SK279227B6

SK279227B6 - Peptidy s ochrannou aktivitou na organizmus, terap

Info

Publication number: SK279227B6
Application number: SK857-94A
Authority: SK
Inventors: Predrag Sikiric; Marijan Petek; Sven Seiwerth; Zeljko Grabarevic; Ivo Rotkvic; Marko Duvnjak; Branko Turkovic; Stjepan Mise; Ernest Suchanek; Boris Mildner; Ivan Udovicic
Original assignee: Predrag Sikiric; Marijan Petek; Sven Seiwerth; Zeljko Grabarevic; Ivo Rotkvic; Marko Duvnjak; Branko Turkovic; Stjepan Mise; Ernest Suchanek; Boris Mildner; Ivan Udovicic
Priority date: 1992-11-16
Filing date: 1993-11-16
Publication date: 1998-08-05
Also published as: BG98907A; SI9300595B; DE69316974T2; JP2812803B2; EP0624164A1; RO115733B1; HUT67982A; HUT66303A; WO1994011394A2; GR3026478T3; HU9303247D0; RU2116311C1; WO1994011394A3; CZ285155B6; SI9300595A; PL304666A1; RU94037232A; CZ162294A3; CA2127553A1; JPH07507568A

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka nových peptidov, vyznačujúcich sa vysokou biologickou aktivitou rovnakého typu ako má známa prírodná zlúčenina BPC, ale s kratším aminokyselinovým reťazcom.

Doterajší stav techniky

Biologicky aktívny proteín s ochrannou aktivitou na organizmus, ktorý bol izolovaný z tela človeka alebo zvieraťa a pomenovaný BPC (Body Protecting Compound), bol opísaný v EP 0 432 400 a tiež publikovaný: P. Sikiric et al, Exp. Clin. Gastroenterol.,1, 15-26, 1991. Tento proteín má vysokú molekulovú hmotnosť asi 40 000 + 5 000 Daltonov a len čiastočne určenú štruktúru. Táto zlúčenina má veľmi široké spektrum biologickej aktivity, ako napríklad protivredová ochrana, ochrana pečene, antivírusová, antiedemická, všeobecne protizápalová a protinádorová aktivita a podobne. Možno ju použiť pri liečbe uvedených chorôb, ďalej v terapii chorôb a porúch nervového systému, porúch dopaminergického pôvodu, v chirurgii, stomatológii, pri liečení plodnosti a vo veterinárnej medicíne. Ale toto široké spektrum aktivít môže byť pravdepodobne aj dôsledkom neurčenej štruktúry, alebo dokonca nedostatočnej čistoty alebo homogenity izolovanej zlúčeniny BPC.

Podstata vynálezu

Objavili sme syntetické peptidy s iba 8 až 15 zvyškami aminokyselín s molekulovou hmotnosťou od 900 do 1 600 Daltonov, ktoré sa vyznačujú podobnou biologickou aktivitou ako prírodná zlúčenina BPC s ochranným účinkom na organizmus, ale so zvýšenou selektivitou. Naše nové peptidy sú pripravované ekonomicky výhodnejšie a sú menej náchylné na účinky vedľajších reakcií, pretože obsahujú menej aminokyselinových zvyškov ako BPC.

V súlade s jedným aspektom predloženého vynálezu bola pripravená trieda syntetických peptidov, ktorá vykazuje prekvapujúco vysokú biologickú aktivitu najmä v smere ochrany organizmu. Tieto syntetické zlúčeniny s dobre definovanou štruktúrou majú v každom prípade veľkú výhodu v porovnaní s vysokomolekulovým, len čiastočne definovaným proteinom BPC, ktorý je možné získať komplikovaným postupom z málo definovaných prírodných zdrojov.

Tento vynález sa zvlášť týka novej skupiny biologicky vysoko aktívnych peptidov, obsahujúcich od 8 do 15 aminokyselinových zvyškov, znázornených nasledujúcim základným štruktúrnym vzorcom, v ktorom každá aminokyselina je vyznačená trojpísmenovým kódom a čísla pod každým aminokyselinovým zvyškom určujú polohu zvyšku v peptidickom reťazci:

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15, kde jeden alebo viacero aminokyselinových zvyškov sú substituované. Substituenty Xaa, Yaa a Zaa, ktoré možno použiť, sú uvedené v nasledujúcej tabuľke 1.

Tab. 1

Zvyšok	Substituent
Xaa	neutrálne alifatické aminokyseliny: Ala, bAla, Leu, íle, Gly, Val, Nie, Nva
Yaa	bázické aminokyseliny: Lys, Arg, Om, His
Zaa	kyslé aminokyseliny: Glu, Asp, Aad, Apm

Ako výhodné peptidy možno uviesť nasledujúce:

Peptidický reťazec č. 1

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val 15 1015

Peptidický reťazec č. 2

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val 15 1015

Peptidický reťazec č. 3

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val 15 1015

V súlade s ďalším hľadiskom predloženého vynálezu boli pripravené analogické peptidy, ukončené amidickou alebo karboxylovou skupinou na koncovom uhlíku, s rovnakým opísaným štruktúrnym vzorcom, v ktorom najmenej jeden a najviac sedem aminokyselinových zvyškov je vynechaných v polohe 1-15 a najmenej jeden z ostávajúcich aminokyselinových zvyškov môže byť substituovaný v zhode so schémou substitúcie, opísanej v tab. 1. Preferované peptidy sú nasledujúce:

