BG61697B1

BG61697B1 - Пептиди с органопредпазна активност, метод за тяхнотополучаване и терапевтичното им приложение

Info

Publication number: BG61697B1
Application number: BG98907A
Authority: BG
Inventors: Predrag Sikiric; Marijan Petek; Sven Seiwerth; Zeljko Grabarevic; Ivo Rotkvic; Marko Duvnjak; Branko Turkovic; Stjepan Mise; Ernest Suchanek; Boris Mildner; Ivan Udovicic
Original assignee: Predrag Sikiric; Marijan Petek; Sven Seiwerth; Zeljko Grabarevic; Ivo Rotkvic; Marko Duvnjak; Branko Turkovic; Stjepan Mise; Ernest Suchanek; Boris Mildner; Ivan Udovicic
Priority date: 1992-11-16
Filing date: 1994-07-15
Publication date: 1998-03-31
Also published as: EP0624164A1; ATE163131T1; HUT66303A; EP0624164B1; AU5624994A; DE69316974T2; RU2116311C1; WO1994011394A2; RU94037232A; PL304666A1; SK279227B6; BG98907A; SK85794A3; DE69316974D1; WO1994011394A3; SI9300595B; RO115733B1; HU211260A9; HUT67982A; GR3026478T3

Description

(54) ПЕПТИДИ С ОРГАНОПРЕДПАЗНА АКТИВНОСТ, МЕТОД ЗА ТЯХНОТО ПОЛУЧАВАНЕ И ТЕРАПЕВТИЧНОТО ИМ ПРИЛОЖЕНИЕ

BG 61697 Bl (57) Изобретението се отнася до синтетични пептиди с верига само от 8 до 15 аминокиселинни остатъка с молекулно тегло от 900 до 1600 Da. Те имат биологичната активност на естественото телесно предпазващо съединение (ПТС), но са с повишена селективност. Новите пептиди са икономически по-изгодни за производство и по-слабо се засягат от ефектите на странични реакции, тъй като съдържат по-малко аминокиселинни остатъци от ПТС.

претенции, 7 фигури (54) ПЕПТИДИ С ОРГАНОПРЕДПАЗНА АКТИВНОСТ, МЕТОД ЗА ТЯХНОТО ПОЛУЧАВАНЕ И ТЕРАПЕВТИЧНОТО ИМ ПРИЛОЖЕНИЕ

Област на техниката

Настоящото изобретение се отнася до нови пептиди с високобиологична активност от същия тип, както на известните природни ПТС (предпазващи тялото съединение), но с по-къси аминокиселинни вериги.

Предшестващо състояние на техниката

Биологично активен протеин с органопредпазна активност, който е изолиран от човешко или животинско тяло и наречен ПТС (предпазващо тялото съединение), се описва в ЕР 432 400 и е публикуван в: Р. Sikiric et al., Exp. Clin. Gastroenterol., 1, 15-26, 1991. Той e c високо молекулно тегло от около 40 000 + 5000 далтона, само с частично определена структура. Съединението е с много широк спектър на биологично действие, например предпазване от язва, хепатопротективно, антивирусно, антиедематозно, общо антивъзпалително, антималигнено действие и други. То може да се използва при лечението на цитираните заболявания, както и при терапията на заболявания и смущения на нервната система, смущения с допаминергична етиология, в хирургията и стоматологията, при лечение на фертилитет и във ветеринарната медицина. Този широк спектър на действие обаче, най-вероятно може да е следствие от неопределена структура или от недостатъчно пречистване или хомогенност на изолираното ПТС съединение.

Техническа същност на изобретението

В съответствие с един аспект на настоящото изобретение се предлага клас синтетични пептиди, който показва изненадващо висока биологична активност, по-специално за предпазване на тялото. Синтетичните съединения с добре дефинирана структура имат голямо предимство в сравнение със само частично дефинирания високомолекулен протеин ПТС, който може да се получи единствено по сложна процедура от несигурен източник.

По-точно изобретението се отнася до нов клас високо-биологично активни пептиди, включващи от 8 до 15 аминокиселинни остатъци, които са представени от следната основна структурна формула, като се използва трибуквеният аминокиселинен код и номерата под всеки аминокиселинен остатък се отнасят до позицията на остатъка в пептидната верига:

Хаа Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa

10 15 където един или повече аминокиселинни остатъци са заместени. Заместителите Хаа,

Остатък

Хаа

Yaa

Zaa

Предпочитани пептиди са както следват:

Yaa и Zaa, които могат да бъдат използвани, са показани на следващата таблица.

