JPH07138289A - 新規なペプチド - Google Patents
新規なペプチドInfo
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- JPH07138289A JPH07138289A JP5286859A JP28685993A JPH07138289A JP H07138289 A JPH07138289 A JP H07138289A JP 5286859 A JP5286859 A JP 5286859A JP 28685993 A JP28685993 A JP 28685993A JP H07138289 A JPH07138289 A JP H07138289A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 下記（Ｉ）式
【化１】Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａ
ｌ−Ａｌａ・・・（Ｉ） で表される神経栄養因子様活性を有する新規なペプチ
ド。 【効果】 本発明のペプチドは、老人性痴呆症、アルツ
ハイマ−痴呆症、脳神経障害等の脳神経機能疾病の治療
薬としての用途が期待される。
ｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａ
ｌ−Ａｌａ・・・（Ｉ） で表される神経栄養因子様活性を有する新規なペプチ
ド。 【効果】 本発明のペプチドは、老人性痴呆症、アルツ
ハイマ−痴呆症、脳神経障害等の脳神経機能疾病の治療
薬としての用途が期待される。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、神経栄養因子様の活性
を示す新規なペプチドに関するものである。
を示す新規なペプチドに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】脳は多くのニュ−ロンやグリア細胞から
構成され、これらが相互に作用して複雑な機能を発現・
維持している。このようなニュ−ロンの分化およびその
機能と生存維持に関わる重要な因子の一つに神経栄養因
子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ）と総称さ
れる蛋白性の因子がある。
構成され、これらが相互に作用して複雑な機能を発現・
維持している。このようなニュ−ロンの分化およびその
機能と生存維持に関わる重要な因子の一つに神経栄養因
子（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ）と総称さ
れる蛋白性の因子がある。
【０００３】近年、中枢神経系において、神経成長因子
（ＮＧＦ）やそのファミリ−を構成するいくつかの神経
栄養因子が発見されている（神経進歩，３４巻４号，５
１５〜５２３頁，１９９０年８月）。しかしながら、未
だそれらが作用するニュ−ロンは限られており、多種類
のニュ−ロンから構成される脳の機能を考慮するとき多
くの未知の因子が存在し作用していることが予想され
る。
（ＮＧＦ）やそのファミリ−を構成するいくつかの神経
栄養因子が発見されている（神経進歩，３４巻４号，５
１５〜５２３頁，１９９０年８月）。しかしながら、未
だそれらが作用するニュ−ロンは限られており、多種類
のニュ−ロンから構成される脳の機能を考慮するとき多
くの未知の因子が存在し作用していることが予想され
る。
【０００４】本発明者らは、先にこのような作用を持つ
新規なペプチドを提案し（特開平５−１０９８号公
報）、さらに新規な物質を提供すべく研究を進めた結
果、本発明を完成するに至った。
新規なペプチドを提案し（特開平５−１０９８号公
報）、さらに新規な物質を提供すべく研究を進めた結
果、本発明を完成するに至った。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、脳の機能発
現、維持およびその修復のメカニズムを明らかにするこ
とを目的とし、その一環として新しい神経栄養因子を探
索してその構造および生理的役割を解明し、さらに脳神
経疾患の治療用として期待される新規な物質を提供しよ
うとするものである。
現、維持およびその修復のメカニズムを明らかにするこ
とを目的とし、その一環として新しい神経栄養因子を探
索してその構造および生理的役割を解明し、さらに脳神
経疾患の治療用として期待される新規な物質を提供しよ
うとするものである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者等は上記の課題
を解決するため、ラット脳の損傷部位から得られたタン
パク質の部分ペプチドを合成して、強い神経栄養因子様
の活性を有する新規なペプチドを見いだし、本発明を完
成した。即ち本発明の要旨は、下記（Ｉ）式
を解決するため、ラット脳の損傷部位から得られたタン
パク質の部分ペプチドを合成して、強い神経栄養因子様
の活性を有する新規なペプチドを見いだし、本発明を完
成した。即ち本発明の要旨は、下記（Ｉ）式
【０００７】
【化２】Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａ
