ES2301547T3

ES2301547T3 - Tratamiento de trastornos del cartilago.

Info

Publication number: ES2301547T3
Application number: ES01937482T
Authority: ES
Inventors: Yves Dubaquie; Ellen H. Filvaroff; Henry B. Lowman
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2000-05-16
Filing date: 2001-05-16
Publication date: 2008-07-01
Anticipated expiration: 2021-05-16
Also published as: DK1282437T3; US7947650B2; DE60133271T2; EP1282437B1; ATE389416T1; US8110548B2; WO2001087323A2; US20090011988A1; DE60133271D1; WO2001087323A3; US20030211992A1; US7423017B2; US20030069177A1; HK1050321A1; EP1282437A2; AU2001263215A1; US20100130411A1

Abstract

Un análogo de IGF-1 con una preferencia de afinidad de unión por la proteína de unión al factor de crecimiento de tipo insulina 3 (IGFBP-3) sobre la proteína de unión al factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGFBP-1) o un análogo de IGF-1 con una preferencia de afinidad de unión por IGFBP-1 sobre IGFBP-3, en el que el análogo es una variante de IGF-1 en la que el resto aminoacídico en las posiciones 3, 7, 10, 16, 25 ó 49 o los restos aminoacídicos en las posiciones 3 y 49 del IGF-1 humano de secuencia nativa se reemplazan con un resto de alanina, de glicina o de serina o en la que el resto aminoacídico en las posiciones 9, 12, 15 ó 20 del IGF-1 humano de secuencia nativa se reemplaza con un resto de lisina o arginina para el uso en un método para la prevención o el enlentecimiento de degradación de la matriz de cartílago, en el que dicho método comprende poner en contacto una cantidad eficaz de uno de dichos agentes activos con el cartílago.

Description

Tratamiento de trastornos del cartílago.

Campo de la invención

La presente invención se refiere generalmente al tratamiento de trastornos del cartílago, incluyendo la estimulación de la reparación del cartílago y el tratamiento de trastornos cartilaginosos degenerativos.

Antecedentes de la invención

Los trastornos cartilaginosos degenerativos describen en líneas generales un grupo de enfermedades caracterizadas por anomalías degenerativas o metabólicas de los tejidos colectivos, que se manifiestan mediante dolor, rigidez y limitación del movimiento de las partes corporales afectadas. El origen de estos trastornos puede ser patológico o como resultado de un traumatismo o lesión.

La osteoartritis (OA), también conocida como osteoartrosis o enfermedad degenerativa de las articulaciones, es el resultado de una serie de procesos degenerativos localizados que afectan a la estructura articular y dan como resultado dolor y una función disminuida. La incidencia de OA aumenta con la edad y pueden detectarse pruebas de la implicación de la OA en algunas articulaciones en la mayoría de la población a partir de los 65 años. Con frecuencia, la OA también se acompaña de un componente inflamatorio local que puede acelerar la destrucción de la articulación.

La OA está caracterizada por una interrupción de la superficie articular lisa del cartílago, seguida de la formación de fisuras y fibrilación y, en última instancia, de la pérdida del grosor completo del cartílago. Son coincidentes con los cambios cartilaginosos alteraciones del hueso periarticular. Éstas incluyen el desarrollo de prolongaciones palpables de hueso en los márgenes de la articulación y la deformidad resultante de la destrucción asimétrica del cartílago. Los síntomas de OA incluyen dolor local en las articulaciones afectadas, especialmente después del uso. Con el avance de la enfermedad, los síntomas pueden evolucionar hacia una sensación de dolor continua, molestias locales y alteraciones estéticas de la articulación afectada. Al contrario que el trastorno de OA localizada, la artritis reumatoide (AR) es una enfermedad destructiva y debilitante sistemática que se piensa que comienza en el sinovio, los tejidos que rodean a la articulación. La prevalencia de AR es de aproximadamente 1/6 la de OA en la población general de Estados Unidos. Es un trastorno autoinmune crónico caracterizado por una sinovitis simétrica de la articulación y que afecta, típicamente, a pequeñas y grandes articulaciones diartrodiales, conduciendo a su destrucción progresiva. A medida que progresa la enfermedad, los síntomas de AR también pueden incluir fiebre, pérdida de peso, adelgazamiento de la piel, implicación multiorgánica, escleritis, úlceras corneales, la formación de nódulos subcutáneos o subperiósteos y muerte prematura.

La respuesta de pacientes normales (por ejemplo, antes de una lesión o enfermedad) a lesiones o degeneración artrítica es frecuentemente subóptima. Las propiedades bioquímicas y mecánicas de este cartílago dañado difieren de las del cartílago normal, dando como resultado una función inadecuada o alterada. Este cartílago dañado, denominado en este documento "fibrocartílago", no se aproxima a la duración y a la función del cartílago normal.

Puesto que el cartílago es avascular y los condrocitos maduros tienen un potencial intrínseco para replicación escaso, el cartílago maduro tiene una capacidad limitada para repararse. Por lo tanto, los daños en la capa de cartílago que no penetran hasta el hueso subcondral no experimentan una reparación eficaz. Al contrario, cuando se penetra el hueso subcondral, su suministro vascular permite que se produzca una reparación trifásica. Habitualmente, el tejido resultante es fibrocartílago mecánicamente subóptimo.

Habitualmente, la degradación asociada con osteoartritis aparece inicialmente como desgastamiento y fibrilación de la superficie. También se produce pérdida de proteoglicano de la matriz. A medida que avanza la fibrilación superficial, los defectos penetran más profundamente hacia el interior del cartílago, dando como resultado una pérdida de células cartilaginosas y de matriz. El hueso subcondral se engrosa, queda expuesto lentamente, y puede aparecer pulido. También se forman con frecuencia nódulos óseos u osteofitos en la periferia de la superficie del cartílago y, ocasionalmente, crecen por encima de las áreas erosionadas adyacentes. Si la superficie de estos sobrecrecimientos óseos es permeable, puede producirse un sobrecrecimiento vascular y causar la formación de tapones de tejido que contienen fibrocartílago.

Se conoce el transplante de condrocitos como un medio de estimular la reparación del cartílago. Sin embargo, la posibilidad de la respuesta inmunogénica del hospedador, así como la posible transmisión de enfermedades virales y otras enfermedades infecciosas, hacen que este método sea menos deseable. Estos riesgos pueden minimizarse en cierto grado con aloinjertos y transplantes autógenos; sin embargo, el cultivo y desarrollo de células específicas de paciente es prohibitivamente costoso a escala masiva.

Otros métodos de estimulación de la reparación del cartílago incluyen el antagonismo de moléculas que están asociadas con, o que agravan la destrucción de cartílago, por ejemplo, interleucina-1-alfa (IL-1\alpha) y óxido nítrico (NO). La citocina IL-1\alpha tiene efectos catabólicos sobre el cartílago, incluyendo la generación de inflamación sinovial y la regulación positiva de metaloproteinasas de la matriz y expresión de prostaglandinas (Baragi et al., J. Clin. Invest., 96: 2454-2460 (1995); Baragi et al., Osteoarthritis Cartilage, 5: 275-282 (1997); Evans et al., J. Keukoc. Biol. 64: 55-61 (1998); Evans y Robbins, J. Rheumatol., 24: 2061-2063 (1997); Kang et al., Biochem. Soc. Trans. 25: 533-537 (1997); Kang et al., Osteoarthritis Cartilage, 5: 139-143 (1997)). Un medio de antagonizar IL-1\alpha es a través de la aplicación de antagonista del receptor de IL-1 soluble (IL-1ra), una proteína de origen natural que inhibe los efectos de IL-1 impidiendo la unión de IL-1 a y la activación de su receptor en condrocitos y sinoviocitos, disminuyendo por lo tanto la concentración eficaz de IL-1.

El NO desempeña un papel importante en la destrucción del cartílago (Ashok et al., Curr. Opin. Rheum., 10: 263-268 (1998)). El cartílago obtenido de articulaciones osteoartríticas produce de forma endógena grandes cantidades de NO. El cartílago normal no produce NO a menos que se estimule con citocinas tales como IL-1, mientras que los explantes de cartílago osteoartrítico continúan expresando NO sintasa durante hasta 3 días en cultivo, a pesar de la ausencia de estímulos añadidos. Además, la inhibición de NO ha demostrado que evita la destrucción de cartílago mediada por IL-1\alpha y la muerte de condrocitos, así como el avance de la osteoartritis.

También se ha examinado la capacidad de factores de crecimiento peptídicos para promover la reparación de cartílago dañado. Los factores de crecimiento peptídicos son reguladores muy importantes del crecimiento del cartílago y del comportamiento celular (es decir, diferenciación, migración, división o síntesis y/o degradación de la matriz) (Chen et al, Am J. Orthop., 26: 396-406 (1997)). Se está investigando estos factores por su potencial para inducir la reparación de cartílago del hospedador sin el transplante de células y se están incorporando en dispositivos obtenidos por ingeniería genética para implantación.

Debido a que los factores de crecimiento son proteínas solubles de una masa molecular relativamente pequeña que se absorben y/o se degradan rápidamente, hacerlas disponibles para las células en cantidad suficiente y por una duración suficiente supone un gran desafío. Probablemente es deseable tener diferentes factores presentes en el lugar de reparación durante las diferentes partes del ciclo de desarrollo y por longitudes de tiempo variables. El vehículo de administración ideal es biocompatible y reabsorbible, tiene las propias mecánicas apropiadas y no da como resultado productos de degradación perjudiciales. Los factores de crecimiento que se han propuesto anteriormente para estimular la reparación de cartílago incluyen factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1) (Osborn, J. Orthop. Res., 7: 35-42 (1989); Florini y Roberts, J. Gerontol., 35: 23-30 (1980); Patente de Estados Unidos Nº 5.843. 899), factor de crecimiento fibroblástico básico (bFGF) (Toolan et al., J. Biomec. Mat. Res., 41: 244-50 (1998); Sah et al., Arch. Biochem. Biophys., 308: 137-47 (1994)), proteína morfogénica ósea (BMP) (Sato y Urist, Clin. Orthop. Relat. Res., 183: 180-187 (1984); Chin et al., Arthritis Rheum. 34: 314-324 (1991)) y factor de crecimiento transformante beta (TGF-\beta) (Hill y Logan, Prog. Growth Fac. Res., 4: 45-68 (1992); Guerne et al., J. Cell Physiol., 158: 476-484 (1994); Van der Kraan et al., Ann. Rheum. Dis., 51: 643-647 (1992)).

Está bien establecido que el sistema GH/IGF/IGFBP está implicado en la regulación de la homeostasis anabólica y metabólica y que los defectos en este sistema pueden afectar negativamente al crecimiento, la fisiología y el control glucémico (Jones et al., Endocr. Rev., 16: 3-34 (1995); Davidson, Endocr. Rev., 8: 115-131 (1987); Moses, Curr. Opin. Endo. Diab., 4: 16-25 (1997)). Se ha propuesto que IGF-1 podría ser útil para el tratamiento o prevención de la osteoartritis debido a su capacidad para estimular tanto la síntesis de la matriz como la proliferación celular en cultivo (Osborn, J. Orthop. Res., 7: 35-42 (1989)). Se ha administrado IGF-1 con pentosán polisulfato sódico (PPS) (un inhibidor de la actividad catabólica de condrocitos) a caninos gravemente osteoartríticos con el efecto de reducir la gravedad de la enfermedad, posiblemente reduciendo los niveles de metaloproteinasa neutra activa en el cartílago. En el modelo de caninos ligeramente osteoartríticos, la intervención terapéutica con IGF-1 y PPS juntos pareció mantener con éxito la estructura y la bioquímica del cartílago, mientras que IGF solo fue ineficaz, como se describe en Rogachefsky, Osteoarthritis and Cartilage, 1: 105-114 (1993); Rogachefsky et al., Ann. NY Acad. Sci., 732: 889-895 (1994). Se ha descrito el uso de IGF-1 solo como adyuvante con otros factores de crecimiento para estimular la regeneración de cartílago en los documentos WO 91/19510, WO 92/13565, US 5.444.047 y EP 434.652.

También se ha descubierto que IGF-1 es útil en el tratamiento de osteoporosis en mamíferos que presentan una densidad mineral ósea disminuida y los expuestos a fármacos o condiciones ambientales que dan como resultado una reducción de la densidad ósea y, potencialmente, osteoporosis, como se describe en los documentos EP 560.723 y EP 436.469.

La insuficiencia de IGF-1 puede tener un papel etiológico en el desarrollo de osteoartritis (Coutts et al., "Effect of growth factors on cartilage repair", Instructional Course Lect., 47: 487-494 (Amer. Acad. Orthop. Surg.: Rosemont, IL 1997)). Algunos estudios indican que las concentraciones de IGF-1 en suero son menores en pacientes osteoartríticos que en grupos de control, mientras que otros estudios no han encontrado diferencias. No obstante, se ha demostrado que tanto los niveles de IGF-1 en suero como la sensibilidad de condrocitos a IGF-1 disminuye con la edad, estando esto último probablemente debido a los altos niveles de proteínas de unión a IGF (IGFBP) (Florini y Roberts, J. Gerontol., 35: 23-30 (1980); Martin et al., J. Orthop. Res., 15: 491-498 (1997); Fernihough et al., Arthr. Rheum. 39: 1556-1565 (1996)). Por lo tanto, tanto la disponibilidad disminuida de IGF-1, así como la sensibilidad de condrocitos disminuida/desregulación de IGFBP en este caso, pueden contribuir a la homeostasis alterada de la matriz de cartílago y a la degeneración tisular que se produce con la edad avanzada y la enfermedad.

De las IGFBP, IGFBP-3 parece ser la máxima responsable de la regulación de los niveles totales de IGF-1 e IGF-2 en plasma. IGFBP-3 es una proteína dependiente de GH y está disminuida en casos de deficiencia de o resistencia a GH (Jones et al., anteriormente; Rosenfield et al., "IGF-1 treatment of syndromes of growth hormone insensitivity" En: The insulin-like growth factors and their regulatory proteins, Eds. Baxter R. C., Gluckman P. D., Rosenfield R. G. Excerpta Medica, Amsterdam, 1994), págs. 357-464; Scharf et al., J. Hepatology, 25: 689-699 (1996)). Las IGFBP son capaces de aumentar o inhibir la actividad de IGF, dependiendo en gran medida de sus modificaciones postraduccionales y de la localización tisular (revisado en Jones y Clemmons, Endocr. Rev. 16: 3-34 (1995); Collet-Solberg y Cohen, Endocrinol. Metabol. Clin. North Am. 25: 591-614 (1996)). Además, la desregulación de IGFBP (3, 4 y/o 5) puede desempeñar un papel clave en trastornos artríticos (Chevalier y Tyler, Brit. J. Rheum. 35: 515-522 (1996); Olney et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 81: 1096-1103 (1996); Martel-Pelletier et al., Inflamm. Res., 47: 90-100 (1998)). Se ha descrito que análogos de IGF-1 con una afinidad de unión muy baja por IGFBP fueron más eficaces que el IGF-1 de tipo silvestre en la estimulación de la síntesis de proteoglicano (Morales, Arch Biochem. Biophys. 324, 173-188 (1997). Sin embargo, datos más recientes sugieren que las IGFBP contribuyen a la unión de IGF a y al transporte a través del tejido cartilaginoso y, por lo tanto, las IGFBP pueden regular la biodisponibilidad de IGF-1 dentro de la articulación (Bhakta et al., J. Biol. Chem., 275: 5660-5866 (2000)).

La biodistribución de IGF-1 depende críticamente de (a) la formación de complejos de alto peso molecular de larga vida y (b) las concentraciones absolutas de IGFBP. La mayoría del IGF-1 en la circulación se encuentra formando un complejo con IGFBP-3 y una tercera proteína denominada subunidad ácido labil (ALS) (Bach y Rechler, Diabetes Reviews, 3: 38-61 (1995); Clemmons, Cytokine Growth Factor Rev., 8: 45-62 (1997); Jones y Clemmons, Endocr. Rev., 16: 3-34 (1995)). Este complejo ternario de 150 kD de peso molecular es incapaz de atravesar las paredes vasculares y actúa como un depósito circulante para IGF. Como consecuencia, se ha descrito que la vida media en suero de IGF-1 en complejos ternarios es de 12-15 horas, en en vez de 30 minutos cuando en complejos binarios o a los 10 minutos en la forma libre (Simpson et al., Growth Horm IGF Res, 8: 83-95 (1998); Twigg y Baxter, J. Biol. Chem., 273: 6074-6079 (1998)).

IGFBP-3 e IGFBP-5 son aparentemente únicas por su capacidad para formar un complejo ternario con ALS. La asociación con ALS se produce sólo en presencia de IGF-1 y un motivo básico en el dominio carboxi-terminal de IGFBP-3 e IGFBP-5 parece mediar esta interacción (Baxter et al., J. Biol. Chem., 267: 60-65 (1992); Firth et al., J. Biol. Chem., 273: 2631-2638 (1998); Twigg y Baxter, anteriormente).

El segundo determinante de la biodistribución de IGF-1 es la concentración total de proteínas de unión: IGFBP-3 es la proteína de unión más abundante, seguida de los niveles de IGFBP-1 e IGFBP-2, mientras que las concentraciones en suero de IGFBP-4, IGFBP-5 e IGFBP-6 son muy bajas (Clemmons, Cytokine Growth Factor Rev., 8: 45-62 (1997)). Por lo tanto, IGFBP-3 representa la principal transportadora de IGF-1 en la sangre. Por el contrario, una porción importante de IGFBP-1 e IGFBP-2 en la sangre están desocupadas. Por lo tanto, parecen ser los moduladores principales de los niveles de IGF-1 libre (Clemmons, 1997, anteriormente).

