DE69826653T2

DE69826653T2 - Bpc peptid salze mit organ-schützender aktivität, deren herstellung und therapeutische verwendung

Info

Publication number: DE69826653T2
Application number: DE69826653T
Authority: DE
Inventors: Predrag Dr.Sc. Sikiric; Marijan Mr.Sc. Petek; Sven Seiwerth; Branko Turkovic; Zeljko Grabarevic; Ivo Rotkvic; Stjepan Mr.Sc. Mise; Marko Duvnjak; Ivan Udovicic
Original assignee: Sikiric Predrag Drsc
Current assignee: Sikiric Predrag Drsc
Priority date: 1997-05-23
Filing date: 1998-05-20
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2018-05-21
Also published as: SK159599A3; TR199902866T2; RS49733B; JP2000515558A; PL193790B1; EP0983300A1; IL132884A; CA2290739C; BR9809457B1; NZ501323A; CZ299423B6; US6288028B1; JP3492381B2; BR9809457A; EP0983300B1; CN1166683C; DK0983300T3; PT983300E; ID23184A; CA2290739A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Anwendungsformen von synthetischen BPC(Body Protection Compound)-Peptiden, die 8 bis 15 Aminosäurereste umfassen, mit einem Molekulargewicht von 900 bis 1600 Dalton, die eine organprotektive Wirkung aufweisen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in der Diagnose und Therapie.
Proteine und Peptide, die zur Behandlung verschiedener Krankheiten bei Menschen und Tieren geeignet sind, sind bekannt. Viele dieser Mittel werden in vivo hergestellt und können aus Tieren oder Menschen extrahiert werden, um pharmazeutische Zusammensetzungen herzustellen. Beispiele für pharmazeutisch brauchbare Proteine oder Peptide sind Insulin, Erythropoietin, BMPs, Interferone, etc. Ein weiteres Beispiel ist ein Magensaftprotein mit mukosaprotektiver Wirkung, das unlängst isoliert und BPC genannt wurde.
WO 92/04368 betrifft ein BPC, das im Körper eine protektive Wirkung besitzt und ein Molekulargewicht von etwa 40000 Dalton aufweist, seine Herstellung und seine Verwendung. WO 93/24521 und WO 94/11394 offenbaren BPC-Peptide mit organprotektiver Wirkung des gleichen Typs, wie sie vom Stammprotein BPC bekannt ist. Sikiric et al. in: Digestive Diseases and Sciences, 41 (1996)7, 1518–1526, beschreiben das Pentadecapeptid BPC 157, das beim Auflösen in Wasser und Salzlösung bei Ratten eine heilende und prophylaktische Wirkung auf akute Pankreatitis und die damit einhergehenden gastroduodenalen Läsionen aufweist.
Somit sind die BPC-Peptide für eine breite Vielzahl von pharmazeutischen Anwendungen bekannt. Allerdings ist die physikalisch-chemische Stabilität dieser Peptide, beispielsweise in normaler Salzlösung, nicht zufrieden stellend. Außerdem verursacht die Anwendung von BPC-Peptiden, insbesondere durch Injektion einer wässrigen Lösung oder in normaler Salzlösung, Schmerzen und/oder Nekrose.
Salze von Proteinen und Peptiden sind aus der Technik gut bekannt. Beispielsweise ist es von Bertrand, M. et al. in: Journal of Peptide Research, 49 (1997)3, 269–272 bekannt, dass die Wirkungen bestimmter Salze bezüglich Stabilität und Struktur von Peptiden sehr selektiv sind. Beispielsweise löst die Zugabe von einwertigen Kationen, wie NH₄ ⁺, zu einer fertigen 0,1 M (Poly(Glu-Leu))-Peptidlösung einen Übergang zu einer wasserlöslichen β-Struktur aus. Im Gegensatz dazu wurde unter Verwendung von Li⁺-, Na⁺- oder Cs⁺-Ionen kein Übergang festgestellt.
Die Rolle der oberflächlich zugänglichen Ionenpaare bei der Proteinstabilität wurde durch die Bestimmung der Wirkungen von zugesetzten Salzen (KCl, MgCl₂ und LaCl₃) bei neutralem und saurem pH auf die Stabilität der de novo aufgebauten doppelsträngigen α-helical gewundenen Spiralen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Salzzugabe komplexe Auswirkungen auf die Proteinstabilität haben kann, die stabilisierende und destabilisierende Beiträge umfassen, wobei die Nettowirkung von der Natur des geladenen Rests und den im Protein vorhandenen ionischen Wechselwirkungen abhängt (Kohn et al. in: Journal of Molecular Biology, 267 (1997)4, 1039–1052).
Bisherige Studien an Peptid-Modellen haben ferner gezeigt, dass Salzbrücken mit dem Abstand i, i + 4 entlang der Peptidkette stärker stabilisierend sind als diejenigen mit einem Abstand von i, i + 3, mit einer Präferenz der Reihenfolge Säure-Base statt Base-Säure vom N- zum C-Terminus. Allerdings ist derzeit nicht bekannt, ob oberflächliche Salzbrücken auf die native Struktur in Proteinen eine starke stabilisierende Wirkung besitzen (Berger et al. in: Journal of Biomolecular Structure and Dynamics, 14 (1996)3, 285–291).
Somit hängen die Eigenschaften der Peptidsalze bezüglich ihrer Stabilität, Struktur und Funktion sehr stark von den speziellen an der Bildung des spezifischen Salzes beteiligten Ionen und von anderen intrinsischen oder extrinsischen Faktoren ab. Derzeit kann nicht vorhergesehen werden, welche bestimmten Eigenschaften ein spezifisches Salz eines spezifischen Peptids haben könnte.
Das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem besteht in der Bereitstellung von BPC-Peptiden in einer stabileren Form und von einer diagnostischen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzung, die BPC-Peptide umfasst, die eine verbesserte Stabilität und mindestens die gleichen pharmazeutischen Wirkungen wie die BPC-Peptide an sich aufweisen. Außerdem besteht das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende technische Problem in der Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die die vorstehend erwähnten Nachteile behebt, was insbesondere die schmerzlose Injektion von BPC-Peptiden ermöglicht.
Die vorliegende Erfindung löst diese Probleme durch Bereitstellen von BPC-Peptidsalzen und einer pharmazeutischen oder diagnostischen Zusammensetzung, die eine pharmazeutische oder diagnostisch wirksame Menge der Salze von BPC-Peptiden umfasst, wobei die Peptide aus 8 bis 15 Aminosäuren bestehen, wobei das Anion des Salzes ein negativ geladenes Peptid, das 8 Aminosäurereste umfasst, mit der allgemeinen Formel (I) [Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala]^{(–)or(2–)} (I)ist,
wobei Xaa ein neutraler aliphatischer Aminosäurerest, insbesondere Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle oder Nva, ist,
Yaa ein basischer Aminosäurerest, insbesondere Lys, Arg, Orn oder His, ist, und
Zaa ein saurer Aminosäurerest, insbesondere Glu, Asp, Aad oder Apm, ist,
und wobei das Kation des Salzes das Kation einer anorganischen oder organischen nicht toxischen und pharmazeutisch verträglichen Base ist. Insbesondere ist das Kation des Salzes ein Alkali- oder Erdalkalimetall, beispielsweise Na⁺, K⁺, Li⁺, Cs⁺, Ca²⁺, oder ein anderes Metall, wie Zn²⁺, oder ein primäres sekundäres oder tertiäres Amin oder eine organische Verbindung, wie NH₄ ⁺, Triethanolamin⁺, Cyclohexylamin⁺, 2-AMP⁺ (2-Amino-1-propanol) oder TRIS⁺ (Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan), solange diese Kationen physiologisch verträglich sind.
Das negativ geladene Peptid weist ein Molekulargewicht von 900 bis 1600 Dalton auf.
Überraschenderweise zeigen die erfindungsgemäßen BPC-Peptidsalze mindestens die gleiche pharmazeutische Wirkung wie die BPC-Peptide und im Vergleich mit den freien BPC-Peptiden oder Acetaten der BPC-Peptide zusätzlich eine nennenswert erhöhte physikalisch chemische Stabilität. Das erfindungsgemäß eingesetzte Kation beeinflusst die Wirkung der BPC-Peptide nicht, sondern erhöht ihre Stabilität. Beispielsweise sind die erfindungsgemäßen BPC-Peptidsalze in normaler Salzlösung oder in Wasser stabiler als die BPC-Peptide oder die BPC-Peptidacetate. Außerdem sind die erfindungsgemäßen Salze gut zur peroralen Anwendung geeignet und zeigen während oder nach der Anwendung, insbesondere durch Injektion, keinerlei unerwünschte Nebenwirkungen, wie Schmerzen oder Nekrose. Darum erlauben die erfindungsgemäßen BPC-Peptidsalze eine verbesserte enterale und parenterale Anwendung. Außerdem sind die erfindungsgemäßen Salze aufgrund des Fehlens jeglicher toxischer Anzeichen bis zu Dosen von 50 mg/kg b. w. (Körpergewicht) sehr günstig.
Die erfindungsgemäßen Salze können durch Auflösen des freien BPC-Peptids in einem wässrigen oder wässrigen/alkoholischen Lösungsmittel oder in anderen geeigneten Lösungsmitteln mit einer entsprechenden Base und durch anschließendes Isolieren des erhaltenen erfindungsgemäßen Salzes durch Eindampfen der Lösung, Freisetzen und Lyophilisieren oder durch Zugeben eines weiteren Lösungsmittels, z. B. Diethylether, zu der wässrigen und/oder alkoholischen Lösung des BPC-Peptidsalzes, das die Abtrennung des unlöslichen rohen Salzes auslöst, erhalten werden. Für die Salzbildung werden in der Regel 1 oder maximal 2 mol Base, d. h. Kation, und 1 mol des freien BPC-Peptids verwendet. Zur Herstellung der alkalischen BPC-Peptidsalze werden vorzugsweise Alkalimetallcarbonate oder -hydrogencarbonate verwendet. Die hergestellten Peptidsalze sind in Wasser beliebig löslich. Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung der BPC-Peptidsalze.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird eine Base als Substanz angesehen, die in der Lage ist, ein Kation in einer Lösung, insbesondere in einer wässrigen und in einer wässrigen/alkoholischen Lösung, zu bilden.
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung umfasst die pharmazeutische Wirkung prophylaktische und therapeutische Wirkungen. Demnach bezieht sich eine pharmazeutische Zusammensetzung auf Zusammensetzungen, die prophylaktische oder therapeutische Wirkung aufweisen.
Zusätzlich betrifft die Erfindung eine pharmazeutische oder diagnostische Zusammensetzung, die die erfindungsgemäßen BPC-Peptidsalze umfasst, gegebenenfalls in Verbindung mit einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern, sowie Verfahren zur Herstellung dieser Zusammensetzungen. Die Zusammensetzungen sind zur topischen oder systemischen Anwendung geeignet, beispielsweise in Form von injizierbaren Lösungen, Tabletten, Cremen, Kapseln, Salben, Lotionen, Lutschtabletten, etc. Die Dosis liegt vorzugsweise im Bereich von 10^–5 bis 10^–2 mg/kg Körpergewicht, systemisch oder topisch in höherer Konzentration zwischen 0,1% bis 0,5% angewandt. Die Bestimmung der optimalen Dosen für eine bestimmte Behandlung obliegt dem Fachmann.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine pharmazeutische oder diagnostische Zusammensetzung, gemäß Obigem, die zusätzlich zu einem oder mehreren der erfindungsgemäßen BPC-Peptidsalze Trehalose, insbesondere zur peroralen Anwendung, und/oder pharmazeutisch oder diagnostisch verträgliche Träger, Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoffe enthält.
Zusätzlich zu dem BPC-Peptidsalz kann die Zusammensetzung, vorzugsweise die erfindungsgemäße wasserlösliche Zusammensetzung, außerdem ein wasserlösliches Protein (im Folgenden wasserlösliches Protein) enthalten, das in die Körperfluide injizierbar ist, ohne dass seine wesentliche pharmakologische Wirkung bei der Konzentration auftritt, die in 1 erfindungsgemäßen Dosierungseinheitsform verwendet wird. Als ein solches wasserlösliches Protein sind Serumalbumin, Globulin, Collagen und/oder Gelatine bevorzugt. Das Protein kann in einer Menge zugesetzt werden, die in der Regel in injizierbaren pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet wird. Somit beträgt das Gewichtsverhältnis zwischen dem wasserlöslichen Protein und dem BPC-Peptidsalz beispielsweise etwa 0,0001 : 1 bis 100 : 1, vorzugsweise etwa 0,001 : 1 bis etwa 10 : 1 oder mehr bevorzugt etwa 0,01 : 1 bis etwa 1 : 1.
Weiterhin betrifft die Erfindung auch die zuvor genannten BPC-Peptidsalze selbst und Zusammensetzungen, die sie enthalten, insbesondere in getrockneter und/oder reiner Form oder in einer wässrigen oder wässrigen/alkoholischen Lösung. Der pH-Wert einer aus der wasserlöslichen Zusammensetzung oder einem erfindungsgemäßen Peptidsalz hergestellten Lösung sollte so sein, dass der pH-Wert auf die Wirkung des pharmakologisch wirksamen Peptids keinerlei nachteiligen Einfluss ausübt, sollte allerdings in der Regel innerhalb eines für Injektionen annehmbaren Bereichs liegen und weiterhin so sein, dass der pH-Wert weder eine große Änderung in der Viskosität der Lösung verursacht noch die Bildung eines Niederschlags oder dergleichen zulässt. Somit sollte die Lösung vorzugsweise einen pH von etwa 6 bis 9, vorzugsweise von etwa 6,5 bis 7,5 aufweisen.
Wird die erfindungsgemäße wasserlösliche Zusammensetzung in eine wässrige Lösung zur Verabreichung übergeführt, sollte die Konzentration des pharmazeutisch wirksamen Peptidsalzes in der Lösung vorzugsweise etwa 0,0000001 bis 10% (Gew./Vol.), mehr bevorzugt etwa 0,000001 bis 5% (Gew./Vol.) oder besonders bevorzugt etwa 0,00001 bis 1% (Gew./Vol.) betragen.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung sollte vorzugsweise eine Dosierungseinheitsform, die das erfindungsgemäße pharmakologisch wirksame BPC-Peptidsalz enthält, und falls notwendig, zusammen mit weiteren Hilfsstoffen, wie das oben erwähnte wasserlösliche Protein, aufweisen. So lässt man beispielsweise die vorstehend erwähnten zwei oder drei Komponenten durch ihr Auflösen oder Suspendieren in sterilem Wasser oder in einer sterilen physiologischen Salzlösung in einer Ampulle oder einem Röhrchen auftreten. In diesem Fall kann das Herstellungsverfahren das Zumischen einer Lösung des pharmakologisch wirksamen BPC-Peptidsalzes und weiterhin, falls notwendig, einer Lösung des Hilfsstoffs oder die Zugabe des Hilfsstoffs in Pulverform zu einer Lösung des pharmakologisch wirksamen BPC-Peptidsalzes oder eine andere Kombination von entsprechenden Verfahrensweisen umfassen. Die Dosierungsform kann auch durch Zugabe von sterilem Wasser oder steriler physiologischer Salzlösung zu einem Lyophilisat oder zu einem Vakuumgetrockneten Pulver, in dem das pharmakologisch wirksame BPC-Peptidsalz und falls notwendig der Hilfsstoff coexistieren, hergestellt werden. Die Dosierungseinheitsform kann einen oder mehrere herkömmliche Hilfsstoffe enthalten, wie pH-einstellende Mittel (z. B. Glycin, Chlorwasserstoffsäure, Natriumhydroxid), Lokalanästhetika (z. B. Xylocainhydrochlorid, Chlorbutanol), Isotonisierungsmittel (z. B. Natriumchlorid, Mannit, Sorbit), Emulgatoren, Adsorptionshemmer (z. B. Tween^®60 oder 80), Talkum, Stärke, Lactose und Tragacanth, Magnesiumstearat, Glycerin, Propylenglycol, Konservierungsmittel, Benzylalkohol, Methylhydroxybenzoat und/oder Arachidis oleum hydrogenatum. Diese Dosierungseinheitsform kann außerdem pharmazeutisch verträgliche Hilfsstoffe, wie Polyethylenglycol 400 oder Dextran, enthalten. Die erfindungsgemäße wasserlösliche Zusammensetzung nimmt vorzugsweise die Form einer parenteralen Präparation ein. Als die parenterale Präparation sind injizierbare Lösungen, Lösungen zur transmukosalen Verabreichung, nasale Lösungen, Ohrlösungen bevorzugt.
Die injizierbaren Lösungen umfassen Lösungen zur intravenösen Verabreichung, subkutanen Verabreichung, intraarteriellen Verabreichung, intramuskulären Verabreichung und intraokularen Verabreichung. Die Langzeit-Präparationen können leicht aus Ampullen oder Röhrchen in Spritzen aufgezogen werden. Blasen, falls beim Aufziehen gebildet, können leicht durch einfaches kurzes Stehen lassen entfernt werden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann in einer in Wasser gelösten Form oder in einer lyophilisierten Form mit einem kristallisierenden gelösten Stoff, wie Mannit, vorhanden sein. Die Zugabe von sterilem Wasser oder steriler physiologischer Salzlösung zu dem Lyophilisat ergibt eine wässrige Lösung.
Die Tonizität einer wässrigen Lösung der erfindungsgemäßen wasserlöslichen Zusammensetzung sollte bei Verabreichung innerhalb des tolerierbaren Bereichs liegen und wird beispielsweise durch Isotonisierungsmittel, wie Natriumchlorid und Mannit, eingestellt. Die Tonizität ist vorzugsweise halb bis doppelt so hoch wie diejenige einer physiologischen Salzlösung, mehr bevorzugt dreiviertel bis eineinhalb Mal so hoch wie diejenige einer physiologischen Salzlösung.