ｌ−Ａｌａ・・・（Ｉ） のアミノ酸配列で表されることを特徴とする新規なペプ
チドに存する。以下、本発明につき詳細に説明する。
ｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａ
ｌ−Ａｌａ・・・（Ｉ） のアミノ酸配列で表されることを特徴とする新規なペプ
チドに存する。以下、本発明につき詳細に説明する。
【０００８】本発明のペプチドは、上記（Ｉ）式の１３
個のアミノ酸からなるアミノ酸配列で表され、以下に述
べる方法により得ることが出来る。例えば、ペプチドの
合成に常用される固相法によるペプチド合成法により行
うことが出来る。なお、以下の説明で用いる記号は各々
次のものを示す。ＭＢＨＡ樹脂：ｐ−メチルベンツヒド
リルアミン樹脂；Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
基；Ｂｚｌ：ベンジル基；Ｃｌ−Ｚ：２−クロロベンジ
ルオキシカルボニル基；ｃＨｅｘ：シクロヘキシル基。
個のアミノ酸からなるアミノ酸配列で表され、以下に述
べる方法により得ることが出来る。例えば、ペプチドの
合成に常用される固相法によるペプチド合成法により行
うことが出来る。なお、以下の説明で用いる記号は各々
次のものを示す。ＭＢＨＡ樹脂：ｐ−メチルベンツヒド
リルアミン樹脂；Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
基；Ｂｚｌ：ベンジル基；Ｃｌ−Ｚ：２−クロロベンジ
ルオキシカルボニル基；ｃＨｅｘ：シクロヘキシル基。
【０００９】例えば、ＭＢＨＡ樹脂を自動ペプチド合成
機にセットし、これに予め製造されたＢｏｃ−Ａｓｐ
（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ
−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏ
Ｈ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｅ
ｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｏ
Ｈ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌ
ａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｏ
Ｈ、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを供給して順次縮合させる。
次いで、得られる側鎖が保護されているＨ−Ａｓｐ（Ｏ
ｃＨｅｘ）−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−Ｌｅｕ−
Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
（Ｃｌ−Ｚ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＭＢ
ＨＡ樹脂をフッ化水素と反応させてすべての側鎖保護基
を除去すると共に、ペプチドをＭＢＨＡ樹脂と切り離
す。
機にセットし、これに予め製造されたＢｏｃ−Ａｓｐ
（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ
−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏ
Ｈ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｅ
ｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｏ
Ｈ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌ
ａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｏ
Ｈ、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨを供給して順次縮合させる。
次いで、得られる側鎖が保護されているＨ−Ａｓｐ（Ｏ
ｃＨｅｘ）−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−Ｌｅｕ−
Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
（Ｃｌ−Ｚ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＭＢ
ＨＡ樹脂をフッ化水素と反応させてすべての側鎖保護基
を除去すると共に、ペプチドをＭＢＨＡ樹脂と切り離
す。
【００１０】本発明のペプチドは、後記実施例に具体的
に記載するように、極めて優れた神経栄養因子様活性を
示す。例えば、本発明のペプチド添加によるニュ−ロン
の生存維持作用を確認するために、生後ラットの中脳カ
テコ−ルアミンニュ−ロン（ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎ
ｅ ｎｅｕｒｏｎ）の初代培養系を用い、このカテコ−
ルアミンニュ−ロンを抗チロシン水酸化酵素（ｔｙｒｏ
ｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏ−ｘｙｌａｓｅ：ＴＨ）抗体で免
疫染色し、抗ＴＨ抗体陽性の細胞数を数える。その結果
から、多くのカテコ−ルアミンニュ−ロンが生存してい
ることが確認された。なお、カテコ−ルアミンニュ−ロ
ンはカテコ−ルアミンを神経伝達物質とするニュ−ロン
である。
に記載するように、極めて優れた神経栄養因子様活性を
示す。例えば、本発明のペプチド添加によるニュ−ロン
の生存維持作用を確認するために、生後ラットの中脳カ
テコ−ルアミンニュ−ロン（ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎ
ｅ ｎｅｕｒｏｎ）の初代培養系を用い、このカテコ−
ルアミンニュ−ロンを抗チロシン水酸化酵素（ｔｙｒｏ
ｓｉｎｅ ｈｙｄｒｏ−ｘｙｌａｓｅ：ＴＨ）抗体で免
疫染色し、抗ＴＨ抗体陽性の細胞数を数える。その結果
から、多くのカテコ−ルアミンニュ−ロンが生存してい
ることが確認された。なお、カテコ−ルアミンニュ−ロ
ンはカテコ−ルアミンを神経伝達物質とするニュ−ロン
である。
【００１１】また、本発明のペプチド添加によるニュ−
ロンの生存維持作用を、生後ラット脳の中隔野コリナ−
ジックニュ−ロン（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃｎｅｕｒｏ
ｎ）の初代培養系を用い、コリンアセチル基転移酵素
（以下、ＣｈＡＴと略記することがある）活性を指標と
して測定したところ、本発明のペプチドを添加しない場
合に比べて高い活性を示し、多くのコリナ−ジックニュ
−ロンが存在していることが確認された。なお、コリナ
−ジックニュ−ロンはアセチルコリンを神経伝達物質と
するニュ−ロンであり、ＣｈＡＴ活性はコリナ−ジック
ニュ−ロン固有のものである。
ロンの生存維持作用を、生後ラット脳の中隔野コリナ−
ジックニュ−ロン（ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃｎｅｕｒｏ
ｎ）の初代培養系を用い、コリンアセチル基転移酵素
（以下、ＣｈＡＴと略記することがある）活性を指標と
して測定したところ、本発明のペプチドを添加しない場
合に比べて高い活性を示し、多くのコリナ−ジックニュ
−ロンが存在していることが確認された。なお、コリナ
−ジックニュ−ロンはアセチルコリンを神経伝達物質と
するニュ−ロンであり、ＣｈＡＴ活性はコリナ−ジック
ニュ−ロン固有のものである。
【００１２】以上から明らかなように、本発明のペプチ
ドは優れた神経栄養因子様活性を有する。
ドは優れた神経栄養因子様活性を有する。
【００１３】
１）Ｈ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−Ａｌａ−Ａｓｐ（Ｏｃ
Ｈｅｘ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｌｅｕ−Ａｌ
ａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖ
ａｌ−Ａｌａ−ＭＢＨＡ樹脂の製造：ＭＢＨＡ樹脂
０．７９ｇ（アミン含量 ０．７６ｍｍｏｌ／ｇ樹脂）
をバイオサ−チ社製９５００型自動ペプチド合成機にセ
ットし、これにＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ、
Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）
−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢ
ｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌａ
−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ
−Ｚ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌａ
−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ
を供給して順次縮合させて、上記の側鎖保護ペプチド−
ＭＢＨＡ樹脂 １．７ｇを得た。
Ｈｅｘ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）−Ｌｅｕ−Ａｌ
ａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖ
ａｌ−Ａｌａ−ＭＢＨＡ樹脂の製造：ＭＢＨＡ樹脂
０．７９ｇ（アミン含量 ０．７６ｍｍｏｌ／ｇ樹脂）
をバイオサ−チ社製９５００型自動ペプチド合成機にセ
ットし、これにＢｏｃ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）−ＯＨ、
Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯｃＨｅｘ）
−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢ
ｚｌ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌａ
−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｃｌ
−Ｚ）−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌａ
−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、Ｂｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ
を供給して順次縮合させて、上記の側鎖保護ペプチド−
ＭＢＨＡ樹脂 １．７ｇを得た。
【００１４】２）フッ化水素処理：上記１）で得た側鎖
保護ペプチド−ＭＢＨＡ樹脂中の ０．８５ｇを採取
し、これを蛋白質研究奨励会ペプチド研究所製のフッ化
水素反応装置にセットし、１．３ｍｌのアニソ−ル、
０．２ｍｌのエチルメチルスルヒド、０．２ｍｌのエタ
ンジチオ−ルの存在下で８．５ｍｌのフッ化水素と、０
℃で１時間反応させた。反応終了後、フッ化水素を減圧
下留去し、残留物を酢酸エチルで洗浄した後、２Ｍ酢酸
２５０ｍｌで抽出処理して、Ｈ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＮＨ2 で表される
粗ペプチド２９５ｍｇを得た。
保護ペプチド−ＭＢＨＡ樹脂中の ０．８５ｇを採取
し、これを蛋白質研究奨励会ペプチド研究所製のフッ化
水素反応装置にセットし、１．３ｍｌのアニソ−ル、
０．２ｍｌのエチルメチルスルヒド、０．２ｍｌのエタ
ンジチオ−ルの存在下で８．５ｍｌのフッ化水素と、０
℃で１時間反応させた。反応終了後、フッ化水素を減圧
下留去し、残留物を酢酸エチルで洗浄した後、２Ｍ酢酸
２５０ｍｌで抽出処理して、Ｈ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＮＨ2 で表される
粗ペプチド２９５ｍｇを得た。
【００１５】３）ペプチドの精製：上記２）で得た粗ペ
プチドの全量を３０％酢酸４０ｍｌに溶解してセファデ
ックスＧ−２５のカラム（内径５ｃｍ、長さ１０７ｃ
ｍ）にかけ、同じ溶媒を用いて溶出して目的物を含む画
分を集めた。この部分精製物の収量は２０４ｍｇであっ
た。その中の１００ｍｇを１０ｍｌの水に溶解し、ＯＤ
Ｓ（オクタデシルシラン）をシリカに結合した逆相系の
カラム（内径２ｃｍ、長さ２５ｃｍ）を用いたＨＰＬＣ
により精製した。溶出は０．１％トリフルオロ酢酸中２
６％のアセトニトリルを用いて溶出し、ペプチドを含む
画分を集め最終目的物であるＨ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＮＨ2 で表される
ペプチド２２ｍｇを得た。
プチドの全量を３０％酢酸４０ｍｌに溶解してセファデ
ックスＧ−２５のカラム（内径５ｃｍ、長さ１０７ｃ
ｍ）にかけ、同じ溶媒を用いて溶出して目的物を含む画
分を集めた。この部分精製物の収量は２０４ｍｇであっ
た。その中の１００ｍｇを１０ｍｌの水に溶解し、ＯＤ
Ｓ（オクタデシルシラン）をシリカに結合した逆相系の
カラム（内径２ｃｍ、長さ２５ｃｍ）を用いたＨＰＬＣ
により精製した。溶出は０．１％トリフルオロ酢酸中２
６％のアセトニトリルを用いて溶出し、ペプチドを含む
画分を集め最終目的物であるＨ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓ
ｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ
−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ−ＮＨ2 で表される
ペプチド２２ｍｇを得た。
【００１６】本物質の構造は、ＦＡＢ−ＭＳおよびアミ
ノ酸分析等により確認された。ＦＡＢ−ＭＳ〔Ｍ＋Ｈ〕
+ １２８４、計算値（Ｃ56Ｈ97Ｎ15Ｏ19＋Ｈ）１２８
４、Ａｌａ５．００（５） Ｌｅｕ２．１７（２） Ｖ
ａｌ１．６２（２） Ａｓｐ２．１３（２） Ｇｌｕ
１．０２（１） Ｌｙｓ０．７０（１） 〔神経栄養因子様活性の測定〕上記の方法で得た、配列
表の配列番号１に記載のアミノ酸配列（（Ｉ）式）で表
されるペプチドの神経栄養因子様活性を以下の２つの方
法により測定した。
ノ酸分析等により確認された。ＦＡＢ−ＭＳ〔Ｍ＋Ｈ〕
+ １２８４、計算値（Ｃ56Ｈ97Ｎ15Ｏ19＋Ｈ）１２８
４、Ａｌａ５．００（５） Ｌｅｕ２．１７（２） Ｖ
ａｌ１．６２（２） Ａｓｐ２．１３（２） Ｇｌｕ
１．０２（１） Ｌｙｓ０．７０（１） 〔神経栄養因子様活性の測定〕上記の方法で得た、配列
表の配列番号１に記載のアミノ酸配列（（Ｉ）式）で表
されるペプチドの神経栄養因子様活性を以下の２つの方
法により測定した。
【００１７】１）中隔野を用いる方法 生後約２週間のラット脳の中隔野を用いた初代培養系を
使用して、次に述べる方法により、培養下のコリナ−ジ
ックニュ−ロンの生存の指標として、細胞抽出液のコリ
ンアセチル基転移酵素（ＣｈＡＴ）活性の変動を測定し
た。中隔野を実体顕微鏡下摘出してパパイン（プロテア
−ゼ）で消化し、これを５％の準胎児牛血清、５％の馬
血清、１％のラット血清および８９％のＤＦ（組織培
養）培地からなる培地上に約２×１０5 細胞／ｃｍ2 に
なるように播いて培養した。一日後この培地に、前記の