El documento WO 94/04569 describe una molécula de unión específica, distinta de una IGFBP natural, que es capaz de unirse a IGF-1 y que puede aumentar la actividad biológica de IGF-1. El documento WO 98/45427, publicado el 15 de octubre de 1998; Lowman et al., Biochemistry, 37: 8870-8878 (1998); y Dubaquié y Lowman, Biochemistry, 38: 6386 (1999), describen agonistas de IGF-1 identificados por presentación de fagos. Además, el documento WO 97/39032 describe inhibidores de ligandos de IGFBP y métodos para su uso. Además, la Patente de Estados Unidos Nº 5.891.722 describe anticuerpos que tienen una afinidad de unión por IGFBP-1 libre y dispositivos y métodos para detectar IGFBP-1 libre y una hernia en una membrana fetal basados en la presencia de líquido amniótico en una secreción vaginal, como indica la presencia de IGFBP-1 libre en la secreción vaginal. El documento WO 00/23469, publicado el 27 de abril 2000, describe fragmentos de IGFBP y análogos de IGF-1 para usar en, por ejemplo, el tratamiento de cáncer, lesiones isquémicas y diabetes.

Existe la continua necesidad de una terapia eficaz para el tratamiento y reparación de cartílago, incluyendo cartílago dañado como resultado de lesiones y/o enfermedades.

Sumario de la invención

Por consiguiente, la presente invención se refiere al uso de un análogo de IGF-1 con una preferencia de afinidad de unión por IGFBP-3 sobre IGFBP-1, o un análogo de IGF-1 con una preferencia de afinidad de unión por IGFBP-1 sobre IGFBP, para la preparación de una composición para la prevención y la reducción de la degradación de la matriz de cartílago, en la que una cantidad eficaz de uno de dichos agentes activos se va a poner en contacto con el cartílago, como se define en las reivindicaciones. Preferiblemente, el cartílago se trata in vivo en un mamífero y el agente activo se administra al mamífero. Además, el agente activo, opcionalmente, se pone en contacto con el cartílago en una forma de liberación prolongada y/o se administra localmente en la articulación en solitario o, si el agente activo es un análogo de IGF-1 con una preferencia por IGFBP-3 sobre IGFBP-1, junto con IGF-1 y/o ALS, preferiblemente humana, e IGF-1 de secuencia nativa si el mamífero es un ser humano.

El agente activo es una variante de IGF-1, en la que el resto aminoacídico en la posición 3, 7, 10, 16, 25 ó 49 o los restos aminoacídicos en las posiciones 3 y 49 del IGF-1 humano de secuencia nativa se reemplazan con un resto de alanina, de glicina o de serina, o una variante de IGF-1 en la que el resto aminoacídico en la posición 9, 12, 15 ó 20 se reemplaza con un resto de lisina o arginina.

La letra seguida por un número seguida por una letra indica un análogo de IGF-1 en el que la letra del aminoácido a la izquierda del número es el aminoácido original en el IGF-1 humano de secuencia nativa, el número es la posición en la que se cambia el aminoácido y la letra del aminoácido a la derecha del número es el aminoácido sustituto. Por lo tanto, por ejemplo, F49A indica una variante de IGF-1 en la que el resto de fenilalanina en la posición 49 del IGF-1 humano de secuencia nativa se cambia a un resto de alanina, y E3AF49A indica una variante de IGF-1 en la que el resto de glutamina en la posición 3 del IGF-1 humano de secuencia nativa se cambia a un resto de alanina y el resto de fenilalanina en la posición 49 del IGF-1 humano de secuencia nativa se cambia a un resto de alanina.

En otra realización, el uso anterior es para el tratamiento de cartílago dañado o enfermo como resultado de un trastorno cartilaginoso degenerativo. Preferiblemente, el trastorno es un trastorno del cartílago articular y, más preferiblemente, es OA o AR.

Se describe además el uso anterior para el tratamiento de articulaciones dañadas directa o indirectamente por lesiones, preferiblemente microlesiones o traumatismos cerrados, una fractura condral o una fractura osteocondral.

Opcionalmente, la invención se refiere al uso anterior en el que el cartílago se va a poner en contacto con una cantidad eficaz del análogo de IGF-1 o de péptido desplazador de IGFBP, como se ha definido anteriormente, junto con una cantidad eficaz de un factor de crecimiento de cartílago o antagonista del catabolismo del cartílago.

Se describe además un método para mantener, potenciar o promover el crecimiento de condrocitos en cultivo sin suero, poniendo en contacto a los condrocitos con una cantidad eficaz de un análogo de IGF-1 o un péptido desplazador de IGFBP, como se han identificado anteriormente. Como alternativa, el método se refiere al contacto del condrocito con una cantidad eficaz de un análogo de IGF-1 o un péptido desplazador de IGFBP en una formulación de liberación prolongada. Como alternativa, también se describe un método de estimulación de la regeneración o prevención de la degradación de cartílago, que es el resultado de lesiones o de un trastorno cartilaginoso degenerativo, mediante el transplante de una cantidad eficaz de condrocitos previamente tratados con una cantidad eficaz de un análogo de IGF-1 o un péptido desplazador de IGFBP, como se ha definido anteriormente.

Se describe además un artículo de fabricación que comprende un envase que contiene un análogo de IGF-1, como se ha definido anteriormente, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, con instrucciones para su uso en el tratamiento de un trastorno del cartílago.

Breve descripción de las Figuras

Las Figuras 1A-1C representan la secuencia de ADN (SEC ID Nº: 1) del plásmido pt4.g8 usado como molde para construir una biblioteca de fagos. También se muestra la secuencia de aminoácidos (SEC ID Nº: 2) de un péptido reconocible por anticuerpos (gD-tag) fusionado a g8p de bacteriófago M13.

La Figura 2 muestra enriquecimientos de bibliotecas de fagos de gen-8 sin tratamiento previo con una selección usando cuatro combinaciones de bibliotecas cada uno y las dianas IGF-1, IGFBP-1 e IGFBP-3.

La Figura 3 muestra un ensayo de bloqueo de IGF-1 usando péptidos de fagos g8 de selecciones con IGFBP-3, en el que la titulación de fagos es con IGF-1 100 nM. En la Figura, los círculos claros son péptido 4A3.1, los triángulos claros son péptido 4B3.4, los cuadrados claros son péptido 4C3.2, los círculos oscuros son péptido 4D3.3, los triángulos oscuros son péptido 4D3.4 y los cuadrados oscuros son péptido 4D3.5.

La Figura 4 muestra un ensayo de bloqueo de IGF-1 usando péptidos de fagos g8 de selecciones con IGFBP-3, en el que la titulación de fagos es sin IGF-1. Las denominaciones para los péptidos son las mismas que las descritas anteriormente para la Figura 3.

La Figura 5 muestra un ensayo de bloqueo de IGF-1 usando péptidos de fagos g8 de selecciones con IGFBP-3, en el que los péptidos (4C3.2, 4D3.8, 4D3.9, 4D3.11 y 4D3.12) son de una selección con NEUTRAVIDIN^{TM}/DTT. Las barras oscuras son con IGF-1 100 \muM y las barras claras son sin IGF-1.

La Figura 6 muestra un ensayo de bloqueo de IGF-1 usando péptidos de fagos g8 de selecciones con IGFBP-3, en el que los péptidos (indicados sobre el eje x) son de una selección con revestimiento directo/HCl. Las barras oscuras son con IGF-1 100 \muM y las barras claras son sin IGF-1.

La Figura 7 representa un ensayo de competición de inhibición de IGFBP-3 por un péptido que se une a IGFBP-3 (denominado BP3-01), usando un positivo de resonancia de plasmón superficial de BIACORE^{TM} para medir proteína de unión libre. Los círculos indican 800 unidades de respuesta (RU) de IGF-1 y los cuadrados indican 400 RU de IGF-1 inmovilizado.

La Figura 8 representa un ensayo de competición de inhibición de IGFBP-3 por un péptido que se une a IGFBP-3 (denominado BP3-02), usando un dispositivo de resonancia de plasmón superficial de BIACORE^{TM} para medir proteína de unión libre. Los círculos indican 800 RU de IGF-1 y los cuadrados indican 400 RU de IGF-1 inmovilizado.

La Figura 9 muestra un ensayo en placa de IGF-1 radiomarcado de la capacidad de dos péptidos que se unen a IGFBP-3 pero no al receptor de IGF de tipo 1 (BP3-01-ox: círculos y BP3-02-OX: cuadrados) para inhibir a IGFBP-3.

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La Figura 10 muestra un ensayo en placa de IGF-1 radiomarcado de la capacidad de los dos péptidos de unión a IGFBP-3 descritos para la Figura 9 para inhibir a IGFBP-1 (los símbolos son los mismos).

Las figuras 11A-11D representan ensayos de KIRA de la actividad de IGF-1 usando tres péptidos (BP1-01: cuadrados, BP1-02: círculos y BP03-ox: triángulos). La figura 11A representa los péptidos solos, la Figura 11B representa los péptidos más IGF-1 más IGFBP-1, la Figura 11C representa los péptidos más IGF-1 y la Figura 11D representa los péptidos más IGF-1 más IGFBP-3.

La Figura 12 representa un ensayo de competición de IGF-2 de la inhibición de IGFBP-3 por cuatro péptidos, denominados BP3-01-ox (cuadrados claros), BP3-14 (círculos claros), BP3-15 (círculos oscuros) y BP3-17 (cuadrados oscuros), usando un dispositivo de resonancia de plasmón superficial de BIACORE^{TM} para medir proteína de unión libre. Cada péptido se ensayó usando IGFBP-3 20 nM y aproximadamente 1500 RU de IGF-2 inmovilizado.

Las Figuras 13A y 13B muestran un ELISA de fagos de la variante, G1S-A70V IGF-1, que se une a IGFBP-1 (Fig. 13A) y a IGFBP-3 (Fig. 13B). Se incubaron placas de microtitulación revestidas con IGFBP-1 1 \mug/ml (Fig. 13A) o IGFBP-3 (Fig. 13B) con partículas de fagos que presentaban G1S-A70V en presencia de las cantidades indicadas de proteína competidora soluble, IGFBP-1 (Fig. 13A) o IGFBP-3 (Fig. 13B). La concentración inhibitoria semimáxima (CI_{50}) del competidor, es decir, la concentración inhibitoria de competidor que da como resultado una unión semimáxima del fagémido en ese experimento en particular, se indica para la IGFBP respectiva.

La Figura 14 muestra la pérdida o ganancia de afinidad por IGFBP para los mutantes de IGF-1 ensayados mediante ELISA de fagos. Se muestran los valores de CI_{50} relativa (CI_{50 mut}/CI_{50 G1S-A70V}) de cada mutante de alanina de IGF-1 (cambios de afinidad de cada mutante por las proteínas de unión con respecto a IGF-1 G1S-A70V) para IGFBP-1 (barras oscuras) e IGFBP-3 (barras claras). Los datos se toman de la Tabla I a continuación. Los valores de CI_{50} relativa <1 denotan ganancia de afinidad; los valores >1 denotan pérdida de afinidad. El asterisco indica que estas variantes en particular no se presentaron en fagos, a juzgar por la unión de anticuerpos.

Las Figuras 15A y 15B muestran la especificidad de unión de la variante de IGF-1 F49A, presentada en fagos contra IGFBP-1 e IGFBP-3, respectivamente, en ELISA competitivo de fagos. Las partículas de fagémidos que presentaban F49A (cuadrados) se unieron a placas revestidas con IGFBP-3 en presencia de las cantidades indicadas de IGFBP-1 soluble (Fig. 15A) o IGFBP-3 (Fig. 15B). Se llevó a cabo el mismo experimento en paralelo con fagos que presentaban la variante de IGF-1 similar al de tipo silvestre G1S-A70V (círculos). Véanse las Tablas I y II a continuación para los valores de CI_{50} absoluta. Los puntos de datos son la media \pm la desviación típica, n = 2. Se revistieron placas inmunoabsorbentes con IGFBP-3 1 \mug/ml y se llevaron a cabo los ELISA como se describe en los Ejemplos a continuación, usando fagos de IGF-1 de tipo silvestre (WT, círculos) y fagos de IGF-F49A (F49A, cuadrados) en paralelo. Los experimentos se llevaron a cabo por duplicado y los puntos de datos se muestran como la media \pm la desviación típica.

La Figura 16 describe un alineamiento de secuencias de IGF-1 humano de secuencia nativa (denominado wtIGF) (SEC ID Nº: 3), proinsulina humana de secuencia nativa (denominada proinsulina) (SEC ID Nº: 4) e insulina humana de secuencia nativa (denominada insulina (cadena B) seguida de insulina (cadena A)) (SEC ID Nº: 5). Los asteriscos y puntos indican identidad de secuencia y similitud de secuencia, respectivamente, en las posiciones de aminoácidos indicadas entre las tres secuencias.

Las Figuras 17A-17D muestran un análisis biodetector de unión de IGFBP a variantes de IGF-1 inmovilizadas. Se muestran sensogramas para unión de IGFBP-1 (Figs. 17A y 17C) o IGFBP-3 (Figs. 17B y 17D) a IFG-1 de tipo silvestre (Figs. 17A y 17B) o variante de IGF F49A (Figs. 17C y 17D) inmovilizados. Las concentraciones de ligando en cada experimento fueron de 1 \muM, 500 nM y 250 nM. Véase la Tabla II para los parámetros cinéticos.

Las Figuras 18A-18B muestran un modelo de los epítopos de unión funcionales para IGFBP-1 e IGFBP-3, respectivamente, sobre la superficie de IGF-1. Las cadenas laterales de aminoácidos se clasificaron de acuerdo con su contribución relativa en energía de unión (Tabla I) y se colorearon de la forma siguiente: sin efecto (gris); pérdida de 2-5 veces de afinidad aparente (amarillo); de 5-10 veces (naranja); de 10-100 veces (rojo claro); >100 veces (rojo oscuro). Si estaban disponibles, se usaron las cifras de los experimentos de ELISA de fagos de la Tabla I a continuación. Se usaron en su lugar los datos de BIACORE^{TM} para las variantes V11A, R36A y P39A (Tabla II). La estructura de RMN de IGF-1 (Cooke et al., Biochemistry, 30: 5484, (1991)) se representó usando el programa Insight II^{TM} (MSI, San Diego, CA). El epítopo de unión para IGFBP-1 (Fig. 18A) se localiza en la cara "superior" e "inferior" de la hélice N-terminal (restos 8-17), unida por el resto energéticamente importante F49. Para IGFBP-3 (Fig. 18B), las cadenas laterales individuales de IGF-1 contribuyen muy poco a la energía de unión. El epítopo de unión se ha eliminado del extremo N-terminal e incluyen nuevos G22, F23 e Y24.

La Figura 19 muestra la cantidad de IGFBP-1 unida, determinada en un experimento de unión de BIACORE^{TM} competitivo, representada contra la concentración de variante de IGF para E3A/F49 (cuadrados) y F49A
(círculos).

Las Figuras 20A y 20B muestran, respectivamente, la actividad de IGF-1 calculada en unidades nM para varias variantes de IGF-1 a concentraciones de variantes de 13 nM (elevadas) y 1,3 nM (bajas) usando análisis de densidad óptica de KIRA de IGF-1. La señal obtenida para cada variante de IGF se comparó con la de una dilución seriada patrón de IGF-1 de tipo silvestre y se describen términos de concentración de IGF-1 aparente que se corresponde con la actividad observada.

Las Figuras 21A y 21B muestran las curvas de activación de receptor de IGF para F49A IGF-1 (Fig. 21A) y E3A/F49A (Fig. 21B), así como para IGF-1 de tipo silvestre, medida usando diluciones seriadas en ensayos de KIRA. Las variantes se representan mediante cuadrados y el IGF-1 de tipo silvestre se representa mediante círculos.

Las Figuras 22A y 22B muestran una evaluación de las propiedades farmacológicas preliminares de IGF-1 F49A y E3A/F49, radiomarcados y administrados por vía intravenosa a ratas. La Figura 22A muestra un curso de tiempo de la velocidad a la que ambas moléculas se eliminan de la sangre de los animales, en la que los cuadrados representan IGF-1 de tipo silvestre, los círculos representan E3A/F49A IGF-1 y los rombos representan F49A IGF-1. La Figura 22B muestra la relación tisular con respecto a sanguínea para estas dos variantes de IGF en diferentes órganos, en concreto, riñón, hígado, bazo, corazón y páncreas, a los 5, 15 y 30 minutos, en la que las barras oscuras representan el IGF-1 de tipo silvestre, las barras punteadas representan E3A/F49A IGF-1 y las barras rayadas representan F49A
IGF-1.

La Figura 23 muestra el espectro de dicroísmo circular de IGF-1 de tipo silvestre (círculos), F49A IGF-1 (cuadrados) y E3A/F49A IGF-1 (rombos).

La Figura 24 es un gráfico de barras que muestra el efecto de control de IGF-1 de tipo silvestre, F49A y E3A/F49A (a una concentración de 40 ó 400 ng/ml) sobre la degradación de la matriz de cartílago (liberación de proteoglicano a las 72 horas).

