bazične amino kisline na mol pentadekapeptida v vodni raztopini pri sobni temperaturi, nato se raztopini nastavi ustrezna pH vrednost, da nastane sol, ki se nato čisti na HPLC koloni in pretvori v trdno obliko z liofilizacijo. V smislu predloženega izuma se pH vrednost raztopine, dobljene pri reakciji 1 mola bazične amino kisline z enim molom pentadekapeptida (SEQ ID NO1) nastavi na 4,1 do 5,0, prednostno 4,60±0,05. V slučaju reakcije 2 molov bazične amino kisline z 1 molom pentadekapeptida (SEQ ID NO1) pa na: 6,7 do 7,8, prednostno 7,40±0,05. Predloženi izum se nanaša tudi na farmacevtsko formulacijo v trdni ali tekoči obliki za oralno, intravenozno, rektalno, vaginalno, intramuskularno, lokalno ali drugačno uporabo, ki vsebuje terapevtsko učinkovito količino soli pentadekapeptida po tem izumu.

Predloženi izum se nanaša tudi na farmacevtsko formulacijo, ki dodatno vsebuje eno ali več drugih aktivnih snovi, prednostno antibiotike ali antioksidante.

Predloženi izum se dalje nanaša tudi na farmacevtsko formulacijo, ki dodatno vsebuje snovi za povečanje stabilnosti iz skupine alkalijskih ali zemljoalkalijskih karbonatov ali hidrogen karbonatov, prednostno natrijev hidrogen karbonat.

Predloženi izum se dalje nanaša tudi na farmacevtsko formulacijo, ki dodatno vsebuje snovi za povečanje stabilnosti izbrane iz skupine sladkorjev kot trehaloza, sorbitol ali D-manitol, prednostno D-manitol.

Predloženi izum se dalje nanaša na farmacevtsko formulacijo za uporabo pri preprečevanju, zaščiti in zdravljenju naslednjih bolezni in bolezenskih stanj:

- bolezni in nepravilnosti v zvezi s stresom, razjede v katerem koli delu gastrointestinalnega trakta, splošno protivnetno delovanje, gastrointestinalna vnetna bolezen, Chronova bolezen in akutni pankreatitis;

- organoprotektivno delovanje: zaščita pred lezijami na jetrih in trebušni slinavki, zaščita endotelijskih celic, preprečevanje nastanka adhezij, preprečevanje in zdravljenje miokardnega infarkta in možganske kapi, zaščitno delovanje v imunskem sistemu;

- zdravljenje virusnih infekcij, posebno hepatitisa A, več vrst herpesa, influence A in infekcij z ARBO virusi kot so: klopov encefalitis, West Nile mrzlica, denga tipi od 1 do 4, citomegalovirus CMV in LCM virus, virus mačje levkemije;

- zdravljenje melanoma in sorodnih tumorjev;

- pospešitev celjenja ran, opeklin, kostnih prelomov, regeneracija pretrganih živčnih povezav, Ahilove tetive in mišic, poškodbe hrbtenjače;

- zdravljenje organskih nepravilnosti povezanih s tvorbo NO: hipertenzija, hipotenzija, anafilaksa, cirkulatorni in septični šok, agregacija trombocitov;

- zdravljenje nevroloških bolezni in nepravilnosti: multipla skleroza, miastenija gravis, lupus erimatozis, nevropatije, disfunkcija somatosenzornih živcev, astma, rinitis, pemfikus in ekcem;

- kateholaminergične disfunkcije, shizofrenija, odvisnost od amfetamina, alkohola in drog;

- preprečevanje in eliminacija težav povzročenih s kortikosteroidi in NSAIDs;

- zdravljenje mokre degeneracije očesne makule;

- kot originalna terapija pri motnjah, kjer je potrebna hitra reorganizacija krvnega obtoka;

- v veterinarski medicini za povečanje prirasta teže živali in za povečanje stabilnosti sperme pri shranjevanju.

Predloženi izum se nanaša tudi na uporabo soli pentadekapeptida za izdelavo preparatov uporabnih kot prehranski dodatek.

Podroben opis izuma

Sestavo in strukturo novih spojin smo določili s pomočjo masnih spektrov, z analizo amino kislin, ¹H-NMR, FTIR in UV spektri. UV spektre smo posneli z Varian Carry 50 spektrometrom, FTIR spektre smo posneli z Perkin Elmer 727B spektrometrom, masne spektre z AutoSpec Q spektrometrom in ¹H-NMR spektre z Bruker Advance DPX500 spektrometrom. Specifične sučnosti [a]_D ²⁸ smo določili z aparatom Perkin Elmer 141. Za optično snemanje smo v primeru 43 uporabili kamero Veho Discovery, VMS.001, x30-30, za termografsko snemanje pa infrardečo kamero T-335 (FLIR, USA) z FLIR OuickPot programom.

Zgoraj opisani problem smo rešili z novimi solmi pentadekapeptida bepecina z bazičnimi amino kislinami, ki so lahko v L, D ali DL obliki. Tipični predstavniki teh amino kislin so: arginin, lizin, ornitin, 2,4-diaminomaslena kislina, 2,6diaminokapronska kislina, 2,6-diaminoheksanojska kislina, 2,5-diaminopentanojska kislina, 2,6-diaminopimelinska kislina, 2,3-diaminopropionska kislina, citrulin, homoarginin, homolizin in slične. Soli so lahko sestavljene iz ene molekule pentadekapeptida in ene, dveh ali treh molekul bazične amino kisline. Od te sestave zavisi tudi pH vrednost vodnih raztopin teh soli kar posredno vpliva tudi na stabilnost. Prednostno uporabimo soli z L-argininom . Pripravimo jih z reakcijo pentadekapeptida SEQ ID NO 1. z bazičnimi amino kislinami v molarnem razmerju od 1 : 1 do 1 : 3 (pentadekapeptid : bazična amino kislina) v vodni raztopini s tem, da bazično amino kislino najprej dodamo v prebitku, nato retitriramo določen del prebitka z raztopino ocetne kisline do ustrezne pH vrednosti. Optimalne pH vrednosti znašajo pri soleh z razmerjem 1 : 1 od 4,1 do 5,0, prednostno 4,60 ± 0,05; pri soleh z razmerjem 1 : 2 pa od 6,7 do 7,8, prednostno 7,40 ± 0,05: pri soleh z razmerjem 1 : 3 vrednosti pH ne nastavljamo. Raztopine soli nato čistimo na HPLC koloni, polnjeni z reverznim nosilcem. Po liofilizaciji ustreznega eluata dobimo soli pentadekapeptida z visoko stopnjo čistosti.

Soli so zelo lahko topne v vodi. Najbolj ugodne lastnosti imajo soli, ki vsebujejo 2 mola bazične amino kisline na 1 mol pentadekapeptida, prednostno sol z L-argininom, to je di-L-argininijev bepecin (okr.: Arg-BPC)

Izhodno spojino za sintezo, to je pentadekapeptid BPC-157 oz. bepecin pripravljamo s peptidno sintezo na trdnem, polimernem nosilcu, kot je opisano v predhodnih patentih EP-0572688, US 6,268346 in v članku Z. Pflaum, R.Ručman, Acta Chem. Slov., 2005, 52, 34-39. Pentadekapeptid je lahko v prosti obliki, kot amonijeva ali natrijeva sol, lahko pa tudi v obliki acetata ali trifluoroacetata.

Stabilnost di-L-argininijeve soli bepecina ( Arg-BPC) pri povišani temperaturi smo določili s pospešeno metodo staranja pri 50 °C in relat. vlažnosti 65%, kar predstavlja za spojino s peptidno strukturo relativno zelo ostre pogoje.

Tabela 1. Padanje vsebnosti bepecina v soleh s stanjem pri 50°C in rel. vlagi 65%:

Snov:	0 dni	10 dni	30 dni	60 dni	90 dni
BPC acetat	99,65%	95,97%	91,98%	85,49%	85,90%
BPC Na sol	99,20%	97,22%	96,46%	97,38%	97,14%

Arg-BPC	99,46%	99,29%	99,20%	98,96%
Arg-BPC/NaHCOs	99,46%	99,37%	99,29%	99,16%
Lys-BPC	99,47	99,24%	99,27%	98,90%

99,07%

99,15%

99,28%

Iz tabele je razvidno tudi, da dodatek natrijevega hidrogenkarbonata k soli bepecina poveča njeno stabilnost pri povišani temperaturi. Ta dodatek bo v mejah od 0,5 mg do 3,0 mg na 1 mg bepecina. To lastnost bomo upoštevali pri sestavi tablet in kapsul. Ločen poskus z dodatkom izbranih sladkorjev kot trehaloze ali D-manitola je pokazal podobno povečanje stabilnosti.

Stabilnost soli bepecina z L-argininom v vodnih raztopinah smo določili z inkubacijo vodnih raztopin soli v koncentraciji 1 g/ 100ml, pri 50 °C in s posebnim poskusom še v zelo ostrih pogojih; pri 100 °C , kjer smo zasledovali razkroj v teku 1 ure.

Tabela 2. Padanje vsebnosti bepecina v raztopinah različnih soli pri 50 °C po času:

Snov:	PH	start/O ur	20 ur	65 ur	148 ur	388 ur
BPC acetat	3,88	98,89%	71,17%	55,25%	52,55%	21,30%
BPC Na sol	8,42	99,01%	98,36%	97,47%	N.D.	96,74%
Arg-BPC	7,35	99,05%	98,97%	99,04%	99,10%	99,01%
Lys-BPC	7,28	99,07%	99,40%	99,09%	99,35%	99,01%
Orn-BPC	7,12	100%	99,64%	99,78%	99,59%	99,44%

Tabela 3. Kuhanje peptidnih soli pri 100 °C -1 uro:

Snov:	start	po 1 uri
BPC acetat	98,89%	56,80%
BPC Na sol	99,01%	98,56%
Arg-BPC	99,05%	99,08% (brez spremembe!)

Stabilnost spojine v želodčnem soku je zelo važen parameter, zlasti pri peptidih, ki se v prisotnosti encima pepsina in v kislem mediju zelo hitro razkrajajo. Večja obstojnost v želodčnem soku pomeni daljšo dobo, ko je spojina na razpolago za resorbcijo in njeno terapevtsko delovanje.

Umetni želodčni sok ponazarja razmere v normalnem človeškem želodčnem soku in vsebuje: 0,08 mola klorvodikove kisline, 0,03 mola natrijevega klorida in 1,0 g pepsina v 1000 ml vode.

Preiskovane peptidne soli v koncentraciji 10 mg/5 ml, smo inkubirali v umetnem želodčnem soku s pH vrednostmi 2,0, 3,0 in 4,0 pri 37 °C.

Snov:	Čas (ure):		1,0	1,5 2,0	2,5
0	0.5
BPC acetat	100	21,4		8,2	4,75 2,46	2,10
BPC Na sol	100	21,6		6,7	4,4 4,2	2,7
Arg-BPC	100	30,2	13,5	8,2 6,0	4,9
Tabela 5. Padanje vsebnosti bepecina (rel. %) v žel. soku ori pH = 3,0:
Snov:	Čas (ure):
	0	0,5	1,0	2,0	3,0 4,0	5,0
BPC acetat	100	41,7	26,1	7,8	2,5 1,1	0,08
BPC Na sol	100	81,9	71,6	56,0	40,2 29,7	10,1
Arg-BPC	100	98,1	96,5	93,6	90,0 87,2	84,9
Tabela 6. Padanje vsebnosti bepecina irel.% ) v žel. soku pri pH = 4,0:
Snov:	Čas (ure):
	0 1	2	3	4	5 6 7	8
BPC acetat	100 89,7	81,3	72,5	60,9	56,4 48,8 44,6	38,0
BPC Na sol	100 99,0	98,9	94,6	89,7	78,3 76,3 68,2	60,9
Arg-BPC	100 99,9	99,5	98,7	96,1	89.8 84,6 73,5	67,2

Vsebnost bepecina v preiskovanih vzorcih smo določali s HPLC metodo v naslednjem sistemu:

kolona:	Reprosil Orpegen C18, 100, 5 μ, 250 x 4,6 mm,
mob. faza A:	0,1% trifluorocetna kislina/ 5% acetonitril / voda
mob. faza B:	0,11% trifluorocetna kislina/ 40% acetonitril/ voda
gradient:	od 100% A na 30% A v 25 min.
temperatura:	20 °C
pretok:	1,0 ml/min.
detekcija:	UV, 210 nm

Rezultati določitev stabilnosti potrjujejo, da so nove amino kislinske soli bepecina v vseh pogledih bistveno bolj stabilne kot doslej znane soli tega peptida, kar je presenetljivo velika prednost.. Boljše so tudi od znanih soli bepecina z raznimi amini, alkalijskimi in zemljoalkalijskimi kovinami po patentih EP 0983300 in US 6,288.028, ki so sicer zelo nagnjene k tvorbi polarnega razkrojnega produkta (do 10 %, struktura še ni ugotovljena).