Die Viskosität einer wässrigen Lösung der wasserlöslichen erfindungsgemäßen Zusammensetzung sollte zur Injektion ausreichend gering sein. Vorzugsweise ist die Viskosität geringer als 500 cP, mehr bevorzugt geringer als 400 cP. Die Werte der Viskosität entsprechen denjenigen, die durch den Einsatz von Cone LD in einem E-Typ-Viskosimeter (TOKIMEC, Japan) bei 25°C gemessen werden.
Liegt die Zusammensetzung in Form eines Lyophilisats vor, ist es bevorzugt, dass Viskosität, Tonizität und Komponenten-Konzentrationen in der davon herrührenden wässrigen Lösung in den jeweiligen hier zuvor erwähnten Bereichen liegen.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung wird durch Mischen dieser Bestandteile nach einem herkömmlichen Verfahren hergestellt. Ziel des Mischens der Bestandteile der vorliegenden Zusammensetzung sollte sein, dass die Wirkung des pharmakologisch wirksamen BPC-Salzes beibehalten und die Blasenbildung während des Vorgangs minimiert wird. Die Bestandteile werden entweder gleichzeitig oder in einer beliebigen Reihenfolge in ein Gefäß (beispielsweise eine Flasche oder eine Trommel) gegeben. Die Atmosphäre in dem Gefäß kann beispielsweise sterile Reinluft oder steriles reines Stickstoffgas sein. Die resultierende Lösung kann in kleine Röhrchen oder Ampullen übergeführt und zudem der Lyophilisation unterzogen werden.
Die flüssige Form der Pulverlyophilisatform der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann in einer Lösung eines biologisch abbaubaren Polymers, wie Poly(Milchsäure-Glycolsäure)-Copolymer, Poly(Hydroxybuttersäure), Poly(Hydroxybuttersäure-Glycolsäure)-Copolymer, oder in dem Gemisch von diesen gelöst und sodann beispielsweise zu Filmen, Mikrokapseln (Mikrokügelchen) oder Nanokapseln (Nanokügelchen), insbesondere in Form von weichen oder harten Kapseln, formuliert werden.
Zusätzlich kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung, die in Liposome eingekapselt ist, die Phospholipide, Cholesterin oder Derivate von diesen umfassen, außerdem in physiologischer Salzlösung oder in einer Hyaluronsäurelösung, gelöst in physiologischer Salzlösung, dispergiert werden.
Die Weichkapsel kann mit der flüssigen Form der erfindungsgemäßen Zusammensetzung gefüllt werden. Die Hartkapsel kann mit dem Lyophilisatpulver der erfindungsgemäßen Zusammensetzung gefüllt werden, oder das Lyophilisatpulver der vorliegenden Zusammensetzung kann zu Tabletten zur rektalen bzw. oralen Verabreichung komprimiert werden.
Natürlich kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung in einer vorgefüllten Spritze zur Selbstverabreichung geliefert werden.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann bei normaler Temperatur, wie +10°C bis +30°C, oder in einem normalen Kühlbereich, vorzugsweise von etwa +2°C bis +8°C, gehalten werden.
Die Erfindung betrifft auch neue Anwendungen und Verfahren für Behandlungen unter Verwendung der zuvor genannten Salze und/oder Zusammensetzungen, insbesondere bezüglich der Behandlung von Störungen im Zusammenhang entweder mit einer Stickoxid(NO)-Bildung oder NO-Systemfunktionsstörungen, insbesondere Hypertension, Angina, Impotenz, Kreislaufschock und septischer Schock, Schlaganfall, Entzündung, Atemnotsyndrom, Adhäsion und Aggregation von Plättchen und Leukozyten, Endothel-Dysfunktion, gastrointestinale Läsionen, Peristaltik-Störungen, Diabetes, Pankreatitis, Hypotension und Parkinson Krankheit; Dysfunktionen oder Hyperfunktionen der somatosensorischen Nerven, insbesondere sensorische Neuropathie, postherpetische Neuralgie, atopische Dermatitis, gestörte Heilung von verletztem Gewebe, erworbene Kälte- und Wärme-Urtikaria, Psoriasis, bullöses Pemphigoid, Ekzem, Photodermatosen, chronische Arthritis, gastrointestinale Läsionen und spezifische oder nicht spezifische Hyperreaktivität der oberen und unteren Atemwege (Asthma, Rhinhitis); Endothellstörungen, Wunden, Ulzera; Zustände im Zusammenhang mit akuter und/oder chronischer Entzündung, insbesondere chronische Arthritis und Störungen im Zusammenhang mit Hypersensitivität vom verzögerten Typ und gastrointestinale Läsionen; Leberstörungen, Organläsionen, ausgelöst durch freie Radikale, insbesondere verursacht durch Strahlung, Störungen in Verbindung mit cathecholaminergen Systemstörungen, insbesondere Schizophrenie, Amphetamin-Provokationseffekte, Arzneimittelmissbrauch; stressbedingte Zustände; akute Pankreatitis, mit einer zusätzlichen positiven Wirkung auf die gleichzeitige gastroduodenale Pathologie; Herzstörungen, insbesondere antiarrhytmische, Antiangina- und kardioprotektive Behandlung; Depressionsstörungen; Parkinson Krankheit und parkinsonkrankheitsartige Pathologie; Temperaturstörungen; Knochenbeeinträchtigungen; verschiedene hypertensionsbedingte Organschäden; Koagulationsstörungen; Schmerzstörungen; Konvulsionsstörungen; Rückenmarksverletzungen; Alkoholverletzungen, ausgelöst durch Alkoholmissbrauch oder verstärkten Alkoholkonsum; ischämische Gehirnstörungen; periphere Nervenverletzungen; kataleptische Störungen und neuroleptische Störungen; Störungen im Zusammenhang mit abnormen oder mutierten Lymphocyten; Störungen von Föten; Vaginalatrophie und Osteoporoseentwicklung auf Grund von Ovariektomie-Zuständen; Tumore; Viruserkrankungen, insbesondere AIDS oder ARC; gastrointestinale Läsionen; kognitive Störungen; Entzugsstörungen; Nierenstörungen und Störungen der zellulären Immunantwort.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein BPC-Peptidsalz oder eine pharmazeutische oder diagnostische Zusammensetzung, gemäß dem Obigen, wobei die allgemeine Formel (II) lautet Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa (II).
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein BPC-Peptidsalz oder eine pharmazeutische oder diagnostische Zusammensetzung, die ein Salz eines BPC-Peptids gemäß der obigen allgemeinen Formel (I) umfasst, wobei das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val;
Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val
(auch BPC157 genannt);
Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val;
Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val;
Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala Gly Leu Val;
Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala;
Asp Pro Pro Pro Ile Arg Pro Ala Asp;
Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp;
Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val;
Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp
und
Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asn.
Die Peptide sind aus WO 94/11394 und WO 93/24521 bekannt, deren Inhalt bezüglich Herstellung und Verwendung der BPC-Peptide hier in der vorliegenden Offenbarung mit eingeschlossen ist.
Außerdem können die Peptide mit anderen funktionellen und/oder strukturellen Gruppierungen verknüpft sein, wie Kohlenhydrate, Fette, Proteine oder Peptide, Antikörper, Rezeptoren, Hormone, cytotoxische Substanzen, Markersubstanzen, Farbstoffe, radioaktive Marker, immunmodulatorische Mittel, Arzneimittel, Träger, Ziel- oder Signalsubstanzen, etc.
Zusätzlich betrifft die Erfindung die oben erwähnten BPC-Peptidsalze und Zusammensetzungen, wobei das Peptid in linearer oder cyclisierter Form, insbesondere über eine Amidbindung zwischen erstem und letztem Aminosäurerest cyclisiert, vorhanden ist.
Die Erfindung wird nun anhand von erläuternden Beispielen und den beigefügten Figuren ausführlicher erläutert. Es zeigen:
1 das IR-Spektrum von NaBPC157.
2 das IR-Spektrum von Na₂BPC157.
3 das IR-Spektrum des Dicäsiumsalzes von BPC157 (Cs₂BPC157).
4 das IR-Spektrum des TRIS-Salzes von BPC157 (TRIS-BPC157).
5 das IR-Spektrum des Di-TRIS-Salzes von BPC157 ((TRIS)₂BPC157).
6 das IR-Spektrum des 2-Aminopropanolsalzes von BPC157 (2-AMP-BPC157).
7 das IR-Spektrum des Triethanolaminsalzes von BPC157 (TEAM-BPC157).
BEISPIEL 1: Herstellung des Mononatriumsalzes von BPC157 (NaBPC157)
0,5 g (0,35 mmol) eines Pentadecapeptids mit der Sequenz Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val (BPC157) wurde in 10 ml Wasser gelöst, enthaltend 29,6 mg Natriumhydrogencarbonat (0,35 mmol), über ein 0,2-μ-Filter steril filtriert und unter Erhalt von 0,48 g eines nicht ganz weißen Feststoffs durch Gefriertrocknen getrocknet.
Reinheit des erhaltenen Salzes: 99,4% (HPLC).
Massenspektrum (FAB): 1419, höhere Ionen bei 1441 (M⁺Na⁺).
Die Aminosäureanalyse des erhaltenen Peptidsalzes nach 72 h Hydrolyse mit 6 N-HCl in einem versiegelten Röhrchen bei 110°C ergab Werte, die der Zusammensetzung entsprachen: 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp, Glu, Leu, Val, Lys.
IR-Spektrum (KBr): 1.
UV-Spektrum (H₂O): λmax = 190 nm, keine weiteren Maxima.
Schmelzpunkt: 288–290°C (Zersetzung).
BEISPIEL 2: Herstellung des Dinatriumsalzes von BPC157 (Na₂BPC157)
0,5 g (0,35 mmol) BPC157 wurden in 10 ml Ethanol gelöst. 1,4 ml von 0,5 mol/l methanolisches Natriumhydroxid wurden unter mäßigem Rühren zugesetzt. Die Lösung wurde über ein 0,2-μ-Filter steril filtriert und langsam einem gerührten Diethylether (50 ml) zugesetzt. Der abgetrennte weiße Feststoff wurde filtriert und unter Erhalt von 0,52 g des Dinatriumsalzes mit Diethylether gewaschen.
Reinheit des erhaltenen Salzes: 99,4% (HPLC).
Massenspektrum (FAB): 1419, höhere Ionen bei 1441 (M⁺Na⁺), 1464 (M⁺Na₂ ⁺).
Die Aminosäureanalyse des erhaltenen Peptidsalzes entspricht der Zusammensetzung: 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp, Glu, Leu, Val, Lys.
IR-Spektrum (KBr): 2.
UV-Spektrum (H₂O): λmax = 190 nm, keine weiteren Maxima.
Schmelzpunkt: 275–277°C.
BEISPIEL 3: Herstellung des Dicäsiumsalzes von BPC157 (Cs₂BPC157)
0,5 g (0,35 mmol) BPC157 wurden in 8 ml Wasser, enthaltend 114 mg Cäsiumcarbonat (0,70 mmol), gelöst, über ein 0,2-μ-Filter steril filtriert und unter Erhalt von 0,55 g eines nicht ganz weißen Feststoffs lyophilisiert.
Reinheit des erhaltenen Salzes: 99,3% (HPLC).
Massenspektrum (FAB): 1419, höhere Ionen bei 1551 (M⁺Cs⁺), 1684 (M⁺Cs₂ ⁺).
Die Aminosäureanalyse des erhaltenen Peptidsalzes entspricht der Zusammensetzung: 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp, Glu, Leu, Val, Lys.
IR-Spektrum (KBr): 3.
UV-Spektrum (H₂O): λmax = 190 nm.
Schmelzpunkt: 268°C.
BEISPIEL 4: Herstellung des TRIS-Salzes von BPC157 (TRIS-BPC157)
0,5 g (0,35 mmol) BPC157 wurden in 10 ml Methanol, enthaltend 42,6 mg (0,35 mmol) Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS), gelöst, über ein 0,2-μ-Filter steril filtriert und durch Eindampfen von Methanol im Vakuum bei 40°C unter Erhalt von 0,56 g eines weißen Feststoffs getrocknet.
Reinheit des erhaltenen Salzes: 99,5% (HPLC)
Massenspektrum (FAB): 1419 (MH⁺)
Die Aminosäureanalyse des erhaltenen Peptidsalzes entspricht der Zusammensetzung: 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp, Glu, Leu, Val, Lys.
IR-Spektrum (KBr): 4.
UV-Spektrum (H₂O): λmax = 190 nm.
Schmelzpunkt: 250°C (Zersetzung).
BEISPIEL 5: Herstellung des Di-TRIS-Salzes von BPC157 ((TRIS)₂BPC157)
Die Verbindung wurde nach der in Beispiel 1 beschriebenen Vorgehensweise hergestellt, mit der Ausnahme, dass 85,2 mg (0,70 mmol) TRIS verwendet wurden.
Reinheit des erhaltenen Salzes: 99,5% (HPLC).
Massenspektrum (FAB): 1419 (MH⁺)
Die Aminosäureanalyse des erhaltenen Peptidsalzes entspricht der Zusammensetzung: 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp, Glu, Leu, Val, Lys.
IR-Spektrum (KBr): 5.
UV-Spektrum (H₂O): λmax = 190 nm.
Schmelzpunkt: 188°–193°C.
BEISPIEL 6: Herstellung des 2-Aminopropanolsalzes von BPC157 (2-AMP-BPC157)
Die Verbindung wurde nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise hergestellt. 2-Aminopropanol (2-AMP) wurde als Base verwendet.
Reinheit des erhaltenen Salzes: 96,6% (HPLC).
Massenspektrum (FAB): 1419 (MH⁺)
Die Aminosäureanalyse des erhaltenen Peptidsalzes entspricht der Zusammensetzung: 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp, Glu, Leu, Val, Lys.
IR-Spektrum (KBr): 6.
UV-Spektrum (H₂O): λmax = 190 nm.
Schmelzpunkt: 158°C (Zersetzung).
BEISPIEL 7: Herstellung des Triethanolaminsalzes von BPC157 (TEAM-BPC157)
Die Verbindung wurde nach der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensweise hergestellt. Triethanolamin (TEAM) wurde als Base verwendet.
Reinheit des erhaltenen Salzes: 99,2% (HPLC).
Massenspektrum (FAB): 1419 (MH⁺)
Die Aminosäureanalyse des erhaltenen Peptidsalzes entspricht der Zusammensetzung: 3Gly, 4Pro, 2Ala, 2Asp, Glu, Leu, Val, Lys.
IR-Spektrum (KBr): 7.
UV-Spektrum (H₂O): λmax = 190 nm.
Schmelzpunkt: 202°–205°C.
BEISPIEL 8: Herstellung von Tabletten, die TRIS-BPC157 enthalten
TRIS-BPC157 (0,5 mg) und Trehalose (20 mg) wurden in 1 ml Wasser gelöst und durch Eindampfen getrocknet. Nach dem Trocknen wurde der rohe Rückstand zur Herstellung der Tabletten mit den anderen Bestandteilen vermischt.
BEISPIEL 9: Herstellung von Kapseln, die NaBPC157 enthalten
NaBPC157 (0,5 mg) und Trehalose (60 mg) wurden in 1 ml Wasser gelöst und durch Eindampfen des Lösungsmittels getrocknet. Zur Herstellung der Kapseln wurde der rohe Rückstand mit den anderen Bestandteilen vermischt.
BEISPIEL 10: Herstellung einer Lösung die NaBPC157 enthält
BEISPIEL 11: Herstellung einer Creme, die TRIS-BPC157 enthält
BEISPIEL 12: Stabilitätstests
Die Stabilität der BPC-Peptidsalze wurde durch Inkubation der Salze für 76 und 120 Tage bei 40°C getestet. Die Konzentration der BPC-Peptidsalze in einer wässrigen Lösung betrug 0,2% (Gew./Vol.). Die Stabilität wurde unter Verwendung des HPLC-Verfahrens gemessen: Säule: Kromasil 100, 5 μ, 150 × 4,6 mm, mobile Phase 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser/Acetonitril (0 bis 50 Vol.-%), Gradientenelution in 25 min, Fliessgeschwindigkeit 1 ml/min, Nachweis: UV bei 214 nm.
Zum Vergleich wurden das freie BPC-Peptid und sein Monoacetat verwendet.
Tabelle 1
Die in dieser Tabelle dargestellten Daten zeigen die im Gegensatz zu dem freien BPC-Peptid oder seinem Monoacetat eindeutig erhöhte Stabilität der erfindungsgemäßen BPC-Peptidsalze. Außerdem verursacht die Injektion dieser Lösung wahrscheinlich aufgrund des hohen pH-Werts der BPC-Peptidsalzlösung keinerlei Schmerz oder Nekrose.
Bei einem weiteren getrennten Experiment wurde eine zusätzliche Verbesserung der Stabilität der erfindungsgemäßen BPC-Peptidsalze in roher Form und in Lösungen nach Zugabe von Trehalose festgestellt. Darum ist die Zugabe von Trehalose als pharmazeutisch verträglicher Hilfsstoff für die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, insbesondere in Form von Tabletten oder Kapseln ein weiterer bedeutender Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Die folgenden Beispiele beschreiben Experimente, die die pharmazeutischen Wirkungen der erfindungsgemäßen BPC-Peptidsalze zeigen. Die Experimente wurden unter Verwendung der verschiedenen gebräuchlichen Modelle in vitro und in vivo vorgenommen. Für die Experimente wurde, wenn nicht anders angegeben, das Mononatriumsalz des BPC-Peptids 157 verwendet (Abkürzung: NaBPC157). Bei sämtlichen Experimenten wurden, wenn nicht anderweitig angegeben, männliche Wistar-Ratten, 250–280 g Körpergewicht, verwendet.