La Figura 25 es un gráfico de barras que muestra el efecto de IGF-1 de tipo silvestre, F49A y E3A/F49A (a una concentración de 40 ó 400 ng/ml) sobre la degradación de cartílago inducida por IL1\alpha a las 72 horas.

La Figura 26 es un gráfico de barras que muestra el efecto de control de IGF-1 de tipo silvestre, F49A y E3A/F49A (a una concentración de 40 ó 400 ng/ml) sobre la síntesis de la matriz.

La Figura 27 es un gráfico de barras que muestra el efecto de IGF-1 de tipo silvestre, F49A y E3A/F49A (a una concentración de 40 ó 400 ng/ml) sobre la inhibición de la síntesis de la matriz inducida por IL1\alpha.

La Figura 28 es un gráfico de barras que muestra el efecto de control IGF-1 de tipo silvestre, F49A y E3A/F49A (a una concentración de 40 ó 400 ng/ml) sobre la liberación de óxido nítrico.

La Figura 29 es un gráfico de barras que muestra el efecto de IGF-1 de tipo silvestre, F49A y E3A/F49A (a una concentración de 40 ó 400 ng/ml) sobre la producción de óxido nítrico inducida por IL1\alpha.

Las Figuras 30A y 30B muestran las curvas de unión para partículas de fagos que presentan IGF-1 de tipo silvestre (círculos), D12K (cuadrados) o D12R (rombos) unidos a IGFBP-1 (Fig. 30A) o IGFBP-3 (Fig. 30B) inmovilizadas.

Las Figuras 31A-31D muestran los efectos sobre explantes de cartílago articular porcino cultivados en medios (-) o medios con IGF-1 D12K, D12R o de tipo silvestre (a 10 nM) en solitario (Fig. 31A y 31C) o en presencia de IL-1\alpha (+a) a 1 ng/ml (Figs. 31B y 31D).

La Figura 32 muestra el efecto sobre la síntesis de la matriz del cartílago articular en tejido humanos de articulaciones enfermas cultivadas en medios solos (-) o con IGF-1 F49, E3A/F49, F16/F49, D12K, D12R o de tipo silvestre (a 40 ng/ml).

Las Figuras 33A-33D muestran el efecto sobre explantes de cartílago articular humano cultivados en medios (-) o tratados con IGF-1 de tipo silvestre en solitario o junto con BP3-40 (Figs. 33A y 33B) o BP3-15 (Figs. 33C y 33D) (a 0,1 mg/ml).

Las Figuras 34A-34C muestran la formación de complejos triméricos de F49A o E3A/F49A con IGFBP-3 y ALS. Se saturó IGFBP-3 inmovilizado sobre una microplaca biodetectora mediante la inclusión de 1 \muM de IGF-1 de tipo silvestre (Fig. 34A), F49A (Fig. 34B) o E3A/F49A (Fig. 34C) en el tampón de desplazamiento. Se inyectó ALS a 98 nM, 148 nM y 33 nM, controlando la asociación y la disociación con el complejo binario preformado a tiempo real.

La Figura 35 muestra un ensayo de inhibición de BIAcore^{TM} de la actividad de IGF-1 usando siete péptidos diferentes (BP1-16: círculos oscuros, (i+7)A: círculos claros, (i+7)B: rombos claros, (i+7)C: triángulos claros, (i+7)D: cuadrados claros, (i+8)B: cuadrados oscuros, (i+8)C: triángulos oscuros).

La Figura 36 muestra un ensayo de KIRA de la actividad peptídica usando cuatro péptidos diferentes (BP1-16: círculos, BP1-02: cuadrados, BP1-25: triángulos y BP1-40: rombos).

La Figura 37 muestra una prueba de HPLC analítica de la fusión de BP1-625-Z escindida con tripsina. Los picos principales se identificaron por espectrometría de masas como (A) fragmento de dominio Z y (B) péptido BP1-625.

La Figura 38 muestra un ensayo de inhibición de BIAcore^{TM} de la actividad de IGF-1 usando cuatro péptidos diferentes (BP1-01: círculos, BP1-625: cuadrados, BP1-21A: triángulos y BP1-25: rombos).

La Figura 39 muestra el efecto sobre la síntesis de proteoglicano en explantes de cartílago articular de articulaciones humanas extirpadas de pacientes que se someten a reemplazo de articulaciones, cultivados con IGF-1 solo (IGF) a 40 ng/ml o IGF-1 con BP1-17, BP3-15 o BP1-16 (0,1 mg/ml) o IGF-1 con tampón (HEPES).

Descripción detallada de la invención Definiciones

Son "análogos de IGF-1" variantes aminoacídicas de IGF-1 de secuencia nativa, preferiblemente variantes de IGF-1 humano de tipo silvestre. Se determinó que la constante de disociación (K_{D}) de IGF-1 de tipo silvestre era de 13 nM para IGFBP-1 y de 1,5 nM para IGFBP-3. La diferencia en afinidad para las IGFBP se debe a una velocidad de asociación 10 veces mayor (K_{a}) de IGF-1 con IGFBP-3 (3,2 x 10^{5} frente a 3,2 x 10^{4} M^{-1}s^{-1}). Dichos análogos pueden tener una o más modificaciones de aminoácidos en comparación con el IGF-1 nativo. Como se usa en este documento, la expresión "análogos de IGF-1" se refiere a un análogo de IGF-1 con una preferencia de afinidad de unión por IGFBP-3 sobre IGFBP-1 o un análogo de IGFBP-1 con una preferencia de afinidad de unión por IGFBP-1 sobre IGFBP-3, como se define a continuación.

La expresión un "análogo de IGF-1 con una preferencia de afinidad de unión por IGFBP-3 sobre IGFBP-1" se refiere a un análogo de IGF-1 que presenta una afinidad de unión modificada por una o más cualesquiera de las IGFBP por encima de la del IGF-1 de secuencia nativa, de tal modo que la afinidad de unión relativa del análogo (R(3)) por IGFBP-3 [definida como R(3) = K_{D}(IGF-1:IGFBP-3)/K_{D}(análogo:IGFBP-3)] es al menos aproximadamente 10 veces mayor que su afinidad de unión relativa (R(1)) por IGFBP-1 [definida como R(1 ) = K_{D}(IGF-1:IGFBP-1)/K_{D}(análogo:IGFBP-1)], como se muestra, por ejemplo, mediante análisis cinético, usando un instrumento BIACORE^{TM}, de los análogos expresados y purificados.

A la inversa, la expresión un "análogo de IGF-1 con una preferencia de afinidad de unión por IGFBP-1 sobre IGFBP-3" se refiere a un análogo de IGF-1 que presenta una afinidad de unión modificada por una o más cualesquiera de las IGFBP por encima de la del IGF-1 de secuencia nativa, de tal modo que la afinidad de unión relativa del análogo (R(1)) por IGFBP-1 [definida como R(1) = K_{D}(IGF-1:IGFBP-1)/K_{D}(análogo:IGFBP-1)] es al menos aproximadamente 10 veces mayor que su afinidad de unión relativa (R(3)) por IGFBP-3 [definida como R(3) = K_{D} (IGF-1:IGFBP-3)/K_{D}(análogo:IGFBP-3)], como se muestra, por ejemplo, mediante análisis cinético, usando un instrumento BIACORE^{TM}, de los análogos expresados y purificados.

Los "péptidos" tienen al menos dos aminoácidos e incluyen polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 50 aminoácidos. La definición incluye derivados de péptidos, sus sales o isómeros ópticos.

Un péptido desplazador de IGFBP, que "inhibe" o "impide" la interacción de un IGF con una IGFBP, se refiere a un péptido que aumenta los niveles en suero y tejido de IGF biológicamente activo, sin importar cómo se produce este aumento. Por ejemplo, el péptido puede desplazar parcialmente o completamente el IGF activo de un complejo en el que IGF está unido a una IGFBP. El péptido de acuerdo con esta definición puede unirse a una IGFBP y, posiblemente, por lo tanto, actuar para desplazar un IGF endógeno anteriormente unido a la IGFBP. Como alternativa, puede unirse al propio IGF en un sitio lejos del implicado en las interacciones con el receptor, de tal modo que inhiba o impida la interacción del IGF con IGFBP, pero no inhiba o impida la interacción del IGF con cualquiera de sus receptores. Además, aunque el péptido ocupará el sitio de unión a IGFBP-3, el efecto sobre el complejo ternario con ALS dependerá de si los complejos binarios pueden formar complejos ternarios. Los péptidos que pueden formar complejos con la ALS del complejo ternario reemplazarán a los IGF pero no afectarán a la concentración de IGFBP-3 o de complejos ternarios. Los péptidos que no pueden formar complejos con ALS ocuparán IGFBP-3 y la cantidad de complejo ALS/IGFBP-3/IGF se reducirá. Preferiblemente, el péptido desplazador de IGFBP es un péptido desplazador de IGFBP-3 o de IGFBP-1.

Un péptido que se "une a IGFBP-3" o que se "une a IGFBP-1" se refiere a un péptido que se une a IGFBP-3 o a IGFBP-1 en al menos cierto grado, ya sea con una afinidad elevada o no.

Como se usa en este documento, la expresión "receptor de IGF humano" se refiere a cualquier receptor para un IGF que se encuentre en seres humanos e incluye los receptores de IGF de Tipo 1 y Tipo 2 en seres humanos a los que se unen tanto IGF-1 como IGF-2 humanos, tal como el receptor de IGF-1 de tipo 1 placentario, etc.

Un péptido que "no se une a un receptor de IGF humano" no se une en absoluto a ninguno de dichos receptores o se une a dicho receptor con una afinidad más de aproximadamente 200 veces menor que con la que el IGF-1 humano de tipo silvestre (hIGF-1) o el IGF-2 humano de tipo silvestre (hIGF-2) se unen a dicho receptor. Preferiblemente, el péptido se une a dicho receptor con una afinidad más de aproximadamente 250 veces menor que con la que el hIGF-1 o el hIGF-2 de tipo silvestre se unen al mismo receptor, o no se une en absoluto.

La expresión "trastorno del cartílago" se refiere a cualquier lesión o daño al cartílago y a un grupo de enfermedades que se manifiestan por síntomas de dolor, rigidez y/o limitación del movimiento de las partes corporales afectadas. Se incluyen dentro del alcance de "trastornos del cartílago" los "trastornos cartilaginosos degenerativos", que son un grupo de trastornos caracterizados, al menos en parte, por degeneración o alteraciones metabólicas de tejidos conectivos del cuerpo, incluyendo no sólo las articulaciones o estructuras relacionadas, que incluyen músculos, bolsas (membranas sinoviales), tendones y tejidos fibrosos, sino también los cartílagos de crecimiento, el sistema de meniscos y los discos intervertebrales.

En una realización, la expresión "trastornos cartilaginosos degenerativos" incluye "trastornos del cartílago articulares", que están caracterizados por una interrupción de la superficie articular lisa del cartílago y degradación de la matriz de cartílago. Las patologías adicionales incluyen producción de óxido nítrico e inhibición o reducción de la síntesis de matriz. Se incluyen dentro del alcance de los "trastornos del cartílago articular" la OA y la AR. Los ejemplos de trastornos cartilaginosos degenerativos incluyen lupus eritematoso sistémico y gota, amiloidosis o síndrome de Felty. Además, la expresión abarca la degradación y la destrucción de cartílago asociada con la artritis psoriásica, trastornos renales, osteoartrosis, inflamación aguda (por ejemplo, artritis por yersinia, artritis por pirofosfato, artritis gótica (artritis úrica) y artritis séptica), artritis asociada con traumatismos, colitis ulcerativa (por ejemplo, enfermedad de Crohn), esclerosis múltiple, diabetes (por ejemplo, insulinodependiente y no insulinodependiente), obesidad, artritis celular gigante y síndrome de Sjögren. En una realización preferida, el trastorno son microlesiones o traumatismo cerrado, una fractura condral o una fractura osteocondral.

La "osteoartritis" u "OA" no define un único trastorno, sino la ruta final común de la destrucción de cartílago que es el resultado de múltiples procesos. La OA se caracteriza por una destrucción asimétrica localizada del cartílago en proporción a la aparición de prolongaciones óseas palpables en los márgenes de la articulación. La OA afecta típicamente a las articulaciones interfalángicas de las manos, la primera articulación carpometacarpiana, las caderas, las rodillas, la columna y a algunas articulaciones en el pie medio, mientras que las grandes articulaciones, tales como los tobillos, los codos y los hombros, tienden a librarse. La OA puede estar asociada con enfermedades metabólicas tales como hemocromatosis y alcaptonuria, anomalías del desarrollo tales como displasia del desarrollo de las caderas (dislocación congénita de las caderas), discrepancias en la longitud de los miembros, incluyendo artritis traumáticas e inflamatorias tales como gota, artritis séptica y artritis neuropática. La OA también puede desarrollarse después de una inestabilidad mecánica prolongada, tal como resultado de lesiones deportivas u obesidad.

La "artritis reumatoide" o "AR" es un trastorno autoinmune sistémico crónico caracterizado por una sinovitis simétrica de la articulación y que afecta, típicamente, a pequeñas y grandes articulaciones diartrodiales por igual. A medida que avanza la AR, los síntomas pueden incluir fiebre, pérdida de peso, adelgazamiento de la piel, implicación multiorgánica, escleritis, úlceras corneales, la formación de nódulos subcutáneos o subperiósteos e incluso muerte prematura. Los síntomas de AR aparecen con frecuencia durante la juventud y pueden incluir vasculitis, atrofia de la piel y del músculo, nódulos subcutáneos, linfadenopatías, esplenomegalia, leucopenia y anemia crónica.

El "tratamiento" es una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo o alterar la patología de un trastorno. Por consiguiente, el "tratamiento" se refiere tanto a un tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, en las que el objeto es prevenir o retrasar (disminuir) la evolución de la afección o trastorno patológico diana. Los que necesitan tratamiento incluyen a los que ya presentan el trastorno, así como aquellos en los que debe prevenirse el trastorno. En el tratamiento de un trastorno cartilaginoso degenerativo, un agente terapéutico puede disminuir o aumentar directamente la magnitud de la respuesta a un componente patológico del trastorno, o hacer que la enfermedad sea más sensible al tratamiento mediante otros agentes terapéuticos, por ejemplo, antibióticos, antifúngicos, agentes antiinflamatorios, quimioterápicos, etc. El término "tratamiento" incluye un método para la prevención de daños o enfermedades de articulaciones iniciales o continuas por trastornos cartilaginosos degenerativos y/o lesiones.

La expresión "cantidad eficaz" es la concentración mínima eficaz del análogo de IGF o del péptido desplazador de IGFBP, como se describe en este documento. Ésta incluye la concentración mínima de dicha proteína o péptido que causa, induce o da como resultado una mejora o reparación de cartílago dañado detectable o una protección medible frente a la destrucción de cartílago continua o inducida, tal como la inhibición de la síntesis o la pérdida de proteoglicanos del tejido cartilaginoso.

La expresión "factor de crecimiento de cartílago", como se usa en este documento, se refiere a un agente o agentes distintos de un análogo de IGF-1 o de un péptido desplazador de IGFBP, como se han identificado en este documento, que causan, inducen o dan como resultado una mejora de la afección o una protección de la destrucción de cartílago inicial o continua sujeta a daños por lesiones o un trastorno cartilaginoso degenerativo. Dichos factores de crecimiento de cartílago incluyen factores de crecimiento de tipo insulina (por ejemplo, IGF-1 o IGF-2), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), proteínas morfogénicas óseas (BMP), factores de crecimiento transformante \beta (1-3), miembros de la familia del factor de crecimiento epidérmico (por ejemplo, EGF, HB-EGF y TGF-\alpha) y factores de crecimiento fibroblástico (FGF).

Son "antagonistas del catabolismo del cartílago" los agentes que inhiben, atenúan o bloquean de otro modo la actividad o el efecto de moléculas que están asociadas con o que agravan la destrucción del cartílago. Por ejemplo, IL-1\alpha y el óxido nítrico (NO) son agentes que se sabe que están asociados con la destrucción del cartílago. Por lo tanto, se considerarán "antagonistas del catabolismo del cartílago" los inhibidores directos (IL-1ra) o indirectos (IL-4 o IL-10) de IL-1\alpha u otras citocinas inflamatorias (por ejemplo, TNF-\alpha) y de la producción de NO. Además, también se considerarán antagonistas del catabolismo del cartílago los antagonistas del catabolismo de condrocitos (por ejemplo, pentosán polisulfato sódico, glucosamina (y variantes de la misma, tales como manosamina) o sulfato de condroitina, tetraciclina y hialuronano). También están incluidos agentes que inhiben el catabolismo del cartílago indirectamente, por ejemplo, a través de sus efectos sobre el hueso subcondral subyacente (por ejemplo, bifosfonatos u osteoprotegerina (OPG)).

La administración "crónica" se refiere a la administración del agente o agentes en un modo continuo en vez de en un modo agudo, de tal modo que se mantenga el efecto terapéutico inicial (actividad) durante un periodo prolongado de tiempo. La administración "intermitente" es el tratamiento que no es consecutivo sin interrupción, sino que es cíclico por naturaleza.