Таблица 1

Заместител неутрална алифатна аминокиселина:

Ala, bAla, Leu, lie, Gly, Val, Nle, Nva базична аминокиселина:

Lys, Arg, Om, His кисела аминокиселина:

Glu, Asp, Aad, Apm

Seg. Id. No: 1

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Ley Gly Val

10 15

Seg. Id. No: 2

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Vai са пропуснати и поне един от оставащите аминокиселинни остатъци може да се замести съгласно описаната в таблица 1 схема за заместване.

Предпочитани пептиди са както следват

1 5	10	15
Seg. Id. No: 3
Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Vai
1 5	10	15

В съответствие c друг аспект на настоящото изобретение се предоставят аналогични пептиди в амидна или карбоксикрайна форма при С-края, имаща структурна формула, описана по-горе, и където поне един от най-много 7 аминокиселинни остатъка в областта 1Seg. Id. No: 4

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Vai 15 1014

Seg. Id. No: 5

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala Gly Leu Vai 15 1014

Seg. Id. No: 6

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala

58

Seg. Id. No: 7

Asp Pro Pro Pro He Arg Pro Ala Asp

59

Seg. Id. No: 8

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp

59

В съответствие c друг възможен вариант пептидите са със структурни формули, описани тук по-горе, и където поне един аминокиселинен остатък може да бъде изпуснат и поне един от оставащите аминокиселинни остатъци може да бъде заместен, както е посо чено в таблица 1. Те са трансформират в циклична форма чрез образуването на нова връзка CO-NH между първия и последния аминокиселинен остатък в молекулата.

Предпочитани пептиди са както следва:

Seg. Id. No: 9

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Vai

\| 2 5	10	13
Seg. Id. No: 10 Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp 12______³________U

Заявителите са открили, че когато се използват пептиди, като описаните по-горе, те показват биологична активност равна или поголяма от изходния ПТС протеин.

Фармакологичните изследвания на описаните пептиди са осъществени върху различни обичайни модели “in vitro” и “in vivo” и според фармакологичните свойства са открити:

1) Предпазващ ефект върху черния дроб и панкреаса

Предпазващият ефект на новосинтезирания пептид, кодиран Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6, се сравнява с референтни стандарти (бромкриптин, амантадин, соматостатин) в различни експериментални модели на нараняване на черен дроб и панкреас при плъхове: 24-часова лигатура на жлъчния канал, 24-часова лигатура на жлъчния канал + чернодробната артерия, 48-часов стрес от въздържане, СС1₄ прилагане. Използваният пептид се прилага в граници между 10 g - 10 ng/kg телесно тегло, също така i.g. или i.p. значително предпазват некрозата на черния дроб и панкреаса, както и мастните промени при животни, подложени на 24часово лигиране на жлъчния канал, 24-часово лигиране на жлъчния канал + чернодробната артерия, 48-часов стрес от въздържане, СС1₄приложение. Биохимичните стойности на билирубина, SGOT, SGPT са напълно във връзка с посочените макро/микроскопски данни.

2) Ефект върху бъбречни лезии

a) Едностранна нефректомия

При експеримента се използват Wistar плъхове албиноси от двата пола с тегло от 190 до 250 g. Извършва се едностранна нефректомия, в резултат на което се наблюдава нарастване на теглото на останалия бъбрек при контролата, както и при групи третирани със Seq. Id. No. 2, 3, 4, 6, приложени в 10 gg/kg телесно тегло i.p. 1 h преди операцията. При групите, третирани с пептиди, последователно се наблюдава намаляване на останалия бъбрек.

Биохимичните параметри в двете групи се сравняват. Резултатите показват, че всичко, което е използвано, подобрява функционирането на останалия бъбрек.

b) Прилагане на гентамицин

При експериментите се използват женски Wistar плъхове албиноси. Индуцират се повреди на каналите чрез прилагане на гентамицин в доза от 40 mg/kg веднъж дневно, в продължение на 30 дни. Всички животни се умър твяват 5 дена след последното прилагане на лекарството. Наблюдават се значителни лезии на каналите при контролните групи, където последователно се откриват значително второстепенни микроскопски лезии при всички групи, третирани с посочените пептиди.

с) Живачен хлорид

При експериментите се използват Wistar плъхове албиноси. Живачен хлорид се прилага при доза от 2 mg/kg телесно тегло интравенозно, а пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6 в дози от 20 gg/kg 1 h преди прилагането на живачния хлорид. Различни контролни данни, както и биохимичните и микроскопските резултати показват предпазващ ефект при групите, третирани с посочените пептиди.

3) Влияние върху тестисни лезии

Влиянието на пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6 върху тестисни лезии се изследва чрез прилагане на кетоконазол (24 mg/kg i.g.), тестостерон (30 mg/kg i.p.) или 6 Gy облъчване. Пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6 се прилагат 1 h преди това. Пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6 показват предпазващ ефект.

