CZ285155B6

CZ285155B6 - Peptidy s organoprotektivním účinkem, způsob jejich výroby a farmaceutické prostředky s jejich obsahem

Info

Publication number: CZ285155B6
Application number: CZ941622A
Authority: CZ
Inventors: Marijan Petek; Sven Seiwerth; Zeljko Grabarevic; Ivo Rotkvic; Marko Duvnjak; Branko Turkovic; Stjepan Mise; Ernest Suchanek; Boris Mildner; Ivan Udovicic; Predrag Dr. Csc. Sikiric
Original assignee: Predrag Dr. Csc. Sikiric; Marijan Petek; Sven Seiwerth; Zeljko Grabarevic; Ivo Rotkvic; Marko Duvnjak; Branko Turkovic; Stjepan Mise; Ernest Suchanek; Boris Mildner; Ivan Udovicic
Priority date: 1992-11-16
Filing date: 1993-11-16
Publication date: 1999-05-12
Also published as: WO1994011394A3; CZ162294A3; RU2116311C1; HU9303247D0; EP0624164B1; BG98907A; GR3026478T3; DE69316974D1; HUT67982A; BG61697B1; SI9300595A; HU211260A9; HU9401952D0; WO1994011394A2; HUT66303A; RO115733B1; SI9300595B; ATE163131T1; SK279227B6; EP0624164A1

Abstract

Syntetické peptidy obsahující pouze 8 až 15 zbytků aminokyselin v peptidovém řetězci, s molekulovou hmotností v romezí 900 až 1600, mají biologickou účinnost, srovnatelnou s účinností přírodní organoprotektivní sloučeniny BPC, současně však mají zvýšenou selektivitu. Způsob výroby těchto peptidů je snadný a ekonomický, mimoto peptidy vyvolávají menší množství vedlejších reakcí než přírodní látka vzhledem k obsahu menšího počtu zbytků aminokyselin v molekule. Farmaceutické prostředky s obsahem těchto peptidů jsou vhodné pro použití různých onemocnění a poškozeních organismu.ŕ

Description

Použití peptidů s organoprotektivním účinkem pro výrobu farmaceutických prostředků

Oblast techniky

Vynález se týká použití peptidů s organoprotektivním účinkem s vysokou biologickou účinností téhož typu jako u přírodní sloučeniny BPC, avšak s kratším řetězcem, pro výrobu farmaceutických prostředků.

Dosavadní stav techniky

Biologicky účinná bílkovina s organoprotektivním účinkem, izolovaná z lidského nebo živočišného organismu a nazvaná BPC (Body protecting Compund, sloučenina, chránící tkáně) byla popsána v EP 432 400 a mimoto také v publikaci P. Sikiric a další, Exp. Clin. Gastroenterol., 1, 15-26, 1991. Tato bílkovina má vysokou molekulovou hmotnost přibližně 40 000 ± 5000 a pouze částečně určenou strukturu. Sloučenina má široké spektrum biologických účinků, poskytuje například ochranu proti tvorbě vředů, ochranu jatemí tkáně, chrání proti virům, brání vzniku otoků, obecně brání tvorbě zánětlivé reakce, poskytuje ochranu proti vzniku zhoubného bujení a podobně. Látka je navrhována pro použití k léčení uvedených chorobných stavů a mimoto také při léčení různých onemocnění a poruch nervového systému, poruch dopaminergního původu, při léčení stavů po chirurgickém zákroku, v zubním lékařství, při neplodnosti a u různých chorob ve veterinárním lékařství. Uvedené široké spektrum účinku však může být také důsledkem dosud nedostatečně stanovené struktury nebo dokonce nedostatečné čistoty nebo homogenity bílkoviny BPC, tak jak byla izolována.

V naší zveřejněné patentové přihlášce PV 205-94, u níž v současné době rovněž probíhá řízení, je popsána skupina nových peptidů s organoprotektivním účinkem. Tyto peptidy je možno použít pro výrobu farmaceutických prostředků, určených pro léčení různých typů poškození tkáně, například stresem, úrazem, zánětem, šokem, tvorbou vředů a podobnými stavy.

Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že uvedená skupina peptidů, která je velmi výhodná zejména pro svůj krátký řetězec, takže nevyvolává značnější vedlejší účinky, má ještě další nepředpokládané biologické vlastnosti. Na jejich základě je možno uvedenou skupinu peptidů použít pro výrobu farmaceutických prostředků, určených pro léčení řady dalších onemocnění, například onemocnění jater a slinivky, atrofie varlat, léčení cukrovky a podobně, jak bude dále podrobněji vysvětleno.

Podstata vynálezu

V poslední době byla připravena skupina biologicky vysoce účinných peptidů s obdobným účinkem a velmi dobře definovanou strukturou.

Uvedené peptidy lze využít k léčebným účelům. Vynález tvoří použití peptidů s organotektivním účinkem, obsahujících 8 až 15 zbytků aminokyselin, obecného vzorce

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa

10 15 kde

- 1 CZ 285155 B6

Xaa znamená zbytek neutrální alifatické aminokyseliny jako Ala, bAla, Leu, Ile, Gly; Val, Nle, Nva,

Yaa znamená zbytek bazické aminokyseliny, jako Lys, Arg, Orgn, His,

Zaa znamená zbytek kyselé aminokyseliny, jako Glu, Asp, Aad nebo Apm, přičemž alespoň jeden ze zbytků Xaa nebo Zaa může být vynechán a současně mohou být vynechány zbytky v polohách 10 až 15, molekula peptidu je popřípadě cyklizována amidovou vazbou mezi prvním a posledním zbytkem aminokyseliny, pro výrobu farmaceutických prostředků pro léčení poruch a onemocnění jater a slinivky, atforie varlat a poruch motility spermií, poruch plodnosti, ke zlepšení chovu a množení zvířat, k potlačení infekce rickettsiemi, k léčení stavů po thyreoparathyreoidektomii, k léčení cukrovky, poruch nadledvinek, poruch krvetvorného systému, poruch krevní srážíivosti a doby krvácení, poruch po kastraci a po menopauze, k léčení ischemického a toxického poškození, psychiatrických poruch, zvýšeného krevního tlaku, odchylek od tělesné teploty, bolestivých stavů a nádorového bujení.