Posledica boljše stabilnosti je tudi boljša biološka aktivnost, saj je intaktna spojina dalj časa prisotna v organizmu in na razpolago za bolj učinkovito resorpcijo.

Stabilnost na svetlobi

Spojine tega tipa so zelo občutljive na ultravijolično svetlobo. Zato smo vodno raztopino Arg-BPC (1 g/100 ml vode) pri 20 °C obsevali z ultravijolično svetlobo valovne dolžine 253,7 nm in merili absorbcijo v območju valovnih dolžin od 230 do 350 nm vsakih 10 minut v toku 70 minut. Rezultati predstavljeni na sliki Fig. 1. potrjujejo, da je spojina stabilna.

Nove soli bepecina, ki so predmet predloženega izuma, lahko uporabimo kot terapevtsko učinkovino, ki jo skupaj z inertnim farmacevtsko sprejemljivim nosilcem pretvorimo v primerno obliko, na primer tablete ali kapsule, in jih nato uporabimo za zdravljenje bolezni in bolezenskih stanj, poškodb organizma, ran, prelomov kosti in opeklin ter virusnih infekcij, kot je bilo predhodno ugotovljeno s farmakološkimi preiskavami.

Predmet predloženega izuma je tudi peroralna farmacevtska formulacija, ki vsebuje amino kislinsko sol bepecina, ki ji primešamo razne pomožne snovi. Kot farmacevtsko sprejemljive pomožne snovi uporabimo v splošnem, povprečnemu strokovnjaku s področja, dobro poznane snovi. Inertne sestavine, oz. farmacevtska pomožne snovi izberemo iz naslednjih skupin:

- polnila kot so: brezvodna laktoza, mikrokristalinična celuloza, škrob, kalcijev fosfat, kalcijev karbonat, maltodekstrin, manitol, trehaloza in drugo;

- veziva kot na primer: mikrokristalinična celuloza, hidroksialkilne celuloze, povidon, celulozni estri, škrob ali njihova zmes;

- razgrajevala kot npr.: škrob, zamrežena natrijeva kroskarmeloza, krospovidon, mikrokristalinična celuloza, natrijeva karboksimetil celuloza in drugo, največkrat v količini 1 -10%.

- stabilizatorji kot na primer alkalijski in zemljoalkalijski hidrogenkarbonati in nekateri izbrani sladkorji, prednostno natrijev hidrogen karbonat in D-manitol, ·· ·· ·· ·· ... ..

- snovi za mazanje in izboljšanje drsenja pri tabletiranju: smukec, magnezijev stearat, stearinska kislina, kalijev stearat in koloidni silicijev dioksid. Te snovi običajno dodamo k ostalim sestavinam v končni fazi.

Po primerjavi stabilnosti soli bepecina v raztopinah z različno kislostjo vidimo, da so te spojine najbolj stabilne v rahlo kislem, nevtralnem ali celo v rahlo alkalnem mediju, prednostno v območju pH od 6,5 do 8,5. Zato je to smiselno upoštevati pri sestavi farmacevtskih formulacij. Pri pripravi granulatov za tabletiranje in kapsuliranje je koristen dodatek rahlo alkalnih snovi kot so: alkalijski in zemljoalkalijski hidrogen karbonati in karbonati, bazični karbonati in oksidi, kot na primer: natrijev hidrogenkarbonat, kalcijev hidrogenkarbonat in magnezijev oksid, ki dodatno izboljšajo stabilnost. Dodatek izbranih sladkorjev služi za preprečevanje Maillardove reakcije. Farmacevtske formulacije pripravljamo po postopkih, ki so znani, kot na primer direktno mešanje, suha granulacija, mokra granulacija ali s pršenje raztopine soli bepecina na inertne farmacevtske snovi ob hkratnem sušenju v protitoku toplega zraka. Tako dobljenemu granulatu po potrebi dodamo še druge sestavine, homogeniziramo in tabletiramo ali kapsuliramo na običajen način. Tablete, kapsule ali dražeje lahko v končni fazi tudi prevlečemo z zaščitnim filmom, ki je odporen proti delovanju želodčnega soka tako, da se bepecin sprošča šele v črevesju.

Amino kislinska komponenta v obravnavanih novih soleh je vzrok za večjo hidrofobnost učinkovine v tej obliki. Zato realno pričakujemo boljši prehod skozi biološke membrane, kar omogoča tudi pripravo praparata za delovanje skozi kožo - na primer kreme, mazila ali obliža.

Transdermalni sistem je sestavljen iz hrbtne strani nepropustne za aktivno snov , polimerne plasti, ki služi kot rezervar za aktivno učinkovino in je občutljiva na pritisk in zaščitno folijo, ki je na več mestih perforirana, da skoznjo pronica učinkovina ter zunanje zaščitne folije.

Amino kislinske soli bepecina lahko uporabljamo tudi v obliki raztopine, klizme, injekcije ali suhe injekcije. V tem primeru uporabimo kot topilo ali vodno raztopino pufra z optimalno vrednostjo pH med 6 in 8, prednostno med 7,0 in 7,5. Raztopino lahko steriliziramo s fino filtracijo skozi filter s porami 0,22 pm ali z zelo kratkim segretjem na 100 °C. Suho injekcijo pripravimo tako, da sterilno raztopino, ki vsebuje sol bepecina, pufer in konzervans, zamrznemo v ampulah in liofiliziramo.

Raztopino za očesne ali nazalne kapljice pripravljamo z uporabo izotonične in izohidrične raztopine s pH vrednostjo od 7,0 do 7,5, ki poleg aktivne snovi, soli bepecina, vsebuje še pufer in konzervans, ter je sterilno filtrirana.

Za pripravo svečk za rektalno in vaginalno uporabo vzamemo kot osnovo želatino, kakavovo maslo, naravne ali polsintetske maščobe z nizkim tališčem, parafin, glicerin, polietilenglikole z molsko maso od 1000 do 6000 v katere vmešamo vodno raztopino amino kislinske soli bepecina. Dodamo še emulgatorje, antioksidante in konzervanse. Soli bepecina lahko uporabljamo tudi v obliki kreme, mazila ali gela. V tem primeru kot osnovo vzamemo lipofilno, hidrofilno ali amfifilno maščobno osnovo na osnovi naravnih rastlinskih ali živalskih maščob, naravnih olj , ki jim dodamo še konzervanse, barvila, konzervanse, emulgatorje, vodo ali puferne raztopine in antioksidante.

Bepecin je spojina, ki učinkuje v zelo nizkih dozah. Pri peroralni uporabi so terapevtske doze od 10'⁵ do 10'² mg/ kilogram telesne teže, odvisno od vrste in teže bolezni. Običajna doza v tabletah, dražejih ali kapsulah bo od 0,1 do največ 5 mg. Pri lokalni uporabi so koncentracije višje, od 0,001% do 0,5%. Določitev optimalne doze je stvar presoje in izkušenj. Pri tem je zelo pomembno, da bepecin ne kaže nobenih stranskih učinkov ali toksičnosti. Glede na to in njegove številne ugodne učinke na organizem obstaja tudi možnost njegove uporabe v obliki prehranskega dopolnila v zelo nizkih dozah, od 1 pg do največ 0,1 mg dnevno. V ta namen pripravljenih formulacijah se lahko kombinira tudi z vitamini, minerali in drugimi ugodno delujočimi snovmi.

V smislu izuma lahko dodamo tudi druge, posamezne aktivne snovi, ki izboljšajo osnovno delovanje bepecina oziroma delujejo sinergistično.To so snovi iz naslednjih skupin:

- snovi z antibiotičnim delovanjem, kot na primer gentamicin, azitromicin, ampicilin, cefalosporini in doksociklin, zlasti v formulacijah za lokalno uporabo, kjer želimo hkrati doseči antivirusno in antibiotično delovanje. Primer so piki klopov, kjer je naš namen hkrati preprečevati borelijo in klopov encefalitis;

- snovi z antioksidantnim delovanjem, na primer suhi ekstrakt zelenega čaja, koencimQio, idebenon, kurkumin, abigenol, piknogenol in drugi.

Posebno je zanimiva kombinacija s koencimom Qi₀ ali ubikinonom, ki je zelo učinkovit antioksidant in lovilec prostih radikalov, poleg tega pa se lahko uporablja pri obolenjih srca, ki so v zvezi z zmanjšanjem pretoka krvi, previsokim krvnim tlakom in pri znakih ·* ·· ·· ·· ·- · « « srčnega popuščanja. Zelo pomemben antioksidant je v zadnjem času tudi kurkumin, ki deluje tudi močno antikancerogeno.

Naše raziskave so pokazale, da bepecin in njegove soli zelo ugodno delujejo pri zdravljenju bolezni živčevja, na primer multiple skleroze. To je vnetno obolenje, kjer pride do poškodb mielinske ovojnice živčevja v možganih in hrbtenjači. Živčne celice komunicirajo s pošiljanjem električnih signalov po živčnih vlaknih - aksonih, kjer služi mielinska ovojnica kot izolator. V primeru poškodb mielinskih ovojnic je prenos električnih signalov prekinjen ali močno moten. Pri multipli sklerozi telesu lastni imunski sistem napada in poškoduje mielinske ovojnice.

Zares učinkovitega zdravila za multiplo sklerozo ni. Obstoječa terapija poizkuša izboljšati stanje po napadih bolezni, preprečevati nove napade, vendar je običajno povezana z raznimi stranskimi učinki ali pa je slabo sprejeta.

Bepecin ima antiinflamatorno, reparativno, zaščitno in imunomodulatorno delovanje.

Na osnovi rezultatov farmakoloških preiskav upravičeno pričakujemo dobro terapijsko delovanje bepecina na multiplo sklerozo. Prav tako bi lahko bila koristna uporaba formulacija z L-argininsko soljo bepecina pri adjuvantnem zdravljenju sekundarnih poškodb in motenj, ki nastanejo zaradi infekcije z lymsko boreliozo (L. Reik et ali., Neurology, 46, 1989, 790 - 795) ali sifilisom (D. Grey, The Lancet, July 12, 1986, 75 77). V vseh teh slučajih pride do poškodb mielinskih ovojnic in lezij v možganih, kar je vidno z MRI.

Pri zdravljenju multiple skleroze bomo uporabljali peroralne pripravke s solmi bepecina v stabilizirani obliki in v dozah od 1 mg do 5 mg. Ti pripravki ne povzročajo nobenih škodljivih ali neprijetnih stanskih učinkov in so zato popolnoma varni tudi za dolgotrajno uporabo.

Na osnovi rezultatov farmakoloških eksperimentov na živalih smatramo, da bo uporaba bepecina v obliki ustrezne farmacevtske formulacije zelo koristna tudi pri drugih obolenjih živčne etiologije, kot so nevropatija , miastenija gravis in drugo.

Bepecin ima tudi zelo ugoden učinek pri reorganizaciji kolateralnih krvnih žil po resni poškodbi femoralne arterije.

Izum pojasnjujejo naslednji izvedbeni primeri, ki so namenjeni za pojasnitev postopka in v nobenem primeru izuma ne omejujejo. Primeri od 18 do 44 opisujejo poskuse za ugotavljanje farmakološke aktivnosti bepecina. Napravljeni so bili z uporabo ·· ·· ·· ·· ··· . · različnih, v praksi široko uporabljanih eksperimentalnih modelov »in-vitro« ter »in-vivo« in z navedbo literaturnih virov. Bepecin je bil uporabljen v obliki soli z L-argininom.

Kratek opis slik

Fig. 1. Prikaz stabilnosti raztopine bepecina pri obsevanju z ultravijolično svetlobo, absorbcija vzorca od 1 do 7 je merjena vsakih 10 min.

Fig 2. Prikaz delovanja bepecina na celice melanoma B-16.

Fig. 3. Prikaz učinka bepecina na virus klopovega encefalitisa (ΤΒΕ):

A: istočasna aplikacija 10² virusa TBE (i.c.v.) in slanice 0,9% NaCI (i.p.), brez bepecina.

B: istočasna aplikacija 10² virusa TBE (i.c.v.) in bepecina 10pg/kg (i.p.).

Simptomi okužbe so znatno kasnejši.

C: Aplikacija bepecina 10pg/kg (i.p.) 4 ure pred infekcijo z virusom 10² TBE (i.c.v.). Ni kliničnih znakov bolezni. Po 30 dneh so živali usmrčene , del možganskega homogenizata pa prenešen na novo žival, glej: D.

