JPH07507568A

JPH07507568A - 有機保護活性を備えたペプチド

Info

Publication number: JPH07507568A
Application number: JP6511727A
Authority: JP
Inventors: シキリク　プレドラグ; ペテク　マリヤン; サイヴェルト　スヴェン; グラバレヴィク　ゼリコ; ロツクヴィク　イーヴォ; ドゥヴニャク　マルコ; トゥルコヴィク　ブランコ; ミーセ　ステパン; スチャネク　エルネスト; ミルドナー　ボリス; ウドヴィチク　イヴァン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-11-16
Filing date: 1993-11-16
Publication date: 1995-08-24
Anticipated expiration: 2013-10-22
Also published as: BG98907A; HU9303247D0; CA2127553A1; SK85794A3; JP2812803B2; GR3026478T3; DE69316974D1; RO115733B1; AU5624994A; EP0624164B1; RU94037232A; EP0624164A1; SI9300595B; CZ285155B6; CZ162294A3; ES2114170T3; RU2116311C1; ATE163131T1; SK279227B6; HUT66303A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ｌ」しり占土員＆数ジ４ヱーｉす１秒ｌ又仄制訂２世玉その使用法本発明は、公知の天然化合物ＢＰＣと同じタイプの高い生物学的活性を有しながらより短いアミノ酸連鎖を備えた新しいペプチドに関するものである。

発明の背景人又は動物の体から分離されＢＰＣ（ボディ・プロチクティング・コンパウンド）と名付けられた有機保護活性を備えた生物学的に活性なタンパク質は、ヨーロッパ特許第４３２４００号（ＥＰ０４３２４００）で開示され、公開もされている：Ｐ、シキリク他、Ｅ！ｐ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｇａ５Ｌｒｏｅｎｌｅｔｏｌ、１．１５〜２６．１９９１゜このタンパク質は、部分的にのみ限定された構造を備え、約４００００±５０００ダルトンの高分子量を有する。この化合物は、潰瘍保護の、肝臓保護の、抗ウイルス性の、抗浮腫性の、一般的な抗炎症性の活性、抗悪性腫瘍の活性等のような生物学的活性の非常に広いスペクトルを有する。これは、列挙された疾患の治療に、更には神経系の疾患及び障害の治療に、ドーパミン作用性の病因の障害、外科、口腔病学、生殖能力の治癒に、及び獣医学において使用される。しかしながら、活性のこの広いスペクトルはおそらく、限定されない構造の、或いは分離された化合物ＢＰＣの不十分な純度乃至均質性の結果であり得る。

３遭Ｖち欣松本発明の一面に従って、とりわけボディ保護の意味で、驚くほど高い生物学的活性を呈するクラスの合成ペプチドが提供される。

いずれにせよ、良好に定義された構造を備える当該合成化合物は、あいまいな天然源からの困難な手順によってのみ得られる部分的にのみ定義された高分子タンパク質ＢＰＣに比べて、大きな利点を有する。

より詳しくは、この発明は、８〜１５個のアミノ酸残基を含有した新しいクラスの生物学的に高い活性のあるペプチドに関するもので、当該残基は３文字のアミノ酸コードを用いた次の基礎的構造式によって表現される。なお、各アミノ酸残基の下の数字はペプチド連鎖での当該残基の位置に関連している：Ｘａａ、Ｚａａ　Ｐ「ｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｘａａ　Ｙａａ　ｒ’＋ｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｚａａ　Ａｌａ　Ｘａａ　Ｘａａ　Ｘａａ＋　５　１０　１５ここで、１以上のアミノ酸残基が置換される。使用されうる置換分Ｘａａ、Ｙａａ及びＺａａは次の表■に示される。

表１残基　置　換　分Ｘａａ　天然の脂肪族アミノ酸：Ａｌａ、ｂＡ、］ａ、Ｌｅｕ、Ｉ　Ｉｅ、Ｇａｙ、Ｖａ　ｌ、ＮＩｅ、ＮｖａＹａａ　塩基性アミノ酸。

Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、ＨｉｓＺａａ　酸性アミノ酸：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａａｄ、Ａｐｍ好適なペプチドは次のようになる。

違±」ん」焼つ。

Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｔｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌｌ　５　１０　１５と上」土」ヒ」− Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌｌ　５　１０　１５計玉」本コ暢」− Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｐｔ６　Ｐｒｏ　Ｐｔｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐ「ｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌｌ　５　１０　１５本発明の別の面に従って、上に記載された構造式を有しＣ末端でアミド乃至カルボキシ終端形状での類推ペプチド力１提供され、１〜１５の部位で少なくと１個、多くとも７個のアミノ酸残基力玉省かれ、残りのアミノ酸残基の少なくとも１個が表Ｉでの置換の概要に従い置換可能である。