BEISPIEL 13: NO-System
Einleitung
Stickoxid (NO) besitzt sowohl die Funktion als Signal-gebendes Molekül in Endothel- und Nervenzellen als auch die eines durch die Immunzellen aktivierten Killermoleküls. Neue Forschungen zeigen, dass es als Medizin durch Inhalation verwendet werden kann. Im Allgemeinen scheint NO entweder durch Überschuss oder Störung eine Vielzahl von Beschwerden hervorzurufen oder dazu beizutragen, insbesondere Hypertension, Angina, Impotenz, Kreislaufschock, septischer Schock, Schlaganfall, Entzündung, Atemnotsyndrome, pulmonale Hypertension, Adhäsion und Aggregation von Plättchen und Leukozyten, Diabetes, Hypotension und Parkinson Krankheit.
Materialien und Methoden
Einige der Wirkungen von NaBPC157 (10 μg oder 10 ng/kg) wurden in Ratten provoziert, wie die heilende Wirkung bei gastrischen Läsionen und die NaBPC157-Wirkung bei der Blutdruck-Aufrechterhaltung. Die Läsionen wurden unter Anwendung einer einstündigen Ethanolbehandlung (96%, i. g. (intragastrisch)) erhalten. Das NaBPC157 wurde gleichzeitig verabreicht (i. p. (intraperitoneal)). In dem Blutdruck-erhaltenden Experiment wurde NaBPC157 intravenös (i. v.) verabreicht.
Ebenfalls studiert wurde die kombinierte Verabreichung von N^G-Nitro-L-argininmethylester (L-NAME) (5 mg/kg i. v.), ein kompetitiver Inhibitor der endothelialen Stickoxid(NO)-Erzeugung, und dem NO-Vorläufer L-Arginin (200 mg/kg i. v.) (D-Arginin war unwirksam). Bei den gastrischen Läsionstests wurden die NO-Agentien 5 min vor der Ethanolverletzung und der Behandlung mit NaBPC157 verabreicht.
Ergebnisse
Im ethanolischen Modell besitzt allein verabreichtes NaBPC157, ebenso wie L-Arginin, eine ulkushemmende Wirkung. NaBPC157 verhinderte die ansonsten schweren gastrischen Läsionen, die bei Ethanol-behandelten Kontrollratten festgestellt wurden. L-NAME besaß keine Wirkung. L-NAME hob die Wirkung von L-Arginin vollständig auf, allerdings dämpfte es nur die Wirkung von NaBPC157. Nach Anwendung einer Kombination von L-NAME + L-Arginin war die Wirkung von NaBPC157 zusätzlich beeinträchtigt.
In Blutdruckstudien besaß NaBPC157 (ohne Wirkung auf die basalen Normalwerte), verglichen mit L-Arginin, sowohl eine mimische Wirkung (gestörte L-NAME-Blutdruck-Erhöhung, prophylaktische Anwendung und Senkung bereits erhöhter L-NAME-Werte, Verabreichung zum Zeitpunkt der maximalen L-NAME-Blutdruck-Erhöhung (d. h. 10 min nach L-NAME)) als auch eine präventive Wirkung (die L-Arginin-induzierte moderate Blutdruck-Senkung wurde durch NaBPC157 vor Behandlung verhindert). Bei Verabreichung von NaBPC157 10 min nach Anwendung der Kombination von L-NAME + L-Arginin (führte immer noch zu einer Blutdruck-Erhöhung) verschwand seine eindeutige Wirkung (festgestellt in L-NAME behandelten Ratten). In vitro löste NaBPC157, verabreicht in der gleichen Dosis (100 μM) wie L-Arginin, in der Magenschleimhaut aus Ratten-Magengewebshomogenaten eine vergleichbare Bildung von NO aus. Allerdings konnte der Effekt von NaBPC157, auch mit einer zehnfach (100 vs. 1000 μM) höheren Dosis als für eine Hemmung der L-Argininwirkung benötigt, nicht durch L-NAME gehemmt werden. Andererseits war die NO-Synthese verringert, wenn NaBPC157 und L-Arginin kombiniert wurden. Zusammenfassend konnte NaBPC157 die NO-Wirkungen sowohl bei der Magenschleimhaut-Integrität als auch bei der Blutdruck-Aufrechterhaltung auf einem bestimmten Weg, insbesondere bei Kombination mit L-Arginin, beeinflussen und besaß eine deutlich auffallendere und/oder besonders verschiedene Wirkung auf NO.
Aufgrund einer deutlich auffallenderen Wirkung auf NO, als es mit L-Arginin der Fall ist, konnte NaBPC157 die mit einer übermäßigen NO-Bildung einhergehenden Nebenwirkungen verhindern (gestörte Wirkung von L-Arginin (z. B. Hypotension)). Diese Nebenwirkungen wurden in vivo in Richtung normaler Werte umgekehrt, und in vitro wurde eine übermäßige NO-Bildung verhindert. Zusätzlich wurden die negativen Folgen der NO-Systemhemmung (z. B. Prävention der L-NAME-induzierten Blutdruck-Erhöhung und Umkehr der bereits etablierten L-NAME-Hypertension) beseitigt.
Auf der Basis der starken Ähnlichkeit der NO-Tests in anderen Geweben (z. B. Lunge, Leber, Blutgefäße, etc.) und der Verschiedenheit der angewandten Modelle (gastrische Läsionen und Blutdruck-Aufrechterhaltung), sind die festgestellten heilenden Wirkungen von NaBPC157 bezüglich sowohl einer übermäßigen NO-Bildung als auch gestörten NO-Systemfunktionen offensichtlich. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen BPC-Peptidsalze bei der Behandlung von Hypertension, Angina, Impotenz, Kreislaufschock, septischem Schock, Schlaganfall, Entzündung, Atemnotsyndrome, pulmonaler Hypertension, Pankreatitis, Adhäsion und Aggregation von Plättchen und Leukozyten, Endothel-Dysfunktion und Parkinson Krankheit geeignet.
BEISPIEL 14: Somatosensorische Neuronen
Einleitung
Somatosensorische Neuronen sind allgemein an der Kontrolle der Homöostase beteiligt, insbesondere bei der Reaktion für die Provokationen der Homöostase. Diese Neuronen können eine potentielle Bedrohung nachweisen. Die Neuronen sind per se in der Lage, sofort entsprechende Maßnahmen auszulösen, um die Gefahr zu lindern. Gefäßwirksame afferente Neuronen stellen somit ein System der Erstabwehr gegen Trauma dar. In der Regel wurde ihr Schutzvermögen durch die experimentelle Beschädigung der Haut und der gastrointestinalen Schleimhaut nachgewiesen. Bei einer Vielzahl von Störungen werden entweder Dysfunktionen oder Hyperfunktionen nahe gelegt, insbesondere kongenitale sensorische Neuropathie, durch Diabetes verursachte sensorische Neuropathie, Herpes Zoster, postherpetische Neuralgie, atopische Dermatitis, gestörte Heilung von verletztem Gewebe (z. B. persistente Hautwunden, Verschlimmerung von Säure-induzierten Hautläsionen und Bildung von keratitisartigen Läsionen in der Cornea), erworbene Kälte- und Wärmeurtikaria, Psoriasis, bullöses Pemphigoid, Ekzem, Photodermatosen, Störungen der oberen und unteren Atemwege, spezifische und nicht spezifische Hyperreaktivität, vasomotorische Rhinitis, Asthma, chronische Arthritis und gastrointestinale Läsionen.
Materialien und Methoden
Die gastroprotektiven Wirkungen von NaBPC157 auf gastrische Läsionen (in Ratten hervorgerufen durch Behandlung mit 96% Ethanol, restraint Stress und Indometacinbehandlung) wurden studiert. Die mögliche Beteiligung sensorischer Neuronen an den Heilwirkungen von NaBPC157 (10 μg/kg, 10 ng/kg i. p.) wurde mit Capsaicin studiert, das auf die sensorischen Neuronen ziemlich distinkte Wirkungen besitzt: eine hoch dosierte Verabreichung an erwachsene Tiere (125 mg/kg s. c., (subkutan) 3 Monate alt) oder eine Verabreichung (50 mg/kg s. c.) an neugeborene Tiere (sieben Tage alt) zerstört sensorische Fasern, wohingegen eine niedrige Dosis (500 μg/kg i. p.) eine Neurotransmitter-Freisetzung und protektive Wirkungen auf die Schleimhaut aktiviert.
Ergebnisse

(i) In Abwesenheit von Capsaicin schützte NaBPC157 die Magenschleimhaut gegen Ethanol, restraint Stress und Indomethacin-Anwendung.
(ii) In Gegenwart neurotoxischer Dosen von Capsaicin beeinflusste der negative Einfluss von Capsaicin auf restraint Stress-, Ethanol- oder Indomethacin-Läsionen die heilende Wirkung von NaBPC157 reproduzierbar. Der Schutz von NaBPC157 war in den Capsaicin-behandelten Modellen (entweder behandelt als Erwachsene oder Neugeborene) in allen diesen Tests immer noch offensichtlich. Nach der Neugeborenen-Capsaicinbehandlung wurde eine vollständige Aufhebung der durch NaBPC157 hervorgerufenen Gastroprotektion festgestellt, wenn NaBPC157 als einmaliges ng-Regime angewandt wurde. Der Schleimhautschutz kehrte vollständig zurück, wenn die gleiche Dosis täglich angewandt wurde.
(iii) In Verbindung mit der Capsaicin-Anregungsdosis wird die heilende Wirkung von NaBPC157 zusätzlich erhöht.

Zusammengenommen zeigen diese Daten die komplexe synergistische Wechselwirkung zwischen der heilenden Wirkung von NaBPC157 und der peptidergischen sensorischen afferenten neuronalen Wirkung. Angesichts der starken Ähnlichkeit der Capsaicin-Wirkungen in Tieren und Menschen und in dem oben beschriebenen Experiment kann NaBPC157 zur Behandlung der vorstehend erwähnten Störungen eingesetzt werden.
BEISPIEL 15: Schutz von Endothel
Einleitung
Vaskuläre Endothelverletzungen gehen bekanntlich der Entwicklung großer Organverletzungen voraus und sind deren Vorraussetzung. Der Endothelschutz könnte die schädigende Folge der Ischämie auf die Schleimhaut-Integrität vermindern. Als brauchbares Modell ist die Anwendung von Monastralblau in Ratten kurz vor der Anwendung eines nekrotisierenden Mittels (z. B. intragastrisch angewandtes Ethanol), das bekanntlich große Läsionen hervorruft, weithin akzeptiert.
Materialien und Methoden
Sämtliche Ratten erhielten i. v. Monastralblau (MB) (Sigma Company, USA) (1,0 ml/kg b. w.) 3 min vor der Ethanolbehandlung. Die Ratten wurden 1 min nach der Ethanolbehandlung getötet. 1 h vor der Behandlung mit Ethanol wurde NaBPC157 (10,0 μg/kg i. p.) oder Salzlösung (5,0 ml/kg i. p.) verabreicht. Unmittelbar nach der Tötung wurde der Magen entnommen, und die Läsionen wurden von unvoreingenommenen Beobachtern bewertet. Repräsentative Abschnitte des Magens und Duodenums wurden zur weiteren histologischen Analyse bearbeitet.
Die Gefäßverletzung wurde in einem frühen Zeitraum (1 min nach der Ethanolbehandlung) unter Verwendung der Monastralblau(MB)-Technik bewertet. Die Flächendichte der angefärbten Schleimhaut wurde durch TEM überprüft.
Ergebnisse
Eine starke verminderte MB-Anfärbung wurde reproduzierbar in Gruppen festgestellt, die mit NaBPC157 behandelt wurden. Die starke Ähnlichkeit der verwendeten Modelle mit den menschlichen Zuständen zeigt die Verwendung von NaBPC157 in der Humantherapie zur Behandlung von Zuständen, die mit Endothelstörungen zusammenhängen.
BEISPIEL 16: Angiogenese
Einleitung
Die Angiogenese ist zur Erzeugung von Granulationsgewebe und Wund- und/oder Ulkusheilung von essentieller Bedeutung. Unter Anwendung einer allgemein bekannten Methode wurden die angiogenen Eigenschaften studiert.
Materialien und Methoden
In jeder Ratte wurden zwei sterile Schwämme (1 cm × 1 cm × 0,25 cm (V = 0,25 ml)) mit den gleichen Mengen an NaBPC157 (Lösung 50 μg, 10 μg, 10 ng/ml) oder den Referenzmitteln, Cimetidin (10 mg, 100 mg, 500 mg/ml), Ranitidin (2,5 mg, 25 mg, 250 mg/ml), Famotidin (10 mg, 50 mg, 100 mg/ml) und Sucralfat (1 mg, 5 mg, 10 mg/ml), subkutan in der Lumbalregion implantiert. Die Schwämme wurden nach drei und sieben Tagen entfernt. Sie wurden anschließend in Formalin fixiert und zur histologischen und histochemischen Bewertung und Morphometrie bearbeitet. Das verwendete Mikroskop war ein DIAPLAN-Mikroskop von Leitz: Zur morphometrischen Analyse wurde das Programm SFORM, hergestellt von VAMS, Zagreb, Kroatien, verwendet.
Ergebnisse
Neu gebildetes Granulationsgewebe um die implantierten Schwämme wird regelmäßig als wertvolles quantitatives Maß für die Wirtsreaktion auf einen Fremdkörper verwendet. Die Experimente mit Ratten, die drei Tage nach der Implantation getötet wurden, zeigten folgendes: In den Gruppen der mit NaBPC157 behandelten Tiere wurde wesentlich mehr Granulationsgewebe festgestellt, verglichen mit demjenigen der Kontrollwerte. Ähnliche Ergebnisse wurden in den Ratten festgestellt, die mit Sucralfat in sämtlichen angewandten Dosen behandelt wurden. Im Gegensatz hierzu wurde kein Unterschied zwischen den Kontrollwerten und dem analysierten Mittel in den Gruppen festgestellt, die mit allen drei H2-Blockern behandelt wurden. In den sieben Tage nach der Implantation getöteten Tiere waren diejenigen, die mit allen drei Dosen von Sucralfat behandelt wurden, und diejenigen, die mit der höchsten Dosis von NaBPC157 (50 μg) behandelt wurden, im Vergleich zur Kontrollgruppe wesentlich verschieden. Die Kontrollwerte unterschieden sich zwischen den beiden Tötungszeiten nicht wesentlich.
Im Inneren des neu gebildeten Granulationsgewebes wurden die Endothelräume gezählt. Relativ zu den Kontrollwerten (die Anzahl neu gebildeter Endothelräume in der Kontrollgruppe betrug drei Tage nach Implantation 7,94 ± 1,23 und sieben Tage nach Implantation 14,8 ± 3,12) führten sämtliche verwendete Substanzen in beiden Zeiträumen (dritter und siebenter Tag) zu signifikant erhöhten Werten.
Zusätzlich zu dem Beweis, dass verschiedene ulkushemmende Arzneimittel gemeinsame angiogene Eigenschaften aufweisen, stimuliert NaBPC157 genau wie Sucralfat auch die Granulationsbildung. Demnach kann NaBPC157 zur Auslösung und Förderung von Heilungsprozessen, insbesondere Wundheilungs- und/oder Ulkus-Heilungsprozesse, eingesetzt werden.
BEISPIEL 17: Entzündung
Einleitung
Die derzeit verwendeten entzündungshemmenden Mittel werden in der Regel in vielen geeigneten Modellen bewertet, die die akuten und/oder chronischen Entzündungsstörungen in Menschen sehr genau darstellen. Allerdings treten als Hauptnebenwirkung dieser Mittel schwere gastrointestinale Läsionen auf.
Eine akute entzündungshemmende und analgetische Wirkung wurde für NaBPC157 (z. B. Turpentin-, Carrageenin-, Essigsäure- oder MgSO₄-schmerzkrümmende (Prostaglandin-abhängig, Prostagladin-unabhängig) Schwanzkneiftests) zusammen mit einer antipyretischen Wirkung (Abnahme des Hefe-induzierten Fiebers (4000 mg/kg s. c.)) festgestellt. Folglich wurde seine bekannte Heilwirkung auf die gastrointestinalen Läsionen, seine Wirkung auf chronisch entzündliche Läsionen, wie adjuvante Arthritis, und seine Wirkung als nicht steroides entzündungshemmendes Mittel bei NSAIAs-induzierten gastrointestinalen Läsionen in Ratten gleichzeitig studiert.
Materialien und Methoden
In den Studien der gastrointestinalen Läsionen (Indomethacin (30 mg/kg s. c.), Aspirin (400 mg/kg i. g.) und Diclofenac (125 mg/kg i. p.)) wurde NaBPC157 (10 μg oder 10 ng/kg i. p.) regelmäßig entweder gleichzeitig und/oder 1 h vor der Arzneimittelanwendung (Indomethacin) verabreicht. Bei den Studien der adjuvanten Arthritis (Schwanz-Anwendung von 0,2 ml Freund's Adjuvans) (14 Tage, 30 Tage, 1 Jahr) wurde NaBPC157 (10 μg oder 10 ng/kg i. p.) als einmalige Verabreichung (1 h, entweder vor oder nach der Anwendung von Freund's Adjuvans) oder in einem einmal täglichen Regime (0–14. Tag, 14–30. Tag und 14. Tag–1 Jahr) verabreicht.