4) Фертилитет/Стопанско развъждане

a) Пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6 и фертилитет

Влияние на олигоастеноспермията. Изследването се осъществява при 10 мъже на възраст между 30 и 40 години, с диагноза за олигоастеноспермия. От тези пациенти се взима еякулат след 3 до 4 дена въздържание. След втечняване (30 min), към 0,5 ml еякулат се прибавя послойно 0,5 ml среда. Контролната среда се състои от HAM-F 10 с 10% дезактивиран хрущялен серум. Експерименталната среда съдържа допълнително 2 gg/ml или 4 gg/ml ПТС. След 90 min при 37°С в атмосфера, съдържаща 5% СО₂, в Horwell фертилитетна камера се определя броят на прогресивно движещи се, движещи се на място и неподвижни сперматозоиди в 1 ml еякулат. Предварителните резултати не показват ефект върху способността на сперматозоидите да се движат при ниски концентрации на посочените пептиди. Въпреки това, при високи концентрации (4 gg) се определя значителен процент на подвижност спрямо контролата.

b) Пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6 и процесите на репродуциране

Посочените пептиди се изследват при мишки с предхождащи три бременности. 20 дена след спиране на последната лактация, животните се подлагат на копулация. Използваните пептиди се прилагат в дози от 10 pg/kg телесно тегло интраперитонеално веднъж на ден, по време на целия период на бременността (19-21 дена) и лактацията (следващите три седмици). Контролни групи получават едновременно равен обем физиологичен разтвор. Отбелязва се броят и теглото на поколението за всяка женска.

Внимателен статистически анализ разкрива последователно значително нарастване на броя на потомството на всяка женска, както и изненадващо, никаква разлика между телесното тегло при всеки от изучаваните интервали от време. На всички женски се предоставя възможност да се възстановят следващите 25 дена след спиране на лактацията. След това те отново се подлагат на копулация, за а се изследва ефектът върху пета бременност.

Регистрира се нарастване степента на фертилитет с повишена способност за лактация при всички групи, третирани с посочените пептиди, в сравнение с контролните такива.

Трябва да се отбележи, че посочените пептиди могат да подобрат фертилитета при сравнително възрастни мишки. В заключение, тези резултати са във връзка с цялата полезна способност на пептидите и с получените in vitro данни при използването на човешка сперма. Способност на пептидите и in vitro данни, са получени при използване на човешка сперма 1 полезен пептид оРа.

с) Промишлено развъждане

1419 здрави прасета (от общо 4306 прасета) получават непосредствено след раждането си 10 pg от пептидите Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6, други 1440 - на 13-ия ден 1 h преди кастриране, като оставащите 1477 получават единствено конвенционалната Fe-терапия. Контузиите, отделянето, смъртността, телесното тегло и консумацията на храна се оценяват след 4 седмици. След като се приложат използваните пептиди, значително се намалява степента на отделяне (в групите третирани с пептиди непосредствено след раждането) и степента на контузии (във всички групи, третирани с пептидите). При животните, третирани с пептиди, се получава същото телесно тегло при забележително по-ниска консумация на храна. За влияние върху инфекции се изследват 40 отбити 28-дневни прасенца, ин фектирани с Е. coli ентероколит. Използваните пептиди се прилагат на 20 животни (10 pg/kg телесно тегло, мускулно). Един месец по-късно се отбелязва значително намаляване на степента на смъртност при третираните с пептиди животни.

В друг експеримент степента на смъртност след първата седмица се изследва при общ брой от 1200 здрави прасета. 400 животни получават посочените пептиди непосредствено след раждането, в добавка на конвенционалната fe-терапия. Отбелязва се значително намалена степен на смъртност при споменатите групи, третирани с пептиди (10 g/kg телесно тегло, мускулно).

5) Влияние върху амфетаминово поведение

Влиянието на пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6 се изследва при дози от 10 pg/kg или 10 ng/kg телесно тегло интраперитонеално, 5 min преди или едновременно с прилагането на амфетамин. При групите, третирани със споменатите пептиди, се отбелязва значително намаляване на амфетамининдуцираното разстройство на поведението.

6) Време на кървене

Влиянието на пептиди Seq. Id. No.: 2, 3,

4, 6 се изследва чрез обикновените опити за време на кървене (отрязване на опашката или инцизия) при мишки или плъхове, със или без прилагане на хепарин (1000 UI/kg, подкожно, 3 h преди кървенето). Изследваните пептиди (10 pg/kg или 10 ng/kg, интраперитонеално) се прилагат едновременно с индукцията на кървенето. При всички третирани животни се отбелязва значително намаляване на времето на кървене.

