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Gebiet der
Erfindung
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Die
Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen zur Herstellung
von Medikamenten für
die Behandlung von durch Angiogenese vorgerufenen Erkrankungen mittels
Hemmung der Angiogenese.
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Hintergrund
der Erfindung
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Angiogenese
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Angiogenese
ist der Prozeß,
bei welchem neue Blutadern in einen Bereich hineinwachsen, dem eine ausreichende
Blutversorgung fehlt.
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Angiogenese
beginnt mit der Erosion der Fundamentalmembran, welche endotheliale
Zellen und Perizythen umgibt, die kapillare Blutadern bilden. Die
Erosion der Fundamentalmembran wird durch Enzyme ausgelöst, die
durch endotheliale Zellen und Leukozyten befreit werden. Danach
migrieren die endothelialen Zellen durch die erodierte Fundamentalmembran
sobald sie durch angiogenische Stimulanzien eingeführt werden.
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Die
migrierenden Zellen bilden einen Keim abseits der elterlichen Blutader.
Die migrierenden endothelialen Zellen wuchern und die Keime schließen sich
zur Bildung kapillarer Schlaufen zusammen und bilden auf diese Weise
eine neue Blutader.
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Angiogenese
kann unter bestimmten Normalbedingungen bei Säugetieren auftreten, wie z.B.
bei der Wundheilung, in der fetalen und embryonischen Entwicklung,
und bei der Bildung von corpus luteum, endometrium und der Plazenta.
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Angiogenese
tritt auch in bestimmten Krankheitsstadien wie bei der Tumorbildung
und Ausdehnung oder in der Retina von Patienten mit bestimmten Augenerkrankungen
auf. Angiogenese kann auch in rheumatischen Gelenken auftreten und
Gelenkzerstörungen
beschleunigen dadurch, daß das
Eindringen von Leukozyten mit nachfolgender Freilassung von entzündenden
Mitteln gestattet wird.
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Die
Offensichtlichkeit der Rolle von Angiogenese im Tumorwachstum wurde
ausführlich
betrachtet durch O'Reilly
und Folkmann, in US PS 5,639,725. Es wird jetzt allgemein akzeptiert,
daß das
Wachstum von Tumoren kritisch von diesem Vorgang abhängt.
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Kininogen
mit hohem Molekulargewicht
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Kininogen
mit hohem Molekulargewicht (HK) ist ein 120 kD Glykoprotein mit
schweren und leichten Ketten, zusammengesetzt aus dem Erbgut 1 bis
3 bzw. und 5 und 6. Diese Form von HK wird oft als „Einkettenkininogen
mit hohem Molekulargewicht" bezeichnet.
HK bindet sich mit hoher Affinität
an endotheliale Zellen, so es durch Plasmakallikrein in schwere
und leichte Ketten aufgespalten wird. Diese Form von gespaltenem
HK ist bekannt als „Zweikettenkininogen
mit hohem Molekulargewicht" (HK)a. Die schweren und leichten Ketten werden
durch Erbgut Nr. 4 zu intaktem HK verkettet.
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Erbgut
4 enthält
Bradykinin, ein potentes biologisches aktives Nonapeptid. Bradykinin
wird von HK durch die Spaltung befreit, die durch Plasmakallikrein
hervorgerufen wird (Kaplan et al., Blood 70: 1-15, 1987). Die schweren
und leichten Ketten, die aus der Elimination von Bradykinin entstehen,
verbleiben durch ein Disulfid verbunden, welches zwischen den Zysteinresiduen
auf den Positionen 10 und 596 gebondet ist. Die Umwandlung von HK
zu HKa wird von einer dramatischen strukturellen
Umwandlung begleitet. Die zentrale globulare Region von HK wird
nach der Befreiung von Bradykinin separiert und mit Zysteinprotease
hemmenden Bereichen gegenüber
dem Prekallikreinbindungsbereich neu geordnet (Weisel et al., J.
Biol. Chem. 262: 1405, 1987).
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Die
HK Leichtkette besteht aus der Folgesequenz von HK Aminosäuren 372-626
(SEQ ID NO: 1):
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Die
HK Leichtkette besteht aus HK Aminosäureserin – 372 bis Threonin 383 und
bildet den C-terminalen Bereich des HK Erbguts 4, welcher nach der
Bradykininbefreiung verbleibt; HK Aminosäurenvalin 384 bis Lysin 502
bilden das HK Erbgut 5 (D5); HK Aminosäurenthreonin 503 bis Serin
626 bilden das HK Erbgut 6 (D6). D5 ist reich an Hystidinen, Glycinen
und Lysinen und wurde für
die Beteiligung der Bindung an negativ geladenen Oberflächen vorausgesetzt.
D5 dient als zellenbindendes Mittel an Plättchen, Granulozyten und endothelialen
Zellen. Für
einen gegenwärtigen
Rückblick
einschließlich einer
Diskussion der Erbgutstruktur von HK und der funktionellen Signifikanz
verschiedener Erbgüter
(einschließlich
D5) siehe Colman und Schmaier, Blood 90: 3819 bis 3843 (1997). HKa wurde bei der Bindung des Urokinaserezeptors
(uPAR) auf endothelialen Zellen gezeigt (Colman et al., J. Clin.
Invest. 100: 1481-7 (1997). HK D5 wurde bei der Beteiligung zur
Zellenbindung nachgewiesen; für
bestimmte Peptide aus den Bereichen von D5 wurde herausgefunden,
daß sie
die HK Bindung an endotheliale Zellen verhindern (Hasan et al.,
J. Biol. Chem., 270: 19265 (1995).
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Entgegen
dieser Ergebnisse wurde keine Rolle für HK im Verfahren der Angiogenese
vorgeschlagen.
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JP 07 082172 A offenbart
Wundheilungsagenten, die Fragmente von Kininogen enthalten.