Ergebnisse
Bei Verabreichung zusammen mit dem untersuchten NSAIAs verminderte NaBPC157 reproduzierbar die ansonsten auffallenden Läsionen im Magen der Kontrollratten sowie die Läsionen im Dünndarm in der Indomethacingruppe. Bei den adjuvanten Arthritisstudien war die Läsionsentwicklung nach einer einzigen NaBPC157-Anwendung beträchtlich vermindert und bei Ratten, die täglich mit NaBPC157 behandelt wurden, sogar noch mehr abgeschwächt. Als Therapie einer bereits etablierten adjuvanten Arthritis trat die heilende Wirkung von NaBPC157 reproduzierbar nach einer nur zweiwöchigen Medikation auf und war nach einjähriger Behandlung eindeutig sichtbar. Diese Daten zeigen die entzündungshemmende und protektive Wirkung von NaBPC157 auf die Schleimhautintegrität.
Zwei distinkte Mechanismen, Entzündung und verzögerte Hypersensitivität, sind bekanntlich an der Medikation der adjuvanten Arthritis beteiligt. NaBPC157 beeinflusst beide von ihnen positiv. Relativ zu den Referenzstandards (d. h. Aspirin, Indomethacin) war NaBPC157 in wesentlich niedrigeren Dosen (μg und ng/kg vs. mg/kg) wirksam. Diese Anfangswirksamkeit bei der adjuvanten Arthritis-Prävention wird bei täglicher Anwendung noch mehr verstärkt. Eine höhere (10 μg/kg) Dosis war entweder nach einem einzigen oder täglichen Regime wirksam, wohingegen eine niedrigere (10 ng/kg) Dosis, die bisher als Einzelanwendung unwirksam verabreicht wird, bei Anwendung in einem täglichen Regime wirksam wurde. Diese Feststellung in Verbindung mit der therapeutischen Wirkung von NaBPC157 auf die voll etablierte Arthritis beweist eine brauchbare Anwendung während des gesamten Verlaufs der adjuvanten Arthritis. Die festgestellte Wirksamkeit von NaBPC157 bei adjuvanter Arthritis (prophylaktische/therapeutische Wirkung, nicht etablierte/etablierte adjuvante Arthritis) konnte mit den derzeit verwendeten therapeutischen Mitteln nicht festgestellt werden. Bei der adjuvanten Arthritis-Prävention sind Glucocorticoide bei täglicher Verabreichung, allerdings nicht bei kurzzeitiger Behandlung, wirksam. Immunsuppressiva (in hoher Dosis) und nicht steroide Analgetika sind nur mit Vor- bzw. Nachbehandlung wirksam.
Somit ist es auf der Grundlage der starken Ähnlichkeit zwischen dem eingesetzten Modell und den entsprechenden menschlichen Störungen offensichtlich, dass NaBPC157 mit seinen mukosaprotektiven Eigenschaften zur Behandlung von Zuständen im Zusammenhang mit einer akuten Entzündung und chronischer Arthritis verwendet werden kann. Zusätzlich kann NaBPC157 zur Behandlung von Störungen im Zusammenhang mit Hypersensitivitätsstörungen des verzögerten Typs und gastrointestinalen Läsionen, die in verschiedenen Teilen des Gastrointestinaltrakts ausgelöst werden, insbesondere diejenigen die durch Mittel, wie NSAIAs ausgelöst werden, verwendet werden.
BEISPIEL 18: Radikalfängerwirkung
Materialien und Methoden
Die hepatoprotektiven Wirkungen von NaBPC157 wurden im Vergleich mit Referenzstandards, wie Bromocriptin, Amantadin und Somatostatin, in verschiedenen experimentellen Modellen einer Leberverletzung in Ratten bewertet: 24 h Gallengang-und-Leberarterien-Ligation, 48 h restraint Stress und Verabreichung von CCl₄ (Radikalbildner). NaBPC157 wurde entweder intragastrisch oder intraperitoneal verabreicht.
Ergebnisse
NaBPC157 verhinderte wesentlich die Entwicklung von Lebernekrose oder Fettveränderungen in Ratten, die einer 24-h-Gallengang-und-Leberarterien-Ligation, 48 h restraint Stress und einer CCl₄-Behandlung (1 ml/kg i. p., Tötung 48 h danach) unterzogen wurden. Die anderen Referenz-Arzneimittel besaßen bei diesen Modellen entweder eine geringe oder keine protektive Wirkung. Die Labortests auf Bilirubin zeigten, dass SGOT und SGPT vollständig mit den makroskopischen/mikroskopischen Feststellungen korrelierten. Somit kann NaBPC157 zur Behandlung von Lebererkrankungen eingesetzt werden. Zusätzlich ist eine durch Bestrahlung verursachte Myelosuppression ein reproduzierbares Modell zum Studium der Dynamik der Erholung von Hämatopoietin-Elementen. NaBPC157 zeigte heilende Wirkungen auf durch subletale Bestrahlung ausgelöste Knochenmarksschäden.
Somit kann NaBPC157 zur Behandlung von durch Strahlung ausgelösten Knochenmarksschäden verwendet werden. Angesichts der allgemein anerkannten Beziehung von CCl₄ mit der freien Radikalbildung und Läsionsentwicklung scheinen die heilenden Wirkungen von NaBPC157 auch auf andere radikalisch, insbesondere durch Strahlung, ausgelöste Organläsionen zuzutreffen.
BEISPIEL 19: Catecholaminerges System
Einleitung
Die indirekt wirkenden sympathomimetischen Arzneimittel, wie die Amphetamine, besitzen gemeinsame Eigenschaften, wie Hervorrufen sowohl erhöhter Catecholamin-Freisetzung als auch Hemmung der Catecholamin-Wiederaufnahme (hauptsächlich Dopamin) an den Nervenendigungen im Zentralnervensystem (ZNS). Als Ergebnis der Aktivierung des dopaminergen Systems im Corpus striatum tritt stereotypes Verhalten auf. Im Allgemeinen wird angenommen, dass ein verstärktes Amphetamin-Kletterverhalten das Ergebnis einer striatalen Dopaminrezeptor-Höherregulierung nach einer dopaminantagonistischen Haloperidolanwendung ist. Dies verursacht anschließend eine Amphetamin-Supersensitivitätsentwicklung. Die Anwendung von NaBPC157 beeinflusst nicht das Gesamtverhalten nicht oder löst Stereotypien aus.
Materialien und Methoden
Die Wirkungen von NaBPC157 auf die dopaminagonistischen Amphetamin(10 mg/kg i. p.)-Stereotypien und auf die Erregbarkeit wurden studiert. NaBPC157 wurde als prophylaktische Co-Behandlung oder als therapeutisches heilendes Regime (10 μg oder 10 ng/kg i. p.) verabreicht. Stereotypes Verhalten und Erregbarkeit wurden in Ratten ausgelöst.
Ergebnisse
Regelmäßig wurden eine deutliche Linderung und Umkehr (Medikation bei maximalen Amphetaminstörungen) sowohl des stereotypen Verhaltens als auch der erhöhten Erregbarkeit (d. h. stärkeres und heftigeres Zucken, panisches Hüpfen und Flüchten) festgestellt.
Ein weiteres angepeiltes Ziel waren die Wirkungen von NaBPC157 auf das verstärkte Kletterverhalten bei Mäusen. Die Mäuse wurden mit dem Dopaminantagonisten Haloperidol (5,0 mg/kg i. p.) vorbehandelt und anschließend mit Amphetamin (20 mg/kg i. p. Provokation 1, 2, 4 und 10 Tage nach der Haloperidolvorbehandlung) behandelt, was in der Regel zum Studium der verhaltensbedingten Supersensitivität auf eine amphetaminstimulierenden Wirkung verwendet wird. Wenn somit die Antagonisierung der Amphetamin-Stereotypien als Ergebnis einer dopaminantagonistischen Wirkung (direkt oder indirekt) des getesteten NaBPC157 auftreten würde, würde eine Potenzierung der Haloperidol-Verstärkungswirkung auf das Amphetamin-Kletterverhalten erwartet werden. Im Gegensatz dazu wurde eine fast vollkommen entgegen gesetzte Wirkung verzeichnet, wenn NaBPC157 mit Haloperidol co-verabreicht wurde. Zusammen genommen liefern diese Daten den Beweis für eine Wechselwirkung von NaBPC157 mit dem Dopaminsystem. Außerdem wurde die Wechselwirkung von NaBPC157 mit dem zentralen Dopaminsystem auch in anderen experimentellen Modellen (d. h. Schutz gegen Stress-Ulzera) gezeigt. Eine Wechselwirkung mit dem Dopaminsystem wurde bereits für viele bekannte Peptide (Neurotensin, CCK, etc.) festgestellt. Zusätzlich kehrt die Anwendung von NaBPC157 auch die durch LSD (z. B. 0,3 mg/kg i. p.) ausgelösten Verhaltungsstörungen um. NaBPC157 besitzt auch eine modulatorische Wirkung auf das Dopaminsystem. Im Zustand der erhöhten Dopaminfreisetzung und -synthese, die durch Amphetamin ausgelöst wird, könnte NaBPC157 die Folgestörungen (d. h. stereotypes Verhalten) sowohl verhindern als auch umkehren. Gleichermaßen könnte NaBPC157 die Folge von durch Haloperidol blockierten Dopaminrezeptoren deutlich abschwächen. Dies legt nahe, dass die modulatorische Wirkung von NaBPC157 ebenfalls einen Ersatz des ansonsten auffallend ungenügenden Dopaminsystems einschließt. Dies vermeidet die anschließende Supersensitivität der Dopaminrezeptoren und die verstärkten Amphetaminstörungen.
Somit ist NaBPC157 ein brauchbares Mittel zur Behandlung von Schizophrenie, Amphetaminprovokationseffekten (Psychose des schizophrenen Formenkreises) und Arzneimittelmissbrauch.
BEISPIEL 20: Stress
Einleitung
Stress ist definiert als nicht spezifisches Ereignis, das Verletzungen verschiedener Organen zur Folge hat. Die Stressreaktion ist als Antwort definiert, die gegen verschiedene schädigende Ereignisse gerichtet ist. Eines der am häufigsten eingesetzten tierischen Stressmodelle ist das restraint Stress-Modell, das bei Ratten zu schwerwiegenden gastrischen Stress-Läsionen führt. Auch andere Organe könnten betroffen sein.
Materialien, Methoden und Ergebnisse
Angewandt in einer Dosis von 10 μg oder 10 ng/kg b. w., i. p. oder i. g., 1 h vor der Stressauslösung, verhinderte NaBPC157 stark die ansonsten unausweichliche Entwicklung schwerer gastrischer Läsionen. Wenn die Zeit zwischen der Anwendung des stressreduzierenden Mittels und der Stressauslösung (im folgenden Text als Zeitraum bezeichnet) verlängert wird, werden die ulkushemmenden Standardmittel praktisch unwirksam, was der eindeutigen Wirksamkeit des getesteten NaBPC157 stark widerspricht. NaBPC157 behielt seine Heilwirkung bei, auch nach einem extrem verlängerten Zeitraum von 48 h. Der von NaBPC157 ausgeübte Schutz umfasst die Linderung von Läsionen, die anderweitig regelmäßig in anderen Organen auftreten, z. B. Leber, Nebenniere, Niere, Testes, Herz, Pankreas, Milz). Da die anderen allgemein bekannten Stressparameter (d. h. thymolymphatische Involution und kortikale Hypertrophie der Nebenniere) offenbar weniger beeinträchtigt sind, ist es somit offensichtlich, dass NaBPC157 bei verschiedenen Stresszuständen angewandt werden könnte. NaBPC157 hat eine positive heilende Wirkung auf verschiedene Läsionen, die in verschiedenen Organen regelmäßig im Zusammenhang mit einer nicht spezifischen Stresspathologie auftreten. Angesichts der gleichen Ereigniskette bei Menschen wie in den angewandten Modellen wird dies sogar noch mehr betont, da NaBPC157 auch bei Anwendung bei bereits fortgeschrittener Stresspathologie (z. B. 24 h nach Stressauslösung) eine heilende Wirkung besitzt.
BEISPIEL 21: Beweis einer cytoprotektiven Wirkung
Einleitung
Die Cytoprotektion war ursprünglich als Eigenschaft zur Abwehr der Zellen gegen verschiedene schädliche Mittel definiert, eine Wirkung, die in der Magenschleimhaut als Magensäure unabhängige Wirkung dargestellt ist.
Später wurde diese Definition ausgeweitet, so dass sie im Wesentlichen ähnliche Schutzwirkungen außerhalb des Gastrointestinaltrakts einschließt, die die Läsionen verschiedener Organe (Cytoprotektion-Organoprotektion) umfassen. Die möglichen cytoprotektiven Wirkungen der Anwendung von NaBPC157 wurden auf der Grundlage ihrer Wirkung auf das Originalmodell von Robert für das Screening eines cytoprotektiven Mittels gegen Ethanol-induzierte gastrische Läsionen studiert.
Materialien, Methoden und Ergebnisse
NaBPC157 (10 μg oder 10 ng/kg i. p.) besitzt eine prophylaktische Wirkung (angewandt entweder 1 h vor oder gleichzeitig mit 96% Ethanol (1 ml/Ratte, i. g.)) und eine heilende Wirkung (angewandt 1 h nach Ethanol bei maximaler Läsionsentwicklung).
Zur Erzeugung einer säurefreien Umgebung für die Cytoprotektionsstudien wurde 24 h vor dem ulcerogenen Prozess eine Totalgastrektomie vorgenommen. In Abwesenheit von Magen und Magensäure wurden die schädigenden Wirkungen von Cysteamin (400 mg/kg s. c., Tötung 24 h danach), das bisher als säureähnliches Duodenal-Ulcerogon angesehen wurde, und die cytoprotektiven Wirkungen von NaBPC157 (10 μg oder 10 ng/kg i. p.) weiterhin im Vergleich mit Referenzmitteln (Cimetidin (50), Ranitidin (10), Omeprazol (10), Bromocriptin (10) und Antropin (10) (Werte angegeben in mg/kg i. p., 1 h vor Cysteamin)), die ebenfalls als cytoprotektiv bekannt sind, provoziert. In nativen Ratten mit intaktem Magen besaßen alle angewandten Substanzen eine sehr günstige Wirkung. In den gastrektomisierten Tieren verhinderte die Anwendung der untersuchten Mittel (d. h. NaBPC157 oder die Referenzmittel vor Cysteamin) die ansonsten schwere duodenale Läsionsentwicklung wesentlich, die in den gastrektomisierten Cysteamin-Kontrollratten festgestellt wurde. In den nicht mit Cysteamin behandelten Gruppen wurden keine Läsionen festgestellt (Laparatomie und Gastrektomie nach nur 24 h oder 48 h postoperativ), und es wurde in den mit Cysteamin behandelten laparatomisierten Tieren auch keine Läsionspotenzierung festgestellt. Diese Feststellungen (gleiche schädigende Wirkung von Cysteamin, gleicher Schutz von NaBPC157 und den Referenzmitteln in gastrektomisierten Ratten mit intaktem Magen und ohne Magen; die schädigende oder protektive Wirkung hängt nicht mit der Magensäure-Sekretion zusammen) sind ein Hinweis auf eine cytoprotektive Wirkung. Eine Analogie (die Läsionen hängen nicht mit der Magensäure zusammen) zwischen gastrischen (z. B. Ethanol) und duodenalen Cysteamin-Verletzungen wird eindeutig nahe gelegt. Ein hohes Cytoprotektionsvermögen, das offensichtlich säureunabhängig und allen getesteten Mitteln gemeinsam ist, allerdings für NaBPC157 eindeutig auffallender ist, ist offensichtlich.
Da NaBPC157 in viel geringeren Dosen als die anderen Mittel (d. h. μg oder ng/kg vs. mg/kg) wirksam war, kann seine Wirksamkeit (und therapeutische Anwendung) auf verschiedene Organläsionen ausgedehnt werden. Dies beruht auf der Tatsache, dass die Wirksamkeit der anderen Mittel in anderen Organen auf Grund ihrer cytoprotektiven Wirkungen (z. B. Somatostatin: Läsionen von Nebenniere, Pankreas, Leber, Lunge und des Gastrointestinaltrakts) ebenfalls nahe gelegt.
BEISPIEL 22: Beweis einer organprotektiven Wirkung
Einleitung
Für eine brauchbare Ausweitung der „cytoprotektiven" Wirkung zu einer „organprotektiven" Wirkung wird in der Regel die Erforschung des Endothels akzeptiert. Als eindeutiges Anzeichen sind die Monastralblaustudien an Ethanol-geschädigten Ratten-Magenschleimhäuten auf Grund der Fähigkeit von Monastralblau, an geschädigtes Endothel zu binden, weithin anerkannt.
Materialien und Methoden
Sämtliche Ratten erhielten Monastralblau (MB) (Sigma Company U.S.A.) (1,50 ml/kg b. w., i. v.) 3 min vor Ethanol, und die Tiere wurde 1 min nach der Ethanolbehandlung getötet. NaBPC157 (10,0 μg/kg i. p.) oder Salzlösung (5,0 ml/kg i. p.) wurden 1 h vor dem Ethanol verabreicht. Unmittelbar nach der Tötung wurde der Magen entfernt, und die Läsionen wurden durch unvoreingenommene Beobachter, wie vorstehend beschrieben, bewertet. Repräsentativen Abschnitte von Magen und Duodenum wurden zur weiteren histologischen Analyse bearbeitet. Gefäßverletzungen in dem frühen Zeitraum (1 min nach der Ethanolbehandlung) wurden unter Anwendung der Monastralblautechnik bewertet. Die Flächendichte der angefärbten Schleimhaut wurde durch TEM geprüft.