Zbytek Xaa, YAA a Zaa, které je v uvedených peptidech možno použít, budou uvedeny podle skupiny pro jednotlivé symboly v následující tabulce I.

Vzhledem ktomu, že je možno použít i některé méně známé zbytky, uvádíme význam jejich zkratek:

bAla kyselina beta-aminopropionová

Nva nor-valin

Apm kyselina 2-aminopimelová

Aad kyselina 2-aminoadipová.

Tabulka I

Zbytek	Substituent
Xaa	neutrální alifatická aminokyselina: Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle, Nva
Yaa	bazická aminokyselina: Lys, Arg, Om, His
Za	kyselá aminokyselina: Glu, Asp, Aad, Apm

Výhodnými peptidy jsou následující sloučeniny:

Řetězec č. 1

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val 15 10 15

-2 CZ 285155 B6

Řetězec č. 2

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val

1 5	10	15
Řetězec č. 3
Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val
1 5	10	15

Podle dalšího provedení vynálezu tvoří součást podstaty vynálezu analogické peptidy s amidovým zakončením nebo s koncovou karboxyskupinou na C-zakončení, tyto peptidy mají svrchu uvedený strukturní vzorec, přičemž alespoň jeden a nejvýše sedm zbytků aminokyselin mezi polohami 1 až 15 je vynecháno a alespoň jeden ze zbývajících zbytků aminokyselin může být nahrazen podle schématu, které bylo uvedeno v tabulce I.

Výhodnými peptidy podle tohoto provedení mohou být následující sloučeniny:

Řetězec č. 4

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val

1014

Řetězec č. 5

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala Gly Leu Val

5 1014

Řetězec č. 6

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala

158

Řetězec č. 7

Asp Pro Pro Pro Ile Arg Pro Ala Asp

59

Řetězec č. 8

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp

59

Podle dalšího možného provedení tvoří součást podstaty vynálezu peptidy, které odpovídají svrchu uvedenému strukturnímu vzorci a v nichž může být alespoň jeden ze zbytků aminokyselin vynechán a alespoň jeden ze zbývajících zbytků aminokyselin může být nahrazen tak, jak bylo svrchu uvedeno v tabulce I, přičemž tyto peptidy jsou transformovány na cyklickou formu tvorby nové vazby CO-NH mezi prvním a posledním zbytkem aminokyseliny v molekule. Výhodnými peptidy podle tohoto provedení jsou následující látky:

Řetězec č. 9

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Va

I 2 5 10 13

-3 CZ 285155 B6

Řetězec č. 10

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp

I 2 5 9

Bylo prokázáno, že v případě použití svrchu popsaných peptidů je možno prokázat biologickou účinnost, která je srovnatelná nebo je ještě vyšší než biologická účinnost známé bílkoviny BPC.

Dále budou uvedeny farmakologické pokusy s peptidy podle vynálezu na řadě běžně používaných modelů in vitro i in vivo, na základě těchto pokusů byly prokázány následující farmakologické účinky peptidů podle vynálezu:

1) Ochranný účinek na játra a na slinivku břišní

Ochranný účinek nově připravených peptidů s řetězci č. 2, 3, 4, 6 byl srovnáván s ochranným účinkem standardních sloučenin, užívaných pro obdobné účely (bromocriptin, amantadin, somatostatin) na různých experimentálních modelech poškození jater a slinivky břišní u krys. Šlo o podvázání žlučovodu na 24 hodin, o podvázání žlučovodu a jatemí tepny na 24 hodin, o stres, trvající 48 hodin a o aplikaci tetrachlormethanu. Bylo prokázáno, že uvedené peptidy, podané v množství 10 mikrogramů až 10 ng/kg hmotnosti do žaludku nebo intraperitoneálně významně chrání játra i slinivku břišní proti nekrose, nedochází také k tukovým změnám těchto orgánů u zvířat po podvázání žlučovodu na 24 hodiny, po podvázání žlučovodu a jatemí tepny na 24 hodin, po stresu v trvání 48 hodin ani po aplikaci tetrachlormethanu. Biochemické hodnoty pro bilirubin, SGOT a SGPT byly zcela v souladu s prokázanými makroskopickými a mikroskopickými údaji při uvedeném hodnocení.

2) Vliv na poškození ledvin

a) Jednostranné vyjmutí ledviny

V pokusu byly užity krysy Kmene Wistar, šlo o bílé krysy obojího pohlaví s hmotnosti 190 až 250 g. Na jedné straně byla odstraněna ledvina a v důsledku tohoto zákroku bylo možno pozorovat zvýšení hmotnosti zbývající ledviny u kontrolních zvířat i u skupin, jimž byly podány peptidy s řetězcem 2, 3, 4 nebo 6 v dávce 10 mikrogramů/kg hmotnosti intraperitoneálně 1 hodinu před chirurgickým zákrokem. V případě skupin, jimiž byly podány peptidy, bylo možno pozorovat pomalejší vzestup hmotnosti zbývající ledviny.

U obou skupin byly srovnávány také biochemické parametry. Podle dosažených výsledků došlo po podání všech použitých peptidů ke zlepšení funkce zbývající ledviny.

b) Podání gantamicinu

K pokusům byly použity bílé krysí samice kmene Wistar. Poškození tubulů ledvin byla vyvolána podáním gantamicinu, tato látka byla podána v dávce 40 mg/kg jednou denně po dobu 30 dnů. Po posledním podání této látky byla zvířata po pěti dnech usmrcena. U kontrolních skupin bylo možno pozorovat významné poškození tubulů ledvin, kdežto u skupin, které byly léčeny svrchu uvedenými peptidy bylo možno prokázat mikroskopicky statisticky významně nižší poškození než u kontrolních skupin.

c) Chlorid rtuťnatý

K pokusu byly použity bílé krysy kmene Wistar. Chlorid rtuťnatý byl podán v dávce 2 mg/kg hmotnosti nitrožilně a peptidy s řetězcem 2, 3, 4 a 6 byly podány v dávce 20 mikrogramů/kg hmotnosti jednu hodinu před podáním chloridu rtuťnatého. U všech skupin, které byly ošetřeny

-4CZ 285155 B6 podáním peptidu podle vynálezu, bylo možno ve srovnání se stejnými hodnotami pro kontrolní skupiny prokázat biochemicky i mikroskopicky ochranný účinek.