Peptidický reťazec č. 4

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val 15 1014

Peptidický reťazec č. 5

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala Gly Leu Val 15 1014

Peptidický reťazec č. 6

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala 1 58

Peptidický reťazec č. 7

Asp Pro Pro Pro íle Arg Pro Ala Asp

59

Peptidický reťazec č. 8

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp

59

V súlade s ďalším opisom ide o peptidy s uvedenými štruktúrnymi vzorcami, v ktorých môže byť vynechaný aspoň jeden aminokyselinový zvyšok a aspoň jeden z ostávajúcich aminokyselinových zvyškov môže byť substituovaný podľa tab. 1, a ktoré sú transformované na cyklickú formu vytvorením novej CONH väzby medzi prvým a posledným aminokyselinovým zvyškom v molekule. Výhodné peptidy sú nasledujúce:

Peptidický reťazec č. 9

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val | 2 5 10_________13_]

SK 279227 Β6

Peptidický reťazec č. 10

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp

L2_____⁵._______U

Pri aplikáciách sa zistilo, že pri použití týchto typov peptidov sa dosiahla rovnaká alebo vyššia biologická aktivita pri pôvodnom proteíne BPC.

Farmakologický výskum opísaných peptidov sa vykonal na rôznych bežných modeloch „in vitro“ a „in vivo“ a boli zistené nasledujúce farmakologické vlastnosti:

1. Ochranný účinok na pečeň a pankreas

Ochranný účinok nedávno syntetizovaného peptidu, označeného ako peptid s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6 bol porovnaný s referenčnými štandardmi (bromocriptin, amantadin, somatostatin) na rôznych experimentálnych modeloch poranenia pečene a pankreasu u krýs: 24 h podviazanie žlčového kanála, 24 h podviazanie žlčového kanála a pečeňovej tepny, 48 h immobilizačný stres, aplikácia CCI4. Použitý peptid, aplikovaný v rozsahu 10 ug - 10 ng/kg telesnej hmotnosti, i, g. aj i. p., zabraňuje nekróze pečene a pankreasu, rovnako ako aj tukovým zmenám u zvierat podrobených 24 h podviazaniu žlčového kanála, 24 h podviazaniu žlčového kanála a pečeňovej tepny, 48 h imobilizačnému stresu a aplikácii CCI4. Biochemické hodnoty bilirubínu, SGOT, SGPT súhlasia s uvedenými makro/mikroskopickými údajmi.

2. Účinok na úrazy obličiek

a) Unilaterálna nefrektómia

Pri experimentoch sa použili biele krysy Wistar oboch pohlaví, 190 - 250 g. Vykonala sa unilaterálna nefrektómia a jej výsledkom bolo zvýšenie hmotnosti zostávajúcej obličky rovnako v kontrolnej skupine ako aj v skupine, ošetrenej peptidmi s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6, podávanými v dávke 10 ug/kg telesnej hmotnosti i. p. 1 h pred chirurgickým zákrokom. V skupine ošetrenej peptidmi bolo zhodne pozorované zníženie rastu ponechanej obličky.

V obidvoch skupinách sa porovnávali biochemické parametre. Zdá sa, že všetky použité peptidy zlepšujú funkciu ponechanej obličky.

b) Aplikácia gentamycínu

Pri experimentoch sa použili samičky bielych krýs Wistar. Aplikáciou gentamycínu v dávkach 40 mg/kg aplikovaných raz denne v priebehu 30 dní sa vyvolalo tubulárne poškodenie. Všetky zvieratá sa usmrtili 5 dní po poslednej aplikácii liečiva. V kontrolnej skupine sa pozorovalo výrazné tubuláme poškodenie, kým významne menšie mikroskopické poranenia boli zhodne zistené vo všetkých skupinách ošetrených uvedenými peptidmi.

c) Chlorid ortuti

Pri experimentoch sa použili biele krysy Wistar. Chlorid ortuti sa aplikoval v dávke 2 mg/kg tel. hmotnosti i. v. a peptidy s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6, v dávkach 20 ug/kg 1 h pred aplikáciou chloridu ortuti. Kontrolné údaje biochemické ako aj mikroskopické výsledky ukázali ochranný účinok v skupinách ošetrených uvedenými peptidmi.

3. Účinok na poškodený semenník

Vplyv peptidov s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6 na poškodené semenníky bol skúmaný pri aplikácii ketoconasolu (24 mg na kg i. g.), testosterónu (30 mg na kg i. p.) alebo ožiarením 6 Gy. Peptidy s peptidickým reťazcom č. 2,

3, 4, 6 sa podávali 1 h pred zákrokom. Peptidy s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6 vykazovali ochranný účinok.

4. Plodnosť/Komerčné rodenie

a) Peptidy s peptidickým reťazcom č. 2, 3,4, 6 a plodnosť.

Účinok na oligo-astenospermózu.