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JP 08 208692 A bezieht
sich auf Peptide, die Zelladhäsion
verhindern und aus Kininogen von hohem Molekulargewicht gewonnen
wurden.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Es
wird jetzt die Verwendung einer Verbindung mit der Formel X1 – (SEQ
ID Nr: 2) – X2 vorgesehen, wobei X1 0-25
Aminosäuren
aufweist, X2 von 0-60 Aminosäuren und
die Verbindung optional eine aminoterminale und/oder carboxiterminale
Schutzgruppe enthält,
für die
Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von durch Angiogenese
hervorgerufenen Erkrankungen mittels Hemmung der Angiogenese.
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In Übereinstimmung
mit einem Ausführungsbeispiel
der Erfindung weist X1 von 0-12 Aminosäuren, bevorzugt
von 0-6 Aminosäuren
auf; X2 weist von 0-45 Aminosäuren, und
besonders bevorzugt von 0-32 Aminsosäuren, besonders bevorzugt von
0-22 Aminosäuren,
und am meisten bevorzugt von 0-6 Aminosäuren auf.
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In
bestimmten bevorzugten Verbindungen zum Gebrauch bei der Erfindung
weist
X1
- (i) 0
Aminosäuren
oder
- (ii) das Segment
K H N L G H G H K H E R D Q G H G H Q
R G (SEQ ID Nr: 3) oder ein N-terminales Verstümmelungsfragment davon auf,
welches wenigstens eine Aminosäure
beinhaltet und
X2 ist - (i) 0 Aminosäuren
oder
- (ii) das Segment
G H K F K L D D D L E H Q G G H V L D
H G H K H K H G H G H G K H K N K G K K N G K H N G W K (SEQ ID
Nr: 4) oder ein C-terminales Verstümmelungsungsfragment davon
auf, welches wenigstens eine Aminosäure enthält.
SEQ ID Nr: 3
und Nr: 4 korrespondieren zu den jeweiligen HK Leichtkettenaminosäuren Lys(420)-Gly(440) und
Gly(456) – Lys
(502).
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Eine Übereinstimmung
mit einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung
weist X1 eine substantielle Aminosäurenhomologie
zur SEQ ID Nr: 3 auf und X2 hat eine wesentliche
Aminosäurenhomologie
zur SEQ ID Nr: 4.
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Beispielhafte
und bevorzugte Verbindungen zum Gebrauch in der vorliegenden Erfindung
beinhalten:
- (a) G H G L G H G H E Q Q H G L
G H (SEQ ID Nr: 9) korrespondierend zu den HK Leichtkettenaminosäuren Gly
(440) – His
(455);
- (b) K H N L G H G H K H E R D Q G H G H Q R G H G L G H G H
E Q Q H G L G H G H K F K L D D D L E H Q G G H V L D (SEQ ID Nr:
5), korrespondierend zu den Leichtkettenaminosäuren Lys (420) – Asp (474);
- (c) K H N L G H G H K H E R D Q G H G H Q R G H G L G H G H
E Q Q H G L G H G H K F K L D D D L E H Q G G H V L D H G H K H
K H G H G H G K H K N K G K K N G K H N G W K (SEQ ID Nr: 6); korrespondierend
zu den HK Leicht-Leichtkettenaminosäuren Lys
(420) – Lys
(502):
- (d) H G L G H G H E Q Q H G L G H G H K F K L D D D L E H Q
G G H V L D H G H K H K H G H G H G K H K N K G K K N G K H N G
W K (SEQ ID Nr: 7), korrepondierend zu den HK Leichtkettenaminosäuren His
(441) – Lys
(502); und
- (e) K H N L G H G H K H E R D Q G H G H Q R G H G L G H G H
E Q Q H G L G H G H K F K L D D D L E H Q G G H V L D H G H K H
K H G H G H G K H K N K G K K N G K H N G W K T E H L A S S S E
D S (SEQ ID Nr: 10); korrespondierend zu den HK Leichtkettenaminosäuren Lys
(420) – Ser
(513).
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Andere
Aspekte und Vorteile der Erfindung werden in der folgenden detaillierten
Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen beschrieben.
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Abkürzungen
und Kurzformen
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Die
folgenden Abkürzungen
und Kurzformen werden in der Beschreibung benutzt.
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„bFGF" bezeichnet den rekombinanten
menschlichen basisfibroblasten Wachstumsfaktor.
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„GST" bezeichnet Glutathion-S-Transferase.
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„HK" bezeichnet die reife
Form von Kininogen mit hohem Molekulargewicht und jedwede allelische
Variation davon. Durch „Reife" wird die nach der
Umsetzung modifizierte Form von HK bezeichnet, die aus der Spaltung
eines Anführers
von 18 Aminosäuren
aus dem ursprünglich
umgesetzten Molekül
resultiert. Alle Numerierungen in Bezug auf die Positionen der Aminosäuren von
HK ist aus dem N-Terminus der reifen Form als Position 1.
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„HK" ist so synonym mit „Einzelketten
HK", das bedeutet
die reife Form von Kininogen mit hohem Molekulargewicht vor der
Spaltung durch Kallikrein und die Bildung von Zweiketten Kininogen
mit hohem Molekulargewicht.
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„HKa" bedeutet
Zweiketten Kininogen mit hohem Molekulargewicht, das Produkt der
Spaltung durch Kallikrein von reifem Kininogen mit hohem Molekulargewicht
und jedweder allelischer Variationen davon.
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„HUVEC" bedeutet menschliche
endotheliale Zelle der Nabelvene
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„VEGF" bedeutet den Wachstumsfaktor
der vascularen endothelialen Zelle.