3) Vliv na poškození varlat

Vliv peptidů s řetězcem 2, 3, 4 a 6 na poškození varlat bylo sledováno po podání ketoconasolu v dávce 24 mg/kg žaludeční sondou, po podání testosteronu 30 mg/kg intraperitoneálně nebo po ozáření při použití 6 Gy. Peptidy s uvedenými řetězci byly podány jednu hodinu před podáním poškozující látky nebo před ozářením, pro všechny tyto peptidy bylo možno prokázat ochranný účinek.

4) Plodnost/vliv na rozmnožování zvířat

a) Peptidy s řetězcem č. 2, 3, 4 a 6 a plodnost

Byl pozorován vliv na oligoasthenospermii. Pokusy byly provedeny u deseti mužů ve stáří 30 až 40 let, u nichž bylo prokázáno uvedené onemocnění. U těchto nemocných byl odebrán ejekulát po 3 až 4 dnech abstinence. Po zkapalnění 30 minut bylo k 0,5 ml tohoto materiálu přidáno vždy 0,5 ml prostředí, kontrolní prostředí bylo tvořeno prostředím HAM-F 10 s 10 % deaktivovaného chordální séra. Experimentální prostředí obsahovalo mimoto ještě dva nebo čtyři mikrogramy/ml sloučeniny BPC. Po době pohybu 90 minut při teplotě 37 °C v atmosféře s obsahem 5 % oxidu uhličitého v komůrkách pro toto stanovení (Horwell Fertility Chamber) byl stanoven počet progresivně putujících, na místě pohyblivých a nepohyblivých spermatozoí v 1 ml ejekulátu. Předběžné výsledky neprokázaly žádný průkazný vliv na motilitu spermatozoí při použití nižších koncentrací uvedených peptidů. Avšak při použití vyšších koncentrací, 4 mikrogramy těchto peptidů na ml prostředí došlo ke statisticky významnému zvýšení podílu pohyblivých částic ve srovnání s kontrolními vzorky.

b) Peptidy s řetězcem č. 2, 3, 4 a 6 a reprodukční pochody

Uvedené peptidy byly zkoumány u myší, které již předtím byly alespoň třikrát březí. 20 dnů po konci poslední laktace byla zvířata připuštěna. Uvedené peptidy byly podávány v dávce 10 mikrogramů/kg hmotnosti intraperitoneálně jednou denně po celou dobu březosti, to znamená 19 až 21 dnů a po celou dobu laktace, následující tři týdny. Kontrolním skupinám byl současně podáván stejný objem fyziologického roztoku chloridu sodného. Pak byl zaznamenám počet mláďat na jednu samici a hmotnost každého mláděte.

Při pečlivé statistické analýzy získaných výsledků bylo možno prokázat statisticky významné zvýšení počtu mláďat na jednu samici, současně však bylo možno prokázat, že neočekávaně nedochází k žádnému rozdílu v tělesné hmotnosti v žádném ze zkoumaných časových intervalů. Všechny samice byly po ustání laktace na 25 dnů chovány odděleně, pak byly opět připuštěny a byla zkoumána jejich pátá březost a její výsledky.

Ve srovnání s kontrolní skupinou bylo možno pozorovat u všech ošetřených skupin zvýšení fertility a také zvýšenou schopnost laktace po podání všech čtyř svrchu uvedených peptidových řetězců.

Je nutno uvést, že zmíněné peptidy mohou zlepšit fertilitu i u poměrně starých myší. Je tedy možno uzavřít, že získané výsledky jsou v souladu s celkovým příznivým účinkem peptidů a s údaji in vitro, které byly získány při použití lidského spermatu.

- 5 CZ 285155 B6

c) Množení zvířat v komerčním měřítku

1419 zdravých vepřů (z celkového množství 4306 vepřů) bylo ihned po vrhu podáno 10 mikrogramů peptidů s řetězcem č. 2, 3, 4 nebo 6, dalším 1440 vepřům byly peptidy podány ve 13. dnu života jednu hodinu před kastrací, kdežto zbývajícím 1477 vepřům bylo jako obvykle podáno pouze železo. Pak byly po 4 týdny sledovány známky poškození, otok, mortalita, tělesná hmotnost a spotřeba potravy. V případě použití peptidů dochází po jediném podání ke statisticky významnému poklesu jakéhokoliv poškození u skupin s podáním peptidů těsně po vrhu a k významnému snížení rozsahu poškození u skupin, jimž byly peptidy podány těsně před kastrací. U zvířat, jimž byly podávány peptidy, bylo možno pozorovat tutéž hmotnost při významně nižší spotřebě krmivá. Pokud jde o vliv na průběh infekce, byla sledována u 40 kojených selat ve stáří 28 dnů infekce způsobená E. coli. V průběhu vzniklé enterokolitidy byly peptidy podávány 20 zvířatům v dávce 10 mikrogramů/kg hmotnosti nitrosvalově. Po dalším měsíci bylo možno prokázat statisticky významné snížení počtu uhynulých selat ve skupinách, jimž byly podávány peptidy podle vynálezu.

V dalším pokusu bylo sledováno uhynutí zvířat v průběhu prvního týdne u celkového počtu 1200 zdravých selat. 400 zvířat obdrželo peptidy okamžitě po vrhu navíc k běžnému podání železa. U zvířat, jimž byly peptidy podány v dávce 10 mikrogramů/kg hmotnosti nitrosvalově bylo možno prokázat statisticky významné snížení počtu uhynulých zvířat ve srovnání s kontrolními skupinami.