7) Влияние върху последиците от кастриране

Прилага се модифицирана процедура на метода на Allen-Doisy. Прилагат се различни дози (10 pg/kg, интраперитонеално), при единично приложение или веднъж на ден, както и претретиране или посттретиране. При групите, третирани с изследваните пептиди, се отбелязва предпазване или реверсия (връщане) от различни последствия на кастрацията (например, атрофия на вагиналния епител, остеопороза).

8) Хипертония

Хипертонията се индуцира чрез едностранна оклузия на бъбречната артерия. След дена животните се третират с пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6 (10 pg/kg или 10 ng/kg телесно тегло, интраперитонеално) или физиологичен разтвор, като се използват различни схеми (еднократно или продължително прилагана). В групите, третирани с изследваните пептиди, се наблюдава значително намаляване на стойностите на повишеното кръвно налягане.

9) Влияние върху експериментален диабетичен мелитус

Wistar мъжки плъхове албиноси, 175-230 g телесно тегло, се използват за стрептозотоцин- или алоксаниндуциран диабетичен мелитус. Пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6, приложени в дози 10 или 100 pg/kg, значително заличават началото на диабет при животните, третирани със стрептозотоцин. Те даже продължават времето на преживяване.

10) Влияние върху тиреопаратиреоидоктомия

Осъществява се цялостно изрязване на тиреопаратироидните жлези при Wistar плъхове. След това се прилагат пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6 (10 ng/kg телесно тегло, интраперитонеално) или физиологичен разтвор (5 ml/kg телесно тегло, интраперитонеално), като се използват различни схеми на приложение (еднократно или повторено третиране). При групите, третирани с изучаваните пептиди, значително се намаляват последствията, причинени от отстраняването на жлезите.

11) Лигиране на каротидната артерия

Животните се умъртвяват 3 h след лигиране на двете каротидни артерии. 1 h преди това всички животни се третират с пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6 (10 ng/kg телесно тегло, интраперитонеално) или физиологичен разтвор (5 ml/kg телесно тегло, интраперитонеално). При групите, третирани с изследваните пептиди, се открива значително по-малко мозъчен едем.

12) Надбъбречни жлези

За индуциране нараняване на надбъбречните жлези животните получават анилин (3000 mg/kg подкожно, в продължение на 7 дена). Всички животни едновременно се третират с пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6 (10 pg/kg телесно тегло, 10 ng/kg телесно тегло, интраперитонеално) или с физиологичен разтвор (15 ml/kg телесно тегло, интраперитонеално). Определя се теглото на надбъбречните жлези, както и микроскопските промени. Изследваните пептиди значително редуцират анилининдуцираното повишение на теглото на надбъбречните жлези при двете дози спрямо анилинконтролната група. Микроскопски, супазният ефект е зависим от дозата. Тъй като обикновено се приема, че индуцираните от анилина нарушения са свързани с АСТН хиперсекретиране, може да се установи причинно-следствена връзка между изследваните пептиди и АСТН. Това се потвърждава също и от наличието на едно и също тегло при групите, третирани със споменатите пептиди, и при първоначалната здрава група.

Животните се подлагат на 48-часова процедура на стрес от въздържание, след предварителното третиране с изследваните пептиди (10 pg или 10 ng/kg i.p./i.g.). Намаляването на повишеното тегло на надбъбречните жлези при животните, третирани с изучаваните пептиди, е съвместимо със съответното микроскопско наблюдение.

13) Температурни смущения

Предизвиква се повишаване на телесната температура чрез прилагане на дрождев разтвор (4000 mg/kg, подкожно), докато спадането на температурата се индуцира чрез потапяне в студена вода, температура 40°С или прилагане на резерпин (5 mg/kg, интраперитонеално) . Последователно е показано, че различни режими на пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6 (10 ng/kg телесно тегло, интраперитонеално) , изследвани както върху повишената температура, така и върху намалената температура, са нормализиращи и за двете температурни смущения.

14) Влияние върху хематопоезата

Мишки албиноси се инжектират с цитостатици (Endoxan, Vincristin, Adriablastin, Cytosinarabinosid) при LD_J0 дози. 1 h преди прилагането на цитостатика животните се третират с пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6 при доза от 10 pg, като контролите получават равен обем физиологичен разтвор. Животните се умъртвяват на 3, 5, 7 и 11-ия ден на експеримента. Определят се параметрите на кръвта (Е, Hb, Htc, L, Tb абе. брой на неутрофили), костния мозък, цитологията и хистологията на черния дроб и далака.

На третия ден от експеримента не се наблюдава разлика между групите в стойностите на L, Е, ТЬ и неутрофилните такива, за разлика от интактните хематопоетични клетки в костния мозък на животните, третирани б

с пептиди, силно различаващи се с отчетената аплазия при контролите.