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Abkürzungen
der Aminosäuren
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Die
Nomenklatur die zur Beschreibung der polypeptiden Verbindungen zum
Gebrauch in der vorliegenden Erfindung benutzt wird folgt der konventionellen
Praxis, bei welcher die Aminogruppe auf der linken und die Karboxylgruppe
auf der rechten Seite jedes Aminosäurenresiduums präsentiert
ist. In den Formeln, die ausgewählte
spezifische Ausführungsbeispiele
der vorliegenden Erfindung darstellen, sind die Amino- und Karboxyterminalen
Gruppen, obwohl nicht im einzelnen gezeigt, so zu verstehen, wie
sie in der Form bei physiologischen pH-Werten angenommen würden, so lange es nicht anderweitig
spezifiziert ist. In den Aminosäurestrukturformeln
wird jedes Residuum generell repräsentiert durch eine einbuchstabige
oder dreibuchstabige Bestimmung, die mit dem üblichen Namen der Aminosäure in Übereinstimmung
mit folgendem Plan korrespondiert:
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Definitionen:
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Die
folgenden Definitionen der Ausdrücke,
die in der Beschreibung gebraucht werden, sind als eine Hilfe zum
Verständnis
des Schutzumfangs und der Praxis vorliegender Erfindung gedacht.
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„Angiogenese" bedeutet die Erzeugung
neuer Blutadern in einem Gewebe oder Organ.
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Ein „Peptid" ist eine Verbindung
bestehend aus Amino säureresiduen
die kovalent durch Peptidbonds verbunden sind.
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Der
Ausdruck „Aminosäure", wie er vorliegend
benutzt wird, beinhaltet sowohl natürliche als auch synthetische
Aminosäuren
und sowohl D als auch L Aminosäuren. „Natürliche Aminosäure" bedeutet jede der zwanzig
primären
natürlich
vorkommenden Aminosäuren,
die typischerweise Peptide, Polypeptide und Proteine bilden. „Synthetische
Aminosäure" bedeutet jede andere
Aminosäure,
unabhängig
ob sie synthetisch hergestellt oder aus einer natürlichen
Quelle hergestellt wurde. Nach dem vorliegenden Gebrauch umfaßt „synthetische
Aminosäure" ebenfalls chemisch
modifizierte Aminosäuren,
einschließlich
aber nicht begrenzt auf Salze, Derivative (solche wie Amide), und
Substituenten. Aminosäuren,
die in den Peptiden zur Verwendung in vorliegener Erfindung enthalten
sind und speziell am Karboxy- oder Aminoterminus können durch
Methylation, Amidation, Acetylation oder Substitution mit anderen
chemischen Gruppen modifiziert werden, die den zirkulierenden Halbwert
der Peptide ohne ungünstige
Beeinflussung von deren Aktivität
verändern
können.
Zusätzlich
kann eine Disulfidverbindung in den Peptiden zur Verwendung in der
Erfindung vorliegen oder abwesend sein, solange die antiangiogenische
Aktivität
aufrechterhalten wird.
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Aminosäuren haben
die folgende Allgemeinstruktur:
Aminosäuren werden in sieben Gruppen
auf der Basis der Seitenkette R klassifiziert: (1) aliphatische
Seitenketten, (2) Seitenketten, die eine Hydroxylgruppe (OH) enthalten,
(3) Seitenketten, die Schwefelatome enthalten, (4) Seitenketten,
die eine saure oder Aminogruppe enthalten, (5) Seitenketten, die
eine basische Gruppe enthalten, (6) Seitenketten, die einen aromatischen
Ring enthalten, und (7) Prolin, eine Iminsäure in der die Seitenkette
mit der Aminogruppe verschmolzen ist. Peptide, die eine große Anzahl
von Aminosäuren
enthalten, werden manchmal „Polypeptide" genannt. Die Aminosäuren der
Peptide, die vorliegend und in den anhängenden Ansprüchen beschrieben
werden, werden verstanden als entweder D oder L Aminosäuren oder
Mischungen daraus, wobei die L Aminosäuren bevorzugt werden.
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„Homologie" bedeutet Gleichheit
der Reihenfolge die einen gemeinsamen Entwicklungsursprung reflektiert.
Es wird gesagt, daß Peptide
oder Proteine Homologie oder Gleichheit besitzen, wenn eine wesentliche
Anzahl von deren Aminosäuren
entweder (1) identisch oder (2) eine chemisch übereinstimmende R Seitenkette
besitzen. Man sagt, Nukleinsäuren
haben Homologie, wenn eine wesentliche Anzahl von deren Nukleotiden
identisch sind.
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Vorliegend
bezieht sich „geschützt" in Bezug auf eine
terminale Aminogruppe eines Peptids, die mit irgendeiner von verschiedenen
aminoterminalen Schutzgruppen verbunden ist, die traditioneller
Weise in Peptidsynthese hergestellt wurden. Solche Schutzgruppen
beinhalten z.B. Acylschutzgruppen wie Formyl, Acetyl, Benzoyl, Trifluoracetyl,
Succinyl oder Methoxisuccinyl; aromatische Urethanschutzgruppen,
wie Benzyloxikarbonyl; und aliphatische Urethanschutzgruppen z.B.
Tert-Butoxylcarbonyl oder Adamantyloxycarbonyl. Siehe Gross und
Mienhofer, eds., The Peptids, vol. 3, pp. 3-88 (Akademische Presse,
New York, 1981) für
geeignete Schutzgruppen.
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Nach
vorliegendem Gebrauch bezieht sich „geschützt" auf eine terminate Karboxylgruppe eines
Peptids, die mit irgendeiner aus verschiedenen Karboxylterminalen
Schutzgruppen verbunden ist. Solche Schutzgruppen beinhalten z.B.
Tert-Butyl, Benzyl, oder andere annehmbare Gruppen, die an die terminale
Karboxylgruppe durch einen Ester- oder Ätherbond
angeschloßen
ist.
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„Substantielle
Aminosäurensequenzhomologie" bedeutet eine Aminosäurefrequenzhomologie,
die größer als
30%, bevorzugterweise größer als
60% noch bevorzugterweise größer als
80% und am meisten bevorzugt größer als
90% ist.
