DE60133271T2

DE60133271T2 - Behandlung von knorpelerkrankungen

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Publication number: DE60133271T2
Application number: DE60133271T
Authority: DE
Inventors: Yves Lawrenceville DUBAQUIE; Ellen H. San Francisco FILVAROFF; Henry B. El Granada LOWMAN
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2000-05-16
Filing date: 2001-05-16
Publication date: 2009-04-23
Anticipated expiration: 2021-05-17
Also published as: WO2001087323A2; US20100130411A1; WO2001087323A3; ES2301547T3; US20090011988A1; US20030069177A1; US8110548B2; US20030211992A1; DE60133271D1; EP1282437B1; AU2001263215A1; EP1282437A2; HK1050321A1; DK1282437T3; US7947650B2; ATE389416T1; US7423017B2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Behandlung von Knorpelstörungen, einschließlich der Stimulation der Knorpelheilung und Behandlung von degenerativen Störungen des Knorpels.
Hintergrund der Erfindung
Degenerative Störungen des Knorpels beschreiben weitreichend eine Sammlung von Störungen, die durch die Degeneration oder metabolischen Abnormalitäten des Bindegewebes, die durch Schmerz, Steifheit und Einschränkung der Bewegung der betroffenen Körperteile manifestiert sind, charakterisiert sind. Der Ursprung dieser Störungen kann pathologisch oder als ein Ergebnis eines Traumas oder einer Verletzung sein.
Osteoarthritis (OA), auch bekannt als Osteoarthrose oder degenerative Gelenkserkrankung, ist das Resultat einer Serie von lokalisierten degenerativen Prozessen, die die artikuläre Struktur beeinträchtigt und in Schmerz und verminderter Funktion resultiert. Das Auftreten von OA nimmt mit dem Alter zu und Nachweis einer OA-Mitleidenschaft kann in einigen Gelenken in der Mehrzahl der Bevölkerung ab einem Alter von 65 Jahren nachgewiesen werden. OA ist auch oft durch eine lokale inflammatorische Komponente begleitet, die die Gelenkszerstörung beschleunigt.
OA ist charakterisiert durch Zersetzung der glatten Oberfläche des Knorpels, gefolgt durch Ausbildung von Rissen und Fibrillation und letztlich völligem Stärkeverlust des Knorpels. Zusammentreffend mit den Veränderungen des Knorpels sind Veränderungen des periartikulären Knochens. Diese schließen die Entwicklung von tastbaren Knochenvergrößerungen an den Gelenkrändern und aus asymmetrischer Knorpelzersetzung resultierender Deformierung ein. OA-Symptome schließen insbesondere nach Gebrauch lokale Schmerzen an den beeinträchtigten Gelenken ein. Mit weiterem Krankheitsverlauf können die Symptome sich auch in ein kontinuierliches Schmerzgefühl, lokale Beschwerden und kosmetische Veränderungen des betreffenden Gelenks entwickeln. Im Gegensatz zu der lokalisierten Störung OA ist rheumatoide Arthritis (RA) eine systemische destruktive und entkräftende Erkrankung, von der angenommen wird, dass sie in dem Synovium, den gelenkumgebenden Geweben, beginnt. Die Verbreitung von RA ist etwa 1/6 der von OA in der gesamten Bevölkerung der Vereinigten Staaten. Sie ist eine chronische Autoimmunerkran kung, charakterisiert durch symmetrische Synovitis des Gelenks und typischerweise beeinträchtigt sie kleine und große diarthrodiale Gelenke, was zu ihrer progressiven Zerstörung führt. Mit fortlaufender Erkrankung können die Symptome von RA auch Fieber, Gewichtsverlust, Verdünnen der Haut, Multiorganbefall, Skleritis, Hornhautgeschwüre, der Ausbildung von subkutanen oder subperiostealen Knötchen und vorzeitigen Tod einschließen.
Das Ansprechen von normalen Patienten (z. B. Vorverletzung oder Vorerkrankung) gegenüber Verletzungen oder artbritischen Entartungen ist oftmals suboptimal. Die biochemischen und mechanischen Eigenschaften dieses verletzten Knorpels unterscheiden sich von denen eines normalen Knorpels, resultierend in einer inadäquaten oder veränderten Funktion. Dieser geschädigte Knorpel, hierin genannt „Faserknorpel" (fibrocartilage), reicht nicht an die Widerstandsfähigkeit und Funktion von normalem Knorpel heran.
Da Knorpel avaskulär ist und reife Chondrozyten nur ein kleines intrinsisches Potential zur Replikation haben, hat ein voll entwickelter Knorpel eine eingeschränkte Fähigkeit zur Heilung. Daher wird ein Schaden der Knorpelschicht, der nicht bis zum subchondriellen Knochen eindringt, nicht eine wirksame Heilung erfährt. Wenn im Gegensatz dazu der subchondrielle Knochen penetriert wird, erlaubt seine vaskuläre Versorgung eine triphasische Heilung stattzufinden. Das resultierende Gewebe ist gewöhnlicherweise mechanisch suboptimaler Faserknorpel.
Die mit Osteoarthritis assoziierte Degradation erscheint anfangs gewöhnlicherweise als Ausfransen und Fibrillation der Oberfläche. Es erfolgt auch ein Verlust von Proteoglycan aus der Matrix. Bei fortlaufender Oberflächenfibrillation penetrieren die Defekte tiefer in den Knorpel, resultierend in einem Verlust von Knorpelzellen und -matrix. Der subchondrielle Knochen verdickt, wird langsam freigelegt und kann poliert hervortreten. Knochenknötchen oder Osteophyten bilden sich auch oft an der Peripherie der Knorpeloberfläche aus und wachsen gelegentlich über die angrenzenden erodierten Flächen. Wenn die Oberfläche dieser Knochenauswüchse durchdrungen wird, kann ein vaskulärer Auswuchs erfolgen und zur Ausbildung von Faserknorpel enthaltenden Gewebepfropfen führen.
Die Transplantation von Chondrozyten ist als ein Mittel zum Stimulieren der Knorpelwiderherstellung bekannt. Die Möglichkeit der Immunantwort des Wirtes, als auch die mögliche Übertragung von viralen und anderen Infektionskrankheiten macht dieses Verfahren weniger wünschenswert. Diese Risiken können bis zu einem gewissen Grad mit allogenen und autogenen Transplantaten minimiert werden; das Kultivieren und Züchten von Patienten-spezifischen Zellen ist jedoch im Großansatz unerschwinglich teuer.
Andere Verfahren zum Stimulieren der Knorpelwiderherstellung schließen den Antagonismus von Molekülen, die mit der Knorpelzerstörung assoziiert sind, oder diesen verschärfen, z. B., Interleukin-1-alpha (IL-1α) und Stickstoffmonoxid (NO), ein. Das Zytokin IL-1α hat katabolische Effekte auf Knorpel, einschließlich der Ausbildung von synovialen Entzündungen und Hochregulation von Matrixmetalloproteinasen und der Prostaglandinexpression (Baragi et al., J. Clin. Invest., 96: 2454–2460 (1995); Baragi et al., Osteoarthritis Cartilage, 5: 275–282 (1997); Evans et al., J. Keukoc. Biol., 64: 55–61 (1998); Evans and Robbins, J. Rheumatol., 24: 2061–2063 (1997); Kang et al., Biochem. Soc. Trans., 25: 533–537 (1997); Kang et al., Osteoarthritis Cartilage, 5: 139–143 (1997)). Ein Weg IL-1α zu antagonisieren, ist die Verabreichung von löslichem IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1ra), einem natürlich vorkommenden Protein, das die Effekte von IL-1 durch Unterbinden der Bindung und das Aktivieren seines Rezeptors auf Chondrozyten und Synoviozyten durch IL-1 inhibiert, wodurch die wirksame Konzentration an IL-1 gesenkt wird.
NO spielt eine wesentliche Rolle in der Knorpelzerstörung (Ashok et al., Curr. Opin. Rheum., 10: 263–268 (1998)). Aus osteoarthritischen Gelenken erhaltener Knorpel erzeugt endogen große Mengen an NO. Normaler Knorpel erzeugt kein NO, sofern er nicht mit Zytokinen, wie z. B. IL-1 stimuliert wurde, während osteoarthritische Knorpelexplantate für bis zu drei Tage in Kultur fortfahren NO-Synthase zu exprimieren, trotz Abwesenheit von zugefügten Stimuli. Des Weiteren wurde für die Inhibition von NO gezeigt, dass sie die IL-1α vermittelte Knorpelzerstörung und Chondrozytensterben als auch den Fortschritt der Osteoarthritis unterbindet.
Die Fähigkeit von Peptidwachstumsfaktoren, die Wiederherstellung von geschädigtem Knorpel zu fördern wurde ebenfalls untersucht. Peptidwachstumsfaktoren sind sehr signifikante Regulatoren des Knorpelwachstums und Zellverhaltens (d. h. Differenzierung, Migration, Teilung, oder Matrixsynthese und/oder -abbau) (Chen et al., Am J. Orthop., 26: 396–406 (1997)). Diese Faktoren werden auf ihr Potential hin untersucht, Knorpelwiederherstellung ohne Transplantation von Zellen zu induzieren, und sie werden in konstruierten Vorrichtungen zur Implantation eingelagert.
Da Wachstumsfaktoren lösliche Proteine von einer relativ kleinen molekularen Masse sind, die schnell absorbiert und/oder abgebaut werden können, besteht eine große Herausforderung darin, die Zellen in ausreichender Anzahl und für eine ausreichende Dauer verfügbar zu machen. Es ist wahrscheinlich wünschenswert unterschiedliche Faktoren an der Reparaturstelle während unterschiedlicher Teile des Entwicklungszyklus und für variierende Zeitlängen vorliegen zu haben. Das ideale Lieferungsvehikel ist biokompatibel und aufnahmefähig, hat die passenden mechanischen Eigenschaften und resultiert in keinen gesundheitschädlichen Abbauprodukten. Wachstumsfaktoren, für die schon früher vorgeschlagen wurde, die Knorpelwiederherstellung zu stimulieren, schließen insulin-like growth factor-I (IGF-1) (Osborn, J. Orthop. Res., 7: 35–42 (1989); Florini und Roberts, J. Gerontol., 35: 23–30 (1980); U. S. Pat. Nr. 5,843,899 ), basic fibroblast growth factor (bFGF), (Toolan et al., J. Biomec. Mat. Res., 41: 244–50 (1998); Sah et al., Arch. Biochem. Biophys., 308: 137–47 (1994)), bone morphogenetic Protein (BMP) (Sato und Urist, Clin. Orthop. Relat. Res., 183: 180–187 (1984); Chin et al., Arthritis Rheum. 34: 314–324 (1991)), und transforming growth factor beta (TGF-β) (Hill und Logan, Prog. Growth Fac. Res., 4: 45–68 (1992); Guerne et al., J. Cell Physiol., 158: 476–484 (1994); Van der Kraan et al., Ann. Rheum. Dis., 51: 643–647 (1992)) ein.
Es konnte einwandfrei festgestellt werden, dass das GH/IGF/IGFBP-System in der Regulation der anabolen und metabolen Homeostase einbezogen ist, und dass Defekte in diesem System Wachstum, Physiologie und glykämische Kontrolle nachteilig beeinflussen können (Jones et al., Endocr. Rev., 16: 3–34 (1995); Davidson, Endocr. Rev., 8: 115–131 (1987); Moses, Curr. Opin. Endo. Diab., 4: 16–25 (1997)). Es wurde vorgeschlagen, dass IGF-1, auf Grund seiner Fähigkeit die Matrixsynthese, als auch die Zellproliferation in Kultur zu stimulieren, für die Behandlung oder Prävention von Osteoarthritis nützlich sein könnte (Osborn, J. Orthop. Res., 7: 35–42 (1989)). IGF-1 wurde mit Natirumpentosanpolysulfat (PPS) (ein katabolischer Aktivitätsinhibitor von Chondrozyten) an schwer osteoarthritischen Hunden verabreicht, mit dem Effekt des Reduzierens der Schwere der Erkrankung, möglicherweise durch Herabsetzen der Spiegel an aktiven neutralen Metalloproteinasen im Knorpel. In dem leicht osteoarthritischen Hundemodell erschien therapeutisches Eingreifen mit IGF-1 und PPS zusammen die Knorpelstruktur und Biochemie zu erhalten, während IGF alleine ineffektiv war, wie beschrieben in Rogachefsky, Osteoarthritis and Cartilage, 1: 105–114 (1993); Rogachefsky et al., Ann. NY Acad. Sci., 732: 889–895 (1994). Die Verwendung von IGF-1 entweder alleine, oder als ein Adjuvants mit anderen Wachstumsfaktoren, um Knorpelregeneration zu stimulieren, wurde beschrieben in WO 91/19510 , WO 92/13565 , US 5,444,047 und EP 434,652 .
IGF-1 wurde auch für nützlich in der Behandlung von Osteoporose in Säugern befunden, die eine herabgesetzte Knochenmineraldichte zeigten, und solchen, die Medikamenten oder Umweltbedingungen ausgesetzt waren, die in einer Knochendichtereduktion und potentieller Osteoporose resultieren, wie beschrieben in EP 560,723 und EP 436,469 .
IGF-1-Insuffizienz kann auch eine etiologische Rolle in der Entwicklung von Osteoarthritis haben (Coutts et al., "Effect of growth factors an cartilagerepair", Instructional Course Lect., 47: 487–494 (Amer. Acad. Orthop. Surg.: Rosemont, IL 1997)). Einige Studien deuten daraufhin, dass Serum IGF-1-Konzentrationen in osteoarthritischen Patienten geringer sind als in Kontrollgruppen, während andere Studien keinen Unterschied gefunden haben. Dennoch konnte gezeigt werden, dass sowohl Serum IGF-1 Spiegel, als auch die Empfindlichkeit der Chrondrozyten bezüglich IGF-1 mit dem Alter abnimmt, letzteres vermutlich auf Grund hoher Spiegel von IGF Bindungsproteinen (IGFBPs) (Florini und Roberts, J. Gerontol., 35: 23–30 (1980); Martin et al., J. Orthop. Res., 15: 491–498 (1997); Fernihough et al., Arthr. Rheum., 39: 1556–1565 (1996)). Daher kann sowohl die herabgesetzte Zugänglichkeit von IGF-1, als auch verminderte Chondrozytenempflindlichkeit/Disregulation von IGFBPs zu der gestörten Knorpelmatrix Homeostase und Gewebedegeneration, die mit fortschreitenden Alter und Erkrankung auftritt, hierzu beitragen.
Von den IGFBPs erscheint IGFBP-3 für die Regulation der Gesamtspiegel von IGF-1 und IGF-2 im Plasma am stärksten verantwortlich zu sein. IGFBP-3 ist ein GH abhängiges Protein und wird in Fällen von GH Defizienz oder Resistenz reduziert (Jones et al., supra; Rosenfield et al., "IGF-1 treatment of syndromes of growth hormoneinsensitivity" In: The insulin-like growth factors and their regulatory proteins, Hrsg. Baxter RC, Gluckman PD, Rosenfield RG. Excerpta Medica, Amsterdam, 1994), S. 357–464; Scharf et al., J. Hepatology, 25: 689–699 (1996)). IGFBPs sind, größtenteils abhängig von ihren posttranslationalen Modifikationen und ihrer Gewebelokalisation, fähig IGF-Aktivität zu erhöhen oder zu inhibieren (zusammengefasst in Jones und Clemmons, Endocr. Rev. 16: 3–34 (1995); Collet-Solberg und Cohen, Endocrinol. Metabol. Clin. North Am. 25: 591–614 (1996)). Zusätzlich kann eine Disregulation in IGFBPs (-3, -4 und/oder -5) eine Schlüsselrolle in arthritischen Störungen spielen (Chevalier und Tyler, Brit. J. Rheum. 35: 515–522 (1996); Olney et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 81: 1096–1103 (1996); Martel-Pelletier et al., Inflamm. Res., 47: 90–100 (1998)). Es wurde berichtet, dass IGF-1-Analoga mit sehr geringen Bindungsaffinitäten für IGFBPs im Stimulieren der Proteoglycan-Synthese effektiver waren als Wildtyp IGF-1 (Morales, Arch Biochem. Biophys. 324, 173–188 (1997)). Weitere jüngere Daten schlagen jedoch vor, dass IGFBPs zur IGF-Bindung an und Transport durch das Knorpelgewebe beitragen, und IGFBPs daher die Bioverfügbarkeit von IGF-1 in dem Gelenk regulieren können (Bhakta et al., J. Biol. Chem., 275: 5860–5866 (2000)).
Die Bioverteilung von IGF-1 hängt kritisch von (a) der Bildung von langlebigen hochmolekulargewichtigen Komplexen und (b) den absoluten IGFBP-Konzentrationen ab. Die Mehrheit von IGF-1 wird im Kreislauf im Komplex mit IGFBP-3 und einem dritten Protein, namens säurelabile Untereinheit (acid-labile subunit) (ALS) gefunden (Bach und Rechler, Diabetes Reviews, 3: 38–61 (1995); Clemmons, Cytokine Growth Factor Rev., 8: 45–62 (1997); Jones und Clemmons, Endocr. Rev., 16: 3–34 (1995)). Dieser tenäre Komplex mit einem Molekulargewicht von 150-kD ist unfähig, die Blutgefäßwände zu durchqueren und agiert als ein zirkulierendes Reservoir für IGFs. Als eine Konsequenz daraus wird die Serumhalbwertszeit von IGF-1 in tenären Komplexen beschrieben 12–15 Stunden zu sein, gegensätzlich zu 30 Minuten in binären Komplexen, oder 10 Minuten in der freien Form (Simpson et al., Growth Horm IGF Res, 8: 8395 (1998); Twigg und Baxter, J. Biol. Chem., 273: 6074–6079 (1998)).
IGFBP-3 und -5 sind scheinbar einzigartig in ihrer Fähigkeit mit ALS einen tenären Komplex auszubilden. ALS-Assoziierung erfolgt nur in Gegenwart von IGF-1, und ein basisches Motiv in den carboxyterminalen Domänen von IGFBP-3 und -5 scheint diese Interaktion zu vermitteln (Baxter et al., J. Biol. Chem., 267: 60–65 (1992); Firth et al., J. Biol. Chem., 273: 2631–2638 (1998); Twigg und Baxter, supra).
Der zweite bestimmende Faktor der IGF-1-Bioverteilung ist die Gesamtkonzentration an Bindungsproteinen: IGFBP-3 ist das am reichlichsten vorhandene Bindungsprotein, gefolgt von IGFBP-1 und -2 Spiegel, wohingegen die Serumkonzentrationen von IGFBP-4, -5 und -6 sehr niedrig sind (Clemmons, Cytokine Growth Factor Rev., 8: 45–62 (1997)). IGFBP-3 stellt daher den hauptsächlichen Träger von IGF-1 im Blut dar. Im Gegensatz dazu liegt ein wesentlicher Teil des IGFBP-1 und -2 frei im Blut vor. Demzufolge scheinen sie die Hauptmodulatoren der freien IGF-1-Spiegel zu sein (Clemmons, 1997, supra).
WO 94/04569 offenbart ein anderes als natürliches IGFBP spezifisches bindendes Molekül, das zum Binden an IGF-1 fähig ist und die biologische Aktivität von IGF-1 verstärken kann. WO 98/45427 , publiziert am 15. Oktober 1998; Lowman et al., Biochemistry, 37: 8870–8878 (1998); und Dubaquié und Lowman, Biochemistry, 38: 6386 (1999) offenbaren durch Phagen Display identifizierte IGF-1 Agonisten. Auch WO 97/39032 offenbart Inhibitorliganden von IGFBPs und Verfahren für ihre Verwendung. Des Weiteren offenbart US-Pat. Nr. 5,891,722 Antikörper mit Bindungsaffinität für freies IGFBP-1 und Mittel und Verfahren zum Detektieren von freiem IGFBP-1 und eines Risses in einer fötalen Membran, das auf dem Vorhandensein von amniotischer Flüssigkeit in einem Vaginalsekret basiert, wie durch das Vorhandensein von freiem IGFBP-1 in dem Vaginalsekret angedeutet.
WO 00/23469 , publiziert am 27. April 2000, offenbart Fragmente von IGFBPs und Analoga von IGF-1 zur Verwendung in z. B. Krebs, ischemischen Verletzungen und in der Behandlung von Diabetes.
Es existiert ein fortlaufender Bedarf für eine effektive Therapie zur Behandlung und Wiederherstellung von Knorpel, einschließlich von einem als ein Ergebnis einer Verletzung und/oder Erkrankung verletzten Knorpels.
Zusammenfassung der Erfindung
Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von einem IGF-Analogon mit einer Bindungsaffinitätspräferenz für IGFBP-3 im Vergleich zu IGFBP-1 oder ein IGF-1-Analogon mit einer Bindungsaffinitätspräferenz für IGFBP-1 in Vergleich zu IGFBP-3, zur Herstellung von einer Zusammensetzung zur Vorbeugung oder Verlangsamung des Abbaus der Knorpelmatrix, wobei eine effektive Menge eines dieser aktiven Mittel mit dem Knorpel in Kontakt gebracht wird, wie in den Ansprüchen definiert. Bevorzugt wird der Knorpel in vivo in einem Säugetier behandelt und das aktive Mittel wird dem Säugetier verabreicht. Das aktive Mittel wird wahlweise auch mit dem Knorpel in einer Form mit verlängerter Freisetzung in Kontakt gebracht und/oder alleine dem Gelenk lokal verabreicht, oder, wenn das aktive Mittel ein IGF-1-Analogon mit einer Präferenz für IGFBP-3 im Vergleich zu IGFBP-1 ist, zusammen mit IGF-1 und/oder ALS, bevorzugt humanes, in der nativen Sequenz vorliegendes IGF-1, wenn das Säugetier ein Mensch ist.
Das aktive Mittel ist eine IGF-1-Variante, wobei der Aminosäurerest an Position 3, 7, 10, 16, 25 oder 49 oder die Aminosäurereste an Positionen 3 und 49 der nativen Sequenz des humanen IGF-1 ersetzt sind durch einen Alanin-, einen Glycin- oder einen Serinrest, oder eine IGF-1-Variante, wobei der Aminosäurerest an Position 9, 12, 15 oder 20 ersetzt ist durch einen Lysin- oder Argininrest.
Der Buchstabe, gefolgt von einer Nummer, gefolgt von einem Buchstaben, deutet auf ein IGF-1-Analogon hin, wobei der Aminosäurebuchstabe links von der Nummer die ursprüngliche Aminosäure in der nativen Sequenz des humanen IGF-1 ist, die Nummer die Position ist, wo die Aminosäure ausgetauscht ist, und der Aminosäurebuchstabe rechts von der Nummer die substituierte Aminosäure ist. Demzufolge bezeichnet F49A z. B. eine IGF-1-Variante hin, wobei der Phenylalaninrest an Position 49 der nativen Sequenz von Human-IGF-1 zu einem Alaninrest getauscht ist, und E3AF49A bezeichnet eine IGF-1-Variante hin, wobei der Glutaminrest an Position 3 der nativen Sequenz von Human-IGF-1 zu einem Alaninrest getauscht ist, und der Phenylalaninrest an Position 49 der nativen Sequenz von Human-IGF-1 zu einem Alaninrest getauscht ist.
In einer anderen Ausführungsform ist die oben beschriebene Verwendung für die Behandlung von Knorpel, der als ein Ergebnis von einer degenerativen Störung des Knorpels beschädigt oder erkrankt ist. Bevorzugt ist die Störung eine artikuläre Knorpelstörung, und am meisten bevorzugt ist sie OA oder RA.
Die oben angegebene Verwendung ist weiterhin beschrieben für die Behandlung von direkt oder indirekt durch eine Verletzung geschädigte Gelenke, bevorzugt Mikroschaden oder einer Aufprallverletzung, einer chondralen Fraktur, einer osteochondralen Fraktur.
Wahlweise betrifft die Erfindung die oben genannte Verwendung, wobei der Knorpel mit einer effektiven Menge des IGF-1-Analogons oder IGFBP-Ersatzpeptids, wie oben definiert, in Kombination mit einer effektiven Menge eines Knorpelwachstumfaktors oder Knorpelkatabolismus-Antagonisten in Kontakt gebracht wird.
Weiterhin ist ein Verfahren zum Erhalten, Verstärken oder Fördern des Wachstums von Chondrozyten in serumfreier Kultur durch in Kontakt Bringen der Chondrozyten mit einer effektiven Menge an IGF-1-Analogon oder einem IGFBP-Ersatzpeptid, wie oben identifiziert, beschrieben. Alternativ dazu betrifft das Verfahren das In Kontakt Bringen der Chondrozyte mit einer effektiven Menge an IGF-1-Analogon oder eines IGFBP-Ersatzpeptidpeptides in einer Formulierung mit verlängerter Freisetzung. Alternativ dazu ist auch ein Verfahren zum Stimulieren der Regeneration oder des Vorbeugens des Knorpelabbaus, resultierend aus einer Verletzung oder einer degenerativen Störung des Knorpels, durch Transplantation einer effektiven Menge von Chondrozyten, die vorher mit einer effektiven Menge an IGF-1-Analogon oder eines IGFBP-Ersatzpeptides, wie oben definiert, behandelt wurden, beschrieben.
Weiterhin beschrieben ist ein Herstellungsartikel, umfassend einen Behälter, beinhaltend ein IGF-1-Analogon, wie oben definiert, in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, mit Anweisung für dessen Verwendung zur Behandlung einer Knorpelstörung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A–1C stellen die DNA-Sequenz (SEQ ID NO. 1) des als ein Matrize zum Aufbau einer Phagenbibliothek verwendeten Plasmids pt4.g8 dar. Es ist auch die Aminosäurese quenz (SEQ ID NO. 2) eines durch einen Antikörper erkennbares Peptids (gD-tag) gezeigt, das mit g8p des Bakteriophagen M13 fusioniert ist.
2 zeigt gene-8 naive Phagenbibliothek-Anreicherungen mit einer Selektion unter Verwendung von jeweils 4 Bibliothekpools und den Zielproteinen IGF-1, IGFBP-1 und IGFBP-3.
3 zeigt einen IGF-1-Blockierungsassay unter Verwendung von g8-Phagenpeptiden aus den IGFBP-3-Selektionen, wo die Phagentitration mit 100 nM IGF-1 ist. In der Abbildung sind die offenen Kreise Peptid 4A3.1, die offenen Dreiecke sind Peptid 4B3.4, die offenen Quadrate sind Peptid 4C3.2, die ausgefüllten Kreise sind Peptid 4D3.3, die ausgefüllten Dreiecke sind Peptid 4D3.4 und die ausgefüllten Quadrate sind Peptid 4D3.5.
4 zeigt einen IGF-1-Blockierungsassay unter Verwendung von g8-Phagenpeptiden aus den IGFBP-3-Selektionen, wo die Phagentitration ohne IGF-1 ist. Die Bezeichnungen für die Peptide sind die gleichen, wie oben beschrieben für 3.
5 zeigt einen IGF-1-Blockierungsassay unter Verwendung von g8-Phagenpeptiden aus den IGFBP-3-Selektionen, wo die Peptide (4C3.2, 4D3.8, 4D3.9, 4D3.11 und 4D3.12) aus einer NEUTRAVIDIN^TM/DTT-Selektion stammen. Die ausgefüllten Balken sind mit 100 μM IGF-1 und die offenen Balken ohne IGF-1.
6 zeigt einen IGF-1-Blockierungsassay unter Verwendung von g8-Phagenpeptiden aus den IGFBP-3-Selektionen, wo die Peptide (angedeutet auf der x-Achse) aus einer direct-coat/HCl-Selektion stammen. Die ausgefüllten Balken sind mit 100 μM IGF-1 und die offenen Balken sind ohne IGF-1.
7 stellt einen Kompetitionsassay der IGFBP-3-Inhibition durch Peptidbindung an IGFBP-3 (bezeichnet als BP3-01) unter Verwendung eines BIACORE^TM-Oberflächenplasmonresonanzgerätes zur Messung von freiem Bindungsprotein, dar. Die Kreise deuten auf 800 response units (RU) von IGF-1 und die Quadrate deuten auf 400 RU immoblisiertes IGF-1 hin.
8 stellt einen Kompetitionsassay der IGFBP-3-Inhibition durch eine Peptidbindung an IGFBP-3 (bezeichnet als BP3-02) unter Verwendung eines BIACORE^TM-Oberflächenplasmonresonanzgerätes zur Messung von freiem Bindungsprotein, dar. Die Kreise deuten auf 800 RU IGF-1 und die Quadrate deuten auf 400 RU immoblisiertes IGF-1 hin.
9 zeigt einen radiomarkierten IGF-1 Plattenassay der Fähigkeit von zwei Peptiden, die an IGFBP-3, aber nicht an den Typ 1 IGF-Rezeptor (BP3-01-ox: Kreise, und BP3-02-ox: Quadrate) binden, IGFBP-3 zu inhibieren.
10 zeigt einen radiomarkierten IGF-1-Plattenassay der Fähigkeit der beiden IGFBP-3 bindenden Peptide, beschrieben für 9, IGFBP-1 zu inhibieren (Symbole sind die gleichen).
11A–11D stellen KIRA-Assays der IGF-1-Aktivität unter Verwendung von drei Peptiden (BP1-01: Quadrate, BP1-02: Kreise und BP03-ox: Dreiecke) dar. 11A stellt die Peptide alleine, 11B stellt die Peptide plus IGF-1 plus IGFBP-1, 11C stellt die Peptide plus IGF-1, und 11D stellt die Peptide plus IGF-1 plus IGFBP-3 dar.
12 stellt einen IGF-2-Kompetitionsassay der IGFBP-3-Inhibition durch vier Peptide, bezeichnet als BP3-01-ox (offene Quadrate), BP3-14 (offene Kreise), BP3-15 (geschlossene Kreise) und BP3-17 (geschlossene Quadrate) dar, unter Verwendung eines BIACORE^TM-Oberflächen-Plasmonresonanzgerätes zum Messen von freiem Bindungsprotein. Jedes Peptid wurde unter Verwendung von 20 nM IGFBP-3 und näherungsweise 1500 RU immobilisiertem IGF-2 getestet.
13A und 13B zeigen einen Phagen-ELISA der Variante G1S-A70V IGF-1 Bindung an IGFBP-1 (13A) und IGFBP-3 (13B). Mit 1 μg/ml IGFBP-1 (13A) oder IGFBP-3 (13B) beschichtete Mikrotiterplatten wurden mit G1S-A70V präsentierenden Phagenpartikeln in Gegenwart der angegebenen Mengen an löslichem Konkurrenzprotein, IGFBP-1 (13A) oder IGFBP-3 (13B), inkubiert. Die halbmaximale inhibitorische Konzentration (IC₅₀) des Kompetitors, d. h. der inhibitorischen Konzentration des Kompetitors, das in einer halbmaximalen Bindung des Phagemids in diesem speziellen Experiment resultierte, ist für das jeweilige IGFBP gekennzeichnet.
14 zeigt den Verlust oder Gewinn der IGFBP-Affinität für die durch Phagen-ELISA getesteten IGF-1-Mutanten. Relative IC₅₀-Werte (IC_50mut/IC_50G1S-A70V) für jede IGF-1-Alaninmutante (Affinitätsänderungen der jeweiligen Mutante für die Bindungsproteine in Bezug auf IGF-1G1S-A70V) sind für IGFBP-1 (ausgefüllte Balken) und IGFBP-3 (offene Balken) gezeigt. Die Werte sind aus der nachstehenden Tabelle 1 entnommen. Relative IC₅₀-Werte < 1 kennzeichnen Gewinn an Affinität; Werte > 1 kennzeichnen Verlust von Affinität. Das Sternchen deutet an, dass diese speziellen Varianten nicht auf den Phagen präsentiert wurden, wie durch Antikörperbindung bewertet.
15A und 15B zeigen Bindungsspezifität der auf den Phagen präsentierten IGF-1-Variante F49A gegenüber IGFBP-1 bzw. -3, in einem kompetitiven Phagen-ELISA. F49A präsentierende Phagemidpartikel (Quadrate) wurden an mit IGFBP-3 beschichteten Platten in Gegenwart der angegebenen Mengen an löslichem IGFBP-1 (15A) oder IGFBP-3 (15B) gebunden. Das gleiche Experiment wurde parallel mit dem die wildtypähnliche IGF-1-Variante G1S-A70V präsentierenden Phagen (Kreise) durchgeführt. Siehe die nachfolgenden Tabellen I und II für absolute IC₅₀-Werte. Die Datenpunkte sind Mittelwerte ± Standardabweichung, n = 2. Immunsorbentplatten wurden mit 1 μg/ml IGFBP-3 beschichtet und ein ELISA wurde, wie in den nachstehenden Beispielen unter Verwendung von Wildtyp-IGF-1-Phagen (WT, Kreise) und IGF-F49A-Phagen (F49A, Quadrate) beschrieben, parallel durchgeführt. Die Experimente wurden in doppelter Ausfertigung durchgeführt und die Datenpunkte sind als Mittelwert ± Standardabweichung gezeigt.
16 offenbart einen Sequenzabgleich der nativen Sequenz von humanem IGF-1 (gekennzeichnet mit wtIGF) (SEQ ID NO: 3), der nativen Sequenz von humanem Proinsulin (gekennzeichnet mit Proinsulin) (SEQ ID NO: 4) und der nativen Sequenz von humanem Insulin (gekennzeichnet als Insulin (B-Kette) gefolgt von Insulin (A-Kette)) (SEQ ID NO: 5). Die Sternchen und Punkte kennzeichnen Sequenzidentität bzw. Sequenzähnlichkeit an den gekennzeichneten Aminosäurepositionen zwischen den drei Sequenzen.
17A bis 17D zeigen eine Biosensoranalyse der IGFBP-Bindung an immobilisierte IGF-1-Varianten. Sensorgramme sind für IGFBP-1- (17A, 17C) oder IGFBP-3- (17B, 17D) Bindung an immobilisiertes Wildtyp-IGF-1 (17A, 17B) oder F49A-IGF-Variante (17C, 17D) gezeigt. Die Ligandenkonzentrationen in dem jeweiligen Experiment betrugen 1 μM, 500 nM und 250 nM. Siehe Tabelle II für kinetische Parameter.
18A bis 18B zeigen ein Modell der funktionellen Bindungsepitope für IGFBP-1 bzw. IGFBP-3, auf der Oberfläche von IGF-1. Die Aminosäureseitenketten wurden entsprechend ihres relativen Beitrags zur Bindungsenergie (Tabelle I) klassifiziert und wie folgt farbig markiert: kein Effekt (grau); 2–5-facher Verlust der apparenten Affinität (gelb); 5–10-fach (orange); 10–100-fach (hellrot); > 100-fach (dunkelrot). Falls zugänglich wurden Zahlen aus den Phagen-ELISA-Experimenten aus der nachstehenden Tabelle I verwendet. Anstatt dessen wurden für V11A-, R36A-, und P39A-Varianten BIACORE^TM-Daten ver wendet (Tabelle II). Die NMR-Struktur von IGF-1 (Cooke et al., Biochemistry, 30: 5484, (1991)) wurde unter Verwendung des Programms Insight II^TM (MSI, San Diego, CA) dargestellt. Das Bindungsepitop für IGFBP-1 (18A) ist an der „oberen" und „unteren" Fläche der endterminalen Helix (Reste 8–17) lokalisiert, verbunden durch den energetisch wichtigen Rest F49. Für IGFBP-3 (18B) tragen einzelne IGF-1-Seitenketten sehr gering zur Bindungsenergie bei. Das Bindungsepitop war versetzt vom N-Terminus und schließt neu G22, F23 und Y24 ein.
19 zeigt die Menge an gebundenem IGFBP-1, bestimmt in einem kompetitiven BIACORE^TM-Bindungsexperiment, aufgetragen gegen die IGF-Variantenkonzentration für E3A/F49A (Quadrate) und F49A (Kreise).
20A und 20B zeigen die berechnete IGF-1-Aktivität in nanomolaren Einheiten für mehrere IGF-1-Varianten bei 13 nM (hohen), bzw. 1,3 nM (niedrigen) Variantenkonzentrationen unter Verwendung der IGF-1-KIRA-optischen-Dichte-Analyse. Die für jede IGF-Variante erhaltenen Signale wurden zu denen einer Standardverdünnungsserie von Wildtyp-IGF-1 verglichen und in Bezug auf eine apparente IGF-1-Konzentration, entsprechend zu der beobachteten Aktivität, ausgewiesen.
21A und 21B zeigen IGF-Aktivierungskurven für F49A-IGF-1 (21A) und E3A/F49A (21B), wie auch für Wildtyp-IGF-1, wie gemessen unter Verwendung serieller Verdünnungen in KIRA-Assays. Die Varianten werden dargestellt durch Quadrate und der Wildtyp IGF-1 wird dargestellt durch Kreise.
22A und 22B zeigen eine Beurteilung der vorläufigen pharmakologischen Eigenschaften von F49A und E3A/F49A-IGF-1, radiomarkiert und intravenös verabreicht in Ratten. 22A zeigt einen Zeitverlauf der Rate, bei der beide Moleküle aus dem Blut des Tieres entfernt werden, wobei die Quadrate Wildtyp IGF-1 darstellen, die Kreise E3A/F49A-IGF-1 darstellen und die Rauten F49A-IGF-1 darstellen. 22B zeigt das Gewebe-zu-Blut-Verhältnis für die beiden IGF-Varianten in verschiedenen Organen, und zwar Niere, Leber, Milz, Herz und Pankreas, bei 5, 15 und 30 Minuten, wo die ausgefüllten Balken Wildtyp IGF-1 darstellen, die gepunkteten Balken E3A/F49A-IGF-1 darstellen und die gestreiften Balken F49A-IGF-1 darstellen.
23 zeigt Zirkulardichroismusspektren von Wildtyp IGF-1 (Kreise), F49A-IGF-1 (Quadrate) und E3A/F49A-IGF-1 (Rauten).
24 ist ein Balkendiagramm, das den Effekt einer Kontrolle, Wildtyp IGF-1, F49A und E3A/F49A (bei einer Konzentration von 40 oder 400 ng/ml) auf die Knorpelmatrixbeschädigung (Proteoglycanfreisetzung nach 72 Stunden) zeigt.
25 ist ein Balkendiagramm, das den Effekt von Wildtyp IGF-1, F49A und E3A/F49A (bei einer Konzentration von 40 oder 400 ng/ml) auf IL1α-induzierte Knorpelbeschädigung nach 72 Stunden zeigt.
26 ist ein Balkendiagramm, das den Effekt einer Kontrolle, Wildtyp IGF-1, F49A, E3A/F49A (bei einer Konzentration von 40 oder 400 ng/ml) auf die Matrixsynthese zeigt.
27 ist ein Balkendiagramm, das den Effekt von Wildtyp IGF-1, F49A und E3A/F49A (bei einer Konzentration von 40 oder 400 ng/ml) auf IL1α-induzierte Inhibition der Matrixsynthese zeigt.
28 ist ein Balkendiagramm, das den Effekt einer Kontrolle, Wildtyp IGF-1, F49A und E3A/F49A (bei einer Konzentration von 40 oder 400 ng/ml) auf die Freisetzung von Stickstoffmonoxid zeigt.
29 ist ein Balkendiagramm, das den Effekt von Wildtyp IGF-1, F49A und E3A/F49A (bei einer Konzentration von 40 oder 400 ng/ml) auf IL1α-induzierte Stickstoffmonoxiderzeugung zeigt.
30A und 30B zeigen die Bindungskurven für Phagenpartikel, die entweder Wildtyp IGF-1 (Kreise), D12K (Quadrate) oder D12R (Rauten) gebunden an immobilisiertes IGFBP-1 (30A) oder IGFBP-3 (30B) zeigt.
31A–31D zeigen die Effekte auf artikuläre Schweineknorpelexplantate, die in Medium (–) oder in Medium mit D12K, D12R oder Wildtyp IGF-1 (bei 10 nM) allein (31A, 31C) oder in Gegenwart von IL1α (+a) bei 1 ng/ml (31B, 31D) kultiviert wurden.
32 zeigt die Effekte auf artikuläre Knorpelmatrixsynthese in menschlichem Gewebe von erkrankten Gelenken, die in Medium alleine (–) oder mit F49, E3A/F49, F16/F49, D12K, D12R oder Wildtyp IGF-1 (bei 40 ng/ml) kultiviert wurden.
33A–33D zeigen den Effekt auf menschliche artikuläre Knorpelexplantate, die in Medium alleine (–) oder nur behandelt mit Wildtyp IGF-1 oder in Kombination mit entweder BP3-40 (33A, 33B) oder BP3-15 (33C, 33D) kultiviert wurden (bei 0,1 mg/ml).
34A–34C zeigen die Ausbildung des trimeren Komplexes von F49A oder E3A/F49A mit IGFBP-3 und ALS. Auf einem Biosensorchip immobilisiertes IGFBP-3 wurde durch Einfügen von 1 μM Wildtyp IGF-1 (34A) F49A (34B) oder E3A/F49A (34C) in dem Laufpuffer gesättigt. ALS wurde bei 98 nM, 148 nM und 33 nM unter Beobachtung der Echtzeitassoziation und -dissoziation zu dem vorgebildeten binären Komplex injiziert.
35 zeigt einen BIAcore^TM-Inhibitionsassay der IGF-1-Aktivität unter Verwendung von sieben unterschiedlichen Peptiden (BP-16: gefüllte Kreise, (i + 7)A: offene Kreise, (i + 7)B: offene Rauten, (i + 7)C: offene Dreiecke, (i + 7)D: offene Quadrate, (i + 8)B: ausgefüllte Quadrate, (i + 8)C: ausgefüllte Dreiecke).
36 zeigt einen KIRA-Assay der Peptidaktivität unter Verwendung von vier unterschiedlichen Peptiden (BP1-16: Kreise, BP1-02: Quadrate, BP1-25: Dreiecke und BP1-40: Rauten).
37 zeigt einen analytischen HPLC-Lauf des trypsingeschnittenen BP1-625-Z-Fusionsproteins. Die Hauptpeaks wurden durch Massenspektrometrie als (A) Z-Domänenfragment und (B) BP1-625-Peptid identifiziert.
38 zeigt einen BIAcore^TM-Inhibitionsassay der IGF-1-Aktivität unter Verwendung von vier unterschiedlichen Peptiden (BP1-01: Kreise, BP1-625: Quadrate, BP1-21A: Dreiecke und BP1-25: Rauten).
39 zeigt den Effekt auf die Proteoglycansynthese von artikulären Knorpelexplantaten aus menschlichen Gelenken, entfernt aus Patienten, die einen Gelenkaustausch unterlaufen, kultiviert mit IGF-1 alleine (IGF) bei 40 ng/ml oder IGF-1 mit BP1-17, BP3-15 oder BP1-16 (0,1 mg/ml) oder IGF-1 mit Puffer (HEPES).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
„IGF-1-Analoga” sind Aminosäurevarianten des IGF-1 mit der nativen Sequenz, bevorzugt Varianten von menschlichem Wildtyp IGF-1. Die Dissoziationskonstante (K_D) des Wildtyp IGF-1 wurde bestimmt auf 13 nM für IGFBP-1 und 1,5 nM für IGFBP-3. Der Unterschied in der Affinität für die IGFBPs ist begründet in einer 10-fach schnelleren Assoziationsrate (k_a) von IGF-1 an IGFBP-3 (3,2 × 10⁵ versus 3,2 × 10⁴ M^–1s^–1). Solche Analoga können eine oder mehrere Aminosäureänderungen, verglichen zum nativen IGF-1, haben. Wie hierin verwendet, betrifft der Begriff „IGF-1-Analoga" entweder ein IGF-Analogon mit einer Bindungsaffinitätspräferenz für IGFBP-3 im Vergleich zu IGFBP-1 oder ein IGF-1-Analogon mit einer Bindungsaffintitätspräferenz für IGFBP-1 im Vergleich zu IGFBP-3, wie nachfolgend definiert.
Ein „IGF-1-Analogon mit einer Bindungsaffinitätspräferenz für IGFBP-3 im Vergleich zu IGFBP-1" betrifft ein IGF-1-Analogon, das eine veränderte Bindungsaffinität für ein beliebiges oder mehrere der IGFBPs im Vergleich zu IGF-1 mit der nativen Sequenz aufweist, so dass die relative Bindungsaffinität des Analogons (R(3)) für IGFBP-3 [definiert als R(3) = K_D(IGF-1:IGFBP-3)/K_D(analog: IGFBP-3)] mindestens etwa 10-fach größer ist als seine relative Bindungsaffinität (R(1)) für IGFBP-1 [definiert als R(1) = K_D(IGF-1:IGFBP-1)/K_D(analog:IGFBP-1)], wie z. B. durch kinetische Analysen der exprimierten und aufgereinigten Analoga unter Verwendung eines BIACORE^TM-Messgerätes gezeigt.
Umgekehrt dazu bezieht sich ein „IGF-1-Analogon mit einer Bindungsaffinitätspräferenz für IGFBP-1 im Vergleich zu IGFBP-3" auf ein IGF-1-Analogon, das eine veränderte Bindungsaffinität für ein beliebiges oder mehrere der IGFBPs im Vergleich zu IGF-1 mit der nativen Sequenz aufweist, so dass die relative Bindungsaffinität (R(1)) für IGFBP-1 [definiert als R(1) = K_D(IGF-1:IGFBP-1)/K_D(analog: IGFBP-1)] mindestens etwa 10-fach größer ist als seine relative Bindungsaffinität (R(3)) für IGFBP-3 [definiert als R(3) = K_D(IGF-1:IGFBP-3)/K_D(analog:IGFBP-3)], wie z. B. durch kinetische Analysen der exprimierten und aufgereinigten Analoga unter Verwendung eines BIACORE^TM-Messgerätes gezeigt.
„Peptide" haben mindestens zwei Aminosäuren und schließen Polypeptide mit mindestens etwa 50 Aminosäuren ein. Die Definition schließt Peptidderivate, ihre Salze oder optischen Isomere ein.
Ein IGFBP-Ersatzpeptid, das die Interaktion eines IGF mit einem IGFBP „inhibiert" oder ihr „vorbeugt", betrifft ein Peptid, das die Serum- und Gewebespiegel von biologisch aktivem IGF erhöht, unabhängig davon, wie diese Erhöhung erfolgt. Das Peptid kann z. B. teilweise oder vollständig aktives IGF aus einem Komplex, in dem das IGF an ein IGFBP gebunden ist, ersetzen. Das Peptid unter dieser Definition kann ein IGFBP binden und möglicherweise dabei so wirken, dass das vorher an das IGFBP gebundene endogenen IGF ersetzt wird. Alternativ dazu kann es an eine Stelle, entfernt von der, die in den Rezeptorinteraktionen eingebunden ist, an IGF selbst binden, um so die Interaktion des IGF mit IGFBP zu inhibieren oder ihr vorzubeugen, aber nicht die Interaktion des IGF mit einem beliebigen seiner Rezeptoren zu inhibieren oder ihr vorzubeugen. Während das Peptid die IGFBP-3-Bindungsstelle besetzen wird, wird der Effekt auf den ternären Komplex mit ALS weiterhin davon abhängen, ob die binären Komplexe ternäre ausbilden können. Peptide, die mit dem ALS des ternären Komplexes Komplexe ausbilden können, werden IGFs ersetzen, aber nicht die Konzentration an IGFBP-3 oder der ternären Komplexe beeinflussen. Peptide, die mit ALS keine Komplexe ausbilden können, werden IGFBP-3 besetzen, und die Menge an ALS/IGFBP-3/IGF-Komplex wird reduziert werden. Bevorzugt ist das IGFBP-Ersatzpeptid ein IGFBP-3- oder IGFBP-1-Ersatzpeptid.
Ein Peptid, das „an IGFBP-3 bindet" oder „an IGFBP-1 bindet" betrifft ein Peptid, das IGFBP-3 oder IGFBP-1 mindestens zu einem gewissen Grad, ob mit hoher Affinität oder nicht, bindet.
Wie hierin verwendet, bezeichnet „humaner IGF-Rezeptor" einen beliebigen im Menschen gefundenen Rezeptor für ein IGF und schließt die Typ-1- und Typ-2-IGF-Rezeptoren im Menschen, an die Human-IGF-1, als auch -IGF-2 binden, ein, wie z. B. den Plazenta-Typ1-IGF-1-Rezeptor usw.
Ein Peptid, das „nicht an einen humanen IGF-Rezeptor bindet" bindet überhaupt nicht an irgendeinen solchen Rezeptor, oder bindet an einen solchen Rezeptor mit einer mehr als etwa 200-fach niedrigeren Affinität als Wildtyp Human IGF-1 (hIGF-1) oder Wildtyp Human IGF-2 (hIGF-2) an einen solchen Rezeptor bindet. Bevorzugt bindet das Peptid an einen solchen Rezeptor mit einer Affinität von mehr als etwa 250-fach weniger als Wildtyp Human IGF-1 oder Human IGF-2 an den gleichen Rezeptor bindet, oder bindet diesen überhaupt nicht.
Der Begriff „Knorpelstörung" bezeichnet eine beliebige Verletzung oder Beschädigung von Knorpel und eine Sammlung von Erkrankungen, die durch Symptome von Schmerz, Steifheit und/oder Einschränkung der Bewegung der betroffenen Körperteile manifestiert ist. Innerhalb des Bereiches von „Knorpelstörungen" sind „degenerative Störungen des Knorpels" eingeschlossen, was eine Sammlung von Störungen ist, die zumindest teilweise charakterisiert ist durch Abbau oder Stoffwechselstörungen des Bindegewebes des Körpers, einschließlich nicht nur der Gelenke oder betroffenen Strukturen, einschließlich Muskeln, Schleimbeutel (synoviale Membran), Sehnen und Fasergewebe, sondern auch der Wachstumsplatte, das Meniskussystems und der Bandscheiben.
In einer Ausführungsform schließt der Begriff „degenerative Störungen des Knorpels" „artikuläre Knorpelstörungen" ein, die durch eine Zersetzung der glatten artikulären Knorpeloberfläche und Abbau der Knorpelmatrix charakterisiert sind. Zusätzliche Symptomatiken schließen Stickstoffmonoxiderzeugung und Inhibition oder Reduktion der Matrixsynthese ein. Im Bereich von „artikulären Knorpelstörungen" eingeschlossen sind OA und RA. Beispiele für degenerative Störungen des Knorpels schließen systemischen Lupus erythematosus und Gicht, Amyloidose oder Felty's Syndrom ein. Zusätzlich deckt der Begriff die mit psoriatischer Arthritis verbundene Knorpeldegradation und -zersetzung, Nierenstörungen, Osteoarthrose, akute Entzündung (z. B. Yersinia Arthritis, Pyrophosphat Arthritis, Gichtarthritis (arthritis urica) und septische Arthritis), Arthritis, verbunden mit Trauma, Collitis ulcerosa (z. B. Morbus Crohn), multiple Sklerose, Diabetes (z. B. insulinabhängige und nichtinsulinabhängige), Fettleibigkeit, Riesenzellarthritis und Sjörgen's Syndrom ein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Störung ein Mikroschaden oder eine Aufprallverletzung, eine chondrale Fraktur oder eine osteochondrale Fraktur.
„Osteoarthrits" oder „OA" definiert nicht eine einzelne Störung, sondern den letztlichen gemeinsamen Weg der Gelenkszersetzung resultierend aus multiplen Prozessen. OA ist charakterisiert durch lokale asymmetrische Zersetzung des Knorpels entsprechend mit tastbaren Knochenvergrößerungen an den Gelenksbegrenzungen. OA beeinträchtigt typischerweise die interphalingialen Gelenke der Hände, das erste carpometacarpale Gelenk, die Hüften, die Knie, das Rückgrat und einige Gelenke im Mittelfuß, während große Gelenke, wie z. B. Knöchel, Ellbogen und Schultern eher unbetroffen sind. OA kann mit Stoffwechselerkrankungen, wie z. B. Hämochromatose und Alkaptonurie, Entwicklungsanomalien, wie z. B. Entwicklungsdysplasie der Hüften (kongenitale Dislokation der Hüften), Unterschieden in den Beinlängen, einschließlich Trauma und entzündliche Arthrididen, wie z. B. Gicht, septische Arthritis und neuropathische Arthritis, verbunden sein. OA kann sich auch nach verlängerter mechanischer Instabilität, wie z. B. resultierend aus Sportverletzungen oder Fettleibigkeit, entwickeln.
„Rheumatoide Arthritis” oder „RA" ist eine systemische, chronische Autoimmunstörung, charakterisiert durch symmetrische Synovitis des Gelenks und beeinträchtigt gleichermaßen kleine und große diarthroide Gelenke. Wenn RA fortschreitet, können die Symptome Fieber, Gewichtsverlust, Ausdünnen der Haut, Multiorganmitleidenschaft, Skleritis, Hornhautgeschwüre, die Ausbildung von subkutanen oder subperiostealen Knötchen und sogar vorzeitigen Tod umfassen. Die Symptome von RA erscheinen oft während der Jugend und können Vaskulitis, Atrophie der Haut und des Muskels, subkutane Knötchen, Lymphadenopathie, Splenomegalie, Leukopänie und chronische Anämie einschließen.
„Behandlung" ist ein mit der Absicht des Vorbeugens der Entwicklung oder des Veränderns der Pathologie einer Störung durchgeführtes Eingreifen. Dementsprechend bezeichnet „Behandlung" sowohl therapeutische Behandlung als auch prophylaktische oder präventive Maßnahmen, wobei es das Ziel ist, dem anvisierten pathologischen Zustand oder der Störung vorzubeugen oder sie zu verlangsamen (abschwächen). Behandlungsbedürftige schließen solche, die bereits die Störung haben, wie auch solche, bei denen der Störung vorzubeugen ist, ein. In der Behandlung einer degenerativen Störung des Knorpels kann ein therapeutisches Mittel direkt das Ausmaß des Ansprechens einer pathologischen Komponente der Störung erniedrigen oder erhöhen, oder die Erkrankung zugänglicher für die Behandlung durch andere therapeutische Mittel machen, z. B. Antibiotika, Antimykotika, antiinflammatorische Mittel, Chemotherapeutika, etc. Der Begriff „Behandlung" schließt ein Verfahren zur Prävention von anfänglicher oder fortgeschrittener Schädigung oder Erkrankung von Gelenken durch degenerative Störungen des Knorpels und/oder Verletzungen ein.
Der Begriff „effektive Menge" ist die minimal wirksame Konzentration des IGF-Analogons oder IGFBP-Ersatzpeptids, wie hierin dargelegt. Dies schließt die minimale Konzentration eines solchen Proteins oder Peptids ein, das entweder eine bestimmbare Verbesserung oder Wiederherstellung von geschädigtem Knorpel oder einen messbaren Schutz vor fortgesetzter oder induzierter Knorpelzerstörung, wie z. B. die Inhibition der Synthese oder Verlust von Proteoglycanen aus Knorpelgewebe, bewirkt, induziert oder darin resultiert.
„Knorpelwachstumsfaktor" betrifft wie hierin verwendet, (ein) Mittel, außer einem IGF-1-Analogon oder einem IGFBP-Ersatzpeptid wie hierin identifiziert, das in einer Verbesserung in dem Zustand oder Schutz vor anfänglicher oder fortgeschrittener Zerstörung der Knorpelsubstanz gegenüber Schäden durch entweder Verletzungen oder eine degenerative Störung des Knorpels bewirkt, induziert oder darin resultiert. Solche Knorpelwachstums faktoren schließen insulinähnliche Wachstumsfaktoren (insulin-like gowth factors) (z. B. IGF-1, IGF-2), (Platelet-Derived Growth Factors; PDGFs), (Bone Morphogenic Proteins; BMPs), Transforming Growth Factor-βs (1–3), Mitglieder der Epidermal-Growth-Factor-Familie (z. B. EGF, HB-EGF, TGF-α) und Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (fibroblast growth factors; FGFs) ein.
„Knorpelkatabolismusantagonisten" sind solche Mittel, die die Aktivität oder den Effekt von Molekülen, die mit der Knorpelzersetzung verbunden sind oder diese verstärken, inhibieren, abschwächen oder in sonstiger Weise blockieren. IL1α und Stickstoffmonoxid (NO) sind zum Beispiel mit Knorpelzersetzung verbundene bekannte Mittel. Daher würden direkte (IL1ra) oder indirekte (IL-4 oder IL-10) Inhibitoren von IL-1α oder andere inflammatorische Zytokine (z. B. TNF-α) und NO-Erzeugung als „Knorpelkatabolismusantagonisten" betrachtet werden. Des Weiteren würden auch Antagonisten des Chondrozytenkatabolismus (z. B. Natriumpentosanpolysulfat, Glukosamin (und Varianten davon, wie z. B. Mannosamin) oder Chondroitinsulfat, Tetracyclin, Hyaluronan) auch als Knorpelkatabolismusantagonisten betrachtet werden. Ebenfalls eingeschlossen sind Mittel, die den Katabolismus von Knorpel indirekt inhibieren, z. B. durch ihre Effekte auf den darunter liegenden subchondralen Knochen (z. B. Biphosphonate oder Osteoprotegerin) (OPG)).
„Chronische" Verabreichung betrifft die Verabreichung von dem/den Mittel(n) in einem fortlaufenden Modus, im Gegensatz zu einem akuten Modus, um den anfänglichen therapeutischen Effekt (Aktivität) für einen verlängerten Zeitraum zu erhalten. „Unterbrechende" Verabreichung ist eine Behandlung, die nicht fortlaufend ohne Unterbrechung ist, sondern eher von zyklischer Natur ist.
Wie hierin verwendet bezeichnet „Säugetier" für Zwecke der Behandlung ein beliebiges Tier, das als Säugetier klassifiziert ist, einschließlich Menschen, Haus- und Farmtiere, und Zoo-, Sport- oder Kleinhaustiere, wie z. B. Hunde, Pferde, Katzen, Schafe, Schweine, Kühe, etc. Das bevorzugte Säugetier hierin ist ein Mensch. Der Begriff „nicht erwachsen" betrifft Säugetiere, die vom Zeitpunkt der Geburt (wie z. B. Säuglinge mit niedrigem Geburtsgewicht) bis zum Alter der Pubertät reichen, letzterer als solche, die noch nicht ihr volles Wachstumspotential erreicht haben.
Verabreichung „in Kombination mit" einem oder mehreren weiteren therapeutischen Mittel(n) schließen eine simultane (gleichzeitige) und aufeinander folgende Verabreichung in einer beliebigen Reihenfolge ein.
„Träger", wie hierin verwendet, schließen pharmazeutisch verträgliche Träger, Hilfsstoffe, oder Stabilisatoren, die bezüglich der Zelle oder dem Säugetier, die bei den angewendeten Dosen und Konzentrationen dazu ausgesetzt wurden, nicht toxisch sind. Der physiologisch verträgliche Träger ist oft eine wässrige pH gepufferte Lösung. Beispiele für physiologisch verträgliche Träger schließen Puffer wie z. B. Phosphat, Zitrat, und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure; Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste); Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Gelatin, oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin, oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glukose, Mannose, oder Dextrine; Chelat bildende Mittel, wie z. B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z. B. Mannitol oder Sorbitol; salzbildende Gegenionen, wie z. B. Natrium; Hyaluronsäure; und/oder nicht-ionische Tenside, wie z. B. TWEEN^TM, Polyethylenglycol (PEG) und PLURONICS^TM ein.
Ein „Liposom" ist ein kleines Vesikel, bestehend aus zahlreichen Lipidtypen, Phospholipiden und/oder Tensiden, das für die Abgabe eines Wirkstoffes (wie z. B. das hierin offenbarte IGF-1-Analogon oder IGFBP-Ersatzpeptid) an ein Säugetier nützlich ist. Die Bestandteile des Liposoms sind gemeinsam in einer Bilayer Formation angeordnet, ähnlich zu der Lipidanordnung von biologischen Membranen.
Der Begriff Formulierungen mit „verlängerte Freisetzung” oder „anhaltende Freisetzung" in dem breitesten möglichen Sinn bedeutet eine Formulierung von dem hierin identifizierten aktiven IGF-1-Analogon oder IGFBP-Ersatzpeptid, resultierend in der Freisetzung oder Aktivierung des aktiven Analogons oder Peptids für einen anhaltenden oder verlängerten Zeitabschnitt - oder mindestens für einen Zeitabschnitt der länger ist als wenn das Analogon oder Peptid in dem nativen oder unformulierten Zustand in vivo zugänglich gemacht werden würde. Wahlweise erfolgt die verlängert freisetzende Formulierung bei einer konstanten Rate und/oder resultiert in einer anhaltenden und/oder kontinuierlichen Konzentration des hierin aktiven Mittels. Geeignete verlängert freisetzende Formulierungen können Mikrokapseln, semipermeable Matrizen von hydrophoben Festpolymeren, biologisch abbaubaren Polymeren, biologisch abbaubaren Hydrogele, Suspensionen, oder Emulsionen (z. B. Öl-in-Wasser oder Wasser-in-Öl) umfassen. Wahlweise umfasst die verlängert freisetzende Formulierung Poly(Lactit-Co-Glycolit)Säure (PLGA) und kann wie beschrieben in Lewis, „Controlled Release of Bioactive Agents form Lactide/Glycolide polymer," in Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, M. Chasin und R. Langeer, Hrsg. (Marcel Dekker, New York), S. 1–41, zubereitet werden. Wahlweise ist die verlängert freisetzende Formulierung stabil und die Aktivität des hierin definierten IGF-1-Analogons oder IGFBP-Ersatzpeptids nimmt mit der Lagerungszeit nicht merklich ab. Noch spezifischer kann die Stabilität durch das Vorhandensein von einem stabilisierenden Mittel, wie z. B. ein wasserlösliches mehrwertiges Metallsalz, verstärkt werden.
Wie hierin verwendet betrifft „IGF-1" den insulin-like growth factor-1 aus einer beliebigen Spezies, einschließlich Rind, Schaf, Schwein, Pferd und Mensch, bevorzugt Mensch, und, wenn Bezug nehmend auf exogene Verabreichung, aus einer beliebigen Quelle, entweder natürlich, synthetisch, oder rekombinant. Humanes IGF-1 „mit der nativen Sequenz", die Sequenz, die in 16 (SEQ ID NO. 3) gezeigt ist, wird hergestellt, z. B. durch das Verfahren beschrieben in EP 230,869 , veröffentlicht am 5. August 1987; EP 128,733 , veröffentlicht am 19. Dezember 1984; oder EP 288,451 , veröffentlicht am 26. Oktober 1988. Stärker bevorzugt wird dieses IGF-1 mit nativer Sequenz rekombinant hergestellt.
Wie hierin verwendet, bezeichnet „IGF-2" insulin-like growth factor-2 aus einer beliebigen Spezies, einschließlich Rind, Schaf, Schwein, Pferd und Mensch, bevorzugt Mensch, und, wenn Bezug nehmend auf exogene Verabreichung, aus einer beliebigen Quelle, entweder natürlich, synthetisch oder rekombinant. Es kann durch das z. B. in EP 128,733 beschriebene Verfahren hergestellt werden.
Ein „IGFBP" oder ein „IGF Bindungsprotein" betrifft ein Protein oder Polypeptid, das normalerweise mit oder gebunden oder komplexiert an IGF-1 oder IGF-2, ob es zirkulatorisch (d. h. im Serum oder Gewebe) ist, oder nicht, assoziiert ist. Solch Bindungsproteine schließen nicht Rezeptoren ein. Diese Definition schließt IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6, Mac 25 (IGFBP-7) und prostacyclin-stimulating factor (PSF) oder endothelial cell-specific molecule (ESM-1), als auch andere Proteine mit hoher Homologie bzgl. IGFBPs ein. Mac 25 ist z. B. beschrieben in Swisshelm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 4472–4476 (1995) und Oh et al., J. Biol. Chem., 271: 30322–30325 (1996). PSF ist beschrieben in Yamauchi et al., Biochemical Journal, 303: 591–598 (1994). ESM-1 ist beschrieben in Lassalle et al., J. Biol. Chem., 271: 20458–20464 (1996). Für andere identifizierte IGFBPs, siehe z. B. EP 375,438 , publiziert am 27. Juni 1990; EP 369,943 , publiziert am 23. Mai 1990; WO 89/09268 , publiziert am 5. Oktober 1989; Wood et al., Molecular Endocrinology, 2: 1176–1185 (1988); Brinkman et al., The EMBO J., 7: 2417–2423 (1988); Lee et al., Mol. Endocrinol., 2: 404–411 (1988); Brewer et al., BBRC, 152: 1289–1297 (1988); EP 294,021 , publiziert am 7. Dezember 1988; Baxter et al., BBRC, 147: 408–415 (1987); Leung et al., Nature, 330: 537–543 (1987); Martin et al., J. Biol. Chem., 261: 8754–8760 (1986); Baxter et al., Corp. Biochem. Physiol., 91B: 229– 235 (1988); WO 89/08667 , publiziert am 21. September 1989; WO89/09792 , publiziert am 19. Oktober 1989; und Binkert et al., EMBO J., 8: 2497–2502 (1989).
Der Begriff „säurelabile Untereinheit" oder „ALS" betrifft ein 85-kDa Glycoprotein, das einen ternären Komplex mit IGF-1 und IGFBP-3 oder IGFBP-5 ausbildet. Siehe z. B. Bach und Rechler, Diabetes Reviews, 3: 38–61 (1995); Clemmons, Cytokine Growth Factor Rev., 8: 45–62 (1997); und Jones und Clemmons, Endocr. Rev., 16: 3–34 (1995).
II. Formen zum Ausführen der Erfindung
Die Erfindung betrifft hierin die Verwendung eines IGF-1-Analogons wie in den Ansprüchen und oben definiert, um Knorpelstörungen, bevorzugt degenerative Störungen des Knorpels, einschließlich dem Regenerieren und/oder Vorbeugen des Knorpelabbaus zu behandeln.
Beispiele für IGF-1-Analoga mit einer Bindungsaffinitätspräferenz für IGFBP-3 im Vergleich zu IGFBP-1 schließen eine IGF-1-Variante ein, wobei die Aminosäure(n) des Wildtyp Human-IGF-1 an der Position 3, 7, 10, 16, 25 oder 49 oder an den Positionen 3 und 49 des Human-IGF-1 mit der nativen Sequenz mit einem Alanin, einem Glycin, und/oder einem Serinrest ausgetauscht sind. Bevorzugt ist eine oder beide der fraglichen Aminosäuren durch ein Alanin oder Glycinrest substituiert, am meisten bevorzugt Alanin. Das stärker bevorzugte IGF-1-Analogon mit solcher Bindungsaffinitätspräferenz ist hierin F49A, F49G, F49S, E3A, E3G, E3S, E3AF49A, E3AF49G, E3AF49S, E3GF49A, E3GF49G, E3GF49S, E3SF49A, E3SF49G, E3SF49S, F16A, F16G, F16S, F16AF49A, F16GF49A, F16SF49A, F16AF49S, F16AF49G, F16SF49S, F16SF49G, F16GF49S oder F16GF49G.
Beispiele für IGF-1-Analoga mit einer Bindungsaffinitätspräferenz für IGFBP-1 im Vergleich zu IGFBP-3 schließen eine IGF-1-Variante ein, wobei die Aminosäure(n) des Wildtyp Human-IGF-1 an Position 9, 12, 15 oder 20 mit einem Lysin- oder Argininrest ausgetauscht ist/sind. Das stärker bevorzugte IGF-1-Analogon mit solch Bindungsaffinitätspräferenz hierin ist D12K oder D12R. Hierin beschrieben sind auch IGFBP-3-Ersatzpeptide, die der Interaktion von IGF mit IGFBP-3 oder IGFBP-1 vorbeugen und nicht an einen humanen IGF-Rezeptor binden, was ein Peptid einschließt, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