D: istočasna aplikacija možganskega homogenizata in nova okužba s 10² TBE (i.c.v.) Tudi po 50 dneh ni nobenih znakov bolezni.

Fig. 4. ¹H-NMR spektri soli bepecina posneti v D₂O:

A - spekter bepecin L-lizinijeve soli (1 : 3),

B - spekter bepecin L-argininijeve soli (1 : 2),

C - spekter bepecin L-ornitinijeve soli (1 : 2).

Fig. 5. Predstavitev kolateralnega krvnega ožilja:

A : kontrolna skupina, ki je prejela samo lokalno kopel s slanico za 1 min, kjer ni videti kolateralnega vaskularnega ožilja;

B : testna skupina, ki je prejela bepecinsko kopel za 1 min- izkazuje bogato kolateralno vaskulamo ožilje z polnimi medsebojnimi povezavami.

PRIMERI

PRIMER 1. Priprava bepecin D -argininijeve soli (1:2)

Bepecin trifluoroacetat (500 mg, 0,34 mmola) raztopimo v 25 ml vode, med mešanjem postopoma dodamo D-arginin (212 mg, 1,22 mmola) in mešamo še 15 minut. Nato z razredčeno ocetno kislino (50 %) nastavimo pH raztopine na 7,40 ± 0,05. Raztopino bistro filtriramo, zamrznemo in liofiliziramo. Liofilizat raztopimo v majhni količini vode in nanesemo na start HPLC kolone (premer=2,2 cm, višina=25 cm, sorbent Reprosil C18, 10 μ), predhodno izprane in uravnovešene s čisto vodo. Eluiramo z rastočo ·· ·· · · · · ··<

koncentracijo izopropanola v vodi: v 30 min od 0 do 5 % izopropanola. Začetne frakcije, ki vsebujejo soli in nečistoče odločimo. Glavno frakcijo zberemo in jo liofiliziramo. Dobimo 550 mg suhe soli, ki vsebuje 2 mola D-arginina na 1 mol pentadekapeptida..

Amino kislinska analiza ustreza sestavi:

2-Ala, 1-Val, 3-Gly, 4-Pro, 1-Leu, 2-Asp, 1-Glu, 1-Lys , 2-Arg.

MS (TOF MS ES+): = 1419,8 (pentadekapeptid + H)

M₂ = 175,1 (D-arginin + H)

FTIR v (cm¹): 3275, 3057, 2958, 2872, 1628, 1533, 1448, 1394, 1315, 1244, 1204, 1161, 1096, 1044, 919, 875.

Specifična sučnost (c = 1 g/100 ml) [a]_D ²⁸ = -154 °. HPLC čistost: 99,48 %.

PRIMER 2. Priprava bepecin L-argininijeve soli (1:1)

Pripravimo raztopino bepecin acetata in L-arginina na enak način kot opisujemo v primeru 1. Z razredčeno ocetno kislino (50 %) nastavimo pH vrednost raztopine na 4,60 ± 0,05. V nadaljevanju raztopino obdelamo enako kot v primeru 1. Dobimo 232 mg amorfne snovi, ki vsebuje 1 mol L-arginina na 1 mol bepecina.

Amino kislinska analiza ustreza sestavi:

2-Ala, 1-Val, 3-Gly, 4-Pro, 1-Leu, 2-Asp, 1-Glu, 1-Lys, 1-Arg.

MS (TOF MS ES+): Μ_Ί = 1419,8 (pentadekapeptid + H)

M₂= 175,1 (L-arginin + H)

FTIR v (cm¹): 3265,3060, 2960, 2875, 1629 (CONH), 1534, 1448, 1394, 1312, 1243, 1202, 1160, 1043, 919, 873.

Specifična sučnost (c = 1 g/100 ml) [a]o²⁸ = -119.0 °. HPLC čistost: 98,57 %.

PRIMER 3. Priprava bepecin L-argininijeve soli (1:2), (okr. Arg-BPC)

Bepecin acetat (1 g, 0,705 mmola) in L-arginin (420 mg, 2,41 mmola) raztopimo v 4 ml vode (pH vrednost raztopine znaša 8,92) in mešamo 20 minut. Nato z razredčeno ocetno kislino (50 %) nastavimo pH na 7,40 ± 0,05. To raztopino nato nanesemo na start HPLC kolone (premer 2,2 cm, višina 25 cm, sorbent: Reprosil C18, 10μ) predhodno dobro izprane in omočene s čisto vodo. Eluiramo gradientno z rastočo koncentracijo izopropanola v vodi: v 30 min od 0 % do 5 % izopropanola. Frakcije, ki vsebujejo soli in nečistoče zavržemo. Glavno frakcijo liofiliziramo. Dobimo 1,10 g bele amorfne soli, lahko topne v vodi.

Amino kislinska analiza ustreza sestavi:

2-Ala, 1-Val, 3-Gly, 4-Pro, 1-Leu, 2-Asp, 1-Glu, 1-Lys , 2-Arg.

MS (TOF MS ES+): M! = 1419,8 (pentadekapeptid + H)

M₂ = 175,1 (L-arginin + H)

FTIR u (cm'¹) : 3271, 3057, 2958, 2875, 1632 (CONH), 1539, 1448, 1394, 1244, 1205, 1161, 1097, 1044, 919, 873,652

Specifična sučnost (c = 1 g/100 ml) [a]_D ²⁸ = -124,3 °. HPLC čistost: 99,54 %.

¹H-NMR spekter je prikazan na sliki Fig. 4/B.

PRIMER 4. Priprava bepecin L lizinijeve soli (1:3), (okr. Lys-BPC)

Bepecin acetat (500 mg, 0,34 mmola) in L-lizin (176 mg, 1,2 mmola) raztopimo v 3 ml vode in mešamo 20 minut. Raztopino nato nanesemo na HPLC kolono in jo čistimo kot je opisano v primeru 3. Dobimo 283 mg bele amorfne snovi, ki je lahko topna v vodi.

Amino kislinska analiza ustreza sestavi:

2-Ala, 1-Val, 3-Gly, 4-Pro, 1-Leu, 2-Asp, 1-Glu, 4-Lys

MS (TOF MS ES+): Mi = 1419,8 (pentadekapeptid + H)

M₂= 147,1 (L-lizin + H)

FTIR v (cm'¹) : 3269, 3060, 2958, 2875, 1981, 1627 (CONH), 1532, 1447, 1393, 1315, 1241, 1203, 1160, 1008, 919, 873, 654

Specifična sučnost (c = 1 g/100 ml) [a]_D ²⁸ = -130 °. HPLC čistost: 99,47 %.

¹H-NMR spekter je prikazan na sliki Fig. 4/A.

PRIMER 5. Priprava bepecin L ornitinijeve soli (1:2), (okr. Orn-BPC)

Bepecin acetat (500 mg, 0,34 mmola) in L-ornitin (177 mg, 1,05 mmola) raztopimo v 5 ml vode in z razredčeno ocetno kislino nastavimo pH vrednost na 7.40 ± 0,05. Raztopino nato očistimo na HPLC koloni kot je opisano v predhodnem primeru. Dobimo 412 mg bele amorfne snovi, lahko topne v vodi.

Amino kislinska analiza ustreza sestavi:

2-Ala, 1-Val, 3-Gly, 4-Pro, 1-Leu, 2-Asp, 1-Glu, 1-Lys, 2-Orn

MS (TOF MS ES+): M! = 1419,8 (pentadekapeptid + H)

M₂ = 170,1 (L-Orn + H)

FTIR u (cm'¹) : 3269, 2958, 2875, 2162, 1636 (CONH), 1522, 1442, 1389, 1311,

1243, 1203, 1160, 1094, 1040, 911, 873, 654, 610

Specifična sučnost (c = 1 g/100 ml) [a]_D ²⁸ = -137 °. HPLC čistost: 99,30 %.

¹H-NMR spekter je prikazan na sliki Fig. 4/C.

PRIMER 6. Tablete

Sestavina: mg/ tableto:

Arg-BPC 1,00

Celuloza Avicel 20,04

Laktoza brezvodna 60,53

Natrijev hidrogen karbonat 2,25

Krospovidon 5,25

Koloidni silicijev dioksid 0,33

Magnezijev stearat_0,60

90,00 mg

PRIMER 7. Tablete - filmsko obložene

Sestavina: mg/tableto:

Arg-BPC 2,00

Trehaloza 96,20

Hidroksipropilceluloza 11,20

Natrijev hidrogen karbonat 2,60

Kurkumin 5,00

Kroskarmeloza Na 2,00

Magnezijev stearat_1,20

Prevleka rezistentna v žel. soku:

EudragitSIOO 0,48

Amonijev hidroksid , 1 mol/l 0,25

Trietilcitrat 0,24

Talk 0,16

Voda 2,90

PRIMER 8. Očesne kapljice Sestavina:

Arg-BPC 0,50 mg

Natrijev fosfatni pufer 0,05 mol/l, pH 7,4 85 ml

Natrijev klorid 0,44 g

Benzilalkohol_0,20 ml

Voda do skupno

100 ml

PRIMER 9. Kapsule
Sestavine:	mg/ kapsulo:
Lys-BPC	1,0
Natrijev hidrogen karbonat	2,5
Laktoza monohidrat	80,6
Koruzni škrob preželatiniran	15,4
Maaneziiev stearat	0.5
	100 mg
PRIMER 10. Raztopina za lokalno uporabo
Sestavine:	g/100 ml:
Voda za injekcije	20,00
Arg-BPC	0,05
Glicerol	22,00
Benzalkonijev klorid	0,02
Natrijev fosfatni pufer, C,05 mol/l, pH 6,£	i do 100 ml.
PRIMER 11. Gel
Sestavine:	g/100 g
Voda inj.	70,00
Arg-BPC	0,20
Carbopol 974, NoveonR	1,00
Metil-p-hidroksibenzoat	0,18
Propil-p-hidroksibenzoat	0,02
Natrijev hidroksid 0,01 mol/l, za nastavitev pH vrednosti na 7,0
Voda injekcijska do:	skupno 100 ml
PRIMER 12. Krema
Lipofilne sestavine za 100 g kreme: stearinsko kislino, cetearilni in stearilni alkohol,
nasičene srednjeverižne trigliceride s kaprilno	in kaprinsko kislino, silikonsko olje
Dimeticon in natrijev cetearil sulfat, skupaj 16,4 g,	stalimo pri 60°C.
Hidrofilne sestavine: k sterilno filtrirani čisti vodi (70 g) dodamo propilenglikol (3 g) in
konzervans butil-4-hidroksibenzoat (0,5 g), zmešamo in segrejemo na 60°C. Z 0,1

molarno raztopino natrijevega hidroksida nastavimo pH 6,5.

Hidrofilno fazo nato med mešanjem dodamo k lipofilni fazi, hladimo in mešamo toliko časa, da dosežemo 30-35°C. Tej mešanici dodamo antioksidant tokoferol acetat (0,05

g), dobro premešamo in na koncu dodamo še 10 g vodne raztopine, ki vsebuje 0,1 g Arg-BPC. Dobro premešamo in polnimo v primerne posodice.

PRIMER 13. Supozitorije

Sestavina:	mg/sup.
Arg-BPC	0,5
Voda	25,0
Glicerol	30,5
Kakavovo maslo	180,0
Metil-p-hidroksibenzoat	2,0
Polietilenglikol PEG 1000	61,0
Tokoferol	1,0
	300 mg
PRIMER 14. Orodisperzivne tablete
Sestavina:	mg/tabl
Arg-BPC	0,5
StarlacR	48,9
Acesulfam K	0,4
Magnezijev stearat	0,1
Koloidni silicijev dioksid	OJ

50,0 mg

PRIMER 15. Transdermalni preparat - obliž

Aktivni sestavini: Arg-BPC (5,0 mg) in doxocilin (1,0 g), raztopimo v mešanici vode (10 g), dietilenglikolmonoetiletra (1,8 g), polietilenglikol - monolaurata (0,5 g) in dietanolamina (0,2 g), Dodamo 25 g polimerne raztopine GEL VA. RTM.2484 (Monsanto) in dobro premešamo. Nato pustimo raztopino stati 20 min, da se odzrači. Nato jo nanesemo na nepropustno membrano, (polietilenski film ali aluminizirani polietilenski film, na primer: 3M-Scotchpack 1006) in posušimo pri 40 do 50°C. To plast nato prekrijemo s porozno folijo za kontrolirano sproščanje snovi in zaščitno folijo ter jo razrežemo na primerno velikost.