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Durch „N-terminales
Verstümmelungsfragment" wird in Bezug auf
eine Aminosäuresequenz
ein Fragment gemeint, welches auf einer Stammsequenz durch Entfernen
von einer oder mehreren Aminosäuren
von dem N-Terminus erhalten wird.
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Mit „C-terminalem
Verstümmelungsfragment" wird im Hinblick
auf eine Aminosäuresequenz
eine Fragment bezeichnet, welches aus einer Stammseguenz durch Entfernen
von einer oder mehreren Aminosäuren von
dem C-Terminus erhalten
wird.
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Kurze Beschreibung
der Figuren
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1A-1D zeigt
die Ergebnisse an der angiogenetischen Probe einer chorioalantoischen
Membram eines Huhns. Angebrütete
Hühnereier
wurden mit Salzlösung
(1A) behandelt, der rekombinante humane basisfibroblatische
Wachstumsfaktor (bFGF) (1B), bFGF
zuzüglich
Glutathion-S-Transferase (GST) (1C) oder
bFGF zuzüglich
dem GST-Fusionspeptid (GST)-SEQ ID-Nr: 10 (1D). Die
wesentliche Verhinderung der bFGF-veranlaßten Angiogenese durch GST-SEQ
ID-Nr: 10 ist in 1D offenkundig.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, daß Peptidanaloge
des HK-Erbguts 5 endotheliale Zellvermehrung verhindern. Diese Aktivität verleiht
den Erbgut 5 Peptiden die Fähigkeit,
zytokingesteuerte Anigiogenese in vivo zu verhindern. In Übereinstimmung
mit den hier verwendeten Proben verhindern die Peptide erheblich
die Vermehrung von humanen endothelialen Zellen in vitro als Antwort
auf den typischen endothelialen Zellenwachstumsfaktor bFGF.
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Endothelia
Zellen müssen
vor dem Durchdringen der Grundmembran migrieren. Migration von endetholialen
Zellen zu Vitronektin ist ein eng in Bezug zur Angiogenese stehender
Prozess. Die Peptide zum Gebrauch in vorliegender Erfindung verhindern
die Migration endothelialer Zellen zu Vitronektin.
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Weiterhin,
wie vorliegend gezeigt, sind die Peptide zum Gebrauch der Erfindung
in einem in vivo Modell der Angiogenese erfolgreich. Die Peptide
verhindern das Einwachsen neuer Blutadern in der choriolantoischen
Membran von intakten lebenden Hühnereiern,
die mit dem endothelialen Zellenwachstumsfaktor angeregt wurden.
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Die
reife humane HK Leichtkettenaminosäuresequenz wird im folgenden
als SEQ ID Nr: 1 bezeichnet. Strukturmäßig enthält Ergbut 5 die Aminosäuren 372
bis 502 aber das Segment 372 bis 419 kann ohne Präjudiz für die Funktion
des verbleibenden Bereichs entfernt werden. Das 372 bis 419 Segment
kann durch Kallikreinspaltung zwischen Arg(419) und Lys(420) entfernt
werden. Peptide, die das D5 Segment SEQ ID Nr: 2 und bestimmte andere
D5 Peptide ebenso enthalten, verhindern endotheliale Zellteilung
und sind nützlich
als antiangiogenische Hilfsstoffe.
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Die
D5-entstammenden Peptide zum Gebrauch in vorliegender Erfindung
können
rekombinante Peptide, natürliche
Peptide oder synthetische Peptide sein. Sie können chemisch synthetisiert
sein unter Verwendung von z.B. Festphasensyntheseverfahren.
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In
der herkömmlichen
Peptidsynthese kann die Peptidkette durch eine Serie von Kuppelreaktionen vorbereitet
sein, bei welcher die maßgeblichen
Aminosäuren
zu den wachsenden Peptidketten in der gewünschten Sequenz hinzugefügt werden.
Die Verwendung unterschiedlicher N-Schutzgruppen, z.B. die Karbobenzyloxygruppe
oder die T-Butyloxikarbonylgruppe, verschiedene Kuppelreagenzien
(z.B. Dizyclohexylkarbodiimide oder Karbonyldimidazole, verschiedene
Aktivester z.B. Ester der N-Hydroxyphthalimide oder N-Hydroxy-Succinimide
und die verschiedenen Spaltreagenzien, z.B. trifluoracetische Säure (TFA),
HCl in Dioxan, Bor-tris-(Trifluoracetat) und Zyanogenbromid und
Reaktion in Lösung
mit Isolation und Reinigung von Zwischenprodukten ist wohl bekannte
klassische Peptidmethodologie. Die bevorzugte Peptidsynthesemethode
folgt der herkömmlichen
Merrifield-Festphasen-Prozedur, siehe Merrifield, J. Amer. Chem.
Soc. 85: 2149-54(1963) und Science 50: 178-85 (1965). Zusätzliche
Information über
die Prozedur der Festphasensynthese erhält man in Bezug auf die Abhandlung
von Steward und Young (Festphasenpeptidsynthese, W.H. Freeman & Co., San Francisco,
1969 und das Übersichtskapitel
von Merrifield in Advances in Enzymology 32: 221-296, F.F. Nold,
Ed., Interscience Publishers, New York, 1969 und Erickson und Merrifield,
The Proteins 2: 255 et seq. (ed. Neurath und Hill), Akademic Press,
New York, 1976. Die Synthese von Peptiden durch Lösungsverfahren
ist in Neurath et al., eds (The Proteins, Volume II, 3d Ed., Academic
Press, NY(1976)) beschrieben.
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Rohe
Peptide können
unter Verwendung von präparativer
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
gereinigt werden. Der Aminoterminus kann in Übereinstimmung mit den Methoden,
wie sie durch Yang et al. (FEBS Lett. 272: 61-64 (1990)) beschrieben
sind, blockiert werden.