wo das C* ein Cystein andeutet, das mit einem anderen Cystein in dem Peptid verknüpft ist. Die restlichen Cysteinpaare werden auch als Disulfide in jedem Peptid oxidiert. Das stärker bevorzugte IGFBP-3-Ersatzpeptid hierin ist BP3-15, BP3-39, BP3-40, BP3-01-OX, BP3-27, BP3-28, BP3-30, BP3-41 oder 4D3.3P.
Beispiele für hierin beschriebene IGFBP-1-Ersatzpeptide schließen ein Peptid ein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

wo das C* ein Cystein bezeichnet, das mit einem anderen Cystein in dem Peptid verknüpft wurde, und die restlichen Cysteinpaare auch als Disulfide in jedem Peptid oxidiert wurden.
Die noch stärker bevorzugten aktiven Mittel hierin sind F49A, E3A, F16A, E3AF49A, F16AF49A, D12K und D12R; und die am stärksten bevorzugten sind F49A, E3AF49A, F16AF49A, D12K und D12R.
Die in Einklang mit dieser Erfindung nützlichen IGF-1-Analoga und die IGFBP-Ersatzpeptide können nach einer beliebigen Art, die im Stand der Technik bekannt ist, einschließlich chemischer Synthese oder rekombinanter Herstellung, hergestellt werden. Chemische Synthese, insbesondere Festphasensynthese, ist für kurze (z. B. weniger als 50 Reste) Peptide oder für solche, die nicht-natürliche oder unübliche Aminosäuren, wie z. B. D-Tyr, Ornithin, Aminoadipinsäure und dergleichen enthalten, bevorzugt. Rekombinante Vorgehensweisen werden für längere Polypeptide bevorzugt. Wenn rekombinante Vorgehensweisen ausgewählt werden, kann ein synthetisches Gen de novo konstruiert werden, oder ein natürliches Gen kann z. B. durch Kassettenmutagenese mutiert werden. Nachstehend sind exemplarisch allgemeine rekombinante Vorgehensweisen.
Aus einem aufgereinigten IGF-1 und seiner Aminosäuresequenz, z. B. einer IGF-Variante, die eine Peptidylmutante von einem parentalen IGF-1-Molekül ist, kann unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken hergestellt werden. Diese Techniken erwägen in vereinfachter Form, Nehmen des Gens, entweder natürlich oder synthetisch, Kodieren des Analgons; Einfügen dessen in einen passenden Vektor; Einfügen des Vektors in eine passende Wirtszelle; Kultivieren der Wirtszelle, um die Expression des Gens zu veranlassen; und Rückgewinnen oder Isolieren des dabei hergestellten Analogons. Bevorzugt wird das rückgewonnene Analogon zu einem geeigneten Grad aufgereinigt.
Noch weiter insbesondere wird die ein Peptidyl-IGF-Variante kodierende DNA-Sequenz so kloniert und manipuliert, dass sie in einem geeigneten Wirt exprimiert werden kann. Parentale Polypeptide kodierende DNA kann aus einer Genbank, aus cDNA, die aus mRNA aus Zellen, die das parentale Polypeptid exprimieren, abgeleitet wurden, oder durch synthetisches Konstruieren der DNA-Sequenz erhalten werden (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe), Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., 1989).
Die parentale DNA wird dann in ein passendes Plasmid oder Vektor, der dazu verwendet wird eine Wirtszelle zu transformieren, eingefügt. Im Allgemeinen werden Plasmidvektoren, die Replikations- und Kontrollsequenzen enthalten, die aus Spezies abgeleitet wurden, die mit der Wirtszelle kompatibel sind, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor trägt gewöhnlich eine Replikationsstelle, als auch Sequenzen, die Proteine oder Peptide kodieren, die zum Bereitstellen einer phänotypischen Selektion in transformierten Zellen fähig sind.
Zum Beispiel kann E. coli unter Verwendung von pBR322, einem aus einer E.-coli-Spezies abgeleiteten Plasmid, transformiert werden (Mandel et al., J. Mol. Biol. 53: 154 (1970)). Plasmid pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz, und stellt daher einfache Mittel der Selektion bereit. Andere Vektoren schließen unterschiedliche Merkmale, wie z. B. unterschiedliche Promotoren ein, die oft in der Expression wichtig sind. Plasmide pKK223-3, pDR720 und pPL-lambda stellen z. B. Expressionsvektoren mit dem tac-, trp- oder P_L-Promotoren dar, die zurzeit erhältlich sind (Pharmacia Biotechnologe).
Ein bevorzugter Vektor ist pB0475. Dieser Vektor enthält Replikationsursprünge für Phagen und E. coli, die es ihm erlauben, zwischen diesen Wirten zu pendeln, wodurch Mutagenese als auch Expression ermöglicht wird (Cunningham et al., Science, 243: 1330–1336 (1989); US-Pat. Nr. 5,580,723 ). Andere bevorzugte Vektoren sind pR1T5 und pR1T2T (Pharmacia Biotechnology). Diese Vektoren enthalten geeignete Promotoren, gefolgt von der Z-Domäne des Proteins A, das den in den Vektoren eingefügten Genen erlaubt, als Fusionsproteine exprimiert zu werden.
Andere bevorzugte Vektoren können unter Verwendung von Standardtechniken durch Kombinieren der notwendigen Eigenschaften der oben beschriebenen Vektoren konstruiert werden. Relevante Elemente schließen den Promotor, die Ribosomenbindungsstelle, das Decorsin- oder Ornatingen oder Genfusion (die Z-Domäne von Protein A und Decorsin oder Ornatin und ihre Linker), die Antibiotikaresistenzmarker und die geeigneten Replikationsursprünge ein.
Die Wirtszelle kann prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Prokaryoten sind zum Klonieren und Exprimieren der DNA-Sequenzen, um die parentalen IGF-1-Polypeptide, segmentsubstituierten Peptide, Reste-substituierte Peptide und Peptidvarianten herzustellen, bevorzugt.
Zum Beispiel kann der E.-coli-K12-Stamm 294 (ATCC Nr. 31446), als auch E. coli B, E. coli X1776 (ATCC Nr. 31537), und E. coli c600 und c600 hfl, E. coli W3110 (F-, gamma-, prototroph/ATCC Nr. 27325), Bacilli, wie z. B. Bacillus subtilis, und andere Enterobacteriacea, wie z. B. Salmonella typhimurium oder Serratia marcesans und zahlreiche Pseudomonas Arten verwendet werden. Der bevorzugte Prokaryot ist E. coli W3110 (ATCC 27325). Wenn die Analoga oder Peptide durch Prokaryoten exprimiert werden, enthalten Sie typischerweise ein N-terminales Methionin oder ein Formylmethionin und sind nicht glycosyliert. Im Falle von Fusionsproteinen befindet sich das N-terminale Methionin oder Formylmethionin am Aminoterminus des Fusionsproteins oder der Signalsequenz des Fusionsproteins. Diese Beispiele sind natürlich beabsichtigt, eher illustrativ als beschränkend zu sein.
Zusätzlich zu Prokaryoten können auch eukaryotische Organismen, wie z. B. Hefekulturen oder Zellen, die aus multizellulären Organismen abgeleitet wurden, verwendet werden. Im Prinzip ist eine beliebige solche Zellkultur praktikabel. Das größte Interesse lag jedoch in Vertebratenzellen, und Vermehren von Vertebratenzellen in der Kultur (Gewebekultur) ist eine reproduzierbare Vorgehensweise geworden. Tissue Culture, Academic Press, Kruse und Patterson, Herausgeber (1973). Beispiele für solche verwendbaren Wirtszellen sind VERO- und HeLa-Zellen, Chinese Hamster Ovary (CHO) Zelllinien, W138-, 293-, BHK-, COS-7- und MDCK-Zelllinien.
Eine Variation der obenstehenden Vorgehensweise erwägt auch die Verwendung von Genfusionen, wobei das gewünschte Analogon oder Peptid kodierende Gen in dem Vektor mit einem anderen Protein oder einem Fragment eines anderen proteinkodierenden Gens assoziiert ist. Dies resultiert darin, dass das gewünschte Analogon oder Peptid als eine Fusion mit einem anderen Protein oder Peptid durch die Wirtszelle hergestellt wird. Das „andere" Protein oder Peptid ist oft ein Protein oder Peptid, das von der Zelle sekretiert werden kann, was es ermöglicht, das gewünschte Analogon oder Peptid aus dem Zellkulturmedium zu isolieren und aufzureinigen, und die Notwendigkeit des Zerstörens der Wirtszellen ausschließt, die auftritt, wenn das gewünschte Analogon oder Peptid in der Zelle verbleibt. Alternativ dazu kann das Fusionsprotein intrazellulär exprimiert werden. Es ist nützlich, Fusionsproteine zu verwenden, die hoch exprimiert werden.
Die Verwendung von Genfusionen, wenn auch nicht notwendig, kann die Expression von heterologen Analoga und Peptiden in E. coli, als auch die nachfolgende Aufreinigung dieser Genprodukte ermöglicht (Harris, in Genetic Engineering, Williamson, R., Hrsg. (Academic Press, London, Band 4, 1983), S. 127; Ljungquist et al., Eur. J. Biochem., 186: 557–561 (1989) und Ljungquist et al., Eur. J. Biochem., 186: 563–569 (1989)). Protein A Fusionsproteine werden oft verwendet, weil die Bindung von Protein A, oder noch spezifischer der Z-Domäne des Proteins A, an IgG einen „Affinitätsgriff" für die Aufreinigung des fusionierten Proteins bereitstellt. Es wurde auch schon gezeigt, dass viele heterologe Proteine degradiert werden, wenn sie direkt in E-coli exprimiert werden, aber stabil sind, wenn sie als Fusionsproteine exprimiert werden (Marston, Biochem J., 240: 1 (1986)).
Fusionsproteine können unter Verwendung von Chemikalien, wie z. B. Bromcyan, welches an einem Methionin spaltet, oder Hydroxylamin, welches zwischen einem Asn- und Gly-Rest spaltet, gespalten werden. Unter Verwendung von rekombinanter Standard-DNA-Methodik können Nukleotidbasenpaare, die diese Aminosäuren kodieren, vor das 5'-Ende des gewünschten analogon- oder peptidkodierenden Gens eingefügt werden.
Alternativ dazu kann man auch eine proteolytische Spaltung von Fusionsproteinen anwenden (Carter, in Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes, Ladisch et al., Herausgeber (American Chemical Society Symposium Series No. 427, 1990), Kapitel 13, Seiten 181–193).
Proteasen, wie z. B. Faktor Xa, Thrombin und Subtilisin oder ihre Mutanten, und eine Anzahl von anderen, wurden erfolgreich zum Spalten von Fusionsproteinen verwendet. Typischerweise wird ein Peptidlinker, der für die Spaltung durch die verwendete Protease zugänglich ist, zwischen dem „anderen" Protein (z. B. der Z-Domäne des Proteins A) und dem gewünschten Analogon oder Peptid eingefügt. Unter Verwendung rekombinanter DNA-Methodik, werden die den Linker kodierenden Nukleotidbasenpaare zwischen den Genen oder Genfragmenten, die die anderen Proteine kodieren, eingefügt.
Proteolytische Spaltung des teilweise aufgereinigten Fusionsproteins, das den richtigen Linker enthält, kann dann entweder mit dem nativen Fusionsprotein, oder dem reduzierten oder denaturierten Fusionsprotein durchgeführt werden.
Das Analogon oder Peptid kann oder kann nicht richtig gefaltet sein, wenn es als ein Fusionsprotein exprimiert wird. Der spezifische Peptidlinker, der die Spaltstelle enthält, kann oder kann nicht für die Protease zugänglich sein. Diese Faktoren bestimmen, ob das Fusionsprotein denaturiert und rückgefaltet werden muss, und wenn, ob diese Verfahren vor oder nach der Spaltung angewendet werden. Wenn Denaturieren und Rückfalten notwendig sind, wird das Analogon oder Peptid typischerweise mit einem Chaotropen behandelt, wie z. B. Guanidin-HCl. Dann wird es mit einem Redoxpuffer behandelt, der z. B. reduziertes und oxidiertes Dithiothreitol oder Glutathion in den passenden Verhältnissen, pH und Temperatur enthält, so dass das Analogon oder Peptid in seine native Struktur zurückgefalten wird.
Wenn Analoga und Peptide nicht unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie zubereitet werden, werden sie bevorzugt unter Verwendung von Festphasensynthese zubereitet, wie z. B. im Allgemeinen beschrieben durch Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1963), obwohl andere im Stand der Technik bekannte äquivalente Synthesen anwendbar sind. In vitro Proteinsynthese kann unter Verwendung manueller Techniken oder Automation durchgeführt werden. Automatisierte Synthese kann z. B. unter Verwendung eines Applied Bioystems Peptide Synthesizer (Foster City, CA), unter Befolgen der Anleitungen des Herstellers, erreicht werden. Zahlreiche Teile des Analogons oder Peptids können getrennt chemisch synthetisiert und unter Verwendung chemischer oder enzymatischer Verfahren kombiniert werden, um das Analogon oder Peptid in voller Länge herzustellen.
Festphasensynthese wird von dem C-Terminus des Analogons oder Peptids durch Koppeln einer geschützten α-Aminosäure an ein geeignetes Harz begonnen. Solch ein Ausgangsmaterial kann durch Anfügen einer α-aminogeschützten Aminosäure durch eine Esterbindung an ein chlormethyliertes Harz oder ein Hydroxymethylharz, oder durch eine Amidbindung an ein BHA-Harz oder MBHA-Harz zubereitet werden. Die Zubereitung des Hydroxymethylharzes ist beschrieben durch Bodansky et al., Chem. Ind. (London), 38: 1597–1598 (1966). Chlormethylierte Harze sind kommerziell erhältlich von BioRad Laborstories, Richmond, CA und von Lab. Systems, Inc. Die Herstellung solch eines Harzes ist beschrieben durch Stewart et al., „Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman and Co., San Francisco 1969), Kapitel 1, Seiten 1–6. BHA- und MBHA-Harzträger sind kommerziell erhältlich und werden im Allgemeinen nur verwendet, wenn das synthetisierte Analogon oder Peptid ein unsubstituiertes Amid am C-Terminus hat.
Die Aminosäuren werden an die Analogon-/Peptidkette gekoppelt unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Techniken für die Ausbildung von Peptidbindungen. Ein Verfahren bezieht das Umwandeln der Aminosäure in ein Derivat, das die Carboxylgruppe für eine Reaktion mit der freien N-terminalen Aminogruppe des Peptidfragments zugänglicher macht, ein. Die Aminosäure kann z. B. in ein gemischtes Anhydrid durch Reaktion von einer geschützten Aminosäure mit Chlorameisensäureethylester, Chlorameisensäurephenylester, Sec-Butylchlorformiat, Isobutylchlorformiat, Pivaloylchlorid oder ähnliche Säurechloride umgewandelt werden. Alternativ dazu kann die Aminosäure zu einem Aktivester, wie z. B. einem 2,4,5-Trichlorphenylester, einem Pentachlorphenylester, einem Pentafluorphenylester, einem p-Nitrophenylester, einem N-Hydroxysuccinimidester oder einem aus 1-Hydroxybenzotriazol gebildeten Ester umgewandelt werden.
Ein anderes Koppelungsverfahren bezieht die Verwendung eines geeigneten Koppelungsmittels, wie z. B. N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid oder N,N'-Diisopropylcarbodiimid, ein. Andere geeignete, dem Fachmann ersichtliche Koppelungsmittel sind offenbart in E. Gross und J. Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biologe, Band I: Major Methods of Peptide Bond Formation (Academic Press, New York, 1979).
Es sollte beachtet werden, dass die α-Aminogruppe von jeder Aminosäure, die in der Analogon-/Peptidsynthese verwendet wird, während der Koppelungsreaktion geschützt sein muss, um Nebenreaktionen, die ihre aktive α-Aminofunktion einbeziehen, vorzubeugen. Es sollte auch beachtet werden, dass gewisse Aminosäuren reaktive funktionelle Gruppen der Seitenketten beinhalten (z. B. Thiol-, Amino-, Carboxyl- und Hydroxylgruppen) und dass solche funktionellen Gruppen auch mit geeigneten Schutzgruppen geschützt werden müssen, um eine chemische Reaktion aus dem Vorkommen an diesen Stellen während des Anfangsschrittes, wie auch während der folgenden Koppelungsschritten vorzubeugen. Geeignete, in der Technik bekannte Schutzgruppen, sind beschrieben in Gross und Meienho fer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology, Band 3: „Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis" (Academic Press: New York, 1981).
In der Auswahl einer speziellen Seitenkettenschutzgruppe, die beim Synthetisieren der Analoga/Peptide verwendet werden sollen, werden die folgenden allgemeinen Regeln befolgt. Eine α-Aminoschutzgruppe muss (a) die α-Aminofunktion unter den in der Koppelungsreaktion angewendeten Bedingungen inert machen, (b) bereitwillig nach der Koppelungsreaktion unter Bedingungen, die nicht die Seitenkettenschutzgruppen entfernen werden und nicht die Struktur des Analogon-/Peptidfragmentes verändern wird, entfernbar sein und (c) die Möglichkeit der Racemisierung nach Aktivierung unmittelbar vor dem Koppeln eliminieren. Eine Seitenkettenschutzgruppe muss (a) die funktionelle Gruppe der Seitenkette unter den in der Koppelungsreaktion angewendeten Bedingungen inert machen, (b) unter den beim Entfernen der α-Aminoschutzgruppe angewendeten Bedingungen stabil sein und (c) bereitwillig nach Fertigstellen des gewünschten Analogons/Peptids unter Reaktionsbedingungen, die nicht die Struktur der Analogon-/Peptidkette verändern wird, entfernbar sein. Dem Fachmann wird es ersichtlich sein, dass die für die Analogon-/Peptidsynthese als verwendbar bekannten Schutzgruppen in der Reaktivität mit den für ihre Entfernung angewendeten Mittel variieren werden. Manche Schutzgruppen, wie z. B. Triphenylmethyl und 2-(p-Biphenylyl)isopropyloxycarbonyl sind z. B. sehr labil und können unter milden salzsauren Bedingungen abgespalten werden. Andere Schutzgruppen, wie z. B. t-Butyloxycarbonyl (BOC), t-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und p-Methoxybenzyloxycarbonyl sind weniger labil und erfordern moderat starke Säuren für ihre Entfernung, wie z. B. Trifluoressigsäure, Salzsäure oder Bortrifluorid in Essigsäure. Noch andere Schutzgruppen, wie z. B. Benzyloxycarbonyl (CBZ oder Z), Halogenbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonylcycloalkyloxycarbonyl und Isopropyloxycarbonyl, sind noch weniger labil und erfordern stärkere Säuren für ihre Entfernung, wie z. B. Flusssäure, Bromwasserstoff oder Bortrifluoracetat in Trifluoressigsäure. Unter den Klassen von verwendbaren Aminosäureschutzgruppen sind eingeschlossen:

(1) Für eine α-Aminogruppe, (a) aromatische Urethan-Typ-Schutzgruppen, wie z. B. Fluorenylmethyloxycarbonyl (FMOC) CBZ und substitutierte CBZ, wie z. B. p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-6-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, und p-Methoxybenzyloxycarbonyl, o-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyloxycarbonyl und Ähnliche; (b) aliphatische Urethan-Typ-Schutzgruppen, wie z. B. BOC, t-Amyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl und Ähnliche; (c) Cycloalkylurethan-Typ-Schutzgruppen, wie z. B. Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxy carbonyl und Cyclohexyloxycarbonyl; und (d) Allyloxycarbonyl. Die bevorzugten α-Aminoschutzgruppen sind BOC oder FMOC.
(2) Für die in Lys vorhandenen Seitenkettenaminogruppen kann der Schutz durch eine beliebige der oben in (1) erwähnten Gruppen sein, wie z. B. BOC, p-Chlorbenzyloxycarbonyl, etc.
(3) Für die Guanidinogruppe von Arg kann der Schutz Nitro, Tosyl, CBZ, Adamantyloxycarbonyl, 2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl oder 2,3,6-Trimethyl-4-methoxyphenylsulfonyl oder BOC sein.
(4) Für die Hydroxylgruppe des Ser, Thr oder Tyr kann der Schutz z. B. durch C₁-C₄-Alkyl, wie z. B. t-Butyl; Benzyl (BZL); substituiertes BZL, wie z. B. p-Methoxybenzyl, p-Nitrobenzyl, p-Chlorbenzyl, o-Chlorbenzyl und 2,6-dichlorbenzyl sein.
(5) Für die Carboxylgruppe von Asp oder Glu kann der Schutz z. B. durch Veresterung unter Verwendung von Gruppen wie z. B. BZL, t-Butyl, Cyclohexyl, Cyclopentyl und dergleichen sein.
(6) Für den Imidazolstickstoff des His wird geeigneterweise der Tosylrest verwendet.
(7) Für die phenolische Hydroxylgruppe von Tyr wird geeigneterweise eine Schutzgruppe, wie z. B. Tetrahydropyranyl, tert-Butyl, Trityl, BZL, Chlorbenzyl, 4-Brombenzyl, oder 2,6-Dichlorbenzyl angewendet. Die bevorzugte Schutzgruppe ist 2,6-Dichlorbenzyl.
(8) Für die Seitenkettenaminogruppe von Asn oder Gln wird bevorzugt Xanthyl (Xan) angewendet.
(9) Für Met wird die Aminosäure bevorzugt ungeschützt gelassen.
(10) Für die Thiol-Gruppe von Cys wird typischerweise p-Methoxybenzyl angewendet.

Die C-terminale Aminosäure, z. B. Lys, wird an der N-Aminoposition durch eine passend ausgewählte Schutzgruppe geschützt, im Fall des Lys durch BOC. Das BOC-Lys-OH kann zuerst an das Benzhydrylamin oder an das chlormethylierte Harz, entsprechend zu der Vorgehensweise, dargelegt in Horiki et al., Chemistry Letters, 165–168 (1978), oder unter Verwendung von Isopropylcarbodiimid bei etwa 25°C für 2 Stunden mit Rühren, gekoppelt werden. Der Koppelung der BOC-geschützten Aminosäure an den Harzträger folgend wird die α-Schutzgruppe entfernt, wie durch Verwendung von Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan, oder TFA alleine. Die Entschützung wird bei einer Temperatur zwischen 0°C und Raumtemperatur durchgeführt. Andere Standardspaltreagenzien, wie z. B. HCl in Dioxan, und Bedingungen zum Entfernen von spezifischen α-Aminoschutzgruppen sind in der Literatur beschrieben.
Nach der Entfernung der α-Aminoschutzgruppe werden die verbleibenden α-Amino- und seitenkettengeschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Anordnung gekoppelt. Als eine Alternative zum separaten Hinzufügen jeder Aminosäure in der Synthese können manche vor dem Hinzufügen zu dem Festphasensynthesizer aneinander gekoppelt werden. Die Auswahl eines passenden Koppelungsreagens liegt innerhalb des Könnens des Standes der Technik. Insbesondere ist N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid oder Diisopropylcarbodiimid als ein Koppelungsreagens geeignet.
Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäuresequenz wird in den Festphasenreaktor im Überschuss eingeführt, und die Koppelung wird geeigneterweise in einer Umgebung von Dimethylformamid (DMF) oder CH₂Cl₂, oder Mischungen davon durchgeführt. Wenn unvollständige Koppelung erfolgt, wird die Koppelungsvorgehensweise vor der Entfernung der N-Aminoschutzgruppe vor dem Koppeln der nächsten Aminosäure wiederholt. Der Erfolg der Koppelungsreaktion kann bei jeder Stufe der Synthese überwacht werden. Ein bevorzugtes Verfahren zum Überwachen der Synthese ist die Ninhydrinreaktion, wie beschrieben durch Kaiser et al., Anal. Biochem., 34: 595 (1970). Die Koppelungsreaktionen können automatisch unter Verwendung wohlbekannter Verfahren z. B. einem BIOSEARCH-9500^TM-Peptide-Synthesizer durchgeführt werden.
Nach Vervollständigung der gewünschten Analogon-/Peptidsequenz muss das geschützte Analogon/Peptid von dem Harzträger gespalten werden, und alle Schutzgruppen müssen entfernt werden. Die Spaltreaktion und Entfernung der Schutzgruppen wird geeigneterweise gleichzeitig oder schrittweise vollzogen. Wenn der Harzträger ein chlormethyliertes Polystyrolharz ist, ist die Bindung, die das Analogon/Peptid mit dem Harz verankert, eine zwischen der freien Carboxylgruppe des C-terminalen Restes und einer der zahlreichen Chlormethylgruppen, die auf der Harzmatrix vorhanden sind, ausgebildete Esterbindungen. Es versteht sich, dass die verankernde Bindung durch Reagenzien gespalten werden kann, die bekannt sind, Esterbindungen zu brechen und die Harzmatrix penetrieren zu können.
Ein insbesondere zweckdienliches Verfahren ist die Behandlung mit flüssiger nicht wässriger Flusssäure. Dieses Reagens spaltet nicht nur das Analogon/Peptid von dem Harz, sondern entfernt auch alle Schutzgruppen. Die Verwendung dieses Reagens liefert daher direkt das vollständig ungeschützte Analogon/Peptid. Wenn das chlormethylierte Harz verwendet wird, resultiert Flusssäurebehandlung in der Ausbildung der freien Peptidsäuren. Wenn das Benzhydrylaminharz verwendet wird, resultiert Flusssäurebehandlung direkt in den freien Peptidaminen. Reaktion mit Flusssäure in Gegenwart von Anisol und Dimethylsulfid bei 0°C für eine Stunde entfernt gleichzeitig die Seitenkettenschutzgruppen und setzt das Analogon/Peptid von dem Harz frei.
Wenn es erwünscht ist das Analogon/Peptid ohne Entfernung der Schutzgruppen abzuspalten, kann das geschützte Analogon-/Peptidharz einer Methanolyse unterzogen werden, um das geschützte Analogon/Peptid, in dem die C-terminale Carboxylgruppe methyliert ist, zu erhalten. Der Methylester wird dann unter milden alkalischen Bedingungen hydrolisiert, um die freie C-terminale Carboxylgruppe zu ergeben. Die Schutzgruppen der Analogon-/Peptidkette werden dann durch Behandlung mit einer starken Säure entfernt, wie z. B. flüssiger Flusssäure. Eine besonders nützliche Technik für die Methanolyse ist die von Moore et al., Peptides, Proc. Fifth Amer. Peilt. Symp., M. Goodman und J. Meienhofer, Hrsg., (John Wiley, N. Y., 1977), Seiten 518–521, in der das geschützte Analogon-/Peptidharz mit Methanol und Kaliumcyanid in Gegenwart von Kronenether behandelt wird.
Ein anderes Verfahren zum Abspalten des geschützten Analogons/Peptids von dem Harz, wenn das chlormethylierte Harz verwendet wird, ist Ammonolyse oder durch Behandlung mit Hydrazin. Wenn gewünscht, kann das resultierende C-terminale Amid oder Hydrazid zum freien C-terminalen Carboxylrest hydrolysiert werden, und die Schutzgruppen können konventionell entfernt werden.
Es ist auch zu verstehen, dass die an der N-terminalen α-Aminogruppe vorhandene Schutzgruppe bevorzugt entweder bevor oder nachdem das geschützte Analogon/Peptid von der Säule gespalten wird, entfernt wird.
Aufreinigung der Analoga der Erfindung und der oben beschriebenen Peptide wird typischerweise unter Verwendung von konventionellen Vorgehensweisen, wie z. B. präparativer HPLC (einschließlich Umkehrphasen-HPLC (Reversed-Phase-HPLC)) oder anderen chromatographischen Techniken, wie z. B. Gelpermeation, Ionenaustausch, Tren nungschromatographie, Affinitätschromatographie (einschließlich monoklonaler Antikörpersäulen) oder Gegenstromverteilung erreicht.
Die Analoga dieser Erfindung und die Peptide können durch Polymerisation stabilisiert werden. Polymerisation kann durch Quervernetzung monomerer Ketten mit polyfunktionellen Quervernetzungsmitteln, entweder direkt oder indirekt, durch multifunktionelle Polymere erreicht werden. Im Allgemeinen werden zwei wesentlich identische Analoga/Peptide an ihren C- oder N-Termini unter Verwendung eines bifunktionellen Quervernetzungsmittels quervernetzt. Das Mittel wird zum Quervernetzen der terminalen Amino- und/oder Carboxylgruppen verwendet. Im Allgemeinen werden beide terminalen Carboxylgruppen oder terminalen Aminogruppen miteinander quervernetzt, obwohl durch Auswahl des passenden Quervernetzungsmittels die α-Aminogruppe des einen Analogons/Peptids mit der terminalen Carboxylgruppe des anderen Analogons/Peptids quervernetzt wird. Bevorzugt werden die Analoga/Peptide an ihren C-Termini durch Cysteine ausgetauscht. Unter im Stand der Technik wohlbekannten Bedingungen kann zwischen den terminalen Cysteinen eine Disulfidbindung ausgebildet werden, wodurch die Analogon-/Peptidketten quervernetzt werden. Disulfidbrücken werden zweckmäßigerweise z. B. durch metallkatalysierte Oxidation der freien Cysteine oder durch nukleophile Substitution eines in geeigneter Weise modifizierten Cysteinrestes ausgebildet. Die Auswahl des quervernetzenden Mittels hängt von der Identität der reaktiven Seitenketten der Aminosäuren, die in den Analoga/Peptiden vorhanden sind, ab. Disulfidquervernetzungen würden z. B. nicht bevorzugt sein, wenn Cystein an zusätzlichen anderen Stellen als dem C-Terminus in dem Analogon/Peptid vorhanden sein würde. Innerhalb des Bereiches hiervon sind auch mit Methylenbrücken quervernetzte Analoga/Peptide.
Geeignete Quervernetzungsstellen in den Analoga/Peptiden schließen, neben den N-terminalen Amino- und C-terminalen Carboxylgruppen, in Lysinresten gefundene epsilon-Aminogruppen, wie auch Amino-, Imino-, Carboxyl-, Thiol- und Hydroxylgruppen, die sich in Seitenketten der internen Reste der Analoga/Peptide befinden, oder in flankierenden Sequenzen eingeführte Reste ein. Quervernetzen durch extern hinzugefügte quervernetzende Reagenzien wird geeigneterweise z. B. unter Verwendung einer beliebigen Anzahl von Reagenzien, die dem Fachmann bekannt sind, z. B. durch Carbodiimidbehandlung des Analogons oder Peptides, erreicht. Andere Beispiele für geeignete multifunktionelle (im Allgemeinen bifunktionelle) quervernetzende Mittel kommen in der Literatur vor.
Die Analoga dieser Erfindung und die Peptide können auch durch Zyklisierung konformativ stabilisiert werden. Die Analoga/Peptide werden im Allgemeinen durch kovalente Bin dung der N- und C-terminalen Domänen des einen Analogons/Peptids zu der korrespondierenden Domäne des anderen Analogons/Peptids dieser Erfindung verbunden, um Cyclooligomere auszubilden, die zwei oder mehr iterierte Analogon-/Peptidsequenzen enthalten, wobei jedes interne Analogon/Peptid im Wesentlichen die gleiche Sequenz hat. Weiterhin werden zyklisierte Analoga/Peptide (ob Cyclooligomere oder Cyclomonomere) quervernetzt, um 1–3-zyklische Strukturen mit 2 bis 6 darin umfassten Peptiden auszubilden. Die Analoga/Peptide werden bevorzugt nicht kovalent durch α-Amino- und Hauptkettencarboxylgruppen (Head-to-Tail) gebunden, sondern eher durch die Seitenketten der in den N- und C-terminalen Domänen enthaltenen Reste quervernetzt. Die Vernetzungsstelle wird daher im Allgemeinen zwischen den Seitenketten der Reste liegen.
Viele geeignete Verfahren zum Zubereiten von mono- oder polyzyklisierten Analoga/Peptiden, wie hierin betrachtet, sind per se bekannt. Lys-/Asp-Zyklisierung wurde unter Verwendung von N α-Amino-BOC-Aminosäuren auf Festphasenträgern mit Fmoc/9-Fluorenylmethyl-(OFm)-Seitenkettenschutz für Lys/Asp bewerkstelligt; das Verfahren wird vervollständigt durch Piperidinbehandlung, gefolgt durch Zyklisierung.
Glu- und Lys-Seitenketten wurden auch beim Herstellen von zyklischen oder bizyklischen Analoga/Peptiden quervernetzt: Das Analogon/Peptid wird durch Festphasenchemie auf einem p-Methylbenzhydrylaminharz synthetisiert. Das Analogon/Peptid wird von dem Harz gespalten und entschützt. Das zyklische Analogon/Peptid wird unter Verwendung von Diphenylphosphorylazid in verdünntem Methylformamid ausgebildet. Für ein alternatives Verfahren siehe Schiller et al., Peptide Protein Res., 25: 171–177 (1985). Siehe auch U.S.-Pat. Nr. 4,547,489 .
Disulfid-quervernetzte oder zyklisierte Analoga/Peptide werden durch konventionelle Verfahren gebildet. Das Verfahren von Pelton et al. (J. Med. Chem., 29: 2370–2375 (1986)) ist geeignet, außer dass ein größerer Anteil an Cyclooligomeren durch Vollziehen der Reaktion in konzentrierteren Lösungen als das durch Pelton et al. für die Herstellung von Cyclomonomeren beschriebene verdünnte Reaktionsgemisch, hergestellt werden. Die gleiche Chemie ist nützlich für die Synthese von Dimeren oder Cyclooligomeren oder Cyclomonomeren. Auch nützlich sind Thiomethylenbrücken. Lebl und Hruby, Tetrahedron Letters, 25: 2067–2068 (1984). Siehe auch Cody et al., J. Med. Chem., 28: 583 (1985).
Die gewünschten zyklischen oder polymerischen Analoga/Peptide werden durch Gelfiltration, gefolgt durch Umkehr-Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie oder andere konven tionelle Vorgehensweisen, aufgereinigt. Die Analoga/Peptide werden sterilfiltriert und in konventionellen pharmakologisch verträglichen Vehikeln formuliert.
Die Ausgangsmaterialien, die für die hierin beschriebenen Verfahren benötigt werden, sind in der Literatur bekannt oder können unter Verwendung von bekannten Verfahren und bekannten Ausgangsmaterialien zubereitet werden.
Wenn in den hergestellten Analoga/Peptiden an vier nicht identische Substituenten gebundene Kohlenstoffatome asymmetrisch sind, dann können die Analoga/Peptide als Diastereoisomere, Enantiomere oder Mischungen davon vorkommen. Die oben beschriebenen Synthesen können Racemate, Enantiomere oder Diastereomere als Ausgangsmaterialien oder als Zwischenprodukte anwenden. Aus solchen Synthesen resultierende diastereomere Produkte können durch chromatographische oder Kristallisationsverfahren abgetrennt werden. Ebenso können enantiomere Produkte unter Verwendung der gleichen Techniken oder durch andere der Technik bekannte Verfahren abgetrennt werden. Bei Vorhandensein liegt jedes der asymmetrischen Kohlenstoffatome in einer von zwei Konfigurationen, R) oder S), vor und beide sind innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung.
Die Analoga dieser Erfindung und die Peptide können mit dem Knorpel durch eine beliebige geeignete Technik in Kontakt gebracht werden, und können als Analogon mit Analogon, Analogon mit Peptid oder Peptid mit Peptid kombiniert werden. Wenn die Behandlung in vivo ist, wird dem Säugetier das Analogon oder Peptid über z. B. orale, parenterale (z. B. intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, intraartikuläre oder subkutane Injektion oder Infusion oder Implantat), nasale, pulmonale, vaginale, rektale, sublinguale oder topikale Verabreichungswege verabreicht werden, und kann in Dosierungsformen formuliert werden, die für jeden Verabreichungsweg passend sind. Der spezifische Verabreichungsweg wird z. B. von der medizinischen Geschichte des Patienten, einschließlich jeglicher bemerkter oder vorhergesehener Nebeneffekte beim Verwenden des Analogons oder Peptids, dem Typ von Analogon oder Peptid, das verabreicht wird, und dem jeweiligen Typ der zu korrigierenden Störung abhängen. Am meisten bevorzugt ist die Verabreichung durch kontinuierliche Infusion (unter Verwendung von z. B. langsam freisetzenden Geräten oder Minipumpen, wie z. B. osmotische Pumpen oder Hautpflaster), oder durch Injektion (unter Verwendung von z. B. intravenösen, intraartikulären oder subkutanen Mitteln). Bevorzugt wird das Analogon oder Peptid lokal verabreicht, z. B. direkt an das Gelenk, wo die Herstellung oder Vorbeugung gebraucht wird.
Das in der Therapie zu verwendende Analogon oder Peptid wird in einer Weise formuliert und dosiert, die übereinstimmend mit „good medical practice" ist, unter Berücksichtigung der klinischen Kondition des individuellen Patienten (insbesondere der Nebeneffekte der Behandlung mit dem Analogon oder Peptid), des Typs der Störung, der Stelle der Verabreichungsverfahren, der Planung des zeitlichen Ablaufs der Verabreichung und anderer dem praktischen Arzt bekannter Faktoren. Für die Zwecke hierin wirksame Mengen des Analogons oder Peptids werden daher durch solche Gesichtspunkte bestimmt und müssen Mengen sein, die in Bioverfügbarkeit des Wirkstoffs bezüglich des Säugetiers und dem gewünschten Effekt resultieren.
Eine bevorzugte Verabreichung ist eine chronische Verabreichung von etwa zweimal pro Tag für 4–8 Wochen, um die Effekte von IGF-1 zu reproduzieren. Als eine Alternative zur Injektion kann chronische Infusion unter Verwendung eines Infusionsgerätes für kontinuierliche subkutane (SC) oder intraartikuläre Infusionen angewendet werden. Eine intravenöse Beutellösung kann auch angewendet werden. Der Schlüsselfaktor in der Auswahl einer passenden Dosis für die fragliche Störung ist das erhaltene Ergebnis, wie durch Kriterien zum Messen der Behandlung der Knorpelstörung, wie als geeignet durch den praktischen Arzt erachtet.
Als ein allgemeiner Vorschlag wird die gesamte pharmazeutisch wirksame Menge des parenteral verabreichten Analogons oder Peptids pro Dosis in einem Bereich sein, der durch eine „Dosis-Wirkungs"-Kurve gemessen werden kann. Zum Beispiel können IGFs, gebunden an IGFBPs oder in dem Blut in Körperflüssigkeiten des zu behandelnden Säugetiers gemessen werden, um die Dosierung zu bestimmen. Alternativ dazu kann man steigende Mengen des Analogons oder Peptids dem Patienten verabreichen und die Serumspiegel des Patienten auf IGF-1 und IGF-2 überprüfen. Die Menge des anzuwendenden Analogons oder Peptids kann auf einer molaren Basis, basierend auf diesen Serumspiegeln von IGF-1 und IGF-2, berechnet werden.
Im Speziellen bedingt ein Verfahren zur Bestimmung der passenden Dosierung des Analogons oder Peptids das Messen des IGF-Spiegels in einer biologischen Flüssigkeit, wie z. B. einer Körper- oder Blutflüssigkeit. Messen solcher Spiegel kann auf jegliche Weise erfolgen, einschließlich RIA und ELISA. Nach dem Messen der IGF-Spiegel wird die Flüssigkeit mit dem Analogon oder Peptid unter Verwendung von einzelnen oder mehrfachen Dosen in Kontakt gebracht. Nach diesem Kontaktierungsschritt werden die IGF-Spiegel in der Flüssigkeit nochmals gemessen. Wenn die Flüssigkeits-IGF-Spiegel um einen ausreichenden Betrag gefallen sind, um die gewünschte Wirksamkeit, für die das Molekül verab reicht wird, zu erzeugen, kann dann die Dosis des Moleküls angepasst werden, um die maximale Wirksamkeit zu erzeugen. Dieses Verfahren kann in vitro oder in vivo durchgeführt werden. Bevorzugt wird dieses Verfahren in vivo durchgeführt, d. h. nachdem die Flüssigkeit aus einem Säugetier entnommen wurde und die IGF-Spiegel gemessen wurden, wird das Analogon oder Peptid hierin dem Säugetier unter Verwendung von einzelnen oder mehrfachen Dosen verabreicht (d. h. der Kontaktierungsschritt wird durch Verabreichung an ein Säugetier erreicht). Dann werden die IGF-Spiegel aus einer dem Säugetier entnommenen Flüssigkeit nochmal gemessen.
Ein anderes Verfahren zum Bestimmen der Dosierung ist die Verwendung von Antikörpern gegenüber dem Analogon oder Peptid oder einem anderen Detektionsverfahren für das Analogon oder Peptid in dem LIFA Format. Dies würde die Detektion von an IGFBP gebundenen endogenen oder exogenen IGFs und die Menge an IGFBP gebundenem Analogon oder Peptid erlauben.
Ein anderes Verfahren zur Bestimmung der Dosierung wäre das Messen des Spiegels von „freiem" oder aktivem IGF im Blut. Für einige Verwendungen wäre der Spiegel an „freiem" IGF ein geeigneter Marker der Wirksamkeit und wirksamen Dosen oder Dosierungen. Die Menge an aktivem IGF kann auch in der Gelenkflüssigkeit gemessen werden.
Zum Beispiel ist ein Verfahren zum Detektieren von endogenen oder exogenen an IGF-Bindungsproteine gebundenes IGF oder der Menge des Analogons oder Peptids hierein oder das Detektieren des Spiegels an ungebundenem IGF in einer biologischen Flüssigkeit beschrieben. Dieses Verfahren umfasst:

(a) Das Inkontaktbringen der Flüssigkeit mit 1) einem Mittel zum Detektieren des Analogons oder Peptids, das für das Analogon oder Peptid spezifisch ist (wie z. B. ein erster für Epitope des Analogons oder Peptids spezifischer Antikörper), befestigt an einen Festphasenträger, so dass in Gegenwart des Analogons oder Peptids die IGF-Bindestelle in dem Analogon oder Peptid zur Bindung an das IGF-Bindungsprotein zugänglich bleibt, wodurch ein Komplex zwischen dem Mittel und dem IGF-Bindungsprotein ausgebildet wird; und 2) dem Analogon oder Peptid für eine Zeitspanne, die ausreicht, um alle zugänglichen IGF-Bindestellen in dem IGF-Bindungsprotein abzusättigen, wodurch ein gesättigter Komplex ausgebildet wird;
(b) Das Inkontaktbringen des gesättigten Komplexes mit einem detektierbar markierten zweiten Mittel, das für das IGF-Bindungsprotein spezifisch ist (wie z. B. ein zweiter für Epitope des IGF-spezifischen Antikörpers), die zur Bindung zugänglich sind, wenn das Analogon oder Peptid an das IGF-Protein gebunden ist; und
(c) quantitatives Analysieren der Menge des gebundenen markierten Mittels, als ein Maßstab für das IGFBP in der biologischen Flüssigkeit und daher als ein Maßstab für die Menge an gebundenem Analogon oder Peptid und IGF-Bindungsprotein, gebundenem IGF und IGF-Bindungsprotein oder in der Flüssigkeit vorhandenem aktivem IGF.