Ergebnisse
Eine stark verminderte MB-Anfärbung wurde reproduzierbar in Gruppen festgestellt, die mit NaBPC157 behandelt wurden. Zudem wurden bei Anwendung von NaBPC157 keine negativen Wirkungen festgestellt. Trotz Anwendung hoher Dosen (z. B. g/kg b. w., i. p.) wurde kein Einfluss auf die verschiedenen basalen Parameter und keine Toxizität festgestellt.
Unter Berücksichtigung des weit verbreiteten Vorliegens von endothelialem Vaskulaturgewebe im Körper und der essentiellen Rolle des Endothels für die organprotektiven Wirkungen kann NaBPC157 bei verschiedenen Organläsionen als organprotektives Mittel verwendet werden.
BEISPIEL 23: Akute Pankreatitis
Materialien und Methoden
NaBPC157 wurde an Ratten als protektives oder therapeutisches Mittel bei akuter Pankreatitis (ausgelöst durch Gallengang-Ligation) getestet. Gleichzeitig wurde der Einfluss von NaBPC157 auf die damit begleitend entwickelten gastrischen und duodenalen Läsionen erforscht.
NaBPC157 (10 μg oder 10 ng/kg b. w., i. p., i. g.) wurde prophylaktisch 1 h vor der Ligation verabreicht, wohingegen die Therapie bei täglicher Anwendung 1 Tag nach der Ligation (letzte Anwendung 24 h vor der Tötung) durchgeführt wurde. Die Wirkung wurde in täglichen Zeitabständen bis zum Ende des 5. Tags nach der Ligation untersucht.
Ergebnisse
Bei der Vorbehandlungsanwendung wurde ein starker Pankreas-Schutz erhalten. Bei Anwendung im Zustand der bereits etablierten schweren akuten Pankreatitis wurde eine offenkundige heilende Wirkung reproduzierbar festgestellt. Unter Bewertung des Aussehens von Nekrose, Ödem, Neutrophilen und Mononukleären wurden bei NaBPC157 behandelten Ratten reproduzierbar weniger Nekrose, Ödem und Neutrophile, allerdings mehr Mononukleäre, festgestellt. Bei den Studien der Serum-Amylasewerte relativ zu den Kontrolldaten wurde ein deutlich geringerer Anstieg (NaBPC157-Vorbehandlungsanwendung) sowie ein Verlust in den bereits erhöhten Werten (therapeutische NaBPC157-Anwendung) festgestellt. Zusammen mit seiner günstigen Wirkung bei Pankreatitis wurde ein positiver Einfluss von NaBPC157 auf den gastrischen und duodenalen Läsionsverlauf in Gallengang-ligierten Ratten sowohl bei Vor- als auch Nachbehandlungsanwendungen festgestellt. Zusammengenommen kann NaBPC157 zur Behandlung akuter Pankreatitis mit zusätzlicher positiver Wirkung auf die damit einhergehende Gastroduodenal-Pathologie angewandt werden.
BEISPIEL 24: Wirkung auf die Kardiotoxizität
Materialien und Methoden
Die Experimente wurden an Albino-Wistar-Ratten und Hartley-Meerschweinchen durchgeführt. Die Kardiotoxizität wurde durch Verabreichung einer Bariumchloridlösung (10 mg/kg b. w.), Desipramin (10 mg/kg), Digitalis (Gesamtdosis 6,5 mg/kg) und Isoprenalin (15 mg/kg) über eine Jugularvenenkanüle ausgelöst. Zusätzlich wurde Doxorubicin in mehreren Dosen (3 mg/kg s. c. einmal wöchentlich über 13 Wochen) und in Einzeldosen (7 mg/kg i. v.) verabreicht und provozierte eine Kardiomyopathie. Die Kardiotoxizität wurde auch durch einen Immobilisierungsstress als nicht pharmakologischer Myokardschaden ausgelöst. NaBPC157 wurde wie nachstehend angegeben verabreicht:

1. Bariumchlorid
a) Vorbehandlung (1 h zuvor): NaBPC157 50 μg/kg, 10 μg/kg und 10 ng/kg, intraperitoneal;
b) Nachbehandlung (nach 60 s): NaBPC157 10 μg/kg und 10 ng/kg, intravenös;
2. Desipramin: NaBPC157 50 μg/kg und 50 ng/kg, intraperitoneal 1 h zuvor;
3. Digitalis: NaBPC157 50 μg/kg und 50 ng/kg, intravenös in 15-minütigen Intervallen;
4. Isoprenalin: NaBPC157 50 μg/kg und 50 ng/kg, intravenös 15 min zuvor;
5. Immobilisierungsstress: NaBPC157 10 μg/kg und 10 ng/kg, intraperitoneal 1 h zuvor und unmittelbar nach dem Festbinden und 24 h und 48 h nach der Immobilisierung;
6.
a) chronische Doxorubicintoxizität: NaBPC157 10 μg/kg und 10 ng/kg, intraperitoneal gleichzeitig mit Doxorubicin;
b) akute Doxorubicintoxizität: NaBPC157 10 μg/kg und 10 ng/kg, intraperitoneal 1 h vor Doxorubicin.

Bei den Arrhythmie-Modellen wurde an anästhesierten Tieren ein Elektrokardiogramm kontinuierlich aufgezeichnet. Alle 15 s oder wenn Rhythmusstörungen auftraten, erfolgten längere Aufzeichnungen bei 50 mm/s oder 100 mm/s. In anderen Modellen wurde mit Tieren, die kurzzeitig anästhesiert wurden, ein Elektrokardiogramm mit einer Papiergeschwindigkeit von 50 mm/s in längeren Aufzeichnungen einmal oder wiederholt aufgezeichnet. Die Doxorubicin-Toxizität wurde durch makroskopische und mikroskopische Untersuchung des Herzens und anderer Organe durch biochemische Analysen bewertet. Ein ähnliches Verfahren wurde bei den Immobilisierungsstresstests angewandt.
Ergebnisse
Eine antiarrhythmische Wirkung von NaBPC157 im Modell der Bariumchlorid-induzierten Arrhythmien wurde festgestellt. Bei den Vorbehandlungsstudien verzögerte NaBPC157 das Auftreten der Arrhythmie und verhinderte sie und verminderte und/oder verhinderte die Ischämie. Bei den Nachbehandlungsstudien verursachte NaBPC157 eine schnelle Umwandlung zum Sinusrhythmus und verhinderte das Wiederauftreten von Arrhythmie.
NaBPC157 verhinderte vollständig die plötzliche Abnahme der Herzfrequenz und Leitungstörungen, ausgelöst durch Desipramin (PQ-Verlängerung und QRS-Verbreiterung). NaBPC157 verhinderte auch die ventrikuläre Tachykardie im Zusammenhang mit der proarrhythmischen Wirkung von Desipramin und einen schweren atrioventrikulären Block. Die Wirkung ist dosisabhängig.
Außerdem besitzt NaBPC157 selektive Wirkungen auf die Digitalis-induzierte Kardiotoxizität. NaBPC157 zeigte positive Wirkungen auf die plötzliche Abnahme der Herzfrequenz und auf Rhythmusstörungen (ventrikuläre Extrasystole, ventrikuläre Tachykardie und atrioventrikulärer Block) durch Prävention oder Linderung. Die Wirkung von NaBPC157 in ng-Dosen auf die durch eine toxische Dosis von Digitalis ausgelöste Leitungsverlangsamung war nicht signifikant. Die Wirkung war mit μg-Dosen von NaBPC157 deutlich auffallender.
NaBPC157 verhinderte eindeutig Ischämie und Myokardinfarkt. Die Wirkung war mit μg-Dosen deutlich auffallender. Intraperitoneale Einzelverabreichung von NaBPC157 in Form einer Vorbehandlung führte zur Prävention der elektrokardiographisch gezeigten Ischämie und der histologischen Myokardschädigung während des Immobilisierungsstresstests. Die Nachbehandlungsverabreichung von NaBPC157 in bereits offenkundigen elektrokardiographischen Änderungen linderte ebenfalls die Ischämie. μg-Dosen von NaBPC157 ergaben, insbesondere bei der Vorbehandlungsanwendung, eine Zunahme in der Spannung des QRS-Komplexes.
Die Anwendung von NaBPC157 führt nach einer einzigen und im größeren Ausmaß nach mehreren Doxorubicin-Verabreichungen zu wesentlich verminderten pathomorphologischen Feststellungen einer Antracyclin-Kardiomyopathie (schwere Schädigung von Myozyten und Gefäßwänden und Vakuolisierung). Die LDH-Aktivität ist trotz deutlich erhöhter absoluter Werte nennenswert verringert.
Zusammenfassend erweist sich NaBPC157 als antiarrhythmisches, antianginales und kardioprotektives Mittel brauchbar.
BEISPIEL 25: Antidepressive Wirkung
Materialien und Methoden
Verschiedene Antidepressiva haben eine ulkushemmende Wirkung, und den derzeit verwendeten Modellen in der Ulkus- und Depressionsforschung sind zu einem beträchtlichen Ausmaß Ähnlichkeiten gemeinsam. Darum wurde die Möglichkeit, dass Depressionsstörungen durch ein primär ulkushemmendes Mittel mit cyto/organprotektiver Wirkung, wie NaBPC157, wirksam beeinflusst werden könnten, in zwei Ratten-Depressionstests erforscht: der erzwungene Schwimmtest (Porsolt-Verfahren) und das Verfahren eines chronischen unvorhersagbaren Stresses (nach einem 5-tägigen Protokoll mit unvorhersagbarem Stress einmal täglich Arzneimittelverabreichung während des Stressvorgangs und eine offene Immobilitätstest-Feldbewertung am 4. und 6. Tag der Medikation).
Ergebnisse
Bei dem erzwungenen Schwimmtest entsprach eine herabgesetzte Immobilitätsdauer in den mit NaBPC157 (10 μg, 10 ng, 10 pg/kg, i. p.) behandelten Ratten der Aktivität der Tiere, die mit 15 mg oder 40 mg (i. p.) der herkömmlichen Antidepressiva Imipramin bzw. Nialamid behandelt wurden. Eine weitere Erschwerung der experimentellen Bedingungen bei dem chronischen unvorhersagbaren Stressvorgang führt zu einem Versagen der Imipramin-Wirkung (30 mg), wohingegen NaBPC157 (10 μg, 10 ng) dosisabhängig die Mobilität der chronisch gestressten Ratten verbesserte.
BEISPIEL 26: Parkinson-Krankheitsmodelle
Materialien und Methoden
Parkinsongene Mittel, 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) (zerstört bekanntlich das nigrostriatale Dopamin-System durch Bildung freier Radikale) (30,0 μg/kg b. w., i. p. einmal täglich 6 Tage und nach 4 Tagen einmal 50,0 mg/kg b. w., i. p.) oder Reserpin (ein Katecholamin-Vesikelentleerungsmittel) (5,0 mg/kg b. w., i. p.), wurden verabreicht. NaBPC157 (1,50 μg oder 15,0 ng/kg b. w., i. p.) wurde 15 min vor oder alternativ 15 min nach jeder MPTP-Verabreichung verabreicht. Bei den Reserpin-Studien wurde NaBPC157 (10,0 μg oder 10,0 ng/kg b. w., i. p.) entweder 15 min vor Reserpin oder bei bereits etablierter vollständiger Katalepsie 24 h danach verabreicht.
Ergebnisse
NaBPC157 verbesserte sehr stark die MPTP-gestörte somatosensorische Orientierung und verminderte die MPTP-induzierte Hyperaktivität. Außerdem verminderte NaBPC157 die motorischen MPTP-Abnormalitäten (Tremor, Akinesie, Katalepsie, sonst sehr auffallend in der Salzlösungskontrolle) und führte zu einer fast vollständigen Aufhebung des normalerweise letalen Verlaufs der MPTP-Behandlung in Kontrollen. In den Reserpin-Experimenten verhinderte NaBPC157 sehr stark die Entwicklung der ansonsten sehr deutlichen Katalepsie. Bei Anwendung 24 h danach kehrte NaBPC157 die etablierte Katalepsie um. Unterstützend wurde eine herabgesetzte Reserpin-Hypothermie (NaBPC157 Vorbehandlung) und eine Umkehr eines weiteren sehr deutlichen Temperaturabfalls (NaBPC157-Nachbehandlung) reproduzierbar festgestellt.
Beide der oben verwendeten gebräuchlichen Tiermodelle geben bekanntlich einen Hinweis auf die menschlichen Störungen und ihre Therapie. Auf Grund der Tatsache, dass in Vor- und Nachbehandlungsstudien unter μg- und ng-Regimen eine hohe Wirksamkeit gezeigt wurde, scheint NaBPC157 zur Verwendung bei der Behandlung von Parkinson-Krankheit und parkinsonartigen Pathologien gut geeignet zu sein.
Außerdem lässt die beobachtete Wirkung auf die Reserpin-Hypothermie den Schluss zu, dass NaBPC157 zur Therapie von Temperaturstörungen gut geeignet ist.
BEISPIEL 27: Wirkung auf die Heilung von Knochendefekten
Materialien und Methoden
Die osteogene Wirkung von Knochenmark und TRIS-BPC157 auf die Heilung von Knochensegmentdefekten wurde 6 Wochen an 42 Kaninchen postoperativ studiert. Im Anschluss an die Verletzungsauslösung (ein 0,8 cm osteoperiostaler Defekt wurde in der Mitte von beiden Radien erzeugt) wurden die Experimente unter Verwendung von Knochenmark und TRIS-BPC157 (6 Kaninchen pro Gruppe) wie folgt durchgeführt: mit Salzlösung (2 ml intramuskulär und 2 ml lokal jeweils in den Knochendefekt) behandelte verletzte Tiere wurden als Kontrollen (Gruppe 1) verwendet. Bei der zweiten und dritten Gruppe wurde jeder Knochendefekt lokal entweder mit 2 ml autologem Knochenmark (7. postoperativer Tag) oder mit TRIS-BPC157 (10 μg/kg b. w. 7. und 14. postoperativer Tag) behandelt. In den Gruppen 4, 5 und 6 wurde TRIS-BPC157 intramuskulär (i. m.) entweder am Tag 7, 9, 14 und 16 postoperativ (10 μg/kg b. w.) oder einmal täglich zwischen dem 7. bis 21. Tag postoperativ (10 μg oder 10 ng/kg b. w.) angewandt. Als Standardbehandlung unmittelbar nach ihrer Bildung wurden die Knochendefekte der 7. Gruppe mit einem autologen Kortex-Transplantat gefüllt.
Sämtliche Tiere wurden in der 6. postoperativen Woche getötet. Die Segmentdefekt-Heilung wurde mit zweiwöchigen Radiographien und histologischen Untersuchungen bewertet.
Ergebnisse
Der Parallelvergleich der Radiographien, die in 4-fachen Intervallen (Kallusoberfläche, Mikrophotodensitometrie des Knochendefekts) aufgenommen wurden, und die quantitative Histomorphometrie ergaben, dass das Knochenmark, das lokal in den Knochendefekt injiziert wurde, und TRIS-BPC157, das intramuskulär verabreicht wurde (insbesondere in einer Tagesdosis von 10 μg/kg b. w. während des 14-tägigen Zeitraums), die Knochenheilung wesentlich beschleunigte (p < 0,001). Die Wirkung entspricht der Wirkung der autologen Kortex-Transplantation.
Unter Berücksichtigung der klinischen Relevanz dieser Studie lösten Knochenmark und TRIS-BPC157 (insbesondere in einer Tagesdosis von 10 μg/kg b. w. 14 Tage lang) die Heilung der Knochendefekte aus. Wegen seiner einfachen Verabreichung und des geringen Risikos von Komplikationen bedeuten autologes Knochenmark, das lokal verabreicht wird, und insbesondere intramuskulär verabreichte osteogene Substanzen, wie TRIS-BPC157, einen Vorteil gegenüber den anderen komplexeren operativen Verfahren (d. h. Knochentransplantate, vaskularisierte Knochentransplantate, Methode von Ilizarov) zur Behandlung von Heilungsstörungen bei Menschen.
BEISPIEL 28: Wirkung auf die Wundheilung
Materialien und Methoden
NaBPC157 wurde verwendet, um seinen Einfluss auf verschiedene Elemente im Zusammenhang mit dem Heilungsprozess zu ermitteln. Elemente, die bei dem Heilungsprozess als wichtig angesehen werden, sind die Bildung von Granulationsgewebe, Angiogenese und Produktion von Kollagen. Der Einfluss von NaBPC157 auf die Bildung von Granulationsgewebe, Kollagenbildung und Angiogenese sowie auf die Zugfestigkeitsentwicklung wurde unter Anwendung von 3 experimentellen Rattenmodellen getestet: 1) Hautschnittwunden 2) Darm-Darm-Anastomosen und 3) Ösophagus-Duodenal-Anastomose. Die Proben wurden unter Anwendung der Bewertungs- und Morphometrie-Methoden histologisch auf Kollagen, Retikulin und Blutgefäße bewertet.
Ergebnisse
Bei allen Experimenten wurden wesentliche Unterschiede zwischen den NaBPC157-behandelten Ratten und den Kontrollen festgestellt. Die Experimente zeigen eine starke beschleunigende Beteiligung von NaBPC157 am Heilungsprozess. Die Wirkungen wurden auf verschiedenen Anwendungswegen, einschließlich intragastrischer und lokaler Anwendung, erzielt. Außerdem ergab die Bewertung der Zugfestigkeit bei den NaBPC157-behandelten Ratten reproduzierbar erhöhte Werte.
Auf der Grundlage einer starken Ähnlichkeit zwischen Tiermodell und entsprechenden menschlichen Störungen und des hohen Ähnlichkeitsgrads zwischen den Heilungsprozessen bei Ratten und Menschen kann NaBPC157 in der Therapie zur Wundheilung bei Menschen verwendet werden.