好適なペプチドは次の通りである゛發土」土ゴ虹」− Ｌｃｕ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐ「ｏ　Ｐｒｏ　Ｌｃｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　八ｌａ　Ｌｃｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌｌ　５　１０　１４發山−劇ユ及区ユＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　ｆ’＋ｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａ！Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ八ｓへ　ｌ’＋ｏ　Ｉ’＋ｏ　Ｔ’ｒｏ　ｌｌｅ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　ＡｓｐＧｌｕ　Ｐｒｏ　Ｉ’ｒｏ　Ｉ’＋ｏ　Ｌｃｕ　Ｌｙｓ　Ｉ”ｒｏ　Ａｌａ　ＡｓＰ＋　５　９別の実施例に従って、上に記載された構造式を有し、アミノ酸残基の少なくとも１個が省かれ得、残ったアミノ酸残基の少なくどもＩｖＡが表■に指摘されたように置換され得るペプチドは、分子中の最初と最後のアミノ酸残基の間で新しい結合Ｃｏ−ＮＨの構成によって環式形状に変形される。好適なペプチドは次の通りＬｅｕ　Ｇｌｕ　ｒ’＋ｏ　Ｉ”＋ｏ　ｌ”ｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ｖａｌＳｅ　、Ｉｄ、Ｎｏ：　１０Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　ｒ’ｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｔｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ出願人は、上に記載したようなペプチドを用いる場合、そのようなペプチドが親タンパク質ＢＰＣのそれと等しいかそれより大きい生物学的活性を示すことを発見した。

既述されたペプチドの薬理学的調査は、「試験管内」及び「生体内」の異なる一般的モデルに基づき行われ、次の薬理学的特性が発見された：１、）肝臓と膵臓に関する保護効果Ｓｅｑ、　ｌｄ、　Ｎｏ、：　２．３．４．６で指定された新しい合成ペプチドの保護効果が、ラットの肝臓と膵臓のキズの異なった実験モデル、即ち、２４時間の胆管結紮、２４時間の胆管＋肝動脈結紮、４８時間の拘束ストレス、ＣＣＩ４施与において、参照基準（ブロモクリプチン（ｂｒｏｍｏｃ＋　ｉｐｔ　ｉｎ）、アマンタジン（ａｍａｎｔａｄｉｎｅ）、ソマトスタチン（ｓｏｍａｌｏｓｌａ＋１ｎ））と比較された。１０ｕｇ−１０ｎｇ／ｋｇ体重の範囲で、胃内にか又は腹膜を通してのいずれかで適用された使用ペプチドは、２４時間の胆管結紮、２４時間の胆管十肝動脈結紮、４８時間の拘束ストレス、ＣＣｌ４施与を受けた動物での肝臓と膵臓の壊死、並びに脂肪変化を著しく阻止する。ピッルピン、５ＧＯＴ、５ＧＰＴの生化学的値は、巨視的／微視的に言及されたデータに完全に則る。

２．）腎臓障害に関する効果ａ）一方だけの腎摘出実験において、１９０〜２５０ｇの両性のアルピノウィスタ一種のラットが用いられた。一方だけの腎摘出が行われ、結果として、残った腎臓の重量の増加が、対照標準においても、並びに手術の１時間前に１０μｇ／ｋｇ体重で腹膜を通して与えられたペプチドＳｅｑ、　ｌｄ、　Ｎｏ、２．３．４．６で処理されたグループにおいても認められた。ペプチドで処理されたグループにおいては、残った腎臓の隆起（ｒａｉｓｅ）の低下が一貫して認められた。

両方のグループでの生化学的パラメータが比較された。用いられた全てで、残った肝臓の機能が改善したようである。

ｂ）ゲンタマイシンの適用実験において、雌のアルピノウィスタ一種のラットが用いられた。３０日の期間の間、毎日１度４０ｍｇ／ｋｇの適用量で、ゲンタマイシンが適用されて、気管系の損傷が誘発された。動物の全てが最後の薬の適用から５日で犠牲となった。

著しい気管系の病変が対照標準のグループで認められ、一方で上記ペプチドで処理された全てのグループにおいて著しく低い微視的病変が一貫して見出された。

Ｃ）塩化水銀実験において、アルピノウィスタ一種のラットが用いられた。

塩化水銀価ｅｒｃｕｒｙ　（ｈｌｏｒｉｄｅ）が２　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重の適用量で静脈内に適用され、ペプチドＳｅｑ、　ｌｄ、　Ｎｏ、：　２．３．４．６が塩化水銀の適用の１時間前に２０μｇ／ｋｇの適用量で適用された。対照標準のデータと異なり、生化学的で微視的な結果が、上記ペプチドで処理されたグループにおいて保護効果を示した。

３、）車丸病変に関する影響車丸病変に関するペプチドＳｅｑ、　ｌｄ、　Ｎｏ、：　２．３．４．６の影響が、ケトコナゾール（ｋｅｊｏｃｏｎａｓｏｌ）の適用（胃内へ２４ｍｇＺｋｇ）、テストステロン（腹膜を通して３０　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ　）又は６グレイの照射によって調べられた。ペプチドＳｅｑ、　ｌｄ、　Ｎｏ、：　２．３．４．６は１時間前に与えられた。ペプチドＳｅｑ、　Ｉｄ、　Ｎｏ、：　２．３．４．６は保護効果を実証した。

４、）生殖能力／商業的繁殖ａ）ペプチドＳｅｑ、　ｌｄ、　Ｎｏ、２．３．４．６と生殖能力。精子障害（ｏｌｉｇｏａｓｔｈｅｎｏｓｐｅｒｍｉａ、精液中の精子数不足と精子の存続力の減少）に関する影響。調査は３０〜４０才の１０人の男性について、精子障害の診断によって行われた。これらの患者から、精液が３〜４日の禁欲後にとられた。液化の後（３０分）　、０．５ｍＱの精液が０．５ｍＱの媒体の層に加えられた。対照標準の媒体は、１０％の不活性化された弦状の漿液（ｃｈｏｒｄａｌ　ｓｅｒｕｍ）を有するＨＡＭ−ＦＩＯからなっている。実験の媒体は、追加的に２μｇ　／　ｍ　Ｑ乃至４μｇ　／　ｍ　ＱのＢＰＣを含有している。バーウェル型生殖室（Ｈｏｒｗｅｌｌ　Ｆｅ目１ｌｉ１ｙ　Ｃｈａｍｂｅｔ）中で、５％のＣＯｚを含有する大気中で３７℃で９０分間のトラベリゲタイム（Ｄａｖｅｌｉｎｇ　ｔｉｍｅ）の後、１ｍ（＋の精液中の進行する可動の、同じ場所で可動の及び静止した精子の数が測定された。予備的な結果は、低濃度の既述のペプチドの精子の運動性に関する影響を示していない。しかしながら、より高い濃度（４μｇ／ｍ（１）においては、対照標準に関して運動性のかなりの％が測定された。