Броят на неутрофилите и левкоцитите значително нараства при животните, третирани с пептиди до петия ден, като достига нормалните стойности до края на седмия ден, за разлика от контролите, където не би трябвало да се наблюдава нормализиране преди 11 -тия ден.

15) Намаляване на болката

Болката се индуцира чрез интраперитонеално прилагане (0,2 ml/мишка) на 2% MgSO₄ или 0,6% оцетна киселина. Различни режими на пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6, в съответствие с дозата или времето на прилагане (10 pg или 10 ng/kg интраперитонеално, едновременно или 30 min преди), значително намаляват времето на страдание, в сравнение с контролните групи.

16) Инфекции, индуцирани от рикеции

0,2 ml разтвор на Coxiella Bumetti, разтворена 10-9, се инжектира в подходящи яйца, като пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6 (1 pg, 10 pg, 100 pg и 1 ng) също се инжектират. Времето на преживяемост е значително по-дълго при третираните групи, отколкото при контролните групи.

17) Влияние върху туморни клетки

a) Две клетъчни линии L-924 и меланома В-16 се култивират in vitro при стандартни условия. In vitro се изследва влиянието на пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6 върху растежа на тези култури. Два дена след инициирането на клетъчните култури посочените пептиди се прибавят при концентрация 3 % (0,1 ml). Три дена по-късно, броят на клетките за култура се определя чрез клетъчен брояч. Резултатите показват инхибиращ ефект на посочените пептиди върху В-16 меланомните клетки.

b) Erlich’s асцитен тумор (ЕАТ) е тумор, който може да расте във всички щамове от мишки, и като асцитен и като солиден, в зависимост от начина на приложение на туморните клетки. Изследва се влиянието на инкубирането на ЕАТ клетките с пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6 върху времето на преживяемост на мишки, инжектирани с тези клетки подкожно или интраперитонеално. Животните се наблюдават в продължение на 45 дена. Контрола от 15 мъжки мишки, щам NMRI, получават 0,4 х 106 ЕАТ клетки. Преди инжектирането, туморните клетки се инкубират в про дължение на 1 h при 4°С във физиологичен разтвор. Обемът на инжекциите е 0,2 ml. Средното време на преживяемост в тази група е 36 дена и само 3/15 преживяват 45 дена.

Експериментални групи от 15 NMRI мъжки мишки получават същата доза туморни клетки, в същия обем, но тези клетки предварително са били инкубирани в разтвор (2 pg/ml) на посочените пептиди. Само 2/15 мишки умират за наблюдавания период (45 дена), докато всички останали преживяват над 45 дни. Разликата между контролната и експерименталната група е значителна (Р < 0,01). Наблюдават се същите резултати, ако се осъществи същата процедура и се инжектира ЕАТ интраперитонеално (вместо подкожно).

с) Мишките се използват за изследване влиянието на пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6 (приложени в дози от 10 pg/kg телесно тегло, интраперитонеално) върху метастази на бял дроб, индуцирани от инжектиране на меланома или апластични клетки от карцином на гърда. При третираните с пептиди групи се определя значително намаляване на броя на метастазите на белия дроб.

Посочените данни показват, че пептидите продължават времето на преживяемост на животните с тумори и проявяват антитуморна активност.

18) Антидепресивно действие

За разкриване на антидепресивното действие се използва тестът на принудително плуване, съгласно Porsolt et al., Eur. J. Pharmacol., 47, 379-391, 1978.

За този експеримент се използват мъжки Wistar плъхове (от 180 до 240 g телесно тегло). Изследваните пептиди Seq. Id. No.: 2, 3, 4, 6 се прилагат съгласно описания протокол. За кратко контролните животни се строяват, определянето е за 5 min, и се изчислява времето на неподвижност. Времето на неподвижност при контролите е 150 s, докато при третираните с пептиди животни се наблюдават стойности само от 60 до 70 s. Може да се изчисли кривата на отговора спрямо дозата както следва: при 10 pg - 10 ng/kg има пълен ефект, при 10 pg/kg телесно тегло действието е все още на лица, а при 1 pg/kg ефект липсва.

Следните резултати от фармакологичните изследвания на тези пептиди посочват активност в посока на предпазване на организма срещу стрес и заболявания и най-общо към нормализиране на функциите му.