BEISPIEL 29: Wirkung auf Atembeschwerden
Materialien und Methoden
Meerschweinchen (Hartley, beide Geschlechter, 500–700 g b. w.) mit Ganzkörper-Plethysmographie, Urethan-Anästhesie (1,5 g/kg i. p.), künstlicher Beatmung unter konstantem Druck (0,98 kPa) und Relaxation der Skelettmuskulatur durch Suxamethonium (0,2 mg/kg i. v.) wurden bei den vorliegenden Experimenten verwendet. Das Inflationsvolumen (mm, Mittelwert ± SD) wurde vor und nach Anwendung, von Spasmogenen (Histamin, Serotonin, Acetylcholin, Bradychinin, i. v.) oder NaBPC157 (10 min vor wiederholter Spasmogen-Anwendung, i. v.) bewertet.
Ergebnisse
Eine durch Serotonin, Histamin, Acetylcholin und Bradychinin hervorgerufene Abnahme des Inflationsvolumens wurde durch NaBPC157 (10 μg/kg b. w. i. v. und/oder 10 ng/kg b. w., i. v.) gehemmt.
Auf der Grundlage der beobachteten heilenden Wirkung von NaBPC157 auf die durch verschiedene Spasmogene ausgelöste Bronchiokonstriktion und auf der Grundlage der bekannten großen Ähnlichkeit zwischen verwendetem Modell und menschlichen Zuständen ist eine erfolgreiche Anwendung von NaBPC157 bei der Behandlung verschiedener Störungen im Zusammenhang mit Bronchiokonstriktion und/oder Störungen der Atemwege offensichtlich.
BEISPIEL 30: Wirkung auf das pulmonale Hypertensionssyndrom
Materialien und Methoden
Die vorliegenden Experimente beschreiben die Wirkungen von Stickoxid(NO)-Agonisten und -Antagonisten und den Einfluss von NaBPC157 auf die Entwicklung des pulmonalen Hypertensionssyndroms (PHS) und von Gewebeläsionen bei Hühnern. Es wurden Experimente durchgeführt, die die akute Toxizität untersuchten. Diese umfassten Einzeldosis-Anwendungen von Salzlösung (1 ml i. p.), NaBPC157 (10 μg/kg b. w.), L-NAME (NO-Antagonist/Dosen 50, 100, 150 mg/kg b. w.) und L-Arginin (NO-Agonist/100 mg/kg b. w./mit ihrer Kombination (L-NAME + NaBPC157, L-NAME + L-Arginin)). Es wurden pathohistologische Untersuchungen von Milz, Herz, Leber und Lunge und die hämatologischen Analysen durchgeführt. Außerdem wurden chronische Toxizitätsexperimente durchgeführt. Die Tiere wurden täglich 5 Wochen lang mit L-NAME (10 mg/kg b. w.), L-Arginin (100 mg/kg b. w.), NaBPC157 (10 μg/kg b. w.) und ihren Kombinationen (L-NAME + NaBPC157, L-NAME + L-Arginin) intraperitoneal behandelt. Sieben Tiere aus jeder Gruppe, einschließlich Kontrollen (Salzlösung 1 ml i. p.), wurden jede Woche getötet.
Ergebnisse
Die Anwendung von L-NAME verursachte in den behandelten Hühnern PHS. Die Wirkung wurde durch gleichzeitige Anwendung von L-Arginin und NaBPC157 verhindert. Die pathohistologischen Untersuchungen sowohl der akuten als auch chronischen Toxizität ergaben, dass L-NAME schwere Gewebeschäden (myokardiale und hepatische Zellnekrose und Nekrose der Lymphoidzellen in der Milz) verursachte, während L-Arginin vorwiegend Kongestion, Ödem und Hämorrhagien in sämtlichen Organen hervorrief. Die hämatologischen Analysen zeigten wesentliche Abnahmen in Hämoglobin und Leukozytenanzahl in der L-NAME-behandelten Gruppe der Hühner. Die Wirkungen von L-NAME wurden durch die Anwendung von L-Arginin und NaBPC157 erfolgreich gehemmt. NaBPC157 verursachte keinerlei Gewebe- oder Organschädigung.
In Anbetracht der Ähnlichkeit des oben angewandten tierischen Modells und der entsprechenden menschlichen Störungen kann NaBPC157 zur Therapie des pulmonalen Hypertensionssyndroms verwendet werden. Außerdem ist seine geeignete Anwendung in der kommerziellen Zucht offensichtlich.
BEISPIEL 31: Experimentelle Hypertension
Materialien, Methoden und Ergebnisse
In hypertensiven Tieren (Goldblatt-Hypertension) mit zwei Nieren (2K1C) oder mit einer Niere (1K1C) verminderte NaBPC157 den Blutdruck schnell (z. B. 5 oder 10 min nach Injektion). Diese Wirkung hielt in 1K1C-Ratten 20 min oder mindestens 12 h in 2K1C-Ratten an. Die Wirkung wurde nach einer zweiten oder dritten Anwendung 24 bis 48 h danach wiederholt erzielt. Gleichermaßen verminderte NaBPC157 in Ratten, die entweder mit einer fructosereichen (80%) oder salzreichen (15%) Diät für einen längeren Zeitraum gefüttert wurden, deutlich die ansonsten kontinuierlich erhöhten Blutdruckwerten in Richtung normaler Werte. Die therapeutische Wirkung ist lang anhaltend, und eine Toleranz wurde auch nach 6-monatiger Dauer nicht entwickelt. Es wurde kein Einfluss von NaBPC157 auf die basalen Blutdruckwerte festgestellt.
Zusätzlich zu einer Abnahme bei den sonst erhöhten Blutdruckwerten verursachte NaBPC157 auch eine deutliche Linderung oder sogar Beseitigung der normalerweise in verschiedenen Organen auftretenden Läsionen und Störungen, die folgende waren (nach 3 Wochen einer salzreicheren Diät in den Kontrollen): sehr schwere Hyalin-Degeneration mit auffallenden Parenchym-Hämorrhagien, Degeneration der Arterienwände, Vakuolisierung der Zellen im Herz, schwere Kongestion (insbesondere medullär) in den Nebennieren, schwere Kongestion, parenchymatöse Blutung mit Hämaturie in der Niere und Hämosiderose und Erzthrocytophagie in der Milz. In den NaBPC157-behandelten Ratten waren die Gefäße viel weniger beschädigt, zusätzlich zu einer geringeren Vakuolisierung der Wand und fehlender Hämorrhagien-Bildung. Außerdem wurde in den NaBPC157-behandelten Ratten reproduzierbar ein eindeutiger Schutz gegen eine Fundus-Schädigung bewiesen.
Unter Verwendung verschiedener Modelle tierischer Hypertension erzielte NaBPC157, verabreicht als 10 μg oder 10 ng/kg b. w., i. v., i. p. oder i. g., im Rahmen von verschiedenen Regimen reproduzierbare Ergebnisse. In Anbetracht der offensichtlichen Ähnlichkeit dieser Modelle mit den entsprechenden menschlichen Zuständen kann NaBPC157 zur Behandlung der Hypertension und verschiedener durch Hypertension verursachter Organschäden verwendet werden.
BEISPIEL 32: Wirkung auf die Blutungsdauer
Materialien und Methoden
Die Wirkung von 2-AMP-BPC157 auf die Blutungsdauer in Mäusen und Ratten (mit und ohne Heparin-Vorbehandlung) wurde in Verbindung mit der in vitro Wirkung auf die Gerinnungsparameter in menschlichem Blut erforscht.
Ergebnisse
Unter den basalen Bedingungen (2-AMP-BPC157, 10 μg, 10 ng, 10 pg, 1 pg, 10 fg/kg b. w., i. p., gleichzeitig mit einer Schwanz-Inzision) wurde eine starke dosisabhängige verminderte Blutungsdauer reproduzierbar sowohl in Mäusen als auch Ratten gezeigt. In den Heparin(1000 IU/kg i. p.)-Vorbehandlungsstudien (2 h vor der Blutungsauslösung) wurde regelmäßig eine auffallende Verminderung der ansonsten stark erhöhten Blutungsdauer in den mit entweder 10 μg oder 10 ng/kg b. w. i. p. 2-AMP-BPC157 behandelten Tieren verzeichnet. In vitro wurde keine Einfluss (2-AMP-BPC157 in der Konzentration von 10 μg/ml, Inkubation 1 h) auf die Gerinnungsparameter in menschlichem Blut gezeigt. Somit wird eine Wirkung auf die Endothelschicht nahe gelegt.
In Anbetracht der starken Ähnlichkeit der Blutungsmechanismen bei Menschen und Tieren und der weithin anerkannten Signifikanz der zum Agens-Screening angewandten Modelle kann 2-AMP-BPC157 zur Behandlung der gestörten Koagulation (z. B. Heparinisierung) verwendet werden.
BEISPIEL 33: Wirkung auf experimentellen Diabetes
Materialien, Methoden und Ergebnisse
Bei intraperitonealer (d. h. 10 μg/kg b. w.) Verabreichung zeigte sich, dass NaBPC157 die Entwicklung von Alloxan- sowie Streptozotozin-induziertem Diabetes in Ratten verhinderte. Eine abnehmende Glukosurie und geringere Inselzellenläsionen wurden während 14 Tagen festgestellt. In unseren Vorexperimenten war NaBPC157 auch bei Anwendung in Gegenwart von bereits etablierten 14-tägigen Alloxan-Läsionen wirksam. Bei weiteren Experimenten wurden ferner die antidiabetischen Wirkungen von NaBPC157 mit besonderer Konzentration auf ihre mögliche Wirkung bei intragastrischer Anwendung erforscht. NaBPC157 (Dosis 10 μg und 10 ng/kg b. w.) wurde mit einer Alloxan-Anwendung von 300 mg/kg s. c. oder 200 mg/kg b. w. s. c. in Vor-(24 h oder 1 h vor Alloxan-Anwendung), Co- und Nach-(48 h nach der Alloxan-Anwendung)Behandlungen kombiniert. Im Allgemeinen senkte NaBPC157 die erhöhten Glucoseserumspiegel und erhöhte das Überleben der Alloxan-behandelten Tiere signifikant (die Wirkung war besonders in den Gruppen offensichtlich, die mit der höheren Alloxan-Dosis behandelt wurden). Interessanterweise wurde, zusätzlich zu den erhöhten Glucoseserumspiegeln in den Alloxan-behandelten Tieren, ein übermäßiges Auftreten von gastrischen Läsionen in den diabetischen Kontrollratten festgestellt. Jedes der NaBPC157-Regime verminderte die Ulkus-Schwere nennenswert, ohne Rücksicht auf die Behandlungsbedingungen. Im Wesentlichen wurden in Mäusen die gleichen Ergebnisse erhalten.
Unter Berücksichtigung der Ähnlichkeit zwischen menschlicher Pathologie und den verwendeten Modellen und im Hinblick auf ihren breiten Einsatz zum Screening der Agens-Wirkung kann NaBPC157 zur Behandlung des Diabetes verwendet werden.
BEISPIEL 34: Schmerzhemmende Wirkungen
Materialien und Methoden
Die schmerzhemmenden Wirkungen von NaBPC157 wurden im Vergleich mit Aspirin- und Morphin-Referenzstandards bei verschiedenen experimentellen Modellen der indirekten/direkten Schmerzempfindung und Neurotoxizität bewertet: Schmerzkrümmung (Essisäure/Magnesiumsulfat), Schwanzkneifen, Heizplatte und Capsaicin-Anwendung.
Ergebnisse
NaBPC157 (verabreicht entweder im ng oder μg/kg-Bereich, i. p.) vermindert die Reaktionen bei Schmerzkrümmungs-(inflammatorisch und nicht inflammatorisch, Prostaglandin-abhängig und -unabhängig) und Schwanzkneiftests wesentlich. Bei dem Heizplattentest besaß NaBPC157 im Gegensatz zu Morphin keine Wirkung auf gesunde Tiere. Außerdem wurde NaBPC157 in Form einer Vorbehandlung oder einmal täglich 14 Tage lang nach einer Capsaicin-Injektion verabreicht. In den Tests verminderte NaBPC157 sehr stark die Capsaicin-Allodynie. Diese verminderte Wirkung von Capsaicin konnte nicht erhalten werden, wenn NaBPC157 in Gegenwart einer etablierten somatosensorischen Capsaicin-Neuronendegeneration angewandt wurde (Anwendung nur am 14. Tag nach Capsaicin). Da die sonst unausweichliche somatoneuronale Entleerung nach einer Capsaicin-Anwendung mit einer täglichen NaBPC157-Anwendung vollständig vermieden werden konnte, ist es möglich, dass die Wirkungen von NaBPC157 spezifisch zusammenhängen könnten mit der Integrität der Capsaicin-empfindlichen somatosensorischen Neuronen und ihrem Schutz (d. h. primäre afferente Neuronen mit Somata von kleinem Durchmesser und unmyelinierten (C-) oder dünn myelinierten(A-8)-Fasern).
Unter Berücksichtigung, dass Capsaicin im Wesentlichen die gleichen Störungen sowohl bei Menschen als auch Tieren auslöst, kann NaBPC157 zur Behandlung verschiedener Schmerzstörungen sowie bei Zuständen nach einer somatosensorischen neuronalen Funktionsstörung angewandt werden.
BEISPIEL 35: Wirkung auf Krämpfe
Materialien und Methoden
Die Wirkungen von KBPC157 auf Krämpfe, die durch Bicucculin, Picrotoxin, Strychnin und Isoniazid ausgelöst wurden, wurden überprüft. KBPC157 (100 μg, 10 μg oder 10 ng/kg b. w.) wurde gleichzeitig oder 15 min vor Verabreichung des konvulsiven Mittels (mg/kg b. w., i. p.) Picrotoxin (3), Strychnin (6, 3 oder 1, 5), Bicucullin (2,5) und Isoniazid (800 mg) verabreicht (i. p.).
Ergebnisse
KBPC157 erzeugte eine reproduzierbar positive (dosis- und zeitabhängig) antikonvulsive Wirkung gegen sämtliche der angewandten Krampfmittel. Angesichts der Ähnlichkeit der verwendeten Modelle mit den menschlichen Zuständen kann KBPC157 zur Behandlung von Konvulsionsstörungen verwendet werden.
BEISPIEL 36: Rückenmarksverletzung
Materialien und Methoden
Eine Rückenmarksverletzung wurde in männlichen Albino-Wistar-Ratten durch kontrollierten Druck (Aesulap-Gefäßklemme, 0,10 bis 0,15 N) auf das exponierte Rückenmark (bei einem Niveau von Th 12) für 30 s ausgelöst. Die Tiere wurden sofort nach der Verletzung einmal täglich bis zum 10. Tag nach der Verletzung mit NaBPC157 (10 μg, 10 ng/kg b. w., i. p.) oder Salzlösung behandelt. Die Tiere wurden 24 h nach der letzten Anwendung getötet.
Ergebnisse
Eine sorgfältige Untersuchung wurde sowohl klinisch (tägliche Bewertungen von 1–5) als auch mikroskopisch durchgeführt. In den mit NaBPC157 behandelten Ratten ergab sich eine starke Linderung der ansonsten (in Kontrollratten) lang anhaltenden Paralyse. Unter Berücksichtigung der Ähnlichkeit der verwendeten Modelle mit den menschlichen Zuständen kann NaBPC157 bei der Therapie von Rückenmarksverletzungen verwendet werden.
BEISPIEL 37: Chronische Alkohol-Intoxikation
Materialien und Methoden
Die Wirkungen von NaBPC157 auf eine chronische Alkohol-Intoxikation wurden überprüft. Für diese Experimente wurden männliche Albino-Wistar-Ratten verwendet. Die Ratten tranken 3 Monate lang entweder handelsüblichen Whisky oder Ethanol (10–20% wässrige Lösung). Die Anwendung von NaBPC157 (10 μg, 10 ng/kg b. w.), Propranolol (10 mg/kg, b. w.) und Ranitidin (10 mg/kg b. w.) (die Kontrollratten erhielten ein gleiches Volumen an Salzlösung 5,0 ml/kg), entweder intragastrisch oder intraperitoneal, wurde entweder prophylaktisch (10 Tage vor dem Alkoholstart) oder als Co-Behandlung zusammen mit Alkohol oder therapeutisch (Beginn am Ende eines zweimonatigen Zeitraums, d. h. während des letzten Monats des Experiments) durchgeführt.
Ergebnisse
Eine direkte Bewertung des Blutdrucks in der Portalvene zeigte eindeutig, dass NaBPC157 sowie Propranolol (verabreicht bei sämtlichen Regimen) die ansonsten erhöhten portalen Blutdruckwerte in den Kontrollratten verhinderte und/oder deutlich senkte. Im Gegensatz dazu führte die Ranitidin-Therapie zu noch stärker erhöhten portalen Blutdruckwerten als diejenigen, die in den Kontrolltieren vorhanden sind. Außerdem war NaBPC157, mehr als Propranolol, dazu in der Lage, die ansonsten fortgeschrittenen Läsionen im Magen der alkoholbehandelten Ratten deutlich zu lindern. Eine ähnliche heilende Wirkung wurde auch auf die anderen Organläsionen (d. h. Niere, Herz) festgestellt.
Angesichts dieser reproduzierbaren positiven Wirkungen und der allgemein bekannten Evidenz, dass eine verstärkte Alkoholaufnahme in Menschen ähnliche Veränderungen hervorruft, ist es offensichtlich, dass NaBPC157 bei der Therapie von Alkoholverletzungen brauchbar ist.