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Peptidsynthese
beinhaltet sowohl manuelle als automatisierte Techniken unter Verwendung
kommerziell erhältlicher
Peptidsynthetisierer. Die D5-abgeleiteten Peptide können durch
chemische Analyse vorbereitet werden und die biologische Aktivität kann durch
Verwendung der Methoden die hier offenbart sind, getestet werden.
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Alternativ
können
die D5-abgeleiteten Peptide vorbereitet werden und Verwendung rekombinanter DNA-Technologie,
die vorsieht, eine Nukleinsäure
zu kombinieren durch Chiffrierung von deren Peptiden in einem geeigneten
Vektor, Einsetzen des Ergebnisvektors in eine geeignete Gastzelle,
Wiedererlangung der durch die resultierenden Gastzelle produzierten
Peptide und Reinigung der erhaltenen Polypeptide. Die Techniken
der rekombinanten DNA-Technologie sind den Fachleuten bekannt. Allgemeine
Methoden zum Klonen und Ausdruck von rekombinanten Molekülen werden
in Maniaties (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories,
1982) und in Sambrook (Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratories,
sec. 1989) und in Ausubel (Current Protocols in Molecular Biology,
Wiley and Sons, 1987) beschrieben. Die vollständige cDNA humaner HK wird
z.B. berichtet durch Takagi et al., J. Biol. Chem. 260: 8601-8609
(1985). Aus dieser Nukleinsäuresequenz
können
synthetische Gene chiffrierter D5-abgeleiteter Peptide unmittelbar auf
einem DNA-Synthetisierer synthetisiert werden oder können als
komplementäre
Oligonukleotiden synthetisiert werden die zueinander zur Bildung
des synthetischen Gens verbunden sind.
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Die
Nukleinsäuren,
welche die D5 abgeleiteten Peptide chiffrieren, können operativ
an eine oder mehrere Regelbereiche gebunden werden. Regelbereiche
beinhalten Promotoren, Polyadenylationssignale, Übersetzungsinitialsignal (Kozakbereiche),
Unterbrechungscodone, Peptidspaltungsanlagen und Verstärker. Die verwendeten
Regelsequenzen müssen
innerhalb der Zellen der zu immunisierenden Wirbelsäule funktionell sein.
Die Auswahl geeigneter Regulationsbereiche oder der Bereiche ist
innerhalb des Ausbildungsstands üblicher
Fachleute Routine.
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Promotoren,
die in den Verbindungen zum Gebrauch der vorliegenden Erfindung
benutzt werden, beinhalten sowohl konstitutive Promotoren als auch
regulierte (inducible) Promotoren. Die Promotoren können abhängig von
dem gastrokaryotisch oder eukaryotisch sein. Innerhalb der prokaryotischen
(einschließlich
der bakteriophagen) Promotoren sind im Rahmen der Praxis vorliegender
Erfindung geeignet lacl, lacZ, T3, T7, lambda Pr' Pl' und
trp Promotoren. Unter den eukaryotischen (die viralen einschließend) Promotoren
sind nützlich
für die
Praxis vorliegender Erfindung die ubiquitösen Promotoren (d. h. HPRT,
Vimentin, Actin, Tubulin), intermediäre Filamentpromotoren (d.h.
Desmin, Neurofilamente, Keratin, GFAP), therapeutische Gen-Promotoren
(d.h. MDR Typ, CFTR, Faktor VIII), gewebsspezifische Promotoren
(d.h. Actin-Promotoren
in weichen Muskelzellen), Promotoren in Antwort auf einen Stimulus
(d.h. Steroidhormonrezeptor, Retinoinsäurerezeptor), Tetracyclin regulierte
transscriptionale Modulatoren, Cytomegalovirus unmittelbar frühzeitig,
retrovirale LTR, Metallothionein, SV-40, E1a und MLP Promotoren.
Tetracyclin regulierte transscriptionale Modulatoren und CMV-Promotoren sind in
WO 96/01313,
US 5,168,062 und
5,385,839 beschrieben.
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Beispiele
von Polyadenylationsignalen, die in den Mischungen zum Gebrauch
der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, beinhalten aber sind
nicht begrenzt auf, SV-40 Polyadenylationsignale und LTR Polyadenylationsignale.
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Die
Peptide zum Gebrauch in vorliegender Erfindung können als Glutathion-S-Transferase
(GST) Fusionsproteine in Übereinstimmung
mit den Verfahren von Kanapuli et al., J. Biol. Chem. 268: 2486-2492
(1993) vorbereitet werden. Die Fusionsproteine werden erzeugt durch
Zerstörung
der Mutagenese unter Verwendung von Plasmid pSK931, dessen Herleitung
durch Kanapuli et al. beschrieben wird. Plasmid pSK931 wurde erzeugt
und beschrieben durch Kanapuli et al. durch Erzeugung von Plasmid
pHKG6 von Takagaki et al., J. Biol. Chem. 260: 8601-8690 (1985).
Plasmide, die zum Ausdruck der gewünschten Fragmente von HK Leichtketten befähigt sind,
werden durch Digestion von pSK931 mit einer Kombination von Restriktionsenzymen
und Relegation des Plasmids mit oligonucleotiden Verbindern konstruiert
um den Leserahmen zu erhalten. Die rekombinanten Proteine werden
dann durch Glutathion-Sepaharose Affinitätschromatographie gereinigt
mittels Entzug von gebundenem rekombinantem Protein mit Glutathion.
Die rekombinanten Proteine enthalten GST an ihrem N-Terminus.
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Die
D5 abgeleiteten Peptide, die entweder durch chemische Synthese oder
rekombinante DNA-Technologie vorbe reitet wurden, können dann
auf biologische Aktivität
geprüft
werden in Übereinstimmung
mit den Überprüfungsmethoden
wie vorliegend beschrieben.
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In
einigen Ausführungsbeispielen
können
die Peptide der vorliegenden Erfindung in Form von pharmazeutisch
annehmbarem Salzen verwendet werden.