Те могат ефективно да бъдат използвани за предотвратяване и лечение на някои заболявания и смущения при човека и животните. По-точно, тези съединения могат да се използват за лечение на: индуцирани от стрес смущения и заболявания; смущения и лезии на черния дроб и панкреаса; атрофия на тестисите и подвижността на спермата; смущения на фертилитета; подобряване на стопанско развъждане; заболявания, причинени от рикеции; тиреопаратиреоидектомия; диабетичен мелитус; смущения в надбъбречните жлези; смущения в хематопоетичната система; смущения в коагулацията; смущения в кървенето; посткастроционни/менопаузни смущения; исхемични и токсични лезии; психитрични смущения; хипертония; смущения на телесната температура; болка; тумор и депресия.

Най-общо, описаните пептиди могат също да се използват в широка гама фармацевтични състави, в комбинация с нетоксичен фармацевтичен носител или вехикулузи, като пълнител, нетоксичен буфер или физиологичен разтвор. Такива фармацевтични състави могат да се използват локално или систематично и могат да бъдат под всякаква подходяща форма, като течност, твърдо или полутвърдо тяло, инжекционен разтвор, таблетки, мазила, лосиони, капсули, лингвалети или подобни.

Пептидите се използват най-общо в дози от КГ⁵ до IO'² mg/kg телесно тегло, когато се прилагат систематично. За локално приложение се използват по-високи концентрации, например 0,1% до 0,5%.

Много благоприятно е отсъствието на какъвто и да е белег на токсичност до дози от 50 mg/kg телесно тегло, както и добро действие на съединенията при перорално прилагане (интрагастрично).

Описаните тук пептиди могат да бъдат синтезирани, като се използва стъпка по стъпка кондензация на защитени аминокиселини в хомогенна течна система или за предпочитане, може да се използва твърдофазовият метод. За приготвяне на циклични пептиди, частично защитени линейни пептиди с желана дължина се приготвят с алкилестерна група на С-края, която се конвертира в азид със следващо куплиране и депротекция. Алтернативно, частично защитен линеен пептид със свободни крайни групи може да се циклира чрез дифенил фосфорилазид в много разреден разтвор.

Изобретението се описва по-нататък с оглед на следващите примери, като обхватът на изобретението не се ограничава с тях.

Примери за изпълнение на изобретението

Пример 1. Пептиден синтез при използване на Вос стратегия

Пептидният синтез се осъществява, като се започне със 100 mg Boc-Val-PAM смола, за продуциране на С-краен карбоксилен пептид (РАМ, доставен от Applied Biosystems, заместване 0,56 meq/g е аминоацил-4-(оксиметил)-фенилоцетна киселина производно на аминополистирен). Вос аминокиселини (Вос = терц.-бутоксикарбонил-) се кондензират една след друга върху полимерен носител, като се използва диизопропилкарбодиимид (DIPC) като кондензационен реагент. При всеки етап Вос-групата се отстранява с 50% разтвор на трифлуороцетна киселина (TFA) в дихлорметан. Аминогрупата след това се депротонира с диизопропилетиленамин.

Конверсията при всеки етап трябва да бъде по-висока от 99,5%. Ако не е, кондензирането се повтаря. След пълния синтез се осъществява разцепване, като се използва ниска HF процедура (2 h при 0°С). Като въглероден йон-чистач се използва анизол. HF се изпарява под поток от азот. Суровият необработен пептид се получава след това чрез наливане на мастен остатък в сух етер.

След това необработеният пептид се пречиства чрез обратнофазова HPLC (ВЕТХ), като се използва колона 5 х 150 mm, заредена със силикагел RP-18, при градиентно елуиране със солвентна система: 0,1% TFA във вода/ ацетонитрил. Детекция: ултравиолетова абсорбция при 225 nm. Синтезът на пептида от Seq. Id. No.: 4 е представен на фиг.1.

Пример 2. Пептиден синтез при използване на Fmoc стратегия

Използват се стандартни Fmoc защитени аминокиселини за синтезата (Fmoc = 9флуоренилметилоксикарбонил-). Функционалните групи на страничната верига се защитават като 0-тетра. бутилови естери (Asp, Apm, Glu, Aad) и като Вос-деривати (Lys). Първата аминокиселина (Val) се свързва върху полимерна ВНА-носител смола (ВНА “ бензхидриламино смола), като се използва диизопро пилкарбодиимид като свързващ агент. При всеки етап Fmoc защитената група се отстранява с пиперидин. След това втората и всички следващи аминокиселини се въвеждат, като се използва същият начин, до завършване на син- 5 теза. Разцепването се извършва със смес от TFA/TFMSA/анизол = 2:17:52 (об./об.).

След това пептидът се пречиства, като се използва методът на ВЕТХ, описан в пример 1. Синтезът на пептида със Seq. Id. No.: 2 е илюстриран на фиг.2.