ペプチドＳｅｑ、　ｌｄ、　Ｎｏ、２．３．４．６と再生プロセス既述のペプチドが３回の妊娠の前歴をもつマウスにおいて調べられた。最後の乳汁分泌の中止後２０日で、動物は交尾を受けた。

使用されたペプチドは、妊娠（１９〜２１日）と乳汁分泌（次の３週）の全期間中、日に一度、１０μｇ／ｋｇ体重の適用量で腹膜を通して与えられた。対照標準のグループは同時に等量の塩水を受けた。雌１匹当たりの子の数と子の体重とが記録された。

慎重な統計学的分析は、雌１匹当たりの子の著しく増加した数と、驚くべきことに、調べられた時間間隔のおのおのでの体重の間に違いがないこととを一貫して示した。全ての雌は、乳汁分泌の中止後の次の２５日間で回復することかできた。その後、５度目の妊娠に関する影響の調査のために再び交尾を受けた。

対照標準のグループに関して、乳汁分泌に対し増加した能力とともに増加した受精率が、既述のペプチドで処理された全ての処理グループにおいて記録された。

既述のペプチドがかなり古いマウスにおける生殖能力を改善できたことに言及されなければならない。結論として、それらの結果は、総合的で有益なペプチド能ノＪ、並びに人の精子を用いて得られた試験管でのデータに合致する。

Ｃ）商業的繁殖（全数４３０６匹のうち）１４１９匹の健康な豚が生後直ちに１０μｇのペプチドＳｅｑ、　Ｉｄ、　Ｎｏ、２．３．４．６を受け、別の１１４０匹は生後１３日口重去勢の１時間前に同じペプチドを受け、残りの１４７７匹が在来のＦｅ治療のみを受けた。打撲傷、えり分け、死亡率１体重及び食物消費が４週間後に査定された。

用いられたペプチドは、一旦適用され、（生後直ちにペプチドで処理されたグループにおいて）えり分は率と（ペプチドで処理された全てのグループにおいて）打撲傷率とを著しく減少する。同じ体重が、ペプチド処理され、食物消費も際立って低い動物において得られた。感染症に関する影響−生後２８日の大腸菌による全腸炎（Ｅ、　ｃｏｌｌｉ　ｅｎｌｅｒｏｃｏｌ目ｉｓ）にかかつている４０匹の離乳した豚が調べられた。用いられたペプチドは２０匹の動物（１０μｇ／ｋｇ体重で筋肉内に）に適用された。１ケ月後、死亡率の著しい低下がペプチド処理された動物に認められた。

別の試験において、最初の１週間後の死亡率が全数１２００匹の健康な豚において調べられた。４００匹の動物が在来のｆｅ治療に加えて、生後直ちに既述のペプチドを受けた。著しく低い死亡率が、既述のペプチドで（１ｅｎｇ／ｋｇ体重で筋肉内に）処理されたグループにおいて認められた。

５、）アンフェタミン作用に関する影響ペプチドＳｅｑ、　Ｉｄ、　Ｎｏ、：　２．３．４．６の影響が、アンフェタミンを適用する５分前か同時に腹膜を通して１０ｐｇ／ｋｇ乃至１０ｎｇ／ｋｇ体重の適用量において調べられた。既述のペプチドで処理されたグループにおいて、アンフェタミンで誘発された作用的障害が著しく減少することが認められた。

６、）出血時間ペプチドＳｅｑ、　Ｉｄ、　Ｎｏ、２．３．４．６の影響が、（出血の３時間前に１００ＯＵＩ／ｋｇで皮下に）ヘパリンを適用するものとしないものとでマウスとラットにおいて通常の出血検査（尻尾の切断又は切開）によって調べられた。調べられたペプチド（腹膜を通して１ｅｎｇ／ｋｇ乃至Ｌｏｎｇ／ｋｇ）は出血誘発と同時に適用された。調べられたペプチドで処理された全ての動物において、出血時間の著しい減少が認められた。

７、）去勢の重大性に関する影響Ａ１１ｅｎ−Ｄｏｉｓｙ法に従う修正された手順が行われた。種々の適用量が、前処理又は後処理として、１回の適用又は日に１度の摂生において、適用された（腹膜を通して１ｅｎｇ／ｋｇ乃至１０ｎｇ／ｋｇ）。調べられたペプチドで処理されたグループにおいて、異なる去勢の重大性（例えば、膣の上皮の萎縮、骨粗しよく症（ｏｓｔｅｏｐｏｔｏｓｉｓ）の予防又は転換が認められた。