Výskum sa uskutočnil na 10 mužoch vo veku 30 - 40 rokov s diagnózou oligoastenospermis. Od týchto pacientov bol po 3 až 4 dňoch abstinencie odobratý ejakulát. Po stekutení (30 min) sa k 0,5 ml ejakulátu navrství 0,5 ml média. Kontrolné médium pozostávalo z HAM-F 10 s 10 % deaktivovaného chordálneho séra. Experimentálne médium navyše obsahovalo 2 ug/ml, alebo 4 ug/ml BPC. Po uplynutí 90 min. pri 37 °C v atmosfére obsahujúcej 5 % CO₂ sa v Horwellovej fertilizačnej komore stanovil počet spermií pohybujúcich sa dopredu, pohybujúcich sa na mieste a nepohyblivých v 1 ml ejakulátu. Predbežné výsledky neukázali žiadny vplyv na pohyblivosť spermií pri nižšej koncentrácii uvedených peptidov. Ale pri vyššej koncentrácii týchto látok (4ug) bolo zistené významne vyššie percento pohyblivosti v porovnaní s kontrolnou skupinou.

b) Peptidy s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6 a reprodukčný proces

Spomínané peptidy boli testované u myší po troch vrhoch. 20 dní po skončení poslednej laktácie sa zvieratá kopulovali. Použité peptidy sa podávali v dávkach 10 ug/kg teles. hmotnosti i. p. raz denne počas obdobia pregnancie (19 - 21 dní) a laktácie (nasledujúce 3 týždne). Kontrolná skupina dostávala súčasne rovnaký objem fyziologického roztoku. Počet mláďat na samicu v jednom vrhu a ich celková hmotnosť boli zaznamenávané.

Dôkladná štatistická analýza ukázala zhodne významné zvýšenie počtu vyliahnutých mláďat na samicu a prekvapivo žiadne rozdiely v telesnej hmotnosti v každom zo študovaných časových intervalov. Všetky samice po ukončení laktácie sa zotavovali 25 dní. Potom boli znovu kopulované s cieľom sledovať priebeh piatej pregnancie.

V porovnaní s kontrolnou skupinou sa vo všetkých skupinách, ošetrených spomínanými peptidmi, registrovala zvýšená plodnosť, ako aj zvýšená schopnosť laktácie.

Stojí za povšimnutie, že uvedené peptidy by mohli zlepšiť plodnosť u pomerne starých myší. Na záver možno povedať, že tieto výsledky sú v zhode s celkovou zlepšujúcou schopnosťou peptidov a s údajmi in vitro s ľudskými spermiami.

c) Komerčné rodenie

419 zdravých prasiat ( z celkového počtu 4 306 prasiat) dostalo hneď po vyliahnutí 10 ug peptidov s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6, ďalších 1 440 v 13. dni života, 1 h pred kastráciou, kým zostávajúcich 1 477 bolo ošetrených konvenčnou Fe-terapiou. Po 4 týždňoch sa vyhodnotili pomliaždeniny, trhliny, úmrtnosť, telesná hmotnosť a spotreba potravy. Použité peptidy, raz aplikované, výrazne znížili vznik trhlín (v skupinách ošetrených peptidmi hneď po vyliahnutí) a pomliaždenín (vo všetkých skupinách 0šetrených peptidmi). Zvieratá ošetrené peptidmi mali rovnakú telesnú hmotnosť aj pri značne nižšej spotrebe potravy. Vplyv na infekciu: bolo sledovaných 40 odstavených 28-dňových prasiat, infikovaných s E. colli enterocolitis. Použité peptidy boli aplikované u 20 zvierat (10 ug na kg teles. hmotnosti i. m.). O mesiac neskôr sa u zvierat ošetrených peptidmi zistilo významné zníženie úmrtnosti.

V ďalšom pokuse sa sledovala úmrtnosť po prvom týždni u celkového počtu 1 200 zdravých prasiat. 400 zvierat dostalo uvedené peptidy hneď po vyliahnutí spolu s konvenčnou Fe-terapiou. V skupine zvierat ošetrených uvedenými peptidmi (10 ug na kg tel. hmotnosti i. m.) sa zistila významne nižšia úmrtnosť.

5. Vplyv na pôsobenie amfetamínu

Vplyv peptidov s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6 sa sledoval s dávkami 10 ug/kg alebo 10 ng/kg telesnej hmotnosti i. p., podávanými 5 min. pred aplikáciou amfetamínu, alebo aplikovanými súčasne s amfetamínom. V skupine ošetrenej uvedenými peptidmi sa zistilo významné zníženie porúch správania, vyvolaných amfetamínom.

6. Čas krvácania

Vplyv peptidov s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6 sa sledoval bežnými postupmi na testovanie krvácania (odrezanie chvosta alebo rezná rana) u myší a krýs s aplikáciou, alebo bez aplikácie heparinu (1000 UI/Kg s. c. 3 h pred krvácaním). Testované peptidy (10 ug na kg, alebo 10 ng na kg i. p.) sa aplikovali súčasne s vyvolaním krvácania. U všetkých zvierat ošetrených študovanými peptidmi sa zistilo významné zníženie času krvácania.

7. Vplyv na dôsledky kastrácie

Použil sa modifikovaný postup podľa metódy Alien - Doisy. Aplikovali sa rozdielne dávky (10 ug alebo 10 ng na kg i. p.) v jednotlivých aplikáciách, alebo v jednej dennej dávke, a to buď pred zákrokom, alebo po zákroku. V skupine ošetrenej testovanými peptidmi sa predišlo, alebo sa zmiernili rôzne dôsledky kastrácie, napríklad atrofia vaginálneho epitelu, osteoporosis.