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Geeignete
Säuren,
die befähigt
sind zur Bildung von Salzen mit den Peptiden beinhalten anorganische Säuren wie
Salzsäure,
Bromsäure,
Hydrochlorsäure,
Salpetersäure,
Thiocyansäure,
Schwefelsäure,
Phosphorsäure
und ähnliches;
sowie organische Säuren
wie Ameisensäure,
Essigsäure,
Propionsäure,
Glycolsäure,
Milchsäure,
Pyruvicsäure,
Oxalsäure,
Malonsäure,
Succinsäure,
Maleinsäure,
Fumarinsäure,
Anthranilsäure,
Cinnamsäure,
Naphtalen Schwefelsäure,
Sulfanilsäure
und ähnliches.
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Geeignete
Laugen die befähigt
sind zur Bildung von Salzen mit den Peptiden, beinhalten anorganische
Laugen wie Natriumhydroxid, Ammoniumhydroxid, Kaliumhydroxid und ähnliches;
sowie organische Laugen wie Mono-Di- und Tri-Alkyl und Arylamine
(d.h. Triethylamin, Diisopropylamin, Methylamin, Dimethylamin und ähnliches)
und wahlweise ergänzte
Methanolamine (d.h. Ethanolamin, Diethanolamin und ähnliches).
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Medikamente zum Verhindern von Angiogenese.
Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel
ist ein Medikament zum Verhindern der Wucherung von Endothelialzellen.
Damit übereinstimmend
können
ein oder mehrere D5 abgeleitete Peptide zur Verwendung in vorliegender
Erfindung einem Patienten bei Bedarf derartiger Behandlung verabreicht
werden. Eine therapeutisch wirksame Menge des Medikaments kann als
eine Zusammensetzung in Kombination mit einem pharmazeutischen Trägerstoff
verabreicht werden.
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Pharmazeutisch
akzeptable Träger
beeinhalten physiologisch ertragbare oder akzeptable Verdünnungsmittel,
Excipientmittel, Lösungsmittel,
Hilfsmittel oder Transportmittel zur parenteralen Injektion, zur
intranasalen oder sublingualen Verabreichung, für orale Verabreichung, für rektale
oder örtliche
Verabreichung oder ähnliches.
Die Zusammensetzungen sind bevorzugterweise steril und nicht pyrogen.
Beispiele geeigneter Trägerstoffe
beinhalten, sind aber nicht limitiert darauf, Wasser, Salzlösung, Dextrose,
Mannitol, Lactose oder andere Zucker, Lecithin, Albumin, Natriumglutamat,
Cysteinhydrochlorid, Ethanol, Polyole (Propylenglycol, Polyethylenglycol,
Glycerol und ähnliches),
Pflanzenöle
(zum Beispiel Olivenöl),
injizierbare organische Ester wie Ehtyloleat, ethoxylierte Isosterarylalkohole,
Polyoxyetheylensorbitol und sorbische Ester, mikrocristalline Zellulose,
Aluminiummethahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragantgummi, oder
Mischungen aus diesen Substanzen, oder ähnliches.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen können ebenfalls geringe Mengen
nicht toxischer Hilfssubstanzen wie Befeuchtungsmittel, Emulsierungsmittel,
pH-puffernde Mittel, antibakterielle und antifungide Mittel (wie
zum Beispiel Paraben, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure und ähnliches)
enthalten. Falls Bedarf vorhanden können absorptionsfördernde
oder verzögernde
Mittel verwendet werden (wie Liposome, Aluminium Monostearat oder
Gelatine). Die Zusammensetzungen können in herkömmlichen
Formen entweder in flüssigen
Lösungen
oder Suspensionen, festen Formen die geeignet sind zur Lösung oder
Suspension in Flüssigkeiten
oder Injektion oder als Emulsionen vorbereitet werden.
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Die
Zusammensetzungen können über jeglichen
geeigneten Weg verabreicht werden der in der Versorgung der Stelle
der ungewünschten
Angiogenese resultiert in einer Menge, welche die Angiogenese am Wachstum
effektiv hindert. Arten der Verabreichung beeinhalten beispielsweise
die orale, rektale, parenterale (intravenöse, intramuskuläre, intraarterielle
oder subcutane) intracisternale, intravaginale, intraperitonale, örtliche
(Puder, Salben oder Drops), oder als ein buccales oder nasales Spray
oder Aerosol. Die Mischungen können
ebenso durch einen Katheder zur lokalen Versorgung an der Zielstelle
verabreicht werden oder über
ein abbaubares Polymer. Die Mischungen können ebenso an Liganten oder
Antikörpern
komplext werden zur zielgerichteten Verteilung der Mischungen.
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Die
Mischungen werden am effektivsten parenteral verabreicht, bevorzugt
intravenös
oder subcutan. Zur intravenösen
Verabreichung können
sie in jedem geeigneten intravenösen
Verteilungsmittel gelöst
werden, welches physiologisch kompatible Substanzen wie Natriumchlorid,
Glycin und ähnliches
beinhaltet mit einem gepufferten pH der mit physiologischen Bedingungen
kompatibel ist. Derartige intravenöse Verteilungsmittel sind dem
Fachmann bekannt. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das Transportmittel
eine sterile Salzlösung.
Wenn die Peptide hinreichend klein sind (d.h., weniger als ungefähr 8 – 10 Aminosäuren) sind
andere bevorzugte Verabreichungswege intranasal, sublingual und ähnliches.
Intravenöse
oder subcutane Verabreichung kann, zum Beispiel, Injektion oder
Infusion beinhalten.