本発明のペプチドを、次の表１に示す量で各々別個に添
加して７日間培養したのち、０．１％トリトンＸ−１０
０（ノニオン界面活性剤）を含む５ｍＭのトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）を添加して細胞を破壊し、得られた
細胞抽出液のＣｈＡＴ活性をフォンナム（Ｆｏｎｎｕ
ｍ）法により測定した。なお、比較のために、本発明の
ペプチドを添加せず、血清のみを用いて培養し、同様に
処理して得た細胞抽出液のＣｈＡＴ活性を測定した。各
々のＣｈＡＴ活性は表１の通りであった。
使用して、次に述べる方法により、培養下のコリナ−ジ
ックニュ−ロンの生存の指標として、細胞抽出液のコリ
ンアセチル基転移酵素（ＣｈＡＴ）活性の変動を測定し
た。中隔野を実体顕微鏡下摘出してパパイン（プロテア
−ゼ）で消化し、これを５％の準胎児牛血清、５％の馬
血清、１％のラット血清および８９％のＤＦ（組織培
養）培地からなる培地上に約２×１０5 細胞／ｃｍ2 に
なるように播いて培養した。一日後この培地に、前記の
本発明のペプチドを、次の表１に示す量で各々別個に添
加して７日間培養したのち、０．１％トリトンＸ−１０
０（ノニオン界面活性剤）を含む５ｍＭのトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７．５）を添加して細胞を破壊し、得られた
細胞抽出液のＣｈＡＴ活性をフォンナム（Ｆｏｎｎｕ
ｍ）法により測定した。なお、比較のために、本発明の
ペプチドを添加せず、血清のみを用いて培養し、同様に
処理して得た細胞抽出液のＣｈＡＴ活性を測定した。各
々のＣｈＡＴ活性は表１の通りであった。
【００１８】
【表１】 ───────────────────────── ペプチドの添加量 ＣｈＡＴ活性 （ｎｇ／ｍｌ） （ピコモル／分／ウェル） ──────────────────────── ０．０ ０．４０ ０．５ ０．６７＊ １．０ ０．５９ ５．０ ０．７１＊ １０．０ ０．６３ ５０．０ ０．９３ ──────────────────────── ＊：ペプチド添加量 ０に比し、ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−
検定でｐ＜０．０５で有意差あり。
検定でｐ＜０．０５で有意差あり。
【００１９】なお、培養には４８ウェルプレ−ト（コス
タ−社製）を使用した。表１から明らかなように、本発
明のペプチドの存在下で培養した場合のＣｈＡＴ活性
は、本発明のペプチドの不在下で培養した場合に比べて
ほぼ用量依存的に増大し、より多くのコリナ−ジックニ
ュ−ロンが生存していることを示している。
タ−社製）を使用した。表１から明らかなように、本発
明のペプチドの存在下で培養した場合のＣｈＡＴ活性
は、本発明のペプチドの不在下で培養した場合に比べて
ほぼ用量依存的に増大し、より多くのコリナ−ジックニ
ュ−ロンが生存していることを示している。
【００２０】２）中脳を用いた測定 生後約２週間のラット脳の中脳下部を用いた初代培養系
を用い、次に述べる方法により培養下のカテコ−ルアミ
ンニュ−ロンの生存の指標として、培養ウェル中のド−
パミンニュ−ロンの数を抗チロシン水酸化酵素（ＴＨ）
抗体による染色で測定した。
を用い、次に述べる方法により培養下のカテコ−ルアミ
ンニュ−ロンの生存の指標として、培養ウェル中のド−
パミンニュ−ロンの数を抗チロシン水酸化酵素（ＴＨ）
抗体による染色で測定した。
【００２１】中脳下部を上記１）と同様にパパインで消
化し、次いで１）と同一の血清培地を用い、本発明のペ
プチドを次の表２に示す量で夫々別個に７日間培養し、
次いで細胞を４％パラホルムアルデヒドを含む生理塩リ
ン酸緩衝液（ＰＢＳ）で固定し、５％ヤギ血清及び０．
１％トリメンＸ−１００を含むＰＢＳで膜を透過させ、
モノクローナル抗チロシン水酸化酵素（ＴＨ）抗体と反
応させた。その後、パーオキシダーゼ結合抗マウスＩｇ
Ｇ抗体、パーオキシダーゼ結合パーオキシダーゼ抗体で
標識し、ジアミノベンチジンにより発色させ、染色され
た細胞数を測定した。なお、比較のために、本発明のペ
プチドを添加せず血清のみを用いて培養し、同様に処理
して得られた抗ＴＨ抗体陽性の細胞数を測定した。各々
の抗ＴＨ抗体陽性ニューロン数は表２に示す通りであ
る。
化し、次いで１）と同一の血清培地を用い、本発明のペ
プチドを次の表２に示す量で夫々別個に７日間培養し、
次いで細胞を４％パラホルムアルデヒドを含む生理塩リ
ン酸緩衝液（ＰＢＳ）で固定し、５％ヤギ血清及び０．
１％トリメンＸ−１００を含むＰＢＳで膜を透過させ、
モノクローナル抗チロシン水酸化酵素（ＴＨ）抗体と反
応させた。その後、パーオキシダーゼ結合抗マウスＩｇ
Ｇ抗体、パーオキシダーゼ結合パーオキシダーゼ抗体で
標識し、ジアミノベンチジンにより発色させ、染色され
た細胞数を測定した。なお、比較のために、本発明のペ
プチドを添加せず血清のみを用いて培養し、同様に処理
して得られた抗ＴＨ抗体陽性の細胞数を測定した。各々
の抗ＴＨ抗体陽性ニューロン数は表２に示す通りであ
る。
【００２２】