In Anbetracht der obenstehenden Verfahren zur Bestimmung von Dosierungen kann im Allgemeinen die Menge an Analogon oder Peptid, das angewendet werden kann, abgeschätzt werden, d. h. von etwa 1 μg/kg/Tag bis 10 mg/kg/Tag, bevorzugt kann etwa 10 μg/kg/Tag bis 1 mg/kg/Tag, stärker bevorzugt etwa 10–200 μg/kg/Tag verwendet werden, basierend auf kg des Patientenkörpergewichtes, obwohl, wie oben erwähnt, dies zum großen Teil therapeutischem Ermessen unterzogen wird.
Es wird angemerkt, dass Dosierungen und gewünschte Wirkstoffkonzentrationen von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die mit der vorliegenden Erfindung anwendbar sind, abhängig von der jeweiligen vorhergesehenen Verwendung variieren können. Die Bestimmung der passenden Dosierung oder des Verabreichungsweges liegt sehr wohl innerhalb des Könnens eines gewöhnlichen Arztes. Tierversuche stellen verlässliche Leitlinien für die Bestimmung von wirksamen Dosen für die Humantherapie bereit. Interspeziesskalieren der wirksamen Mengen kann durch Befolgen der Prinzipien, festgeschrieben durch Mordenti und Chappell, „The use of interspecies scaling in toxicokinetics" in Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Hrsg., (Pergamon Press: New York, 1989), Seiten 42–96, durchgeführt werden.
Das Analogon oder Peptid kann geeigneterweise durch ein anhaltend freisetzendes System verabreicht werden. Geeignete Beispiele von anhaltend freisetzenden Verbindungen schließen semipermeable Polymermatrizen in der Form von geformten Artikeln, z. B. Filmen oder Mikrokapseln, ein. Anhaltend freisetzende Matrizen schließen Polylactide ( US-Pat. Nr. 3,773,919 , EP 58,481 ), Copolymere von L-Glutaminsäure und gamma-Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al., Biopolymers, 22, 547–556 (1983), Poly-(2-hydroxyethylmethacrylat) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167–277 (1981), und Langer, Chem. Tech., 12: 98–105 (1982)), Ethylenvinylacetat (Langer et al., supra) oder Poly-D-(–)-3-hydroxybutansäure ( EP 133,988 ) ein. Anhaltend freisetzende Zusammensetzungen schließen auch ein liposomal eingeschlossenes Analogon oder Peptid ein. Analo gon oder Peptid enthaltende Liposome werden durch per se bekannte Verfahren zubereitet: DE 3,218,121 ; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688–3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030–4034 (1980); EP 52,322 ; EP 36,676 ; EP 88,046 ; EP 143,949 ; EP 142,641 ; japanische Patentanmeldung 83-118008 ; US-Patentnrn. 4,485,045 und 4,544,545 ; und EP 102,324 . Gewöhnlich sind die Liposomen von dem kleinen (von oder etwa 200 bis 800 Ångstrøm) unilamellaren Typ, in dem der Lipidgehalt größer als etwa 30 mol-% Cholesterol ist, wobei der ausgewählte Anteil für die wirksamste Therapie angepasst wird.
PEGylierte Analoga oder Peptide mit einer längeren Lebensspanne können auch angewendet werden, basierend auf z. B. der Konjugattechnologie, beschrieben in WO 95/32003 , publiziert am 30. November 1995.
Zur parenteralen Verabreichung wird das Analogon oder Peptid im Allgemeinen durch Mischen eines jeden bei dem gewünschten Grad an Reinheit, in einer einheitsdosierungsinjizierbaren Form (Lösung, Suspension oder Emulsion) mit einem pharmazeutisch oder parenteral verträglichen Träger, d. h. einem der bezüglich des Empfängers bei den angewendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch ist und mit anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel ist, formuliert. Die Formulierung beinhaltet z. B. bevorzugt keine oxidierenden Agenzien und andere Peptide, die als den Polypeptiden schädlich bekannt sind.
Im Allgemeinen werden die Formulierungen durch in Kontakt bringen des Analogons oder Peptids einheitlich und eng mit flüssigen Trägern, oder feingeteilten festen Trägern, oder beiden zubereitet. Dann wird das Produkt, wenn nötig, in die gewünschte Formulierung geformt. Bevorzugt ist der Träger ein parenteraler Träger, stärker bevorzugt eine Lösung, die mit dem Blut oder der Gelenkflüssigkeit des Empfängers isotonisch ist. Beispiele für solche Trägervehikel schließen Wasser, Salzlösungen, Ringers Lösung, eine gepufferte Lösung, Hyaluronan und Dextroselösungen ein. Nichtwässrige Vehikel, wie z. B. fixierte Öle und Ethyloleate sind ebenfalls hierin verwendbar.
Der Träger enthält geeigneterweise geringere Mengen von Additiven, wie z. B. Substanzen, die die Isotonizität und chemische Stabilität erhöhen. Solche Materialien sind bezüglich des Empfängers bei den angewendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und schließen Puffer, wie z. B. Phosphat, Citrat, Succinat, Essigsäure und andere organische Säuren oder ihre Salze ein; Antioxidanzien, wie z. B. Ascorbinsäure; niedrigmolekulare (weniger als etwa zehn Reste) Polypeptide, z. B. Polyarginin oder Tripeptide; Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Gelatin, oder Immunglobuline; hydrophile Polymere, wie z. B. Polyvinylpyrrolidon; Glycin; Aminosäuren, wie z. B. Glutaminsäure, Asparaginsäure, Histidin oder Arginin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Cellulose oder deren Derivate, Glukose, Mannose, Trehalose oder Dextrine; chelatierende Mittel, wie z. B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z. B. Mannitol oder Sorbitol; Gegenionen, wie z. B. Natrium; nichtionische Tenside, wie z. B. Polysorbate, Poloxamere oder Polyethylenglykol (PEG); und/oder neutrale Salze, z. B. NaCl, KCl, MgCl₂, CaCl₂, etc. ein.
Das Analogon oder Peptid wird typischerweise in solchen Vehikeln bei einem pH von oder etwa 4,5 bis 8 formuliert. Es wird verständlich sein, dass die Verwendung von gewissen der vorangegangenen Hilfsstoffe, Träger oder Stabilisatoren in der Ausbildung von Salzen des Analogons oder Peptids resultieren werden. Die letztliche Zubereitung kann eine stabile Flüssigkeit oder ein lyophilisierter Feststoff sein.
Typischerweise werden etwa 0,5 bis 500 mg des Analogons oder Peptids oder Mischung von Analoga und/oder Peptiden als die freie Säure- oder Baseform oder als ein pharmazeutisch verträgliches Salz mit einem physiologisch verträglichen Vehikel, Träger, Hilfsstoff, Binder, Konservierungsmittel, Stabilisator, Geschmacksstoff, etc., hergestellt, wie durch die akzeptierte pharmazeutische Praxis verlangt. Die Menge an aktivem Bestandteil in diesen Zusammensetzungen ist so, dass eine geeignete Dosierung in dem angegebenen Bereich erhalten wird.
Das für die therapeutische Verabreichung zu verwendende Analogon oder Peptid muss steril sein. Sterilität wird leicht durch Filtration durch Sterilfiltrationsmembranen (z. B. 0,2-μm-Membranen) erreicht. Therapeutische Zusammensetzungen werden im Allgemeinen in einem Behälter mit einem sterilen Zugangsverschluss platziert, z. B. einem intravenösen Lösungsbeutel oder Ampulle mit einem durch eine hypodermische Injektionsnadel durchstechbaren Stopfen.
Das Analogon oder Peptid wird gewöhnlich in Einheiten oder Multidosenbehältern gelagert werden, z. B. versiegelten Ampullen oder Fläschchen, als eine wässrige Lösung oder als eine lyophiliserte Formulierung zur Rekonstitution. Als ein Beispiel für eine lyophilisierte Formulierung werden 10 ml-Fläschchen mit 5 ml sterilfiltrierter 1%iger (Gew./Vol.) wässriger Lösung des Analogons oder Peptids gefüllt und die resultierende Mischung wird lyophilisiert. Die Infusionslösung wird durch Rekonstituieren des lyophilisierten Analogons oder Peptids unter Verwendung bakteriostatischen Injektionswassers zubereitet.
Kombinationstherapie mit dem Analogon oder Peptid hierin und einem oder mehreren anderen passenden Reagenzien, die den Effekt des Analogons oder Peptids verstärken, ist auch Teil dieser Erfindung. Dies schließt Cytokinantagonisten, NO oder IL-1ra, einem Knorpelkatabolismusantagonisten, oder einen Knorpelwachstumsfaktor, wie z. B. Wildtyp IGF-1 und/oder ALS, wenn das aktive Mittel ein IGFBP-3-Ersatzpeptid oder ein IGF-1-Analogon mit einer Bindungsaffinitätspräferenz für IGFBP-3 im Vergleich zu IGFBP-1 ist, ein. Zusätzlich kann das IGFBP-Ersatzpeptid mit einem IGF-1-Analogon hierin zusammen verabreicht werden, bevorzugt mit dem Analogon mit einer Bindungsaffinitätspräferenz für IGFBP-1 im Vergleich zu IGFBP-3.
Das aktive Mittel und dessen effektverstärkendes Reagens können zeitgleich oder nacheinander verabreicht werden, und das Reagens kann bei der gleichen oder niedrigeren Dosis verabreicht werden, als wenn sie andererseits alleine verabreicht worden wären. Das Ersatzpeptid/IGF-1-Analogon mit Bindungspräferenz für IGFBP-3 kann getrennt von dem IGF-1 und/oder ALS verabreicht werden, aber bevorzugt werden diese Mittel zusammen als ein binärer oder ternärer Komplex verabreicht, wo solch ein Komplex ausgebildet werden kann. Verabreichungen als ein Komplex von ALS, IGF-1 und IGFBP-3-Ersatzpeptid/IGF-1-Analogon resultiert in der längsten Halbwertszeit für das aktive Mittel.
Hierin wird auch die Verwendung der Gentherapie zur Behandlung eines Säugetiers, unter Verwendung von Nukleinsäuren, die das Analogon oder Peptid kodieren, beschrieben. Im Allgemeinen wird die Gentherapie verwendet, um IGF-Spiegel in dem Säugetier zu steigern (oder überzuexprimieren). Nukleinsäuren, die das Analogon oder Peptid kodieren, können für diesen Zweck verwendet werden. Ist die Aminosäuresequenz erst einmal bekannt, kann man mehrere Nukleinsäuremoleküle unter Verwendung der Degeneration des genetischen Codes generieren und auswählen, welche für die Gentherapie zu verwenden sind.
Es gibt zwei Hauptansätze, um die Nukleinsäure (wahlweise in einem Vektor enthalten) für Zwecke der Gentherapie in die Patientenzellen zu bekommen: in vivo und ex vivo. Zur in vivo Verabreichung wird die Nukleinsäure direkt in den Patienten injiziert, gewöhnlich an die Stelle wo das Analogon oder Peptid benötigt wird. Zur ex vivo Behandlung werden Patientenzellen entfernt, die Nukleinsäure wird in diese isolierten Zellen eingeführt und die modifizierten Zellen werden dem Patienten entweder direkt oder z. B. in durchlässigen Membranen gekapselt, dem Patienten implantiert. Siehe z. B. US-Pat. Nr. 4,892,538 und 5,283,187 .
Es gibt eine Vielzahl von zugänglichen Techniken zum Einführen von Nukleinsäuren in lebende Zellen. Die Techniken variieren abhängig davon, ob die Nukleinsäure in kultivierte Zellen in vitro, oder in vivo in die Zellen des beabsichtigten Wirts transferiert werden. Geeignete Techniken für den in vitro Transfer von Nukleinsäuren in Säugerzellen schließen die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, das Kalziumphosphat-Präzipitationsverfahren, virale Infektion, etc. ein. Ein gewöhnlich verwendeter Vektor für ex vivo Verabreichung des Gens ist ein Adeno- oder Retrovirus.
Die zur Zeit bevorzugten in vivo Nukleinsäuretransfertechniken schließen Infektion mit viralen Vektoren (wie z. B. Adenovirus, Herpes Simplex I Virus, Retrovirus oder Adenoassoziierter Virus) und lipidbasierende Systeme (verwendbare Lipide für lipidvermittelten Gentransfer des Gens sind z. B. DOTMA, DOPE und DC-Chol) ein. In einigen Situationen ist es wünschenswert, der Nukleinsäurequelle einen Wirkstoff bereitzustellen, der die Zielzellen anvisiert, wie z. B. ein für ein Zelloberflächenmembranprotein der Zielzelle spezifischer Antikörper, ein Ligand für einen Rezeptor auf der Zielzelle, etc. Wo Liposomen angewendet werden, können Proteine, die an einen Zelloberflächenmembranprotein, das mit Endocytose verbunden ist, zum Anvisieren und/oder um die Aufnahme zu vermitteln, verwendet werden. Beispiele beinhalten Kapsidproteine oder Fragmente davon, tropisch für einen gewissen Zelltyp, Antikörper gegen Proteine, die in Zyklen internalisiert werden, und Proteine, die die intrazelluläre Lokalisation anvisieren und die intrazelluläre Halbwertszeit erhöhen. Die Technik der rezeptorvermittelten Endocytose wird beschrieben z. B. durch Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429–4432 (1987); und Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410–3414 (1990). Für einen Überblick der zurzeit bekannten Genmarkierung und Gentherapieprotokolle, siehe Anderson et al., Science, 256: 808–813 (1992). Siehe auch WO 93/25673 und die darin zitierten Referenzen.
Kits werden hierin auch beschrieben. Der Herstellungsartikel umfasst einen Behälter und eine Anleitung. Geeignete Behälter schließen z. B. Flaschen, Fläschchen, Spritzen und Teströhrchen ein. Die Behälter können aus zahlreichen Materialien gebildet sein, wie z. B. Glas oder Plastik. Der Behälter beinhaltet eine Zusammensetzung, die wirksam zur Behandlung der Knorpelstörung, z. B. degenerative Störung des Knorpels, ist und kann einen sterilen Zugangsverschluss haben (z. B. kann der Behälter ein intravenöser Lösungsbeutel sein oder ein Fläschchen mit einem durch eine hyperdermische Injektionsnadel durchstechbaren Stopfen sein). Der aktive Wirkstoff in der Zusammensetzung ist ein IGF-1-Analogon oder ein IGFBP-Ersatzpeptid, wie hierin definiert. Die Zusammensetzung kann beliebige oder mehrere hierin offenbarte Bestandteile umfassen. Die Anleitung auf, oder assoziiert mit dem Behälter, gibt an, dass die Zusammensetzung zur Behandlung einer Knorpelstörung verwendet wird. Die Anleitung könnte z. B. angeben, dass die Zusammensetzung wirksam für die Behandlung von Osteoarthritis, rheumatoide Arthritis, oder irgendeiner anderer degenerativen Knorpelstörung ist. Der Herstellungsartikel kann weiterhin einen zweiten Behälter umfassen, umfassend eine pharmazeutisch verträglichen Puffer, wie z. B. phosphatgepufferte Saline, Ringer's Lösung oder Dextroselösung. Alternativ dazu kann die Zusammensetzung einen beliebigen der wie hier oben erwähnten Träger, Hilfsstoffe und/oder Stabilisatoren enthalten. Es kann weiterhin andere, einem kommerziellen und Verwenderstandpunkt wünschenswerte Materialien enthalten, einschließlich anderer Puffer, Verdünnungsmittel, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Anleitungen zur Verwendung. Das Kit enthält wahlweise einen abgetrennten Behälter, bevorzugt ein Fläschchen, für ein Zusatzmittel, das zusammen mit dem aktiven Wirkstoff, wie z. B. IGF-1, verabreicht wird.
Die Erfindung wird durch Referenz auf die folgenden Beispiele noch vollständiger verstanden sein. Sie sollten jedoch nicht als eine Beschränkung des Bereichs der Erfindung ausgelegt werden.
BEISPIELE
Die nachfolgenden Beispiele 1–4 wurden entnommen aus WO 98/45427 zum Beschreiben der hierin definierten IGFBP-3-Ersatzpeptide. Basierend aus den Ergebnissen von in vitro und in vivo Experimenten unter Verwendung eines IGFBP-3-Ersatzpeptides mit Aminosäureaustauschen an den Resten 24 und 31 (Y24L, Y31A), auch bezeichnet (Leu²⁴, Ala³¹) hIGF-1 oder IGF-M, offenbart in WO 98/45427 , wird vorhergesagt, dass andere Peptide, die die Interaktion eines IGF mit einem IGFBP inhibieren, und schlecht oder überhaupt nicht an den IGF-1-Rezeptor binden, die aktiven IGF-Spiegel in einer behandelten Testperson steigern sollten. Zusätzlich ist es möglich, dass eine andere Klasse von Molekülen selbst IGF-1 an einer Stelle, entfernt von der, die in den Rezeptorinteraktionen einbezogen sind, in solch einer Weise bindet, so dass die Interaktion von IGF-1 mit dem IGFBPs, aber nicht die Interaktion von IGF-1 mit seinem Rezeptor inhibiert oder vorgebeugt wird.
In den Beispielen können allgemein α-Aminosäuren durch den Ein- oder Dreibuchstaben-Standard-Aminosäurecode beschrieben werden, wenn sich auf Intermediate und Endprodukte bezogen wird. Durch allgemeine α-Aminosäuren sind solche Aminosäuren gemeint, die unter mRNA-Anleitung in Proteinen eingebaut werden. Standardabkürzungen sind auf gelistet in The Merck Index, 10. Auflage, Seiten Misc-2–Misc-3. Wenn nicht anders bezeichnet, haben die allgemeinen α-Aminosäuren die natürliche oder „L"-Konfiguration am alpha-Kohlenstoffatom. Geht dem Code ein „D" voraus, kennzeichnet dies das entgegengesetzte Enantiomer der allgemeinen α-Aminosäure. Modifizierte oder unübliche α-Aminosäuren, wie z. B. Norleucin (Nle) und Omithin (Orn) werden bezeichnet, wie beschrieben in US-Patent and Trademark Office Official Gazette 1114 TMOG, 15. Mai 1990.
BEISPIEL 1
Phagenabgeleitete IGF-1 und Bindungsproteine bindende Peptide
Einführung:
Es wurde gezeigt, dass Peptide, die spezifisch und mit messbarer Affinität an Zielmoleküle, wie z. B. Proteine binden, aus einer Ausgangsbibliothek von vielen bindenden und nichtbindenden Peptiden durch Bindungsselektion unter Verwendung von bakteriophagen Hüllproteinfusionen identifiziert werden können (Smith, Science, 228: 1315 (1985); Scott und Smith, Science, 249: 386 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 309 (1990); Devlin et al., Science, 249: 404 (1990); diskutiert durch Wells und Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol., 2: 597 (1992); US-Pat. Nr. 5,223,409 ). Zusätzlich können die auf den Phagen präsentierten Proteine, als auch Peptide, durch wiederholende Zyklen von Mutationen, Selektion und Vermehrung affinitätsverstärkt werden.
Bibliotheken von Peptiden, die an bestimmten Positionen von Resten sich unterscheiden, können unter Verwendung von synthetischen Oligodeoxynukleotiden hergestellt werden. Die Peptide werden als Fusionsproteine mit einem Phagenhüllprotein (wie z. B. g3p oder g8p) auf Bakteriophagenpartikeln präsentiert, von denen jedes ein einzelsträngiges DNA-Genom enthält, welches die besondere Peptidvariante kodiert. Nach Zyklen der Affinitätsaufreinigung, unter Verwendung eines immobilisierten Zielmoleküls, werden individuelle Bakteriophagenklone isoliert, und die Aminosäuresequenz der von ihnen präsentierten Peptide wird aus ihren DNA-Sequenzen abgeleitet.
Materialien und Methoden:
Herstellung der Peptidphagenbibliotheken
Um einen Satz von Peptidmolekülen, mit der Fähigkeit an IGF-1 oder an IGF-Bindungsprotein, wie z. B. IGFBP-1 oder IGFBP-3, zu binden, zu identifizieren, wurden mehrere diverse Phagenbibliotheken an Peptiden, von einer Länge, reichend von 18 bis 20 Resten, hergestellt. Peptide dieser Größe wurden ausgewählt, um die Selektion von Peptiden zu begünstigen, die fähig sind, wohldefinierte Strukturen in Lösung beizubehalten. Da natürliche Aminosäurepeptide dieser Größe eine potentielle Sequenzdiversität von 20¹⁸ bis 20²⁰ (d. h. 2,6 × 10²³ bis 1,0 × 10²⁶) Varianten haben, ist es nicht durchführbar, alle solche Varianten zu konstruieren und zu testen. Stattdessen waren gewisse Reste festgesetzt oder konstant, für die erwartet werden konnte, dass sie innerhalb jedes Peptids stabile Elemente der Peptidstruktur, wie z. B. Disulfidbindungen oder beta-Schleifen, erlauben oder begünstigen.
Strukturzwänge oder Gerüste wurden früher zur Präsentation von Peptidbibliotheken auf Phagen und zur anschließenden, sukzessiven Verstärkung der Bindungsaffinitäten durch Mutation und Selektion verwendet. Solch strukturierte Rahmengerüste können stabile Bindungskonformationen von Peptidsegmenten begünstigen. Als Analogie stellen Immunglobuline ein stabiles (und konserviertes) strukturelles Gerüsts zur Präsentation einer Diversität von unterschiedlichen Peptidschleifen (CDR's, complementary-determining regions) bereit, die unterschiedliche Antigene binden können.
Als eine Matrize zur Herstellung von Bibliotheken wurde ein Plasmid, pt4.g8 (komplette DNA-Sequenz ist in 1 gezeigt), das durch einen Antikörper erkennbares (gD-tag) Peptid, fusioniert an g8p des Bakteriophagen M13, exprimiert, verwendet. Dieses Plasmid enthält einzelsträngige und doppelsträngige DNA-Replikationsursprünge. Der phoA-Promotor und die STII-Sekretionssignalsequenzen sind upstream des gD-Peptids (nachfolgend unterstrichen), welches gefolgt ist durch ein „Linkerpeptid" (nachfolgend doppelt unterstrichen), und dann das g8p des Bakteriophagen M13:

Mehrere zufallsbedingte Sequenzpeptidbibliotheken (Tabelle I) wurden unter Verwendung von einzelsträngiger matrizengerichteter Mutagenese (Kunkel et al., Methods. Enzymol., 204: 125 (1991)) mit den nachfolgend beschriebenen Oligonukleotiden hergestellt. TABELLE I Große naive Bibliotheken für g8-Präsentation

Bibliothek	Oligonukleotid Nr.	Peptidmotiv	SEQ ID NO
A	HL-300	SGTACX₂GPX₄CSLAGSP	SEQ ID NO: 56
B	HL-301	X₄CX₂GPX₄CX₄	SEQ ID NO: 57
C	HL-302	X₂₀	SEQ ID NO: 58
D	HL-303	X₇CX₄CX₇	SEQ ID NO: 59
D	HL-304	X₇CX₅CX₆	SEQ ID NO: 60
D	HL-305	X₆CX₆CX₆	SEQ ID NO: 61
D	HL-306	X₆CX₇CX₅	SEQ ID NO: 62
D	HL-307	X₅CX₈CX₅	SEQ ID NO: 63
D	HL-308	X₅CX₉CX₄	SEQ ID NO: 64
D	HL-309	X₄CX₁₀CX₄	SEQ ID NO: 65

A. Beta-Schleifen Sequenzmotiv
Ein Beispiel eines Peptids von bekannter dreidimensionaler Struktur ist gegeben durch Wrigton et al., der einen Peptidagonisten für den Erythropoietin-Rezeptor (EPO-R) durch Phagen Display selektierte (Wrighton et al., Science, 273: 458 (1996)). Das Peptid GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (SEQ ID NO: 66) (mit einer Disulfidbindung, die die beiden Cys-Reste verbindet) bildet ein Dimer von zwei beta-Haarnadeln, in dem kristallisierten Komplex mit EPO-R (Livnah et al., Science, 273: 464 (1996)). Obwohl die Struktur der ungebundenen Form dieses Peptids in Lösung nicht berichtet wurde, legt die beta-Schleifenstruktur, die durch dieses Peptid im Komplex mit EPO-R ausgebildet wird, nahe, dass ähnliche Strukturen durch Peptide der Form CX₂GPX₄C (SEQ ID NO: 67) ausgebildet werden können.
Als ein Typ einer strukturierten Peptidbibliothek wurde ein Teil des gD-Peptids durch das Motiv CX₂GPX₄C (SEQ ID NO: 67) ausgetauscht, wobei die upstream und downstream („flankierenden") Reste von denen des Ausgangsplasmids unverändert blieben. Daher wurde diese Bibliothek so entworfen, das Peptid SGTACX₂GPX₄CSLAGSP (SEQ ID NO: 56) zu präsentieren, wo X eine beliebige der 20 natürlichen L-Aminosäuren repräsentiert, fusioniert an den Linker und an g8p, wie oben beschrieben. Diese Bibliothek wurde hergestellt unter Verwendung des Oligonukleotids HL-300:
wo N eine Mischung der Nukleotide A, G, C und T angibt und S eine Mischung der Nukleotide G und C darstellt.
Eine zusätzliche Bibliothek wurde hergestellt, um weitere Interaktionen innerhalb des Peptids und/oder mit den Zielproteinen durch willkürliches Auswählen auch der flankierenden Sequenzen zu erlauben. Diese Bibliothek wurde hergestellt mit der Form X₄CX₂GPX₄CX₄ (SEQ ID NO: 57) unter Verwendung von Oligonukleotid HL-301:
B. Disulfidschleifenmotive
Da viele zusätzliche Peptidkonformationen für die Bindung an ein gegebenes Zielprotein produktiv sein könnten, war es wünschenswert, andere Typen von Peptidsequenzmotiven in Phagen-präsentierten Bibliotheken zu testen. Eine einzelne Disulfidbindung innerhalb eines kleinen Peptids kann z. B. stabile Strukturen begünstigen, die eine relative höhere affine Bindung erlauben als in zwanglosen Strukturen (Geysen et al., Mol. Immunol., 23: 709 (1986); Wood et al., Science, 232: 633 (1986); Oldenburg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5393 (1992); O'Neil et al., Proteins, 14: 509 (1992); McLafferty et al., Gene, 128: 29 (1993); Giebel et al., Biochem., 34: 15430 (1995)). Mehrere Peptid-Phagen-Bibliotheken wurden daher nach der Form X_mCX_nCX_k hergestellt, wo m = 4, n = 10 und k = 4, oder wo m = 5, n = 8–9 und k = 4–5, oder m = 6, n = 6–7 und k = 5–6, oder m = 7, n = 4–5 und k = 6–7 (SEQ ID NOs: 59 bis 65) sind. In diesen Peptiden wird eine Disulfidbindung vorhergesagt, die eine stabilisierende Einschränkung der Peptidkonformation ausbildet.
Diese Peptidbibliotheken (siehe Tabelle I) wurden konstruiert nach X₇CX₄CX₇ (SEQ ID NO: 59), unter Verwendung von Oligonukleotid HL-303:
X₇CX₅CX₆ (SEQ ID NO: 60), unter Verwendung von Oligonukleotid HL-304:
X₆CX₆CX₆ (SEQ ID NO: 61), unter Verwendung von Oligonukleotid HL-305:
X₆CX₇CX₅ (SEQ ID NO: 62), unter Verwendung von Oligonukleotid HL-306:
X₅CX₈CX₅ (SEQ ID NO: 63), unter Verwendung von Oligonukleotid HL-307:
X₅CX₉CX₄ (SEQ ID NO: 64), unter Verwendung von Oligonukleotid HL-308:
X₄CX₁₀CX₄ (SEQ ID NO: 65), unter Verwendung von Oligonukleotid HL-309:
C. Zwanglose Peptide
Zwanglose Bibliotheken (d. h. mit keinen festgesetzten Resten innerhalb des Peptids) erbrachten auch spezifisch bindende Moleküle (Scott und Smith, supra; Cwirla et al., supra; Devlin et al., supra; Kay et al., Gene, 128: 59 (1993)). Solche Bibliotheken können strukturierte Peptide erbringen, da nicht-kovalente Interaktionen immer noch Struktur in den gebundenen und/oder ungebundenen Formen induzieren kann. Eine zwanglose Peptidbibliothek der Form X₂₀ (SEQ ID NO: 58) wurde unter Verwendung von Oligonukleotid HL-302 konstruiert:
Polyvalente (g8) Phagenbindungsselektionen
Die Produkte von zufallsbedingten Mutagenesereaktionen wurden in XL1-BLUE^TM E. coli Zellen (Strategene) durch Elektroporation transformiert und amplifiziert durch wachsen lassen für 15 bis 16 Std. mit M13K07 (Vieira und Messing, Methods Enzymol., 153: 3–11 (1987)) oder VCSM13 Helferphagen (Stratagene Corp.). Basierend auf dem Plattieren der Anfangstransformationen waren die Anzahl an Transformanten pro Bibliothek ungefähr 1,8 × 10⁸ für die Bibliothek HL-300, 7,9 × 10⁸ für HL-301, 5,0 × 10⁸ for HL-302, 5,3 × 10⁸ für HL-303, 5,6 × 10⁸ für HL-304, 5,0 × 10⁸ für HL-305, 6,3 × 10⁸ für HL-306, 4,5 × 10⁸ für HL-307, 1,9 × 10⁸ für HL-308, und 2,1 × 10⁸ für HL-309.
IGFBP-3 und IGF-1 wurden in einem molaren Verhältnis von 1,5:1 eines spaltbaren Biotinreagenz, EZ-LINK^TM NHS-SS-Biotin (Pierce) zu Protein nach Herstellerangaben biotinyliert.
Die Anfangsselektion von Peptiden auf Bindung an IGFBP-3 oder IGF-1 wurde unter Verwendung von Phagenpools von ungefähr 10¹⁰ Phagen/ml (100 μl Gesamtvolumen) durchgeführt. MAXISORP^TM 96-Wellplastikplatten (Nunc) wurden mit einer Lösung von 2 μg/ml NEUTRAVIDIN^TM brand avidin (Pierce) in 50 mM Natriumcarbonatpuffer, pH 9,6 über Nacht bei 4°C beschichtet. Die NEUTRAVIDIN^TM-Lösung wurde dann entfernt und die Platten wurden mit einer Blocklösung von 5 g/l Rinderserumalbumin, oder 5 g/l Ovalbumin, oder 5 g/l Trockenmilch in 50 mM Natriumcarbonatpuffer für 1 bis 2 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Blocklösung wurde dann entfernt und eine Lösung von biotinyliertem Zielprotein wurde hinzugefügt. Nach 1 bis 2 Std. bei Raumtemperatur wurde die Ziellösung entfernt und die Platten zehnmal mit PBS/TWEEN^TM-Tensid (0,05% TWEEN-20^TM in PBS-Puffer) gewaschen.
Phagen der oben beschriebenen Bibliotheken wurden wie folgt gepoolt: Pool A, bestehend aus HL-300-Phagen, Pool B aus HL-301-Phagen, Pool C aus HL-302-Phagen, und Pool D aus Phagen aus den HL-303, HL-304, HL-305, HL-306, HL-307, HL-308 und HL-309 Bibliotheken. Phagen wurden in PBS/TWEEN^TM/Albumin/Biotin (PBS/TWEEN^TM-Puffer mit 1 μM Biotin, 5 g/l Rinderserumalbumin oder Ovalbumin) zu den mit dem jeweiligen Zielprotein beschichteten Well, und zu Kontrollwells, die mit NEUTRAVIDIN^TM oder mit Albumin, aber nicht mit biotinyliertem Zielprotein beschichtet wurden, hinzugefügt. Den Phagen wurde erlaubt für 5 bis 15 Std. bei Raumtemperatur zu binden. Die Platten wurden dann zehnmal mit PBS/TWEEN^TM-Puffer gewaschen.
Verbleibende, an die Platten gebundene Phagen wurden durch Inkubieren mit 50 mM DTT für 1 bis 2 Std. bei Raumtemperatur eluiert. Die eluierten Phagen wurden in E. coli Zellen transformiert und über Nacht bei 37°C erlaubt zu wachsen, um die Phagen zu vervielfältigen.
Der zweite und dritte Zyklus der Bindungsselektion wurde wie oben durchgeführt, außer dass Streptavidin (0,1 mg/ml) in den Phagencocktails zusammen mit Biotin beinhaltet war. Ein Aliquot wurde aus jedem Zielprotein-beschichtetem Well und Kontrollwell, das mit jeder Bibliothek inkubiert wurde, entnommen und es wurden Serienverdünnungen der verdünnten Phagen durchgeführt, um die spezifische Bindung an das Zielprotein zu messen. Die verdünnten Phagen wurden dann in E. coli Zellen transfiziert und zum Zählen der Kolonien ausplattiert.
Die vierte Runde der Bindungsselektion wurde auf MAXISORP^TM-Platten durchgeführt, die direkt mit 2 μg/ml des jeweiligen Zielproteins, oder nur mit Albumin beschichtet waren. Die Ergebnisse der Phagenbindungsselektionen in den Zyklen 2–4 sind in 2 gezeigt.
Die gleichen Anfangsphagenbibliotheken (A, B, C, D) wurden auch für Bindungsselektionen an direkt beschichtetes IGFBP-3 verwendet. In diesem Fall wurden MAXISORP^TM 96-Wellplastikplatten (Nunc) mit einer Lösung von 2 μg/ml von IGFBP-3 in 50 mM Natriumcarbonatpuffer, pH 9,6, über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Zielproteinlösung wurde dann entfernt und die Platten mit einer Blocklösung von 5 g/L Rinderserumalbumin für 1 bis 2 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Phagen wurden mit den Platten wie oben inkubiert, und nicht gebundene Phagen weggewaschen. Die gebunden verbleibenden Phagen wurden durch Inkubieren mit 20 mM HCl für 10 Min. bei Raumtemperatur eluiert. Danach wurden die säureeluierten Phagen mit einem fünftel Volumen von 1 M Tris-HCl, pH 8,0 neutralisiert. Die Phagen wurden wie oben beschrieben zum Zählen von Kolonien transfiziert.
Screening von polyvalenten Phagenklonen (IGF blockierender Phagenassay)
Peptidphagenklone wurden durch Mischen der Phagenpools mit E. coli Zellen und Ausplattieren auf Antibiotika enthaltendes Medium isoliert. Kolonien wurden isoliert und mit Helferphagen (wie oben) gezüchtet, um einzelsträngige DNA zum Sequenzieren zu erhalten. Für die Bindung an IGFBP-3 oder IGF-1 ausgewählte Peptidsequenzen wurden aus den DNA-Sequenzen der Phagemidklone abgeleitet. Eine Anzahl solcher Klone sind dargestellt durch die Peptidsequenzen in den Tabellen II bzw. III.
TABELLE II Peptidsequenzen aus g8-Präsentation, IGFBP-3-Selektion
TABELLE III Peptidsequenzen aus g8-Präsentation, IGF-1-Selektion
Solche Peptidphagenklone könnten spezifische Zielproteinbindungspeptide repräsentieren, die entweder die Ligandenbindung (IGF-1 an IGFBP-3) blockieren, oder nicht, oder eine beliebige Anzahl an nicht-bindenden oder Hintergrundmitgliedern des ausgewählten Pools. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, wurden die Phagenklone auf ihre Fähigkeit in Gegenwart und Abwesenheit von IGF-1 an IGFBP-3 zu binden, getestet.
IGFBP-3 wurde wie obenstehend direkt auf MAXISORP^TM-Platten beschichtet. Die Phagen aus den klonalen Kulturen wurden mit IGF-1 vermischt (100 nM Endkonzentration), und mit dem immobilisierten IGFBP-3 für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden dann zehnmal wie obenstehend gewaschen und eine Lösung von Kaninchen-anti-Phagen-Antikörper, vermischt mit einem Ziegen-anti-Kaninchen-Konjugat mit Meerrettich-Peroxidase, wurde hinzugefügt. Nach einer Inkubation von 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Platten mit einem chromogenen Substrat, O-Phenylenediamin (Sigma), entwickelt. Die Reaktion wurde durch Hinzufügen des halben Volumens an 2,5 M H₂SO₄ gestoppt. Die optische Dichte bei 490 nm wurde auf einem spektrophotometrischen Plattenlesegerät gemessen.
Die Titration mehrerer IGFBP-3-ausgewählter Peptidphagenklone zeigte, dass ihre Bindung an IGFBP-3 alle durch IGF-1 bei einigen Phagenkonzentrationen inhibiert wurde (3 und 4). Diese Peptide besitzen vermutlich eine überlappende Stelle mit dem IGF-Bindungs-Epitop von IGFBP-3. Zusätzliche Peptidphagenklone wurden gleichzeitig bei einer niedrigen Phagenkonzentration, mit und ohne IGF-1 gescreent.
5 zeigt die Ergebnisse eines Blockierungsassay für mehrere Phagemid-Klone, die aus drei Runden DTT-Elution, gefolgt von einer Runde HCl-Elution, wie obenstehend beschrieben, abgeleitet wurden. In jedem Fall wurde der Phagemid-Klon aus einer Einzelkolonie über Nacht bei 37°C in einem Kulturvolumen von 5 ml gezüchtet. Die Phagenpartikel wurden präzipitiert und in 0,5 ml PBS-Puffer resuspendiert. Eine 50-fache Verdünnung jeder Phagenlösung wurde in PBS/TWEEN^TM-Puffer gemacht und die Phagen wurden mit oder ohne 100 nM IGF-1 auf einer IGFBP-3-beschichteten MAXISORP^TM-Platte inkubiert. Wie in 5 gezeigt, wurden die meisten Klone zu > 40% für ihre Bindung an IGFBP-3 bei diesen Phagenkonzentrationen inhibiert, obwohl Klon 4D3.11 nur zu 5% unter diesen Bedingungen inhibiert wurde.
6 zeigt die Ergebnisse eines Blockierungsassay für mehrere Phagemidklone, die aus drei Runden HCl-Elution, wie obenstehend beschrieben, abgeleitet wurden. In jedem Fall wurde der Phagemidklon aus einer Einzelkolonie über Nacht bei 37°C in einem Kulturvolumen von 5 ml gezüchtet. Die Phagenpartikel wurden wie obenstehend beschrieben zubereitet. In diesem Fall, wie in 6 gezeigt, wurden die meisten Klone > 80% für Ihre Bindung an IGFBP bei diesen Phagenkonzentrationen inhibiert, obwohl die Klone 23A3.3 und 23A3.5 nur zu etwa 20% unter diesen Bedingungen inhibiert wurden.
Die Abweichung in dem Grad, in dem die Phagenbindung durch eine konstante Konzentration von IGF-1 blockiert ist, als eine Funktion der Phagenverdünnung (3), oder als eine Funktion des präsentierten Peptids (5-6) ist von Interesse, weil, ohne sich auf eine bestimmte Theorie zu beschränken, es prädiktiv für (1) den Grad der Überlappung zwischen IGF-1- und Peptidbindungsepitopen auf dem IGFBP-3-Molekül, und/oder (2) die relative Affinität von IGF-1 im Vergleich zum phagenpräsentierten Peptid für die Bindung an IGFBP-3 sein kann. Da alle hier getesteten Peptidphagenklone einen gewissen Grad der Inhibition mit IGF-1 zeigten, ist es wahrscheinlich, dass das Epitop für die Peptidbindung an IGFBP-3 für jeden innerhalb eines Bereiches liegt, der durch gebundenes IGF-1 besetzt ist. Peptidassays (siehe unten) unterstützen diese Schlussfolgerung (d. h., Fall 1). Andererseits, ohne sich auf irgendeine Theorie zu beschränken, ist es möglich, dass einige Peptidepitope einfach innerhalb eines Bereiches der Bindung des Phagenpartikels, der solche Peptide präsentiert, sterisch durch gebundenes IGF-1 ausgeschlossen sein könnte.
Die Abhängigkeit der Inhibition von der Phagenkonzentration, und die Unterschiede zwischen den Phagenklonen (3) kann Fall 2 widerspiegeln. Insbesondere Phagenklone, deren Bindung an IGFBP-3 beschichtete Platten nur bei niedrigen Phagenkonzentrationen inhibiert wurden (z. B. 4D3.3, 4B3.4, entsprechend den Peptiden BP3-C1-ox bzw. BP3-02-ox) scheinen höher-affine Peptide (siehe nachfolgend) für IGFBP-3 zu ergeben, als die Phagenklone, deren Bindung an eine IGFBP-3 beschichtete Platte bei hohen, als auch bei nierigen Phagenkonzentrationen (z. B. 4C3.2, 4D3.5, entsprechend den Peptiden BP-23 bzw. BP-24) inhibiert wurde.
Daher kann dieser Typ von Phagentitrationsblockierungsassay allgemein verwendbar sein als ein Mittel, um die relative Affinität und das inhibitorische Potential von phagenpräsentierten Bibliotheken abgeleiteten Peptiden vorherzusagen.
Monovalente (g3) Präsentation von IGFBP-3-Bindungspeptiden
Affinitätsreifung einer Peptid- oder Proteinsequenz durch sukzessive Runden zufallsbedingter Mutagenese, Selektion und Vermehrung kann effizient erreicht werden, wenn die Kopienanzahl der präsentierten Peptide oder Proteine beschränkt ist (Bass et al., Proteins, 8: 309–314 (1990). Solch ein Affinitätsreifungsprozess ist veranschaulicht durch die Affinitätsreifung von hGH ( US-Pat. Nr. 5,534,617 ). In diesem Fall war die Kopienanzahl von präsentiertem hGH eher durch Fusionieren des präsentierten Proteins an g3, als an g8 der bakteriophagen Partikel beschränkt, was den Expressionslevels an hGH, und Verwenden eines Helferphagen, um Wildtyp g3p zum Phagemidverpacken und Vermehren bereitzustellen, einschränkt.
Um höher affine Peptidvarianten aus den Pools an Peptiden auf g8p präsentierendes Phagen zu selektionieren, wurden Peptid-cDNAs aus zwei g8-Bibliothekpools der Runde 4, 4B und 4D, in einen g3-Vektor für monovalente Phagenpräsentation transferiert. Die Bindungsselektionen wurden über drei Runden, wie obenstehend beschrieben, mit saurer Elution der bindenden Phagen ausgeführt.
Die nach drei Runden erhaltenen Peptidsequenzen sind in Tabelle IV gezeigt. Zwei Klone, 4B3.3 und 4D3.11, dominierten die ausgewählten Pools und wurden in den früheren g8-Phagenselektionen gesehen. Ein dritter Klon, 3Ai.2, repräsentiert eine neue Peptidsequenz, die nicht in der g8-Präsentation identifiziert wurde. Im Phagen-ELISA-Kompetitionsassay war die apparente Affinität der g3-4B3.3- und g3-4D3.11-Klone < 100 nM; die entsprechenden Peptide zeigten jedoch eine sehr viel schwächere Inhibition (siehe unten).
TABELLE IV Peptidsequenzen der g3-Präsentation, IGFBP-3-Selektion
Es wird erwartet, dass Affinitätssteigerungen durch wiederholtes Mutieren, Selektionieren und Vermehren von Peptidphagenbibliotheken, wie beschrieben für hGH, erhalten werden können. Siehe z. B. US-Pat. Nr. 5,534,617 .
Peptidassays
Die Peptide wurden entsprechend zu einer Anzahl von phagenabgeleiteten Sequenzen synthetisiert. In Fällen, wo zwei Cys-Reste in der Peptidsequenz gefunden wurden, wurde die Disulfid (oxidierte oder „ox" Suffix) monomere Form des Peptides hergestellt und aufge reinigt. In Fällen wo vier Cys-Reste gefunden wurden, wurde die {1–4, 2–3}-Disulfidform hergestellt und aufgereinigt.
Die Fähigkeit dieser Peptide, IGFBP-3 zu binden und die IGF-1-Bindung zu blockieren, wurde in einem oder mehreren der folgenden Assays getestet.
BIACORE^TM-Kompetitionsassay (für IGFBP-3-Binder)
IGF-1 wurde auf einem Dextranchip für einen Inhibitionsassay unter Verwendung von einem BIACORE^TM 2000 Oberflächenplasmonresonanzgerätes (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) immobilisiert, um freies Bindungsprotein zu messen. IGF-1 wurde wie oben beschrieben biotinyliert und über einen Chip injiziert, an den Streptavidin gekoppelt wurde (BIA-core, Inc.) um 400 bis 800 RU (response units) von immobilisiertem IGF-1 zu erhalten. Das IGF-1 zeigte keine detektierbare Dissoziation über die Zeitspanne eines jeden Experimentes. Serienverdünnungen von Peptid wurden mit einer konstanten Konzentration an IGFBP-3 (40 nM) gemischt. Nach einer Inkubation von ≥ 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde ein Aliquot von 20 μl bei einer Durchflussrate von 20 μl pro Minute über den IGF-1-Chip injiziert. Der Injektion folgend wurde ein Reaktionslauf gemessen, um die an IGF-1 gebundene relative Menge an IGFBP-3 zu messen.
Die Ergebnisse (7–8) zeigen eine Dosis-Wirkungs-Kurve für die Inhibition der IGFBP-3-Bindung an den Chip durch das jeweilige Peptid. Die insbesondere wirksamsten getesteten Inhibitoren der IGFBP-3-Bindung waren die Peptide BP3-01-ox (entsprechend dem Phagenklon 4D3.3) und eine verkürzte Form dieses Peptides, BP3-15 (siehe Tabelle V). In dieser Tabelle ist eine Disulfidbindung zwischen den beiden Cys-Resten eines jeden 2-Cys enthaltenen Peptids ausgebildet. Für Peptide, die vier Cysteine enthalten, bilden die beiden Cys*-Reste ein Disulfid und die verbleibenden zwei ein zweites Disulfid. Diese Peptide zeigten IC50-Werte von 2 μM, bzw. 0,75 μM. Andere Peptide, wie z. B. BP3-4D3.11 (Phagenklon 4D3.11 aus der g8-Präsentation und 3Bi.1 aus der g3-Präsentation) zeigten Inhibition mit IC50-Werten von < 10 μM.
IGFBP-1 zeigte keine Bindung an auf diese Weise immobilisiertes IGF-1. TABELLE V Inhibition der IGF-1-Bindung an IGFBP-3 durch synthetische Peptide