Пример 3. Пептиден синтез с използване на Ddz стратегия

Всички аминокиселини се използват защитени при тяхната -аминофункционална група чрез Ddz (= алфа, а-диметил-3, 5 диметоксибензилоксикарбонил-). Страничните функционални групи се защитават със Z група (= бензилоксикарбонил-) за лизин и o-t-Bu група (t-бутилов естер) за аспартат и глутамат. 20 Merrifield носител (омрежен хлорометилиран полистиролов гел) с капацитет 1,4 mmol/ g се използва за свързване на първата Ddzаминокиселина чрез нейната цезиева сол. След кондензиране с дициклохексилкарбодиимид (DCC) се отстранява Ddz-защитната група при всеки етап, с 5% TFA в дихлорометан, следвано от промиване и депротониране с 10% триетиламин в дихлорметан. След депротониране следващият етап на свързване се извършва с помощта на същия метод. Етапите на свърз10 ване се повтарят, докато пептидната последователност се попълни.

Накрая, пептидът се отцепва от полимерния носител, като се използва смес НВг/ TFA/анизол. След изпаряване на летливата 15 част, текущо отцепеният пептид се утаява със сух етер и се изсушава. Поредният пептид след това се пречиства чрез ВЕТХ-метод, както е описано в пример 1.

Синтезът на пептида от Seq. Id. No.: 6 е илюстриран на фиг.З.

Пример 4. Синтез на цикличен пептид: Пептид в частично защитена форма:

OBzl NO₂ OBzl

Gly - Glu - Pro - Pro - Pro - Gly - Arg - Pro - Ala - Asp - OH предварително се приготвя съгласно метода, описан в примери 1 или 2.

0,0005 mol разтвор на този пептид в диметилформамид се привежда в циклична форма след прибавяне на дифенилфосфорилазид и триетиламин при 20°С в продължение на 12 h.

След това сместа се хидрогенира с ка30 тализатор водород/паладиев активен въглен при 25°С, в продължение на 8 h.

Разтворителят се изпарява внимателно и суровият продукт се пречиства, като се използва ВЕТХ метода, описан в пример 1.

Цикличен пептид с Seq. Id. No.: 10

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp

5 10 се получава c добив 10%.

Синтез на линейни и циклични пептиди с помощта на Ddz стратегията.

Същата стратегия с Ddz защитните групи се използва за получаване на линейни и циклични пептиди. Страничните функционални групи се защитават със Z група (лизин) и с О-бензил естерни групи - OBzl - (глутамат и аспартат). Полимерен носител е Hycram* смола (търговска марка на Orpegen, Heidelberg, Germany), която е 4-бромокротонил- -аланил45 амидометил-полистирол. Първата аминокиселина (Ddz-валин) се свързва върху полимерния носител чрез нейната цезиева сол.

След това Ddz групата се отстранява, като се използва трифлуороцетна киселина (5%) в дихлорметан и аминогрупа, депротонирана с диизопропилетиламин. При следващия етап Ddz-глицин се свързва върху валиновия остатък в полимерна матрица, като се използва диизопропилкарбодиимид (DIPC) в присъствие на 1-хидроксибензотриазол.

затор паладий върху активен въглен (10%) при 30°С, чрез продухване на водород и интензивно разклащане в продължение на 8 h.

След това катализаторът се отстранява чрез филтриране, а разтворът се изсушава чрез изпаряване на разтворителя под вакуум. Суровият пореден пептид допълнително се пречиства чрез ВЕТХ, като се използва методът, описан в пример 1. Полученият чист цикличен 10 пептид се идентифицира като пептид със Seq. Id. No.: 9.

Синтезът върху Hycram^R полимерен носител, като се използва Ddz стратегия и циклизирането, са илюстрирани на фиг. 4 и 5. Чистотата на всички синтезирани пептиди се проверява чрез ВЕТХ-метод, използвайки колона със силикагел RP-18 (октадецилсиланизиран), елуирани със смес от разтворители, състояща се от вода/ацетонитрил/трифлуороцетна киселина, обикновено в градиент. При всички случаи чистотата е над 95%.

Пептидите се характеризират чрез аминокиселинен анализ (стойностите са + -10% от теоретичните), секвенционен анализ, молекулно тегло чрез мас-определяне - FAB спектрометрия, ултравиолетови и инфрачервени спектри (фиг. 6 и 7).

Тъй като в настоящото изобретение са описани само някои варианти в специфични детайли, очевидно е за специалиста в областта, че много други специфични варианти могат да бъдат осъществени и могат да се извършат много промени, всички в духа на изобретението и на обхвата на прилежащите претенции.