８、）高血圧高血圧は、片側の腎動脈の閉塞によって誘発された。１０日後、動物は、各種の実験計画案（単独又は連続適用）を用いて、ペプチドＳｅｑ、　Ｉｄ、　Ｎｏ、２．３．４，６（腹膜を通して１０Ｐｇ／ｋｇ乃至１０　ｎ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重）か塩水で処理された。調べられたペプチドで処理されたグループにおいて、上昇した血圧値の著しい減少が観察された。

９、）実験に基づく真性糖尿病に関する影響１７５〜２３０ｇ体重のウィスターの雄のアルピノラットが、ストレプトシトシン又はアロキサンで誘発される真性糖尿病に用いられた。１０又は１００μｇ／ｋｇの適用量で適用されたペプチドＳｅｑ、　ｌｄ、　Ｎｏ、２．３．４．６は、ストレプトシトシンで処理された動物において、糖尿病の兆候をかなり遅らせる。更に、生存時間をかなり引き延ばした。

１０、甲状腺上皮小体切除に関する影響ウィスターラットにおける甲状腺上皮小体の総切除が行われた。

その後、異なる実験計画案（単独又は繰り返し処理）を用いて、ペプチドＳｅｑ、　ｌｄ、　Ｎｏ、２．３．４．６（腹膜を通してＬｏｎｇ／ｋｇ体重）か塩水（腹膜を通して５　ｍ　Ｑ　／　ｋ　ｇ体重）で処理された。調べられたペプチドで処理されたグループにおいて、腺切除の重大性がかなり減少した。

１１、）頚動脈の動脈結紮動物は両方の頚動脈の動脈結紮の後、３時間で犠牲になった。

１時間前に全ての動物はペプチドＳｅｑ、　ｌｄ、　Ｎｏ、２．３．４．６（腹膜を通して１０　ｎ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重）か塩水（腹膜を通して５ｍＱ　／　ｋ　ｇ体重）で処理された。調べられたペプチドで処理されたグループにおいて、脳浮腫が著しく低くなることが見出された。

１２、）副腎副腎の損傷誘発のために動物はアニリンを受けた（７日間に皮下に３００ｍｇ／ｋｇ）。全ての動物は、同時にペプチドＳｅｑ。

Ｉｄ、　Ｎｏ、　：　２．３．４．６（腹膜を通して１ｅｎｇ／ｋｇ体重、１０　ｎ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重）か塩水（腹膜を通して５　ｍ　Ｑ　／　ｋ　ｇ体重）で処理された。副腎の重さ及び微視的な変化が査定された。アニリン対照Ｉｎのグループに関して、調べられたペプチドは雨滴用量において副腎の重量のアニリン誘発された増加を著しく減少した。微視的な保護が投与量に依存した。アニリンで誘発された障害がＡ　ＣＴ　１−１分泌過多に関連があることが一般に受け入れられているので、調べられたペプチドとＡ　ＣＴ　Ｈとの間で因果関係を確立することが可能であった。これは、既述のベブーＦドで処理されたグループと実験を受けていない健康な対照標準のグループとで同じ重量であることが見出されたことによって支持されたようにも思われる。

加えて、動物は、調べられたペプチドで前処理された（腹膜を通して／胃内に１ｅｎｇ又は１０　ｎ　ｇ／ｋ　ｇ体重）後に、４８時間抑制ストレス手続きを受けた９調べられたペプチドで処理された動物における副腎の増加した重量の減少が、対応する微視的な観察と一致した。

１３、）温度障害体温の上昇が、酵母溶液の適用（皮下に４０００ｍｇ／ｋｇ）によって引き起こされ、温度低下が、温度４℃の冷水での浸漬を用いて又はレセルピン適用（腹膜を通して５ｍｇ／ｋｇ）で誘発された。温度上昇と低下の両方で調べられたペプチドＳｅｑ、　ｌｄ。

Ｎｏ、２．３．４．６（腹膜を通して１０ｎｇ／ｋｇ体重）の異なる摂生が、両方の温度障害を正常化するように一貫して実証された。

１４、）血液生成に関する影響アルピノ種のマウスに、ＬＤ５ｏの投与量で細胞成長抑止剤（エンドキサン、ビンクリスチン、アトリアブラスチン、サイトシンアラビシド（Ｃｙｌｏｓｉｎａｒａｂｉｎｏｓｉｄ））が注射された。細胞成長抑止剤を適用される１時間前に、動物は１ｅｎｇの投与量でペプチドＳｅｑ、　ｌｄ、　Ｎｏ、２．３．４．６で処理され、一方、対照標準が等量の塩水を受けた。動物は実験から３日、５日、７日及び１１日口重犠牲になった。血液中のパラメータ（Ｅ、Ｈｂ、Ｈｔｃ、Ｌ、Ｔｂａｂｓ、好中球数）、骨髄、肝臓と肺臓の細胞構造と組織構造が査定された。

実験から３日目に、Ｌ、Ｅ、Ｔｂ及び好中球値においてグループ間に違いは観察されなかったが、ペプチドで処理された動物の骨髄中の無傷の造血細胞とは異なって、対照標準では形成不全の差異が強く認められた。

好中球と白血球の数が、１１日目前まで正常化が観察されなかった対照標準とは異なって、ペプチドで処理された動物において５日目までに著しく増加し、７日目までに通常値に達した。

１５、）苦痛の減少苦痛は２％ＭｇＳＯ４又は０．６％酢酸の腹膜を通した適用（０，２ｍＱ／マウス）によって誘発された。適用の時間又は適用量に関するペプチドＳｅｑ、　Ｉｄ、　Ｎｏ、２．３．４．６の（腹膜を通して１０日ｇ又は１０　ｎ　ｇ　／　ｋ　ｇ、同時に又は３０分前に）各種摂生が、対照標準のグループに比べて悶え苦しむ時間をかなり減少する。