wo nh2 bedeutet, dass das Peptid mit einem Amid blockiert wurde und wo das C* ein Cystein angibt, dass mit einem anderen Cystein in dem Peptid verknüpft wurde. Die verbleibenden Cys-Paare sind auch in jedem Peptid als Disulfide oxidiert.
Radioaktiv markierter IGF-Assay (für IGFBP-3-Binder)
Als ein zusätzlicher Assay der Peptidaktivität wurden mehrere Peptide in einem Assay unter Verwendung von ¹²⁵I-markiertem IGF-1 getestet, um, wie obenstehend beschrieben (Assay 3) die Inhibition der IGFBP-Bindung zu messen. Serienverdünnungen des Peptids wurden zu einer IGFBP-1 oder einer IGFBP-3-Platte hinzugefügt. Danach wurde ¹²⁵I-markiertes IGF-1 hinzugefügt und die Platten wurden für 2 Stunden inkubiert. Die Platten wurden dann gewaschen, die Radioaktivität gemessen, und die Menge an gebundenem IGF-1 bestimmt.
9 zeigt die Inhibition von zwei IGFBP-3-ausgewählten Peptiden, BP3-01-ox und BP3-02-ox für die IGF-1-Bindung an eine IGFBP-3-Platte. Im Gegensatz dazu inhibierten diese Peptide nicht die IGF-1-Bindung an eine IGFBP-1 vorbeschichtete Platte (10).
In vitro Aktivierung (KIRA)
Die Fähigkeit mehrere synthetischer Peptide, die IGF-1-Bindung an IGFBPs zu blockieren und funktionelles IGF-1 freizusetzen wurde in einem KIRA-Assay der IGF-1-Aktivität wie obenstehend beschrieben getestet. Die Zellen wurden mit dem Peptid alleine, Peptid plus IGF-1 plus IGFBP-1, Peptid plus IGF-1, und Peptid plus IGF-1 plus IGFBP-3 behandelt. Die Ergebnisse sind jeweils in den 11A–D gezeigt.
Während BP3-01-ox eine niedrigere Affinität für das IGFBP hat als die anderen in diesem Assay getesteten Moleküle, ist die Tatsache, dass BP3-01-ox die Bindung von IGFBP-3 an IGF-1 inhibiert, für sich, nützlich für zahlreiche Zwecke, einschließlich dem LIFA und anderen obenstehend erwähnten Assays. Weiterhin verwendete der KIRA-Assay nur IGF-1; es wurde nicht IGF-2 angewendet, und wie in dem nachstehend beschriebenen Kompetitionsassay bemerkt, wurde für BP3-01-ox gezeigt, dass es die Bindung von IGFBP-3 an IGF-2 inhibiert.
BIACORE^TM-Kompetitionsassay (für IGFBP-3-Binder)
IGF-2 wurde auf einem Dextranchip für Inhibitionsassays unter Verwendung eines BIACORE^TM 2000 Oberflächenplasmonresonanzgerätes (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) immobilisiert, um freies Bindungsprotein zu messen. IGF-2 wurde, wie obenstehend beschrieben, biotinyliert und über einen Chip injiziert, an den Streptavidin gekoppelt wurde (BIAcore, Inc.) um ungefähr 1500 RU an immobilisiertem IGF-2 zu erhalten. Das IGF-2 zeigte keine detektierbare Dissoziation über die Zeitspanne eines jeden Experimentes. Serienverdünnungen des Peptids wurden mit einer konstanten Konzentration an IGFBP-3 (20 nM) gemischt. Nach Inkubation für ≥ 1 Stunde bei Raumtemperatur wurde ein Aliquot von 20 μl bei einer Flussrate von 20 μl/Min. über den IGF-2-Chip injiziert. Der Injektion fol gend wurde ein Reaktionslauf gemessen um die relative Menge des an das IGF-2 gebundene IGFBP-3 zu messen.
Die Ergebnisse (siehe z. B. 12) zeigen eine Dosis-Wirkungs-Kurve für die Inhibition der IGFBP-3-Bindung an IGF-2 für das jeweilige Peptid. Die Peptide BP3-01-ox, BP3-14, BP3-15 und BP3-17 zeigten IC50-Werte von 0,92 μM, 1,0 μM, 0,78 μM, bzw. 5,1 μM. Daher inhibieren diese Peptide die Bindung von IGFBP-3 sowohl an IGF-1 als auch an IGF-2.
BEISPIEL 2
Ersatz von IGF-1 von IGFBPs unter Verwendung von BP3-15
Dieses Beispiel testet ein IGFBP-3-spezifisches Peptid, BP3-15, für seine Fähigkeit die Bindung von ¹²⁵I-IGF-1 in humanem Serum zu blockieren. Humanes Serum wurde mit ¹²⁵I-IGF-1 ± dem Peptid inkubiert und die Menge an IGFBPs gebundenem Tracer durch Größenausschluss-Chromatographie gemessen. Zugabe des Peptides resultierte in einer schätzungsweise 42%igen Abnahme an mit dem 150-KD IGF/IGFBP-3/ALS-Komplex assoziierten ¹²⁵I-IGF-1 und einer 49%igen Abnahme in der Menge an freiem ¹²⁵I-IGF-1. Das Peptid zeigte keine Abnahme der ¹²⁵I-IGF-1-Bindung an die 44 KD IGFBPs (tatsächlich wurde sie leicht erhöht), was andeutet, dass das Peptid nur mit IGF-1 für die Bindung an IGFBP-3 konkurriert.
Diese Ergebnisse zeigen, dass das Analogon (bei 0,2 mM) mit IGF-1 um die Bindung an IGFBP-3 in humanem Serum konkurrieren kann.
BEISPIEL 3
Relative Affinität der IGFBP-3 Bindungs-Peptidvarianten
Die relativen Affinitäten von zahlreichen BP3-01-ox-Varianten wurden mit dem BIACORE^TM-Kompetitionsassay gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI gezeigt. Man kann sehen, dass 4D3.3P (SEQ ID NO: 6), BP3-30 (SEQ ID NO: 20), BP3-41 (SEQ ID NO: 23), BP3-40 (SEQ ID NO.: 22), BP3-39 (SEQ ID NO: 21), BP3-28 (SEQ ID NO: 19), BP3-27 (SEQ ID NO: 18), und BP3-25 (SEQ ID NO: 17) ähnliche oder größere Affinitäten haben als BP3-01-ox und für sie wird erwartet, die Verfügbarkeit von IGF-1 in einem in vitro Zellkulturassay zu erhöhen. Der Mangel an messbarer Aktivität für das Peptid BP3-24 (SEQ ID NO: 126) zeigt die kritische Rolle, die das intakte Disulfid spielt, in einer Erhaltung einer Peptidkonformation, die eine Bindung an IGFBP-3 für diese Serie an Peptiden begünstigt.
Tabelle VI Relative Affinitäten von BP3-01-ox-Varianten durch BIACORE^TMKompetitionsassay
BEISPIEL 4
Screenen zusätzlicher Bibliotheken für die Bindung an IGFBP-3
Zusätzliche polyvalente (g8) Peptidphagenbibliotheken wurden entworfen und durchsucht, die zwei Peptide, die die IGFBP-3-Bindung an IGF-1 inhibierten, erbrachten. Die Ergeb nisse, gezeigt in Tabelle VII, deuten daraufhin, dass BP3-107 (SEQ ID NO: 24) und BP3-108 (SEQ ID NO: 25) Inhibitoren sind und für sie zu erwarten ist, dass sie die Verfügbarkeit von IGF-1 in einem in vitro Zellkulturassay erhöhen.
TABELLE VII Peptidinhibition der IGFBP-3-Bindung an IGF-1 durch BIACORE^TM-Kompetition
BEISPIEL 5
Struktur/Funktion von BP1-01 und Affinitätsreifung
A. Kinetiken der BP1-01-Bindung an IGFBP-1
WO 98/45427 , publiziert am 15. Oktober 1989, offenbart die Herstellung und Charakterisierung des IGFBP-1-Ersatzpeptids BP1-01 (CRAGPLQWLCEKYFG) (SEQ ID NO: 26). Die Kinetiken der BP1-01-Peptidvarianten wurde in einem BIAcore^TM(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)-Assay unter Verwendung von kovalent über EDC/NHS an einen Dextranchip gekoppelten (wie beschrieben durch den Hersteller) IGFBP-1, untersucht. Das Peptid BP1-01 zeigte Dissoziationskinetiken, die zu schnell waren, um sie zu messen. BP1-02, die 19-mer-Variante (SEVGCRAGPLQWLCEKYFG) (SEQ ID NO: 27) zeigte jedoch messbare Kinetiken. Die Assoziationsratenkonstante war 2,30 × 10⁵ M^–1s^–1 und die Dissoziationsratenkonstante war 5,03 × 10^–2 s^–1. Letztere impliziert eine Halbwertszeit der Peptiddissoziation von IGFBP-1 von schätzungsweise 28 s. Die Assoziationsratenkonstante ist mäßig schnell, konsistent mit der Beobachtung, dass das Peptid keine signifikante Konformationsänderung nach Bindung an IGFBP-1 untergeht.
B. Scanning-Mutagenese der BP1-01-Peptide
Zwei Serien von synthetischen Peptidvarianten wurden generiert um zu bestimmen, welche Seitenketten des BP1-01-Peptids direkt zur Bindung an IGFBP-1 beitragen. In der ersten Serie wurde ein Alanin-Scanning-Ansatz (Cunningham und Wells, Science, 244: 1081–1085 (1989)) verwendet, um diesen Teil jeder Seitenkette hinter dem beta-Kohlenstoff zu entfernen. Der Beitrag dieser Atome zu der freien Bindungsenergie des Peptids an IGFBP- 1 wurde danach durch Messen der Stärke (IC50) der Variante zum Inhibieren der IGFBP-1-Bindung an IGF-1 oder IGF-2 in einem BIAcore^TM-Kompetitionsassay festgestellt, analog zu dem für IGFBP-3 beschriebenen Assay. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII gezeigt.
Eine zweite Serie von Peptiden verwendete nicht natürliche Aminosäuren, um zu untersuchen, welche anderen strukturellen Merkmale, wie z. B. eine hinzugefügte Methylgruppe am alpha-Kohlenstoff oder ein Isomer (D-Alanin), die Peptidbindung an IGFBP-1 beeinträchtigen kann. Die Wirksamkeiten dieser Peptide wurde durch biotinylierten IGFBP-1-ELISA-Assay gemessen, mit den in Tabelle IX gezeigten Ergebnissen. Diese Ergebnisse bestätigen die Wichtigkeit der Seitenketten L6, L9, W8 und Y13 in der Bindung von BP1-01 an IGFBP-1. Strukturelle Beiträge werden auch nahe gelegt durch die Effekte der Substitutionen an R2 und A3.
Im Gegensatz dazu hatten einige Substitutionen, wie z. B. aib-Substitutionen an G4, Q7, E11, K12 und F14 einen geringen oder keinen Effekt auf die Bindungsaffinität. Peptide mit einer oder mehrerer dieser Substitutionen können gleichwohl nützlich sein, da nicht natürliche Aminosäuren oft einem Peptid größere Resistenz gegenüber Proteolyse verleihen (siehe Schumacher et al., Science, 271: 1854 (1996) und den Referenzen darin). Solche Peptide könnten eine längere Halbwertszeit im Serum erreichen, als solche mit ausschließlich natürlichen Aminosäuren.
In Anbetracht der in Tabelle IX gezeigten Ergebnisse wird erwartet, dass Peptide mit einem D-Alanin substituiert an Position 2, 3 oder 6 des BP1-01 oder mit einer alpha-Aminoisobuttersäure substituiert an Position 7, 8, 9, 11, 12, 13 oder 14 die Verfügbarkeit von IGF-1 in einem in vitro Zellkulturassay erhöhen werden.
Zuletzt wurden die relativen Affinitäten der zahlreichen C-terminalen BP1-01-Varianten durch ELISA, wie in Tabelle X gezeigt, bestimmt. Diese Daten zeigen, dass der C-terminale Bereich des Peptids für die Bindung wichtig ist. Nur Peptid BP1-18 (SEQ ID NO: 37) behielt eine messbare inhibitorische Aktivität der IGF-1:IGFBP-1-Bindung bei. Es wird erwartet, dass dieses Peptid die Verfügbarkeit von IGF-1 in einem in vitro Zellkulturassay erhöhen wird.

Zusammengefasst legen die Strukturfunktionsdaten nahe, dass eine kleine Verbindung, einschließlich einem nicht-Peptidylbestandteil, durch Einbeziehen von Elementen des C-Terminus dieses Peptids in Kombination mit den Seitenketten L6, L9, W8 und Y13, um die Wirkung des BP1-01-Peptids nachzuahmen, entworfen werden kann. TABELLE VIII Relative Affinitäten der BP1-01 Ala-Scan Peptidvarianten durch BIAcore^TM

Variante	IGF-1-Inhibition IC50 (mut)/IC50 (wt)	IGF-2-Inhibition IC50 (mut)/IC50 (wt)
C1	n. d.	n. d.
R2A	0,9	0,9
A3	-1-	-1-
G4	n. d.	n. d.
P5	n. d.	n. d.
L6A	30,3	34,7
Q7A	0,7	0,6
W8A	7,4	6,4
L9A	33,2	29,7
C10	n. d.	n. d.
E11A	2,9	2,4
K12A	7,9	5,3
Y13A	12,5	14,6
F14A	6,2	5,8
(wt)	-1-	-1-

TABELLE IX Relative Affinitäten der BP1-01 nicht-natürlichen Peptidvarianten durch ELISA (a = D-Alanin; aib = alpha-Aminoisobuttersäure)

Variante	IGF-1-Inhibition IC50 (mut)/IC50 (wt)
C1	n. d.
R2a	50
A3a	34
G4a	0,6
P5	n. d.
L6a	400
Q7aib	1,6
W8aib	24
L9aib	400
C10	n. d.
E11aib	1,0
K12aib	2,0
Y13aib	7,1
F14aib	3,0
(wt)	-1-

TABELLE X Relative Affinitäten der C-terminalen BP1-01-Varianten durch ELISA
C. Polyvalente (g8) Selektion von BP1-01 Sekundärbibliotheken
NNS-Kodons wurden verwendet, um unterschiedliche Peptidbibliotheken, wie obenstehend beschrieben, zu erstellen. Um Aviditätseffekte zu minimieren, wurden die Affinitätsselektionen durch Bindung von Phagen zu biotinyliertem IGFBP-1 (wie obenstehend beschrieben zubereitet) in Lösung durchgeführt. Eine ähnliche Strategie wurde für Antikörper-Phagenselektionen durch Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889 (1992) verwendet. Für jede Selektionsrunde wurde die Menge an Zielprotein reduziert, um nach Varianten mit verstärkter Affinität zu selektionieren. Typischerweise wurden 10⁹–10¹⁰ gereinigte Phagen mit MPBST (5% Magermilch in PBS + 0,05% TWEEN^TM 20) für 1 Std. bei Raumtemperatur vorgeblockt und auf Bindung an das biotinylierte Zielprotein gescreent. Die Bindungsbedingungen sind nachstehend beschrieben. Phagen, die an das Zielprotein banden wurden durch Inkubieren mit Streptavidin-Magnetic Beads (Promega Corp., Madison, WI) für 2–5 Minuten bei Raumtemperatur erfasst. Nach der Bindung wurden die Beads vor dem Eluieren mit 0,1 M HCl zehnmal mit PBS-TWEEN^TM/MPBST gewaschen. Das Eluat wurde umgehend neutralisiert mit 1/3 Volumen an 1 M IRIS, pH 8,0. Der eluierte Phage wurde durch Infizieren von XL1 für den nächsten Selektionszyklus vermehrt. Die Runden 1, 2, 3 wurden mit 1 Std.-Inkubationen mit 400 nM-, 200 nM-, bzw. 20 nM-Zielprotein ausgeführt. Runde 4 wurde mit 4 nM Zielprotein über Nacht durchgeführt. Alle Bindungsreaktionen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die identifizierten Mutationen sind in Tabelle XIII von WO 98/45427 gezeigt und die relativen Affinitäten durch ELISA-Plattenassay oder BIAcore^TM sind nachstehend in Tabelle XI gezeigt. Es kann gesehen werden, dass BP1-10 (SEQ ID NO: 29), BP1-11 (SEQ ID NO: 30), BP1-12 (SEQ ID NO: 31), BP1-13 (SEQ ID NO: 32), BP1-15 (SEQ ID NO: 34), BP68 (SEQ ID NO: 45), BP1027 (SEQ ID NO: 48), BP1028 (SEQ ID NO: 49), BP1029 (SEQ ID NO: 50) und BP1030 (SEQ ID NO: 51) eine vergleichbare oder höhere Affinität als BP1-02 und BP1-01 haben, und daher für sie erwartet wird, dass sie die Verfügbarkeit von IGF-1 in einem in vitro Zellkulturassay erhöhen.
TABELLE XI Relative Affinitäten der g8 BP1-01-Selektanten durch ELISA-Plattenassay oder BIAcore^TM*
D. Monovalente (g3) Selektion von BP1-01 sekundären Bibliotheken
Monovalente (g3) Selektionen von BP1-01 Sekundärbibliotheken wurden im Wesentlichen, wie in Teil C oben beschrieben, ausgeführt. Die Matrizen enthielten entweder das TAA-Stopcodon an den gezielten Stellen der Zufallsordnung oder eine vollständig unverwandte Bindungssequenz aus BP1-01. Selektionsbedingungen waren, wie nachstehend beschrieben, mit BSA als Ersatz für Milch in dem Blockpuffer. Phagenzielproteinkomplexe wurden durch magnetische Streptavidin-Beads (Promega Corp., Madison, WI) erfasst. Biotinyliertes Zielprotein wurde mit Phagen für 1–3 Std. bei Raumtemperatur in jeder Runde preinkubiert, mit reduziertem Zielproteinkonzentrationen von 200–500 nM in Runde 1, bis 50–100 nM in Runde 2, 10–50 nM in Runde 3 und 1–20 nM in Runde 4.
Die identifizierten Mutationen sind in Tabelle XV von WO 98/45427 gezeigt, und die relativen Affinitäten von mehreren ausgewählten Peptiden, wie durch BIAcore^TM-Kompetitionsassay oder durch ELISA-Plattenassay bestimmt (wie obenstehend ausgeführt, außer dass 5% Acetonitril zur Peptidlöslichkeit verwendet wurden), sind in Tabelle XII nachstehend gezeigt. BP1-16 (SEQ ID NO: 35), eine 13-Reste-Version des BP1-01 (der das C-terminalen Gly fehlt), hatten eine zu BP1-01 vergleichbare Affinität. Substitutionen an dem N-Terminus oder C-Terminus erbrachten keine Affinitätsverbesserungen. Verglichen mit BP1-16 erbrachte z. B. das Hinzufügen der STY-Sequenz an den C-Terminus eine etwa 3-fache Affinitätsverbesserung für das Peptid BP1-21B. Ein ähnlicher Effekt wurde auch im Kontext des 18-mer gesehen: nämlich eine 3-fache Verbesserung wurde zwischen BP1-14 und BP1-21A beobachtet. Substitution des N-Terminalen S- zu G-Motif verbesserte auch die Affinität 2- bis 3-fach in den Peptiden BP1-19 und BP1-20. Alle diese Peptide hatten eine vergleichbare oder verbesserte apparente Affinität für IGFBP-1 verglichen mit BP1-01 und BP1-02 und für sie wird daher erwartet die Verfügbarkeit von IGF-1 in einem in vitro Zellkulturassay zu erhöhen.
TABELLE XII Relative Affinitäten von g3 BP1-01-Selektanten durch BIAcore^TM oder ELISA-Plattenassay*
BEISPIEL 6
Alanin-Scanning-Mutagenese von IGF-1 und strukturellen IGF-1-Analoga
Einführung:
Ein Alanin-Scanning-Mutagenese-Ansatz (Cunningham und Wells, Science, 244: 1081–1085 (1989); US-Pat. Nr. 5,834,250 ) wurde verwendet, um den Teil einer jeden Seitenkette von IGF-1 nach dem beta-Kohlenstoff zu entfernen. Der Beitrag dieser Atome zu der freien Bindungsenergie der IGF-1-Analoga zu IGFBP-1 oder zu IGFBP-3 wurde dann durch kompetitiven Phagen-ELISA festgestellt. In diesem Assay wird IGFBP-1 oder IGFBP-3 verwendet, um die Bindung von IGF-Phagenmutanten an IGFBP-1- oder IGFBP-3-beschichtete Immunosorbentplatten zu inhibieren. Aus einer Titrationsserie von Bindungsproteinen kann die Bindung (IC₅₀) berechnet werden. Für einige Mutanten wurde auch die direkte Bindung in BIACORE^TM-Assays untersucht.
Materialien und Methoden:
Konstruktion des Phagemidvektors und Mutagenese
Das Gen, kodierend für das reife humane IGF-1, wurde aus pBKIGF2B ( US-Pat. Nr. 5,342,763 ) unter Verwendung der PCR-Primer 5'-AGC TGC TTT GAT ATG CAT CTC CCG AAA CTC TGT GCG GT-3' (SEQ ID NO: 127) und 5'-GAG CGA TCT GGG TCT AGA CAG ATT TAG CGG GTT TCA G-3' (SEQ ID NO: 128) vervielfältigt. Das resultierende Fragment wurde mit NsiI und XbaI geschnitten und in zuvor mit NsiI und XbaI verdautem pH0753 ligiert. pH0753 ist ein Derivat an phGHam-g3 (Lowman et al., Biochemistry, 30: 10832–10838 (1991)) in der die zusätzliche XbaI-Schnittstelle in dem alkalischen Phosphatasepromotor-(PhoA)-Bereich unter Verwendung des Oligonukleotids 5'-AAA AGG GTA TGT AGA GGT TGA GGT-3' (SEQ ID NO: 129) deletiert wurde. Der das IGF-1-offene-Leseraster enthaltende ligierte Vektor pH0753 wurde pIGF-g3 benannt. Er kodiert die Doppelmutation G1S-A70V enthaltene IGF, fusioniert an ein Fragment des Gen-III-Proteins (Reste 249–406) des E. coli-Bakteriophagen M13. Bindung dieser IGF-1-Variante an IGFBP-1 und -3 war nicht unterscheidbar von der des Wildtyp IGF-1. Unter Verwendung von einzelsträngigem Plasmid pIGF-g3 als Matrize wurde Alanin-Mutagenese durchgeführt (Kunkel et al., Methods Enzymol., 204: 125–139 (1991)). Alle Reste von IGF-1 mit Ausnahme von Cysteinen und Alaninen wurden einzeln durch Alanin ersetzt. Die resultierenden Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
Bindung von auf Phagen präsentierten IGF-Mutanten an IGFBP-1 und -3 (Phagen-ELISA)
Immunosorbentplatten (Nunc, MAXISORP^TM, 96 Wells) wurden mit 100 μl/Well von 1 μg/ml IGFBP-1 oder IGFPB-3 in PBS-Puffer, pH 7,2 bei 4°C über Nacht beschichtet. Die Platten wurden dann mit 0,5% TWEEN 20^TM/PBS (auch verwendet als Bindungspuffer) für 2 Stunden bei Raumtemperatur geblockt (proteinöse Blockmittel, wie Rinderserumalbumin wurden vermieden, um mögliche IGF- oder IGFBP-Kontamination zu vermeiden). Frisch mit dem Phagemidvektor transformierte E. coli-Zellen (XL1-Blue, Stratagene) wurden über Nacht in 5 ml 2YT-Medium (Sambrook et al., supra) in Gegenwart von M13-VCS-Helferphagen (Stratagene) gezüchtet. Die Phagenpartikel wurden geerntet und in PBS-Puffer resuspendiert, wie beschrieben in Lowman, H. B., "Phage Display of Peptide Libraries an Protein Scaffolds", in Cabilly, S. (Hrsg.), Combinatorial Peptide Library Protocols (Humana Press Inc.: Totowa, NJ, (1998), Seiten 249–264. Danach wurden die Phagenkonzentrationen normalisiert, um ein maximales ELISA-Signal von 0,2–0,4 für jede Mutante zu erhalten (Lowman, in Cabilly, S. (Hrsg.), supra). Dreifache Serienverdünnungen des löslichen Kompetitors wurden auf nichtabsorbierenden Mikrotiterplatten (Nunc, F, 96 Wells) mit Bindungspuffer (0,5% TWEEN 20^TM/PBS), enthaltend Phagen bei den zuvor bestimmten Konzentrationen, zubereitet. Der Verdünnungsbereich des Kompetitorpro teins erstreckte sich über sechs Zehnerpotenzen, startend bei 5 μM für IGFBP-1 und 500 nM für IGFBP-3. Nach dem Blocken wurden die das immobilisierte Zielprotein enthaltenden Platten mit 0,05% TWEEN^TM-PBS-Puffer gewaschen und anschließend mit 80 μl/Well der vorgemischten Phagen-Kompetitorlösungen für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurden gebundene Phagen mit 80 μl/Well einer Lösung, enthaltend einen primären Kaninchen-anti-Phagen polyklonalen Antikörper und ein sekundäres monoklonales Ziege-anti-Kaninchen Antikörper-Merrettichperoxidasekonjugat in 0,5% TWEEN 20^TM/PBS, detektiert. o-Phenylendiamin (Sigma) und Tetramethylbenzidin (Kirkegaard und Perry) wurden als chromogene Substrate verwendet, resultierend in einer Produktdetektion bei 492 bzw. 450 nm. Durch Anpassen der Bindungsdaten an eine generische Sättigungskurve wurden die IC₅₀-Werte bestimmt (Lowman, in Cabilly, S. (Hrsg.), supra). Mindestens zwei individuelle Klone einer jeden IGF-1-Mutante wurden untersucht. Zahlenwerte in Tabelle XIII repräsentieren Mittelwerte ± Standardabweichung der einzeln gemessenen IC₅₀-Werte.
Expression und Aufreinigung von IGFBP-1 und IGFBP-3
Humanes IGFBP-1 wurde in CHO-Zellen exprimiert und aus dem konditionierten Medium wie beschrieben durch Mortensen et al., Endocrinology, 138: 2073–2080 (1997), aufgereinigt. Rekombinantes humanes IGFBP-3 wurde auch kloniert und in Säugerzellen exprimiert (Wood et al., Mol. Endocrinology, 2: 1176–1185 (1988)). Die Aufreinigung aus dem konditionierten Medium folgte im Wesentlichen der für IGFBP-1 beschriebenen Vorgehensweise, mit Verwendung einer IGF-Affinitätssäule (Martin and Baxter, J. Biol. Chem., 261: 8754–8760 (1986)).
Expression und Aufreinigung von löslichen IGF-1-Mutanten
Das Plasmid pBKIGF2B ( US-Pat. Nr. 5,342,763 ) exprimiert humanes Wildtyp-IGF-1, fusioniert zu dem Leaderpeptid von lamB unter der Kontrolle des PphoA-Promotors. Zur Erleichterung der stellenspezifischen Mutagenese wurde der Phagen-fl-Replikationsursprung (fl ori) in das Plasmid pBKIGF2B eingeführt. Zu diesem Zweck wurde ein 466-BP BamHI-Fragment, das den fl ori enthält, aus pH0753 herausgeschnitten (Lowman et al., supra, 1991), während das Plasmid pBKIGF2B mit EcoRI linearisiert wurde. Vektor wie auch Fragment wurden mit Klenow-Enzym behandelt, um die Restriktionsschnittstellenüberhänge vor einer Blunt-end-Ligation aufzufüllen. Korrekte Konstrukte wurden nach der Fähigkeit selektioniert, einzelsträngige Phagemid-DNA in Gegenwart von M13-VCS-Helferphagen herzustellen. Der resultierende Phagemidvektor wurde pBKIGF2B-fl-ori genannt und wurde als Matrize verwendet, um die IGF-1-Ala-Mutanten von Interesse (siehe Tabelle XIV) unter Verwendung der Vorgehensweise von Kurekel et al., Methods Enzymol., 204: 125–139 (1991), herzustellen. Jeder Mutageneseschritt wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Die Expression der IGF-1-Mutanten war wie beschrieben für den IGF-Wildtyp (Joly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 2773–2777 (1998)), aber ohne transiente Überexpression von Oxidoreduktasen. Die Aufreinigungsvorgehensweise basierte auf einem früheren Protokoll (Chang und Swartz, „Single-Steg Solubilization and Folding of IGF-1 Aggregates from Escherichia coli" in Cleland, J. L. (Hrsg.), Protein Folding In Vivo and In Vitro (American Chemical Society, Washington, DC, 1993), Seiten 178–188) mit kleineren Anpassungen. Typischerweise werden 6 g nasser Zellpaste (entsprechend zu 2 Litern Niedrigphosphatmedium, wachsen gelassen für 24 h) in 150 ml 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, enthaltend 5 mM EDTA, resuspendiert. Die Zellen wurden in einem Mikrofluidizer (Microfluidics Corp., Newton, MA) lysiert und akkumulierte IGF-1-Aggregate enthaltende refraktive Partikel wurden durch Zentrifugation bei 12.000 × g gesammelt. Die refraktiven Partikel wurden zweimal mit Lysepuffer, zweimal mit 1% N-Laroylsarcosin (Sigma) enthaltenden Lysepuffer, um Membranproteine zu extrahieren, gewaschen, und noch zweimal mit Lysepuffer gewaschen. Die gewaschenen refraktilen Körper werden bei schätzungsweise 2 mg/ml in 50 mM CAPS-(3-(Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure; Sigma)-Puffer, pH 10,4, enthaltend 2 M Harnstoff, 100 mM NaCl, 20% MeOH und 2 mM DTT, resuspendiert. Diese Vorgehensweise kombiniert das Löslichmachen von refraktilen Körpern und anschließende oxidative Rückfaltung der IGF-1-Mutanten (Chang und Swartz, supra). Nach 3 Stunden bei Raumtemperatur wurden die Rückfaltungslösungen durch Mikrokonzentratormembranen (Centricon, Amicon) mit einem Molekulargewicht-Cutoff von 50 kD filtriert.
Die Mehrheit an monomeren IGF-1 wurde in dem Eluat zurückgewonnen, während höher molekulargewichtige Kontaminationen in dem Rückstand konzentriert wurden. An dieser Stelle waren die IGF-1-Fraktionen > 95% rein, wie aus SDS PAGE-Analyse beurteilt. Um richtig Disulfid-verknüpftes IGF-1 von falschem IGF-1 (die zwei nicht native Disulfide enthalten; Hober et al., Biochemistry, 31: 1749–1756 (1992); Miller et al., Biochemistry, 32: 5203–5213 (1993)) abzutrennen, wurden die Rückfaltungslösungen mit 5% Essigsäure angesäuert und auf eine Dynamax^TM C18 semipräparative HPLC-Säule (Varian; 10,0 mm ID) bei 4 ml/min geladen. Die Puffer waren H₂O/0,1% TFA (A) und Acetonitril/0,1% TFA (B). Trennung der Disulfidisomere wurde durch Anwenden des folgenden Gradienten erreicht: 0–30% B in 20 min, 30–45% B in 60 min. Das Verhältnis von nativem IGF-1 zu falschem IGF war gewöhnlich etwa 2:1 für jede Mutante, wobei das falsche IGF früher in dem Gradienten eluiert als das native IGF-1. Die molekulare Masse wurde für jede Mutan te durch Massenspektrometrie verifiziert. Nach der HPLC-Reinigung wurden die Proben lyophilisiert und bei ungefähr 1 mg/ml in 100 mM HEPES-Puffer, pH 7,4 rekonstituiert.
Biosensorkinetik-Messungen
Die Bindungsaffinitäten der IGF-Varianten für IGFBP-1 und IGFBP-3 wurden unter Verwendung eines BIACORE^TM-2000 Echtzeitkinetik-Interaktionsanalysesystems (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) bestimmt, um die Assoziations-(k_a) und Dissoziationsraten (k_d) zu messen. Carboxymethylierte Dextranbiosensorchips (CM5, Biacore, Inc.) wurden mit EDC(N-Ethyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimidhydrochlorid) und NHS (N-Hydroxysuccinimid) entsprechend den Herstellerangaben aktiviert. Zur Immobilisierung wurden die IGF-Mutanten in 20 mM Natriumacetat, pH 4,8, auf den Biosensorchip bei einer Konzentration von 50 μg/ml injiziert, um ungefähr 450 bis 600 RUs (resonanceresponse units) von kovalent gekoppeltem Protein zu erhalten. Unreagierte Gruppen wurden mit einer Injektion von 1 M Ethanolamin geblockt. Kinetische Messungen wurden durch Injizieren von dreifachen Serienverdünnungen (Starten bei 1 μM) von entweder IGFBP-1 oder IGFBP-3 in Laufpuffer (PBS, 0,05% TWEEN 20^TM, 0,1% Ovalbumin, 0,1% Natriumazid) bei 25°C unter Verwendung einer Durchflussrate von 20 μl/min ausgeführt. Assoziationsraten (k_a) und Dissoziationsraten (k_d) wurden separat berechnet unter Verwendung eines 1:1 Langmuir^TM-Assoziationsmodells in der BIACORE^TM-Bestimmungssoftware V. 3.0. Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante (K_D) wurde berechnet als k_d/k_a.
Ergebnisse:
Monovalentes Phagen-Display von IGF-1
Für einen schnellen und umfassenden Alanin-Scan der 70 Aminosäurereste des IGF-1 wurde zuerst bestimmt, ob das Protein monovalent auf der Oberfläche eines M13-Phagen präsentiert werden kann (Bass et al., supra). Die Phagen-Display-Technologie kombiniert den Vorteil der schnellen einzelsträngigen DNA-Mutagenese mit einer einfachen Aufreinigung des resultierenden mutagenen Proteins, einfach durch Isolierung der entsprechenden Phagenpartikel (z. B. Cunningham et al., EMBO J., 13: 2508–2515 (1994)). Ein Vektor wurde konstruiert, in dem reifes humanes IGF-1 an die carboxyterminale Domäne des Produktes des GenIII aus M13 fusioniert wurde. Dieses Konstrukt beinhaltet die stII-Signalsequenz, die das Fusionsprotein in den periplasmatischen Raum von E. coli leitet und eine monovalente Präsentation des Proteins erlaubt (Bass et al., supra; Lowman et al., supra, 1991). Für Klonierungszwecke wurden die erste und die letzte Aminosäure von IGF-1 ausgetauscht; die resultierende Mutante G1S-A70V wurde als das Matrizenkonstrukt für die anschließende Alanin-Scanning-Mutagenese verwendet.
Wenn IGF-1 G1S-A70V präsentierende Phagenpartikel isoliert wurden und in einem Bindungs-Kompetitions-Phagen-ELISA auf ihre Affinität zu IGFBPs untersucht wurden, wurde der IC50-Wert in diesem Experiment für IGFBP-1 auf 8,5 nM und für IGFBP-3 auf 0,5 nM bestimmt (13). Diese Werte sind in guter Übereinstimmung mit den durch BIACORE^TM-Experimenten bestimmten Dissoziationskonstanten unter Verwendung von Wildtyp-IGF-1 (Heding et al., J. Biol. Chem., 271: 13948–13952 (1996)). Die durch radioaktive Immunoassays (RIA) bestimmten Wildtyp-IGF-1-Affinitäten betragen ~2,8 nM für IGFBP-1 und ~0,8 nM für IGFBP-3, die weiterhin die aus dem Phagen-ELISA abgeleiteten IC₅₀-Werten bestätigen. Zusätzlich wurden die IGF-1 G1S-A70V präsentierenden Phagenpartikel wirksam durch 11 unabhängige monoklonale Maus-Anti-IGF1-Antikörper, immobilisiert auf Mikrotiterplatten, erfasst. Diese Resultate legen zusammen nahe, dass die präsentierte IGF-Variante korrekt gefaltet und auf der Oberfläche der Phagenpartikel zugänglich ist.
Ala-Scanning Mutagenese der IGF-1-Bindung an IGFBP-1 und IGFBP-3

Alle Reste des G1S-A70V IGF-1, mit Ausnahme der vier nativen Alanine und sechs Cysteine, wurden einzeln durch Alanin substituiert, unter Verwendung des beschriebenen G1S-A70V IGF-1 gIII-Vektors als Matrize. Zusätzlich wurden die Einzelmutanten S1G und V70A, und die Wildtyp-IGF-1 wiederherstellende Doppelmutation hergestellt. Jedes dieser Konstrukte wurde in E. coli exprimiert und auf Phagen präsentiert. Die IC₅₀-Werte für die Bindung an IGFBP-1 und IGFBP-3 wurden durch kompetitiven Phagen-ELISA, wie in 13 gezeigt, bestimmt. Mindestens zwei unterschiedliche Klone jeder Mutante wurden getestet. Die resultierenden IC₅₀-Werte sind in Tabelle XIII aufgelistet und der Gewinn oder Verlust in IC₅₀ in Bezug auf G1S-A70V ist für jede Mutante graphisch dargestellt in 14. TABELLE XIII Apparente Affinitäten (IC₅₀) von IGF-1-Varianten für IGFBP-1 und IGFBP-3 bestimmt durch Phagen Displays^a