PRIMER 16. Tablete s podaljšano stabilnostjo

Preformulacija:

Bepecin L-argininijevo sol (1 : 2) (1,0 g) in D-manitol raztopino v 20 ml vode , sterilno • · ·· - · «· ..

filtriramo (0,22 μ filter) in liofiliziramo. Dobimo bel amorfen prah, ki vsebuje 50 % soli bepecina.

Priprava tablet:

Sestavina:	mg/tableto
Preformulirani Arg-BPC (50 %)	2,0
D-manitol pharm. (Pearlitol 300DC)	70,0
Celuloza Avicel (PH 102)	25,0
Natrijev hidrogen karbonat	1,3
Koloidni silicijev dioksid (Aerosil200)	0,7
Maaneziiev stearat	LP

100 mg

Test stabilnosti:

Tablete pripravljene po zgornjem postopku smo inkubirali pri -15 °C, 25 °C in pri 50 °C / 65 % relat. vlažnosti. Vsebnost bepecina smo določili s HPLC metodo. Čas inkubacije: 18 mesecev.

Temperatura: -15°C 25 °C 50 °C

Vsebnost bepecina: 99,8 % 96,6 % 92,35 %

Če uporabimo metodo ekstrapolacije lahko zaključimo, da bodo tablete pri sobni temperaturi stabilne najmanj 2 leti.

PRIMER 17. Prehranski dodatek z bepecinom - šumeče tablete

Sestavina:	mg/tableto:
Arg-BPC	0,1
Glukoza	150,0
Fruktoza	29,0
Vitamin C	50,4
Natrijev hidrogen karbonat	30,0
Naravna aroma	0,5
260 mg

PRIMER 18. Delovanje na NO sistem

Dušikov oksid (NO) ima vlogo signalne molekule v endotelijskih in živčnih celicah, pa tudi kot tako imenovana ubijalska molekula, ki jo aktivirajo imunske celice. Na splošno, * * · * * · · tako pri višku, kot pri pomanjkanju NO izgleda, da NO močno prispeva k nastanku različnih nepravilnosti in motenj v organizmu, kot so na primer: hipertenzija, angina, impotenca, cirkulatorni in septični šok, srčne napake, aritmije, kap, vnetni procesi, adhezija in agregacija krvnih ploščic in levkocitov, slabo celjenje ran in opeklin, poškodbe mišic, tetiv, ligamentov in kostnih prelomov, gastrointestinalne lezije, diabetes, pankreatitis, cirkulatorni in septični šok, aritmije, endotelijske motnje, srčne napake in Parkinsonova bolezen.

Bepecin ima značilno lastnost, da vpliva na sproščanje in normalizacijo nivoja NO ter deluje proti snovem, ki NO blokirajo, kot L-NAME in proti povečani koncentraciji NO prekurzorjev, kot je L-arginin. Prav tako delovanje bepecina na NO sistem nam do neke mere tudi pojasnjuje zelo širok spekter njegove farmakološke učinkovitosti.

Z metodami opisanimi v literaturi: Regul. Pept. ,2009, 156 (1-3).83-89: J. Pharm. Sci., 2008,108 (1), 7-17, in Eur. J. Pharmacol., 1997, 332 (1), 23-33, smo eksperimentalno dokazali, da bepecin lahko povzroči sproščanje NO »in-vitro« in nasprotuje učinkom L-NAME. Tako normalizira motnje v krvnem tlaku, ki jih posledično povzroča NO. Bepecin zaščiti tudi proti aritmijam povzročenim z metildigoksinom (6 mg/kg, i.v. ali i.p.), če se uporabi v dozah 10 ng do 10pg/kg telesne teže, parenteralno ali peroralno. Preprečuje poslabšanje lezij, ki jih povzroči NO-blokator L-NAME. Bepecin deluje na obe, tako visoko kot nizko vrednost NO in jo normalizira.

Bepecin običajno deluje modulatorno v NO sistemu, če se uporablja v dozah od 10 ng do 10 pg/kg tel. teže. Preprečuje poslabšanje lezij, ki jih povzroča NOS blokator LNAME.

PRIMER 19. Učinek na celjenje ran

Z uporabo metod, podrobno opisanih v literaturi: J. Physiol. Pharmacol., 2009, 60 (Sup. 7) ,191-196; J. Orthop. Res., 2010, 28 (9), 1155-1161; Burns, 2005, 31 (3), 310315; Bone, 1999, 24 (3), 195-202; Surg. Today, 2007, 37 (9), 768-777. smo ugotovili, da bepecin na osnovi delovanja na tvorbo novega tkiva, angiogeneze in proizvodnjo kolagena, znatno pospeši celjenje:

- ureznin na koži,

- globokih opeklin kože,

- različnih anastomoz kot intestinalnih ran,

- različnih fistul,

- raznih prerezanih tkiv, zlasti vezi, tetiv, mišic in živcev,

- prelomov kosti, vključno s hkratnimi poškodbami mehkega tkiva,

- ran na roženici, tudi pri abraziji celotnega epitela ali pri razjedi roženice.

Na osnovi teh rezultatov in velike podobnosti procesov celjenja pri podganah in ljudeh, se bo bepecin lahko uspešno uporabljal za celjenje ran, opeklin in prelomov kosti pri ljudeh.

PRIMER 20. Zaščita endotelija, angiogeneza, tromboza in motnje pri krvavitvah

Na osnovi dalj časa znanih objav (J. Physiol. Pariš, 1993, 87, 313-27; Inflammopharmacol.,2006, 14, 214-21; Curr. Pharm. Des., 2010, 16, 1224-34, smo dokazali, da bepecin vpliva na dogajanje pri izgubi vaskularne integritete. Bepecin ureja in ohranja stanje endotelija po intragastričnem vnosu absolutnega etanola (i.e., kaže se citoprotektivno delovanje). Prav tako bepecin vpliva na zdravljenje poškodb tako v gastrointestinalnem tkivu kot izven njega. V nadaljevanju smo prikazali, da po anastomozi abdominalne aorte pri podganah, uporaba bepecina preprečuje nastanek zamašitve s trombi, najmanj 24 ur. Če pa ga damo v primeru že formirane tromboze in vaskularne zamašitve, hitro to zamašitev s trombom razkroji, hkrati pa se ohrani tudi funkcija spodnjega uda.

V drugih poizkusih na podganah, po amputaciji, smo ugotovili, da bepecin dosledno deluje proti predolgi krvavitvi in trombocitopeniji. Tudi če sta dolga krvavitev in trombocitopenija nastali zaradi aspirina, warfarina in heparina. Bepecin je bil dan intraperitonealno, intravenozno ali intragastrično (10 ng/kg , 10 pg/kg tel. teže). Važna ugotovitev pri preprečevanju in eliminaciji že nastalega strdka, podaljšane krvavitve ali trombocitopenije, nastale zaradi uporabe res velikih doz heparina (250 mg/kg, 25 mg/kg in 10 mg/kg, i.v.), warfarina (1,5 mg/kg, i.a., enkrat dnevno v 3 zaporednih dnevih) in aspirina (0,1 g/kg, i.g., enkrat dnevno v 3 zaporednih dnevih, ali 1 g/kg, i.p.,enkrat) je bila, da bepecin sam po sebi ne deluje na koagulacijske parametre. Glede na vse to, bi lahko terapijo z bepecinom razširili na vsa pomembna stanja, kjer se pojavljata tromboza in nepravilnosti v krvnem obtoku. Bepecin bi lahko bil tudi izvirna terapija stanj, kjer je moteno delovanja gena egr-1.

PRIMER 21. Nastanek adhezij

Naše predhodne raziskave so pokazale izrazit učinek bepecina na vnetne procese in njihove posledice. Dodatno k temu smo ugotovili tudi terapijski učinek bepecina na nastanek adhezij (zlepljanja) in zaščito pred adhezijami (ali najmanj znatno zmanjšanje).

S kirurško odstranitvijo parietalnega peritoneuma pri podganah po metodah opisanih v Gastroenterology, 2010, 138 (5, Suppl.1), 753; ileo-ilealne anastomoze po Surg. Today, 2007, 37(9), 768-777; jejuno-ilealne anastomoze po Dig. Dis. Sci., 2009, 54 (10), 2070-2083; smo ugotovili, da bepecin v splošnem zmanjša nastanek adhezij (makroskopsko in mikroskopsko ) združeno s funkcionalnimi izboljšavami (ojačanje anastomoze, porast teže živali do normalnega nivoja). Pri tem je bil bepecin uporabljen v obliki soli z L-argininom (2 ; 1) in v nizkih dozah od 10 pg do 10 ng/kg telesne teže, parenteralno, per os ali lokalno.

Podobnost med živalskim modelom in pogoji v človeškem organizmu, v katerih pride do antagonizma adhezij, omogočajo možnost terapevtske uporabe bepecina v ta namen.

PRIMER 22. Imunomodulacija

Imunomodulacija (posebno kot vitalna funkcija makrofagov), ki jo povzročijo naravne ali sintetske snovi, se smatra kot dobra alternativa za preprečevanje in zdravljenje tako infekcijskih kot neoplastičnih bolezni.

Z uporabo metode opisane v J. Physiol. Pharmacol., 2009, 60, Suppl.2, 69, smo določili »in-vivo« učinkovitost bepecina v povečanju aktivnosti makrofagov kot glavnihimunološko aktivnih celic pri miših (i.e., povečana gibljivost makrofagov , obnovitev razmerja M/P med mononuklearnimi in polinuklearnimi levkociti). Miškam smo dnevno vbrizgali 50 oz. 100 pg/kg 1.1. (i.p.) bepecina v treh zaporednih dnevih. Aktivirani makrofagi sprožijo proizvodnjo in sproščanje faktorjev, ki regulirajo delovanje B-, T-, in NK - celic, kar je važno za imunomodulatorno delovanje. To imunomodulatorno učinkovanje bepecina bomo lahko koristno uporabili kot pomoč pri terapiji nekaterih infekcijskih oziroma neoplastičnih boleznih.

PRIMER 23. NSAIDs - nesteroidna protivnetna sredstva

Kot smo že ugotovili ima bepecin močno delovanje na vse vnetne parametre, hkrati z močnim izboljšanjem zdravljenja ter preprečevanjem lezij in poškodb.

Paracetamol, aspirin, diklofenak, ibuprofen in podobne spojine so v večjih, pa tudi že v običajnih dozah toksične in imajo številne stranske učinke opisane v literaturi: J. Physiol. Pharmacol., 2010, 61 (2), 241-250; Gastroenterology, 2010, 138 (5, Suppl.1),

S-369. To se kaže zlasti v nastanku želodčnih, črevesnih in jetrnih lezij, krvavitvah, povečanju vrednosti bilirubina, encimov AST in ALT, encefalopatija jeter in drugo. Arg-BPC učinkovito antagonizira povečano krvavitev po uporabi aspirina (1 g/kg i.p.) ali diklofenaka (12,5 mg/kg t.t., i.p.) in to v zelo malih dozah 10 pg do 10 ng/kg t.t., dan peroralno, intragastrično ali kar v pitni vodi.

Arg-BPC deluje proti stranskim učinkom NSAIDs. Še več, glede na njegove dobre učinke na akutno in kronično vnetje (kjer se uporabljajo tudi NSAIDs), bi bilo najbolje uporabljati kar samega, brez NSAIDs.

PRIMER 24. Anafilaksa in anafilaktoidna reakcija

Pri parenteralnem vnosu jajčnega beljaka in dekstrana v organizem pride do resne anafilaktoidne reakcije pri podganah ( B.N. Halper, Histamine, Ciba Found. Symp., J. and A. Churcil Ltd., London, 1956, 92-123 in H. Selye, Endocrinology, 1937,21, 169 ). Naravni ali sintetični polimeri povzročijo masivno sproščanje endogenega histamina. Anestezirane živali so prejele intravenozno raztopine dekstrana v koncentracijah: 6%, 10%, 20%, 40%, 60%, 80% in 90%, in/ali jajčnega beljaka (1 ml/podgano ali 0,15 ml na miš) v rep. Nastal je izrazit edem, ki je obsegal lice, zgornjo in spodnjo ustnico, smrček, tačke in genitalije (izražen z ekstremno cianozo) in slabo respiracijo ter več smrtnih primerov po aplikaciji dekstrana in/ali jajčnega beljaka.

Nasprotno, bepecin v območju doziranja (10 pg, 1 pg, 10 ng, 10 pg/kg) prepreči anafilaktoidno reakcijo in vaskularni kolaps. Znatno pa tudi izboljša delovanje antihistaminikov kot klomipramina (20 mg/kg) in cimetidina (10 mg/kg), ki sta sama v teh pogojih sicer slabo ali nič učinkovita.