Como se usa en este documento, el término "mamífero" con los fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja y zoo, animales deportivos o de compañía, tales como perros, caballos, gatos, ovejas, cerdos, vacas, etc. El mamífero preferido en este documento es un ser humano. El término "no adulto" se refiere a mamíferos que tienen desde una edad perinatal (tal como lactantes de bajo peso al nacimiento) hasta la edad de la pubertad, siendo estos últimos los que aún no han alcanzado el potencial de crecimiento completo.

La administración "junto con" uno o más agentes terapéuticos adicionales incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva, en cualquier orden.

El término "vehículos", como se usa en este documento, incluye vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables que no son tóxicos para la célula o mamífero que se está exponiendo a los mismos a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Con frecuencia, el vehículo fisiológicamente aceptable es una solución acuosa de pH tamponado. Los ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosácaridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcares, tales como manitol o sorbitol, contraiones formadores de sales, tales como sodio; hialuronano; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN^{TM}, polietilenglicol (PEG) y PLURONICS^{TM}.

Un "liposoma" es una vesícula pequeña, compuesta por diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos, que es útil para la administración de un fármaco (tal como el análogo de IGF-1 o el péptido desplazador de IGFBP descritos en este documento) a un mamífero. Los componentes del liposoma se organizan comúnmente en una formación bicapa similar a la organización de lípidos de membranas biológicas.

Las expresiones formulaciones "de liberación prolongada" o "de liberación sostenida", en el sentido más amplio posible, se refieren a una formulación de análogo de IGF-1 activo o de péptido desplazador de IGFBP, identificados en este documento, que da como resultado la liberación o activación del análogo o péptido activo durante un periodo sostenido o prolongado de tiempo o al menos durante un periodo de tiempo que es mayor que si el análogo o péptido se hubieran hecho disponibles in vivo en el estado nativo o no formulado. Opcionalmente, la formulación de liberación prolongada se produce a una velocidad constante y/o da como resultado una concentración sostenida y/o continua del agente activo de este documento. Las formulaciones de liberación prolongada adecuadas pueden comprender microencapsulación, matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos, polímeros biodegradables, hidrogeles biodegradables, suspensiones o emulsiones (por ejemplo, de aceite en agua o de agua en aceite). Opcionalmente, la formulación de liberación prolongada comprende ácido poliláctico-coglicólico (PLGA) y puede prepararse como se describe en Lewis, "Controlled Release of Bioactive Agents form Lactide/Glycolide polymer", en Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems, M. Chasin y R. Langeer, Ed. (Marcel Dekker, Nueva York), págs. 1-41. Opcionalmente, la formulación de liberación prolongada es estable y la actividad del análogo de IGF-1 o del péptido desplazador de IGFBP, como se identifican en este documento, no disminuye de forma apreciable con el almacenamiento durante el tiempo. Más específicamente, dicha estabilidad puede mejorarse a través de la presencia de un agente estabilizante, tal como una sal metálica polivalente soluble en agua.

Como se usa en este documento, el término "IGF-1" se refiere al factor de crecimiento de tipo insulina 1 de cualquier especie, incluyendo bovina, ovina, porcina, equina y humana, preferiblemente humana y, si se refiere a una administración exógena, de cualquier origen ya sea natural, sintético o recombinante. El IGF-1 humano "de secuencia nativa", cuya secuencia se muestra en la Figura 16 (SEC ID Nº: 3), se prepara, por ejemplo, por el proceso que se describe en los documentos EP 230.869, publicado el 5 de agosto de 1987; EP 128.733, publicado el 19 de diciembre de 1984; o EP 288.451, publicado el 26 de octubre de 1988. Más preferiblemente, este IGF-1 de secuencia nativa se produce de forma recombinante.

Como se usa en este documento, el término "IGF-2" se refiere al factor de crecimiento de tipo insulina 2 de cualquier especie, incluyendo bovina, ovina, porcina, equina y humana, preferiblemente humana y, si se refiere a una administración exógena, de cualquier origen ya sea natural, sintético o recombinante. Puede prepararse por el método que se describe, por ejemplo, en el documento EP 128.733.

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Una "IGFBP" o una "proteína de unión a IGF" se refiere a una proteína o polipéptido normalmente asociada con o unida o formando un complejo con IGF-1 o IGF-2, esté o no en la circulación (es decir, en suero o en tejido). Dichas proteínas de unión no incluyen receptores. Esta definición incluye IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6, Mac 25 (IGFBP-7) y factor estimulante de prostaciclina (PSF) o molécula específica de células endoteliales (ESM-1), así como otras proteínas con una elevada homología con IGFBP. Mac 25 se describe, por ejemplo, en Swisshelm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 4472-4476 (1995) y Oh et al., J. Biol. Chem., 271: 30322-30325 (1996). PSF se describe en Yamauchi et al., Biochemical Journal, 303: 591-598 (1994). ESM-1 se describe en Lassalle et al., J. Biol. Chem., 271: 20458-20464 (1996). Para otras IGFBP identificadas, véanse, por ejemplo, los documentos EP 375.438, publicado el 27 junio de 1990; EP 369.943, publicado el 23 mayo de 1990; WO 89/09268, publicado el 5 octubre de 1989; Wood et al., Molecular Endocrinology, 2: 1176-1185 (1988); Brinkman et al., The EMBO J., 7: 2417-2423(1988); Lee et al., Mol. Endocrinol., 2: 404-411 (1988); Brewer et al., BBRC, 152: 1289-1297 (1988); EP 294.021, publicado el 7 de diciembre de 1988; Baxter et al., BBRC, 147: 408-415 (1937); Leung et al., Nature, 330: 537-543 (1987); Martin et al., J. Biol. Chem., 261: 8754-8760 (1986); Baxter et al., Comp. Biochem. Physiol., 91B: 229-235 (1988); WO 89/08667, publicado el 21 de septiembre de 1989; WO 89/09792, publicado el 19 de octubre de 1989; y Binkert et al., EMBO J., 8: 2497-2502 (1989).

La expresión "subunidad ácido labil" o "ALS" se refiere a una glicoproteína de 85 kDa que forma un complejo ternario con IGF-1 e IGFBP-3 o IGFBP-5. Véanse, por ejemplo, Bach y Rechler, Diabetes Reviews, 3: 38-61 (1995); Clemmons, Cytokine Growth Factor Rev., 8: 45-62 (1997); y Jones y Clemmons, Endocr. Rev., 16: 3-34 (1995).

II. Modos de llevar a cabo la invención

La invención de este documento se refiere al uso de un análogo de IGF-1, como se define en las reivindicaciones y anteriormente, para tratar trastornos del cartílago, preferiblemente trastornos cartilaginosos degenerativos, incluyendo la regeneración y/o prevención de la degradación del cartílago.

Los ejemplos de análogos de IGF-1 con una preferencia de afinidad de unión por IGFBP-3 sobre IGFBP-1 incluyen una variante de IGF-1 en la que el aminoácido o aminoácidos del IGF-1 humano de tipo silvestre en las posiciones 3, 7, 10, 16, 25 ó 49 o en las posiciones 3 y 49 del IGF-1 humano de secuencia nativa se reemplazan con un resto de alanina, de glicina y/o de serina. Preferiblemente, uno o ambos de los aminoácidos en cuestión se sustituyen por un resto de alanina o glicina, más preferiblemente alanina. El análogo de IGF-1 con dicha preferencia afinidad de unión más preferido en este documento es F49A, F49G, F49S, E3A, E3G, E3S, E3AF49A, E3AF49G, E3AF49S, E3GF49A, E3GF49G, E3GF49S, E3SF49A, E3SF49G, E3SF49S, F16A, F16G, F16S, F16AF49A, F16GF49A, F16SF49A, F16AF49S, F16AF49G, F16SF49S, F16SF49G, F16GF49S o F16GF49G.

Los ejemplos de análogos de IGF-1 con una preferencia de afinidad de unión por IGFBP-1 sobre IGFBP-3 incluyen una variante de IGF-1 en la que el aminoácido o aminoácidos del IGF-1 humano de tipo silvestre en las posiciones 9, 12, 15 ó 20 se reemplazan con un resto de lisina o de arginina. El análogo de IGF-1 con dicha preferencia de afinidad de unión más preferido en este documento es D12K o D12R. También se describen en este documento péptidos desplazadores de IGFBP-3 que impiden la interacción de IGF con IGFBP-3 o IGFBP-1 y que no se unen a un receptor de IGF humano, que incluyen un péptido seleccionado del grupo constituido por:

Y24LY31A (variante de IGF-1);

4D3.3P (ASEEVCWPVAEWYLCNMWGR) (SEC ID Nº: 6);

BP3-4D3.11 (VAWEVCWDRHDQGYICTTDS) (SEC ID Nº: 7);

BP3-4D3.11DEL (AWEVCWDRHQGYICTTDS) (SEC ID Nº: 8);

BP3-4B3.3 (EESECFEGPGYVICGLVG) (SEC ID Nº: 9);

BP3-01-ox (SEEVCWPVAEWYLCNMWG) (SEC ID Nº: 10);

BP3-02-ox (DMGVCADGPWMYVCEWTE) (SEC ID Nº: 11);

BP3-06 (TGVDCQC*GPVHC*VCMDWA) (SEC ID Nº: 12);

BP3-08 (TVANCDC*YMPLC*LCYDSD) (SEC ID Nº: 13);

BP3-15 (SEEVCWPVAEWYLCN) (SEC ID Nº: 14);

BP3-16 (VCWPVAEWYLCNMWG) (SEC ID Nº: 15);

BP3-17 (VCWPVAEMYLCN) (SEC ID Nº: 16);

BP3-25 (CWPVAEWYLCN) (SEC ID Nº: 17);

BP3-27 (EVCWPVAEWYLCN) (SEC ID Nº: 18);

BP3-28 (EEVCWPVAEWYLCN) (SEC ID Nº: 19);

BP3-30 (ASEEVCWPVAEWYLCN) (SEC ID Nº: 20);

BP3-39 (SEEVCWPVAEWYLCN-nh2) (SEC ID Nº: 21);

BP3-40 (ac-SEEVCWPVAEWYLCN-nh2) (SEC ID Nº: 22);

BP3-41 (GPETCWPVAEWYLCN) (SEC ID Nº: 23);

BP3-107 (suc-CQLVRPDLLLCQ-nh2) (SEC ID Nº: 24); y

BP3-108 (suc-IPVSPDWFVCQ-nh2) (SEC ID Nº: 25);

en el que C* indica una cisteína que se ha unido a otra cisteína en el péptido. Las parejas de Cys restantes también se oxidan como disulfuros en cada péptido. El péptido desplazador de IGFBP-3 más preferido en este documento es BP3-15, BP3-39, BP3-40, BP3-01-OX, BP3-27, BP3-28, BP3-30, BP3-41 ó 4D3.3P.

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Los ejemplos de péptidos desplazadores de IGFBP-1 descritos en este documento incluyen un péptido seleccionado del grupo constituido por:

BP1-01 (CRAGPLQWLCEKYFG) (SEC ID Nº: 26);

BP1-02 (SEVGCRAGPLQWLCEKYFG) (SEC ID Nº: 27);

BP1-04 (CRAGPLQWLCE) (SEC ID Nº: 28);

BP1-10 (CRKGPLQWLCELYF) (SEC ID Nº: 29);

BP1-11 (CRKGPLQWLCEKYF) (SEC ID Nº: 30);

BP1-12 (CKEGPLQWLCEKYF) (SEQ ID Nº:31);

BP1-13 (CKEGPLLWLCEKYF) (SEC ID Nº: 32);

BP1-14 (SEVGCRAGPLQWLCEKYFG-nh2) (SEC ID Nº: 33);

BP1-15 (CAAGPLQWLCEKYF) (SEC ID Nº: 34);

BP1-16 (CRAGPLQWLCEKYF-nh2) (SEC ID Nº: 35);

BP1-17 (CRAGPLQWLCEK-nh2) (SEC ID Nº: 36);

BP1-18 (CRAGPLQWLCEKAA) (SEC ID Nº: 37);

BP1-19 (SEMVCRAGPLQWLCEIYF-nh2*) (SEC ID Nº: 38);

BP1-20 (EARVCRAGPLQWLCEKYF-nh2) (SEC ID Nº: 39);

BP1-21A (SEVGCRAGPLQWLCEKYFSTY-nh2) (SEC ID Nº: 40);

BP1-21B (CRAGPLQWLCEKYFSTY-nh2) (SEC ID Nº: 41);

BP1-25 (EARVCRAGPLQWLCEKYFSTY) (SEC ID Nº: 42);

BP1-40 (GQQSCRAGPLQWLCEKYFSTY) (SEC ID Nº: 43);

BP67 (CRAGPLQWLCERYF) (SEC ID Nº: 44);

BP68 (CRAGPLQWLCEKFF) (SEC ID Nº: 45);

BP1-625 (GQQSCAAGPLQWLCEHYFSTYGR) (SEC ID Nº: 46);

1

BP1-625T (GQQSCAAGPLQWLCEHYFSTY) (SEC ID Nº: 153);

BP1027 (CKAGPLLWLCERFF) (SEC ID Nº: 48);

BP1028 (CRAGPLQWLCERFF) (SEC ID Nº: 49);

BP1029 (CREGPLQWLCERFF) (SEC ID Nº: 50);

BP1030 (CKEGPLLWLCERFF) (SEC ID Nº: 51);

(1+7)D (acRAGPLEWLAEKYEG) (SEC ID Nº: 52);

(i+8)B (acRPLEWLAEKYFE) (SEC ID Nº: 53); y

(i+8)C (acRAGPLEWLAEKYFE) (SEC ID Nº: 54);

en el que C* indica una cisteína que se ha unido a otra cisteína en el péptido y las parejas de Cys restantes también se oxidan como disulfuros en cada péptido.

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Los agentes activos aún más preferidos en este documento son F49A, E3A, F16A, E3AF49A, F16AF49A, D12K y D12R, y los más preferidos son F49A, E3AF49A, F16AF49A, D12K y D12R.

Los análogos de IGF-1 útiles de acuerdo con esta invención y los péptidos desplazadores de IGFBP pueden prepararse por cualquier medio que se conozca en la técnica, incluyendo síntesis química o producción recombinante. Se prefiere la síntesis química, especialmente la síntesis en fase sólida, para péptidos cortos (por ejemplo, de menos de 50 restos) o los que contienen aminoácidos no naturales o inusuales, tales como D-Tyr, ornitina, ácido aminoadípico y similares. Se prefieren procedimientos recombinantes para polipéptidos más grandes. Cuando se seleccionan procedimientos recombinantes, puede construirse un gen sintético de novo o puede mutarse un gen natural mediante, por ejemplo, mutagénesis en casete. Se exponen a continuación procedimientos recombinantes generales ejemplares.

A partir de un IGF-1 purificado y de su secuencia de aminoácidos, por ejemplo, puede producirse una variante de IGF que sea un mutante de peptidilo de una molécula parental de IGF-1 usando técnicas de ADN recombinante. Estas técnicas contemplan, de una forma simplificada, tomar el gen, ya sea natural o sintético, que codifica el análogo; insertarlo en el interior de un vector apropiado; insertar el vector en el interior de una célula hospedadora apropiada; cultivarlas la célula hospedadora para provocar la expresión del gen; y recuperar o aislar el análogo producido por la misma. Preferiblemente, el análogo recuperado se purifica después hasta un grado adecuado.

Algo más particularmente, la secuencia de ADN que codifica una variante de peptidilo de IGF se clona y se manipula de tal modo que pueda expresarse en un hospedador conveniente. Puede obtenerse ADN que codifica polipéptidos parentales a partir de una genoteca genómica, a partir de ADNc procedente de ARNm de células que expresan el polipéptido parental o construyendo sintéticamente la secuencia de ADN (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.), Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., 1989).

Después, el ADN parental se inserta dentro de un plásmido o vector apropiado que se usa para transformar una célula hospedadora. En general, se usan en relación con esos hospedadores vectores plasmídicos que contienen secuencias de replicación y de control que proceden de especies compatibles con la célula hospedadora. Generalmente, el vector lleva un sitio de replicación, así como secuencias que codifican proteínas o péptidos que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en células transformadas.

Por ejemplo, E. coli puede transformarse usando pBR322, un plásmido procedente de una especie de E. coli (Mandel et al., J. Mol. Biol. 53: 154 (1970)). El plásmido pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y, por lo tanto, proporciona un medio fácil para la selección. Otros vectores incluyen diferentes características tales como diferentes promotores, que a menudo son importantes en la expresión. Por ejemplo, los plásmidos pKK223-3, pDR720 y pPL-lambda representan vectores de expresión con los promotores tac, trp o P_{L}, que están disponibles actualmente (Pharmacia Biotechnology).

Un vector preferido es pB0475. Este vector contiene orígenes de replicación para fagos y E. coli que permiten que sea lanzadera entre dichos hospedadores, facilitando de este modo tanto la mutagénesis como la expresión (Cunningham et al., Science, 243: 1330-1336 (1989)); Patente de Estados Unidos Nº 5.580.723). Otros vectores preferidos son pR175 y pR1T2T (Pharmacia Biotechnology). Estos vectores contienen promotores apropiados seguidos por el dominio Z de la proteína A, permitiendo a los genes insertarse en los vectores para expresarse como proteínas de fusión.

Otros vectores preferidos pueden construirse usando técnicas convencionales mediante la combinación de rasgos importantes de los vectores descritos anteriormente. Los rasgos importantes incluyen el promotor, el sitio de unión a ribosomas, el gen de la decorsina u ornatina o una fusión de genes (el dominio Z de la proteína A y la decorsina u ornatina y su enlazador), los marcadores de resistencia a antibióticos y los orígenes de replicación apropiados.