１６、）各種リケッチア属により誘発された感染症１０−９に溶解されたＱ熱病原体（Ｃｏｘｉｅｌｌｅ　ＢｕｒｎｅＬ＋ｉ）の懸濁液０．２ｍＱが適当な卵に注射された。当該卵に、ペプチドＳｅｑ。

Ｉｄ、Ｎｏ、２．３．４．６（ＩＩ）ｇ、１０日ｇ、１１００ｐ及びｌｎｇ）も注射された。生存時間は、対照標準に比べて、処理されたグループで著しく長くなった。

１７、）腫瘍細胞に関する影響ａ）２列の細胞系Ｌ−９２４と黒色腫Ｂ−１６が標準条件において試験管内で培養された。試験管内で、既述の細胞培養の成育に関するペプチドＳｅｑ、　ｌｄ、　Ｎｏ、２．３．４．６の影響が調べられた。細胞培養の開始から２日で、既述のペプチドが３％濃度（０゜１　ｍ　Ｑ　）で加えられた。３日後、培養光たりの細胞数が細胞計数器によって測定された。その結果は、Ｂ−１６黒色腫細胞での既述のペプチドの抑制効果を示した。

ｂ）エールリッヒ腹水腫瘍（Ｅｒｌｉｃｈ’ｓ　ａｓｃｉｔｅｓ　ｔｕｍｏｒ、　ＥＡＴ）は、腫瘍細胞の施与の方法に依って、腹水腫瘍か充実性腫瘍のいずれかとしてマウスの全ての血統において成長しうる腫瘍である。

マウスの生存時間に関して皮下に又は腹膜を通して注射されたペプチドＳｅｑ、　Ｉｄ、　Ｎｏ、　２．３．４．６でのＥＡＴ細胞の培養の影響が調べられた。

動物が４５日の間、観察された。ＮＭＲＩ血統の１５匹の雄のマウスの対照標準が０．４Ｘ１０６ＥＡＴ細胞を受けた。注射に先立ち、腫瘍細胞が塩水中において４℃で１時間培養された。注射量は０．２ｍＱであった。このグループでの中央生存時間は３６日で、３／１５だけが４５日生存した。

実験グループの１５匹のＮＭＲＩの雄のマウスが、同じ量で同じ投与量の腫瘍細胞を受けたが、これら細胞は予め既述のペプチド溶液（２μｇ／ｍＱ）中で培養された。僅かに２／１５のマウスが観察期間（４５日）の間に死亡し、残りの全ては４５日以上生存した。対照標準と実験のグループの間での差異は著しく異なった（Ｐ＜０．０１）。同じ手順を行いＥＡＴを（皮下への代わすに）腹膜を通して注射した場合にも同じ結果が観察された。

Ｃ）黒色腫又は悪性乳癌（ａｐｌａｓｌｉｃ　ｍａｍａｓ　ｃｅｒｃｉｍｏｍａ）細胞の注射により誘発された肺転移（ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）に関する（腹膜を通して１０μｇ／ｋｇ体重の投与量で与えられた）ペプチドＳｅｑ、　Ｉｄ。

Ｎｏ、２．３．４．６の影響の調査のためにマウスが用いられた。

ペプチドで処理されたグループにおいて、肺転移数の著しいの減少が測定された。

上記データに基づき、既述のペプチドが腫瘍を持つ動物の生存時間を引き延ばし、抗腫瘍活動を示したことを述べることができた。

１８、）抗抑僻活性抗抑ｊ活性の発現のために、ボーシルト等、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、、４７．３７９〜３９１頁（１９７８）に従う強制遊泳試験が用いられた。

雄のウィスターのラット（１８０〜２４０ｇ体重）が、この実験に用いられた。

調べられたペプチドＳｅｑ、　ｌｄ、　Ｎｏ：４が、既述の実験計画案に従って適用された。簡単に、対照標準の動物は食塩水を受け、査定は５分間で、動けない時間が計算された。対照標準での動けない時間は１５０秒であり、一方、ペプチドで処理された動物では僅かに６０〜７０秒の値が観察された。投与量レスポンスの曲線が次のようにして計算された。即ち、１０μｇ〜１０ｎｇ／ｋｇで充分な効果が、ｉｏｐｇ／ｋｇ体重で活性がなお存在し、ｌｐｇ／ｋｇで効果が存在しない。

これらペプチドの薬理学的調査の以下の結果は、ストレスと疾患に対して有機体を保護するための意味、一般的に有機機能を正常化するための意味において活性を示す。

それらペプチドの使用は、幾つかの人間又は動物の疾患と障害の予防と治療に効果的でもある。より詳しくは、これら化合物は次の処理に用いられよう。

一ストレスで誘発された障害と病気 −肝臓と膵臓の障害と病変一來丸萎縮と精子移動性一生殖能力の障害一商業的繁殖の改善一各種すケッチア属の病気一甲状腺上皮小体切除一貫性糖尿病一副腎の障害一血液生成系の障害一凝固作用の障害一出血の障害一去勢後の／閉経の障害一虚血及び毒性障害 −精神医学的障害 −高血圧一体温障害一苦痛一腫瘍一抑Ｖ症一般に、既述のペプチドは、充填剤、非毒性の緩衝剤又は生理的食塩水のような非毒性の薬剤キャリア又は媒介物と組み合わせて、かなり広範囲の薬剤構成物において用いることもできる。そのような薬剤構成物は局所的に又は全身的に用いることができ、液体、固体、半固体、注射可能な溶液、錠剤、軟膏、ローション、カプセル、舌下錠のようにどのような適当な形態でもよい。