Glede na ugotovitev, da so uporabljeni modeli regularni in dobro posnemajo anafilaktoidno reakcijo pri ljudeh, je ugodno delovanje bepecina v anafilaktoidnih pogojih zagotovljeno.

PRIMER 25. Kortikosteroidi

Kortikosteroidi, posebej če so dani sistemično, lahko povzročijo resne motnje (imunosupresija, slabo celjenje ran idr.) Z uporabo metode opisane v literaturi (Med. Sci. Monit., 2010, 16 (3), BR 81-88; in Burns, 2005, 31 (3), 310-315) smo ugotovili, da bepecin v celoti prepreči slabo celjenje ran, ki je posledica uporabe kortikosteroidov (to je 6-alfa-metilprednisolona, 1 mg in 10 mg/kg telesne teže, i.p. pri miših in podganah), delovanje je dosledno prikazano v primeru s kortikosteroidi sistemično tretirane zmečkanine mišic, globoke kožne opekline, presekane Ahilove tetive in srednjega kolateralnega ligamenta, različnih fistul, želodčnih, črevesnih in kožnih poškodb ali kortikosteroidne imunosupresije (preiskava vraničnih celic).

Bepecin je bil uporabljen v dozah od 10 ng do 10 pg/kg tel. teže, parenteralno, peroralno ali lokalno kot tanka plast kreme (to je: 1 pg/g nevtralne kreme).

Glede na dobro primerljivost z razmerami v človeškem organizmu, bi bepecin lahko našel uporabo za odpravljanje motenj, ki jih povzroča uporaba kortikosteroidov in/ali pri nekaterih indikacijah celo namesto njih.

PRIMER 26. Hipertenzija, hipotenzlja in regulacija krvnega tlaka

Eksperimenti na osnovi znanih in opisanih metod, kot na primer v: J. Physiol. Pariš, 1993, 87(5),313-327 in Eur. J. Pharmacol., 1997,332 (1), 23-33, so pokazali, da bepecin nima učinka na krvni tlak pri normotenzivnih živalih, toda lahko zniža povišan krvni tlak kot tudi zviša prenizek tlak. Značilno je, da bepecin zniža povišan krvni tlak pri hipertenzivnih živalih z Goldblatt hipertenzijo z dvema ledvicama - 2K1C - ali z eno ledvico - 1K1C - in je podgana dietno hranjena z veliko fruktoze (80 %) bodisi je na dieti z veliko soli (15 %) v daljšem obdobju; podgana tretirana z NOS blokatorjem LNAME (5 mg/kg, i.v.), ali z veliko dozo KCI i.p. Bepecin prav tako deluje proti hipotenziji, to je normalizira krvni tlak pri podganah s kronično okvaro srca in povišano vrednostjo endotelina-1, z doksorubicinom (2,5 mg/kg, i.p., 6 krat v 15 dneh) povzročeno hipotenzijo , poleg reverzne kronične srčne odpovedi. Torej, bepecin deluje proti hipotenziji pri podganah tretiranih z NO-prekurzorjem L-argininom (100 mg/ kg, i.v.). Bepecin je bil redno dan tako profilaktično kot terapevtsko.

Bepecin v dozah od 10 ng do 10 pg/kg , parenteralno ali oralno, povzroča znatno zmanjšanje ali celo izginotje drugin lezij sicer nastalih v teh procesih.

Pri hipovolumičnem šoku bepecin popravi krvni tlak in prepreči sicer smrtni izid. Tako naj bi povečal izgubo krvnega volumna, ki sicer lahko povzroči smrt.

Glede na znatno podobnost med navedenimi modeli za motnje v krvnem tlaku in motnjami pri ljudeh, je uporaba bepecina upravičena pri terapiji motenj v krvnem tlaku, hipertenziji, hipotenziji in podobnimi nepravilnostmi.

PRIMER 27. Alkohol - akutne in kronične zastrupitve - anestetiki

Raziskave učinkovitosti bepecina pri zastrupitvah z alkoholom so bile napravljene z uporabo metod opisanih v : Curr. Pharm. Des., 2010, 16 (10), 1224-1234; J. Physiol. Pharmacol., 2009, 60 (Suppl.7), 177-181; Eur. J. Pharmacol., 1999, 364 (1), 23-31.

Bepecin v dozah od 10 ng do 10 pg/kg t.t., parenteralno ali peroralno, preprečuje in zavira učinek alkohola v slučaju akutne zastrupitve, odvisnosti, akutnih in kroničnih ran na želodcu in jetrih kot tudi portalno hipertenzijo, ki nastane zaradi akutne uporabe alkohola, ali zaradi daljšega kroničnega pitja alkohola. Po analogiji, bepecin antagonizira simptome odvisnosti pri miših, odvisnih od morfina.

Dodatno, bepecin podobno kot naloxon (10 mg/kg, s.c.) antagonizira anestetsko delovanje morfina (16 mg/kg, s.c.).

Če vzamemo alkohol kot prototip, bepecin nasprotuje delovanju propofola, tiopentala in ketamina. Znižuje učinkovitost tako anestezije kot katalepsije (n.pr.: fentanil, dehidrobenzperidol).

Ker ima uživanje alkohola podobne učinke tudi pri človeku, je bepecin mogoče uporabiti pri akutnih in kroničnih zastrupitvah z alkoholom ter pri odtegnitvenih simptomih (tudi na pr.: pri morfinu in sličnih snoveh) in torej tudi pri anestetikih, kjer uravnava njihovo anestetsko delovanje.

PRIMER 28. Delovanje bepecina na tumorje

Običajen model za raziskavo eksperimentalnih tumorjev je zasledovanje števila metastaz karcinoma in melanoma B-16 pri miših. Ti eksperimentalni tumorji imajo veliko podobnost s tumorji pri človeku.

Ehrlichov ascitični tumor (EAT) lahko raste v vseh sojih miši in se pri teh raziskavah splošno in priznano uporablja. Miši okužene z EAT tumornimi celicami preživijo do največ 25 dni. Predhodna inkubacija miši z bepecinom (2 pg/ml) znatno podaljša preživetje živali, večinoma do konca opazovanja (45 dni). Bepecin preprečuje tudi nastanek nevtropenije, zniža retikulocite in izboljša vrednosti hemoglobina po uporabi citostatika ciklofosfamida.

Poskusi in-vitro.

Delovanje na celice melanoma smo raziskali na celični kulturi človeškega melanoma v mediju RPMI-1840 z dodatkom fosfatnega pufra in antibiotikov. V inkubatorju je kultura celic nastala pri 37°C in v vlažni atmosferi z 5% CO₂ V dobro razvito kulturo celic smo dodali bepecin v koncentracijah 2 pg/ml 2 ng/ml in 10 ng/ml, posebej tudi v kombinaciji z vaskularnim endotelijskim rastnim faktorjem (VEGF - 10 ng/ml) za dobo 48 ur. Zgradbo celic smo opazovali v svetlobnem mikroskopu in s pretočno citometrijo. Po dodatku bepecina v celično kulturo se je gostota melanocitnih celic bistveno zmanjšala. Spremenil se je tudi celični fenotip in sicer iz okroglih melanocitnih celic v vretenaste epitelijske celice s finim celičnim prepletom. Najbolj izstopajoči rezultati so bili vidni pri koncentraciji bepecina 10 ng/ml. Podobne spremembe so bile tudi v slučaju celic najprej stimuliranih z VEGF in nato z bepecinom. Slika Fig. 2.

Analiza s pretočno citometrijo je pokazala, da je pri koncentraciji bepecina 2 pg/ml število celic v S fazi zmanjšano na 20% glede na kontrolo, pri koncentracijah bepecina 2 ng/ml in pri 10 ng/ml na 55%.

S tehniko odtisa VVestern smo ugotovili, da bepecin deluje antimitogeno z zaviranjem z mitogenom aktivirane protein-kinaze (MAPK), ki se odziva na faktor VEGF.

Bepecin ima jasno izražen protitumorski potencial. Z upoštevanjem podobnosti med živalskimi modeli in pogoji pri človeku ter ugodnimi rezultati dobljenimi in-vitro ter invivo, bo uspešen v terapiji tumorjev. Uporaben je pa tudi za zmanjšanje stranskih pojavov pri citostatikih

PRIMER 29. Rane v gastrointestinalnem traktu

Metode in materiali opisani v številnih publikacijah: Curr. Pharm. Des., 2010, 16 (10), 1224-1234; J. Physiol. Pharmacol., 2009, 60 (Suppl. 7), 107-114; Dig. Dis. Sci.,2008, 108 (11), 7-17; Dig. Dis. Sci., 2009, 54 (1), 46-56. so nam služili za ugotavljanje terapevtskega delovanja bepecina v dozah od 10 pg do 10 ng/kg (i.p., i.g.) , primerjalno z referenčnimi standardi na več eksperimentalnih modelih ulkusa (na primer: 24 urni omejitveni stres, podkožni ali intrarektalni vnos cisteamina, vnos 96 odstotnega etanola v želodec, NSAlAs lezije, DNFB (dinitrofluor- benze) lezije, refluksni ezofagitis v pred-, sočasnem in kasnejšem tretiranju. Bepecin je bil apliciran paranteralno ali peroralno.

Na vseh modelih je bepecin učinkovito zaviral nastanek ran in pospeševal celjenje obstoječih ran.

Glede na močno podobnost z motnjami pri ljudeh, bi se bepecin lahko uspešno uporabljal v terapiji vseh ran v gastrointestinalnem traktu.

PRIMER 30. Kalij - hipokalemija in hiperkalemija

Kalij je ključnega pomena za normalno delovanje gladkih mišic srca, prebavnega trakta, skeletnih mišic in živčevja. Za srčni ritem je zelo važna normalna koncentracija kalija, tako prenizka koncentracija (hipokalemija) kot previsoka koncentracija (hiperkalemija) povzročata motnje v srčnem ritmu in številne druge nepravilnosti v organizmu.

Z uporabo metod opisanih v J. Ciin. Exp. Cardiolog., 2012, 3^ 201 smo z aplikacijo furosemida (100 mg/kg, i.p.) po 90 -150 min elektrokardiografsko zasledovali trajanje PR, RR, QRS ih QT intervalov, P, R, S, T valove in njihove amplitude ter dalje analizirali pojav AV blokade, ventrikularnih prezgodnjih utripov in ventrikularne tahikardije. Kljub prisotni hipokalemiji je bil pri vseh z bepecinom (10 pg/kg in 10 ng/kg, i.p. in i.g.) tretiranih živalih ohranjen sinusni ritem, ni bilo prezgodnjih ventrikularnih udarcev, ne ventrikularne tahikardije in AV blokade, niti podaljšanih intervalov in valov s krajšo amplitudo. Bepecin je bil dan 90 min po furosemidu (prisotna hipokalemija, AV blokada 3 stopnje in/ali ventrikularna tahikardija). Znotraj 5-10 min so se v bepecinski skupini normalizirali P, R, S T valovi, trajanje PR, RR, QRS in QT intervalov, RST amplitud, celotni AV blok in je bila ustavljena tahikardija.

Po metodah opisanih v: J. Pharmacol. Sci., 2007, 104 (1), 7-18; J. Pharmacol. Sci.,2006, 102 (3), 269-277 smo prikazali polno delovanje bepecina proti preveliki dozi KCI (intraperitonealno (i), intragastrično (II), in-vitro (III).

Zato bi bil bepecin uporaben kot osnovna terapija za normalizacijo vseh nepravilnosti, ki nastanejo zaradi navzočnosti hipokalemije in hiperkalemije.

PRIMER 31. Kalcij - hiperkalciemija

Kalcij ima v organizmu zelo važno vlogo, ker deluje na celice srčne mišice, krvnih žil in nevronov. Najpogostejši vzrok previsokega nivoja kalcije v organizmu hiperkalciemijeje je primarni hiperparatiroidizem, drugi vzrok je malignost ter granulomatoza. Hiperkalciemija ima številne posledice kot na primer, hipertenzijo, kalcifikacijo mehkih tkiv in roženice očesa ter nefrolitiazo in peptični ulkus. Patofiziološko kalciemijo lahko povzročijo bolezni, ki povečajo aktivnost osteoklastov in kostno reapsorbcijo, ki ji ledvice ne sledijo. Lahko se javlja tudi pri predoziranju z vitaminom D in jemanju kalcijevih nadomestkov - antacidov in tiazidnih diuretikov.

Zelo pogost vzrok je često uporaba blokatorjev kalcijevih kanalov pri pacientih s hipertenzijo.

Bepecin smo raziskali glede na delovanje pri hiperkalciemiji in pri predoziranju blokatorjev Ca kanalov.