Claims

Патентни претенции

1. Нов клас биологично високоактивни пептиди, характеризиращ се с това, че съдържа от 8 до 15 аминокиселинни остатъци, и който се представя с общата формула:

Тези стъпки се повтарят, докато се завърши пептидната верига. Синтезираната пептидна верига в защитена форма след това се отцепва внимателно от Hycram^R носителя с тетракис (трифенил-фосфино)-паладий (о), разтворен в анхидриден тетрахидрофуран, в отсъствие на кислород. Използва се добавка като морфолин, като молекулен акцептор за ацикличните групи.

Полимерният носител се филтрира и промива с тетрахидрофуран. Пептидният разтвор след това се филтрира през къса колона със силикагел за отстраняване на паладиевия катализатор.

Елуатът, който съдържа частично защи- 15 тения пептид 4а се изсушава след изпаряване на разтворителя под вакуум.

Синтез на линеен пептид със Seq. 1с 4.

Частично защитен пептид 4а се разтваря в
2,2,2 трифлуороетанол и се хидрогенира в 20 присъствие на активен въглен (10%) с газ водород при 30°С. Катализаторът се филтрира, а разтворителят се изпарява под вакуум. Суровият остатък след това се пречиства, като се използва ВЕТХ-метод, както е описан в при- 25 мер 1. След пречистване се получава пептид със Seq. Id. No.: 4. Продуктът е идентичен на съединението, получено в пример 1.

Синтез на цикличен пептид със Seq. Id.

No.: 9 30

Частично защитен пептид 4а се разтваря в диметилформамид/дихлорметан (1:1) до образуване на 0,001 mol разтвор. За циклизирането се прибавят DIPC и НОВТ и се оставят да престоят при 20°С в продължение на 10 h. 35 След това разтворът се концентрира до малък обем, разтваря се с 2,2,2 трифлуороетанол и се пречиства, като се пропуска през колона, заредена със Sephadex LH-20. Фракциите, съдържащи частично защитения цикличен пеп- 40 тид 9а, се събират и се хидрогенират с каталиХаа Zaa Pro Pro Pro Xaa Yaa Pro Ala Asp Zaa Ala Xaa Xaa Xaa 15 10 15 в която Xaa означава неутрален алифа- Zaa означава кисел аминокиселинен остен аминокиселинен остатък като: татък като:

Ala, bAla, Leu, He, Gly, Vai, Nle, Nva Glu, Asp, Aad или Apm;

Yaa означава базичен аминокиселинен 50 като поне един от остатъците Хаа или остатък като: Zaa може да се пропусне.

Lys, Arg, Om, His 2. Пептиди c обща формула съгласно претенция 1, характеризиращи се с това, че татъка в областта от 1-15-та аминокиселина поне един и най-много 7 аминокиселинни ос- са делетирани.
3. Пептид със Seq. Id. No.: 1 с формула:

Leu Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val 15 1015
4. Пептид със Seq. Id. No.: 2 c формула:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Asp Ala Gly Leu Val

1 5 1015
5. Пептид със Seq. Id. No.: 3 c формула:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Asp Ala Leu Gly Val

15 1015
6. Пептид със Seq. Id. No.: 4 c формула:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val 1 5 1014
7. Пептид със Seq. Id. No.: 5 c формула:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Lys Pro Ala Asp Ala Gly Leu Val 15 1014
8. Пептид със Seq. Id. No.: 6 c формула:

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala

1 58
9. Пептид със Seq. Id. No.: 7 c формула:

Asp Pro Pro Pro lie Arg Ala Asp

1 59
10. Пептид със Seq. Id. No.: 9 c формула:

Leu Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp Ala Leu Gly Val

I 2______________5 ______________1013 I
11. Пептид със Seq. Id. No.: 10 c формула:

Gly Glu Pro Pro Pro Gly Arg Pro Ala Asp

I ^{2 59}
12. Пептид със Seq. Id. No.: 8 c формула:

Glu Pro Pro Pro Leu Lys Pro Ala Asp

1 59
13. Терапевтичен състав, съдържащ едно или повече съединения, съгласно която и да е претенция от 1 до 11, в смес с фармацевтично приемлив твърд или течен вехикулум.
14. Използване на новите пептиди съг- 5 ласно претенции 1 до 11 за лечение на индуцирани от стрес смущения или болести, смущения и лезии на черния дроб и панкреаса, атрофия на тестисите и подвижността на спермата, смущения на плодовитостта, подобряване на стопанско отглеждане, рикециозни забо- лявания, тиреопаратиреоидоктомия, начало на диабет, смущения на надбъбречната жлеза, смущения на хематопоетичната система, смущения на коагулацията, смущения на кървенето, смущения вследствие на кастрация/менопауза, исхемични и токсични лезии, психиатрични смущения, хипертония, смущения на телесната температура, болки, тумори, депресия.