【表２】 ───────────────────────── ペプチドの添加量 抗ＴＨ抗体陽性ニュ−ロンの数 （ｎｇ／ｍｌ） （ニュ−ロン数／ウェル） ───────────────────────── ０．０ １５９．５ ０．５ １５０．５ １．０ １８４．５ ５．０ ２２１．０＊ １０．０ ２０９．０＊ ───────────────────────── ＊：ペプチド添加量 ０に比し、ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−
検定でｐ＜０．０５で有意差あり。
検定でｐ＜０．０５で有意差あり。
【００２３】表２から明らかなように、本発明のペプチ
ドの存在下で培養した場合の生存カテコ−ルアミンニュ
−ロン数（抗ＴＨ抗体陽性ニュ−ロン数）は、本発明の
ペプチドの不在下で培養した場合に比べて遙かに多かっ
た。
ドの存在下で培養した場合の生存カテコ−ルアミンニュ
−ロン数（抗ＴＨ抗体陽性ニュ−ロン数）は、本発明の
ペプチドの不在下で培養した場合に比べて遙かに多かっ
た。
【００２４】
【発明の効果】本発明の新規ペプチドは、以上に述べた
ように、コリナージックニューロンの生存維持に対し
て、ほぼ用量依存的に作用し、培養下のコリナージック
ニューロンのＣｈＡＴ活性を高いレベルに維持する。ま
た、カテコ−ルアミンニュ−ロンの生存維持に対しても
ほぼ用量依存的に作用し、培養下のカテコ−ルアミンニ
ュ−ロンのカテコ−ルアミン量を高いレベルに維持す
る。以上から、本発明の新規ペプチドは、例えば老人性
痴呆症、アルツハイマ−痴呆症、脳神経障害等の脳神経
機能疾病の治療薬としての用途が期待される。
ように、コリナージックニューロンの生存維持に対し
て、ほぼ用量依存的に作用し、培養下のコリナージック
ニューロンのＣｈＡＴ活性を高いレベルに維持する。ま
た、カテコ−ルアミンニュ−ロンの生存維持に対しても
ほぼ用量依存的に作用し、培養下のカテコ−ルアミンニ
ュ−ロンのカテコ−ルアミン量を高いレベルに維持す
る。以上から、本発明の新規ペプチドは、例えば老人性
痴呆症、アルツハイマ−痴呆症、脳神経障害等の脳神経
機能疾病の治療薬としての用途が期待される。
【００２５】
配列番号：１ 配列の長さ：１３ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Asp Ala Asp Leu Glu Leu Ala Val Lys Ala Ala Val Ala 13 1 5 10
Claims (1)
- 【請求項１】 下記（Ｉ）式 【化１】Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｅｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａ
ｌ−Ａｌａ・・・（Ｉ） のアミノ酸配列で表されることを特徴とするペプチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5286859A JPH07138289A (ja) | 1993-11-16 | 1993-11-16 | 新規なペプチド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5286859A JPH07138289A (ja) | 1993-11-16 | 1993-11-16 | 新規なペプチド |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07138289A true JPH07138289A (ja) | 1995-05-30 |
Family
ID=17709954
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5286859A Pending JPH07138289A (ja) | 1993-11-16 | 1993-11-16 | 新規なペプチド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07138289A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1169048A2 (en) * | 1998-07-06 | 2002-01-09 | Glenn D. Prestwich | Hyaluronic acid mimics and methods related thereto |
-
1993
- 1993-11-16 JP JP5286859A patent/JPH07138289A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1169048A2 (en) * | 1998-07-06 | 2002-01-09 | Glenn D. Prestwich | Hyaluronic acid mimics and methods related thereto |
| EP1169048A4 (en) * | 1998-07-06 | 2002-07-17 | Glenn D Prestwich | ANALOGS OF HYALURONIC ACID AND RELATED METHODS OF USE |
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