La célula hospedadora puede ser procariota o eucariota. Se prefieren procariotas para clonación y expresión de secuencias de ADN para producir el polipéptido IGF-1 parental, péptidos con segmentos sustituidos, péptidos con restos sustituidos y variantes de péptidos. Por ejemplo, puede usarse la cepa 294 de E. coli K12 (ATTC Nº 31446), así como E.coli B, E.coli X1776 (ATCC Nº. 31537) y E. coli c600 y c600hfl, E. coli W3110 (F-, gamma-, prototrófica/ATCC Nº 27325), bacilos tales como Bacillus subtilis y otras enterobacteriáceas tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcesans y diversas especies de Pseudomonas. El procariota preferido es E. coli W3110 (ATCC Nº 27325). Cuando se expresan en procariotas, los análogos o péptidos contienen típicamente una metionina N-terminal o una formil-metionina y no están glicosilados. En el caso de proteínas de fusión, la metionina N-terminal o restos de formil-metionina en el extremo amino terminal de la proteína de fusión o la secuencia señal de la proteína de fusión. Por supuesto, se pretende que estos ejemplos sean ilustrativos en lugar de limitantes.

Además de procariotas, pueden usarse organismos eucariotas, tales como cultivos de levaduras o células procedentes de organismos multicelulares. En principio, es factible cualquiera de dichos cultivos celulares. Sin embargo, ha sido mayor el interés en células de vertebrados y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento reproducible. Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, editores (1973). Son ejemplos de dichas líneas celulares hospedadoras útiles células VERO y HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), líneas celulares W138, 293, BHK, COS-7 y MDCK.

Una variación de los procedimientos anteriores contempla el uso de fusiones de genes, en las que el gen que codifica el análogo o péptido deseado se asocia, en el vector, con un gen que codifica una proteína o un fragmento de otra proteína. Esto da como resultado que el análogo o péptido deseado se produzca por la célula hospedadora como una fusión con otra proteína o péptido. La "otra" proteína o péptido es frecuentemente una proteína o péptido que puede secretarse por la célula, haciendo posible aislar y purificar el análogo o péptido deseado a partir del medio de cultivo y eliminar la necesidad de destruir las células hospedadoras, que surge cuando el análogo o péptido deseado se queda en el interior de la célula. Como alternativa, la proteína de fusión puede expresarse intracelularmente. Es útil usar proteínas de fusión que se expresen mucho.

El uso de fusiones de genes, aunque no es esencial, puede facilitar la expresión de análogos péptidos heterólogos en E. coli, así como la posterior purificación de esos productos génicos (Harris, en Genetic Engineering, Williamson, R., Ed. (Academic Press, Londres, Vol. 4, 1983), pág. 127; Ljungquist et al., Eur. J. Biochem., 186: 557-561 (1989) y Ljungquist et al., Eur. J. Biochem., 186: 563-569 (1989)). A menudo se usan fusiones de proteína A porque la unión de la proteína A o, más específicamente, del dominio Z de la proteína A a IgG proporciona un "asa de afinidad" para la purificación de la proteína fusionada. También se ha demostrado que muchas proteínas heterólogas se degradan cuando se expresan directamente en E. coli, pero son estables cuando se expresan como proteínas de fusión (Marston, Biochem J., 240: 1 (1986)).

Las proteínas de fusión pueden escindirse usando agentes químicos, tales como bromuro de cianógeno, que escinde en una metionina, o hidroxilamina, que escinde entre un resto de Asn y Gly. Usando metodología de ADN recombinante convencional, los pares de bases de nucleótidos que codifican estos aminoácidos pueden insertarse justo antes del extremo 5' del gen que codifica el análogo o péptido deseado.

Como alternativa, se puede emplear la escisión proteolítica de una proteína de fusión (Carter, en Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes, Ladisch et al., eds. (American Chemical Society Symposium Series Nº 427, 1990), Cap. 13, páginas 181-193).

Se han usado con éxito proteasas tales como Factor Xa, trombina y subtilisina o sus mutantes y varias otras para escindir proteínas de fusión. Típicamente, se inserta un enlazador peptídico, que es susceptible de escindirse por la proteasa usada, entre la "otra" proteína (por ejemplo, el dominio Z de la proteína A) y el análogo o péptido deseado. Usando metodología de ADN recombinante, las pares de bases de nucleótidos que codifican el enlazador se insertan entre los genes o fragmentos de genes que codifican las otras proteínas. Después, puede llevarse a cabo la escisión proteolítica de la proteína de fusión parcialmente purificada que contiene el enlazador correcto, en la proteína de fusión nativa o en la proteína de fusión reducida o desnaturalizada.

El análogo o péptido puede estar o no bien plegado cuando se expresa como una proteína de fusión. Además, el enlazador peptídico específico que contiene el sitio de escisión puede estar o no accesible para la proteasa. Estos factores determinan si la proteína de fusión debe desnaturalizarse y volver a plegarse y, si es así, si se emplean estos procedimientos antes o después de la escisión. Cuando se requiere una desnaturalización y nuevo plegamiento, típicamente, el análogo o péptido se trata con un caótropo, tal como guanidina HCl. Después, se trata con un tampón redox que contiene, por ejemplo, ditiotreitol o glutatión reducido y oxidado en las proporciones, pH y temperatura apropiados, de tal modo que el análogo o péptido se repliegue a su estructura nativa.

Cuando los análogos y péptidos no se preparan usando tecnología de ADN recombinante, se preparan, preferiblemente, usando la síntesis en fase sólida, tal como la que se describe en líneas generales en Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85: 2149 (1963), aunque pueden emplearse otras síntesis químicas equivalentes conocidas en la técnica. Puede realizarse la síntesis de proteínas in vitro usando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automatizada puede efectuarse, por ejemplo, usando un sintetizador de péptidos Applied Biosystems (Foster City, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. Pueden sintetizarse químicamente por separado diversas porciones del análogo o péptido y combinarse usando métodos químicos o enzimáticos para producir el análogo o péptido de longitud
completa.

La síntesis en fase sólida se inicia a partir del extremo C-terminal del análogo o péptido por acoplamiento de un \alpha-aminoácido protegido con una resina adecuada. Dicho material de partida puede prepararse uniendo un aminoácido \alpha-amino protegido mediante un enlace éster a una resina clorometilada o una resina hidroximetílica, o mediante un enlace amida a una resina BHA o resina MBHA. La preparación de la resina hidroximetílica se describe en Bodansky et al., Chem. Ind. (Londres), 38: 1597-1598 (1966). Están disponibles en el mercado resinas clorometiladas de BioRad Laboratories, Richmond, CA y de Lab. Systems, Inc. La preparación de dicha resina se describe en Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman and Co., San Francisco 1969), Capítulo 1, págs. 1-6. Están disponibles en el mercado soportes de resina BHA y MBHA y se usan generalmente sólo cuando el análogo o péptido deseado que se está sintetizando tiene una amida no sustituida en el extremo C-terminal.

Los aminoácidos se acoplan con la cadena del análogo/péptido usando procedimientos bien conocidos en la técnica para la formación de enlaces peptídicos. Un método implica convertir el aminoácido en un derivado que hará que el grupo carboxilo sea más susceptible a la reacción con el grupo amino N-terminal libre del fragmento peptídico. Por ejemplo, el aminoácido puede convertirse en un anhídrido mixto por reacción de un aminoácido protegido con etilcloroformato, fenil cloroformato, cloroformato de sec-butilo, cloroformato de isobutilo, cloruro de pivaloilo o cloruros de ácidos similares. Como alternativa, el aminoácido puede convertirse en un éster activo, tal como un éster de 2,4,5-triclorofenilo, un éster de pentaclorofenilo, un éster de pentafluorofenilo, un éster de p-nitrofenilo, un éster de N-hidroxisuccinimida o un éster formado a partir de 1-hidroxibenzotriazol.

Otro método de acoplamiento implica el uso de un agente de acoplamiento adecuado tal como N,N'-diciclohexilcarbodiimida o N,N'-diisopropil-carbodiimida. Se describen otros agentes de acoplamiento apropiados, evidentes para los especialistas en la técnica, en E. Gross y J. Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology, Vol. I: Major Methods of Peptide Bond Formation (Academic Press, Nueva York, 1979).

Debería reconocerse que el grupo \alpha-amino de cada aminoácido empleado en la síntesis del análogo/péptido debe protegerse durante la reacción de acoplamiento para evitar reacciones secundarias que involucren a su función \alpha-amino activa. También debería reconocerse que ciertos aminoácidos contienen grupos funcionales de cadenas laterales reactivos (por ejemplo, sulfhidrilo, amino, carboxilo e hidroxilo) y que dichos grupos funcionales también deben protegerse con grupos protectores adecuados para evitar que se produzca una reacción química en ese sitio durante las etapas de acoplamiento tanto inicial como posterior. Se describen grupos protectores adecuados, conocidos en la técnica, en Gross y Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology, Vol. 3: "Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis" (Academic Press: Nueva York, 1981).

En la selección de un grupo protector de cadenas laterales en particular, para usarlo en la síntesis de análogos/péptidos, se siguen las siguientes normas generales. Un grupo protector de \alpha-amino (a) debe volver a la función \alpha-amino inerte en las condiciones que se emplean en la reacción de acoplamiento, (b) debe ser fácilmente eliminable después de la reacción de acoplamiento en condiciones que no eliminarán grupos protectores de cadenas laterales y que no alterarán la estructura del fragmento de análogo/péptido y (c) debe eliminar la posibilidad de racemización tras la activación inmediatamente anterior al acoplamiento. Un grupo protector de cadenas laterales (a) debe volver al grupo funcional de la cadena lateral inerte en las condiciones que se emplean en la reacción de acoplamiento, (b) debe ser estable condiciones que se emplean en la eliminación del grupo protector de \alpha-amino y (c) debe ser fácilmente eliminable tras la terminación del péptido/análogo deseado en condiciones de reacción que no alterarán la estructura de la cadena del análogo/péptido.

Será evidente para los especialistas en la técnica que los grupos protectores que se sabe que son útiles para la síntesis de análogos/péptidos variarán en reactividad con los agentes empleados para su eliminación. Por ejemplo, ciertos grupos protectores, tales como trifenilmetilo y 2-(p-bifenilil)isopropiloxicarbonilo son muy lábiles y pueden escindirse en condiciones ácidas suaves. Otros grupos protectores, tales como t-butiloxicarbonilo (BOC), t-amiloxicarbonilo, adamantil-oxicarbonilo y p-metoxibenciloxicarbonilo son menos lábiles y requieren ácidos moderadamente fuertes, tales como trifluoroacético, hidroclórico o trifluoruro de boro en ácido acético, para su eliminación. Otros grupos protectores más, tales como, benciloxicarbonilo (CBZ o Z), halobenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, cicloalquiloxicarbonilo e isopropiloxicarbonilo, son incluso menos lábiles y requieren ácidos más fuertes, tales como fluoruro de hidrógeno, bromuro de hidrógeno o trifluoroacetato de boro en ácido trifluoroacético, para su eliminación. Entre las clases de grupos protectores de aminoácidos útiles se incluyen:

(1) Para un grupo \alpha-amino, (a) grupos protectores de tipo uretano aromáticos, tales como fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC) CBZ y CBZ sustituido, tales como, por ejemplo, p-clorobenciloxicarbonilo, p-6-nitrobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo y p-metoxibenciloxicarbonilo, o-clorobenciloxicarbonilo, 2,4-diclorobenciloxicarbonilo, 2,6-diclorobenciloxicarbonilo y similares; (b) grupos protectores de tipo uretano alifáticos, tales como BOC, t-amiloxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, 2-(p-bifenilil)-isopropiloxicarbonilo, aliloxicarbonilo y similares; (c) grupos protectores de tipo uretano cicloalquílicos, tales como ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo y ciclohexiloxicarbonilo; y (d) aliloxicarbonilo. Los grupos protectores de \alpha-amino preferidos son BOC o FMOC.

(2) Para el grupo amino de la cadena lateral presente en Lys, la protección puede ser por cualquiera de los grupos mencionados anteriormente en (1), tales como BOC, p-clorobenciloxicarbonilo, etc.

(3) Para el grupo guanidino de Arg, la protección puede ser mediante nitro, tosilo, CBZ, adamantiloxicarbonilo, 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo o 2,3,6-trimetil-4-metoxifenilsulfonilo o BOC.

(4) Para el grupo hidroxilo de Ser, Thr o Tyr, la protección puede ser, por ejemplo, mediante alquilo C1-C4, tal como t-butilo; bencilo (BZL), BZL sustituido, tal como p-metoxibencilo, p-nitrobencilo, p-clorobencilo, o-clorobencilo y 2,6-diclorobencilo.

(5) Para el grupo carboxilo de Asp o Glu, la protección puede ser, por ejemplo, mediante esterificación usando grupos tales como BZL, t-butilo, ciclohexilo, ciclopentilo y similares.

(6) Para el nitrógeno del imidazol de His, el resto tosilo se emplea convenientemente.

(7) Para el grupo hidroxilo fenólico de Tyr, se emplea convenientemente un grupo protector tal como tetrahidropiranilo, terc-butilo, tritilo, BZL, clorobencilo, 4-bromobencilo o 2,6-diclorobencilo. El grupo protector preferido es 2,6-diclorobencilo.

(8) Para el grupo amino de la cadena lateral de Asn o Gln, se emplea preferiblemente xantilo (Xan).

(9) Para Met, el aminoácido se deja preferiblemente sin proteger.

(10) Para el grupo tio de Cys, se emplea típicamente p-metoxibencilo.

El aminoácido C-terminal, por ejemplo Lys, se protege en la posición N-amino mediante un grupo protector apropiadamente seleccionado, en el caso de Lys, BOC. El BOC-Lys-OH pueda acoplarse primero con la bencihidrilamina o resina clorometilada de acuerdo con el procedimiento que se describe en Horiki et al., Chemistry Letters, 165-168 (1978) o usando isopropilcarbodiimida a aproximadamente 25ºC durante 2 horas con agitación. Después del acoplamiento del aminoácido protegido con BOC con el soporte de resina, el grupo protector de \alpha-amino se elimina, como mediante el uso de ácido trifluoroacético (TFA) en cloruro de metileno o TFA solo. La desprotección se lleva a cabo a una temperatura entre aproximadamente 0ºC y la temperatura ambiente. Se describen en la bibliografía otros reactivos de escisión convencionales, tales como HCl en dioxano, y condiciones para la eliminación de grupos protectores \alpha-amino específicos.

Después de la eliminación del grupo protector \alpha-amino, los aminoácidos con \alpha-amino y cadenas laterales protegidos restantes se acoplan paso a paso en el orden deseado. Como una alternativa a añadir cada aminoácido por separado en la síntesis, algunos pueden acoplarse entre sí antes de la adición al sintetizador en fase sólida. La selección de un reactivo de acoplamiento apropiado está dentro de la experiencia en la técnica. Es particularmente adecuado como reactivo de acoplamiento la N,N'-diciclohexilcarbodiimida o diisopropilcarbodiimida.

Cada aminoácido o secuencia de aminoácidos protegida se introduce en el reactor en fase sólida en exceso y el acoplamiento se lleva a cabo convenientemente en un medio de dimetilformamida (DMF) o CH_{2}Cl_{2} o mezclas de los mismos. Si se produce un acoplamiento incompleto, el procedimiento de acoplamiento se repite antes de la eliminación del grupo protector de N-amino anterior al acoplamiento del siguiente aminoácido. El éxito de la reacción de acoplamiento en cada fase de la síntesis puede controlarse. Un método preferido de controlar la síntesis es mediante la reacción de ninhidrina, como se describe en Kaiser et al., Anal. Biochem, 34: 595 (1970). Las reacciones de acoplamiento pueden realizarse automáticamente usando métodos bien conocidos, por ejemplo, un sintetizador de péptidos BIOSEARCH 9500^{TM}.

Tras la terminación de la secuencia del análogo/péptido deseado, el análogo/péptido protegido debe escindirse del soporte de resina y todos los grupos protectores deben eliminarse. La reacción de escisión y la eliminación de los grupos protectores se efectúan convenientemente de forma simultánea o paso a paso. Cuando el soporte de resina es una resina de poliestireno clorometilado, el enlace que ancla el análogo/péptido a la resina es un enlace éster formado entre el grupo carboxilo libre del resto C-terminal y uno de los muchos grupos clorometilo presentes en la matriz de resina. Se entenderá que el enlace de anclaje puede escindirse mediante reactivos que se sabe que son capaces de romper un enlace éster y penetrar en la matriz de resina.

Un método especialmente conveniente es por tratamiento con fluoruro de hidrógeno anhidro líquido. Este reactivo no sólo escindirá el análogo/péptido de la resina, sino que también eliminará todos los grupos protectores. Por lo tanto, el uso de este reactivo proporcionará directamente el análogo/péptido completamente desprotegido. Cuando se usa la resina clorometilada, el tratamiento con fluoruro de hidrógeno da como resultado la formación de los ácidos peptídicos libres. Cuando se usa la resina de bencihidrilamina, el tratamiento con fluoruro de hidrógeno da como resultado directamente las aminas peptídicas libres. La reacción con fluoruro de hidrógeno en presencia de anisol y dimetilsulfuro a 0ºC durante una hora eliminará simultáneamente los grupos protectores de cadenas laterales y liberará al análogo/péptido de la resina.