5) Vliv na chování podání amfetaminu

Vliv peptidů s řetězcem č. 2, 3, 4 a 6 byl sledován po podání dávky 10 mikrogramů/kg nebo lOng/kg hmotnosti intraperitoneálně 5 minut před podáním nebo současně s podáním amfetaminu. U skupin, jimž byly podány uvedené peptidy, bylo možno pozorovat statisticky významný pokles poruch chování po podání amfetaminu ve srovnání s neléčenými kontrolními skupinami.

6) Doba krvácení

Účinek peptidů s řetězcem č. 2, 3, 4 a 6 byl sledován při provádění obvyklých zkoušek na krvácení u myší a u krys, šlo o naříznutí ocasu po podání nebo bez podání heparinu, heparin byl podán v dávce 1000 MJ/kg podkožně 3 hodiny před vyvoláním krvácení. Zkoumané peptidy byly podávány v dávce 10 mikrogramů nebo lOng/kg intraperitoneálně současně s vyvoláním krvácení. U všech zvířat, která byla vyléčena podáním peptidů podle vynálezu, bylo možno prokázat statisticky významné zkrácení doby krvácení ve srovnání s neléčenými kontrolními skupinami.

7) Vliv na důsledky kastrace

Byl proveden modifikovaný postup metodou Allen-Doisy. Byly podány různé dávky 10 mikrogramů nebo 10 ng/kg intraperitoneálně v jediném podání nebo jednou denně jako předběžné nebo následné ošetření. U skupin, které byly léčeny podáním peptidů podle vynálezu bylo možno pozorovat zábranu nebo zlepšení nepříznivých důsledků kastrace, jako jsou atrofie poševní výstelny nebo osteoporóza.

8) Zvýšený krevní tlak

Zvýšený krevní tlak byl vyvolán uzávěrem ledvinové tepny na jedné straně. Po 10 dnech byly zvířatům podány peptidy podle vynálezu s řetězcem 2, 3, 4 nebo 6 v dávce 10 mikrogramů nebo 10 ng/kg hmotnosti intraperitoneálně nebo byl u kontrolních skupin podán fyziologický roztok chloridu sodného, podání bylo v jedné dávce nebo kontinuálně. U skupin, které byly léčeny

-6CZ 285155 B6 podáním peptidu podle vynálezu, bylo možno pozorovat statisticky významný pokles zvýšených hodnot krevního tlaku ve srovnání s kontrolními skupinami.

9) Vliv na pokusně vyvolanou cukrovku

Bílí krysí samci kmene Wistar s hmotností 175 až 230 g byli užiti při pokusu, v němž byla cukrovka vyvolána podáním straptozotocinu nebo alloxanu. Peptidy s řetězcem č. 2, 3, 4 nebo 6 byly podány v dávce 10 nebo 100 mikrogramů/kg. Po jejich podání došlo ke statisticky významnému opoždění vzniku cukrovky u zvířat, jimž byl podáván straptozotocin. Mimoto byla statisticky významně prodloužena doba přežití u těchto zvířat.

10) Vliv na thyreoparathyreoidektomii

U krys kmene Wistar byla úplně odstraněna štítná žláza spolu s příštítnými tělísky. Pak byly krysám podány peptidy podle vynálezu s řetězcem 2, 3, 4 nebo 6 v dávce 10 ng/kg hmotnosti intraperitoneálně nebo bylo podáno 5 ml fyziologického roztoku chloridu sodného na kg hmotnosti intraperitoneálně, jednorázově nebo opakovaně. U skupin, jimž byly podány peptidy podle vynálezu, došlo k podstatnému snížení důsledků odstranění uvedených žláz.

11) Podvázání krkavice

Zvířata byla usmrcena 3 hodiny po podvázání obou krkavic. Jednu hodinu předtím byly všem zvířatům podány peptidy podle vynálezu s řetězcem č. 2, 3, 4 nebo 6 v dávce 10 ng/kg hmotnosti intraperitoneálně nebo bylo podáno 5 ml fyziologického roztoku chloridu sodného na kg hmotnosti intraperitoneálně. U skupin, léčených podáním peptidů podle vynálezu bylo možno prokázat významně menši otok mozku než u kontrolních skupin.

12) Nadledvinky

Aby bylo možno prokázat vliv peptidů podle vynálezu na poškození nadledvinek, byl zvířatům podáván anilin 7 dnů v dávce 300 mg/kg podkožně. Zvířatům byly současně podávány peptidy podle vynálezu s řetězcem č. 2, 3, 4 nebo 6 v dávce 10 mikrogramů nebo 10 ng/kg hmotnosti intraperitoneálně nebo bylo podáno 5 ml fyziologického roztoku chloridu sodného na kg hmotnosti intraperitoneálně. Pak byla stanovena hmotnost nadledvinek a mikroskopické zněny těchto orgánů. Ve srovnání s kontrolní skupinou, jíž byl podáván pouze anilin, došlo u skupin, jimž byly podávány peptidy podle vynálezu ke statistickému snížení vzestupu hmotnosti nadledvin po podání anilinu u obou použitých dávek. Mikroskopická ochrana tkáně nadledvin byla závislá na dávce podávaného peptidu. Jak je všeobecně uznáváno, jsou poruchy, vyvolané anilinem ve vztahu k hypersekreci hormonu ACTH, a skutečně bylo možno prokázat vztah mezi sledovanými peptidy a ACTH. Tato skutečnost je podporována také tím, že bylo možno prokázat tutéž hmotnost nadledvin u skupin, léčených peptidy podle vynálezu a u zdravých kontrolních skupin.

Mimoto byla zvířata podrobena na 48 hodin stresu, při němž nebyla podávána potrava a byl omezen pohyb, před pokusem byly podány peptidy podle vynálezu v dávce 10 mikrogramů nebo 10 ng/kg hmotnosti intraperitoneálně nebo žaludeční sondou. Pokles zvýšené hmotnosti nadledvin u zvířat, jimž byly podávány peptidy, byl v souladu s odpovídajícím mikroskopickým pozorováním.