Prevelika doza kalcija in podaljšana kalciemija namreč povzroči akutni pankreatitis in pri podganah skrajšanje intervala QT in podaljšanje PQ. Podgane so prejele raztopino CaCb (200 mg in 400 mg/kg, i.p.). Stalno smo snemali EKG in določali K, Na, Cl, amilazo, kreatin-kinazo in LDH (na 5, 10, 15, 25 in 60 min.) in akutni pankreatitis na 60 min kot je navedeno v Dig. Dis. Sci., 1996, 41 (7), 1518-1526: Regul. Pept., 2009,

156 (1-3), 83-89; J. Pharmacol. Sci.,2004, 95 (1), 19-26. Bepecin je bil dan tudi preventivno (10 pg/kg, i.p.) 30 min pred CaC^.

Podgane so prejele bolus verapamila (40 mg/kg, i.p.). Bepecin (10 pg in 10ng/kg, i.p.) je bil apliciran 30 min pred verapamilom (predtretiranje) ali 5 min potem.

Bepecin deluje proti posledicam resne kalciemije, odstrani skrajšanje intervala QT in podaljšanje intervala PQ , deluje proti sicer resnemu akutnemu pankreatitisu ter zmanjša vrednost serumske amilaze.

Verapamil po 5 min povzroči bradikardijo (200 - 230/min) skupaj z drugo stopnjo atrioventrikularnega bloka, ki traja 30 in 45 min. Bepecin ohrani in popravi sinusni ritem (pri terapijski aplikaciji se odstrani tudi atrioventrikularni blok).

Eksperimenti so dokazali, da bepecin preprečuje oziroma obrne vse posledice hiperkalciemije. Zato se lahko uporabi pri preprečevanju te motnje.

PRIMER 32. Delovanje na miastenični sindrom

Miastenični sindrom, ki se odraža v povečani relaksaciji mišic, je bil povzročen po metodi znani iz Acta Neurol. Scand.Suppl., 1984, 100, 39-47 z intraperitonealno administracijo prevelike doze magnezijevega sulfata. Podganam moškega in ženskega spola, telesne teže 200-300 g, intraperitonealno injiciramo magnezijev sulfat (500 mg/kg tel. teže), da nastane močan miastenični sindrom (progresivna slabost, nemoč, slabost v mišicah), ki že po 5 min napreduje do popolne negibnosti.

Bepecin apliciran 15 min predtem ali istočasno z MgSO₄ (10 pg/kg in 10 ng/kg tel teže, i.p.). v celoti deluje proti motnjam povzročenih z magnezijevim sulfatom, tako da vse živali ostanejo normalno aktivne.

Preizkus z mlinom na stopalke pokaže, da po aplikaciji bepecina podgane izboljšajo svoje sposobnosti in tečejo dalj časa kot predtem

Tako bi v splošnem lahko bil bepecin osnovna terapija za normalizacijo motenj, ki se kažejo kot miastenični sindrom in s posebnim delovanjem proti motnjam, ki se pojavljajo pri terapiji z magnezijem. Tako bi bil bepecin lahko tudi osnovna terapija za izboljšanje splošnega delovanja skeletnih mišic.

PRIMER 33. Delovanje pri nevromuskulatornih in nevropsihiatričnih motnjah

Splošno se smatra, da je dopaminski sistem pomemben za delovanje motoričnih funkcij (J. Neural. Transm., 2010 Dec., 117 (12), 1359-69). Z uporabo predhodno že opisanih metod v Life Sci. 2001 March 9, 68 (16), 1905-12 in J. Physiol.Pariš, 2000 March-Apr., 94 (2), 105-110, smo ugotovili, da bepecin na poseben način močno vpliva na dopaminski sistem tako, da deluje proti posledicam blokade dopaminskih receptorjev, katalepsiji, somatosenzornim motnjam povzročenih z nevroleptiki kot haloperidol, flufenazin in klozapin, izčrpanjem dopaminskih veziklov ali z nigrostriatalnim uničenjem dopamina. To se inducira z nevrotoksinom 1-metil-4-fenil1,2,3,6-tetrahidropiridinom (MPTP). Bepecin močno izboljša z MPTP poslabšano somatosenzorno orientacijo in zmanjša z MPTP povzročeno hiperaktivnost in kar je zelo važno MPTP motorne anomalije (tremor, akinezijo in katalepsijo - sicer zelo opazno v kontrolni skupini s slanico). Eliminira pa tudi drugače sicer redno smrten izid pri aplikaciji MPTP v kontrolni skupini.

Kot že omenjeno, bepecin močno deluje na celjenje ran mišic po prerezanju ali udarcu in na celjenje prerezanih živcev, z anastomozo ali brez nje. Posledično naj bi vse to pomenilo, da je bepecin sposoben izboljšati slabo nevromuskulaturno povezavo, torej prenos signalov od živcev na mišice.

Iz tega sledi, da bi se bepecin lahko uporabljal za izboljšanje okvar mišične funkcije na splošno.

Če upoštevamo običajen pomen omenjenih dopaminskih in serotoninskih modelov na živalih in motnjami pri ljudeh, bi se bepecin lahko uporabljal pri zdravljenju odgovarjajočih nevropsihiatričnih nepravilnostih, posebno sorodnih z dopaminskim ali serotoninskim sistemom.

PRIMER 34. Insulin - Diabetes

Z uporabo metode opisane v Skin Pharmacol. Physiol., 2006, 19 (5), 266-274 in J. Physiol. Pariš, 1999 Dec., 93 (6), 501-4, če se aplicira bepecin lokalno pride do znatnega izboljšanja celjenja kožnih ran pri diabetičnih živalih. Ugotovili smo, da bepecin preprečuje razvoj z aloksanom povzročenih razjed, hipertenzijo povzročeno z vnosom fruktoze in odpornost na inzulin. Na enak način bepecin (10 pg/kg) vnešen (i) intraperitonealno ali (ii) intragastrično neposredno za inzulinom, kot proti-ulkusni peptid, poleg proti želodčnim razjedam močno deluje tudi proti vsem motnjam, ki jih povzroči inzulin (v preveliki dozi: 250 lU/kg, i.p.) in usodnim posledicam (na primer: napadom, eventulno usodnim, resnim poškodbam nevronov v hrbtenjači in hipokampusu, hepatomegalijo, zamaščena jetra, sesutje jetrnega glikogena s posledično močno hipoglikemijo).

Tako, da uspešnost bepecinske terapije očividno kaže na možno vlogo bepecina pri kontroli inzulina, in da bepecin verjetno vpliva na več posledic prekomerne uporabe inzulina. Zato bi bila mogoča tudi uporaba bepecina za kontrolo različnih motenj pri diabetičnih pacientih, posebno pri zlo-rabi v insulinski terapiji.

PRIMER 35. Antiinflamatorno delovanje, bolečina in temperatura

Na osnovi pred časom objavljenih člankov (J. Physiol. Pariš, 1993, 87, 313-27, Inflammopharmacol., 2006, 14, 214-21; Curr. Pharm. Desd., Dec. 2010, 16, 1224-34, smo dokazali, da bepecin zmanjša sproščanje mediatorjev vnetja (n.pr.: mieloperoksidaze, leukotriena B4, tromboksana B₂) in-vitro” in in-vivo”. Bepecin uspešno deluje antagonistično na več modelih akutnega nespecifičnega vnetja (npr.: karagenin, terpentin, bombažni drobec), kot tudi pri poškodbah zaradi DNFB. Prav tako, bepecin deluje proti znižanju temperature (test s potapljanjem v vodo) in dvigu temperature (povzročeno s kvasovkami). Bepecin dosledno deluje tako proti vnetni bolečini (ocetna kislina), kot proti ne-vnetni bolečini (MgSO₄).

Bepecin tudi zviša prag za bolečino v karageninskem testu na podganah in kaže antihiperalgezični učinek v Randall-Selitte testu.

Tudi pri prerezanem išiatičnem živcu, brez ali z anastomozo, bepecin močno zmanjša nevropatično bolečino.

Delovanje bepecina na kronično vnetne lezije, kot je adjuvantni artritis in z nesteroidnimi sredstvi (NSAIDs) povzročene lezije je zelo ugoden. Pri zdravljenju dobro razvitega adjuvantnega artritisa (povzročenega s Freundovim adjuvansom), se učinek bepecina zanesljivo pokaže že po dveh tednih zdravljenja in se lahko jasno vidi še eno leto po aplikaciji.

V skladu s tem bi bepecin lahko predstavljal osnovno medikacijo za zmanjšanje negativnih posledic akutnega in kroničnega vnetja, za normalizacijo telesne temperature in posebno za zmanjšanje bolečin.

PRIMER 36. Delovanje pri poškodbah živcev

Z uporabo predhodno že opisane metode v Regul. Pept., 2010 Feb.25, 160 (1-3), 3341, smo prikazali celjenje presekanega išiatičnega živca in izboljšanje z uporabo bepecina (10 pg/kg, 10 ng/kg) po poškodbi (intraperitonealno/intragastrično/lokalno na mestu anastomoze. Izboljšanje je bilo vidno klinično (avtotomija), mikroskopsko-morfometrično in funkcionalno (EMG, en ali dva meseca po poškodbi, izboljšanje hoje v tedenskih intervalih). Z bepecinom tretirane podgane so kazale hitrejšo aksonalno regeneracijo, kar ugotovimo histomorfometrično (povečana gostota in velikost regeneriranih vlaken, epinevralna in perinevralna regeneracija, povečan obseg mieliniziranih vlaken in mielinske ovojnice, večje število mieliniziranih vlaken po površini; elektrofiziološko kot povečana motorna aktivnost in funkcionalno (izboljšan faktor SFI).

Tako bepecin znatno izboljša celjenje išiatičnega živca pri podganah. Glede na ugotovljeno podobnost med eksperimentalnimi modeli in človeško patologijo, bi bili ti izsledki praktično uporabni v terapiji različnih poškodb živcev.

PRIMER 37. Somatosenzorni nevroni, poškodbe motornih živcev, poškodbe možganov in prekinjen prenos signalov na relaciji živci/mišice

Tako disfunkcija kot hiperfunkcija somatosenzornih nevronov se kaže v različnih nepravilnostih kot: kongenitalni nevrosenzorni nevropatiji, povzročeni zaradi diabetesa, herpes zostra, postherpetični nevralgiji, atopičnem dermatitisu, motenem celjenju poškodovanega tkiva, psoriaze, ekcemov, astme, kroničnem artritisu itd. Somatosenzorni nevroni so sistem prve linije obrambe proti poškodbam, kontrolirajo homeostazo in sprožijo tudi primerne ukrepe v slučaju nevarnosti.

Njihova zaščitna sposobnost se vidi pri eksperimentalnih poškodbah kože in gastrointestinalne sluznice s kapsaicinom. Ta snov v visokih dozah razkroji senzorna vlakna, medtem, ko nizka doza (pod 0,5 mg/kg) aktivira sproščanje nevrotransmiterjev in ima zaščitni efekt na sluznico.

V poskusu opisanem v Dig.Dis.Sci.,1996, 41 (8), 1604 -1614, smo uporabili visoko dozo kapsaicina, ki je razkrojila senzorna vlakna. Bepecin uporabljen v dozah 10 pg 10 ng/kg tel. teže živali, per os ali lokalno, močno zmanjša učinek kapsaicina.

Bepecin močno zmanjša tudi posledice možganske poškodbe pri živalih, povzročene s padajočo utežjo. Model je opisan v: Regulat. Pept., 2010, 160 (1-3), 26 - 32.

Tudi poskus z injekcijo sukcinilholina (0,2 mg/kg) v desno mišico - kvadriceps povzroči nevromuskularno motnjo v delovanju mišice zaradi slabega prenosa signala od živca do mišice. Bepecin dan pred injekcijo sukcinilholina , ali potem, v celoti eliminira lokalni efekt sukcinilholina.

Z upoštevanjem nevroprotektivnega delovanja bepecina, ugotovljeno podobnostjo med eksperimentalnimi modeli in človeško patologijo, bi se to praktično lahko pomenilo izboljšanje klinične prakse za terapijo različnih poškodb živcev.

PRIMER 38. Delovanje na encefalopatijo in multiplo sklerozo

Z uporabo predhodno opisanih metod (Eur. J. Pharmacol. 2011, 667, 322-9; Life Sci. 2011, 88, 535-42; J. Physiol. Pharmacol. 2010, 61, 241-50; J. Physiol. Pharmacol., 2009, 60 Suppl 7, 107-14; Regul. Pept.,2010, 160,26-32): smo ugotovili, da bepecin deluje proti vsem faktorjem, ki posledično vodijo do encefalopatije zaradi previsokih doz NSAIDs. Deluje tudi proti posameznim možganskim lezijam, ki nastanejo zaradi prevelikih doz insulina in proti toksičnemu učinku inzulina, ki ogroža življenje (nevarni napadi, resne poškodbe nevronov, hrbtenjače in hipokampusa). Prav tako bepecin lahko zmanjša poškodbe možganov zaradi travmatskih ran.