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Die
vorbereiteten Zusammensetzungen in Übereinstimmung mit der Erfindung
können
unter jeglichen Umständen
verabreicht werden, unter denen die Verhinderung von Angiogenese
gewünscht
ist. Krankheitsstadien die behandelt werden können, beinhalten ohne Beschränkung Krebs,
rheumatische Arthritis und bestimmte Augenerkrankungen die durch
ungewünschte
Vascularisation der Retina gekennzeichnet sind. Weil die Peptide
der Erfindung antiangiogenisch sind, können Krebsarten, die gekennzeichnet
sind durch das Wachstum von Festtumoren durch Angiogenese des Gewebes,
welches die Tumorstelle umgibt, in Übereinstimmung mit der Erfindung
behandelt werden. Andere angiogenetisch verursachte Krankheiten,
die behandelt werden können,
schließen
die angiogenetisch verursachten Krankheiten ein, die in US PS 5,733,876
in Spalte 10, Zeilen 2-19 gelistet sind.
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Die
Menge des verabreichten Aktivmittels hängt vom Grad des gewünschten
antiangionetischen Effekt ab. Der Fachmann wird geeignete Dosierungen
und Verabreichungspläne
an die spezifischen Umstände
und den Bedarf des Patienten anpassen. Typischerweise betragen Dosierungen
zwischen 0,1 bis ungefähr
100, bevorzugt zwischen ungefähr
0,5 bis ungefähr
50, besonders bevorzugt von ungefähr 1 bis 20 mg/kg Körpergewicht.
Das Aktivmittel kann durch tägliche
Injektion verabreicht werden, während
einer Therapie die zwei bis drei Wochen z.B. dauert. Alternativ
kann das Hilfsmittel durch kontinuierliche Infusion verabreicht
werden, wie zum Beispiel über
eine implantierte subcutane Pumpe.
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Intravenöse oder
subcutane Verabreichung wird bevorzugt. Das Aktivmittel kann durch
kontinuierliche intravenöse
Infusion über
eine Zeit von 4-5 Tagen zum Beispiel gegeben werden. Für subcutane
Verabreichung kann das Mittel über
12 Stunden zum Beispiel mit einer Dosiereinstellung verabreicht
werden, die auf pharmakokinetischen Studien beruht.
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Peptide,
welche die Endothelialzellenwucherung zu mindestens 60%, bevorzugterweise
mindestens 90% und besonders bevorzugt zu 100% verhindern, wenn
sie in solche Zellen mit einer Konzentration von 0,27 μM sind, werden
bevorzugt. Peptide die Endothelialzellenwucherung mit einem IC50 von nicht weniger als ungefähr 0,1 μM verhindern,
bevorzugterweise nicht mehr als ungefähr 0,01 werden im einzelnen
bevorzugt. Zum Zwecke dieser Präferenz
werden die prozentuale Verhinderung der Zellwucherung und IC50 in Bezug auf die Prüfmethoden, die im unten stehendem
Beispiel 1 genannt sind, unterschieden.
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Die
vorliegende Erfindung wird durch die folgenden nicht beschränkenden
Beispiele näher
erläutert.
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Beispiel 1
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Effekt von
Kininogenpeptiden hohen Molekulargewichts an Endothelialzellenwucherung
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Die
folgenden HK Leichtkettenpeptide wurden als Glutathion-S-Transferase
(GST) Fusionsproteine in Übereinstimmung
mit dem Verfahren von Kanapuli et al., J. Biol. Chem. 268: 2486-2492
(1993) vorbereitet:
GST-Lys(420)-Ser(513) (GST-SEQ ID Nr: 10)
GST-Lys(420)-Asp(474)
(GST-SEQ ID Nr: 5)
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Die
folgenden HK Erbgut 5 Peptide wurden chemisch synthetisiert:
Gly(440)-His(455)
(SEQ ID Nr: 9)
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SEQ
ID Nr: 5, 9 und 10 sind im wesentlichen innerhalb HK Erbgut 5 enthalten.
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Die
Fusionsproteine wurden durch mutagenetische Vernichtung unter Verwendung
von Plasmid pSK 931 erzeugt. Plasmid pSK 931 wurde wie beschrieben
durch Kanapuli et al. erzeugt durch Herstellung von Plasmid pHKG6
von Takagaki et. al., J. Biol. Chem. 260: 8601-8690 (1985). Plasmide
die zum Ausdruck der gewünschten
Fragmente der HK leichtkettenfähig
sind, wurden durch Digestion von pSK931 mit einer Kombination aus
Restriktionsenzymen und Relegieren des Plasmids mit oligonucleotiden
Verbindungsstoffen zum Zwecke des Erhalts des Leserahmens konstruiert.
Die rekombinanten Proteine werden dann durch Gluthathion-Sepharose
Affinitätschromatographie
gereinigt unter Auswaschen des gebundenen rekombinanten Proteins
mit Glutathion.
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Zellteilung
wurde bestimmt unter Verwendung einer CyQUANT-Zellteilungsprüfungsausrüstung von Molekularproben
(Katalog # C-7026). Grundlage für
die CyQUANT-Prüfung
ist die Verwendung einer geeigneten grünfluoreszenten Farbe (CyQUANT
GR Farbe) welche bei der Bindung an zellulare Nukleinsäuren eine starke
fluoreszente Verstärkung
zeigt.
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HUVEC-Zellen
(50,000/Quelle) in einer 96 Quellmicrotiterplatte wurden mit 10
ng/ml bFGF in serumfreiem M199 Wachstumsmittel mit oder ohne HK
Peptid für
48 Stunden bei 37°C
in einem CO2 Inkubator angeregt. Die Zellen
wurden mit serumfreiem Medium gewaschen und bei –40°C gefroren. Gefrorene Zellen
wurden aufgetaut und lysiert mit einem Lysepuffer der die CyQUANT
GR Farbe enthält.
Fluoreszenz wurde unter Verwendung von einem Cytofluor II Fluoreszenz
Mehrquellenplattenleser mit Erregung bei 485 nm und Emission mit
530 nm gemessen.