Cuando se desea escindir el análogo/péptido sin eliminar los grupos protectores, el análogo/péptido protegido-resina puede someterse a metanolisis para producir el análogo/péptido protegido, en el que el grupo carboxilo C-terminal esté metilado. Después, el éster metílico se hidroliza en condiciones alcalinas suaves para dar el grupo carboxilo C-terminal libre. Después, los grupos protectores en la cadena del análogo/péptido se eliminan mediante tratamiento con un ácido fuerte, tal como fluoruro de hidrógeno líquido. Una técnica particularmente útil para metanolisis es la de Moore et al., Peptides, Proc. Fifth Amer. Pept. Symp., M. Goodman y J. Meienhofer, Eds., (John Wiley, N. Y., 1977), págs. 518-521, en la que el análogo/péptido protegido-resina se trata con metanol y cianuro de potasio en presencia de éter corona.

Otro método para escindir el análogo/péptido protegido de la resina cuando se emplea la resina clorometilada es mediante amonolisis o mediante tratamiento con hidrazina. Si se desea, la amida o hidrazida C-terminal resultante puede hidrolizarse hasta el resto carboxilo C-terminal libre y los grupos protectores pueden eliminarse de forma convencional.

También se reconocerá que el grupo protector presente en el grupo \alpha-amino N-terminal puede eliminarse de forma preferencial antes o después de que el análogo/péptido protegido se escinda del soporte.

La purificación de los análogos de la invención y de los péptidos anteriores se consigue típicamente usando procedimientos convencionales, tales como HPLC preparativa (incluyendo HPLC de fase inversa) u otras técnicas cromatográficas conocidas, tales como de exclusión molecular, intercambio iónico, cromatografía de partición, cromatografía de afinidad (incluyendo columnas de anticuerpos monoclonales) o de distribución contracorriente.

Los análogos de esta invención y los péptidos pueden estabilizarse por polimerización. La polimerización puede efectuarse por entrecruzamiento de cadenas de monómeros con agentes de entrecruzamiento polifuncionales, directa o indirectamente, a través de polímeros multifuncionales. Generalmente, dos análogos/péptidos sustancialmente idénticos se entrecruzan en sus extremos C o N terminales usando una agente de entrecruzamiento bifuncional. El agente se usa para entrecruzar los grupos amino y/o carboxilo terminales. Generalmente, tanto los grupos carboxilo terminales como los grupos amino terminales se entrecruzan entre sí, aunque mediante la selección del agente de entrecruzamiento apropiado, el grupo alfa-amino de un análogo/péptido se entrecruza con el grupo carboxilo terminal del otro análogo/péptido. Preferiblemente, los análogos/péptidos se sustituyen en sus extremos C-terminales con cisteína. En condiciones bien conocidas en la técnica, puede formarse un enlace disulfuro entre las cisteínas terminales, entrecruzando por lo tanto las cadenas de análogos/péptidos. Por ejemplo, se forman convenientemente puentes disulfuro mediante oxidación catalizada por metales de las cisteínas libres o mediante sustitución nucleófila de un resto de cisteína adecuadamente modificado. La selección del agente de entrecruzamiento dependerá de las identidades de las cadenas laterales reactivas de los aminoácidos presentes en los análogos/péptidos. Por ejemplo, no se preferirá un entrecruzamiento por disulfuros si hubiera presentes cisteínas en el análogo/péptido en sitios adicionales distintos del extremo C-terminal. También están dentro del alcance de esto análogos/péptidos entrecruzados con puentes
metileno.

Los sitios de entrecruzamiento adecuados en los análogos/péptidos, aparte de los grupos amino N-terminal y carboxilo C-terminal, incluyen grupos épsilon-amino que se encuentran en restos de lisina, así como grupos amino, imino, carboxilo, sulfhidrilo e hidroxilo localizados en las cadenas laterales de restos internos de los análogos/péptidos o restos introducidos en secuencias flanqueantes. Se consigue convenientemente el entrecruzamiento a través de agentes de entrecruzamiento externamente añadidos, por ejemplo, usando cualquiera de varios reactivos familiares para los especialistas en la técnica, por ejemplo, mediante tratamiento con carbodiimida del análogo o péptido. Se encuentran en la bibliografía otros ejemplos de agentes de entrecruzamiento multifuncionales (generalmente, bifuncionales) adecuados.

Los análogos de esta invención y los péptidos también pueden estabilizarse conformacionalmente mediante ciclación. Los análogos/péptidos generalmente se ciclan uniendo covalentemente los dominios N y C terminales de un análogo/péptido con el dominio correspondiente de otro análogo/péptido de esta invención, de tal modo que se formen ciclo-oligómeros que contienen dos o más secuencias de análogo/péptido repetidas, teniendo cada análogo/péptido interno sustancialmente la misma secuencia. Además, los análogos/péptidos ciclados (ya sean ciclo-oligómeros o ciclo-monómeros) se entrecruzan para formar estructuras cíclicas 1-3 que tienen de 2 a 6 péptidos comprendidos en ellas. Preferiblemente, los análogos/péptidos no se unen covalentemente a través de grupos \alpha-amino y carboxilo de la cadena principal (cabeza con cola), sino que se entrecruzan a través de las cadenas laterales de restos localizados en los dominios N y C terminales. Los sitios de unión estarán generalmente, por lo tanto, entre las cadenas laterales de los restos.

Se conocen muchos métodos adecuados en sí para preparar análogos/péptidos mono o poli-ciclados, como se contempla en este documento. Se ha efectuado la ciclación Lys/Asp usando N\alpha-Boc-aminoácidos sobre un soporte en fase sólida con protección de cadenas laterales con Fmoc/9-fluorenilmetilo (OFm) para Lys/Asp; el proceso se completa mediante tratamiento con piperidina seguido de ciclación.

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También se han entrecruzado cadenas laterales de Glu y Lys en la preparación de análogos/péptidos cíclicos o bicíclicos: el análogo/péptido se sintetiza mediante química en fase sólida sobre una resina de p-metilbenzhidrilamina. El análogo/péptido se escinde de la resina y se desprotege. El análogo/péptido cíclico se forma usando difenilfosforilazida en metilformamida diluida. Para un procedimiento alternativo, véase Schiller et al., Peptide Protein Res., 25: 171-177 (1985). Véase también la Patente de Estados Unidos Nº 4.547.489.

Se generan análogos/péptidos entrecruzados por disulfuros o ciclados por métodos convencionales. El método de Pelton et al. (J. Med. Chem., 29: 2370-2375 (1986)) es adecuado, excepto por que se produce una proporción mayor de ciclo-oligómeros mediante la realización de la reacción en soluciones más concentradas que la de la mezcla de reacción diluida que se describe en Pelton et al., para la producción de ciclo-monómeros. La misma química es útil para la síntesis de dímeros o ciclo-oligómeros o ciclo-monómeros. También son útiles puentes tiometileno. Lebl and Hruby, Tetrahedron Letters, 25: 2067-2068 (1984). Véase también Cody et al., J. Med. Chem., 28: 583
(1985).

Los análogos/péptidos cíclicos o poliméricos deseados se purifican mediante filtración en gel seguida de cromatografía líquida de alta presión en fase inversa u otros procedimientos convencionales. Los análogos/péptidos se esterilizan por filtración y se formulan en vehículos convencionales farmacológicamente aceptables.

Los materiales de partida que se requieren para los procesos que se describen en este documento se conocen en la bibliografía o pueden prepararse usando métodos conocidos y materiales de partida conocidos.

Si en los análogos/péptidos que se están generando los átomos de carbono unidos a 4 sustituyentes no idénticos son asimétricos, entonces los análogos/péptidos pueden existir como diastereoisómeros, enantiómeros o mezclas de los mismos. La síntesis descrita anteriormente puede emplear racematos, enantiómeros o diastereómeros como materiales de partida o intermedios. Los productos diastereoméricos que resultan de dichas síntesis pueden separarse por métodos cromatográficos o de cristalización. Asimismo, pueden separarse mezclas de productos enantioméricos usando las mismas técnicas o mediante otros métodos conocidos en la técnica. Cada uno de los átomos de carbono asimétricos, cuando están presentes, pueden estar en una o dos configuraciones R) o S), y ambas están dentro del alcance de la presente invención.

Los análogos de esta invención y los péptidos pueden ponerse en contacto con el cartílago mediante cualquier técnica adecuada y pueden combinarse, análogo con análogo, análogo con péptido o péptido con péptido. Si el tratamiento es in vivo, el análogo o péptido se administra al mamífero mediante, por ejemplo, la vía de administración oral, parenteral (por ejemplo, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intraarticular o inyección o infusión subcutánea o implante), nasal, pulmonar, vaginal, rectal, sublingual o tópica, y puede formularse en formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración. La vía de administración específica dependerá, por ejemplo, del historial médico del paciente, incluyendo cualquier efecto secundario que se perciba o prevea que puede producirse usando el análogo o péptido, del tipo de análogo o péptido que se administra y del tipo particular de trastorno a corregir. Más preferiblemente, la administración es mediante una infusión continua (usando, por ejemplo, dispositivos de liberación lenta o minibombas, tales como bombas osmóticas o parches dérmicos) o mediante inyección (usando, por ejemplo, medios intravenosos, intraarticulares o subcutáneos). Preferiblemente, el análogo o péptido se administra localmente, por ejemplo, directamente en la articulación en la que se necesita la reparación o prevención.

El análogo o péptido que se va a usar en la terapia se formulará y se dosificará en un modo coherente con una buena práctica médica, teniendo en cuenta el estado clínico del paciente individual (especialmente, los efectos secundarios del tratamiento con el análogo o péptido), el tipo de trastorno, el lugar de administración, el método de administración, la pauta de administración y otros factores conocidos por los especialistas. Las cantidades eficaces del análogo o péptido para los fines de este documento se determinan, por lo tanto, mediante dichas consideraciones y deben ser cantidades que den como resultado la biodisponibilidad de los fármacos para el mamífero y el efecto deseado.

Una administración preferida es una administración crónica de aproximadamente dos veces al día durante 4-8 semanas para reproducir los efectos del IGF-1. Como una alternativa a la inyección, puede emplearse la infusión crónica usando un dispositivo de infusión para infusiones subcutáneas (SC) o intraarticulares continuas. También puede emplearse una solución en bolsa intravenosa. El factor clave en la selección de una dosis apropiada para el trastorno en cuestión es el resultado obtenido, medido mediante criterios para medir el tratamiento del trastorno del cartílago según lo considere apropiado el especialista médico.

Como una propuesta general, la cantidad total farmacéuticamente eficaz del análogo o péptido administrado por vía parenteral por dosis estará en un intervalo que puede medirse mediante una curva de dosis-respuesta. Por ejemplo, los IGF unidos a IGFBP o en la sangre pueden medirse en líquidos corporales del mamífero que se va tratar para determinar la dosificación. Como alternativa, se pueden administrar cantidades crecientes del análogo o péptido al paciente y comprobar los niveles en suero del paciente para IGF-1 e IGF-2. La cantidad de análogo o péptido que se va a emplear puede calcularse en una base molar, basándose en estos niveles en suero de IGF-1 e IGF-2.

En concreto, un método para determinar una dosificación apropiada del análogo o péptido implica medir los niveles de IGF en un líquido biológico, tal como un líquido corporal o sanguíneo. La medición de dichos niveles puede realizarse por cualquier medio, incluyendo RIA y ELISA. Después de la medición de los niveles de IGF, el líquido se pone en contacto con el análogo o péptido usando dosis individuales o múltiples. Después de esta etapa de contacto, los niveles de IGF se vuelven a medir en el líquido. Si los niveles de IGF en el líquido han disminuido en una cantidad suficiente para producir la eficacia deseada para la que se va a administrar la molécula, entonces la dosis de la molécula puede ajustarse para producir una eficacia máxima. Este método puede llevarse a cabo in vitro o in vivo. Preferiblemente, este método se lleva a cabo in vivo, es decir, después de que el líquido se extrae de un mamífero y se miden los niveles de IGF, el análogo o péptido de este documento se administra al mamífero usando dosis individuales o múltiples (es decir, la etapa de contacto se consigue mediante la administración a un mamífero). Después, los niveles de IGF se vuelven a medir en líquido extraído del mamífero.

Otro método para determinar la dosificación es usar anticuerpos contra el análogo o péptido u otro método de detección para el análogo o péptido en el formato de LIFA. Esto permitiría la detección de IGF endógenos o exógenos unidos a IGFBP y la cantidad de análogo o péptido unido a la IGFBP.

Otro método para determinar la dosificación sería medir el nivel de IGF "libre" o activo en sangre. Para algunos usos, el nivel de IGF "libre" sería un marcador adecuado de eficacia y dosis o dosificación eficaz. La cantidad de IGF activo también puede medirse en el líquido sinovial.

Por ejemplo, se describe un método para detectar IGF endógeno o exógeno unido a una proteína de unión a IGF o la cantidad del análogo o péptido de este documento o detectar el nivel de IGF no unido en un líquido biológico. Este método comprende:

(a) poner en contacto al líquido con 1) un medio para detectar el análogo o péptido que es específico para el análogo o péptido (tal como un primer anticuerpo específico para epítopos sobre el análogo o péptido) unido a un soporte en fase sólida, de tal modo que en presencia del análogo o péptido los sitios de unión a IGF permanecen disponibles sobre el análogo o péptido para unirse a la proteína de unión a IGF, formando por lo tanto un complejo entre los medios y la proteína de unión a IGF; y 2) el análogo o péptido durante un periodo de tiempo suficiente para saturar todos los sitios de unión a IGF disponibles sobre la proteína de unión a IGF, formando por lo tanto un complejo saturado;

(b) poner en contacto al complejo saturado con un segundo medio marcado detectable que es especifico para la proteína de unión a IGF (tal como un segundo anticuerpo específico para epítopos sobre la IGFBP) que esté disponible para unirse cuando el análogo o péptido esté unido a la proteína de unión a IGF; y

(c) analizar de forma cuantitativa la cantidad de los medios marcados unidos como una medida de la IGFBP en el líquido biológico y, por lo tanto, como una medida de la cantidad del análogo o péptido unido y proteína de unión a IGF, IGF unido y proteína de unión a IGF o IGF activo presente en el líquido.

Dados los métodos anteriores para determinar dosificaciones, en general, la cantidad de análogo o péptido que puede emplearse puede estimarse, es decir, de aproximadamente 1 \mug/kg/día a 10 mg/kg/día, preferiblemente, de aproximadamente 10 \mug/kg/día a 1 mg/kg/día, más preferiblemente, aproximadamente 10-200 \mug/kg/día, podrían usarse en base a los kg de peso corporal del paciente aunque, como se ha indicado anteriormente, esto estará sujeto en gran medida a discreción terapéutica.

Se señala que dosificaciones y concentraciones de fármaco deseadas de composiciones farmacéuticas que pueden emplearse con la presente invención pueden variar dependiendo del uso en particular que se prevea. La determinación de la dosificación o de la vía de administración apropiada está bien dentro de las habilidades de un médico normal. Los experimentos animales proporcionan una orientación fiable para la determinación de dosis eficaces para terapia en seres humanos. El cambio de escala interespecífico de dosis eficaces puede realizarse siguiendo los principios establecidos por Mordenti y Chappell, "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" in Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., (Pergamon Press: Nueva York, 1989), págs. 42-96.

El análogo o péptido puede administrarse convenientemente mediante un sistema de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de composiciones de liberación sostenida incluyen matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen poliláctidos (Patente de Estados Unidos Nº 3.773.919, documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983), poli(2-hidroxietil metacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)), acetato de etilenvinilo (Langer et al., anteriormente) o ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988). Las composiciones de liberación sostenida también incluyen un análogo o péptido liposomalmente atrapado. Los liposomas que contienen el análogo o péptido se preparan por métodos conocidos en sí: documentos DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; Solicitud de Patente Japonesa 83-118008; Patentes de Estados Unidos Nº 4.985.045 y 4.594.545: y documento EP 102.324. Generalmente, los liposomas son del tipo unilamelar pequeño (de aproximadamente 200 a 800 Angstroms), en los que el contenido de lípidos es mayor que aproximadamente el 30% en moles de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia más eficaz.

También pueden emplearse análogos o péptidos PEGilados que tienen una vida más larga, basados en, por ejemplo, la tecnología de conjugados que se describe en el documento WO 95/32003, publicado el 30 de noviembre de
1995.

Para la administración por vía parenteral, el análogo o péptido se formula generalmente mezclando cada uno en el grado de pureza deseado en una forma inyectable de dosificación unitaria (solución, suspensión o emulsión) con un vehículo farmacéuticamente, o parenteralmente, aceptable, es decir, uno que sea no tóxico para los destinatarios de las dosificaciones y concentraciones empleadas y que sea compatible con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, preferiblemente la formulación no incluye agentes oxidantes ni otros péptidos que se sabe que son perjudiciales para polipéptidos.

Generalmente, las formulaciones se preparan poniendo en contacto el análogo o péptido de forma uniforme y estrechamente con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos, o ambos. Después, si es necesario, el producto se conforma en la formulación deseada. Preferiblemente, el vehículo es un vehículo parenteral, más preferiblemente, una solución que es isotónica con la sangre o el líquido sinovial del destinatario. Los ejemplos de dichos vehículos de soporte incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, una solución tamponada, hialuronano y solución de dextrosa. También son útiles en este documento vehículos no acuosos tales como aceites fijos y oleato de etilo.