これらペプチドは、一般に、全身的に適用される際に、体重の１０−５〜１０− ２ｍｇ／ｋｇの適用量で投与される。局所的に投与される際、それらはより高い濃度、例えば０．１％〜０．５％で用いられる。

非常に好ましいことに、５０　ｍ　ｇ　／　ｋ　ｇ体重の投与量まで何ら毒性の兆候がなく、経口投与（胃内へ）によって化合物の良好な活性もある。

ここに記載されたペプチドは、均質な液体系中での保護アミノ酸の段階的濃縮を用いること、また望ましくは固相法（ｓｏｌｉｄｐｈａｓｅ　ｍｅｔｈｏｄ）を用いることで合成することができる。環状ペプチドの調製のために、所望の長さの部分的に保護された線形ペプチドが、Ｃ末端でのアルキルエステル群とともに、そしてアジ化物に転化され、次いで結合され、保護されて調製される。選択的に、自由末端群を有した部分的に保護された線形ペプチドが、非常に薄い溶液中でジフェニルホスリルアジ化物によって環式化されうる。

本発明は次の例に関して記載されるが、本発明の範囲はそれによって限定されるものではない。

例　ＩＢｏｃ計画を用いるペプチド合成ペプチド合成は、Ｃ−末端カルボキシペプチドを作るために、Ｂｏｃ−Ｖａ　Ｉ −ＰＡＭ樹脂１００ｍｇで始められて行われた（応用バイオ系から購入されたＰＡＭ、置換物０．５６ｍｅｑ／ｇはアミノポリスチレンのアミノ−アシル−４− （オキシメチル）−フェニル酢酸誘導体である。）。Ｂｏｃアミノ酸（Ｂｏａ− ＝第三級ブトキシカルボニル基−）は、濃縮試薬としてジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）を用いて重合体キャリアにおいて次々と濃縮された。各段階において、Ｂｏａ群はジクロロメタン中でトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の５０％溶液で除去された。その後アミノ群はジイソプロピルエチルアミンで陽子を取り除かれた。

各段階での転化は９９．５％よりも高くなければならない。そうでない場合、濃縮は繰り返された。完全な合成後、開裂が低いＨＦ手続き（０℃で２時間）で行われた。カルボニウムイオン除去剤としてアニソールが用いられた。ＨＦは窒素の流れによって蒸発された。未処理の生ペプチドがその後、油性残基をドライエーテルに注ぐことによって得られた。

そして生ペプチドが、シリカゲルＲＰ−１８を充填した５×１５０ｍｍのコラム、溶媒系での傾斜溶出°水／アセトニトリルでの０．１％ＴＦＡを用いて逆相ＨＰ　Ｌ　Ｃで浄化された。検出。

２２５ｎｍでの紫外線吸収。Ｓｅｑ、　ｌｄ、　Ｎｏ：　４でのペプチドの合成は図１に示される。

例　２Ｆｍｏ　ｃ計画を用いるペプチド合成標準的なＦ　ｍ　ｏ　ｃ保護アミノ酸が合成に用いられた（Ｆｍｏｃ＝９−フルオレニルメチルオキ−カルボニル基−）。側鎖機能は〇−第三級ブチルエステル（Ａｓ　ｐ、Ａｐｍ、Ｇ　ｌ　ｕ、Ａａ　ｄ）として、及びＢｏｃ誘導体（Ｌ　ｙ　ｓ　）として保護された。第一アミノ酸（Ｖａｌ）は、カップリング試薬としてジイソプロピルカルボジイミドを用いて、重合体キャリアーＢＨＡ樹脂（ＢＨＡ−ベンゾヒドリルアミノ樹脂）に結合された。各段階で、Ｆ　ｍ　ｏ　ｃ保護群はピペリジンと共に除去された。その後、第二等、以降のすべてのアミノ酸は、合成が完了するまで、同じようにして導かれた。開裂はＴＦＡ／ＴＦＭＳＡ／アニソール−２：１７：５２（ｖｏｌ／ｖｏｌ　）の混合物によって行われた。

その後ペプチドは例１に記載されたＨＰＬＣ法を用いて浄化された。Ｓｅｑ、　Ｉｄ、　Ｎｏ：　２でのペプチドの合成は図２に示される。

例　３Ｄｄｚ計画を用いるペプチド合成すべてのアミノ酸が、Ｄｄｚ（＝α、αジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基−）によってそのαアミノ機能で保護され用いられた。副機能は２群（＝ベンジルオキシカルボニル基−）によってリジンが、０−ｔ−Ｂｕ群（ｔ−ブチルエステル）によってアスパラギン酸及びグルタミン酸が保護された。

１．４ｍｍｏｌ／ｇのキャパシティーを備えた（クロロメチル化されたポリスチレンゲルを架橋された）メリフィールド文体（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　５ｕｐｐｏ＋ドポリマー樹脂）が、そのセシウム塩を介して第−Ｄｄｚ−アミノ酸の結合に用いられた。ジシクロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）で濃縮後、Ｄｄｚ保護群は、ジクロロメタン中で５％ＴＦＡを用いた各段階で除去され、次いで洗浄され、ジクロロメタン中で１０％トリエチルアミンで陽子を取り除かれた。陽子除去後、次のカンブリング段階が、同じ方法を用いて引き継がれた。当該カップリング段階は、ペプチドシーケンスが完了するまで繰り返された。