BEISPIEL 38: Wirkungen auf die ischämischen Gehirn-Störungen
Materialien und Methoden
NaBPC157 (10 μg oder 10 ng/kg b. w., i. p.) oder Salzlösung (5,0 ml/kg b. w., i. p.) wurde entweder 1 h vor oder 1 h nach der Ligation für 3 bis 6 h beider Carotidarterien in Ratten angewandt.
Ergebnisse
Eine starke positive Wirkung von NaBPC157 ist sowohl bei Anwendung als Vorbehandlung (1 h vor Ligation) als auch als Nachbehandlung (1 h nach Ligation) offensichtlich. Dies war sowohl im μg- als auch im ng-Bereich und sowohl bei der 3- als auch 6-h-Studie der Fall. Neben den beabsichtigten Wertungen waren schwere perivaskuläre Ödeme und Gehirngewebsödeme mit Kongestion des Gehirns die besonders distinkten und charakteristischen Feststellungen. Auch Bereiche einer Demyelinisierung wurden, insbesondere im Cerebellum, festgestellt. Alle diese Merkmale waren in den NaBPC157-behandelten Gruppen von Tieren ohne Rücksicht auf die Behandlungsbedingungen viel weniger ausgeprägt.
Angesichts der in den Kontrollen festgestellten schweren ischämischen Läsionen und der offensichtlichen Ähnlichkeit zwischen den ischämischen Störungen bei Ratten und Menschen ist eine günstige Anwendung von NaBPC157 zur Behandlung von ischämischen Gehirnstörungen bei Menschen offensichtlich.
BEISPIEL 39: Wirkung auf Nervenverletzung
Materialien und Methoden
Die Wirkung von NaBPC157 auf die periphere Nerven-Regenerierung wurde untersucht. In anästhesierten erwachsenen männlichen Wistar-Ratten (225–250 g) wurde der rechte Ischiasnerv exponiert, von Bindegewebe befreit und 5 cm distal zur Hüfteinbuchtung durchtrennt. 3 perineurale Nähte (10,0 Ethilon, Ethicon) wurden zur Anastomose verwendet, die eine ordnungsgemäße faszikuläre Ausrichtung sicherstellte. Die Tiere wurden entweder lokal an der Stelle der Anastomose durch ein Bad von 1 ml NaBPC157 (2 μg/ml oder 2 ng/ml) intragastrisch oder intraperitoneal (10 μg oder 10 ng/kg b. w.) sofort nach der Anastomosebildung behandelt. Den Kontrollen wurde ein gleiches Volumen an Salzlösung verabreicht. An den angegebenen postoperativen Tagen (Tag 3, 6, 9, 12 und 30) wurden Funktionstests durchgeführt. Die Tests umfassten einen Test mit heißem Wasser (60°C), kaltem Wasser (2°C), Laufspuranalyse, EMG-Distallatenz und CMAP-Amplitude. Auch Proben zur histologischen und morphometrischen Analyse wurden entnommen. Bei den anderen Experimenten unter Anwendung des gleichen operativen Verfahrens an der gleichen Stelle des Nervs wurde eine Quetschverletzung mit einer mikrochirurgischen Pinzette 60 s lang ausgelöst und NaBPC157 lokal angewandt. Die Bewertung wurde nach 2, 7, 10, 50 und 100 Tagen durchgeführt.
Ergebnisse
Bei Bewertung entweder klinisch oder mikroskopisch, insbesondere im frühen Zeitraum, beschleunigte die Anwendung von NaBPC157 deutlich die Heilung der verletzten Ratten.
Angesichts der starken Ähnlichkeit zwischen der tierischen Verletzung und den menschlichen Zuständen kann NaBPC157 zur Therapie der peripheren Nervenverletzung verwendet werden.
BEISPIEL 40: Wirkung auf neuroleptische Störungen
Die Wirkung von NaBPC157 auf verschiedene neuroleptische ausgelöste Störungen wurde überprüft.
Materialien, Methoden und Ergebnisse
Die Anwendung von NaBPC157 (10 μg oder 10 ng/kg b. w., i. p.) linderte reproduzierbar die Haloperidol- und Fluphenazin-Katalepsie (Haloperidol 0,625, 1,25, 2,5, 5,0 und 10,0 mg/kg b. w., i. p., Fluphenazin 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5 und 5,0 mg/kg b. w., i. p. (4,0 ml/kg)) bei den niedrigeren Dosen beider Neuroleptika in den anschließenden Zeitintervallen. Zusätzlich zu der heilenden Wirkung der niedriger dosierten Neuroleptika tritt eine noch günstigere antikataleptische Wirkung von NaBPC157 mit einer höheren Dosis beider Neuroleptika auf, die sowohl mit μg- als auch ng-Dosen von NaBPC157 beobachtet wird. Die Wirkung wurde auch bei der somatosensorischen Orientierung von mit Sulpirid (20, 40, 80 und 160 mg/kg b. w., i. p.) behandelten Tieren festgestellt, obwohl in den Sulpirid-Kontrollmäusen keine Katalepsie festgestellt werden konnte.
Die günstige Anwendung von NaBPC157 bei der Behandlung von Störungen im Zusammenhang mit Dopamin-Systemen, kataleptischen Störungen und neuroleptischen Störungen ist offensichtlich.
BEISPIEL 41: Anwendung in der Schocktherapie
Materialien und Methoden
Ein experimenteller hämorrhagischer Schock wurde in anästhesierten Ratten (Kanülen in einer gemeinsamen Carotidarterie und in einer Jugularvene) untersucht. Eine kontrollierte Blutvolumen-Entfernung wurde bis zum Tod oder zum stabilisierten niedrigen Blutdruck (30–35-mmHg) durchgeführt. Bei diesen Experimenten wurde CaBPC157 (10 μg oder 10 ng/kg b. w.) oder Salzlösung intraperitoneal (5,0 ml/kg) 15 min vor dem Ausbluten oder intravenös (3,0 ml/kg) nach einem Zeitraum von 5 min eines stabilen niedrigen Blutdrucks verabreicht.
Ergebnisse
Relativ zu den Kontrollwerten wurde ein wesentlich höherer lang anhaltender Blutvolumen-Verlust (der Dosis-abhängig ist) vor dem Tod in den CaBPC157-behandelten Ratten reproduzierbar festgestellt. In hypovolämischen und hypotensiven Tieren, die mit CaBPC157 behandelt wurden, wurde eine sofortiger und lang anhaltende signifikante Blutdruckzunahme ohne Sterben gezeigt. Dies steht im Gegensatz zu dem kurzen und schwachen Blutdruckanstieg und einer 75%-igen Todesrate vor dem Ende des 45-minütigen experimentellen Zeitraums in der Kontrollgruppe. In Ratten, die nur dem operativen Eingriff nach Anästhesierung unterzogen wurden, allerdings nicht ausbluteten, beeinflusste CaBPC157 (i. p. oder i. v.), verabreicht nach einem 65-minütigen Stabilisierungszeitraum, die arteriellen Blutdruckwerte innerhalb des gleichen Zeitraums nach der Anwendung nicht wesentlich. Diese Daten legen nahe, dass CaBPC157 bei der Verbesserung der Folgen eines akuten Blutvolumen-Verlusts wirksam sein könnte. Angesichts der offensichtlichen Ähnlichkeit zwischen den verwendeten Tiermodellen und den menschlichen Störungen kann CaBPC157 zur Schocktherapie verwendet werden.
BEISPIEL 42: Wirkung auf abnorme Lymphozyten
Materialien, Methoden und Ergebnisse
Die immunologischen Feststellungen bei 2 weiblichen Patienten, die an einem seltenen klinischen Erscheinungsbild – hereditäre Eosinophilie in Verbindung mit intraepidermaler bullöser Dermatitis und subakuter sklerosierender Panenzephalitis – litten, wurden überprüft. Die Wirkungen von NaBPC157 (in vitro) auf die lymphozytären Chromosomen-Aberrationen und die T-Zellen-Proliferation wurde erforscht. NaBPC157 bewirkte eine nennenswerte Verminderung der schweren Typen der Chromosomen-Aberrationen (d. h. Feststellung von normalisierten Lymphozyten) und zeigte eine stimulatorische Wirkung auf die Mitosecyclen.
BEISPIEL 43: Wirkungen auf Missbildungen
Materialien und Methoden
Die Wirkung von NaBPC157 auf die Vitamin A-induzierten Missbildungen in Mäusen wurde überprüft. NaBPC157 (10 ng/kg b. w. oder 10 μg/kg b. w., i. p.) oder Salzlösung (5 ml/kg b. w., i. p.) wurde gleichzeitig mit Vitamin A (15700 IU/kg b. w., i. m.) am 10. Tage der Schwangerschaft verabreicht. Nicht mit Vitamin A behandelte Mäuse, die allerdings eine Salzlösung der gleichen Dosis zum gleichen Zeitpunkt erhielten, wurden als Kontrollen eingesetzt.
Ergebnisse
Durch die Anwendung von Vitamin A wurde eine Anzahl von Missbildungen ausgelöst. Eine nennenswerte Verminderung in der Anzahl der Missbildungen wurde in den Gruppen festgestellt, die mit NaBPC157 behandelt wurden. Eine günstige Anwendung von NaBPC157 in der Therapie fetaler Störungen ist offensichtlich.
BEISPIEL 44: Ovariektomie
Materialien und Methoden
Eine herkömmliche Ovariektomie wurde durchgeführt. NaBPC157 wurde entweder einmal täglich 28 Tage lang oder einmal täglich 14 Tage lang, beginnend am 15. Tag nach der Ovariektomie, angewandt (10 μg oder 10 ng/kg b. w., i. p.). Regelmäßig erfolgte bei dem verlängerten Regime die letzte Anwendung 24 h vor der Tötung. Die anderen Gruppen erhielten eine einzige μg-Anwendung am 15. Tag nach der Ovariektomie. 5 Gruppen wurden als Kontrollen verwendet: 2 Gruppen waren ovariektomisiert, mit Salzlösung behandelt und wurden am 15. und 28. Tag nach der Ovariektomie getötet. Eine Gruppe war nicht ovariektomisiert, allerdings mit Salzlösung behandelt, und 2 nicht ovariektomisierte Gruppen wurden einmal täglich 28 Tage lang mit NaBPC157 (10 μg oder 10 ng/kg b. w., i. p.) behandelt. Vaginalabstriche wurden jedem Tier 5 min vor der Operation an den Tagen 9, 14 und 28 des Experiments entnommen und zur cytologischen Bewertung Pap-angefärbt. Der Maturationsgrad des Vaginalepitels wurde mittels der Maturationswerte ausgedrückt. Nach der Tötung wurden die Extremitäten-Knochen von jedem Tier zum Zwecke des biochemischen Tests, wie nachstehend kurz beschrieben, gesammelt.
Biomechanische Testung
Sämtliche Knochen wurden in Abhängigkeit von den unterschiedlichen Biegemomenten (Einpunktebiegung) (Biegemoment = Nm) in verschiedene Richtungen, anterior, posterior und latero-lateral, überprüft. Bei diesem Experiment wurden die Femoral- und Tibialknochen verwendet. Die distalen Teile der Knochen wurden mit Knochenzement (Palacos) in 1 cm langen Metallröhrchen fixiert. Die Metallröhrchen wurden in einem Belastungssystem fixiert. Die Knochen wurden kontinuierlich feucht gehalten. Die Länge des freien Teils des Knochens sowie die Länge vom Fixierungsteil bis zum Belastungspunkt wurden gemessen. Das Experiment erfolgte nach dem Prinzip des Biegens eines an einem Punkt fixierten Stocks innerhalb der Elastizitätsgrenzen. Die Belastung betrug 0,1, 0,2, 0,5, 0,7, 1,0 N. Die Verformung oder der Biegewinkel wurde als Richtungsänderungswinkel des Laserstrahls gemessen, der von einem kleinen Spiegel gebrochen wurde, der am Ende des Knochens befestigt war. Das Gewicht des Spiegels wurde zu der angelegten Biegekraft addiert. Das mm-Papier, auf das der Laserstrahl gerichtet war, war etwa 1,5 bis 1,8 m von dem Knochen beabstandet, an dem der kleine Spiegel befestigt war. Der Deformationswinkel wurde unter Anwendung eines trigonometrischen Verfahrens gemessen. Während jeder einzelnen Belastung wurde die Dauer der Deformation (und die anschließende Erholung) gemessen. Nach dem Entlasten kehrte der Knochen in seine Ausgangsposition zurück, was bewies, dass keine strukturellen Veränderungen im Knochen vorlagen und dass diese Belastung innerhalb der Elastizitätsgrenzen des Hookschen Diagramms bereitgestellt war. Die Feststellung zeigte, dass es möglich war, den gleichen Knochen zweimal in unterschiedlicher Richtung zu belasten, ohne seine Struktur zu verändern. Wenn keine zusätzliche Deformität während der zwei anschließenden Minuten festgestellt wurde oder wenn eine zusätzliche Erholung erreicht wurde, wurden diese Punkte als Ende bewertet (im Allgemeinen betrug die Messzeit etwa 30 s (ovariektomisierte Kontrolle) oder 16 min (gesund)). Die Knochenwinkeldeformifät (Belastung und Erholung nach der Belastung) wurde in mm/s ausgedrückt.
Ergebnisse
Die tägliche Behandlung mit beiden Dosen von NaBPC157 ergab einen bemerkenswert erhöhten Maturationswert im Vergleich mit dem athrophischen verminderten Maturationswert in den unbehandelten Kontrollratten. Somit liegt es nahe, dass NaBPC157 in der Lage ist, die durch Kastration verursachte Vaginalatrophie bei Ratten zu verhindern.
In den ovariektomisierten Kontrollgruppen wurde die geringste Biegeamplitude mit der kürzesten Zeit sowie die geringste Rückstellamplitude festgestellt. Die gleichen niedrigen Werte wurden in beiden entweder nach 15 oder 28 Tagen getöteten Kontrollgruppen erhalten. Dies wurde in beiden ovariektomisierten Salzlösungs-behandelten Gruppen (getötet entweder am 15. oder 28. Tag) festgestellt. Eine positive Tendenz wurde in der Gruppe festgestellt, die eine einzelne μg-NaBPC157-Verabreichung am Tag 15 nach der Ovariektomie erhielten. Wesentlich bessere Ergebnisse wurden in allen anderen Gruppen, die mit NaBPC157, entweder ng oder μg, behandelt wurden, erhalten. Die besten Ergebnisse wurden in der Gruppe erhalten, die 28 Tage lang eine tägliche NaBPC157-μg-Behandlung erhielt. Alle Parameter in den ovariektomisierten Tieren waren deutlich verbessert, und das Niveau der Verbesserung erreichte tendenziell die Werte, die in den gesunden Gruppen verzeichnet wurden. Es wurde kein Unterschied zwischen den gesunden Ratten festgestellt, ohne Rücksicht darauf, ob sie mit Salzlösung oder mit NaBPC157 (μg- oder ng-Dosis) behandelt wurden.
Angesichts der allgemein akzeptierten Signifikanz dieser tierischen Modelle der menschlichen Ovariektomie-Bedingungen sowohl für die Vaginalatrophie als auch Osteoporose-Entwicklung ist es offensichtlich, dass NaBPC157 bei der Ovariektomie-Therapie eingesetzt werden kann.
BEISPIEL 45: Tumore
Materialien, Methoden und Ergebnisse
Eines der allgemein verwendeten Modelle für experimentelle Tumore umfasst die Bewertung der Anzahl der Metastasen von Karzinom und Melanom B-16 in Mäusen. Ebenso wie die verschiedenen Modelle für die experimentellen Tumore ist diesen experimentellen Tumoren eine nennenswerte Ähnlichkeit mit Störungen gemeinsam, die bei menschlichen Patienten festgestellt wurden. Angewandt in verschiedenen Protokollen zeigte sich, dass NaBPC157 die Anzahl der Metastasen in behandelten Mäusen relativ zu den entsprechenden Kontrollen senkte. Der Ehrlich-Aszites-Tumor (EAT) ist ein Tumor, der in allen Stämmen von Mäusen wachsen kann. Er kann in Abhängigkeit von dem Weg, auf dem die Tumorzellen verabreicht werden, in aszitischer oder in fester Form wachsen. Obwohl im Allgemeinen tierische Tumormodelle nur teilweise eine Ähnlichkeit mit einer menschlichen Krankheit haben, hat die Anwendung dieses Modells auf Grund seiner möglichen Brauchbarkeit bei Anwendung in der Antitumormittelforschung eine allgemeine Akzeptanz gefunden.
Das Überleben (Tage) bei den Mäusen, denen Ehrlich-Aszites-Tumorzellen injiziert wurden, war meistens auf weniger als 25 Tage beschränkt. Eine vorherige Inkubation der Tumorzellen mit NaBPC157 (2 μg/ml) führte zu einem längeren Leben der Tiere, denen die Tumorzellen injiziert wurden. Mehr als 90% der Tiere überlebten bis zum Ende des 45-tägigen Beobachtungszeitraums. Zusätzlich lösten verschiedene cytostatische Arzneimittel eine Neutropenie in Patienten sowie in Versuchstieren aus. Cyclophosphamid ist ein zur Neuropenie-Induktion allgemein verwendetes Mittel. Eine Anwendung von Cyclophosphamid (180 mg/kg i. p.) löste wesentliche Störungen aus. NaBPC157 verhinderte Neutropenie, senkte die Retikulozyten und verbesserte die Hämoglobinwerte.
Folglich ist ein Antitumorpotential von NaBPC157 offensichtlich. Angesichts der offensichtlichen Ähnlichkeit der tierischen Modelle und der menschlichen Zustände und der heilenden Wirkungen, die sowohl bei in vivo als auch bei in vitro Experimenten erhalten wurden, ist NaBPC157 in der Antitumortherapie brauchbar. NaBPC157 ist zur Abschwächung der cytostatischen schädlichen Wirkungen geeignet.