8. Hypertenzia

Hypertenzia sa vyvolala jednostrannou oklúziou renálnej tepny. Po 10 dňoch boli zvieratá ošetrené peptidmi s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6 (10 ug alebo 10 ng na kg tel. hmotnosti i. p.) alebo vodným roztokom soli rôznymi postupmi (jednorazovou alebo kontinuálnou aplikáciou). V skupine ošetrenej študovanými peptidmi bolo pozorované výrazné zníženie zvýšeného krvného tlaku.

9. Vplyv na experimentálnu diabetes mellitus

U samcov bielych krýs Wistar, 175-230 g telesnej hmotnosti, sa vyvolal diabetes mellitus streptozotocinom alebo alloxanom. Peptidy s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6 aplikované v dávkach 10 alebo 100 ug/kg významne potláčali vznik diabetu u zvierat ošetrených streptozotocinom. Okrem toho tiež významne predĺžili čas prežitia.

10. Vplyv na tyieoparatyreoidoktomiu

U krýs Wistar sa vykonala totálna ablácia tyreoparatyroidných žliaz. Potom sa podali peptidy s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6 (10 ng na kg tel. hmotnosti i. p.), alebo fyziologický roztok (5 ml na kg tel. hmotnosti i. p.) rôznym postupom (jednorazové alebo opakované ošetrenie). V skupinách ošetrených študovanými peptidmi sa podstatne zredukovali dôsledky odstránenia žliaz.

11. Legácia karotidnej tepny

Zvieratá sa usmrtili 3 h po legácii oboch karotidných tepien. Hodinu pred zákrokom sa všetky zvieratá ošetrili s peptidmi s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6 (10 ng na kg tel. hmotnosti i. p.) alebo fyziologickým roztokom (5 ml na kg tel. hmotnosti i. p.). V skupine ošetrenej peptidmi sa zistil významne menší mozgový edém.

12. Nadobličkové žľazy

Poškodenie nadobličkových žliaz sa vyvolalo u zvierat podávaním anilínu (300 mg na kg s. c. počas 7 dní). Všetky zvieratá sa súčasne ošetrili peptidmi s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6 (10 ug na kg tel. hmotnosti, 10 ng na kg tel. hmotnosti i. p.) alebo fyziologickým roztokom (5 ml na kg tel. hmotnosti i. p.). Určila sa hmotnosť nadobličiek a mikroskopické zmeny. V porovnaní s kontrolnou anilínovou skupinou sa zistilo, že testované peptidy pri oboch dávkach významne zredukovali zvýšenie hmotnosti nadobličky, vyvolané anilínom. Mikroskopicky bola ochrana závislá od dávky. Keďže sa všeobecne uznáva, že poruchy vyvolané anilínom sú príbuzné poruchám vyvolaným hypersekréciou ACTH, možno nájsť súvislosť medzi študovanými peptidmi a ACTH. Zdá sa to tiež podporené zistením, že hmotnosť zvierat v skupine ošetrenej spomínanými peptidmi bola rovnaká ako v neošetrenej zdravej kontrolnej skupine.

Zvieratá ošetrené testovanými peptidmi (10 ug alebo 10 ng na kg tel. hmotnosti i. g.) boli ešte navyše podrobené 48 h immobilizačnému stresu. U zvierat ošetrených peptidmi bolo zníženie stúpajúcej hmostnosti nadobličiek v zhode so zodpovedajúcim mikroskopickým pozorovaním.

13. Poruchy teploty

Zvýšenie telesnej teploty bolo vyvolané aplikáciou roztoku kvasiniek (4000 mg na kg s. c.), a zníženie teploty bolo vyvolané ponorením do studenej vody s teplotou 4 °C, alebo aplikáciou rezerpinu (5 mg na kg i. p). Rozdielnymi postupmi dávkovania peptidov s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6 (10 ng na kg tel. hmotnosti i. p.), testovaných u skupiny so zvýšenou aj zníženou teplotou sa zhodne demonštrovalo odstránenie porúch teploty.

14. Vplyv na hematopoeasis

Biele myši sa očkovali cytostatikami (Endoxan, Vincristin, Adriablastin, Cytosin-arabinosid) v dávkach LD50. Hodinu pred podaním cytostatík sa zvieratá ošetrili peptidmi s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6 v dávke 10 ug, kým kontrolné skupiny dostali rovnaký objem fyziologického roztoku. Zvieratá boli usmrtené v 3., 5., 7. a 11. dni pokusu. Stanovovali sa krvné parametre (E, Hb, Htc, L, Tb abs. počet neutrofilov), parametre kostnej drene, cytológia a histológia pečene a sleziny.

V oboch skupinách na 3. deň pokusu neboli pozorované rozdiely v L, E, Tb a neutrofilných hodnotách, kým neporušené hematopoetické bunky v kostnej dreni zvierat, 0šetrených peptidmi silne kontrastovali s apláziou pozorovanou v kontrolných skupinách.

U zvierat ošetrených peptidmi výrazne stúpol počet neutrofilov a leukocitov do 5. dňa, dosiahol normálnu hodnotu do 7. dňa, kým v kontrolných skupinách pred

11. dňom sa nepozorovala normalizácia.