最後にペプチドは、ＨＢｒ／ＴＦＡ／アニソール混合物を用いて重合体キャリアから開裂された。揮発性部分の蒸発後、丁度開裂されたペプチドはドライエーテルから沈澱され、乾燥された。

その後、生ペプチドは例１に記載されたようにＨＰＬＣ法によって浄化された。

Ｓｅｑ、　Ｉｄ、　Ｎｏ＋　６でのペプチドの合成は図３に示される。

例　４環式ペプチドの合成部分的に保護された形態でのペプチド：ＯＢｘ　ｌ　ＮＯ２０Ｂｘ　ＩＧｌｙ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐ＋ｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ａｌａ− Ａｓｐ−ＯＨは予め例１又は２に記載された方法に従って調製された。

ジメチルホルムアミド中のこのペプチドの０．０００５モル溶液は、ジフェニルホスホリルアジ化物及びトリエチルアミンを添加した後に２０℃、１２時間で環化された。

そしてこの混合物が、水素／パラジウム木炭触媒で２５℃、８時間水素化された。

溶媒は注意深く蒸発され、未処理の生成物は、例１に記載されたｌ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ法を用いて浄化された。

Ｓｅｑ、　ｌｄ、　Ｎｏ：　１０での環式ペプチドＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐ【ｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｕｇ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ１５１゜が１０％収率で得られた。

Ｄｄｚ計画を用いる線形及び環式ペプチドの合成群を保護するＤｄｚでの同じ計画が、線形及び環式ペプチドを得るのに用いられた。副機能は７群（リジン）で、及びＯ−ベンジルエステル群−〇Ｂｚｌ−（グルタミン酸及びアスパラギン酸）で保護された。重合体キャリアはＨＹＣＲＡＭＲ樹脂（ＯＲＰＥＧＥＮ社、ドイツ、ハイデルベルクの商標）で、これは４−ブロモクロトニル−β−アラニルアミドメチル−ポリスチレンである。第一アミノ酸（Ｄｄｚ−バリン）はそのセシウム塩を介して重合体キャリアに結合した。

その後Ｄｄｚ群はジクロロメタン中でトリフルオロ酢酸（５％）を用いて除去され、アミン群はジイソプロピルエチルアミンで陽子を取り除かれた。次の段階において、Ｄｄｚ−グリシンは、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの存在でジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）を用いて、ポリマーマトリックスのバリン残基に結合した。

これらの段階は、ペプチド連鎖が完了するまで繰り返された。

合成された保護形態でのペプチドは、その後酸素のない無水テトラヒドロ−フランに溶けたテトラキス（トリフェニル−ホスフィノ）−パラジウム（０）でｌ− ＩＹＣＲＡＭＲキャリアから注意深く開裂された。モルホリンのような添加剤がアリル群の受体分子として用いられた。

重合体キャリアが濾過され、テトラヒドロフランで洗浄された。

ペプチドの溶液がその後シリカゲルの短いコラムを通して濾過され、パラジウム触媒が除去された。

部分的に保護されたペプチド４ａを含有する溶出液が、真空での溶媒の蒸発後、乾燥された。

Ｓｅｑ、　ｌｄ、　Ｎｏ：　４での線形ペプチドの合成部分的に保護されたペプチド４ａが２．２．２トリフルオロエタノールに溶解され、木炭でのパラジウムの存在（１０％）において３０℃で水素ガスによって水素化された。触媒が濾過され、溶媒が真空で蒸発された。その後、未処理の残基は例１に記載されたようなＨＰ　Ｌ　Ｃ法を用いて浄化された。浄化後、Ｓｅｑ、　ｌｄ。

Ｎｏ：４でのペプチドが得られた。当該生成物は例１で得られた化合物と同じであった。

Ｓｅｑ、　Ｉｄ、　Ｎｏ：　９での環式ペプチドの合成部分的に保護されたペプチド４　ａは、ジメチルホルムアミド／ジクロロメタン（１：　１）に溶かされ、０．００１モル溶液が形成された。環化のために、ＤＩＰＣとＨＯＢ　ｔが加えられ、２０℃で１０時間おかれた。その後当該溶液は、濃縮され小さな容量となり、２．２．２トリフルオロエタノールで希釈され、５ｅｐｈａｄｅｘ　ＬＨ −２０で充填されたコラムを通すことで浄化された。部分的に保護された環式ペプチド９ａを含有する留分が集められ、８時間の水素バブリングと激しい攪拌によって３０℃で木炭でのパラジウム（１０％）触媒で水素化された。

その後、触媒が濾過によって除去され、溶液は真空での溶媒蒸発によって乾燥された。未処理の生ペプチドは、例１で記載された方法を用いてＨＰ　Ｌ　Ｃによって追加的に浄化された。得られた純環式ペプチドはＳｅｑ、　Ｉｄ、　Ｎｏ：　９でのペプチドと同じである。

Ｄ　ｄ　ｚ計画と環化を用いたＨＹＣＲＡＭ”重合体キャリアでの合成は、図４及び５に示された。合成されたペプチドの全ては、シリカゲルＲＰ−１８（オクタデシルシラン化された）のコラムを用いてＨＰＬＣ法によってその純度をチェックされ、通常の様式において水／アセトニトリル／トリフルオロ酢酸からなる溶媒の混合物で傾斜して溶出された。全ての場合において、純度は９５％以上であった。