El vehículo contiene, convenientemente, cantidades minoritarias de aditivos, tales como sustancias que potencian la isotonicidad y la estabilidad química. Dichos materiales no son tóxicos para los destinatarios a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente diez restos), por ejemplo, poliarginina o tripéptidos; proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; glicina; aminoácidos tales como ácido glutámico, ácido aspártico, histidina o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa, trehalosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcares, tales como manitol o sorbitol; contraiones, tales como sodio; tensioactivos no iónicos, tales como polisorbatos, poloxámeros o polietilenglicol (PEG); y/o sales neutras, por ejemplo, NaCl, KCl, MgCl_{2}, CaCl_{2},
etc.

El análogo o péptido típicamente formulado en dichos vehículos a un pH de, o de aproximadamente 4,5 a 8. Se entenderá que el uso de algunos de los excipientes, vehículos o estabilizantes anteriores darán como resultado la formación de sales del análogo o péptido. La preparación final puede ser un líquido estable o un sólido liofilizado.

Típicamente, de aproximadamente 0,5 a 500 mg del análogo o péptido o mezcla de análogos y/o péptidos, como la forma de ácido o de base libre o como una sal farmacéuticamente aceptable, se componen con un vehículo, soporte, excipiente, aglutinante, conservante, estabilizante, aromatizante, etc. fisiológicamente aceptable, como exige la práctica farmacéutica aceptada. La cantidad de ingrediente activo en estas composiciones es tal que se obtiene una dosificación adecuada en el intervalo indicado.

El análogo o péptido que se va a usar para la administración terapéutica debe ser estéril. La esterilidad se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles (por ejemplo, membranas de 0,2 \mum). Generalmente, se colocan composiciones terapéuticas en un envase que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

El análogo o péptido se almacenará generalmente en envases de dosis unitarias o multidosis, por ejemplo, ampollas o viales cerrados herméticamente, como una solución acuosa o como una formulación liofilizada para reconstitución. Como ejemplo de una formulación liofilizada, viales de 10 ml se cargan con 5 ml de solución acuosa al 1% (p/v) esterilizada por filtración de análogo o péptido y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara mediante reconstitución del análogo o péptido liofilizado usando agua para inyección bacteriostática.

También es parte de esta invención la terapia de combinación con el análogo o péptido de este documento y uno o más de otros reactivos apropiados que potencien el efecto del análogo o péptido. Éstos incluyen antagonistas para citocinas, NO o IL-1ra, un antagonista del catabolismo del cartílago o un factor de crecimiento del cartílago, tal como IGF-1 de tipo silvestre y/o ALS si el agente activo es un péptido desplazador de IGFBP-3 o un análogo de IGF-1 con una preferencia de afinidad de unión por IGFBP-3 sobre IGFBP-1. Además, el péptido desplazador de IGFBP puede coadministrarse con un análogo de IGF-1 de este documento, preferiblemente, con el análogo con una preferencia de afinidad de unión por IGFBP-1 sobre IGFBP-3.

El agente activo y reactivo para potenciar su efecto pueden administrarse simultáneamente o secuencialmente, y el reactivo puede administrarse a la misma o a dosis inferiores a en las que de otro modo se administraría si se administrase solo. El péptido desplazador/análogo de IGF-1 con preferencia de unión por IGFBP-3 puede administrarse por separado del IGF-1 y/o ALS pero, preferiblemente, estos agentes administran juntos como un complejo binario o ternario en el que puede formarse dicho complejo. La administración como un complejo de ALS, IGF-1 y péptido desplazador de IGFBP-3/análogo de IGF-1 da como resultado una vida media más larga para el agente
activo.

También se describe en este documento el uso de terapia génica para tratar a un mamífero, usando ácidos nucleicos que codifiquen el análogo o péptido. Generalmente, se usa terapia génica para aumentar (o sobreexpresar) los niveles de IGF en el mamífero. Pueden usarse con este fin ácidos nucleicos que codifican el análogo o péptido. Una vez que se conoce la secuencia de aminoácidos, se pueden generar varias moléculas de ácido nucleico usando la degeneración del código genético y seleccionar las que se van usar para terapia génica.

Existen dos procedimientos fundamentales para introducir el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las células del paciente con el fin de la terapia génica: in vivo y ex vivo. Para la administración in vivo, el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, habitualmente en el lugar en el que se requiere el análogo o péptido. Para el tratamiento ex vivo, se extirpan las células del paciente, el ácido nucleico se introduce en estas células aisladas y las células modificadas se administran al paciente directamente o, por ejemplo, encapsuladas en el interior de membranas porosas que se implantan en el paciente. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.892.538 y 5.283.187.

Existen una diversidad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere a células cultivadas in vitro o in vivo en las células del hospedador deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico a células de mamíferos in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación con fosfato cálcico, infección viral, etc. Un vector que se usa comúnmente para la administración del gen ex vivo es un adenovirus o retrovirus.

Las técnicas de transferencia de ácidos nucleicos in vivo actualmente preferidas incluyen la infección con vectores virales (tales como adenovirus, virus herpes simple I, retrovirus o virus adenoasociados) y sistemas basados en lípidos (son lípidos útiles para transferencia del gen mediada por lípidos DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo). En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que lo dirija a las células diana, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de la superficie celular o la célula diana, un ligando para un receptor sobre la célula diana, etc. Cuando se emplean liposomas, pueden usarse proteínas que se unen a una proteína de membrana de la superficie celular asociada con endocitosis para dirigir y/o facilitar la captación. Los ejemplos incluyen proteínas de la cápsida o fragmentos de las mismas con tropismo por un tipo celular en particular, anticuerpos para proteínas que experimentan internalización en el ciclado y proteínas que dirigen la localización intracelular y potencian la vida media intracelular. La técnica de endocitosis mediada por receptor se describe, por ejemplo, en Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990). Para una revisión de los protocolos de marcación de genes y terapia génica actualmente conocidos, véase Anderson et al., Science, 256: 808-813 (1992). Véase también el documento WO 93/25673 y las referencias que se citan en el mismo.

También se describen en el mismo kits. El artículo de fabricación comprende un envase y unas instrucciones. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los envases pueden estar fabricados de una diversidad de materiales, tales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición que es eficaz para el tratamiento del trastorno del cartílago, por ejemplo, un trastorno cartilaginoso degenerativo, y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa o una vial de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). El agente activo en la composición es un análogo de IGF-1 o un péptido desplazador de IGFBP, como se han definido en este documento. La composición puede comprender cualquiera o múltiples ingredientes de los que se describen en este documento. Las instrucciones sobre, o asociadas con el envase indican que la composición se usa para el tratamiento de un trastorno del cartílago. Por ejemplo, las instrucciones pueden indicar que la composición es eficaz para el tratamiento de osteoartritis, artritis reumatoide o cualquier otro trastorno cartilaginoso degenerativo. El artículo de fabricación puede comprender además un segundo envase que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer o solución de dextrosa. Como alternativa, la composición puede contener cualquiera de los vehículos, excipientes y/o estabilizantes que se han mencionado este documento anteriormente. También puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones para usarlo. El kit incluye, opcionalmente, un envase separado, preferiblemente un vial, para un coagente que se va a administrar junto con el agente activo, tal como
IGF-1.

La invención se entenderá más completamente tomando como referencia los siguientes ejemplos. Sin embargo, no deberían interpretarse como limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos

Los ejemplos 1-4 a continuación están tomados del documento WO 98/45427, puesto que describe péptidos desplazadores de IGFBP-3 definidos en este documento. Basándose en los resultados de experimentos in vitro e in vivo usando un péptido desplazador de IGFBP-3 con cambios aminoacídicos en los restos 24 y 31 (Y24L, Y31A), también denominado (Leu^{24}, Ala^{31}) hIGF-1 o IGF-M, que se describe en el documento WO 98/45427, se predice que otros péptidos que inhiben la interacción de un IGF con una IGFBP y que se unen mínimamente o no se unen en absoluto al receptor de IGF-1, deberían aumentar los niveles de IGF activo en un sujeto que se esté tratando. Además, es posible que otra clase de moléculas puedan unirse al propio IGF-1 en un sitio lejos del implicado en las interacciones con el receptor, de tal modo que inhiba o impida la interacción del IGF-1 con las IGFBP, pero no la interacción de IGF-1 con su receptor.

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En los ejemplos, pueden describirse \alpha-aminoácidos comunes mediante el código de aminoácido convencional de una o de tres letras cuando se hace referencia a intermedios y productos finales. Por \alpha-aminoácidos comunes se entienden los aminoácidos incorporados en proteínas bajo la dirección de ARNm. Las abreviaturas convencionales se enumeran en The Merck Index, 10ª Edición, págs. Misc-2 - Misc-3. A menos que se indique otra cosa, los \alpha-aminoácidos comunes tienen la configuración natural o "L" en el átomo de carbono alfa. Si el código está precedido por una "D", ésta se refiere al enantiómero opuesto del \alpha-aminoácido común. Los \alpha-aminoácidos modificados o inusuales, tales como norleucina (Nle) y ornitina (Orn) se denominan como se describe en la Patente de Estados Unidos y en la Trademark Office Official Gazette 1114 TMOG, 15 de mayo de 1990.

Ejemplo 1 Péptidos procedentes de fagos para unirse a IGF-1 y proteínas de unión Introducción

Se ha demostrado que pueden identificarse péptidos que se unan específicamente y con una afinidad medible a moléculas diana, tales como proteínas, a partir de una biblioteca inicial de muchos péptidos de unión y de no unión, a través de selecciones de unión usando fusiones de proteína de cubierta de bacteriófagos (Smith, Science, 228: 1315 (1985); Scott y Smith, Science, 249: 386 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 309 (1990); Devlin et al., Science, 249: 404 (1990); revisados por Wells y Lowman, Curr. Opin. Struct. Biol., 2: 597 (1992); Patente de Estados Unidos Nº 5.223.409). Además, tanto las proteínas como los péptidos presentados en fagos pueden aumentar su afinidad a través de ciclos repetidos de mutaciones, selección y propagación.

Pueden construirse bibliotecas de péptidos que difieren en secuencia en posiciones de restos particulares usando oligodesoxinucleótidos sintéticos. Los péptidos se presentan como proteínas de fusión con una proteína de cubierta de fago (tal como g3p o g8p) sobre partículas de bacteriófagos, conteniendo cada una un genoma de ADN monocatenario que codifica la variante peptídica en particular. Después de ciclos de purificación por afinidad, usando una molécula diana inmovilizada, se aíslan clones individuales de bacteriófagos y las secuencias de aminoácidos de sus péptidos presentados se deducen de sus secuencias de ADN.

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Materiales y métodos Construcción de bibliotecas de péptidos en fagos

Para identificar un conjunto de moléculas peptídicas que tienen la capacidad de unirse a IGF-1 o a una de una proteína de unión a IGF, tal como IGFBP-1 o IGFBP-3, se construyeron varias diversas bibliotecas de fagos de péptidos de longitud que variaba de 18 a 20 restos. Se seleccionaron péptidos de este tamaño para favorecer la selección de péptidos capaces de mantener estructuras bien definidas en solución. Debido a que los péptidos de aminoácidos naturales de este tamaño tiene una diversidad de secuencia potencial de 20^{18}-20^{20} (es decir, de 2,6 x 10^{23} a 1,0 x 10^{26}) variantes, no es práctico construir y ensayar todas dichas variantes. En su lugar, ciertos restos se fijaron o eran constantes, lo que podría esperarse que permitirá o promoverá elementos estables de estructura peptídica, tales como enlaces disulfuro o giros beta, dentro de cada péptido.

Se han usado anteriormente restricciones o armazones estructurales para la presentación de bibliotecas de péptidos en fagos y para la posterior y sucesiva mejora de las afinidades de unión a través de mutación y selección. Dichos armazones estructurados pueden favorecer conformaciones de unión estables de segmentos peptídicos. Por analogía, las inmunoglobulinas proporcionan una región marco conservada estructural estable (y conservada) para la presentación de una diversidad de diferentes bucles peptídicos (CDR, regiones determinantes de complementariedad), que pueden unirse con diferentes antígenos.

Como molde para las construcciones de bibliotecas se usó un plásmido, pt4.g8 (la secuencia de ADN completa se muestra en la Fig. 1) que expresa un péptido reconocible por anticuerpos (gD-tag) fusionado a g8p de bacteriófago M13. Este plásmido contiene orígenes de replicación de ADN monocatenarios y bicatenarios. El promotor phoA y las secuencias señal de secreción STII están cadena arriba del péptido gD (subrayadas a continuación), que están seguidas de un péptido "enlazador" (con subrayado doble a continuación) y, después, por el g8p de bacteriófago
M13.

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Se construyeron varias bibliotecas de péptidos de secuencia aleatoria (Tabla I) usando mutagénesis dirigida de molde de cadena sencilla (Kunkel et al., Methods. Enzymol., 204: 125 (1991)), con los oligonucleótidos que se describen a continuación:

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TABLA I Grandes bibliotecas sin tratamiento previo para presentación en g8

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A. Motivo de secuencia de giro beta

Se proporciona un ejemplo de un péptido de estructura tridimensional conocida en Wrighton et al., que seleccionaron un agonista peptídico para el receptor de eritropoyetina (EPO-R) mediante presentación de fagos (Wrighton et al., Science, 273: 458 (1996)). El péptido GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG (SEC ID Nº: 66) (que tiene un enlace disulfuro uniendo los dos restos de Cys) forma un dímero de dos horquillas beta en el complejo cristalizado con EPO-R (Livnah et al., Science, 273: 464 (1996)). Aunque no se ha descrito la estructura de la forma no unida de este péptido en solución, la estructura de giro beta que forma este péptido en complejo con EPO-R sugería que podrían formarse estructuras similares por péptidos de la forma Cx_{2}GPX_{4}C (SEC ID Nº: 67).

Como un tipo de biblioteca de péptidos estructurada, se reemplaza una porción del péptido gD con el motivo CX_{2}GPX_{4}C (SEC ID Nº: 67), dejando los restos cadena arriba y cadena abajo ("flanqueantes") sin modificar con respecto a los del plásmido de partida. Por lo tanto, esta biblioteca se diseñó para presentar sobre partículas de fago el péptido SGTACX_{2}GPX_{4}CSLAGSP (SEC ID Nº: 56), en el que X representa cualquiera de los 20 L-aminoácidos naturales, fusionado con el enlazador y con g8p, descritos anteriormente. Esta biblioteca se construyó usando el oligonucleótido HL-300:

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en el que N indica una mezcla de los nucleótidos A, G, C y T y S representa una mezcla de los nucleótidos G y C.

Se construyó una biblioteca adicional para permitir interacciones adicionales dentro del péptido y/o con las proteínas diana mediante aleatorización también de las secuencias flanqueantes. Esta biblioteca se construyó con la forma X_{4}CX_{2}GPX_{4}CX_{4} (SEC ID Nº: 57) usando el oligonucleótido HL-301: 5'-GCT ACA AAT GCC TAT GCA NNS NNS NNS NNS TGC NNS NNS GGT CCT NNS NNS NNS NNS TGT NNS NNS NNS NNS GGT GGA GGA TCC GGA GGA G-3' (SEC ID Nº: 69).

B. Motivos de bucles disulfuro

Debido a que muchas conformaciones peptídicas adicionales podrían ser productivas para la unión a una proteína diana dada, era deseable ensayar otros tipos de motivos de secuencias peptídicas en bibliotecas presentadas en fagos. Por ejemplo, un único enlace disulfuro en el interior de un pequeño péptido puede favorecer estructuras estables que permitan una afinidad de unión relativamente mayor que en estructuras no restringidas (Geysen et al., Mol. Immunol., 23: 709 (1986); Wood et al., Science, 232: 633 (1986); Oldenburg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5393 (1992); O'Neil et al., Proteins, 14: 509 (1992); McLafferty et al., Gene, 128: 29 (1993); Giebel et al., Biochem., 34: 15430 (1995)). Por lo tanto, se construyeron varias bibliotecas de péptidos en fagos de la forma X_{m}CX_{n}CX_{k}, en la que m = 4, n = 10 y k = 4, o en la que m = 5, n = 8-9 y k = 4-5, o m = 6, n = 6-7 y k = 5-6, o m = 7, n = 4-5 y k = 6-7 (SEC ID Nº: 59 a 65). En estos péptidos, se predice que un enlace disulfuro forma una restricción estabilizante para la conformación del péptido.