15. Zníženie bolesti

Bolesť sa vyvolala intraperitonálnou aplikáciou (0,2 ml na myš) 2 %-ného MgSCfy, alebo 0,6 %-nou kyselinou octovou. Pri rôznych postupoch aplikovania peptidov s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6, líšiacich sa veľkosťou dávky alebo časom podania dávky (10 ug alebo 10 ng na

SK 279227 Β6 kg i. p., súčasne alebo 30 min. pred aplikáciou) sa významne znížil čas kŕčovitej bolesti v porovnaní s kontrolnými skupinami.

16. Infekcia vyvolaná rickettsiami

Do vhodných vajec sa očkovalo 0,2 ml suspenzie Coxielle Bumetti, zriedenej 10~⁶. Do vajec sa rovnako naočkovali aj peptidy s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6 (1 pg 10 pg, 100 pg a 1 ng). Doba prežitia bola významne vyššia v ošetrenej skupine v porovnaní s kontrolnými skupinami.

17. Vplyv na tumorové bunky

a) Dva typy buniek L-924 a melanóm B-16 sa kultivovali in vitro za štandardných podmienok. Testoval sa vplyv peptidov s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6, in vitro na rast uvedených bunkových kultúr. Tieto peptidy sa podávali v 3 % koncentrácii (0,1 ml) dva dni po iniciácii bunkových kultúr. O 3 dni neskôr sa počítačom buniek stanovil počet buniek vu každej kultúre. Výsledky ukázali inhibičný účinok uvedených peptidov na bunky melanómu B-16.

b) Erlichov ascites tumor (EAT) je tumor, ktorý môže rásť u všetkých kmeňov myší ako ascitický alebo tuhý, v závislosti od spôsobu zavedenia tumorových buniek. Skúmal sa vplyv inkubácie buniek EAT s peptidmi s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6 injektovaných s týmito bunkami subkutánne alebo intraperitoneálne na dobu prežitia myší. Zvieratá sa pozorovali počas 45 dní. Kontrolnej skupine 15 myších samcov kmeňa NMRI sa nadávkovalo 0,4.10⁶ buniek EAT. Pred injektovaním sa tumorové bunky inkubovali jednu hodinu pri 4 °C vo fyziologickom roztoku. Injekčný objem bol 0,2 ml. Stredná doba prežitia v tejto skupine bola 36 dní a len 3/15 prežili 45 dní.

Experimentálna skupina 15 myších samcov NMRI dostala rovnakú dávku tumorových buniek v rovnakom objeme, ale tieto bunky boli predtým inkubované v roztoku uvedených peptidov ( 2 ug na ml). V priebehu sledovaného obdobia (45 dní) zahynuli len 2/15 myší, kým všetky ostatné prežili viac ako 45 dní. Rozdiel medzi kontrolnou a experimentálnou skupinou bol výrazný (p 0,01). Rovnaké výsledky sa získali aj v prípade rovnakého postupu a injekcie EAT i. p. (namiesto s. c.).

c) Na skúmanie vplyvu peptidov s peptidickým reťazcom č. 2, 3, 4, 6 (podávané v dávke 10 ug na kg tel. hmotnosti i. p.) na pľúcne metastázy, indukované očkovaním buniek melanómu alebo aplastického karcinómu prsných žliaz sa použili myši. V skupine ošetrenej peptidmi sa zistilo významné zníženie počtu pľúcnych metastáz.

Na základe uvedených údajov možno konštatovať, že testované peptidy predlžujú dobu prežitia zvierat s tumormi a teda vykazujú antitumorovú aktivitu.

18. Antidepresivna aktivita

Na zhodnotenie antidepresívnej aktivity sa použil vynútený plávací (swimming) test podľa Porsolta et al ,Eur. J. Pharmacol., 47, 379 - 391, 1978.

Na tento experiment sa použili samce krýs Wistar s telesnou hmotnosťou 180 - 240 g. V zhode s opísaným postupom sa aplikovali testované peptidy s peptidickým reťazcom č. 4. Stručne, kontrolné zvieratá sa ponechali zoradené, odhadom asi na 5 min. a počítal sa čas znehybnenia. Čas znehybnenia v kontrolnej skupine bol 150 s, kým u zvierat ošetrených peptidom sa pozorovali hodnoty len 60 -

- 70 s. Závislosť odozvy od dávky možno počítať nasledovne: 10 ug až 10 ng na kg je plný efekt, 10 pg na kg telesnej hmotnosti - efekt sa ešte prejavuje; 1 pg/kg - efekt sa stráca.

Podľa výsledkov farmakologického výskumu sú tieto peptidy aktívne v zmysle ochrany organizmu proti stresom a chorobám a vo všeobecnosti normalizujú funkcie organizmu.

Ich použitie môže byť tiež efektívne pri prevencii a terapii viacerých chorôb a porúch zdravia ľudí a zvierat. Tieto zlúčeniny možno použiť predovšetkým pri liečení:

- chorôb a porúch zdravia vyvolaných stresom,

- porúch a úrazov pečene a pankreasu,

- atrofie semenníkov a pohyblivosti spermií,

- porúch plodnosti,

- zlepšení komerčného rodenia,

- chorôb spôsobených rickettsiami,

- tyreoparatyreoidoktómie,

- diabetes mellitus,

- porúch nadobličkových žliaz,

- porúch hematopoetického systému, - porúch koagulácie,

- porúch krvácania,

- postkastračných a menopauzálnych porúch,

- ischemických a toxických poškodení,

- psychiatrických porúch, - hypertenzie,

- porúch telesnej teploty, - bolestí,

- tumoru,

- depresie.