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Die
prozentuale Verhinderung von Wachstum bei einer bestimmten Peptidkonzentration
wurde für
einige Peptide festgestellt. Für
andere Peptide wurde ein IC50 aus einem
Kurvenzug der Verhinderungskonzentration über Prozentverhinderung innerhalb
eines Verhinderungsbereichs von zehn bis neunzig Prozent Verhinderung
berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zu sehen.
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Diese
Ergebnisse zeigen, daß die
Formel 1 Peptidanaloge und bestimmte andere Erbgut 5 Analoge starke
Inhibitoren von Endothelialzellenwucherung sind.
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Beispiel 2
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In Ovo Huhn chorioallantoische
membranangiogenese Probe
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Der
Effekt der HK Erbgut 5 Peptide auf cytokinerregte Angiogenese in
vivo wurde unter Verwendung der GST-SEQ ID Nr: 10 bestimmt.
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Neue
Adern, quantifiziert durch Blutadernverzweigung erschienen als Antwort
auf bFGF, VEGF, oder einer Kombination aus beiden. Übereinstimmend
wurden 10 Tage alte angebrütete
Hühnereier
durchleuchtet um Blutadern unter der Schale zu beleuchten. Ein Bereich
mit einem Minimum kleiner Blutadern wurde identifiziert. Die chorioallantoische
Membran (CAM) wurde von der Eierschale in diesem Bereich durch das
Schleifen eines kleinen Loches in der mineralisierten Schale und
Aufbringen von Druck auf die darunterliegende innere Schalenmembran
entfernt. Dies veranlasste eine Lufttasche, sich vom weiten Ende
des Ei's zu dem
identifizierten Bereich zu verlagern und zwang einen kreisförmigen Bereich
des CAM, ungefähr
2cm im Durchmesser, sich weg von der Schale zu verlagern. Ein Fenster
wurde in die Eierschale geschnitten. Eine mit Kortisonacetat vorbehandelte
Filterscheibe mit 5mm Durchmesser, die in 1 μg/ml bFGF gesättigt wurde,
einer Kombination aus bFGF und VEGF oder Salzlösung, wurde auf dem CAM plaziert.
Das Fenster in der Schale wurde mit Klebeband versiegelt und das
Ei wurde für
vier Tage inkubiert. Peptid GST-SEQ ID Nr: 10 (0-25μg in 25μl Salzlösung; 0,27 μM) wurde
auf den gesättigten
Filter 24 Stunden später
aufgebracht und auf der angeregten CAM angebracht. Die CAM wurde
dann am vierten Tag der Anregung geerntet. Die Daten wurde in Ausdrücken der
Durchschnittsanzahl von Blutaderverzweigungspunkten pro Behandlungsgruppe
und ebenso prozentual durch Kontrolle unter Verwendung einer Videokamera,
die an einen PC angeschlossen war, berechnet. Unter den Bedingungen
der Probe verhinderte Peptid GST-SEQ ID Nr: 10 bFGF-angeregte Angiogenese
zu 97 % und bFGF/VEGF-angeregte Angiogenese zu 94 %. Es gab keine
Verhinderung von bFGF-angeregter Angiogenese durch GST allein (< 10% Verhinderung).
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Die 1A-1D zeigen
Kontrolleier und Testeier in der vorgenannten Probe: 1A Salzlösungskontrolle
(keine Behandlung); 1B, bFGF; 1C,
bFGF plus GST; 1D, bFGF plus GST-SEQ ID Nr: 10.
Die wesentliche Verhinderung von bFGF induzierter Angioginese durch
GST-SEQ ID Nr: 10 ist in 1D ersichtlich.
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Beispiel 3
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Verhinderung
der Migration endothelialer Zellen zu Vitronectin
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Endotheliale
Zellen müssen
vor dem Eindringen der Basismembran migrieren. Migration endothelialer Zellen
zu Vitronectin ist ein eng in Beziehung zur Angiogenese stehender
Prozeß.
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Die
untere Seite von Einsätzen
mit 8μm
Poren (Costar, Inc.) wurden mit 2μg/ml
Vitronectin für
eine Stunde beschichtet und mit zwei Prozent bovinem Serum Albumin
in Phosphat gepufferter Salzlösung
für eine Stunde
geblockt. Die Einsätze
wurden dann in 24 Quellkulturschalen, die 500μl Migrationspuffer in der unteren Kammer
platziert. Fünfundzwanzigtausend
HUVECs in 50μl
Migrationspuffer wurden der oberen Kammer der doppelten Einsätze hinzugefügt, die
50μl einer
Lösung
von 50μg/ml
GST-SEQ ID Nr: 10 Peptid im Migrationspuffer (Herpes gepuffertes
M199 Medium enthaltend 1% BSA, 2μM
MgCl2, 2μM
CaCl2 and 0,2μM
MnCl2) oder Migrationspuffer allein enthalten.
Den Zellen wurde erlaubt, von der oberen bis zur unteren Kammer
zu migrieren während
vier Stunden bei 37 °C.
Nicht migrierende Zellen wurden von der oberen Oberfläche durch
wischen der oberen Seite mit einem absorbierenden Tip entfernt.
Zellen die zur unteren Seite des Durchtritteinsatzes migrierten
wurden dann für
15 Minuten mit 3,7% Paraformaldehyd in Phosphat gepufferter Salzlösung fixiert
und mit einer 2% christallvioletten Lösung gefärbt. Nach ausgiebigem Waschen
mit Wasser um überschüssiges Christallviolett
zu entfernen wurden die Anzahl von Zellen, die migriert hatten,
in drei repräsentativen
Hochleistungs(200X)feldern durch Einsätzen gezäht.
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Peptid
GST-SEQ ID Nr: 10 mit einer Konzentration von 0.27μM erreichte
100 Verhinderung der HUVEC Migration zu Vitronectin. SEQUENZLISTE
SEQUENCE
LISTING
SEQUENCE LISTING