V sedanjem času se za zdravljenje multiple skleroze in Crohnove bolezni uporablja, natalizumab, humana monoklonska protitelesa z delovanjem proti celični adheziii molekul a4-integrinov.

Z upoštevanjem učinkovitosti bepecina v različnih modelih ulcerativnega kolitisa, že omenjeno učinkovitostjo bepecina pri zdravljenju poškodovanih mišic, živcev in možganov, je pričakovati možen učinek bepecina tudi ha ustreznem modelu za multiplo sklerozo.

Med več različnimi eksperimentalnimi modeli alergičnega encefalitisa je bil kuprizonski model izbran kot najbolj zanesljiv (J. Physiol. Pharmacol., 2013 in Brain, 2006, 129, 1940-1952). VVistar podgane so prejemale 2,5 % kuprizona v dietni hrani , kombinirano z dodatkom bepecina v pitni vodi (10 pg/kg ali 10 ng/kg) ,0,16 pg/ml/12 ml/dan/podgano ali 0,16 ng/ml/12 ml/dan/podgano, do usmrtitve po 4 dneh; dodatno še kuprizon 1 g/kg intragastrično enkrat dnevno in bepecin 10 pg/kg ali 10 ng/kg intragastručno. Tako smo z uporabo večkratne, višje doze kuprizona v hrani pretiravali in pospešili tvorbo poškodb. Nastale so poškodbe v različnih delih možganov, najbolj izrazite na področjih: corpus callosum, laterodorzalni talamus in nucleus reunion. Pri podganah obravnavanih s kuprizonom in bepecinom je bilo dosledno manj poškodb živcev v vseh področjih. Najbolj ugoden učinek bepecina je bil ravno v tistih področjih, ki so bila najbolj prizadeta.

Iz tega sledi, da je v skladu z eksperimentalnimi rezultati bepecin primeren za terapijo vnetne črevesne bolezni in multiple skleroze. Prav tako bi bila uporaba bepecina lahko osnovna terapija pri različnih encefalopatijah.

PRIMER 39. Protivirusno delovanje

ARBO virusi, virusi hepatitisa, herpesa in LCM

Protivirusno delovanje smo preiskovali na novorojenih miškah obeh spolov, starih 24 ur, seva BALB-C. Arbovirusi (TBE = virus klopovega encefalitisa, Bhania, denga tipi 1, 2, 3 in 4, Sindbis, West Nile in Čalovo) , hepatitisa A, (LCM) - virus limfatičnega horiomeningitisa in virusi herpesa tip 1 in 2 so bili uporabljeni i.c. (intracerebralno) ali p.o. (peroralno) - pri hepatitisu A kot virusna suspenzija v razredčenju 10'² (0,02 ml/miš). Doze so bile nastavljene tako, da je primerljivo glede na LD ₁₀o pri 0,02 ml i.c. (ali p.o.pri hepatitisu A) / miško in inokulat v razredčenju 10 '² . Bepecin (20 pg/kg tel. teže) oziroma raztopina NaCI -0,9% (0,02 ml/miš) sta bila aplicirana i.c. ali i.p. in sicer:

i - tretiranje 2 uri pred virusno infekcijo (-2h), ii - istočasno z virusno infekcijo (0), iii - 4 dni kasneje v prisotnosti simptomov infekcije.

Rezultati so prikazani v Tabeli 7.

Pri aplikaciji bepecina pred virusno infekcijo (i) v času opazovanja ni bilo nobenih znakov bolezni ali smrti.

Če je bil bepecin dan hkrati z infekcijo (ii) je prišlo do izbruha bolezni znatno kasneje, po 20 dneh (v kontrolni skupini brez bepecina so vse živali umrle po 5 dneh).

Če je bil bepecin dan v navzočnosti prvih bolezenskih simptomov je bil izbruh bolezni znatno podaljšan (iii).

Številke v tabeli 7 predstavljajo čas, ko vse inficirane živali poginejo (vključno s kontrolno skupino). V drugi kontrolni skupini, kjer so bile samo zdrave živali brez tretiranja ni bilo smrtnih slučajev. Znak + pomeni oralno doziranje, znak a pomeni arbovirus in znak n.d. pomeni, da ni bilo smrtnih slučajev. Vse živali so bile opazovane 40 dni po infekciji.

Virus klopovega encefalitisa

Učinkovitost bepecina proti virusu klopovega encefalitisa na poskusnih miškah je prikazana na sliki Fig.3. Bepecin je bil uporabljen v dozi 0,02 mg/kg telesne teže. Bepecin je znatno podaljšal preživetje poskusnih živali, pri ustreznem doziranju je celo preprečil infekcijo.

Za verifikacijo rezultatov glede virulence uporabljene virusne suspenzije smo odvzeli del možganskega tkiva z virusno suspenzijo (TBE) in hkrati z bepecinom tretirane živali in napravili možganski homogenizat - suspenzijo. S to suspenzijo smo inokulirali nove živali in jih inficirali z novo virusno suspenzijo (TBE). Tako tretirane živali tudi po 50 dneh niso kazale nobenih simptomov bolezni, pač pa so živali, ki so prejele samo slanico namesto možganskega homogenizata poginile v 5 dneh.

Tabela 7:

Vrsta virusa: način vnosa	Čas (dnevi) do nastopa smrti pri miših po infekciji z virusi
Sredstvo za tretiranje živali
Slanica 0,9 %	Bepecin
Aplikacija 2 uri pred virusno infekcijo <-2h)	Aplikacija hkrati z virusno infekcijo (0)	Aplikacija 2 uri pred virusno infekcijo (-2h)	Aplikacija hkrati z virusno infekcijo (0)
'P	ic	'P	ic	'P	ic	'P	ic
TBE3	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Bhania3	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Dengue 1a	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Dengue 2a	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Dengue 3a	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Dengue 4a	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Sindbis3	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
West Nilea	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Calovo3	5	5	5	5	n.d.	n.d.	15	15
Hepatitis A+	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
LCM3	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Herpes type HSV1a	5	5	5	5	n.d.	n.d.	20	20
Nič (zdrave živali)	n.d	n.d	n.d	n.d	n.d.	n.d.	n.d	n.d

Herpes virus

V nadaljevanju študije z uporabo VERO celic (TICD ₅₀, HSV-1 10¹⁰, ID₅o/2oopi in HSV2, 10¹¹ ID 5o/ioo μι , inkubacija za 24, 48 in 72 ur) smo ugotovili, da v in-vitro celularnem sistemu, inokuliranem z virusi HSV-1 in HSV-2, bepecin inhibira HSV reprodukcijo in ščiti celice pred citopatogenim delovanjem HSV virusov.

Delovanje bepecina in-vivo smo ugotovili s poskusi na novorojenih miših seva BALB/C z intracerebralno inokulacijo s HSV-1 v koncentraciji 10¹° ID 50/ιοομΐ in HSV-2 v koncentraciji 10¹¹ ID ₅₀/ιοομι- Bepecin kot sol z argininom smo aplicirali v dozah 10 pg/kg in 100 pg/kg. Kot primerjava so služile skupine netretiranih živali, tretiranih samo s slanico in z aciklovirjem v dozah 10 mg/kg in 100 mg/kg. Vsi agensi so bili aplicirani 48h in v drugi skupini 72 ur po virusni infekciji. Rezultati so pokazali, da bepecin pri letalno okuženih miših znatno zmanjša število obolelih živali in je učinkovitejši od priznanega zdravila aciklovir. Čas preživetja pri miših tretiranih z aciklovirjem je bil 112/105/115 ur (srednji, min., max.), pri bepecinu (pri manjši dozi!) pa znatno daljši: 131/128/135 ur.

Ugotavljamo, da je učinkovitost bepecina v dozah 10 pg/kg in 100 pg/kg večja kot pri aciklovirju v znatno večjih dozah 10 mg/kg in 100 mg/kg - v enakih pogojih testiranja. Podobni rezultati so bili dobljeni tudi v slučaju infekcije z virusom citomegalije CMV. Virus influence A

Študija delovanja bepecina na viruse influence A, tipa H1N1 in H3N2 je bil napravljena na MDCK modelu (Madin Darby Canine Kidney) . Kot gojišče je služil medij MEM (Minimal Essencial Medium) z dodatkom 5% zarodnega govejega seruma in antibiotikov (Naruse N. et al., J. Antibiot., 1991, 44, 733-740). Bepecin kaže zelo močan inhibitorni učinek na viruse influence A že v zelo nizki koncentraciji 32 pg / ml in je znatno močnejši do dosedaj znanih, v ta namen uporabljanih spojin.

Virus mačje levkemije.

Virus mačje levkemije (FeLV) je retrovirus in kot tak se prenaša kot RNA virus, pač pa se RNA reverzno prepiše v DNA. Prenaša se med mačkami s slino ali nosnimi izločki. Imunski sistem živali mu ni kos, zato je okužba za žival smrtna. Bolezen tega tipa je oblika raka krvnih limfocitov (levkemija).

Delovanje bepecina je bilo (s privoljenjem lastnikov) raziskano s poizkusi na 32 mačkah (obeh spolov) v starosti od 6 mesecev do 5 let, ki niso bile predhodno cepljene proti tej bolezni. Vse so bile v močno izraženem stadiju bolezni, test Combo FeLV/FIV *« ·· »· ·· je bil pozitiven. Vse živali so imele visoko temperaturo do 41,5 °C in so imele znake težke bolezni: ikterus, diarejo, tahikardijo, abdominalne bolečine, dehidracijo in depresivnost.

Vse mačke so takoj po ugotovitvi bolezni prejele raztopino bepecina v obliki podkožne injekcije v dozi 1 pg/kg telesne teže ( v 1 ml), enkrat dnevno prvih 8 dni, nato pa peroralno v teku 1 meseca. Izboljšanje je sledilo takoj, temperatura pri živalih je že po 30 min padla za najmanj 1 °C, nato se je stanje postopoma izboljševalo v 1 tednu. Pri nekaterih živalih se je stanje po 4 - 5 dneh sicer ponovno kratkotrajno poslabšalo za 24 ur, nakar se je šesti dan ponovno izboljšalo in je sledilo popolno okrevanje v približno 10 dneh.

Zaključek: mačke, ki niso bile preventivno vakcinirane in obolijo za mačjo levkemijo lahko popolnoma ozdravijo v desetih dneh z dnevno dozo bepecina 1 pg/kg telesne teže. Doslej razen vakcinacije in zelo dragega interferona-omega za to bolezen ni bilo učinkovitega zdravila.

Na osnovi genetske podobnosti virusnih podtipov pričakujemo, da bi bil bepecin učinkovit tudi v primeru nekaterih drugih virusnih infekcij, na primer herpesa varičelezoster (VZV ali HHV-3), virusa Epstein-Barr (EBV), humanih herpes virusov HHV-6, HHV-7, HHV-8 (Kaposi) in čikungunje (CHIKV).

Z upoštevanjem dejstva, da navedeni virusi sprožijo slične bolezenske pojave tudi pri človeku smatramo, da se bepecin lahko uporabi za zdravljenje teh bolezni tudi pri ljudeh, posebno takrat kadar so izgledi za pacienta zelo neugodni (npr. AIDS in AIDSsorodni sindromi).

PRIMER 40. Delovanje na sfinkter

Eksperimentalna metoda za testiranje je natančno opisana v J. Pharmacol. Sci., 2007, 104 (1), 7-18 in J. Pharmacol. Sci., 2006, 102 (3), 269-277. Ugotovili smo, da bepecin (10 pg/kg do 10 ng/kg t.t., parenteralno, ali per os) pri podganah lahko ohranja funkcijo sfinkterja ( ezofagealni sfinkter, pilorusni sfinkter in uretralni sfinkter) in tlak znotraj sfinkterja, ki bi bili sicer moteni. Prav tako lahko hitro popravi funkcijo sfinkterja in njegov tlak, tudi pri bolj dolgotrajnih motnjah ( pri ezofagitisu, akutnem pankreatitisu, transabdominalni urolitiazi in vaginalni dilataciji). Poleg tega bepecin umiri in eliminira ezofagitis in druge motnje, ki so posledica okvare sfinkterja (akutni pankreatitis).