13) Poruchy tělesné teploty

Zvýšení tělesné teploty bylo vyvoláno podáním roztoku kvasinek v dávce 400 mg/kg podkožně, pokles teploty byl vyvolán ponořením do chladné vody s teplotou 4 °C nebo podáním reserpinu v dávce 5 mg/kg intraperitoneálně. Peptidy podle vynálezu s řetězcem 2, 3,4 nebo 6 byly podány

- 7 CZ 285155 B6 podkožně nebo intraperitoneálně v dávce 10 ng/kg jak v případě zvýšené, tak v případě snížené tělesné teploty, v obou případech došlo k úpravě teploty na normální hodnoty.

14) Vliv na krvetvorbu

Bílým myším byly injekčně podány cytostatické látky endoxan, vincristin, adriablastin nebo cytosinarabinosid v dávkách LD50. Jednu hodinu před podáním těchto sloučenin byly zvířatům podány peptidy podle vynálezu s řetězcem č. 2, 3, 4 nebo 6 v dávce 10 mikrogramů, kdežto kontrolním zvířatům byl podán stejný objem fyziologického roztoku chloridu sodného. Zvířata byla po skupinách usmrcena třetího, pátého, sedmého a jedenáctého dne po začátku pokusu. Pak byly stanoveny obvyklé hodnoty v krvi (červené krvinky, hemoglobin, počet bílých krvinek, absolutní počet neutrofilů, mimoto byly stanoveny základní hodnoty pro kostní dřeň, byla provedena cytologie a histologie jater a sleziny.

Ve třetím dnu pokusu nebylo možno pozorovat žádné rozdíly pro jednotlivé skupiny, zejména pokud jde o počet leukocytů, červených krvinek a neutrofilů, avšak zachovaná krvetvorba v kostní dřeni u zvířat, léčených peptidy podle vynálezu, byla v silném kontrastu s aplasií, pozorovanou u kontrolní skupiny.

Počet neutrofilních buněk u leukocytů byl statisticky významně zvýšen u léčených zvířat od pátého dne a do sedmého dne byly uchovány normální hodnoty, kdežto u kontrolní skupiny nebylo možno pozorovat návrat k normálním hodnotám před jedenáctým dnem.

15) Snížení pocitu bolesti

Bolest byla vyvolána intraperitoneálním podáním množství 0,2 ml/myš, podán byl dvouprocentní roztok síranu hořečnatého nebo 0,6% roztok kyseliny octové. Mimoto byly podány peptidy podle vynálezu s řetězcem 2, 3, 4 nebo 6 v dávce 10 mikrogramů nebo 10 ng/kg hmotnosti intraperitoneálně, a to současně s látkou, vyvolávající pocit bolesti nebo 30 minut před jejím podáním. Podání peptidů podle vynálezu statisticky snížilo dobu trvání bolestivých křečí ve srovnání s kontrolními skupinami.

16) Infekce, vyvolaná Rickettsiemi

0,2 ml suspenze Coxiella bumetti, 10-9, se vstřikne do vajec. Do vajec se rovněž vstřiknou peptidy podle vynálezu s řetězcem 2, 3, 4 nebo 6 v dávkách 1 pg, 10 pg, 100 pg nebo 1 ng. Je možno pozorovat, že doba přežívání je u ošetřených vajec statisticky významně vyšší než u vajec kontrolních.

17) Účinek na nádorové buňky

a) Dvě buněčné linie, L-924 a melanomová linie B-16 byly pěstovány in vitro za standardních podmínek. Rovněž in vitro byl sledován vliv peptidů s řetězcem 2, 3, 4 nebo 6 na růst uvedených buněčných kultur. Dva dne po založení buněčných kultur byly uvedené peptidy přidávány v koncentraci 3%, dávka 0,1 ml roztoku. Po 3 dnech byl stanoven počet buněk v kultuře. Výsledky prokázaly inhibiční účinek použitých peptidů na melanomové buňky B-16.

b) Ehrlichův ascitický tumor EAT je nádor, který může růst u všech kmenů myší, a to jako ascitický nebo jako pevný nádor v závislosti na cestě podání nádorových buněk. Byl zkoumán vliv inkubace buněk EAT s peptidy s řetězcem 2, 3, 4 nebo 6 na dobu přežívání myší, jimž byl uvedený buněčný materiál vstříknut podkožně nebo intraperitoneálně. Zvířata byla pozorována po dobu 45 dnů. Kontrolním myším, 15 myším samců kmene NMRI bylo podáno 0,4 x 10⁶ buněk EAT. Před injekcí byly nádorové buňky inkubovány 1 hodinu při teplotě 4 °C ve fyziologickém

- 8 CZ 285155 B6 roztoku chloridu sodného. Objem vstřiknutého materiálu byl 0,2 ml. Průměrná doba přežití u této skupiny myší byla 36 dnů a pouze 3 myši z 15 přežily až do doby 45 dnů.

V pokusné skupině bylo rovněž použito 15 myších samců kmene NMRI, zvířatům byla podána stejná dávka nádorových buněk ve stejném objemu, avšak buněčný materiál byl předběžně inkubován v roztoku s obsahem peptidů podle vynálezu v koncentraci 2 mikrogramy/ml roztoku.

V této skupině uhynuly v době 45 dnů pouze dvě z 15 myší, všechny další myši žily déle než 45 dnů. Rozdíl mezi kontrolní a pokusnou skupinou byl statisticky významný při p nižším než 0,01. Stejného výsledku bylo dosaženo v případě, že v průběhu téhož pokusu byly buňky EAT vstřiknuty intraperitoneálně místo podkožně.

c) Myši byly užity také pro sledování účinků peptidu podle vynálezu se řetězcem 2, 3, 4 nebo 6, v dávce 10 mikrogramů na kg hmotnosti intraperitoneálně v případě plicních metastáz, které byly vyvolány injekčním podáním buněk melanomu nebo aplastického karcinomu mléčné žlázy. Ve skupinách léčených podáním peptidů podle vynálezu bylo možno prokázat statisticky významné snížení počtu plicních metastáz ve srovnání s kontrolní skupinou.