Opísané peptidy môžu byť celkove využité tiež v širokej palete farmaceutických prípravkov v kombinácii s netoxickým farmaceutickým nosičom alebo vehikulom ako je plnivo, netoxické pufre, alebo fyziologické soľné roztoky. Takéto farmaceutické prípravky môžu byť použité miestne alebo systémovo a môžu byť použité v každej vhodnej forme, a to kvapalnej, tuhej, polotuhej, v injekčných roztokoch, tabletách, mastiach, omývacích roztokoch, tobolkách, lingvetách a podobne.

Pri systémovej aplikácii môžu byť tieto peptidy podávané vo všeobecnosti v dávkach od 1 - 5 do 10 - 2 mg/kg tel. hmotnosti. Keď sa používajú miestne, môžu byť podané vo vyšších koncentráciách t. j. 0,1 až 0,5 %.

Veľmi výhodná je neprítomnosť akýchkoľvek príznakov toxicity do dávok 50 mg/kg tel. hmotnosti a tiež dobrá aktivita zlúčenín pri perorálnom užívaní (intragastrikálne).

Tu opísané peptidy môžu byť syntetizované postupnou kondenzáciou chránených aminokyselín v homogénnom kvapalnom systéme, alebo výhodne využitím metódy s tuhou fázou. Na prípravu cyklických peptidov sa pripravujú čiastočne chránené lineárne peptidy s požadovanou dĺžkou reťazca s alkylesterovou skupinou na koncovom uhlíku, ktorá sa prevedie na azid, nasleduje kondenzácia a uvoľnenie koncovej skupiny. Čiastočne chránený lineárny peptid s voľnými koncovými skupinami sa môže alternatívne cyklizovať s difenylfosforylazidom vo veľmi zriedených roztokoch.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Príklady uskutočnenia vynálezu sú graficky vysvetlené na obr. 1 až obr. 5 a charakteristika peptidov podľa vynálezu analýzou aminokyselín je vyjadrená na obr. 6 a 7.

Syntéza peptidu s peptidickým reťazcom č. Boe postupom je znázornená na obr. 1 a syntéza peptidu s peptidickým reťazcom č. 2. Fmoc postupom je znázornená na obr.

2. Syntézu peptidu s peptidickým reťazcom č. 6 Ddz postupom ilustruje obr. 3 a syntézu čiastočne chráneného peptidu s peptidickým reťazcom č. 4a Ddz postupom ilustruje obr. 4.

Syntéza lineárneho peptidu s peptidickým reťazcom č. 4a a cyklického peptidu s peptidickým reťazcom č. 9 z čiastočne chráneného lineárneho peptidu 4a je znázornená na obr. 5.

Ultrafialové spektrá peptidov s peptidickým reťazcom č. 4 a 6 (voda, c = 1 mg/ml) zobrazuje obr. 6 a infračervené spektrá peptidov s peptidickým reťazcom č. 4 a 6 (KBr technika) zobrazuje obr. 7.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Vynález je možné bližšie opísať pomocou nasledujúcich príkladov, ktoré však neohraničujú rozsah predloženého vynálezu.

Príklad 1

Syntéza peptidu Boe postupom

Syntéza peptidu sa zahájila so 100 mg Boc-Val-PAM živice s cieľom pripraviť peptid s koncovou karboxylovou skupinou (PAM získaný od Applied Biosystems, substitúcia 0,56 mekv/g je aminoacyl-4-(oxymetyl)-fenyloctový derivát aminopolystyrénu/. Boe aminokyseliny (Boe = tercbutoxykarbonyl-) boli kondenzované jedna za druhou na polymémy nosič pomocou diizopropylkarbodiimidu (DIPC) ako kondenzačného činidla. V každom kroku sa Boe skupina odstránila s 50 % roztokom kyseliny triíluóroctovej /TFA/ v dichlórmetáne. Aminoskupina sa potom deprotonizovala s diizopropyletylamínom.

Konverzia v každom kroku musí byť vyššia ako 99,5 %, v opačnom prípade sa kondenzácia opakovala. Po úplnej syntéze sa uskutočnilo za miernych podmienok štiepenie s HF (2 hodiny pri 0 °C). Na odstránenie karboniového iónu sa použil anizol. HF sa potom odparil v prúde dusíka. Surový peptid sa získal naliatím olejovitého zvyšku do suchého éteru.

Potom sa surový peptid čistil vysokotlakou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) s reverznou fázou na kolóne 5 x 150 mm, naplnenej silikagélom RP-18, gradientová elúcia s rozpúšťadlovým systémom: 0,1 % TFA v zmesi voda/acetonitril. Detekcia: ultrafialová absorpcia pri 225 nm.

Syntéza peptidu s peptidickým reťazcom č. 4 je vyznačená na obr. 1.

Príklad 2 Syntéza peptidu Fmoc postupom

Pri syntéze sa použili štandardné Fmoc chránené aminokyseliny (Fmoc = 9-fluórfenylmetyloxykarbonyl-). Funkčné skupiny na bočnom reťazci sa chránili ako O-tercbutylestery (Asp, Apm, Glu, Aad) a ako Boe deriváty (Lys). Prvá aminokyselina (Val) sa naviazala na polymérny nosič - BHA živicu (BHA = benzhydrilaminoživica) použitím diizopropylkarbodiimidu ako kopulačného činidla. V každom kroku sa ochranná Fmoc skupina odstránila piperidínom. Potom druhá a rovnako všetky ďalšie aminokyseliny boli naviazané rovnakým postupom až do ukončenia syntézy. Štiepenie sa vykonalo zmesou TFA/TFMSA/anizol = 2 : 17 : 52 (obj.).