	IGFBP-1		IGFBP-3
IGF-1-Mutante	IC₅₀ (nM)	relativer IC₅₀	IC₅₀ (nM)	relativer IC₅₀	relative Spezifität
S1A	5,2 ± 0,9	0,6	0,91 ± 0,32	1,2	0,5
P2A	11,0 ± 3,7	1,3	0,81 ± 0,18	1,1	1,2
E3A	278 ± 86	33,9	1,05 ± 0,08	1,4	24,2
T4A	19,4 ± 6,4	2,4	0,80 ± 0,02	1,1	2,2
L5A	55,3 ± 11,6	6,7	1,53 ± 0,22	2,0	3,3
G7A	> 1000	> 100	4,58 ± 0,28	6,1	> 16
E9A	8,6 ± 0,6	1,0	1,32 ± 0,30	1,8	0,6
L10A	311 ± 87	37,9	3,55 ± 0,33	4,7	8,1
V11A*	n. d.		n. d.	-	-
D12A	4,3 ± 0,8	0,5	1,49 ± 038	2,0	0,3
L14A	36,7 ± 1,1	4,5	0,90 ± 0,04	1,2	3,7
Q15A	13,9 ± 0,9	1,7	1,26 ± 0,41	1,7	1,0
F16A	57,8 ± 20,1	7,0	1,32 ± 0,25	1,8	4,0
V17A	42,9 ± 3,2	5,2	3,67 ± 1,02	4,9	1,1
G19A	11,0 ± 2,3	1,3	0,90 ± 0,28	1,2	1,1
D20A	8,4 ± 4,1	1,0	1,11 ± 0,06	1,5	0,7
R21A	7,1 ± 1,6	0,9	0,58 ± 0,01	0,8	1,1
G22A	15,9 ± 2,8	1,9	2,07 ± 0,11	2,8	0,7
F23A	10,9 ± 1,9	1,3	2,18 ± 0,01	2,9	0,5
Y24A	13,3 ± 2,9	1,6	2,53 ± 0,76	3,4	0,5
F25A	181 ± 46	22,1	3,69 ± 0,25	4,9	4,5
N26A	9,1 ± 1,8	1,1	0,90 ± 0,07	1,2	0,9
K27A	12,8 ± 0,1	1,6	0,66 ± 0,35	0,9	1,8
P28A	9,3 ± 1,4	1,1	1,41 ± 0,05	1,9	0,6
T29A	7,3 ± 2,4	0,9	1,23 ± 0,16	1,6	0,5
G30A	7,1 ± 1,7	0,9	0,58 ± 0,11	0,8	1,1
Y31A	6,8 ± 0,5	0,8	0,73 ± 0,10	1,0	0,9
G32A	10,9 ± 1,3	1,3	0,76 ± 0,28	1,0	1,3
S33A	9,1 ± 1,0	1,1	1,01 ± 0,24	1,3	0,8
S34A	9,5 ± 0,7	1,2	1,65 ± 0,21	2,2	0,5
S35A	11,7 ± 0,6	1,4	0,47 ± 0,01	0,6	2,3
R36A*	n. d.		n. d.	-	-
R37A	12,3 ± 0,1	1,5	0,75 ± 0,08	1,00	1,5
P39A*	n. d.		n. d.	-	-
Q40A	10,2 ± 0,9	1,2	0,56 ± 0,03	0,7	1,7
T41A	13,7 ± 3,1	1,7	0,43 ± 0,06	0,6	2,9
G42A	15,7 ± 3,4	1,9	0,53 ± 0,20	0,7	2,7
I43A	31,3 ± 4,1	3,8	1,17 ± 0,07	1,6	2,4
V44A	18,8 ± 5,4	2,3	1,03 ± 0,06	1,4	1,7
D45A	4,7 ± 0,7	0,6	0,69 ± 0,21	0,9	0,6
E46A	7,9 ± 2,1	1,0	0,94 ± 0,28	1,3	0,8
F49A	> 1000	> 100	2,72 ± 1,11	3,6	> 28
R50A	16,2 ± 1,8	2,0	0,64 ± 0,18	0,9	23
S51A	13,4 ± 0,4	1,6	0,65 ± 0,35	0,9	1,9
D53A	15,3 ± 2,8	1,9	1,05 ± 0,11	1,2	1,6
L54A	23,1 ± 12,0	2,8	1,83 ± 0,91	2,4	1,2
R55A	9,0 ± 2,3	1,1	0,66 ± 0,03	0,9	1,2
R56A	13,1 ± 1,8	1,6	1,00 ± 0,19	1,3	1,2
L57A	21,8 ± 5,6	2,7	1,78 ± 0,56	2,4	1,1
E58A	11,9 ± 1,8	1,5	1,03 ± 0,47	1,4	1,1
M59A	13,1 ± 1,8	1,6	0,74 ± 0,14	1,0	1,6
Y60A	6,6 ± 1,8	0,8	0,52 ± 0,01	0,7	1,2
P63A	> 1000	> 100	> 100	> 100	-
L64A	12,1 ± 3,3	1,5	0,93 ± 0,03	1,2	1,2
K65A	12,4 ± 0,6	1,5	0,69 ± 0,05	0,9	1,6
P66A	9,4 ± 3,2	1,1	0,57 ± 0,12	0,8	1,5
K68A	10,5 ± 2,8	1,3	0,76 ± 0,23	1,0	1,3
S69A	12,8 ± 2,3	1,6	0,71 ± 0,62	1,2	1,3
V70A	19,1 ± 0,7	2,3	0,68 ± 0,15	0,9	2,6
S1G	11,2 ± 1,1	1,4	0,99 ± 0,42	1,3	1,0
IGF-WT	8,4 ± 0,8	1,0	1,01 ± 0,42	1,3	0,8
G1S-A70V	8,2 ± 1,6	1,0	0,75 ± 0,32	1,0	1,0
Ala(1–3)-IGF	90,4 ± 9,6	11,0	1,12 ± 0,04	1,5	7,3
Des(1–2)-IGF	5,0 ± 0,1	0,6	0,53 ± 0,03	0,7	0,9

^aDie mit einem Sternchen vermerkten Varianten wurden nicht erfolgreich auf Phagen präsentiert (n. d.), wie aus im Text beschriebenen Antikörperexperimenten beurteilt. Relativer IC₅₀ ist definiert als IC_50mut/IC_50G1S-A70V. Die relative Spezifität ist definiert als relativer IC_50IGFBP-1/relativer IC_50IGFBP-3 für jede Variante.

Die Mehrheit der Alaninmutanten erbrachte nur geringfügige Veränderungen in den IC₅₀-Werten im Phagen ELISA. Wildtyp-IGF-1 zeigte bedeutend die gleichen Affinitäten für IGFBP-1 und IGFBP-3 wie G1S-A70V, in dessen Hintergrund die Alaninsubstitutionen durchgeführt wurden (Tabelle XIII, 14). Nur einige wenige Reste verursachten beträchtliche (> 10-fach) Verluste in der Affinität, wenn sie gegen Alanin ausgetauscht wurden: E3, G7, L10, V11, F25, R36, P39, F49 und P63 für die IGFBP-1-Bindung; V11, R36, P39 und P63 für die IGFBP-3-Bindung. Es wurde bemerkt, dass Alaninsubstitutionen von Glycinen und Prolinen zu strukturellen Störungen des Proteinrückgrats führen können (Di Cera, Chem. Rev., 98: 1563–1591 (1998)).
Nur einige wenige moderate Verbesserungen der Bindungsaffinität wurden für Alaninaustausche gefunden. S1A, D12A und D45A zeigten einen ungefähr 2-fachen Anstieg in der IGFBP-1-Bindung, während S35 und T41A einen ähnlichen Effekt für IGFBP-3 zeigten. Zweifache Unterschiede in den IC₅₀-Werten sind jedoch in diesen Experimenten an der Grenze der Präzision.
IGFBP-Spezifitätsdeterminanten
E3A, G7A, LIGA, F25A und F49A zeigten einen unterschiedlichen Effekt in der Bindung von IGFBP-1 im Vergleich zu IGFBP-3. Für diese fünf IGF-1-Einzel-Alanin-Mutanten unterscheidete sich der relative IC₅₀ für IGFBP-1 mehr als 4-fach von dem für IGFBP-3 (14, Tabelle XIII, relative Spezifität). E3A und F49A zeigten die größten relativen Spezifitätsfaktoren in dieser Gruppe. Alaninsubstitution von E3 hatte nahezu keinen Effekt auf die IGFBP-3-Affinität (1,4-fach), während Bindung an IGFBP-1 34-fach geschwächt war. Die Affinität von F49A war noch dramatischer mehr als 100-fach für IGFBP-1, aber nur 3,6-fach für IGFBP-3 reduziert. Dieses Ergebnis wurde in einem direkten Vergleich durch Phagen-ELISA veranschaulicht. IGF-1 F49A präsentierende Phagenpartikel wurden zu IGFBP-3 beschichteten Wells in Gegenwart von löslichem IGFBP-1 (15A) oder IGFBP-3 (15B) hinzugefügt. Verglichen zum IGF-1 G1S-A70V präsentierenden Kontrollphagen war die Bindungskurve von F49A durch mehr als zwei Zehnerpotenzen in der IGFBP-1-Kompetition verändert (15A). Im Gegensatz dazu waren die Bindungskurven in der IGFBP-3-Kompetition ähnlich und die IC₅₀-Werte unterschieden sich weniger als ein Faktor von 4 (15B). Daher sind E3 und F49 zwei Hauptspezifitätsdeterminanten für IGFBP-1-Bindung in dem IGF-1-Molekül.
Die Reste G7, L10 und F25 schienen für die Bindung beider IGFBPs wichtig zu sein, obwohl sie einen ausgeprägteren Verlust von Affinität für IGFBP-1 als für IGFBP-3 zeigen, wenn sie durch Alanine substituiert werden. Es wurde keine signifikante Determinante für die Spezifität für IGFBP-3 identifiziert, wie eine Mutante, die stärker an IGFBP-1 als an IGFBP-3 bindet. Die Mutationen E9A, D12A, F23A, Y24A, T29A, S34A und D45A hatten jedoch leicht größere (etwa zweifache) Effekte auf die IGFBP-3- als die IGFBP-1-Bindung.
BIACORE^TM-Messungen von gereinigten löslichen IGF-Mutanten
Zur Validierung der durch Phagen-ELISA erhaltenen Ergebnisse wurden spezifische Alaninmutanten für die kinetische Analyse unter Verwendung eines BIACORE^TM-Messgerätes exprimiert und aufgereinigt. Die Dissoziationskonstante von Wildtyp-IGF-1 wurde bestimmt als 13 nM für IGFBP-1 und 1,5 nM für IGFBP-3 (17A und 17B; Tabelle XIV). Der Unterschied in der Affinität für IGFBPs ist in einer 10-fach schnelleren Assoziationsrate (k_a) von IGF-1 an IGFBP-3 (3,2 × 10⁵ versus 3,2 × 10⁴ M^–1s^–1) begründet. Diese Ergebnisse entsprechen gut den durch Phagen-ELISA bestimmten absoluten IC₅₀-Werten (13A und 13B; Tabelle XIII). Wie erwartet zeigte die Doppelmutante G1S-A70V vom Wildtyp im Wesentlichen unterscheidbare kinetische Parameter (Tabelle XIV).
V11A, R36A und P39A wurden getestet, da diese Varianten nicht korrekt auf dem Phagen präsentiert wurden, basierend auf den Antikörper-Erkennungsexperimenten (siehe oben). R36A und P39A zeigten Wildtyp-Kinetiken für beide Bindungsproteine, während V11A eine fünffache Reduktion in der Affinität für IGFBP-1 als auch für IGFBP-3 zeigte.
Es wurde außerdem beschlossen, die lösliche IGF-Variante T4A zu untersuchen. Dieser Rest wurde in früheren Publikationen mit IGFBP-Bindung in Zusammenhang gebracht (Bayne et al., J. Biol. Chem., 263: 6233–6239 (1988); Clemmons et al., J. Biol. Chem., 265: 12210–12216 (1990)), aber zeigte hierin in den Phagenassays nur mäßige Effekte. Der Anstieg in den K_D-Werten von T4A bezüglich des Wildtyp-IGF-1 war ungefähr 2- bis 3-fach höher als die durch Phagen-ELISA bestimmten IC₅₀-Verhältnisse (Tabelle XIV). Eine größere Diskrepanz zwischen den Ergebnissen, die durch Phagen und der Biosensoranalyse erhalten wurden, wurde für F16A gesehen. In diesem Fall unterschieden sich die beiden Verfahren um einen Faktor von 4.

Es wurde gezeigt, dass Mutationen in dem ersten α-helikalen Bereich einen destabilisierenden Effekt auf die IGF-Proteinstruktur haben (Jansson et al., Biochemistry, 36: 4108–4117 (1997)). Ohne sich auf irgendeine Theorie zu beschränken, wird angenommen, dass das g3-Fusionsprotein auf der Oberfläche des Phagen stabiler sein könnte als das rückgefaltete aufgereinigte lösliche Protein. Dies wird unterstützt durch die für F25A und F49A, zwei Resten, die sich außerhalb der strukturell sensitiven N-terminalen Helix befinden, erhaltenen BIACORE^TM-Ergebnisse. Die jeweiligen Änderungen in den K_D- und IC₅₀-Werten sind in exzellenter Übereinstimmung für diese zwei Mutanten (Tabelle XIV). Der unterschiedliche Effekt von F49A auf die Bindung an die IGFBPs wurde durch BIACORE^TM-Analyse bestätigt. Eine 70-fache Abnahme in der Affinität wurde für die IGFBP-1-Bindung gemessen (17C; Tabelle XIV), während die IGFBP-3-Bindung nur 4-fach reduziert war (17D; Tabelle XIV). TABELLE XIV Kinetische Parameter für die Interaktion von aufgereinigten IGF-1-Varianten mit IGFBP-1 und -3 bestimmt durch BIACORE^TM-Analyse^a Bindung an IGFBP-1

	k_a	K_d	K_D	Relativer K_D	Relativer IC₅₀
	(×10⁴ M^–1s^–1)	(×10⁴ s^–1)	(nM)
IGF-1WT	3,2 ± 0,2	4,1 ± 0,2	13,0 ± 1,0	1,0	1,0
G1S-A70V	3,2 ± 0,2	4,5 ± 0,01	14,0 ± 0,7	1,1	1,0
T4A	1,9 ± 0,2	16,7 ± 1,6	90,0 ± 11,0	6,9	2,4
V11A	1,9 ± 0,1	12,3 ± 0,6	66,5 ± 4,5	5,1	-
F16A	1,9 ± 0,6	60,3 ± 4,5	321 ± 98	25	6,0
F25A	1,5 ± 0,5	49,0 ± 5,7	323 ± 107	25	22
R36A	4,0 ± 0,2	5,6 ± 0,2	13,9 ± 0,8	1,1	-
P39A	3,1 ± 0,2	4,2 ± 0,1	13,6 ± 0,8	1,0	-
F49A	1,26 ± 0,8	115 ± 1,5	913 ± 551	70	> 100

Bindung an IGFBP-3

	k_a	K_d	K_D	Relativer K_D	Relativer IC₅₀
	(×10⁵ M^–1s^–1)	(×10⁴ s^–1)	(nM)
IGF-1 WT	3,2 ± 0,5	4,7 ± 0,8	1,5 ± 0,3	1,0	1,4
G1S-A70V	2,9 ± 0,8	6,3 ± 0,5	2,2 ± 0,6	1,5	1,0
T4A	1,8 ± 0,6	5,5 ± 0,1	3,1 ± 1,0	2,1	1,1
V11A	3,1 ± 0,5	20,9 ± 2,8	6,7 ± 1,3	4,5	-
F16A	1,1 ± 0,4	11,4 ± 2,7	10,3 ± 4,7	6,9	1,8
F25A	1,5 ± 0,5	11,8 ± 0,1	7,7 ± 0,3	5,1	4,9
R36A	4,0 ± 0,1	4,7 ± 0,2	1,2 ± 0,1	0,8	-
P39A	2,7 ± 0,2	6,0 ± 0,3	2,2 ± 0,2	1,5	-
F49A	2,7 ± 0,7	17,1 ± 0,9	6,3 ± 1,7	4,2	3,6

^aDie relativen Änderungen in den Dissoziationskonstanten (K_Dmut/K_Dwt) werden mit den durch Phagen-Display bestimmten relativen IC₅₀-Werten (IC_50mut/IC_50G1s-A70V) verglichen (Tabelle XIII).

Rolle der N-terminalen IGF-1-Reste
Überraschender Weise war die IGFBP-3-Interaktion im Allgemeinen sehr viel geringer durch die Alaninsubstitutionen beeinträchtigt als die Interaktion mit IGFBP-1, trotz der Tatsache dass IGFBP-3 IGF-1 mit ungefähr 10-fach höherer Affinität bindet. Mit Ausnahme von P63A zeigte keine Alaninmutante eine > 6-fache Reduktion in der IGFBP-3-Affinität (14; Tabelle XIII).
Es wurde früher in Biosensorexperimenten gezeigt, dass des(1–3)-IGF-1 IGFBP-3 mit 25-fach reduzierter Affinität bindet (Heding et al., supra). Dieser natürlich vorkommenden Form von IGF-1 fehlen die ersten drei N-terminalen Reste und sie zeigt eine angestiegene mitogene Potenz, vermutlich auf Grund ihrer Reduktion in der IGFBP-Bindung (Bagley et al., Biochem. J., 259: 665–671 (1989)). Da keine der ersten drei Aminosäureseitenketten eine Energie zur Bindung an IGFBP-3 (Tabelle I) beizutragen scheinen, aber dennoch des (1–3)-IGF-1 in der IGFBP-3-Bindung beeinträchtigt, wird, ohne sich auf irgendeine Theorie zu beschränken, angenommen, dass Rückgratinteraktionen einbezogen sein könnten.
Diese Hypothese wurde durch Repräsentieren einer Dreifach-Alanin-Mutante (Ala(1–3)-IGF-1), die die ersten drei N-terminalen Aminosäuren substituieren, auf einem Phagen getestet. Wenn das Rückgrat in diesem Bereich zu der Interaktion mit IGFBP-3 beiträgt, sollte diese Mutante fähig sein zu binden. Bindung an IGFBP-1 sollte jedoch auf Grund des Fehlens der E3-Seitenkette (Tabelle I) reduziert sein. Als eine Kontrolle wurde die des(1–2)-IGF-1-Mutante generiert, um jegliche potentielle Rückgratinteraktionen mit IGFBP-1 an Positionen 1 und 2 zu testen. Wie erwartet, zeigte Ala(1–3)-IGF-1 eine herabgesetzte IGFBP-1-Affinität, ähnlich zu E3A, aber keine Änderung in der IGFBP-3-Affinität (14; Tabelle XIII). Für des(1–2)-IGF-1 wurde kein Unterschied in der Affinität für beide Bindungsproteine beobachtet. In Kombination mit den Beobachtungen von des(1–3)-IGF-1 (Heding et al., supra) legen diese Ergebnisse nahe, ohne sich auf irgendeine Theorie zu beschränken, dass das Peptidrückgrat zwischen Rest 3 und 4 von IGF-1 wichtige Interaktionen mit IGFBP-3 vermittelt.
Diskussion:
Die funktionellen IGFBP-1- und IGFBP-3-Bindungsepitope auf der Oberfläche von IGF-1 wurden durch Alanin-Scanning-Mutagenese untersucht. Beide Bindungsepitope sind veranschaulicht in 18. Individuelle IGF-1-Seitenketteninteraktion spielen eine sehr viel wichtigere Rolle für die Bindung an IGFBP-1 als für die Bindung an IGFBP-3. Es sind zwei Hauptbindungsstellen für IGFBP-1 gefunden (18A). Eine befindet sich auf der oberen Seite der N-terminalen Helix (bestehend aus G7, L10, V11, L14, F25, I43 und V44) und eine auf der Unterseite (bestehend aus E3, T4, L5, F16, V17, und L54). Diese beiden Bindungsstellen sind verbrückt durch F49 und R50. Für IGFBP-3 ist das Bindungsepitop diffuser und ist versetzt um G22, F23 und Y24 (18B) einzuschließen. Bindung an IGFBP-3 ist im Allgemeinen weniger sensitiv gegenüber Alaninsubstitutionen. Tatsächlich ist die größte Reduktion der Affinität (mit Ausnahme von P63A, siehe nachstehend) eine für G7A gesehene 6-fache Abnahme. Dieses Ergebnis ist verblüffend, da IGFBP-3 mit 10-fach höherer Affinität an IGF-1 bindet als IGFBP-1. Höchstwahrscheinlich, ohne sich auf jegliche Theorie zu beschränken, tragen aus dem IGF-1-Hauptkettenrückgrat stammende Interaktionen zu der Bindung an IGFBP-3 bei. Diese Hypothese wird weiter erhärtet durch die Experimente mit der Ala(1–3)-IGF-Mutante. Während die Einzel- und Dreifach-Alaninsubstitutionen keinen Effekt auf die IGFBP-3-Bindung haben, resultierte die Deletion der ersten drei Aminosäuren in einer 25-fachen Abnahme der Affinität (Bagley et al., supra; Clemmons et al., Endocrinology, 131: 890–895 (1992); Heding et al., supra). Zu sammenfassend verwendet IGF-1 unterschiedliche Bindungsarten um mit IGFBP-1 und IGFBP-3 zu assoziieren: einige Aminosäureseitenketteninteraktionen sind wichtig für die Bindung an IGFBP-1, während Rückgratinteraktionen eine hauptenergetische Rolle für die Bindung an IGFBP-3 zu spielen scheinen.
Eine kürzliche Publikation untersuchte das Bindungsepitop auf IGF-1 für IGFBP-1 durch hetronukleare NMR-Spektroskopie (Jansson et al., J. Biol. Chem., 273: 24701–24707 (1998)). Die Autoren fanden, dass die IGF-1-Reste 29, 30, 36, 37, 40, 41, 63, 65 und 66, neben anderen, chemische Verschiebungsstörungen erfuhren, nach Komplexierung mit IGFBP-1 bei 30°C. Außerdem identifizierten Jansson und Mitarbeiter R36, R37 und R50 als Teil des funktionellen Bindungsepitops und testeten diese Alaninmutanten in BIACORE^TM-Experimenten. Die größte durch diese Autoren beobachtete Änderung in der Affinität war eine 3-fache Abnahme für R50A. Auf Grund der strukturellen Flexibilität von IGF-1, die schon in der ersten NMR-Studie des Hormons beobachtet wurde (Cooke et al., supra), waren jedoch Jansson et al. nicht im Stande, viele Reste dem NMR-Spektrum komplett zuzuordnen, einschließlich F49.
In ähnlichen Studien von Protein-Protein-Schnittstellen wurde herausgefunden, dass nur einige wenige Seitenkettenreste zur Masse der freien Bindungsenergie beitragen (Clackson und Wells, Science, 267: 383–386 (1995); Kelley et al., Biochemistry, 34: 10383–10392 (1995)). Das gleiche gilt für die IGF-1-IGFBP-1-Interaktion. Die Größenordnung der aus den wichtigen Seitenketten abstammenden freien Bindungsenergiewerten (ΔΔG) ist hier jedoch geringer als in dem Fall des Wachstumshormons (Kelley et al., supra), wie es auch bemerkt war für die Bindung von Gewebefaktor an Faktor VIIa. Die Reste mit vorherrschenden ΔΔG-Beiträgen waren nicht auf der IGF-1-Oberfläche geclustert, wie in der Wachstumshormonrezeptorschnittstelle (Clackson und Wells, supra), aber bilden immer noch ein kontinuierliches IGFBP-1-Bindungsepitop aus (18A). Im Gegensatz dazu ist das IGFBP-3-Bindungsepitop auf IGF-1 diskontinuierlich, und Seitenketten trugen nur sehr mäßig individuelle Bindungsenergien bei.
Substitution von P63 durch Alanin in IGF-1 resultiert in einer herabgesetzten Affinität für beide Bindungsproteine, die nicht in dem Konzentrationsbereich, der in dem Kompetitionsphagen-ELISAs verwendet wurde, gemessen werden konnte. In Bezug auf das Hauptbindungsepitop befindet sich jedoch der Rest P63 auf der entgegengesetzten Seite des IGF-1-Moleküls. Außerdem wurde bemerkt, dass Alanin-Substitutionen von Glycinen und Prolinen zu strukturellen Veränderungen führen können (Di Cera, supra). Zusätzlich schlussfolgerten Jansson et al., 1998, supra, dass der C-terminale Teil von IGF-1 nicht in direkten IGF-1-Kontakten einbezogen ist, sondern eher indirekten konformationellen Änderungen nach Komplexausbildung untergeht. Eine ausführliche Charakterisierung von Antikörperbindungsstellen auf IGF-1 wurde durch Mañes et al., Endocrinology, 138: 905–915 (1997) ausgeführt. Sie zeigten simultane Bindung von IGFBP-1 oder -3 an IGF-1 im Komplex mit Antikörpern, die die C-terminale D-Domäne erkennen. Diese Ergebnisse unterstützen weiterhin frühere Beobachtungen, dass die D-Domäne, anfangend mit Rest P63, nicht in der Bindung von IGFBP-1 oder -3 einbezogen ist (Bayne et al., supra, 1988).
Die Hauptdiskrepanz zwischen einem IC₅₀-Verhältnis, das durch Phagen-ELISA und einem BIACORE^TM-Ergebnis erhalten wurde, wurde mit dem Rest F16 beobachtet. Wie bereits erwähnt, induzierte die Substitution dieses Restes durch Alanin strukturelle Änderungen in dem IGF-1-Molekül (Jansson et al., supra, 1997). Der gleiche Effekt wurde mit dem K_D in den BIACORE^TM-Ergebnissen beobachtet, aber die Affinitätsabnahme war in den Phagen-ELISA-Experimenten geringer ausgeprägt (siehe Tabelle II). Beide BIACORE^TM-Messungen verwendeten IGF-F16A, das während des Aufreinigungsverfahrens rückgefaltet wurde (Jansson et al., supra, 1997). Im Phagen-Display wird jedoch das Protein von Interesse natürlich durch die Sekretionsmaschinerie von E. coli translociert. Die niedrige Proteinmenge in monovalentem Phagen-Display (< 1 Molekül pro Phagenpartikel) könnte Aggregation und Missfaltung entgegenwirken. Zusätzlich könnte das Fusionieren von IGF-1 zu dem verkürzten g3-Phagenprotein einen stabilisierenden Effekt auf die native Struktur des Peptids ausüben.
Die Spiegel an IGFPB-3 werden positiv durch IGF-1 reguliert. Die Rolle von IGFBP-1 ist im Gegensatz dazu weniger klar. Diese Klasse von Bindungsproteinen kommt im Allgemeinen weniger häufig vor als IGFBP-3, und ihre Spiegel sind negativ reguliert durch Insulin (Bach und Rechler, supra; Clemmons, supra, 1997; Jones und Clemmons, supra).
Basierend auf den Ergebnissen hierin, werden IGFBP-spezifische IGF-1-Varianten erhalten. Kombination von mehreren Alaninmutationen generiert eine Variante, die IGFBP-1 sehr schwach bindet, während sie hoch affine Bindung für IGFBP-3 beibehält. Der Entwurf von IGFBP-1-spezifischen Varianten, die nicht länger an IGFBP-3 binden, kann Phagen-Display von IGF-1 und die zufällige Anordnung von Aminosäuren an spezifischen Positionen einbeziehen (Cunningham et al., 1994, supra; Lowman und Wells, J. Mol. Biol., 243: 564–578 (1993)).
Schlussfolgerung:
Wichtige Reste für die Bindung an IGFBP-1- und IGFBP-3 in IGF-1 wurden identifiziert. Mehrere Reste wurden gefunden, die die Bindungsspezifität für ein spezielles IGFBP bestimmen. Kürzliche Publikationen (Loddick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 1894–1898 (1998); Lowman et al., supra, 1998) berichteten Tierstudien, wo erhöhte Pools von bioverfügbarem „freiem" IGF-1 durch Ersetzen von endogenem IGF-1 aus Bindungsproteinen generiert wurden. IGFBP spezifische IGF-1-Varianten könnten, wie hierin beschrieben, diagnostisch und therapeutisch verwendet werden.
BEISPIEL 7
Charakterisierung von gewissen IGF-1-Analoga
Materialien und Methoden:
Herstellung der IGF-1-Analoga
In Beispiel 6 (und in Dubaquié und Lowman, supra) wurden IGF-1-Analoga identifiziert, in denen die Bindungsaffinität für IGFBP-1, IGFBP-3 oder beiden Bindungsproteinen reduziert war. Insbesondere die gesamte Alanin-Scanning-Mutagenese von IGF-1 identifizierte Glutaminsäure 3 (E3) und Phenylalanin 49 (F49), als auch Phenylalanin 16 (F16) und zu einem gewissen Grad Phenylalanin 25 (F25), als Spezifitätsdeterminanten für die Bindung an IGFBP-1. Phagen Display Alanin-Scanning Ergebnisse legen nahe, dass beide Seitenketten an Positionen 3 und 49 selektiv erhebliche Bindungsenergie für die Komplexausbildung mit IGFBP-1 beitragen (~30-facher Verlust der Affinität für E3A, ~100-fach für F49A), während ihr Beitrag in der Bindungsenergie für IGFBP-3 nicht detektierbar ist (E3A) oder geringfügig ist (~4-fach für F49A) (siehe Beispiel 1 und Dubaquié und Lowman, supra).
Eine weiterhin verbesserte Spezifität für IGFBP-3 würde wahrscheinlich durch kumulative Mutation von IGF-1 erreicht werden, da die Effekte von Punktmutationen, im Bezug zu ihrem Beitrag zu der freien Bindungsenergie, oft additiv sind (Wells, Biochemistry, 29: 8509 (1990)). Daher wurde eine Doppelmutante von IGF-1, E3A/F49A durch Kombinieren der Punktmutationen E3A und F49A in einem einzelnen Molekül hergestellt. Obwohl F16A einen geringeren IGFPB-Spezifitätseffekt zeigte (Beispiel 1 und Dubaquié und Lowman, supra) wurde auch die Doppelmutante F16A/F49A hergestellt.
Es wurde auch eine neue Punktmutante von IGF-1, Y31C, das ein mutmaßlich ungepaartes Cysteinthiol enthält, hergestellt, um stellenspezifische Immobilisierung von IGF-1 für Bindungsassays zu ermöglichen. Es wurde Y31C ausgewählt, da es außerhalb der Bindungsepitope für IGFBP-1 und IGFBP-3 liegt (Dubaquié und Lowman, supra). Diese Immobili sierungstechnik gewährleistet eine einheitliche Ligandenpopulation (Cunningham und Wells, J. Mol. Biol., 234: 554 (1993)) für die Bindung durch die injizierten Analyte (d. h. IGF-Bindungsprotein). Der Vorteil dieses Verfahrens gegenüber der vorher angewendeten Aminkopplung ist, dass der IGF-1-Endterminus ungeblockt und frei von jeglicher möglicher Aminbindungen an die Chipmatrix ist. Dies kann insbesondere wichtig für die Bindungsanalyse von IGFBP-1, für das angenommen wird dass es mit Seitenketten des IGF-1-N-Terminus interagiert (Dubaquié und Lowman, supra), wichtig sein. Auf Phagen repräsentiertes Y31C zeigte Wildtyp-artige Affinitäten für IGFBP-1, als auch IGFBP-3, was die Beobachtung unterstützt, dass der Bereich um Rest 31 wichtig für die Rezeptorbindung ist, aber keinen Kontakt mit den Bindungsproteinen ausbildet (Bayne et al., J. Biol. Chem., 264: 11004 (1988); Bayne et al., J. Biol. Chem., 265: 15648 (1989)).
Einzel-Alanin-Varianten von IGF-1, einschließlich F49A, als auch die E3A/F49A-Doppelmutante, wurden exprimiert, aufgereinigt und rückgefaltet, um das richtige Disulfidisomer zu ergeben, wie durch HPLC-Analyse nachgewiesen (Beispiel 1 hierin und Dubaquié und Lowman, supra). Diese Varianten wurden in Assays auf spezifische Bindungsproteinbindung und Rezeptoraktivierung getestet.
Ergebnisse:
IGFBP-1 und IGFBP-3 Bindungsaffinität

Die Bindungsaffinitäten dieser Varianten für IGFBP-1 und IGFBP-3 wurden verglichen zu der von Wildtyp IGF-1 unter Verwendung der BIACORE^TM-Analyse. Kinetische Experimente mit IGFBP-3-Bindung zu immobilisiertem IGF-1 oder Varianten (Tabelle III) wurden wie in Beispiel 1 und in Dubaquié und Lowman, supra, beschrieben durchgeführt und mit F49A-IGF-1 und Wildtyp IGF-1 verglichen. In diesem Assay war die Doppelmutante E3A/F49A etwa 20-fach schwächer in der Bindungsaffinität für IGFBP-3 als der Wildtyp, und die Doppelmutante F16A/F49A war etwa 66-fach schwächer (Tabelle XV). TABELLE XV Kinetiken der IGFBP-3-Bindung an IGF-1 (*Werte aus Tabelle II aus Beispiel 1)

Immobilisiertes Protein	IGFBP-3
Immobilisiertes Protein	K_a (×10⁵ M^–1)	k_d (×10^–4 s^–1)	K_D (nM)
IGF-1*	3,2 ± 0,5	4,7 ± 0,8	1,5 ± 0,3
F49A IGF-1*	2,7 ± 0,7	17,1 ± 0,9	6,3 ± 1,7
E3A/F49A IGF-1	0,74 ± 0,4	13,3 ± 0,6	22,2 ± 10,3
F16A/F49A IGF-1	0,4 ± 0,1	38,6 ± 2,7	99,0 ± 26,0

Für Messungen von IGFBP-1-Bindung an IGF-1 wurden kinetische Experimente unter Verwendung einer Einzel-Cystein-IGF-1-Variante, Y31C, die auf der Sensorchipoberfläche über eine Disulfidbindung immobilisiert wurde (BIACORE^TM System Manual Supplement, 5a-1, Pharmacia (1991)) durchgeführt. Die Ergebnisse sind konsistent (Tabelle XVI) mit der unter Verwendung von Wildtyp IGF-1, immobilisiert über nicht-spezifische Aminkopplung zu dem Biosensorchip (Beispiel 1 und Dubaquié und Lowman, supra), gemessenen Bindungsaffinität. TABELLE XVI Kinetiken der IGFBP-1-Bindung an IGF-1 (*Werte aus Tabelle XIV aus Beispiel 6)

Immobilisiertes Protein IGFBP-1

k_a (×10⁴ M^–1) k_d (×10^–4 s^–1) K_D (nM)

Y31C IGF-1 3,9 ± 0,4 3,8 ± 0,1 10,0 ± 1,1

IGF-1* 3,2 ± 0,2 4,1 ± 0,2 13,0 ± 1,0
Die Bindung von F49A und E3A/F49A an IGFBP-1 war für genaue Kinetikmessungen zu schwach. Daher wurde ein kompetitiver Bindungsassay ( WO 98/45427 , veröffentlicht am 15. Oktober 1998) durchgeführt, um die entsprechenden Affinitäten abzuschätzen. Die Einzel-Cystein-IGF-1-Variante, Y31C, wurde verwendet, indem sie auf eine BIACORE^TM-Biosensor-Chipoberfläche, wie obenstehend beschrieben, immobilisiert wurde. Halbmaximale inhibitorische Konzentrationswerte (IC₅₀) erbringende kompetitive Bindungsexperimente wurden wie folgt durchgeführt: 50 nM IGFBP-1 wurde mit einer Verdünnungsserie der gewünschten IGF-Variante inkubiert. Diese Proteingemischlösungen wurden bei 5 μl/min über einen B1-Chip, der das Cystein gekoppelte IGF-1-Y31C enthält (200 Response Units) injiziert. Die Menge an gebundenem IGFBP-1 wurde durch Subtrahieren nicht-spezifischer Bindung nach einer 20-minütigen Injektion bestimmt und gegen die IGF-Variantenkonzentration aufgetragen (19). Die Ergebnisse sind in Tabelle XVII gezeigt. TABELLE XVII Inhibition der IGFBP-1-Bindung an immobilisiertes Y31C-IGF-1

Immobilisiertes Protein Kompetitierendes Protein IGFBP-1 IC₅₀ (μM)

Y31C IGF-1 F49A IGF-1 1,6 ± 0,2

Y31C IGF-1 E3A/F49A IGF-1 64 ± 9
Verglichen zu Wildtyp IGF-1 hatten F49A und E3A/F49A stark herabgesetzte Bindungsaffinitäten für IGFBP-1. F49A band zu IGFBP-1 mit einem IC₅₀ von 1,6 ± 0,2 μM (Tabelle XVII), während eine hoch affine Dissoziationskonstante (K_D) von 6,3 ± 1,7 nM für IGFBP-3 beibehalten wurde (Tabelle XV). Bindung von E3A/F49A an IGFBP-1 wurde als noch schwächer bestimmt, mit einem abgeschätzten IC₅₀ von 64 ± 9 μM; (Tabelle XVII), mit einer währenddessen nur mäßig reduzierten Affinität (K_D = 22,2 ± 10,3 nM) für IGFBP-3 (Tabelle XV). Diese in vitro Messungen legen nahe, dass keine IGF-Varianten stabil mit IGFBP-1 unter physiologischen Bedingungen assoziieren sollten.
KIRA Assays der IGF-Typ-I-Rezeptor-Aktivierung
Der Kinase-Rezeptor-Aktivierungsassay (KIRA) beobachtet spezifisch und quantitativ das Maß der cytoplasmatischen IGF-Rezeptor-Phosphorylierung nach extrazellulärer Stimulation durch einen Liganden (Sadic et al., J. Pharm. Biomed. Analysis, 19 (6): 883–891 (1998)). Mehrere IGF-Varianten, G1S/A70V, T4A, V11A, F16A, F25A, F16A/F49A, R36A, P39A und F49A wurden in Einzelkonzentrationsassays der Rezeptoraktivierung getestet. Die IGFBP-1 und IGFBP-3-Bindungsaffinitäten dieser Varianten, außer für F16A/F49A, sind in Tabelle XIV und in Dubaquié und Lowman, supra, dargelegt. Tabelle XVIII fasst die relativen Affinitäten und Spezifitäten aus BIACORE^TM-Messungen zusammen.