ペプチドはアミノ酸分析（値は理論の±１０％以内であった）、連続分析、マスーＦＡＢ分光測定法で決定された分子量、紫外線及び赤外線スペクトルで特徴づけられた（図６及び７）。

我々の発明の成る実施例のみが特別詳細に記載されたが、所謂当業者にとって、多くの他の特有の実施例も実施でき、多くの変更もすべて、本発明の精神と書き添えられたクレームの範囲のうちで行いうろことも明らかである。

波　長　（ｎｍ）波　長　（ｎｍ）波　数 “　１ ■ す・　１フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３８１００　ＡＡＫＣＯ７Ｋ　７１０８　８３１８−４Ｈ１４／４３５　ＡＣ３８３１８−４ＨＩＡ６１Ｋ　３７１０２　ＡＤＰＡＨフロントページの続き（７１）出願人　ロックヴイク　イーヴオクロアチア　バーエル・４１０００　ザグレブクヴエツノ　ナセリエ　１／２１（７１）出願人　ドゥヴニャク　マルコフロアチア　バーエル・４１０００　ザグレブ、ローザ　ルクセンブルグ　４（７１）出願人　トウルコヴイク　ブランコクロアチア　バーエル・４１０００　ザグレブバウエロヴア　１９（７１）出願人　ミーセ　ステバンクロアチア　バーエル・５８０００　スプリトルズヴエルトーヴア　３７（７１）出願人　スチャネク　エルネストクロアチア　バーエル・４１０００　ザグレブアレヤ　ファウ　ポポヴイカ　１２５（７１）出願人　ミルトナー　ポリスクロアチア　バーエル・４１０００　ザグレブコペルニコヴア　あ（７１）出願人　ウドヴイチク　イヴアンスイス　ツェーハー・６３７０　シュタンスエンネトモーザーシュトラーセ　１６（７２）発明者　シキリク　プレドラグクロアチア　バーエル・４１０００　ザグレブユリシェヴア　５（７２）発明者　ペテク　マリャンクロアチア　バーエル・４１０００　ザグレブヴイスニカ　２９（７２）発明者　サイヴエルト　ステバンクロアチア　バーエル・４１０００　ザグレブパルモティチェヴア　１７（７２）発明者　グラバレヴイク　ゼリコクロアチア　バーエル・４１０００　ザグレブレルマノーヴア　１２アー（７２）発明者　ロックヴイク　イーヴオクロアチア　バーエル・４１０００　ザグレブクヴエツノ　ナセリエ　１／２１（７２）発明者　ドゥヴニャク　マルコフロアチア　バーエル・４１０００　ザグレブローザ　ルクセンブルグ　４（７２）発明者　トウルコヴイク　ブランコクロアチア　バーエル・４１０００　ザグレブバウエロヴア　１９（７２）発明者　ミーセ　ステバンクロアチア　バーエル・５８０００　スプリトルズヴエルトーヴア　３７（７２）発明者　スチャネク　エルネストクロアチア　バーエル・４１０００　ザグレブアレヤ　ファウ　ポポヴイカ　１２５（７２）発明者　ミルトナー　ポリスクロアチア　バーエル・４１０００　ザグレブコペルニコヴア　あ（７２）発明者　ウドヴイチク　イヴアンスイス　ツェーハー・６３７０　シュタンスエンネトモーザーシュトラーセ　１６

Claims

【特許請求の範囲】

１．）８〜１５個のアミノ酸残基を含み、これが一般式、【配列があります】で表され、ＸａａがＡｌａ、ｂＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｎｌｅ、Ｎｖａのような中性脂肪アミノ酸残基を意味し、ＹａａがＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｏｒｎ、Ｈｉｓのような塩基性アミノ酸残基を意味し、ＺａａがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ａａｄ又はＡＰｍのような酸性アミノ酸残基を意味し、残基Ｘａａ又はＺａａの少なくとも１つが省略可能であることを特徴とする新しいクラスの生物学的に高い活性のペプチド。
２．）分子が第１アミノ酸残基と最終アミノ酸残基との間のアミド結合によって環化される請求項１に従うペプチド。
３．）Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ：１の式、【配列があります】のペプチド。
４．）Ｓｅｇ．Ｉｄ．Ｎｏ：２の式、【配列があります】のペプチド。
５．）Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ：３の式、【配列があります】のペプチド。
６．）Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ：４の式、【配列があります】のペプチド。
７．）Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ：５の式、【配列があります】のペプチド。
８．）Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ：６の式、【配列があります】のペプチド。
９．）Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ：９の式、【配列があります】のペプチド。
１０．）Ｓｅｑ．Ｉｄ，Ｎｏ：１０の式、【配列があります】のペプチド。
１１．）Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ：１１の式、【配列があります】のペプチド。
１２．）薬事的に許容できる固体又は液体媒介物との混合剤における請求項１〜１１に従う一又は複数の化合物を含有する治療構成物。
１３．）ストレスで誘発された障害及び病気、肝臓及び膵臓の障害と病変、睾丸の萎縮と精子易動性、受胎能力障害、商業的繁殖改良、リケッチア属の病気、甲状腺上皮小体切除、真性糖尿病、副賢の障害、造血系の障害、凝固作用の障害、出血の障害、去勢後／閉経の障害、虚血及び毒性病変、精神医学的障害、高血圧症、体温の障害、苦痛、腫瘍、抑鬱症を処理するための請求項１〜１１に従う新規なペプチドの使用法。