Peptid sa potom čistil metódou HPLC opísanou v príklade 1. Syntéza peptidu s peptidickým reťazcom č. 2 je ilustrovaná na obr. 2.

Príklad 3

Syntéza peptidu Ddz postupom

Všetky aminokyseliny boli použité v chránenej forme na ich -aminoskupine pomocou Ddz (= a, a-dimetyl-3,5-dimetoxybenzyloxykarbonyl-). Vedľajšie funkčné skupiny sa chránili pomocou skupiny Z (= benzyloxykarbonyl-) pri lyzíne a O-t-Bu skupiny (t-butylester) pri asparágovej a glutámovej kyseline. Na naviazanie prvej Ddz aminokyseliny cez jej céziovú soľ sa použil nosič Merrifielf (zosietený chlórmetylovaný polystyrénový gél) s kapacitou 1,4 mmol/g. Po kondenzácii s dicyklohexylkarbodiimidom (DCC) sa v každom kroku odstránila ochranná skupina Ddz s 5 % TFA v dichlórmetáne, nasledovalo prepieranie a deprotonizácia s 10 % trietylamínom v dichlórmetáne. Po deprotonizácii bol sprostredkovaný ďalší kopulačný krok rovnakou metódou. Tieto kopulačné kroky sa opakovali až do skompletizovania peptidického reťazca.

Nakoniec bol peptid odštiepený z polymémeho nosiča zmesou HBr/TFA/anizol. Po odparení prchavých podielov sa práve odštiepený peptid vyzrážal zo suchého éteru a sušil. Surový peptid sa potom čistil HPLC metódou ako bolo opísané v príklade L Syntéza peptidu s peptidickým reťazcom č. 6 je ilustrovaná na obr. 3.

Príklad 4

Syntéza cyklického peptidu

Peptid v čiastočne chránenej forme:

OBzl NO₂ OBzl

Gly-Glu-Pro-Pro-Pro-Gly-Arg-Pro-Ala-Asp-OH bol najskôr pripravený rovnakou metódou ako bolo opísané v príklade 1 alebo 2.

0,0005 molárny roztok tohto peptidu v dimetylformamide sa cyklizoval po pridaní difenylfosforylazidu a trietylamínu 12 hodín pri 20 °C. Potom sa táto zmes hydrogenovala vodíkom v prítomnosti katalyzátora Pd/aktívne uhlie pri 25 °C 8 hodín. Rozpúšťadlo sa opatrne odparilo a surový produkt sa čistil metódou HPLC, opísanou v príklade 1.

Cyklický peptid s peptidickým reťazcom č. 10

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp 1|_________________5 _________________| 10 sa získal v 10 % výťažku.

Syntéza lineárnych a cyklických peptidov Ddz postupom

Pri získavaní lineárnych a cyklických peptidov sa použil rovnaký postup s Ddz chránením skupín. Vedľajšie funkčné skupiny sa chránili Z skupinou (lyzín) a s O-benzylesterovými skupinami -OBzl- (glutámová a asparágová kyselina).

Polymémym nosičom bola živica HYCRAMR (obchodná značka ORPEGEN, Heidelberg, Nemecko), čo je 4-bromkrotonyl- B -alanylamidometyl-polystyrén. Prvá aminokyselina (Ddz-valín) sa naviazala na polymémy nosič cez jej céziovú soľ. Potom sa Ddz skupina odstránila pomocou roztoku trifluóroctovej kyseliny (5 %) v dichlór metáne a deprotonizácia aminoskupiny sa vykonala s diizopropyletylamínom.

V ďalšom kroku sa naviazal Ddz-glycín na valínový zvyšok na polymérnej matrici s použitím diizopropylkarbodiimidu (DIPC) v prítomnosti 1-hydroxybenztriazolu.

Tieto kroky sa opakovali až do úplného skompletizovania peptidického reťazca. Syntetizovaný peptid v chránenej forme sa potom opatrne odštiepil z nosiča HYCRAMR s tetrakis-(trifenylfosfmo)-paládiom (O), rozpusteným v bezvodom tetrahydrofuráne v neprítomnosti kyslíka. Ako akceptorná molekula pre alylskupiny sa použil aditív morfolínového typu.

Polymémy nosič sa odfiltroval a premyl tetrahydrofuránom. Roztok peptidu sa potom filtroval cez krátku silikagélovú kolónu, aby sa odstránil paládiový katalyzátor.

Eluát, ktorý obsahoval čiastočne chránený peptid s peptidickým reťazcom 4a, sa po odparení rozpúšťadla sušil vo vákuu.

Syntéza lineárneho peptidu s peptidickým reťazcom č. 4

Parciálne chránený peptid 4a sa rozpustil v 2,2,2-trifluÓTetanole a hydrogenoval vodíkom v prítomnosti paládia na aktívnom uhlí (10 %) pri 30 °C. Katalyzátor sa odfiltroval a rozpúšťadlo sa odparilo vo vákuu. Surový zvyšok sa potom čistil HPLC metódou ako bolo opísané v príklade 1. Po čistení sa získal peptid s peptidickým reťazcom č. 4. Produkt bol identický so zlúčeninou, získanou v príklade 1.