Na základě svrchu uvedených údajů je možno uzavřít, že peptidy podle vynálezu mají protinádorovou účinnost a na základě této účinnosti jsou schopné prodloužit dobu přežívání u živočichů s nádorovým onemocněním.

18) Účinnost proti depresi

Aby bylo možno prokázat antidepresivní účinnost peptidů podle vynálezu, byl použit test s nuceným plaváním, popsaným v publikaci Porsolt a další, Eur. J. Pharmacol., 47, 379-391, 1978.

Krysí samci kmene Wistar s tělesnou hmotností 180 až 240 g byli užiti k uskutečnění zkoušek na depresi. Peptid podle vynálezu s řetězcem č. 4 byl podán způsobem, uvedeným v publikaci. Kontrolním zvířatům byl podán fyziologický roztok chloridu sodného, stanovení bylo prováděno 5 minut a pak byla vypočítána doba nepohyblivosti. Tato doba byla v kontrolní skupině průměrně 150 sekund, kdežto ve skupině ošetřených zvířat byla tato hodnota v rozmezí pouze 60 až 70 sekund. Byla připravena křivka závislosti odpovědi na dávce a byly vypočítány přibližně následující výsledky. Dávka 10 mikrogramů až 10 ng/kg hmotnosti zajistí plný účinek, při dávce 100 pg/kg je stále ještě možno pozorovat určitou účinnost a při dávce 1 pg/kg je účinek již nepozorovatelný.

Výsledkem farmakologických sledování těchto peptidů tedy je, že peptidy jsou schopny chránit organismus proti účinkům stresu a různým onemocnění, obecně tak, že dochází k opětné normalizaci funkcí organismu.

Peptidy by mohly rovněž být použity k prevenci a k léčení řady chorob a poruch u člověka i u jiných živočichů. Z řady chorob, které je možno tímto způsobem léčit, lze uvést zejména následující choroby:

- stres, vyvolaný poruchou nebo onemocněním,

- poruchy a poškození jater a slinivky,

- atrofie varlat a ztráta pohyblivosti spermií,

- poruchy plodnosti,

-je možno dosáhnout zvýšeného množení živočichů,

- choroby, způsobené riskettsiemi,

- stavy po thyreoparathyreoidektomii,

-9CZ 285155 B6

- diabetes mellitus,

- poruchy funkce nadledvin,

- poruchy systému pro krvetvorbu,

- poruchy srážlivosti,

- poruchy doby krvácení,

- poruchy po kastraci nebo menopauze,

- ischemická a toxická poškození,

- psychiatrické poruchy,

- zvýšený krevní tlak,

- poruchy tělesné teploty,

- pocity bolesti,

- nádorová onemocnění,

- deprese.

Obecně je možno uvést, že peptidy podle vynálezu je možno použít v široké škále farmaceutických prostředků v kombinaci s netoxickými, z farmaceutického hlediska přijatelnými nosiči nebo s nosnými prostředími, může jít o plniva, netoxické pufry nebo také fyziologický roztok chloridu sodného. Farmaceutické prostředky s obsahem peptidů podle vynálezu je možno použít místně nebo systemicky v jakékoliv vhodné formě, například ve formě kapalné, pevné nebo polotuhé, jako injekční roztoky, tablety, mazání, emulze, kapsle, tablety k rozpuštění pod jazyk a podobně.

Peptidy podle vynálezu budou obvykle podávány v dávce 10‘⁵ až 10'² mg/kg tělesné hmotnosti v případě systemického podání. Při místním podání bude koncentrace vyšší, například 0,1 až 0,5 %.

Velmi příznivé je nepřítomnost jakýchkoliv známek toxicity peptidů podle vynálezu až do dávky 50 mg/kg hmotnosti a také dobrá účinnost těchto látek při perorálním podání včetně podání žaludeční sondou.

Peptidy podle vynálezu je možno připravit postupnou kondenzací chráněných aminokyselin v homogenním kapalném systému nebo s výhodou při použití metody na pevné fázi. Při přípravě cyklických peptidů se připraví chráněné lineární peptidy s požadovanou délkou, například s alkylesterovou skupinou na C. zakončení, tato skupina se převede na azidovou skupinu, pak se aminokyselina naváže a ochranná skupina se odstraní. Je také možno postupovat tak, že se částečně chráněný lineární peptid s volnými koncovými skupinami cyklizuje pomocí difenylfosforylazidu ve velmi zředěném roztoku.

Praktické provedení vynálezu, zejména pokud jde o výrobu peptidů podle vynálezu, bude nyní osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

-10CZ 285155 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntéza peptidů při použití ochranné skupiny Boc

Syntéza peptidů byla uskutečněna při použití 100 mg Boc-Val-PAM-pryskyřice k vytvoření Cterminálního peptidu s karboxylovou skupinou (pryskyřice PAM je podávána Applied Biosystems, substituce 0,56 meq/g, jde o derivát aminopolystyrenu s kyselinou aminoacyl-4(oxymethyl)fenyloctové. Aminokyseliny, opatřené ochrannou skupinou Boc, to znamená tercbutoxykarbonylovou skupinou byly navázány jedna po druhé po polymemí nosič při použití diisopropylkarbodiimidu DIPC jako kondenzačního činidla. V každém stupni byla skupina Boc odstraněna při použití 50% roztoku kyseliny trifluoroctové TFA v dichlormethanu. Pak byla aminoskupina deprotonována působením diisopropylethylenu.

V každém stupni by přeměna měla být vyšší než 99,5 %. V případě, že této přeměny není dosaženo, je nutno kondenzaci opakovat. Po ukončení syntézy se materiál odštěpí při použití nízké koncentrace fluorovodíku, odštěpení trvá 2 hodiny při teplotě 0 °C. Jako látka, schopná vázat karboniový ion se užije anisol. Fluorovodík se odpaří v proudu dusíku. Surový peptid se pak získá vlitím olejového zbytku do bezvodého etheru.