Für den KIRA-Assay wurden die Variantenkonzentrationen grob auf 13 nM („hohe Konzentration”) oder 1,3 nM („niedrige Konzentration") abgeschätzt, basierend auf Messungen der optischen Dichte. Das für jede IGF-Variante erhaltene Signal wurde zu dem einer Standardverdünnungsserie von Wildtyp IGF-1 verglichen und im Sinne einer apparenten IGF-1-Konzentration, entsprechend zu der beobachteten Aktivität in dem KIRA-Assay, berichtet (20A und 20B). Obwohl exakte relative Wirksamkeiten nicht gemessen wurden, zeigen diese Ergebnisse, dass alle getesteten Mutanten die Fähigkeit, den IGF-Typ-I-Rezeptor zu aktivieren, beibehalten. TABELLE XVIII Relative IGFBP-1- und IGFBP-3-Affinitäten von IGF-1-Varianten. NDB, keine detektierbare Bindung; ND, nicht bestimmt; *Werte aus Tabelle XIV aus Beispiel 6

	IGFBP-1	IGFBP-3	Spezifität
IGF-1 Variante	K_D (Mutante)/K_D (IGF-1)	K_D (Mutante)/K_D (IGF-1)	Relativer BP-1/Relativer BP-3
G1S/A70V*	1,1	1,5	0,7
T4A*	6,9	2,1	3,3
V11A*	5,1	4,5	1,1
F16A*	25	6,9	3,6
F25A*	25	5,1	4,9
R36A*	1,1	0,8	1,4
P39A*	1,0	1,5	0,7
F49A*	70	4,2	16,7
F16A/F49A	ND	65,6	ND

Tabelle XVIII zeigt, dass, zusätzlich zu F49A, sowohl F16A als auch F25A wesentlich in der Affinität für IGFBP-1, aber weniger für IGFBP-3, reduziert sind. Basierend auf KIRA-Assays (20) behalten beide eine biologische Aktivität bei.
Zum Bestimmen der relativen Wirksamkeit von F49A und E3A/F49A, wurde unter Verwendung von Serienverdünnungen in KIRA-Assays ihre Fähigkeit gemessen, den Typ-I-IGF-Rezeptor zu aktivieren. Wie in den 21A–21B gezeigt, zeigen sowohl F49A als auch E3A/F49A IGF-Rezeptoraktivierungskurven, die von Wildtyp IGF-1 nicht unterscheidbar sind. Die halbmaximalen effektiven Konzentrationen (EC₅₀) waren 20,0 ± 1,3 ng/ml für F49A, 19,8 ± 0,5 ng/ml für E3A/F49A und 18,9 ± 0,2 ng/ml und 19,8 ± 0,6 ng/ml für Wildtyp IGF-1. Diese Ergebnisse legen stark nahe, dass beide IGF-Mutanten vollständig biologisch aktiv sind.
Blut-Clearance und renale Akkumulation von IGF-1-Varianten in Ratten
Um die pharmakologischen Fähigkeiten von F49A und E3A/F49A-IGF-1 zu bestimmen, wurden beide Proteine radioaktiv markiert und intravenös in Ratten verabreicht. 22A zeigt einen Zeitverlauf der Rate, mit der beide Moleküle aus dem Blut des Tieres entfernt werden. Wie auf Grund ihrer IGFBP-Affinitäten zu erwarten, wurden beide Varianten verglichen zu Wildtyp-Human-IGF-1 mit einer schnelleren Rate entfernt. Interessanter Weise wurde die Doppelmutante (E3A/F49A) schneller als die Einzelmutante (F49A) entfernt, das gut den jeweiligen Affinitäten für das Hauptbindungsprotein im Serum, IGFBP-3, korreliert (Tabelle XV). 22B zeigt die Gewebe-zu-Blut-Verteilung für die IGF-Varianten in unterschiedlichen Organen. Der Großteil der radioaktiv markierten IGF-Moleküle wurde in der Niere detektiert, währenddessen die Radioaktivitätspiegel in der Leber, Milz, Herz und Pankreas sehr viel geringer waren. Es ist erwiesen, dass die Varianten F49A und E3A/F49A in statistisch signifikant höheren Spiegeln in der Niere akkumulieren, verglichen zu Wildtyp IGF-1.
Cirkuladichroismus-Analyse von IGF-1-Varianten
Die Cirkulardichroismus-Spektren von F49A- und E3A/F49-IGF-1 wurden analysiert, um zu testen, ob die eingeführten Mutationen größere Veränderungen auf die Proteinstruktur ausüben. Strukturelle Destabilisierung könnte zu erhöhter proteolytischer Zugänglichkeit führen, was eine alternative Erklärung für die schnelleren Blut-Clearance-Raten der IGF-Varianten bereitstellt. Wie in 23 gezeigt, haben beide Mutanten jedoch nahezu identische Spektren zu dem einen, das für Wildtyp IGF-1 aufgenommen wurde. Die CD-Spektren zeigen Elemente von sowohl α-Helix als auch von zufälligen Windungen, wie aus der NMR-Spektroskopie für IGF-1 erwartet (Cooke et al., supra). Die thermale Stabilität von IGF-1 konnte durch Cirkulardichroismus nicht genau bestimmt werden, vermutlich auf Grund des relativ hohen Anteils (~30%) an zufälligen Windungen (Jansson et al., supra, 1997), die schon bei Raumtemperatur vorhanden sind. Die Tatsache, dass die CD-Spektren beider Varianten keine signifikante Abweichung vom Wildtyp IGF-1 zeigten, ist ein Hinweis darauf, dass die eingeführten Mutationen nicht die Gesamtstruktur von IGF-1 verändern.
Schlussfolgerung:
Aus den oben präsentierten Belegen wäre zu erwarten, dass die Einzel- und Doppelmutanten F16A, F16G, F16S, F25A, F25G, F25S, F49A, F49G, F49S, E3A/F49A, E3A/F49G, E3G/F49A, E3G/F49G, E3A/F49S, E3S/F49A, E3S/F49S, E3G/F49S und E3S/F49G IGF-1 wirksam in der Behandlung von Knorpelstörungen sein würden, da die alaninsubsti tuierten Mutanten eine reduzierte Affinität für IGFBP-1, ohne wesentlichen Verlust der Fähigkeit an IGFBP-3 zu binden, aufzeigen und, basierend auf vielen Tests, biologisch aktiv sind. Für diese Mutanten wird weiterhin erwartet, dass sie wirksam in der Behandlung von Knorpelstörungen sind, da die Alanin-substituierten Mutanten nur schwach an IGFBP-1 binden und eine Disregulation von IGFBP-3 in arthritischen Störungen vorhanden ist (Martel-Pelletier et al., supra). Es wäre auch zu erwarten, dass BP3-01 und BP3-15 ebenfalls für diesen Zweck, im Sinne ihrer Rolle im Ersetzen von IGFBP-3 wirksam sind (Lowman et al., supra, 1998; WO 98/45427 ).
BEISPIEL 8
Artikulärer Knorpelexplantat-Assay von IGF-1-Analoga mit selektiv reduzierter Affinität für IGFBP-1 im Vergleich zu IGFBP-3
Einführung:
Die Experimente dieses Beispiels untersuchen sowohl das synthetische, als auch das prophylaktische Potential der IGF-1-Analoga E3A/F49A und F49A auf die Knorpelmatrix.
Materialien und Methoden:
Artikuläre Knorpelexplantate
Das Metacarpophalangeal-Gelenk von 18–24 Monate alten Kühen wurde aseptisch seziert, und artikulärer Knorpel wurde durch freihändiges Schneiden entfernt, darauf achtend, den unterliegenden Knochen zu umgehen. Der Knorpel wurde gehackt, gewaschen und in seinem Umfang für mindestens 24 Stunden in einer angefeuchteten Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO₂ in serumfreien (SF) LG DMEM/F12-Medium mit 0,1% BSA, 100 U/ml Penicillin/Streptomycin (Gibco), 2 mM L-Glutamin, 0,1 mM MEM-Natriumpyruvat (Gibco), 20 μg/ml GENTAMICIN^TM (Gibco) Antibiotikum und 1,25 mg/l AMPHOTERICINB^TM (Sigma) Antibiotikum kultiviert. Der artikuläre Knorpel wurde in MICRONICS^TM-Röhrchen (ungefähr 55 mg pro Röhrchen) aliquotiert und für mindestens 24 Stunden in dem obenstehendem Medium inkubiert. Die Kontrolle (Medium alleine), Wildtyp IGF-1, E3A/F49A oder F49A wurden dann in jedes Röhrchen hinzugefügt (zu einer Endkonzentration von 40 oder 400 ng/ml, wie angegeben). Die Medien wurden geerntet und an verschiedenen Zeitpunkten gewechselt (0, 24, 48 und 72 Stunden).
Proteoglycan-Freisetzung
An unterschiedlichen Zeitpunkten geerntetes Medium wurde auf den Proteoglycangehalt untersucht, unter Verwendung des 1,9-Dimethylmethylen Blau (DMMB) kolorimetrischen Assays von Farndale und Buttle, Biochem. Biophys. Acta, 883: 173–177 (1985). Eine Standardkurve von Chondroitinsulfat, reichend von 0,0 bis 5,0 μg, wurde zubereitet.
Proteoglycan-Synthese
Nach dem Mediumwechsel nach 48 Stunden, wurde ³⁵S-Sulfat (zu einer Endkonzentration von 10 μCi/ml) zu den Knorpelexplantatkulturen hinzugefügt. Nach einer zusätzlichen Inkubation bei 37°C für 17 Stunden wurde unter Verwendung des DMMB-Assays die Menge an Proteoglycanen in dem Medium gemessen. Die Knorpelstücke selbst wurden zweimal mit Explantatmedium gewaschen und über Nacht bei 50°C in einem Reaktionsvolumen von 900 μl 10 mM EDTA, 0,1 M Natriumphosphat und 1 mg/ml Proteinase K (Gibco BRL) verdaut. 600 μl der Verdaureaktion wurden (2:1) mit 10% gew./vol. Cetylpyridiniumchlorid (Sigma) vermischt und bei 1000 × g für 15 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und Ameisensäure (500 μl, Sigma) wurde hinzugefügt, um die Pellets zu lösen. Die Proben wurden dann in Szintillationsröhrchen überführt, die 10 ml Szintillationsflüssigkeit (ICN) enthielten und in einem Szintillationszähler gemessen.
Verbleibendes Proteoglycan in Knorpelgeweben
Nach 72 Stunden wurden die verbleibenden artikulären Knorpelexplantate, wie oben beschrieben unter Proteoglycan-Synthese, verdaut und auf ihren Proteoglycan-Inhalt unter Verwendung des DMMB kolorimetrischen Assays (obenstehend referiert unter Proteoglycan-Freisetzung) bestimmt.
Stickstoffmonoxid-Assay
Artikuläres Knorpelmedium, gesichert von den Knorpelexplantaten zu unterschiedlichen Zeiten (24, 48 und 72 Stunden) wurde mit 10 μl 0,05 mg/ml 2,3-Diaminonapthalin (DAN) in 0,62 M HCl vermischt und bei Raumtemperatur für 10 bis 20 Minuten im Dunkeln inkubiert. Die Reaktion wurde mit 5 μl 2,8 N NaOH gestoppt. Die Menge der Fluoreszenz des 2,3-Diaminonaphthotriazol wurde mit einem CYTOFLOR^TM-Fluoreszenzplatten-Lesegerät bei 365-nm-Anregung bei 409-nm-Emission gemessen.
Ergebnisse:
Die in den 24 bis 27 präsentierten Daten zeigen, dass die beiden getesteten IGF-1-Analoga den Knorpelmatrixabbau (wie durch Proteoglycanfreisetzung gemessen) vermindern, die Induktion des Abbaus der Knorpelmatrix durch IL-1α blockieren, Knorpelmatrixsynthese induzieren (wie durch Proteoglycansynthese gemessen) und der Inhibition der Matrixsynthese durch IL-1α vorbeugen.
Diese Effekte sind ähnlich denen von Wildtyp IGF-1. Da jedoch humanes IGF-1 mit Rindergewebe angewendet wird, könnten Speziesunterschiede einen inhibitorischen Effekt von endogenen Bindungsproteinen auf Wildtyp IGF-1-Aktivität maskieren.
Die IGF-1-Analoga vermindern signifikant die Freisetzung von Stickstoffmonoxid (28). Zusätzlich blockierten die IGF-1-Analoga die Induktion von Sticktstoffmonoxid durch IL-1α (29).
Diskussion:
Es ist hierin gezeigt, dass IGF-1-Analoga zum Inhibieren des Matrixabbaus, Stimulieren neuer Matrixsynthese und Inhibieren der Stickstoffmonoxidfreisetzung fähig sind. Zusätzlich inhibieren diese IGF-1-Analoga die zahlreichen Effekte von Interleukin 1, welches in erkrankten Gelenken erhöht ist.
Die Rolle von Stickstoffmonoxid im Abbau von artikulärem Knorpel, insbesondere der mit Ostoarthritis assoziierten Zerstörung wurde beschrieben in Ashok et al., Curr. Opin. Rheum., 10: 263–268 (1998). Da Stickstoffmonoxid auch Auswirkungen auf andere Zellen hat, könnte das Vorhandensein von Stickstoffmonoxid innerhalb des Gelenks die Vasodilation und Permeabilität erhöhen, Cytokin-Freisetzung durch Leukocyten potenzieren und angiogene Aktivität durch Monocytenmakrophagen stimulieren. Normaler Knorpel erzeugt kein Stickstoffmonoxid, ohne dass es mit Cytokinen, wie z. B. IL-1, stimuliert wurde, während osteoarthritische Knorpelexplantate für über 3 Tage in Kultur fortfahren, Stickstoffmonoxid freizusetzen, trotz der Abwesenheit eines hinzugefügten Stimulus. Daher korreliert die Herstellung von Stickstoffmonoxid durch Knorpel mit einem Krankheitsstadium, und da Stickstoffmonoxid sowohl in den erosiven, als auch den inflammatorischen Komponenten von Gelenkserkrankungen eine Rolle zu spielen scheint, wäre ein Protein oder Peptid, das die Stickstoffmonoxiderzeugung vermindert, wahrscheinlich förderlich für die Behandlung von degenerativen Störungen des Knorpels. Tatsächlich legen in-vivo-Tiermodelle nahe, dass die Inhibition der Stickstoffmonoxiderzeugung das Fortschreiten von Arthritis reduziert (Pelletier et al., Arthritis Rheum., 7: 1275–1286 (1998); van de Loo et al., Arthritis Rheum., 41: 634–646 (1998); Stichtenoth und Frolich, Br. J. Rheumatol., 37: 246–257 (1998)).
Der hierin beschriebene Assay basiert auf dem Prinzip, dass 2,3-Diaminonaphthalin (DAN) mit Nitrit unter sauren Bedingungen reagiert, um 1-(H)-Napthotriazol, ein fluoreszierendes Produkt, auszubilden. Da Stickstoffmonoxid schnell in Nitrit (NO₂ ^–1) und Nitrat (NO₃ ^–1) metabolisiert wird, ist die Detektion von Nitrit ein Weg zum Detektieren (wenn auch unterberechnet) des aktuell im Knorpelgewebe erzeugten Stickstoffmonoxids.
Stickstoffmonoxid hat, wie obenstehend beschrieben, schädliche Auswirkungen sowohl auf Chondrozyten als auch auf andere Zelltypen innerhalb des Gelenks. Da Inhibition von Stickstoffmonoxid zeigte, das Fortschreiten von Arthritis in Tieren zu inhibieren, legen die Auwirkungen der IGF-Analoga auf Stickstoffmonoxid weiterhin nahe, dass die getesteten IGF-Analoga für Gelenkgewebe in vivo schützend wären. Letztlich wird für diese Analoga oder die IGFBP-Ersatzpeptide erwartet, anabolische Auswirkungen auf Gewebe zu haben, wie z. B. arthritischer Knorpel, die andernfalls IGF-1-resistent sind.
Zusammenfassend demonstrierten zwei IGFBP-selektive Varianten (F49A und E3AF49A) eine 700-fache und 80.000-fache offensichtliche Reduktion in der Affinität für IGFBP-1, während sie für IGFBP-3, dem Hauptträger von IGF-1 in Plasma, eine niedrige nanomolare Affinität beibehalten. Beide Varianten zeigten Wildtyp-ähnliche Wirkungen in zellulären Rezeptorkinaseassays, stimulierten humane Knorpelmatrixsynthese und behielten ihre Fähigkeit bei, mit ALS in Komplex mit IGFBP-3 zu assoziieren. Daher wird die Halbwertszeit dieser Varianten weiterhin durch IGFBP-3 bestimmt, aber ihre Aktivität wird nicht länger durch IGFBP-1 reguliert. Außerdem unterscheiden sich die pharmakokinetischen Parameter und die Gewebeverteilung dieser beiden IGF-1-Varianten von Wildtyp-IGF-1 in Ratten als eine Funktion ihrer IGFBP-Affinitäten.
BEISPIEL 9
Generierung von IGF-1-Analoga mit selektiv reduzierter Affinität für IGFBP-3 im Vergleich zu IGFBP-1 und artikulärem Knorpelexplantatassay hierfür
Einführung:
Von den IGFBPs wird im Allgemeinen angenommen, dass sie die biologische Aktivität von IGF-1 durch Binden des Wachstumsfaktors in hochaffine Komplexe und dadurch Vorbeugen ihrer Rezeptorassoziation inhibieren (Jones und Clemmons, Endocr. Rev. 16: 3–34 (1995)). Die Spiegel an IGFBP-3 (und IGFBP-4) wurden als erhöht in menschlicher inflammatorischer Synovialflüssigkeit gefunden (Kanety et al., J. Rheumatol. 23: 815–818 (1996)). Für diese Änderung in der IGFBP-Homöostase wird angenommen, dass sie zu den pathologischen Bedingungen, durch Entziehen der Zellen des IGF-1-Überlebenssignals, beiträgt. In diesem Beispiel wurden IGF-1-Moleküle mit selektiv reduzierter Affinität für IGFBP-3, ohne Ändern der Aktivität auf den IGF-Typ-I-Rezeptor generiert. Solche Moleküle würden als biologisch potenter eingeschätzt als Wildtyp-IGF-1 in Gegenwart von erhöhten pathophysiologischen IGFBP-3-Spiegeln. Da außerdem IGFBP-3 der Hauptträger von IGF-1 im Serum ist, wäre die Halbwertszeit und biologische Verteilung von solchen IGF-1-Varianten vermutlich drastisch verändert.
Die Bindungsepitope von IGFBP-1 und IGFBP-3 wurden durch Alanin-Scanning auf der Oberfläche von IGF-1 festgestellt (Dubaquié und Lowman, Biochemistry, 38: 6386–6396 (1999)). Jede individuelle IGF-1-Seitenkette trägt nur mäßige Mengen an Bindungsenergie für IGFBP-3 bei. Basierend auf dieser Beobachtung scheint es möglich, die IGFBP-3-Affinität durch Einführen von nur einigen wenigen spezifischen Alaninmutationen in IGF-1 wesentlich herabzusetzen. Eine andere Strategie, um die Protein-Protein-Interaktionen zu unterbrechen, bezieht das Einführen eines geladenen Restes in die Bindungsschnittstelle ein, was zu einer elektrostatischen Abstoßung der Bindungspartner führt. Es wurde durch Jansson et al. (Biochemistry, 36: 4108–4117 (1997)) angemerkt, dass IGF-1 ein elektrostatisch polarisiertes Protein mit einer kontinuierlich negativ geladenen Stelle am N-Terminus (einschließlich der B-Region-Helix) ist, während die C-Region hauptsächlich positiv geladen ist. Basierend auf diesen Beobachtungen wurde Rest D12 ausgewählt, da er nicht zu irgendeiner Bindungsenergie für IGFBP-1 beiträgt, und Teil des strukturellen IGFBP-3-Bindungsepitops zu sein scheint (Dubaquié und Lowman, supra). Es war gedacht, dass Ersetzen des Restes 12 durch eine positive Ladung die kontinuierlich negativ geladene Stelle unterbrechen würde, die möglicherweise in der IGFBP-3-Interaktion einbezogen sein könnte.
Materialien und Methoden:
Generierung von Analoga
IGF-1-Varianten präsentierende Phagenpartikel, in denen der Aspartatrest an Position 12 zu Lysin (D12K) oder Arginin (D12R) mutiert wurde, wurden wie beschrieben in Dubaquié und Lowman, supra, hergestellt. Außerdem wurden diese Proteinvarianten in E. coli, wie beschrieben in Dubaquié und Lowman, supra, exprimiert und aufgereinigt.
Artikuläre Knorpelexplantate
Das Metacarpophalangeal-Gelenk von einem sechs Monate alten Schwein wurde, wie oben beschrieben für den artikulären Knorpel vom Rind in Beispiel 8, kultiviert. Dieses Explantat wurde in Medium alleine, oder in Medium mit D12K, D12R oder Wildtyp-IGF-1 (bei 10 nM), alleine oder in Gegenwart von IL-1α bei 1 ng/ml, wie oben beschrieben, kultiviert. Die menschlichen Explantate waren aus Patienten, die eine Gelenkaustauschoperation unterliefen. Artikulärer Knorpel wurde geerntet, aliquotiert (40–45 mg/Röhrchen) und wie obenstehend kultiviert. 24 Stunden später wurden die Explantate mit 40 ng/ml IGF-1, F16A/F49A, E3A/F49A oder F49A jeden Tag für 5 Tage behandelt. Frisches Medium wurde an Tag 0, 1, 2 und 3 hinzugefügt. Der Matrixabbau wurde durch Messen der Menge an Proteoglycanen in dem Medium unter Verwendung des DMMB-Assays wie obenstehend dargelegt bestimmt. Die Matrix-(Proteoglycan)-Synthese wurde durch Messen der ³⁵S-Sulfataufnahme, wie oben dargelegt, bestimmt.
Des Weiteren wurden für Vergleichszwecke F49A, E3A/F49A, F16A/F49A, D12K, D12R oder Wildtyp-IGF-1 (bei 40 ng/ml) auf Knorpelmatrixsynthese in menschlichem Gewebe, wie oben beschrieben, getestet. Menschlicher artikulärer Knorpel aus erkrankten Gelenken wurde in Medium alleine oder mit F49A, E3A/F49A, F16A/F49A, D12K, D12R oder Wildtyp-IGF-1 (bei 40 ng/ml) kultiviert und die Matrixsynthese wurde durch Messen der ³⁵S-Sulfataufnahme, wie obenstehend beschrieben, bestimmt.
Ergebnisse:
30 zeigt die Bindungskurven von entweder Wildtyp-IGF-1, D12K oder D12R präsentierenden Phagenpartikeln, gebunden an immobilisiertes IGFBP-1 (30A) oder IGFBP-3 (30B). Der an IGFBP-1 oder an IGFBP-3 gebundene Wildtyp-IGF-1-Phagenpartikel generierte ähnliche Detektionssignalintensitäten. D12K und D12R zeigten jedoch niedrigere Signalintensitäten, wenn sie an IGFBP-3 banden, verglichen zu IGFBP-1. Dieses Ergebnis legt nahe, dass diese Varianten eine selektiv reduzierte Affinität für IGFBP-3 im Vergleich zu Wildtyp-IGF-1 haben.
Wie IGF-1, inhibierten D12K und D12R den Knorpelmatrixabbau (31A) und steigerten die Matrixsynthese (31C). Zusätzlich inhibierten D12K oder D12R, wie IGF-1, die katabolischen Effekte von IL-1α (31B) und beugten IL-1α-induzierter Inhibition der Proteoglycansynthese vor (31D). Daher behalten diese Mutanten volle Aktivität bei und sind wahrscheinlich gute therapeutische Wirkstoffe für Knorpelstörungen wie z. B. Arthritis, die durch gesteigerten Matrixabbau und herabgesetzte Matrixsynthese charakterisiert sind. Da hohe Spiegel von IL-1 in erkrankten Gelenken gefunden werden, empfiehlt es sich weiterhin aufgrund der Fähigkeit dieser Mutanten die schädlichen Auswirkungen von IL-1α auf Knorpel zu inhibieren, zusätzlich diese IGF-Varianten zu Behandlungen von Arthritis zu verwenden.
Die IGF-1-Varianten haben bedeutenderweise Aktivität auf menschlichen Knorpel, erhalten aus Patienten, die einen Gelenkaustausch unterlaufen, d. h. mit Arthritis. Wie in 32 gezeigt, stimulierten alle getesteten fünf IGF-Varianten mit selektiven Präferenzen für IGFBP-3 im Vergleich zu IGFBP-1 oder vice versa (F49A, E3AF49A, F16/F49, D12K und D12R) die Matrixsynthese in erkranktem humanem artikulärem Knorpel, und die Aktivität dieser Varianten war genauso gut, oder besser als die von Wildtyp-IGF-1. Im Unterschied zu vorherigen Studien, die IGF-1-Resistenz in artikulärem Knorpel von osteoarthri tischen Gelenken zeigen, verbleibt der Knorpel insbesondere dieser Patienten reagierend bezüglich IGF-1.
Diskussion:
Die Proteinschnittstelle zwischen IGF-1 und IGFBP-3 scheint sensitiv gegenüber Mutationen zu sein, die die Ladungsverteilung ändern. Von dem Einführen von positiven Ladungen in den N-terminalen Bereich von IGF-1 wird erwartet, dass die IGFBP-3-Affinität selektiv reduziert wird.
Die IGF-1-Varianten D12K und D12R sind biologisch aktiv, wie hierin in den artikulären Matrix-Synthese-Stimulationsexperimenten gezeigt.
IGF-1 ist ein Schlüsselregulator der Matrixhomöostase in artikulärem Knorpel. Das metabolische Ungleichgewicht in Osteoarthritis, das den Matrixabbau gegenüber neuer Matrixsynthese begünstigt, könnte, zumindest zum Teil, auf Insensitivität der Chondrozyten auf IGF-1-Stimulation zurückzuführen sein. Während die für diese IGF-1-Resistenz verantwortlichen Mechanismen nicht bekannt sind, wird, ohne sich auf eine Theorie zu beschränken, angenommen, dass IGFBPs, die bei vielen arthritischen Patienten erhöht sind, eine Rolle spielen. Bei diesen Patienten würden IGF-1-Analoga, die nicht an IGFBPs binden, und daher nicht inhibiert werden, vermutlich die Knorpelwiederherstellung im Gewebe, das ansonsten IGF-1-resistent ist, stimulieren. Alternativ dazu könnten Peptide, die die IGF-1-Bindung an inhibitorische Bindungsproteine blockieren, IGF-1 freisetzen, um auf ansässige Chondrozyten zu wirken. Basierend auf der möglichen Rolle von IGFBPs (insbesondere IGFBP-1) beim Modifizieren der Aktivität von IGF-1 können außerdem die hierin beschriebenen IGF-1-Analoga eine bessere Clearance aus, und/oder einen besseren Transport durch Gewebe innerhalb menschlicher Gelenke, bezüglich Wildtyp-IGF-1, haben.
Da Verlust von Knorpelmatrixproteinen ein früher und kontinuierlicher Teil des Gelenksschadens ist, der zu einer Knorpelstörung führt, deutet die Fähigkeit dieser IGF-1-Analoga Knorpelkatabolismus zu inhibieren und neue Matrixsynthese zu stimulieren, darauf hin, dass diese IGF-Analoga heilsame Wirkungen auf erkrankte oder verletzte Gelenke haben werden.
IL-1α hat katabolische Effekte auf Knorpel, einschließlich der Generierung von Gelenksentzündung, Hochregulation von Matrixmetalloproteinasen, Stimulation des Matrixabbaus und Inhibition der Proteoglycan- und Collagensynthese. Außerdem wird IL-1-Protein in erkrankten, aber nicht in normalen Gelenken gefunden. Daher deutet die Fähigkeit der ge testeten Analoga, positive Effekte auf Knorpel zu haben, als auch den schädlichen Effekten von IL-1α entgegenzuwirken, stark darauf hin, dass solche Moleküle einen schützenden Effekt auf Knorpelstörungen haben würden, einschließlich verletztem und/oder erkranktem Knorpel. Zusätzlich verspricht solch eine Aktivität, dass die IGF-1-Analoga und Peptide die Degradationen, die unter artbritischen Bedingungen auftreten, inhibieren würde, zumal Antagonismus der IL-1α-Funktion nachweislich das Fortschreiten von Osteoarthritis reduziert (Arendt et al., Ann. Rev. Immunol., 16: 27–55 (1998)).
BEISPIEL 10
Artikulärer Knorpelexplantatassay von BP3-15- und BP3-40-Analoga Materialien und Methoden:
Humane artikuläre Knorpelexplantate wurden in Medium kultiviert, oder mit IGF-1 für sich oder in Kombination mit entweder BP3-40 oder BP3-15 bei 0,1 mg/ml, wie obenstehend dargelegt, behandelt. Matrixabbau wurde bestimmt durch Messen der Freisetzung von Proteo-glycanen in das Medium, wie oben beschrieben. Die Matrixsynthese wurde bestimmt durch Zählen der Menge an eingebautem ³⁵S-Sulfat in Knorpelgewebe, wie obenstehend beschrieben.
Ergebnisse und Diskussionen:
Da erkrankte Knorpel hohe Spiegel an IGFBPs aufweisen, und diese IGFBPs die IGF-1-Aktivität inhibieren könnten, wurde die Wirkung von zwei IGFBP-3-Ersatzpeptiden auf IGF-1-Aktivität getestet. Humane artikuläre Knorpelexplantate aus arthritischen Patienten wurden mit IGF-1 alleine oder in Kombination mit einem IGFBP-Ersatzpeptid (BP3-15 oder BP3-40) behandelt. Diese Ersatzpeptide schienen die Fähigkeit von IGF-1, den Matrixabbau zu vermindern, zu verstärken (33A, 33C) und die Matrixsynthese zu stimulieren (33B, 33D). Daher wird für diese Peptide erwartet, nützlich für Zustände wie z. B. Arthritis, zu sein, wo hohe Spiegel an inhibitorischen Bindungsproteinen vorhanden sind. In solchen Zuständen wird für die Behandlung mit einem Ersatzpeptid allein oder in Kombination mit IGF-1 erwartet, die anabolischen Effekte von endogenem oder exogenem IGF-1 zu verstärken und in der Behandlung von Arthritis nützlich zu sein.
BEISPIEL 11
Komplexbildung mit ALS
Materialien und Methoden:
Humanes ALS wurde in CHO-Zellen exprimiert (Leong et al., Mol. Endocrinol., 6: 870–876 (1992)). Das sekretierte ALS wurde auf DEAE-Sepharose angereichert, gefolgt von Affinitätsaufreinigung auf einer IGF-1-/IGFBP-3-Säule, wie beschrieben in Baxter et al., J. Biol. Chem., 264: 11843–11848 (1989).
Um die trimere Komplexausbildung zu beobachtetn, wurden 300 RUs biotinyliertes IGFBP-3 (Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin; Pierce, Rockford, IL) auf einem Streptavidingekoppelten Chip (SA; Biacore, Inc., Piscataway, NJ) in PBS, 0,05% Tween^TM-20 und 0,01% Natriumazid immobilisiert. Der Biosensorchip wurde mit 1 μM des jeweiligen IGF-Analogons (F49A oder E3A/F49A) enthaltendem Laufpuffer grundiert. ALS wurde in Mengen von 98, 148 und 333 nM bei 50 μl/min für 2 Minuten, gefolgt von einer 2-Minuten-Dissoziationsperiode, injiziert. Der Chip wurde mit 10 μl einer 2 M KSCN (in 50 mM HEPES, pH 7,2) bei einer Durchflussrate von 20 μl/min regeneriert, gefolgt von einem 3-minütigen Pufferdurchfluss zur Stabilisierung der Basislinie.
Ergebnisse:
F49A und E3A/F49A bilden ternäre Komplexe mit IGFBP-3 und ALS
Die Mehrheit an IGF-1 wird in Serum in einem 150-kDa-ternären Komplex, bestehend aus IGFBP-3 und einem Glycoprotein, genannt ALS, gefunden. Die Halbwertszeit dieses ternären Komplexes ist eine Größenordnung länger als die von freiem IGF-1 (Ferry et al., Horm. Metab. Res., 31: 192–202 (1999)). Daher ist die ternäre Komplexausbildung eine Hauptdeterminante für die IGF-1-Bioverteilung. Um zu testen, ob die entwickelten IGF-1-Varianten weiterhin fähig sind, trimäre Komplexe mit ALS auszubilden, wurden Biosensor-Bindungsexperimente durchgeführt. Biotinyliertes IGFBP-3 wurde auf einem Biosensorchip immobilisiert und ALS wurde mit entweder Wildtyp-IGF-1 (34A), F49A (34B) oder E3A/F49A (34C) enthaltend im Laufpuffer bei einer Konzentration von 1 μM injiziert. Wie in 34 gezeigt, waren die ALS-Bindungskurven im Wesentlichen identisch zu Wildtyp-IGF-1 und den beiden IGF-1-Varianten. Die Dissoziationsraten für Wildtyp-IGF-1 und die jeweilige IGF-1-Variante ist in Tabelle XIX aufgelistet, reichend von 4,0 × 10^–4 s^–1 bis 6,3 × 10^–4 s^–1. In der Abwesenheit von jeglichem IGF-1 im Laufpuffer assoziierte ALS nicht mit IGFBP-3 auf dem Chip. Dieses Experiment zeigt, dass die IGF-1-Varianten ihre Fähigkeit, ternäre Komplexe auszubilden, beibehalten und dass ihre letztliche Halbwertszeit im Serum daher nicht drastisch kürzer sein sollte als die für Wildtyp-IGF-1. TABELLE XIX ALS-Dissoziationsraten von IGFBP-3-/IGF-1-Komplexen, bestimmt durch Biosensor-Experimente

Material Dissoziationsrate kd (×10^–4 s^–1)

wt IGF-1 6,3 ± 1,7

F49A IGF-1 4,2 ± 0,9

E3A/F49A IGF-1 4,0 ± 2,2
Clearance und Verteilung von F49A und E3A/F49A in Ratten.

Humanes Wildtyp-IGF-1, F49A und E3A/F49A wurden radioaktiv markiert und intravenös Ratten verabreicht, um ihre pharmakokinetischen Eigenschaften zu bestimmen. Beide IGF-1-Varianten wurden im Vergleich zu Wildtyp-Human-IGF-1 signifikant schneller entfernt (Tabelle XX). E3A/F49A wurde mit der schnellsten Rate (1107 ± 45 ml/h(kg), gefolgt von F49A (427 ± 125 ml/h/kg) und wt IGF-1 (151 ± 24,7 ml/h/kg) entfernt. Ein ähnlicher Trend wurde für die dazwischen liegenden Halbwertszeiten t_1/2 ^β beobachtet: E3A/F49A hatte die kürzeste, F49A dazwischen liegend und wt IGF-1 die längste t_1/2 ^β (Tabelle XX). Diese Ergebnisse korrelieren gut mit den entsprechenden in-vitro-Affinitäten für das Hauptbindungsprotein im Serum, IGFBP-3. Interessanterweise waren die Verteilungsvolumen im stationären Zustand für die IGF-1-Varianten sehr viel größer, was darauf hindeutet, dass sie weniger auf den Plasmabereich beschränkt sind als Wildtyp-IGF-1 (Tabelle XX). Die größten Gewebe-zu-Blut-Verhältnisse für die IGF-1-Moleküle wurden in der Niere entdeckt, wohingegen die Verhältnisse in der Leber, Milz, Herz und Pankreas sehr viel geringer waren. Es ist aus diesem Experiment ersichtlich, dass F49A und E3A/F49A in statistisch signifikant höheren Verhältnissen in der Niere akkumulieren, verglichen zu Wildtyp-IGF-1. TABELLE XX Pharmakokinetische Parameter nach einer einzelnen IV-Dosis in Ratten.