BEISPIEL 46: Antivirale Wirkung
Materialien und Methoden
ARBO-Viren (Tick Born Encephalitis (TBE), Bhania, Dengue 1, 2, 3, 4, Sinbis, West Nile, Éalovo), Hepatits A, lymphatische Choriomeningitis (LCM) und Herpes Typ 1 wurden i. c. (oder p. o. (postoperativ) – Hepatitis A) als Virus-Suspensionen in einer Verdünnung von 10^–2 (0,02 ml/Maus) verabreicht. NaBPC157 (20 μg/kg b. w.) oder 0,9% NaCl (0,02 ml/Maus) wurde i. c. oder i. p. verabreicht a) bei einem Vorbehandlungsregime b) gleichzeitig mit der Virusverabreichung oder c) 4 Tage nach Infektion in Gegenwart der etablierten Krankheitssymptome.
Ergebnisse
Eine nennenswerte Verzögerung des Einsetzens der Krankheitssymptome und des folgenden Todes (ansonsten regelmäßig aufgetreten am Tag 4 und 5 nach der Infektion in den Kontrolltieren) wurde nach gleichzeitiger Verabreichung von NaBPC157 mit den Viren festgestellt. Bei Verabreichung bei Vorliegen eines schweren Krankheitsbildes wurde reproduzierbar eine wesentliche Verlängerung der Überlebensdauer verzeichnet. Ein vollständiges Fehlen beider Symptome oder des anschließenden Todes nach der NaBPC157-Vorbehandlung war offensichtlich.
Zur Verifizierung der erhaltenen Ergebnisse wurde auch die Virulenz der verabreichten Virus-Suspensionen (ARBO-Virus infiziert) durch Inokulation von Gehirnsuspensionen gestestet, die aus den Mäusen hergestellt wurden, die zuvor mit NaBPC157 oder Salzlösung behandelt wurden und die überlebten (NaBPC157) (trotz Virus-Verabreichung) bzw. spontan starben (Salzlösung). Im Gegensatz zu den mit Salzlösung-Gehirnsuspension angeimpften Mäusen (die sich nicht von den mit Virus-Suspension angeimpften, mit Salzlösung behandelten Mäusen unterschieden) wurden keine Krankheitssymptome oder Tod in mit NaBPC157-Gehirnsuspension angeimpften Mäusen festgestellt. Die Mäuse wurden 50 Tage lang nach der Animpfung mit den Gehirnsuspensionen beobachtet.
Die günstigen Wirkungen von NaBPC157 waren bei einer Inkubation bei erhöhter Temperatur (56°C für 30 min) resistent.
Angesichts dieser virusinduzierten ähnlichen Störungen in Menschen kann NaBPC157 bei der Therapie von Viruserkrankungen, insbesondere bei einer Therapie, wobei der allgemeine Zustand deutlich gestört ist (z. B. AIDS und AIDS-ähnliche Zustände), verwendet werden.
BEISPIEL 47: Intestinale Läsionen
Materialien und Methoden
Die Wirkung von NaBPC157 (10 μg oder 10 ng/kg i. p., i. g.) wurde in Ratten im Vergleich mit mehreren Referenzstandards in mehreren experimentellen Ulkus-Modellen (48 h restraint Stress, subkutanes Cysteamin, intragastrische 96-%-Ethanol-Ulkus-Tests, NSAIAs-Läsionen, DNFB (Dinitrofluorbenzol), Reflux-Ösophagitis nach ösophago-jejunaler termino-lateraler Anastomose) (Vor-/Co-/Nachbehandlung) erforscht.
Ergebnisse
Nur die NaBPC157-Regime waren in allen getesteten Modellen reproduzierbar wirksam. Bromocryptin, Amatadin, Famotidin, Cimetidin und Somatostatin waren unwirksam (restraint Stress) oder nur teilweise wirksam (intestinale Bromocryptin- und DNFB-Läsionen; Sucralfat, Ranitidin, Cholestyramin, Reflux-Ösophagitis). Angesichts der Referenzpeptide wurde ein dosisabhängiger Schutz (Cysteamin) und/oder eine teilweise positive Wirkung (hängt mit den Behandlungsbedingungen zusammen) (Ethanol) mit Glucagon, NPY und Sekretin erhalten, wohingegen CCK /26-30/ nicht wirksam war.
Angesichts der Tatsache, dass alle diese Modelle zum Screening der Mittel eingesetzt werden, die derzeit in der Therapie von gastrointestinalen Läsionen verwendet werden, und der reproduzierbar günstigen Wirkungen von NaBPC157, ist seine günstige Anwendung bei der Therapie der Läsionen des gesamten Intestinaltrakts offensichtlich.
BEISPIEL 48: Wirkung auf kognitive Störungen
Materialien und Methoden
Die Anwendung von anticholinergen Mitteln (Scopolamin, Atropin, 10 mg/kg, b. w., i. p.) bewirkte in Ratten ein wesentliches kognitives Defizit, eine Feststellung, die unter Bewertung des tierischen Verhaltens in Wasser-T-maze für einen verlängerten Zeitraum erfolgreich reproduziert wird.
Ergebnisse
Relativ zu den Kontrollen konnte eine erhöhte Fehleranzahl bei Scopolamin- und Atropin-behandelten Ratten eindeutig nachgewiesen werden. Dieses kognitive Defizit wurde durch anschließende Co-Verabreichung von NaBPC157 (10 μg oder 10 ng/kg b. w., i. p.) (die erhaltenen Werte entsprachen den Kontrollwerten) behoben.
Angesichts der weithin angenommenen Signifikanz dieser Modelle für menschliche kognitive Funktionsstörungen ist es offensichtlich, dass NaBPC157 bei der Therapie von kognitiven Störungen geeignet ist.
BEISPIEL 49: Wirkung auf Entzugsstörungen
Materialien, Methoden und Ergebnisse
NaBPC157 zeigte eine antikonvulsive Wirkung in Wechselwirkung mit dem GABA-ergen System und verbesserte die Diazepam-Wirksamkeit bei Co-Verabreichung (10 μg/kg, 10 ng/kg i. p.) mit Diazepam (5,0 mg/kg i. p. zweimal täglich für 10 Tage). NaBPC157 dämpfte die Diazepam-Toleranz und verschob die Entzugserscheinungen und die physikalische Abhängigkeit. In Toleranztests 42 h nach dem Konditionierungsregime wurden kürzere präkonvulsive Latenzen festgestellt als diejenigen bei gesunden Mäusen nach einer Isoniacid-Behandlung (800 mg/kg i. p.), wenn Diacepam (5,0 mg/kg i. p.) wiederum an Mäuse verabreicht wurde, die zuvor mit Diacepam allein konditioniert wurden. Dies wurde bei Tieren, die mit NaBPC157 (beide Dosen) und Diacepam konditioniert wurden, vollständig unterbunden. Bei einem physikalischen Abhängigkeitstest (bewertet 6, 14, 42, und 72 h nach der Konditionierungsbehandlung) wurden in den Diacepam-konditionierten Mäusen im Anschluss an eine Isoniacid-Behandlung 42 h und 72 h nach der Konditionierungsbehandlung kürzere präkonvulsive Latenzen festgestellt als in den nicht konditionierten gesunden Mäusen. NaBPC157 (10 μg/kg Dosis), kombiniert mit Diacepam, verschob diese Wirkung bis zum letzten beobachteten Zeitintervall. In dieser Gruppe waren, im Gegensatz zu den Diacepam-konditionierten Mäusen, bei 6-stündigen Intervallen die präkonvulsiven Isoniacid-Latenzen immer noch länger als in den entsprechenden Kontrollen. NaBPC157 rief keinerlei Toleranzwirkung hervor.
Angesichts der Signifikanz dieser Modelle für die menschlichen Zustände ist es offensichtlich, dass NaBPC157 bei der Therapie der Entzugsstörungen geeignet ist.
BEISPIEL 50: Die Wirkung auf Nierenstörungen
Materialien und Methoden
Die Verabreichung von Quecksilberchlorid (1 mg/kg i. v.) oder cis-Platin (10 mg/kg s. c.) ruft in Versuchstieren akutes Nierenversagen hervor. Bei Auslösung auf diesem Weg korreliert das Nierenversagen sehr stark mit den entsprechenden Störungen beim Menschen. Folglich haben die in Ratten ausgelösten Läsionen einen bemerkenswert hohen Ähnlichkeitsgrad mit den entsprechenden Läsionen bei den menschlichen Patienten.
Ergebnisse
NaBPC157 linderte, sowohl bei den Vorbehandlungs- als auch Nachbehandlungsbedingungen, die Läsionen in Ratten deutlich. Eine unilaterale Nephrektomie rief in der verbleibenden Niere eine deutliche Funktionsüberlastung und Funktionshypertrophie hervor. Die NaBPC157-Behandlung erhöhte die Diurese in den unilateral nephrektomisierten Tieren und senkte die Hypertrophie der verbleibenden Niere. Somit unterstreichen diese Feststellungen, bezogen auf die Funktionstherapie der kompensatorischen Nieren-Hypertrophie, deutlich eine verbesserte Funktion der verbleibenden Niere. Dies wird auch durch die zusätzlichen biochemischen Ergebnisse unterstützt. Zusätzlich stehen diese Daten vollkommen mit den Wirkungen im Einklang, die bei hypertensiven Ratten mit Nierenarterien-Stenose und/oder unilateraler Nephrektomie erhalten werden. Die geeignete Anwendung von NaBPC157 bei der Therapie von Nierenstörungen ist offensichtlich.
BEISPIEL 51: Zelluläre Immunreaktionen von peripheren Blutlymphozyten
Die zellulären Immunreaktionen von peripheren Blutlymphozyten auf BPC wurden in Kontrollen und in Patienten mit verschiedenen in Tabelle 2 aufgeführten Krankheiten erforscht. Die peripheren Blut-T-Zellen-Reaktionen auf BPC wurden mittels des bei deSmet et al. beschriebenen Verfahrens (deSmet MD et al., in: Cellular immune responses of patients with uveitis to retinal antigens and their fragments. Am. J. Ophthal., 110: 135–142, 1990) mit 7-tägigen Zellkulturen getestet. Die Zellen wurden ohne das Antigen und mit 20 μg/l des Antigens (BPC157-Pentadecapeptid) inkubiert. Für jeden Patienten wurde der Stimulationsindex durch Division der gemittelten Zählungen der Antigen-stimulierten Kulturen durch die gemittelten Zählungen der Kontrollzellkulturen, denen kein Antigen, d. h. BPC157-Pentadecapeptid, zugesetzt wurde, berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Die Kontrollwerte von ≤ 2, gemessen in den Kontrollsubjekten (Tabelle 2), entsprachen den Werten der anderen Forscher für die Peptide von ähnlichem Molekulargewicht, d. h. in den Kontrollsubjekten wurde keine Sensibilisierung von peripheren Blutlymphozyten auf das BPC157-Pentadecapeptid festgestellt. In den Patienten mit verschiedenen Krankheiten zeigten die deutlichen zellulären Reaktionen auf BPC, die in Tabelle 2 dargestellt sind, eine systemische Lymphozyten-Sensibilisierung auf dieses Magensaftpeptid an. Diese Daten zeigen eindeutig das Vorliegen von BPC-ähnlichen Störungen in Patienten, die an offensichtlich verschiedenen Krankheiten leiden. Dies legt die Anwendung von BPC-ähnlichen Mitteln (z. B. die Salze des Pentadecapeptids BPC157) bei einer immunmodulatorischen Therapie der entsprechenden Störungen nahe.
Tabelle 2
Die Ergebnisse der oben beschriebenen pharmakologischen Untersuchungen zeigen die vorteilhafte Wirkung der Salze der BPC-Peptide beim Schutz von Organismen gegen Stress und Krankheiten und im Allgemeinen bei der Normalisierung der Organfunktionen. Die erfindungsgemäßen Peptidsalze sind auch zur Prävention und Therapie von mehreren menschlichen und/oder tierischen Krankheiten und Störungen wirksam.

Claims

Salz eines BPC(Body Protection Compound)-Peptids, wobei das Peptid aus 8 bis 15 Aminosäuren besteht, wobei das Anion des Salzes ein negativ geladenes Peptid ist, das 8 Aminosäurereste der allgemeinen Formel [Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala]^{(–)oder(2–)} umfasst, wobei Xaa ein neutraler aliphatischer Aminosäurerest ist, Yaa ein basischer Aminosäurerest ist und Zaa ein saurer Aminosäurerest ist, und wobei das Kation des Salzes das Kation einer anorganischen oder organischen nicht toxischen Base ist.
Salz nach Anspruch 1, wobei das Kation aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Alkalimetallen, Erdalkalimetallen, Zn²⁺, primären, sekundären und tertiären Aminen, insbesondere Na⁺, K⁺, Li⁺, Cs⁺, Ca²⁺, NH₄ ⁺, Triethanolamin⁺, Cyclohexylamin⁺, 2-AMP⁺ (2-Amino-1-propanol) und TRIS⁺ (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan) besteht.
Salz nach Anspruch 1 oder 2, wobei Xaa Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle oder Nva ist, Yaa Lys, Arg, Orn oder His ist und Zaa Glu, Asp, Aad oder Amp ist.
Salz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das außerdem einen pharmazeutisch oder diagnostisch verträglichen Träger umfasst.
Salz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das außerdem Trehalose umfasst.
Salz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die allgemeine Formel lautet:
Salz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Peptid aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus
Salz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Peptid cyclisiert ist, insbesondere durch eine Amidbindung zwischen dem ersten und dem letzten Aminosäurerest.
Salz nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Salz in einer wässrigen oder wässrigen/alkoholischen Lösung, vorzugsweise bei einem pH von 6,0 bis 8,5, gelöst ist.
Lagerbeständige pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine pharmazeutisch wirksame Menge des BPC-Peptidsalzes nach einem der vorhergehenden Ansprüche und gegebenenfalls einen physiologisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10 zur peroralen Anwendung im Gemisch mit Trehalose.
Diagnostische lagerbeständige Zusammensetzung, umfassend eine diagnostisch wirksame Menge des BPC-Peptidsalzes nach einem der vorhergehenden Ansprüche.
Verwendung eines BPC-Peptidsalzes nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung einer kompatiblen, lagerbeständigen, pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 10 zur Behandlung von: Störungen im Zusammenhang entweder mit einer Stickoxid(NO)-Bildung oder NO-Systemfunktionsstörungen, insbesondere Hypertension, Angina, Impotenz, Kreislaufschock und septischer Schock, Schlaganfall, Entzündung, Atemnotsyndrom, Adhäsion und Aggregation von Plättchen und Leukozyten, Endothel-Dysfunktion, gastrointestinale Läsionen, Peristaltik-Störungen, Diabetes-Pankreatitis, Hypotension und Parkinson Krankheit; Dysfunktionen oder Hyperfunktionen der somatosensorischen Nerven, insbesondere sensorische Neuropathie, postherpetische Neuralgie, atopische Dermatitis, gestörte Heilung von verletztem Gewebe, erworbene Kälte- und Wärme-Urtikaria, Psoriasis, bullöses Pemphigoid, Ekzem, Photodermatosen, chronische Arthritis, gastrointestinale Läsionen und spezifische oder nicht spezifische Hyperreaktivität der oberen und unteren Atemwege (Asthma, Rhinitis); Endothelstörungen; Wunden, Ulzera; Zuständen im Zusammenhang mit akuter und/oder chronischer Entzündung, insbesondere chronische Arthritis und Störungen im Zusammenhang mit Hypersensitivität vom verzögerten Typ und gastrointestinale Läsionen; Leberstörungen, Organläsionen, ausgelöst durch freie Radikale, insbesondere verursacht durch Strahlung; Störungen in Verbindung mit catecholaminergen Systemstörungen, insbesondere Schizophrenie, Amphetamin-Provokationseffekte, Arzneimittelmissbrauch; stressbedingten Zuständen; akuter Pankreatitis; insbesondere mit gleichzeitiger gastroduodenaler Pathologie; Herzstörungen; Depressionsstörungen; Parkinson Krankheit und parkinsonkrankheitsartiger Pathologie; Temperaturstörungen; Knochenbeeinträchtigungen; verschiedenen hypertensionsbedingten Organschäden; Koagulationsstörungen; Schmerzstörungen; Konvulsionsstörungen; Rückenmarksverletzung; Alkoholverletzungen, ausgelöst durch Alkoholmissbrauch oder verstärkten Alkoholkonsum; ischämischen Gehirnstörungen; peripheren Nervenverletzungen; kataleptischen Störungen und neuroleptischen Störungen; Störungen im Zusammenhang mit abnormen oder mutierten Lymphozyten; Störungen von Föten; Vaginalatrophie und Osteoporoseentwicklung auf Grund von Ovariektomie-Zuständen; Tumoren; Viruserkrankungen, insbesondere AIDS oder ARC; gastrointestinalen Läsionen; kognitiven Störungen; Entzugsstörungen; Nierenstörungen und Störungen der zellulären Immunantwort.
Verwendung des BPC-Peptidsalzes nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung einer lagerbeständigen pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 10 als cytoprotektives und organprotektives Mittel.
Verfahren zur Herstellung des BPC-Peptidsalzes nach einem der Ansprüche 1 bis 9 durch Mischen von mindestens einem BPC-Peptid in einem wässrigen oder wässrigen/alkoholischen Lösungsmittel mit einer oder mehreren Basen und Erhalten eines BPC-Peptidsalzes, wobei das Kation des Salzes das Kation einer anorganischen oder organischen nicht toxischen Base ist.