Surový peptid se pak čistí pomocí HPLC v reverzní fázi na sloupci s rozměrem 5 x 150 mm s náplní silikagelu RP-18, užije se gradientová eluce a systém rozpouštědel 0,1% TFA ve směsi vody a acetonitrilu. Detekce se provádí absorpcí ultrafialového světla při 225 nm. Syntéza peptidu s řetězcem č. 4 je znázorněna na obr. 1.

Příklad 2

Syntéza peptidu při použití skupiny FMOC

Pro syntézu byly použity aminokyseliny s ochrannou skupinou Fmoc, tj. 9-fluorenylmethyloxykarbonylovou skupinou. Funkce na postranním řetězci byly chráněny ve formě O-tetrabutylesterů v případě Asp, Apm, Glu a Aad a skupinou Boc v případě Lys. První aminokyselina Val byla navázána na polymemí nosič-DHA-pryskyřici, BHA = benzhydrylaminopryskyřice, jako vazné reakční činidlo byl užit diisopropylkarbodiimid. V každém stupni byla ochranná skupina Fmoc odstraněna působením piperidinu. Pak byly stejným způsobem navázány všechny následující aminokyseliny až do ukončení postupu. Nakonec byl materiál odštěpen působením směsi TFA/TFMSA/anisol v objemovém poměru 2 : 17 : 52.

Peptid byl pak čištěn při použití HPLC obdobným způsobem jako v příkladu 1. Syntézy peptidu s řetězcem č. 2 je znázorněna na obr. 2.

Příklad 3

Syntéza peptidu při použití skupin Ddz

Všechny aminokyseliny byly použity ve formě, chráněné na alfa-aminoskupině ochrannou skupinou Ddz, jde o alfa, alfa-dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxykarbonylovou skupinu. Funkce na postranním řetězci byly chráněny použitím skupiny Z, jde o benzyloxykarbonylovou skupinu v případě lysinu, v případě kyseliny asparagové a glutamové byla užita skupina O-t-Bu, to znamená, že postranní řetězec byl chráněn formou tvorby terč, butylesteru.

-11CZ 285155 B6

Pro vazbu první aminokyseliny s ochrannou skupinou Ddz ve formě česné soli byl užit Merrifieldův nosič, což je zesítěný chlormethylovaný polystyrénový gel s kapacitou 1,4 mmol/g. Po kondenzaci s použitím dicyklohexylkarbodimidu DCC byla v každém stupni ochranná skupina Ddz odstraněna působením 5% TFA v dichlormethanu, pak byl materiál promyt a deprotonová působením 10% triethylaminu v dichlormethanu. Po deprotonaci byla uskutečněna vazba následující aminokyseliny stejným způsobem. Postup byl opakován až do ukončení požadovaného řetězce peptidů.

Nakonec byl peptid z polymemího nosiče odštěpen při použití směsi HBr/TFA/anisoI. Po odpaření těkavého podílu byl odštěpený peptid vysrážen z bezvodého etheru a usušen. Pak byl surový peptid čištěn při použití HPLC způsobem podle příkladu 1.

Syntéza peptidů s řetězcem č. 6 je podrobněji znázorněna na obr. 3.

Příklad 4

Syntéza cyklického peptidů

Předběžně byl způsobem podle příkladu 1 nebo 2 připraven peptid v částečně chráněné formě se vzorcem

OBzl NO₂ OBzl

I I I

Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Arg-Pro-Ala-Asp-OH

Roztok tohoto peptidů v dimethylformamidu s koncentrací 0,005 M byl smísen s difenylfosforylazidem a triethylaminem při teplotě 20 °C na 12 hodin.

Pak byla směs hydrogenována 8 hodin při teplotě 25 °C při použití vodíku a paladia na aktivním uhlí jako katalyzátor.

Pak bylo rozpouštědlo pečlivě odpařeno a surový produkt byl čištěn vysokotlakou kapalinovou chromatografií způsobem podle příkladu 1.

Tímto způsobem byl ve výtěžku 10 % získán cyklický peptid s řetězcem č. 10

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp

5 10

Syntéza lineárních a cyklických peptid při použití ochranné skupiny Ddz

Tentýž postup pro přípravu lineárních a cyklických peptidů byl uskutečněn při použití ochranné skupiny Ddz. Tímto způsobem bylo možno získat lineární a cyklické peptidy, jejichž funkce na postranních řetězcích byly chráněny pomocí skupiny Z v případě lysinu nebo ve formě Obenzylesterových skupin OBzl v případě kyseliny glutamové a asparagové. Polymemím nosičem byla pryskyřice HYCRAM^R (ORPEGEN, Heidelberg, SRN), jde o 4-bromkrotonyl-betaalanylamidomethylpolystyren. První aminokyselina Ddz-valin byla na polymemí nosič vázána ve formě česné soli.

-12CZ 285155 B6

Pak se skupina Ddz odstraní při použití 5% kyseliny trifluoroctové v dichlormethanu a aminoskupina se podrobí deprotonaci působením diisopropylethylaminu. V následujícím stupni se Ddz-glycin naváže na zbytek valinu v polymemí matrici při použití diisopropylkarbodiimidu DIPC v přítomnosti 1-hydroxybenzotriazolu.

Tyto stupně byly opakovány až do ukončení požadovaného peptidového řetězce. Pak byl syntetizovaný peptid v chráněné formě opatrně odštěpen z nosiče HYCRAM^r působením tetrakis-(trifenylfosfin)paladia (O) v roztoku v bezvodém tetrahyrofuranu v nepřítomnosti kyslíku. Jako akceptorová molekula pro allylové skupiny byla užita zvláštní přísada, například 10 morfolin.

Pak byl polymemí nosič odfiltrován a promyt tetrahydrofuranem. Roztok peptidu byl pak zfiltrován přes krátký sloupec silikagelu k odstranění paladia jako katalyzátoru.

Eluát, obsahující částečně chráněný peptid se vzorcem 4a byl po odpaření rozpouštědla sušen ve vakuu.