Ker obstaja trdna korelacija uporabljenega modela s patologijo pri ljudeh, bi se bepecin lahko uporabljal kot osnovna terapija pri vseh motnjah povezanih z nepravilnim delovanjem sfinkterja .

PRIMER 41. Prirastek teže pri živalih - veterina

Z uporabo metod opisanih v Dig. Dis. Sci., 2009, 54 (1), 45-56, smo 4 tedne preučevali podgane s stopnjevanim sindromom kratkega črevesa in napredovane izgube telesne teže po resekciji tankega črevesa. Postoperativno se je pojačala izčrpanost živali z upadom telesne teže, dvojnim porastom globine kripta in štirikratnim porastom mišične debeline v prvem tednu, jejunalno in ilealno dilatacijo in motenim razmerjem jejeunum/ ileum. Takoj po aplikaciji bepecina smo zabeležili konstantni prirastek telesne teže, prav tako so se povečali: višina resic, globina kripta in debelina mišic (krožni mišični sloj). Podgane tretirane z bepecinom v dozah 10pg do 10 ng/kg t.t., i.m. ali p.o., niso imele razlike v premeru jejunuma in ileuma. Imele so konstantno razmerje jejunum/ileum in zvišano točko razpočenja anastomoze.

Skladno s tem imajo mladi prašiči tretirani z bepecinomv navedenih dozah od 1 do 21 dneva, bistveni boljši prirastek teže in so brez diareje. Bepecin bi lahko uporabljali za doseganje boljšega prirasta telesne teže in zdravljenje sindroma kratkega črevesa pri farmsko gojenih živalih.

PRIMER 42. Vpliv bepecina na shranjevanje sperme

Splošno je znano, da proces zamrznjenja sperme pri njenem shranjevanju povzroči približno 50 odstotno zmanjšanje gibljivosti zaradi temperaturne spremembe in osmotskega vpliva. Morfološke spremembe se zgodijo zaradi organizacije, prepustnosti in lipidne sestave membrane spermijev.

Ugotovili smo ugodno delovanje bepecina na gibljivost bikove sperme, ki je bila zamrznjena po nekoliko modificirani standardni metodi (v medij je bil dodan bepecin pred zamrzovanjem).

V prvem delu poskusa smo ugotavljali vpliv »in-vitro« najbolj učinkovite doze bepecina, ki je 20 ng/ml, če je sperma tako obdelana pred zamrzovanjem, glede na njeno kvaliteto po odmrznjenju. V drugem delu pa vpliv na obliko spermijev. Rezultate smo vrednotili s fazno-kontrastnim mikroskopom in z računalniško obdelavo ČASA.

Tretiranje z bepecinom pred zamrznjenjem medija izboljša gibljivost po stalitvi pri

37° C glede na kontrolni vzorec sperme (p<0,05, subjektivna metoda : p = 0,0046, ČASA: p = 0,014).

Sočasno tretiranje sperme z bepecinom takoj po staljenju izboljša gibljivost glede na kontrolni vzorec (p<0,05, subjektivna metoda: p = 0,0018, ČASA: p = 0,014).

Glede na te rezultate sklepamo, da ima dodatek bepecina k bikovi spermi pri zamrzovanju zelo dober učinek na in-vitro kvaliteto sperme po odmrznjenju. Za potrditev teh rezultatov bi bila koristna še raziskava in-vivo.

Zaključek: bepecin že po dosedanjih razultatih ugodno vpliva na kvaliteto sperme pri shranjevanju z zamrzovanjem.

PRIMER 43. Učinek po odstranitvi krvne žile

Bepecin ima poseben zaščitni učinek po odstranitvi velikih krvnih žil. Za razliko od učinka L-NAME in L-arginina, bepecin hitro premosti defektno mesto med štrclji krvne žile in tako, v slučaju najslabšega scenarija hitro reorganizira oskrbo s krvjo.

Del femoralne arterije pri podganah (med a. epigastrica caudalis in a. femoralis circumflexa lateralis) smo izrezali, da bi raziskali prisotnost kolateralnih krvnih žil potem, ko je nastala kritična vaskularna poškodba. Prisotnost kolateralnih krvnih žil znotraj defekta smo določili po metodi za mikroangiografijo opisani v Cardiovasc. Res., 1997 Sep., 35 (3), 547-52. Za termografsko snemanje smo uporabili infrardečo kamero.

V kontrolni skupini ni opaziti pojava kolateralnih krvnih žil znotraj vaskularnega defekta v 5 - 10 minutah po odstranitvi določenega dela femoralne arterije pri podganah, ki so prejele lokalno kopel fiziološke raztopine (1 ml/podgano, 5 ml/kg) v trajanju 1 minute, neposredno po nastanku vaskularnega defekta, Slika Fig. 5A.

Tanke kolateralne žile so prisotne, vendar brez medsebojne povezave, sicer znotraj vaskularnega defekta 5-10 minut po odstranitvi določenega dela femoralne arterije pri podganah, ki so prejele lokalno kopel raztopine L-arginina (1 ml/podgano, 100 mg/kg) v času 1 minute neposredno po nastanku vaskularnega defekta.

Področje vaskularnega defekta je kompletno prazno, brez kolateralnih krvnih žil v razdobju 5-10 minut po odstranitvi določenega dela femoralne arterije pri podganah, ki so prejele lokalno kopel L-NAME (1 ml/podgano, 5 mg/kg) v času 1 minute neposredno po nastanku vaskularnega defekta.

V primeru uporabe bepecina vidimo prisotne kolateralne krvne žile s popolno medsebojno povezavo v obliki funkcionalne mreže, ki premosti defekt (potrjeno s termografskim snemanjem) in sicer 5-10 minut po odstranitvi določenega dela femoralne arterije pri podganah, ki so prejele lokalno kopel bepecina (1 ml/podgano, 10 pg/kg) v trajanju 1 minute takoj po nastanku vaskularnega defekta, slika Fig. 5B. To dokazuje, da se adaptacija zaradi bepecina znotraj obstoječih kolateralnih žil zgodi hitro po odstranitvi femoralne arterije in okluzije, z namenom restavriranja poteka krvnih žil in s tem tudi pretoka krvi v ekstremitete.

V bistvu je kasnejša adaptacija arteriogeneza , to je proces remodeliranja kolateralnih krvnih žil, medtem ko je hitra adaptacija vazodilatacija (J. Vase. Surg., 2010 Jan., 51 (1), 165-73). Vseeno pa jasna razlika med L-argininom in bepecinom kaže, da zgodnja adaptacija (za sedaj raziskana v času dnevnih period, ne pa v min periodah) po vaskularni poškodbi ni enostavna vazodilatacija, pač pa poseben premostitveni proces zaradi uporabe bepecina. Tako lahko govorimo o pomembnem procesu, ki zelo vpliva na začetni porast pretoka krvi skozi kolateralne žile tako, da postane trajen. Posledično pride do zelo napredne stopnje in znatnega izboljšanja končnega izhoda (nastanek vaskularnega stebla med obema štrcljema).

Iz rezultatov eksperimenta sledi, da bi bepecin lahko bil kar originalna terapija pri motnjah, kjer je potrebna hitra reorganizacija krvnega pretoka.

PRIMER 44. Akutna toksičnost

V vseh študijah bepecin izkazuje zelo varen profil. Bepecin v obliki di-L-argininijeve soli, (1 : 2) , kakor tudi v obliki vseh drugih soli, apliciran na VVistar albino podganah obeh spolov, v zelo visokih dozah , na primer 1 g/kg telesne teže, intraperitonealno, intravenozno ali intragastrično, ne kaže nobenih toksičnih in stranskih pojavov.

Claims (12)

1. Nove stabilne soli pentadekapeptida s splošno formulo I :

GlyGlu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val . n.BAA 15 10 15 (SEQ D NO.1) kjer BAA pomeni bazično amino kislino in n pomeni 1,2 ali 3.

2. Nove stabilne soli pentadekapeptida s splošno formulo I., kjer so bazične amino kisline arginin, ornitin , lizin in druge, prednostno L-arginin.

3. Postopek za pridobivanje novi soli pentadekapeptida s splošno formulo I. označen s tem, da pentadekapeptid s sekvenco (SEQ ID NO. 1) presnovimo z bazičnimi amino kislinami BAA:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val + n BAA 15 10 15

SEQ ID NO 1

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val . n BAA 15 10 15

SEQ ID NO 1 v molskem razmerju od 1 do 3 molov bazične amino kisline na mol pentadekapeptida (SEQ ID NO.1) v vodni raztopini pri sobni temperaturi, raztopini nastavimo ustrezno pH vrednost s titracijo , nato pa nastalo sol s formulo I. izoliramo v trdni obliki s HPLC kromatografijo in liofilizacijo.

4. Postopek po zahtevku 3, označen s tem, da kot bazično amino kislino uporabimo arginin, lizin, ornitin ali drugo amino kislino v D, L ali DL konfiguraciji, prednostno L-arginin.

5. Postopek po zahtevkih 3 in 4, označen s tem, da pri presnovi 1 mola bazične amino kisline z 1 molom pentadekapeptida (SEQ ID NO. 1) nastavimo pH vrednost raztopine od 4,1 do 5,0, prednostno 4,60 +/-0,05.

6. Postopek po zahtevkih 3 in 4, označen s tem , da pri presnovi 2 molov bazične amino kisline z 1 molom pentadekapeptida (SEQ ID NO. 1) nastavimo pH vrednost raztopine od 6,7 do 7,8, prednostno 7,40 +/-0.05.

7. Farmacevtska formulacija v trdni in tekoči obliki za peroralno, intravenozno, rektalno vaginalno, intramuskularno, lokalno in drugo uporabo, ki vsebuje terapevtsko učinkovito količino soli pentadekapeptida s formulo I. po patentnih zahtevkih 1 in 2.

8. Farmacevtska formulacija po patentnem zahtevku 7, označena s tem , da vsebuje poleg soli pentadekapeptida s formulo I. še eno ali več drugih učinkovin, prednostno antibiotikov ali antioksidantov.

9. Farmacevtska formulacija po zahtevkih 7 in 8, označena s tem, da vsebuje dodatke za povečanje stabilnosti iz skupine alkalijskih in zemljoalkalijskih karbonatov oziroma hidrogen karbonatov, prednostno natrijev hidrogen karbonat.

10. Farmacevtska formulacija po zahtevkih 7, 8 in 9, označena s tem, da vsebuje dodatke za povečanje stabilnosti izbrane iz skupine sladkorjev kot so: D-manitol, trehaloza, sorbitol in slični, prednostno D-manitol.

11. Farmacevtska formulacija po zahtevkih od 7 do 10 za uporabo pri preventivi, zaščiti in zdravljenju naslednjih bolezni in bolezenskih stanj:

- bolezni povezanih s stresom kot so razjede v gastrointestinalnem traktu, vnetja, vnetna bolezen gactrointestinalnega trakta, akutni pankreatitis;

- organoprotektivno delovanje, zaščita in zdravljenje poškodb jeter, zaščita endotelija, preprečevanje adhezij; poškodbe trebušne slinavke, preprečevanje in zdravljenje miokardnega infarkta in možganske kapi, zaščitno delovanje v imunskem sistemu;

- virusnih infekcij, posebno z virusi hepatitisa A, sevov herpesa, influence A, in ARBO virusov kot: klopovega encefalitisa, West Nile, denge tipov 1-4, citomegalovirusa CMV in LCM virusa ter virusa mačje levkenije;

- za zdravljenje melanoma in sorodnih tumorjev;

- pospešeno celjenje ran, opeklin, kostnih prelomov, pretrganih živčnih povezav, pretrgane Ahilove tetive, poškodb hrbtenjače , regeneracija poškodb mišic;

- bolezni in motnje povezane s tvorbo NO: hipertenzija, hipotenzija, anafilaksa, cirkulatorni in septični šok, agregacija trombocitov;

- zdravljenje nevroloških bolezni in nepravilnosti: multipla skleroza, miastenija gravis, lupus erimatozis, disfunkcija somarosenzornih živcev, astma, rinitis, pemfikus in ekcem;

- kateholaminergične disfunkcije, shizofrenija, odvisnost od amfetamina, alkohola in drog;

- preprečevanje in eliminacija težav povzročenih s kortikosteroidi in NSAIDs;

- zdravljenje mokre degeneracije očesne makule;

- kot originalna terapija pri motnjah, kjer je potrebna hitra reorganizacija krvnega obtoka;

- v veterinarski medicini za povečanje prirasta teže živali in za povečanje stabilnosti sperme pri shranjevanju.

12. Uporaba soli pentadekapeptida po zahtevkih 1 in 2 za pripravo formulacij, ki služijo kot prehranski dodatek.