Syntéza cyklických peptidov s peptidickým reťazcom č. 9

Čiastočne chránený peptid 4a : 1) tak, aby vznikol 0,001 molámy roztok. Na cyklizáciu sa pridal DIPC a HOBt a reakčná zmes sa nechala stáť 10 hodín pri 20 °C. Potom sa roztok zakoncentroval na malý objem, zriedil 2,2,2-trifluóretanolom a čistil prechodom cez kolónu, naplnenú Sephadexom LH-20. Frakcie obsahujúce čiastočne chránený cyklický peptid 9a sa spájali a hydrogenovali v prítomnosti paládia na aktívnom uhlí (10 %) pri 30 °C prebublávaním vodíkom 8 hodín za intenzívneho trepania.

Potom sa katalyzátor odstránil filtráciou a roztok sa sušil odparením rozpúšťadla vo vákuu. Surový peptid sa dodatočne čistil metódou HPLC opísanou v príklade L Získaný čistý cyklický peptid bol identifikovaný ako peptid s peptidickým reťazcom č. 9.

Syntéza na polymémom nosiči HYCRAMR Ddz postupom a cyklizácia sú ilustrované na obr. 4 a 5. Pri všetkých syntetizovaných peplidoch sa stanovovala ich čistota metódou HPLC na silikagélovej kolóne RP-18 (oktadecylsilanizovaný) a elučným činidlom bolo zmesové rozpúšťadlo voda/acetonitril/trifluóroctová kyselina, gradientovo bežným postupom. Vo všetkých prípadoch bola čistota vyššia ako 95 %.

Peptidy boli charakterizované analýzou aminokyselín (hodnoty boli v rámci + 10 % teórie), sekvenčnou analýzou, stanovením molekulovej hmotnosti hmotnostnou FAB spektrometriou, ultrafialovými a infračervenými spektrami (obr. 6 a 7).

I keď tu boli opísané len určité charakteristiky nášho vynálezu v špecifických detailoch, odborník v tejto oblasti bude schopný vykonať ďalšie špecifické vylepšenia a mnohé zmeny, tieto však budú vždy v duchu vynálezu a v rozsahu priložených patentových nárokov.

Claims

1. Peptidy s ochrannou aktivitou na organizmus, vyznačujúci sa tým, že obsahujú od 8 do 15 aminokyselinových zvyškov a sú reprezentované všeobecným vzorcom:

Xaa Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15, v ktorom

Xaa znamená neutrálny zvyšok alifatickej aminokyseliny ako Ala, bAla, Leu, íle, Gly, Val, Nie, Nva

Yaa znamená bázický zvyšok aminokyseliny ako Lys, Arg, Om, His

Zaa znamená kyslý zvyšok aminokyseliny ako Glu, Asp, Aad alebo Apm;

a v ktorom môže byť vynechaný najmenej jeden a vynechaných najviac sedem z aminokyselinových zvyškov.

2. Peptidy podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že molekuly sú cyklizované amidickou väzbou medzi prvým a posledným aminokyselinovým zvyškom.

3. Peptid podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že jeho peptidický reťazec má vzorec:

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val 15 1015

4. Peptid podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že jeho peptidický reťazec má vzorec:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val 15 1015

5. Peptid podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že jeho peptidický reťazec má vzorec:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val 15 1015

6. Peptid podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že jeho peptidický reťazec má vzorec:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val 15 1014

7. Peptid podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že jeho peptidický reťazec má vzorec: Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala Gly Leu Val 15 10 14

8. Peptid podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že jeho peptidický· reťazec má vzorec:

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala

1 58

9. Peptid podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že jeho peptidický reťazec má vzorec:

Asp Pro Pro Pro íle Arg Pro Ala Asp

1 59

10. Peptid podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že jeho peptidický reťazec má vzorec:

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp

1 59

11. Peptid podľa nárokov la 2, vyznačujúci sa tým, že jeho peptidický reťazec má vzorec:

L^u Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val , 2_____________5_____________________10___________13:

12. Peptid podľa nárokov la 2, vyznačujúci sa tým, že jeho peptidický reťazec má vzorec:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp

I 2_________________5 9 I

13. Peptid podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že jeho peptidický reťazec má vzorec:

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asn

1 5 9

14. Terapeutický prípravok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje jeden alebo viac peptidov podľa nárokov 1 až 13 v prímesi s farmaceutický akceptovateľným tuhým alebo kvapalným vehikulom.

15. Použitie peptidov podľa nárokov 1 až 13 na výrobu liečiv na liečenie chorôb a porúch zdravia vyvolaných stresom, porúch a úrazov pečene a pankreasu, atrofie semenníkov a pohyblivosti spermií, porúch plodnosti, zlepšení komerčného rodenia, chorôb spôsobených rickettsiami, tyreoparatyreoidoktómie, diabetes mellitus, porúch nadobličkových žliaz, porúch hematopoetického systému, porúch koagulácie, porúch krvácania, postkastračných a menopauzálnych porúch, ischemických a toxických poškodení, psychiatrických porúch, hypertenzie, porúch telesnej teploty, bolestí, tumoru, depresie.