Syntéza lineárního peptidu s řetězcem lc

Částečně chráněný peptid s řetězcem 4a byl rozpuštěn ve 2,2,2-trifluorethanolu a pak byl hydrogenován v přítomnosti 10% palladia na aktivním uhlí při použití plynného vodíku při teplotě 30 °C. Pak byl katalyzátor odfiltrován a rozpouštědlo bylo odpařeno ve vakuu. Surový odparek byl pak čištěn pomocí HPLC způsobem podle příkladu 1. Po čištění byl získán peptid s řetězcem č. 4. Produkt byl totožný s produktem z příkladu 1.

Syntéza cyklického peptidu s řetězcem č. 9

Částečně chráněný peptid vzorce 4a se rozpustí ve směsi dimethylformamidu a dichlormethanu v objemovém poměru 1:1 za vzniku roztoku s koncentrací 0,001 M. Pro cyklizaci byl přidán 30 DIPC a HOBt a směs byla ponechána 10 hodin při teplotě 20 °C. Pak byl roztok odpařen na malý objem, zředěn přidáním 2,2,2-trifluorethanolu a čištěn průchodem sloupce s náplní Sephadexu LH-20. Frakce, které obsahovaly částečně chráněný cyklický peptid s řetězcem 9a byly odděleny a hydrogenovány při použití 10% palladia na aktivním uhlí jako katalyzátoru při teplotě 30 °C a při probublávání hydrogenované směsi plynným vodíkem, postup byl za 35 intenzivního protřepávání prováděn 8 hodin.

Katalyzátor byl pak odstraněn filtrací a roztok byl vysušen odpařením rozpouštědla ve vakuu. Takto získaný surový peptid byl pak dále čištěn pomocí HPLC způsobem, který byl popsán v příkladu 1. Tímto způsobem byl získán čistý cyklický peptid, sloučenina byla totožná 40 s peptidem s řetězcem č. 9.

Syntéza na polymemím nosiči HYCRAM při použití ochranné skupiny Ddz a cyklizace jsou znázorněny na obr. 4 a 5. Všechny syntetizované peptidy byly kontrolovány, pokud jde o čistotu sloučenin při použití HPLC na sloupci silikagelu RP-18 (oktadecylsilanizovaný materiál) 45 sloupec byl vymýván směsí rozpouštědel, běžně byla užívána směs vody, acetonitrilu a kyseliny trifluoroctové obvyklým způsobem ve formě gradientu. Ve všech případech bylo možno prokázat čistotu vyšší než 95 %.

Připravené peptidy byly charakterizovány analýzou jednotlivých aminokyselin (získané hodnoty 50 se pohybovaly v rozmezí ± 10 % teoretického množství), analýzou řetězce, molekulovou hmotností, stanovenou hmotovou spektrometrií FAB a pomocí spektra v ultrafialovém a infračerveném světle, výsledky jsou znázorněny na obr. 6 a 7.

-13CZ 285155 B6

Vynález byl v příkladové části osvětlen na základě jednotlivých specifických provedení, je však zřejmé, že by bylo možno navrhnout řadu dalších provedení a uskutečnit různé změny, které by rovněž spadaly do oboru vynálezu tak, jak je jeho rozsah vymezen v nárocích.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití peptidů s organoprotektivním účinkem, obsahujících 8 až 15 zbytků aminokyselin, obecného vzorce

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa 15 10 15 kde

Xaa znamená zbytek neutrální alifatické aminokyseliny jako Ala, bAla, Leu, Ile, Gly, Val, Nle, Nva,

Yaa znamená zbytek bazické aminokyseliny, jako Lys, Arg, Om, His,

Zaa znamená zbytek kyselé aminokyseliny, jako Glu, Asp, Aad nebo Apm, přičemž alespoň jeden ze zbytků Xaa nebo Zaa může být vynechán a současně mohou být vynechány zbytky v polohách 10 až 15, molekula peptidu je popřípadě cyklizována amidovou vazbou mezi prvním a posledním zbytkem aminokyseliny, pro výrobu farmaceutických prostředků pro léčení poruch a onemocnění jater a slinivky, atrofie varlat a poruch motility spermií, poruch plodnosti, ke zlepšení chovu a množení zvířat, k potlačení infekce rickettsiemi, k léčení stavů po thyreoparathyreoidektomii, k léčení cukrovky, poruch nadledvinek, poruch krvetvorného systému, poruch krevní srážlivosti a doby krvácení, poruch po kastraci a po menopauze, k léčení ischemického a toxického poškození, psychiatrických poruch, zvýšeného krevního tlaku, odchylek od tělesné teploty, bolestivých stavů a nádorového bujení.
2. Použití podle nároku 1, při němž se užije peptid s řetězcem č. 1, vzorce

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val 15 1015
3. Použití podle nároku 1, při němž se užije peptid s řetězcem č. 2, vzorce

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val 15 1015
4. Použití podle nároku 2, při němž se užije peptid s řetězcem č. 3, vzorce

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val 15 1015

-14CZ 285155 B6
5. Použití podle nároku 1, při němž se užije peptid s řetězcem č. 4, vzorce

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val 15 1014
6. Použití podle nároku 1, při němž se užije peptid s řetězcem č. 5, vzorce

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala Gly Leu Val

1 5 1014
7. Použití podle nároku 1, při němž se užije peptid s řetězcem č. 6, vzorce

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala

1 58
8. Použití podle nároku 1, při němž se užije peptid s řetězcem č. 7, vzorce

Asp Pro Pro Pro Ile Arg Pro Ala Asp

1 59
9. Použití podle nároku 1, při němž se užije peptid s řetězcem č. 8, vzorce

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp

1 59
10. Použití podle nároku 1, při němž se užije peptid s řetězcem č. 9, vzorce

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val | 2_____________5 ____________10____________13|
11. Použití podle nároku 1, při němž se užije peptid s řetězcem č. 10, vzorce

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp
12_____!LJ

12. Použití podle nároku 1, při němž se užije peptid s řetězcem č. 11, vzorce

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asn