Gruppe	Halbwertszeit (h)			Clearance (ml/h/kg)	Verteilungsvolumen im stationären Zustand (ml/kg)
Gruppe	t_1/2 ^α	t_1/2 ^β	t_1/2 ^γ	Clearance (ml/h/kg)	Verteilungsvolumen im stationären Zustand (ml/kg)
¹²⁵I-wt IGF-1	0,033 ± 0,004	1,22 ± 0,237	5,88 ± 0,374	151 ± 24,7	936 ± 94,8
¹²⁵I-F49A	0,064 ± 0,052	0,971 ± 0,336⁺	8,97 ± 4,50	427 ± 125⁺	3201 ± 488*⁺
¹²⁵I-E3A/F49A	0,032 ± 0,005	0,321 ± 0,091*	6,23 ± 1,47	1107 ± 45,0*	6520 ± 874*

*P < 0,05 verglichen zu ¹²⁵I-wt IGF-1
+P < 0,05 verglichen zu ¹²⁵I-E3A/F49A

Diskussion:
Die Fähigkeit der Analoga F49A und E3A/F49A, ternäre Komplexe mit ALS und IGFBP-3 auszubilden, hat wichtige Konsequenzen für die Serumhalbwertszeit dieser Varianten. Wie ALS mit dem IGF-1-/IGFBP-3-Komplex interagiert, ist nicht bekannt aufgrund des Fehlens von strukturellen Informationen über IGFBP-3 und ALS. Ein neueres Modell von ALS postuliert eine Donut-förmige Struktur, dessen interne Aushöhlung umrandet ist mit negativen Ladungen; diese Bereiche könnten potentiell mit positiven Ladungen auf IGFBP-3 und IGFBP-5 interagieren (Janosi et al., J. Biol. Chem., 274: 5292–5298 (1999)). Die Affinität von ALS für einen quervernetzten IGF-1-/IGFBP-3-Komplex liegt in der Größenordnung von 0,1 bis 0,3 nM, abhängig von dem Kohlenhydratanteil des ALS (Janosi et al, supra). In den Biosensormessungen, die ALS-Bindung an einen nicht kovalenten IGF-1-/IGFBP-3-Komplex analysierten (durch Einschließen sättigender Mengen an IGF-1 im Laufpuffer) verblieben die Dissoziationsraten des Wildtyp-IGF-1, F49A und E3A/F49A konstant zwischen 4,0 × 10^–4 s^–1 bis 6,3 × 10^–4 s^–1 (Tabelle XIX). Das Experiment bestätigt, dass beide getesteten IGF-1-Varianten ternäre Komplexe mit ALS ausbilden.
Die Pharmakokinetiken der IGF-1-Varianten in Ratten zeigten unterschiedliche Charakteristika gegenüber Wildtyp-IGF-1 (Tabelle XX). Es erscheint, dass der Großteil der Unterschiede in den ersten 60–100 Minuten des Experiments beobachtet wird. In dem pharmakokinetischen Analysemodell ist diese Phase charakterisiert durch anfängliche und zwischenzeitliche Halbwertszeiten t_1/2 ^α und t_1/2 ^β, die wahrscheinlich die Verteilung von freien und gesamten radioaktiv markierten Molekülen in extravaskulären Geweben und ihre Clearance beschreiben (Tabelle XX). Dieser Anfangsphase folgend werden alle drei IGF-1-Moleküle bei vergleichbaren Raten entfernt, wie durch ihre ähnlichen terminalen Halbwertszeitwerte t_1/2 ^γ, nahe gelegt, die wahrscheinlich die Eliminierung von ¹²⁵I aus der Ratte reflektiert (Tabelle XX). Die in t_1/2 ^α und t_1/2 ^β beobachteten Trends zwischen den drei Molekülen sind im Allgemeinen konsistent mit einer schnelleren Verteilungsrate und Clearance für die IGF-1-Varianten, die weniger an IGFBPs gebunden sind. Außerdem unterstützen die berechneten Verteilungsvolumen in stationärem Zustand und Clearance-Raten die Interpretation, dass IGFBP-Assoziation eine Hauptrolle in der Verteilung und Clearance der IGF-1-Varianten spielt. Daher, ohne sich auf eine Theorie zu beschränken, legt dies nahe, dass die anfänglichen Unterschiede in dem pharmakokinetischen Profil die IGF-1-/IGFBP-3-Bindungsgleichgewichte reflektieren, da sie gut mit den korrespondierenden Affinitäten der IGF-1-Varianten für IGFBP-3 in vitro entsprechen.
Da IGFBP-3 im Blut unter normalen Bedingungen gesättigt zu sein scheint (Jones und Clemmons, Endocr. Rev., 16: 3–34 (1995)), wird geglaubt, ohne sich auf eine Theorie zu beschränken, dass die injizierten IGF-1-Varianten mit endogenem IGF-1 um IGFBP-3-Bindung konkurrieren. Die IGF-1-Moleküle, die nicht fähig sind, mit IGFBP-3 zu assoziieren, könnten aus dem Blutkreislauf diffundieren und entweder mit anderen Bindungsproteinen assoziieren oder bei einer schnellen Rate entfernt werden (t_1/2 für freies IGF-1 = 10–15 min). Solche Moleküle, die eine ternäre Komplexausbildung mit IGFBP-3 und ALS erreichen, erfahren eine weiter verlängerte Serumhalbwertszeit und werden in dem Blutkreislauf „gefangen". Ternäre Komplexausbildung der IGF-1-Varianten erfolgt mit der gleichen Effizienz wie Wildtyp-IGF-1 in vitro (33, Tabelle XIX) und diese Eigenschaft scheint sich in der späteren Phase (> 100 Minuten) des pharmakokinetischen Profils widerzuspiegeln. Die Tatsache, dass sowohl humane IGF-1-Varianten als auch humanes Wildtyp-IGF-1-terminale Halbwertszeiten in der Ordnung von 6–9 Stunden zeigen, legen stark nahe, dass die Komplexbildung mit Ratten-IGFBP-3 und ALS in vivo erfolgt. Dies ist wichtig, da alle in-vitro-Experimente ausschließlich mit humanen IGFBP-3 und ALS durchgeführt wurden, während die in-vivo-Experimente sich auf die Bewahrung der entwickelten Spezifitäten für die homologen Ratten-Bindungsproteine stützen.
BEISPIEL 12
Substitutionen in BP1-16
Mehrere Einzelrestsubstitutionen in BP1-16 wurden auf ihre Wirkung auf die IGFBP-1-Bindungsaffinität durch Synthetisieren der Peptide und Messen der Inhibition der IGFBP-1-Bindung an IGF-1 getestet. Die Substitutionsstellen wurden basierend auf der bekannten Wirkung eines Alanins, oder anderer substituierter Reste an der Stelle, ausgewählt.
Für G4 wurde herausgefunden, substituierbar für D-Alanin zu sein. Da die konformationellen Effekte von D-Alanin unterschiedlich von denen von L-Alanin sind, wurde L-Alanin für G4 in Peptid BP1-29 substituiert. Inhibitionsassays zeigten einen 50fachen Verlust der Bindungsaffinität mit dieser Substitution (Tabelle XXI).
Für P5 wurde früher herausgefunden, dass es hochkonserviert in Phagen-Display-Peptidbibliotheken ist; einige Substitutionen wurden jedoch beobachtet. Es wurden zum Beispiel drei unterschiedliche Peptidphagenklone mit Argininen an dieser Position gefunden. Daher wurde die L-Alanin-Substitution für Prolin getestet, sowie mehrere alternative Substitutionen (BP1-30, BP1-31, BP1-34). Die Ergebnisse (Tabelle XXI) zeigen, dass P5A, P5N und P5R gut toleriert werden.
L6 und L9 waren vollständig konserviert in 40 von 40 sequenzierten Klonen, bzw. 61 von 61 sequenzierten Klonen aus zwei unterschiedlichen IGFBP-1 ausgewählten Peptid-Phagenbibliotheken. Zusätzlich resultierte die Substitution jeder dieser Reste mit L-Alanin- oder aib-(alpha-Aminoisobuttersäure)Seitenketten in einem signifikanten Verlust an IGFBP-1-Bindungsaffinität. Zwei weitere Substitutionen wurden an jeder Position getestet: Norleucin (Nle), ein Isomer des Leucins, oder Arginin (der aliphatische Teil der Seitenkette, welcher weiterhin fähig sein könnte, in die Peptidstruktur zu packen). Während die Arg-Substitutionen in Peptiden mit undetektierbarer IGFBP-1-Affinität (BP1-32 und BP1-26) resultierten, wurden die Nle-Substitutionen gut toleriert (BP1-36 und BP1-37). Die nicht natürlichen Substitutionen L6 (Nle) und L9 (Nle) sind daher die einzigen Substitutionen an diesen Positionen, die bekannt sind, eine moderate Bindungsaffinität an IGFBP-1 zu bewahren.
W8 war auch vollständig konserviert in IGFBP-1 ausgewählten Peptid-Phagenbibliotheken, obwohl die Alaninsubstitution einen geringeren Effekt auf die Bindung hatte als im Falle von L6 oder L9. Daher wurden mehrere große Seitenkettensubstitutionen an dieser Position getestet. Interessanterweise hatten Arginin, 1-Naphtthylalanin (Nal(1)) oder Histidinsubstitutionen (BP1-22, BP1-23, bzw. BP1-24) jeweils mäßige (< 10fach) Effekte auf die IGFBP-1-Bindungsaffinität (Tabelle XXI). Aus diesen Experimenten könnte eine neue Konsensussequenz für die IGFBP-1-Bindung wie folgt formuliert werden:
CysXaa₍₆₎Xaa₍₇₎GlyXaa₍₉₎LeuXaa₍₁₁₎TrpLeuCysXaa₍₁₅₎Xaa₍₁₆₎Xaa₍₁₇₎Xaa₍₁₈₎ (SEQ ID NO: 130), wo Xaa₍₆₎, Xaa₍₇₎, Xaa₍₉₎, Xaa₍₁₁₎, Xaa₍₁₅₎ und Xaa₍₁₆₎ unabhängig voneinander eine beliebige Aminosäure sind, und Xaa₍₁₂₎, Xaa₍₁₇₎ und Xaa₍₁₈₎ unabhängig voneinander Nal(1), His, Phe, Trp, Tyr, Pro, Gin oder Met ist.
TABELLE XXI Relative Affinitäten der BP1-16-Varianten gemessen durch ELISA oder BIAcore^TM(*) Inhibitionsassays
BEISPIEL 13
Minimierung des BP1-01-Peptids über "locked helix"
Es wurde vorher gezeigt, dass das Entfernen der Disulfidbindung in BP1-01 destabilisierend für sowohl die Struktur als auch die Funktion des Peptids ist. Es wurde die Möglichkeit untersucht, die Disulfidbindung von BP1-01 mit einer chemisch unterschiedlichen Struktureinschränkung auszutauschen, während eine moderate Bindungsaffinität an IGFBP-1 beibehalten wird. Diese Einschränkung wurde entworfen, die durch 7 (von Position i bis Position i + 7) oder 8 (von i bis i + 8) Reste in dem BP1-01-Peptid getrennten Seitenkettenpositionen zu verknüpfen.
Die i + 7 locked helix-Strategie, einer der hierin verwendeten Ansätze, wurde beschrieben durch Phelan et al., J. Am. Chem. Soc., 119: 455–460 (1997); WO 98/20036 , publiziert am 14. Mai 1998, wie mit anderen i + 7-, i + 3- und i + 4-Verknüpfungen (diskutiert in Phelan et al., supra). Zusätzlich wurden andere Seitenkettensubstitutionen, die ionische oder hydrophobe Interaktionen oder Metallchelationen erlauben, für den Zweck des Stabilisierens einer helikalen Struktur verwendet (diskutiert in Phelan et al., supra). Hierin ist eine neuartige i + 8 locked helix-Strategie beschrieben, die insbesondere nützlich für die Stabilisierung der helikalen Struktur, die in der BP1-01-Peptidfamilie gefunden wird, ist.
Mutagenesestudien deuteten darauf hin, dass die Hauptdeterminanten der IGFBP-1-Bindung sich hauptsächlich in dem helikalen Segment von BP1-01 befinden. Diese wichtigen Bindungsdeterminanten segregieren hauptsächlich auf eine Seite der Helix, und schließen Leu6 und Leu9, und die aromatischen Reste Trp8, Tyr13 und Phe14 ein. Ohne sich auf eine Theorie zu beschränken, könnte der Rest des Peptids hauptsächlich die Helix stabilisieren, um die ausreichende Präsentation der Hauptseitenketten-Bindungsdetermi nanten zu gewährleisten. Daher könnten andere Verfahren zum Einschränken des Bindungssegmentes des Peptids in eine helikale Konformation potente BP1-Bindungspeptide erbringen. Seitenketten-Seitenketten-Quervernetzungen auf der entgegengesetzten helikalen Oberfläche der Haupt-BP1-Bindungsdeterminanten wurden zur Verwendung ausgewählt. Diese Methode wurde beschrieben in WO 98/20036 , supra. In dem vorliegenden Fall verbindet die i + 7-Quervernetzung die ausgetauschten Reste für Gln7 bis Phe14, die eine der hydrophoben IGFBP-1-Bindungsdeterminanten ersetzt. Die i + 8-Quervernetzung verbindet die Reste, die Gln7 bis Gly15 ersetzen.
Die Quervernetzungschemie bezieht den Austausch der geeigneten zwei Reste mit Glutaminsäureresten (die ersten und letzten in Tabelle XXII gezeigten Glu-(E)-Reste), wo die beiden Glu-Reste durch Ausbildung von Amiden mit 1,5-Diaminopentan verbunden sind. Dieses Quervernetzungsverfahren wurde in WO 98/20036 , supra, beschrieben.
Um aktive Peptide, die kürzer sind als BP1-01, zu entwickeln, wurde auch beschlossen, das Disulfid (Cys1–Cys10) zu entfernen und den N-terminalen Loop-Bereich in eingeschränkten helikalen Peptiden zu verkürzen. Das Cys10 wurde geändert zu Ala und Cys1 ausgetauscht mit einer Acetylgruppe (ac in Tabelle XXII). Mehreren kürzeren Varianten fehlten eine oder mehrere der anderen Loop-Reste. Daher wurden diese Peptide nur durch die 1,5-Diaminopentanverknüpfung zyklisiert. Solche Peptide, denen Disulfidbindungen fehlen, können in vitro und in vivo stabiler gegenüber Degradation sein. Sie können auch in ihrer Immunogenizität verglichen zu Disulfid enthaltenden Analoga reduziert sein.
Funktionelle Analyse von locked Helices
Die Peptide wurden in einem BIAcore^TM-Assay untersucht, wie beschrieben in WO 98/45427 , supra. Diese Inhibitionsassays (35) vergleichen die relative Wirksamkeit dieser Peptide zum Blockieren der Interaktion von IGFBP-1 mit IGF-1. Hinzufügen des „i + 7 helical lock" zu einer Variante von BP1-01 reduzierte die relative Wirksamkeit (Tabelle XXII) 6-fach (Peptid (i + 8)C) bis 8-fach (Peptid (i + 7)D oder (i + 8)B) in den besten locked helix-Varianten. Diese Peptide demonstrieren, dass eine Disulfidbindung nicht notwendig ist, um strukturierte, funktionelle Peptide der BP1-01-Familie zu erhalten.
Im Gegensatz zu den obenstehend beschriebenen locked helix-Varianten zeigte eine locked helix-Variante, in der zwei der Schlüssel-IGFBP-1-Bindungsdeterminanten abhanden gekommen sind ((i + 7)A; Tabelle XXII) einen signifikanten Verlust an Bindungsaktivität bezüglich BP1-01. In diesem Peptid wurde W8 ausgetauscht mit dem ersten quervernetzenden Rest und Gly15 ausgetauscht mit dem zweiten quervernetzenden Rest; F14 ist in die sem Peptid ausgetauscht durch Alanin. Die Disulfidbindung ist in diesem Peptid immer noch vorhanden.
Für gewisse Zusätze an den N-Terminus und C-Terminus dieser Peptide (siehe Beispiel 3) wird vorhergesagt, dass sie die Bindungsaffinität und Wirksamkeit verbessern, wie in dem folgend diskutierten Fall von Disulfid beschränkten Peptidvarianten.
Daher kann eine Konsensussequenz wie folgt formuliert werden:
Xaa_(1-4)Xaa₍₅₎Xaa_(6-7)ProLeuGluXaa₍₁₁₎LeuAlaXaa₍₁₄₎Xaa₍₁₅₎Xaa₍₁₆₎ Xaa₍₁₇₎GluXaa₍₁₉₎ (SEQ ID NO: 142), wobei Xaa_(1-4) fehlt oder zwischen 1 und 4 beliebige Aminosäuren ist; Xaa₍₅₎ eine beliebige Aminosäure ist, Xaa_(6-7) fehlt oder zwischen 1 und 2 Aminosäuren ist, Xaa₍₁₄₎ und Xaa₍₁₅₎ unabhängig voneinander eine beliebige Aminosäure sind, Xaa₍₁₁₎ und Xaa₍₁₆₎ unabhängig voneinander Nal(1), His, Phe, Trp, Tyr, Pro, Gln oder Met sind, Xaa₍₁₇₎ fehlt oder 1-Napthyl-Ala, His, Phe, Trp, Tyr, Pro, Gln oder Met ist, und Xaa₍₁₉₎ fehlt oder Gly ist.
NMR-Analyse von locked helices
¹H-NMR-Spektroskopie wurde verwendet, um einwandfrei festzustellen, dass die locked helix-Varianten von BPI-01 die gewünschte dreidimensionale helikale Struktur hatten. Eindimensionale Spektren und zweidimensionale COSY-, TOCSY- und ROESY-Spektren wurden für die Peptide (i + 7)A, (i + 7)B, (i + 7)C, (i + 7)D und (i + 8)C aufgenommen; die experimentellen Details waren ähnlich zu denen, beschrieben für BP1-01 in Lowman et al., supra, 1998. Vorläufige Analyse der Rückgrat-³JHN-Ha-Scalar-Kopplungskonstanten (abgeleitet aus 2D COSY-Spektren) und kurzen H^a(i)-H^N(i + 3)-Distanzen (abgeleitet aus ROESY-Spektren), deutete darauf hin, dass für (i + 7)A, (i + 7)C, (i + 7)D und (i + 8)C die entworfene Helix vorhanden war. In dem Fall von (i + 7)B waren die NMR-Daten nicht konsistent mit einer helikalen Struktur. Das Fehlen einer gut gefalteten Struktur erklärt vermutlich die niedrige Affinität dieses Peptids für IGFBP1 (> 360-fach schwächer als BP1-01).
Die Scalar-Kopplung und ROESY-Daten für (i + 7)A, (i + 7)D und (i + 8)C wurden detaillierter analysiert, um Input-Einschränkungen für die Berechnung der dreidimensionalen Strukturen, wie zuvor beschrieben für BP1-01 (Lowman et al., supra, 1998), zu generieren. Vergleich der minimierten Hauptstrukturen der locked helix-Varianten zu der von BP1-01 erbrachten RMSDs (N-, Ca-, C-Atome von Leu6-Phe14) von 1,02 Å und 0,22 Å für (i + 7)D, bzw. (i + 8)C. Weiterhin war die Packung der hydrophoben Seitenketten Leu6, Trp8, Leu9 und Tyr13 in diesen zwei locked helix-Varianten auch sehr ähnlich zu der Packung in BP1-01. Daher haben die (i, i + 7)- und (i, i + 8)-locked helix-Gerüste viele Aspekte der BP1-01-Struktur ohne die Notwendigkeit für eine Disulfidbindung erfolgreich beibehalten. Obwohl die kovalenten Kräfte in (i + 7)A die gewünschten zwei Bindungen der Helix (das N, Ca, C, RMSD zwischen minimierten BP1-01 und (i + 7)A ist 1,06 Å) erzeugte, unterschieden sich einige Seitenketten-Rotamere signifikant von denen von BP1-01.
Die obenstehend beschriebene Strukturanalyse legt nahe, dass kovalente Kräfte (andere als die in BP1-01 beobachtete Disulfidbindung) verwendet werden können, um die Peptidstruktur zu kontrollieren. Die Verwendung von i, i + 7- oder i, i + 8-Kräften erzeugte die Peptide (i + 7)D und (i + 8)C, die eine hohe Affinität gegenüber IGFBP-1 in der Abwesenheit einer Disulfidbindung beibehielten. Vermutlich leitet sich die Affinität aus der Stabilisierung einer Struktur ab, die sowohl die helikale Rückgratfaltung, als auch die Anordnung der Seitenkettenpackung der in BP1-01 beobachteten Schlüsselbindungsdeterminanten unterhält. Obwohl das Peptid (i + 7)A die Rückgratfaltung unterhält, fehlen zwei der Schlüsseldeterminanten (Trp8 und Phe14) und die Orientierung von anderen (z. B. Tyr13) ist gestört; als ein Ergebnis hat dieses Peptid eine reduzierte Affinität. Das Peptid (i + 7)B kann die gewünschte Faltung nicht annehmen und hat daher keine messbare Affinität für IGFBP1.
TABELLE XXII Locked helix-Varianten von BP1-01 (Die ersten und letzten Glus (Es) sind Stellen des Zyklisierungs-„lock")
BEISPIEL 14
N-terminale Varianten von BP1-16
Vorherige Affinitätsreifungsexperimente führten zu einem Peptidzusatz zu dem C-Terminus von BP1-02, einschließlich einer Anzahl von Peptidphagenklonen (Tabelle XXIII), und dem synthetischen Peptid BP1-21A, dessen Sequenz in Tabelle XXIII gezeigt ist. Tabelle XXIII veranschaulicht die C-terminalen Substitutionen im Hintergrund von BP1-02.
TABELLE XXIII C-terminale Substitutionen abgeleitet aus Runde 3 der monovalenten Phagenselektionen in dem BP1-02-Peptidhintergrund
Es ist hierin gewünscht, die Affinität weiterhin durch zwei Verfahren zu verbessern: Substitution der ersten vier N-terminalen Aminosäurereste von BP1-20 in BP1-21A und wiederholte zufällige Anordnung der N-terminalen Aminosäurereste von BP1-21A (im Kontext des zuvor verbesserten C-Terminus).
Peptid BP1-25 (Tabelle XXV) wurde synthetisiert, um die Addititivät (Wells, Biochemistry, 29: 8509–8517 (1990)) für die N-terminalen und C-terminalen maximal bevorzugten Substitutionen zu testen. Verglichen mit BP1-16 in den Inhibitionsassays zeigte BP1-25 etwa eine 20-fache Affinitätsverbesserung. Die Affinität von BP1-25 war jedoch nicht signifikant verbessert gegenüber BP1-21A. Diese Affinitätsverbesserung wurde in anderen nachstehend beschriebenen Assays bestätigt.
In dem zweiten Ansatz wurde eine BP1-21A, fusioniert zu g3p, präsentierende monovalente Display-Peptidphagenbibliothek an den vier N-terminalen Resten zufällig angeordnet (Lowman, Methods Mol. Biol., 87: 249–264 (1998)). Bindungsselektion an IGFBP-1 wurde ausgeführt, indem es zunächst den Bibliothekphagen ermöglicht wurde, an in Lösung biotinyliertes IGFBP-1 zu binden, mit einer Anfangskonzentration von 50 nM, gefolgt von 28 nM für die anschließenden vier Selektionsrunden. Zur Bindung an IGFBP-1 bestätigte Peptidphagen wurden durch Inkubieren mit Streptavidin Magnetic Beads (Promega) für 10 Minuten bei Raumtemperatur erfasst. Für jede Selektionsrunde wurde das Waschen graduell modifiziert, um stringenter zu sein. Off-Rate-Selektion wurde durchgeführt durch Hinzufügen von 2,5–5 μM IGF in Lösung, um die wiederholte Bindung von Phagen mit schnelleren Off-Rates vorzubeugen. Es ist von Interesse zu bemerken, dass die letzte Runde der Selektion (Runde 5) mit einer Übernacht-Inkubation bei 4°C in Gegenwart von 2,5 μM IGF, es weiterhin Phagen gab, die gebunden an den Beads verblieben (2,2 × 10⁴ Phagen insgesamt wurden eluiert). Anschließende Sequenzierungsdaten zeigten, dass 14 von 20 selektierten Klonen zu einer einzigen DNA-Sequenz konvergierten (Klon Y0791A; Tabelle XXIV). Ein dieser Sequenz entsprechendes Peptid wurde zur Analyse synthetisch hergestellt.
TABELLE XXIV N-terminale Substitution abgeleitet aus Runde 5 der monovalenten Phagenselektionen in dem BP1-21A-Peptid-Hintergrund
Inhibitionsassays zum Messen der relativen Wirksamkeit von Peptiden zum Inhibieren der IGFBP-1-Bindung an IGF-1 wurden beschrieben (z. B. WO 98/45427 , supra). Die hierin beschriebenen Peptide waren von ausreichender Bindungsaffinität, um eine direkte Messung der Bindungsaffinitäten durch Oberflächenplasmonresonanz (SPR) unter Verwendung eines BIAcore^TM-Systems zu erlauben. Die direkten Bindungskinetiken der IGFBP-1-Peptide wurde durch Injizieren einer Serie von 2-fach verdünnten Peptiden in Laufpuffer (0,05% TWEEN 20^TM in PBS) über einen Carboxymethyl-(CM)-Biosensorchip, gekoppelt mit etwa 590–1000 RU von IGFBP-1, bei einer Durchflussrate von 50 μl/min auf einem BIAcore-2000^TM- oder BIAcore-3000^TM-Gerät gemessen. Die Immobilisierung von IGFBP-1 wurde durch EDC/NHS-Chemie, wie durch den Hersteller beschrieben, durchgeführt. Die Peptide wurden auch durch eine Durchflusszelle injiziert, die IGFBP-3 als Hintergrundkontrolle enthielt. Da die Off-Rate für die meisten der Peptide relativ schnell ist (im Bereich von 2 × 10^–2 s^–1) wurde die Off-Rate-Messung für 30 min angesetzt. Dies erlaubte die Regeneration von IGFBP-1 auf dem Chip durch einfache Dissoziation, anstatt durch Hinzufügen eines Elutionsmittels. Für jede Verdünnung von Peptiden wurde eine pauschale Anpassung der Sensorgrammdaten unter Verwendung eines 1:1 Langmuir-Bindungsmodells durchgeführt. On-Rates reichten von 4 × 10⁵ bis 1,9 × 10⁶ M^–1s^–1. Die Bindungsaffinitäten, KD, berechnet als k_off/k_on, sind zusammengefasst in Tabelle XXV. Die Peptide BP1-20, BP1-21A, BP1-25 und BP1-40 hatten alle ähnliche Bindungsaffinitäten (K_D) von etwa 20 nM bis 40 nM.
Die Schlussfolgerung aus diesen Experimenten ist, dass N-terminale Verlängerungen an das BP1-01-Peptid die Bindungsaffinität verbessern kann (wie in BP1-02, BP1-20, BP1-21A, BP1-25, BP1-40 und anderen in Tabelle XXIV identifizierten Varianten). Einige Substitutionen könnten die Expressionsspiegel in E. coli ändern, da GQQS (SEQ ID NO: 147) eindeutig aus den Phagen-Display-Peptidbibliotheken ausgewählt war. Peptide mit den Sequenzen SEVG (SEQ ID NO: 148), SEMV (SEQ ID NO: 149), EARV (SEQ ID NO: 150) oder GQQS (SEQ ID NO: 151) an ihren N-Termini hatten jedoch alle ähnliche Bindungsaffinitäten. Daher scheint die Natur der hinzugefügten Seitenketten an dem N-Terminus einen geringen Effekt auf die Peptidbindungsaffinität zu haben. Dies suggeriert, dass Hauptketteninteraktionen des Peptids in diesem Bereich zu der Bindungsaffinität für IGFBP-1 beitragen.
Eine verbesserte Konsensussequenz für IGFBP 1 bindende Peptide wird daher erwartet für:
Xaa_(1-4)CysXaa₍₆₎Xaa₍₇₎GlyXaa₍₉₎LeuXaa₍₁₁₎Xaa₍₁₂₎LeuCysXaa₍₁₅₎Xaa₍₁₆₎Xaa₍₁₇₎Xaa₍₁₈₎ (SEQ ID NO: 152), wobei Xaa_(1-4) fehlt oder zwischen 1 und 4 beliebige Aminosäuren ist; Xaa₍₆₎, Xaa₍₇₎, Xaa₍₉₎, Xaa₍₁₁₎, Xaa₍₁₅₎ und Xaa₍₁₆₎ unabhängig voneinander eine beliebige Aminosäure sind, und Xaa₍₁₂₎, Xaa₍₁₇₎ und Xaa₍₁₈₎ unabhängig voneinander Nal(1), His, Phe, Trp, Tyr, Pro, Gin oder Met sind. Wie in Beispiel 1 bemerkt, hat die Verkürzung der vier aminoterminalen Reste (Xaa_1-4) nur einen geringen Effekt auf die Aktivität, so dass man einen kürzeren Konsensus erhält, der weiterhin Bindung beibehält:
CysXaa₍₆₎Xaa₍₇₎GlyXaa₍₉₎LeuXaa₍₁₁₎TrpLeuCysXaa₍₁₅₎Xaa₍₁₆₎Xaa₍₁₇₎Xaa₍₁₈₎ (SEQ ID NO: 130).
TABELLE XXV Peptidaffinitätsbestimmungen durch BIAcore^TM-Kinetiken
BEISPIEL 15
Zellbasierter Assay der Peptidaktivität
Ein zellbasierter (KIRA) Assay wurde zuvor zum Messen der durch Peptide aus Mischungen von IGF-1 und Bindungsproteinen ersetzten Menge an IGF-ähnliche Aktivität (Lowman et al., supra, 1998; WO 98/45427 , supra) beschrieben. Der KIRA-Assay wurde verwendet, um die in-vitro-Bioaktivität von BP1-16, BP1-02, BP1-25 und BP1-40 zu vergleichen. In diesem Beispiel wurden sehr geringe Konzentrationen an IGF-1 und IGFBP-1 verwendet, d. h. unterhalb des K_D des Peptides: 2 nM [IGF-1] und 1,5 nM [IGFBP-1] mit einer Titrationsserie von [Peptid] = 0,1 bis 200 nM. IGF-1 und das Peptid wurden vermischt und zu den IGF-Rezeptor exprimierenden Zellen für 30 Minuten hinzugefügt, danach wurde IGFBP-1 für eine zusätzliche Stunde hinzugefügt.
Für die Peptide BP1-25, als auch BP1-40 wurde eine erhöhte Wirksamkeit gegenüber den Peptiden BP1-16 und BP1-02 beobachtet (36). Unter diesen Bedingungen war BP1-02 jedoch nicht signifikant aktiver als BP1-16; und BP1-30 war nicht signifikant aktiver als BP1-25. Die EC₂₀-(Konzentration bei 20% der beobachteten maximalen IGF-1-Aktivität)-Werte betrugen 10–20 nM für BP1-25 und BP1-40, und 150–200 nM für BP1-16 und BP1-02.
BEISPIEL 16
Biosynthese einer BP1-01-Peptidvariante
Eine zusätzliche Variante von BPI-21A wurde für die Peptidbiosynthese in E. coli entworfen. Für diesen Ansatz wurde eine das Peptid kodierende Sequenz durch stellenspezifische Mutagenese an das Gen für eine Konsensusdomäne des Proteins A, bekannt als Z-Domäne, fusioniert (Nilsson et al., supra, 1987). Nach der Expression und Sekretion aus E. coli wurde das Fusionsprotein enzymatisch mit Trypsin geschnitten, um das freie Peptid zu erhalten, welches aus dem enzymatischen Reaktionsgemisch aufgereinigt werden kann (siehe z. B. Varadarajan et al., supra; Castellanos-Serra et al., supra; Nilsson et al., supra, 1996).
Ein detailliertes Verfahren für Trypsinverdaue wurde beschrieben in Smith, supra. Da diese Protease hochspezifisch für Arg- und Lys-Reste ist, wurde das BP1-40-Peptid durch Mutation dieser Reste für die Konstruktion des Fusionsproteins modifiziert. Aus früheren Mutagenese- und Phagenbibliothek-Ergebnissen war bekannt, dass Arg- und Lys-Reste aus BP1-01 ohne signifikanten Verlust an Bindungsaffinität substituiert werden konnten. Daher wurde ein Fusionsprotein entworfen mit den Substitutionen R2A und K12H (Nummerierung entspricht der BP1-01-Sequenz). Außerdem war von BP1-01 mit einem Gly-Rest folgend dem C-terminalen F14 von BP1-16 bekannt, dass es eine signifikante Wirkung auf die Bindungsaffinität hat. Daher wurde eine Gly-Arg-Sequenz am Ende des Peptids hinzugefügt, um die Trypsinspaltung zu erlauben. Die Sequenzen des BPI-625-Z-Fusionsproteins und des BP1-625-Peptids (wie durch Trypsin gespalten) sind in Tabelle XXVI gegeben.
TABELLE XXVI Peptidsequenzen für die E. coli-Biosynthese
Das Fusionsprotein BP1-625-Z wurde aus E. coli-Schüttelkolbenkulturen hergestellt. Die Kulturüberstände wurden sterilfiltriert, dann auf eine IgG-Sepharose^TM-Säule (Pharmacia) appliziert. Die gebundene Fraktion wurde mit 1 M Essigsäure eluiert, dann lyophilisiert und in Trypsinverdaupuffer resuspendiert: 10 mM Tris (pH 8,0), 100 mM NaCl, 1 mM CaCl₂. TPCK-behandeltes Trypsin (Sigma) wurde in einem Gewicht/Gewicht-Verhältnis von 1:100 bis 1:200 (Trypsin zu Substrat) hinzugefügt und der Verdau wurde bei 25°C für 1–2 Stunden durchgeführt. Danach wurde PMSF zu 1 mM hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen. Die Proben wurden auf 1 mM TFA eingestellt und auf einer analytischen HPLC-Säule mit einem 0–60% Acetonitril-Gradienten in 0,1% TFA laufen gelassen. Die beiden vorherrschenden Peaks wurden gesammelt (37) und durch Massenspektrometrie gezeigt, dass sie einem Z-Domänenfragment und dem Peptid BP1-625 entsprechen.
Die Peptid BP1-625-Fraktion wurde lyophilisiert und in 100 mM HEPES-Puffer, pH 7,2 resuspendiert. Die Inhibitionsexperimente wurden in einem BIAcore^TM-Assay, wie zuvor beschrieben, ausgeführt, außer dass begrenzende Mengen (9–10 nM IGFBP-1) verwendet wurden, um den Assay sensitiv hinsichtlich Affinitäten in dem 10^–8 M Bereich zu machen. Diese Assays zeigten, dass das BP1-625-Peptid IGFBP-1-Bindung an immobilisiertes IGF-1 blockierte, und ähnlich in seiner Aktivität zu BP1-25 war, mit etwa 20-fach gesteigerter Wirksamkeit gegenüber BP1-01 (38).
Es kann erwartet werden, dass BP1-625 die IGF-1-Bindung an IGFBP-1 blockieren wird und IGF-artige Aktivität auf Zellen, mit ähnlicher Wirksamkeit wie BP1-21A, BP1-25 oder BP1-40, auslösen wird. Es wäre auch zu erwarten, dass ein Peptid, BP1-625T, umfassend die Sequenz:
GlyGlnGlnSerCysAlaAlaGlyProLeuGlnTrpLeuCysGluHisTyrPheSerThrTyr (SEQ ID NO: 153) sich ähnlich wie BP1-625 verhalten würde.
Das BP1-625-Z-Fusionsprotein ist nützlich zum Herstellen von IGFBP bindenden Peptiden aus E. coli, und der Z-Teil des Fusionsproteins kann vorteilhaft an andere Peptide hierin fusioniert werden, als nur BP1-625.
BEISPIEL 17
Artikuläre Knorpelexplantate aus humanen Gelenken
Materialien und Methoden:
Das gleiche Material und Methoden (für humanes Gewebe) wurden wie obenstehend beschrieben verwendet, unter Verwendung von artikulären Knorpelexplantaten aus humanen Gelenken, entnommen aus Patienten, die einen Gelenkaustausch unterlaufen. Diese Explantate wurden mit IGF alleine bei 40 ng/ml, oder IGF-1 mit BP1-17, BP3-15 oder BP1-16 (0,1 mg/ml) oder IGF-1 mit Puffer (HEPES) kultiviert.
Proteoglycanabbau und -synthese wurden wie obenstehend beschrieben gemessen.
Ergebnisse und Diskussion:
Die Rolle von spezifischen IGFBPs in der IGF-1-Aktivität wurde getestet durch Behandeln von artikulären Knorpelexplantaten aus Patienten, die einen Gelenkaustausch unterlaufen, mit IGF-1 in Gegenwart von Peptiden, die die IGF-1-Bindung zu bestimmten IGFBPs inhibieren. Insbesondere inhibiert BP1-16 die IGF-1-Bindung an IGFBP-1, und BP3-15 inhibiert die IGF-1-Bindung an IGFBP-3. BP1-17 bindet mit sehr viel niedriger Affinität an IGFBP-1. Zusätzlich wurde Puffer alleine (100 mM HEPES) als eine Negativkontrolle miteingeschlossen.
Wie in 39 gezeigt, verstärken sowohl BP3-15 als auch BP1-16, und auch in geringerem Ausmaß BP1-17, den vorbeugenden Effekt von IGF-1. BP3-15 und BP1-16, und in einem gewissen Maß BP1-17, verstärken nämlich den Anabolismus, wie durch den Anstieg der Matrixsynthese gezeigt. Daher wird für diese drei Peptide erwartet, und insbesondere für BP3-15 und BPI-16, nützliche Therapeutika für die Behandlung von Arthritis zu sein.

Claims

Ein IGF-1-Analogon mit einer Bindungsaffinitätspräferenz für Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-Bindungsprotein-3 (IGFBP-3) im Vergleich zu Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-Bindungsprotein-1 (IGFBP-1) oder ein IGF-1-Analogon mit einer Bindungsaffinitätspräferenz für IGFBP-1 im Vergleich zu IGFBP-3, wobei das Analogon eine IGF-1-Variante ist, bei der der Aminosäurerest an den Positionen 3, 7, 10, 16, 25 oder 49 oder die Aminosäurereste an den Positionen 3 und 49 der nativen Sequenz des humanen IGF-1 ersetzt sind durch einen Alanin-, einen Glycin- oder einen Serinrest, oder bei der der Aminosäurerest an Positionen 9, 12, 15 oder 20 der nativen Sequenz des humanen IGF-1 ersetzt ist durch einen Lysin- oder Argininrest zur Verwendung in einem Verfahren zur Vorbeugung oder Verlangsamung des Abbaus der Knorpelmatrix, wobei das Verfahren das in Kontakt bringen einer effektiven Menge eines dieser aktiven Mittel mit dem Knorpel umfasst.
Analogen nach Anspruch 1, bei dem das Verfahren im Zusammenhang mit einer in einem Säugetier aufgetretenen Störung durchzuführen ist und das aktive Mittel an das Säugetier zu verabreichen ist.
Analogen nach Anspruch 2, bei dem das aktive Mittel lokal an den Knorpel zu verabreichen ist.
Analogen nach Anspruch 3, bei dem das aktive Mittel ein IGF-1-Analogon mit einer Bindungsaffinitätspräferenz für IGFBP-3 im Vergleich zu IGFBP-1 ist, wobei das aktive Mittel an ein Säugetier mit einer effektiven Menge an IGF-1, säurelabile Untereinheiten (acid-labile subunit, ALS) oder IGF-1 und ALS zu verabreichen ist.
Analogen nach Anspruch 4, bei dem das aktive Mittel und IGF-1 oder ALS oder das aktive Mittel, IGF-1 und ALS zusammen als Komplex zu verabreichen sind.
Analogen nach Anspruch 2, bei dem das Säugetier menschlich ist.
Analogen nach Anspruch 1, bei dem das aktive Mittel F49A, E3A, F16A, E3AF49A, F16AF49A, D12K oder D12R ist.
Analogen nach Anspruch 1, bei dem das Verfahren im Zusammenhang mit einer degenerativen Störung des Knorpels durchzuführen ist.
Analogen nach Anspruch 8, bei dem die Störung eine Knorpelstörung im Gelenk ist.
Analogen nach Anspruch 9, bei dem die Knorpelstörung im Gelenk ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis.
Analogen nach Anspruch 1, bei dem das aktive Mittel durch direkte Injektion in die betroffene Knorpelregion oder Gelenk zu verabreichen ist.
Analogen nach Anspruch 1, bei dem das aktive Mittel eine Formulierung mit verlängerter Freisetzung ist.
Analogen nach Anspruch 1, bei dem das aktive Mittel mit einer effektiven Menge eines Knorpelwachstumsfaktors oder eines Knorpelkatabolismus-Antagonisten an den Knorpel zu verabreichen ist.
Analogen nach Anspruch 13, bei dem der Knorpelwachstumsfaktor IGF-1 ist.
Verwendung eines IGF-1-Analogons mit einer Bindungsaffinitätspräferenz für Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-Bindungsprotein-3 (IGFBP-3) im Vergleich zu Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-Bindungsprotein-1 (IGFBP-1) oder eines IGF-1-Analogons mit einer Bindungsaffinitätspräferenz für IGFBP-1 im Vergleich zu IGFBP-3, bei der das Analogon eine IGF-1-Variante ist, bei der der Aminosäurerest an den Positionen 3, 7, 10, 16, 25 oder 49 oder die Aminosäurereste an Position 3 und 49 der nativen Sequenz des humanen IGF-1 ersetzt sind durch einen Alanin-, einen Glycin- oder einen Serinrest, oder bei dem der Aminosäurerest an Positionen 9, 12, 15 oder 20 der nativen Sequenz des humanen IGF-1 ersetzt ist durch einen Lysin- oder Argininrest zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Vorbeugung oder Verlangsamung des Abbaus der Knorpelmatrix, wobei eine effektive Menge eines dieser aktiven Mittel mit dem Knorpel in Kontakt zu bringen ist.
Verwendung nach Anspruch 15, mit den Merkmalen wie in irgendeinem der Ansprüche 2 bis 14 definiert.