Estas bibliotecas de péptidos (véase la Tabla I) se construyeron como X_{7}CX_{4}CX_{7} (SEC ID Nº: 59), usando el oligonucleótido HL-303:

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X_{7}CX_{5}CX_{6} (SEC ID Nº: 60), usando el oligonucleótido HL-304:

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X_{6}CX_{6}CX_{6} (SEC ID Nº: 61), usando el oligonucleótido HL-305:

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X_{6}CX_{7}CX_{b} (SEC ID Nº: 62), usando el oligonucleótido HL-306:

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X_{5}CX_{8}CX_{5} (SEC ID Nº: 63), usando el oligonucleótido HL-307:

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X_{5}CX_{9}CX_{4} (SEC ID Nº: 64), usando el oligonucleótido HL-308:

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X_{4}CX_{10}CX_{4} (SEC ID Nº: 65), usando el oligonucleótido HL-309:

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C. Péptidos no restringidos

Las bibliotecas no restringidas (es decir, que no tienen restos fijos dentro del péptido) también han producido moléculas de unión específica (Scott y Smith, anteriormente; Cwirla et al., anteriormente; Devlin et al., anteriormente; Kay et al., Gene, 128: 59 (1993)). No obstante, dichas bibliotecas pueden producir péptidos estructurados, puesto que las interacciones no covalentes todavía pueden inducir estructura en las formas unida y/o no unida. Se construyó una biblioteca de péptidos no restringidos, de la forma X_{20} (SEC ID Nº: 58), usando el oligonucleótido HL-302:

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Selecciones de unión de fagos polivalentes (g8)

Los productos de las reacciones de mutagénesis aleatoria se usaron para transformar células de E. coli XL1-BLUE^{TM} (Stratagene) por electroporación y se amplificaron por cultivo 15-16 h con M13K07 (Vieira y Messing, Methods Enzymol., 153: 3-11 (1987)) o fago auxiliar VCSM13 (Strategene Corp.). Basándose en la siembra en placas de las transformaciones iniciales, el número de transformantes por biblioteca fue de aproximadamente 1,8 x 10^{8} para la biblioteca HL-300, 7,9 x 10^{8} para HL-301, 5,0 x 10^{8} para HL-302, 5,3 x 10^{8} para HL-303, 5,6 x 10^{8} para HL-304, 5,0 x 10^{8} para HL-305, 6,3 x 10^{8} para HL-306, 4,5 x 10^{8} para HL-307, 1,9 x 10^{8} para HL-308 y 2,1 x 10^{8} para HL-309.

IGFBP-3 e IGF-1 se biotinilaron con una proporción molar de 1,5:1 de un reactivo de biotina escindible, EZ-LIN^{TM} NHS-SS-Biotin (Pierce), con respecto a proteína, usando las instrucciones del fabricante.

La selección inicial de péptidos para unión a IGFBP-3 o IGF-1 se llevó a cabo usando combinaciones de fagos de aproximadamente 10^{10} fagos/ml (100 \mul de volumen total). Se revistieron placas de plástico de 96 pocillos MAXISORP^{TM} (Nunc) con una solución de 2 \mug/ml de avidina de marca NEUTRAVIDIN^{TM} (Pierce) en tampón carbonato sódico 50 mM a pH 9,6 durante una noche a 4ºC. Después, se retiró la solución de NEUTRAVIDIN^{TM} y se incubaron las placas con una solución de bloqueo de 5 g/l de albúmina de suero bovino o 5 g/l de ovoalbúmina o 5 g/l de leche en polvo en tampón carbonato sódico 50 mM durante 1-2 h a temperatura ambiente. Después, se retiró la solución de bloqueo y se añadió una solución de proteína diana biotinilada. Después de 1-2 h a temperatura ambiente, se retiró la solución diana y las placas se lavaron diez veces con PBS/tensioactivo TWEEN^{TM} (TWEEN-20^{TM} al 0,05% en tampón PBS).

Los fagos de las bibliotecas descritas anteriormente se combinaron de la forma siguiente: combinación A constituida por fagos HL-300, combinación B de fagos HL-301, combinación C de fagos HL-302 y combinación D de fagos de las bibliotecas HL-303, HL-304, HL-305, HL-306, HL-307, HL-308 y HL-309. Se añadieron los fagos en PSB/TWEEN^{TM}/albúmina/biotina (tampón PSB/TWEEN^{TM} con biotina 1 \muM, albúmina de suero bovino 5 g/l u ovoalbúmina) a pocillos revestidos con cada diana y con pocillos de control que se revistieron con NEUTRAVIDIN^{TM} o con albúmina, pero no con diana biotinilada. Se dejó que los fagos se unieran 3-15 h a temperatura ambiente. Después, las placas se lavaron diez veces con tampón PBS/TWEEN^{TM}.

Los fagos restantes unidos a las placas se eluyeron mediante incubación con DTT 50 mM durante 1-2 h a temperatura ambiente. Los fagos eluidos se usaron para transfectar células de E. coli y se dejaron crecer durante una noche a 37ºC para amplificar los fagos.

El segundo y tercer ciclo de la selección de unión se llevaron a cabo como anteriormente, excepto por que se incluyó estreptavidina (0,1 mg/ml) en las combinaciones de fagos junto con biotina. Se tomó una alícuota de cada pocillo revestido con diana y de control incubado con cada biblioteca y se realizaron diluciones seriadas de los fagos diluidos para medir la unión específica a la diana. Después, los fagos diluidos se usaron para transfectar células de E. coli y se sembraron en placas para el recuento de colonias.

La cuarta vuelta de la selección de unión se llevó a cabo en placas MAXISORP^{TM} revestidas directamente con 2 \mug/ml de cada proteína diana o sólo con albúmina. Los resultados de las selecciones de unión de fagos en los ciclos 2-4 se muestran en la Figura 2.

Se utilizaron también las mismas bibliotecas de fagos iniciales (A, B, C y D) para selecciones de unión para IGFBP-3 revestida directamente. En este caso, se revistieron placas de plástico de 96 pocillos MAXISORP^{TM} (Nunc) con una solución de 2 \mug/ml de IGFBP-3 en tampón carbonato sódico 50 mM a pH 9,6 durante una noche a 4ºC. Después, se retiró la solución diana y las placas se incubaron con una solución de bloqueo de 5 g/l de albúmina de suero bovino, durante 1-2 h a temperatura ambiente. Los fagos se incubaron con las placas como anteriormente y se retiraron mediante lavado los fagos no unidos. Los fagos restantes unidos se eluyeron mediante incubación con HCl 20 mM durante 10 min a temperatura ambiente. A partir entonces, los fagos eluidos con ácido se neutralizaron con un quinto de volumen de Tris-HCl 1 M a pH 8,0. Los fagos se usaron para transfección para el recuento de colonias como se ha descrito anteriormente.

Selección de clones de fagos polivalentes (ensayos de fagos que bloquean a IGF)

Se aislaron clones de péptidos en fagos mediante la mezcla de combinaciones de fagos con células de E. coli y siembra en placas sobre medios que contenían antibióticos. Se aislaron colonias y se cultivaron con fago auxiliar (como anteriormente) para obtener ADN monocatenario para secuenciación. Se dedujeron las secuencias peptídicas seleccionadas por su unión a IGFBP-3 o IGF-1 a partir de las secuencias de ADN de los clones de fagémidos. Se representan varios de dichos clones mediante las secuencias peptídicas en las Tablas II y III, respectivamente.

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Dichos clones de péptidos en fagos pueden representar péptidos de unión a diana específicos que bloqueen o no la unión del ligando (IGF-1 a IGFBP-3), o cualquiera de varios miembros que no se unen o de fondo de la combinación seleccionada. Para distinguir entre estas posibilidades, se ensayaron los clones de fagos para determinar la capacidad para unirse a IGFBP-3 en presencia y ausencia de IGF-1.

Se revistió IGFBP-3 directamente sobre placas MAXISORP^{TM} como anteriormente. Se mezclaron fagos de cultivos de clones con IGF-1 (concentración final 100 mM) y se incubaron con la IGFBP-3 inmovilizada durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, las placas se lavaron diez veces, como anteriormente, y se añadió una solución de anticuerpo de conejo anti-fago mezclado con un conjugado de cabra anti-conejo con peroxidada de rábano rusticano. Después de una incubación de 1 hora a temperatura ambiente, las placas en revelaron con un sustrato cromogénico, o-fenilendiamina (Sigma). La reacción se detuvo con la adición de 1/2 volumen de H_{2}SO_{4} 2,5 M. Se midió la densidad óptica a 490 nm en un lector de placas espectrofotométrico.

La titulación de varios clones de péptidos en fagos seleccionados por IGFBP-3 mostró que todos se inhibían por IGF-1 para la unión a IGFBP-3 a cierta concentración de fagos (Figs. 3 y 4). Por lo tanto, es probable que estos péptidos ocupen un sitio solapante con el epítopo de unión a IGF sobre IGFBP-3. Se seleccionaron clones de péptidos en fagos adicionales de forma similar, a una baja concentración de fagos con y sin IGF-1.

La Figura 5 muestra los resultados de un ensayo de bloqueo de varios clones de fagémidos procedentes de tres vueltas de elución con DTT, seguidas de una vuelta de elución con HCl, como se ha descrito anteriormente. En cada caso, el clon de fagémido se cultivó a partir de una única colonia durante una noche a 37ºC en un volumen de cultivo de 5 ml. Las partículas de fago se precipitaron y se resuspendieron en 0,5 ml de tampón de PBS. Se realizó una dilución de 50 veces de cada solución de fagos en tampón PBS/TWEEN^{TM} y los fagos se incubaron con o sin IGF-1 100 nM en una placa MAXISORP^{TM} revestida con IGFBP-3. Como se muestra la Figura 5, la mayoría de los clones se inhibieron >40% para unión a IGFBP-3 a estas concentraciones de fagos, aunque el clon 4D3.11 sólo se inhibió el 5% en estas condiciones.

La Figura 6 muestra los resultados de un ensayo de bloqueo de varios clones de fagémidos procedentes de tres vueltas de elución con HCl, comos se ha descrito anteriormente. En cada caso, el clon de fagémido se cultivó a partir de una única colonia durante una noche a 37ºC en un volumen de cultivo de 5 ml. Las partículas de fago se prepararon como se ha descrito anteriormente. En este caso, como se muestra en la Figura 6, la mayoría de los clones se inhibieron >80% para unión a IGFBP-3 a estas concentraciones de fago, aunque los clones 23A3.3 y 23A3.5 se inhibieron sólo aproximadamente el 20% en estas condiciones.

La variación en el grado al que se bloquea la unión del fago mediante una concentración constante de IGF-1, como función de la dilución del fago (Fig. 3) o como función del péptido presentado (Figs. 5-6) es de interés porque, sin limitarse a teoría alguna, puede ser predictivo de (1) el grado de solapamiento entre epítopos de unión a IGF-1 y a péptido en la molécula de IGFBP-3, y/o (2) la afinidad relativa de IGF-1 frente al péptido presentado en fagos para unión a IGFBP-3. Puesto que todos los clones de péptidos en fagos ensayados en este documento demostraron cierto grado de inhibición de IGF-1, es probable que el epítopo para la unión del péptido en IGFBP-3 para cada uno se encuentre en el interior de un área ocupada por IGF-1 unido. Los ensayos de péptidos (véase a continuación) apoyan esta conclusión (es decir, caso 1). Por otro lado, sin limitarse a teoría alguna, es posible que algunos epítopos peptídicos puedan estar simplemente dentro de un área para la que la unión de la partícula de fago que presenta dichos péptidos está estéricamente excluida por IGF-1 unido.

La dependencia de la inhibición de la concentración de fago y las diferencias entre clones de fagos (Fig. 3) puede reflejar el caso 2. En particular, los clones de fagos cuya unión a una placa revestida con IGFBP-3 se inhibió sólo a bajas concentraciones de fagos (por ejemplo, 4D3.3 y 4B3.4, que se corresponden con los péptidos BP3-01-ox y BP3-02-ox, respectivamente) parecen producir péptidos de mayor afinidad (véase a continuación) por IGFBP-3 que los clones de fagos cuya unión a una placa revestida con IGFBP-3 se inhibió a concentraciones de fago tanto elevadas como bajas (por ejemplo, 4C3.2 y 4D3.5, que se corresponden con los péptidos BP-23 y EP-24, respectiva-
mente).

Por lo tanto, este tipo de ensayo de bloqueo de titulación de fagos puede ser útil, generalmente, como un medio para predecir las afinidades relativas y las potencias inhibidoras de péptidos procedentes de bibliotecas de presentación de fagos.

Presentación monovalente (g3) de péptidos que se unen a IGFBP-3

Puede efectuarse con eficacia la maduración por afinidad de una secuencia peptídica o proteica mediante vueltas sucesivas de mutagénesis aleatoria, selección y propagación cuando el número de copias de péptidos o proteínas presentadas es limitado (Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)). Dicho proceso de maduración por afinidad se ilustra mediante la maduración por afinidad de hGH (Patente de Estados Unidos Nº 5.534.617). En este caso, el número de copias de hGH presentado se limitó mediante fusión de la proteína presentada con g3, en lugar de con g8 de partículas de bacteriófago, restringiendo el nivel de expresión de hGH y usando un fago auxiliar para suministrar g3p de tipo silvestre para la encapsulación y propagación del fagémido.

Para seleccionar para variantes peptídicas de mayor afinidad a partir de combinaciones de fagos que presentan péptidos sobre g8p, se transfirieron ADNc de péptidos de 4 combinaciones de bibliotecas de g8 de dos vueltas, 4B y 4D, en un vector de g3 para presentación de fagos monovalente. Se llevaron a cabo selecciones de unión durante tres vueltas, como se ha descrito anteriormente, eluyendo con ácido los fagos unidos.

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Se muestran en la Tabla IV secuencias peptídicas obtenidas después de tres vueltas de selección. Dos clones, 4B3.3 y 4D3.11, dominaban las combinaciones seleccionadas, y se observaron en las selecciones de fagos g8 más tempranas. Un tercer clon, 3Ai.2, representa una nueva secuencia peptídica que no se identificó a partir de la presentación en g8. En ensayos de competición de ELISA de fagos, la afinidad aparente de los clones g3-4B3.3 y g3-4B3.11 fue <100 nM; sin embargo, los péptidos correspondientes demostraron una inhibición mucho más débil (véase a
continuación).

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Se prevé que pueden obtenerse mejoras de la afinidad mediante mutación, selección y propagación de forma repetida de bibliotecas de péptidos en fagos, como se ha descrito para hGH. Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.534.617.

Ensayos peptídicos

Se sintetizaron los péptidos que se corresponden con varias secuencias procedentes de fagos. En los casos en los que se encontraron dos restos de Cys en la secuencia peptídica, se preparó y se purificó la forma monomérica disulfuro (oxidada o sufijo "ox") del péptido. En los casos en los que se encontraron cuatro restos de Cys, se preparó y se purificó la forma {1-4, 2-3}-disulfuro.

Se ensayó la capacidad de estos péptidos para unirse a IGFBP-3 y bloquear la unión de IGF-1 en uno o más de los siguientes ensayos.

Ensayo de competición de BIACORE^{TM}(para agentes de unión a IGFBP-3)

Se inmovilizó IGF-1 sobre una microplaca de dextrano para ensayos de inhibición usando un dispositivo de resonancia de plasmón superficial de BIACORE^{TM} 2000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) para medir proteína de unión libre. Se biotiniló IGF-1 como se ha descrito anteriormente y se inyectó sobre una microplaca a la que se había acoplado estreptavidina (BlAcore, Inc.) para dar de 400 a 800 RU (unidades de respuesta) de IGF-1 inmovilizado. El IGF-1 no mostró una disociación detectable durante el curso de tiempo de cada experimento. Se mezclaron diluciones seriadas de péptido con una concentración constante (40 nm) de IGFBP-3. Después de la incubación durante \geq1 hora a temperatura ambiente, se inyectó una alícuota de 20 \mul a una velocidad de flujo de 20 \mul/min sobre la microplaca de IGF-1. Después de la inyección, se tomó una lectura de la respuesta para medir la cantidad relativa de IGFBP-3 unida al IGF-1.

Los resultados (Figs. 7-8) muestran una curva de dosis-respuesta para la inhibición de cada péptido de la unión de IGFBP-3 a la microplaca. En particular, los inhibidores más eficaces de la unión de IGFBP-3 ensayados fueron los péptidos BP3-01-ox (que se corresponden con el clon de fagos 4D3.3) y una forma truncada de este péptido, BP3-15 (véase la Tabla V). En esa tabla, se formó un enlace disulfuro entre los dos restos de Cys de cada péptido que contenía 2 Cys. Para péptidos que contenían cuatro cisteínas, los dos restos de Cys* forman un disulfuro y los restantes dos forman un segundo disulfuro. Estos péptidos mostraron CI50 de 2 \muM y 0,75 \muM, respectivamente. Otros péptidos, tales como BP3-4D3.11 (clon de fagos 4D3.11 de presentación en g8 y 3Bi.1 de presentación en g3) demostraron una inhibición con CI50 de <10 \muM.

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IGFBP-1 no mostró unión a IGF-1 inmovilizado de esta forma.

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en la que nh2 significa que el péptido se ha bloqueado con una amida y en la que C* indica una cisteína que se ha unido a otra cisteína en el péptido. Las parejas de Cys restantes también están oxidadas como disulfuros en cada péptido.

Ensayo de IGF radiomarcado (para agentes de unión a IGFBP-3)

Como un ensayo adicional de la actividad peptídica, se ensayaron varios péptidos en un ensayo usando IGF-1 marcado con ^{125}I para medir la inhibición de la unión a IGFBP, como se ha descrito anteriormente (Ensayo 3). Se añadieron diluciones seriadas de péptidos a una placa de IGFBP-1 o de IGFBP-3. A partir de entonces, se añadió IGF-1 marcado con ^{125}I y las placas se incubaron durante 2 horas. Después, las placas se lavaron y se contaron para determinar la cantidad de IGF-1 unido.

La Figura 9 muestra la inhibición de los péptidos seleccionados con IGFBP-3, BP3-01-ox y BP3-02-ox para la unión de IGF-1 a una placa de IGFBP-3. Por el contrario, estos péptidos no inhibieron la unión de IGF-1 a una placa revestida con IGFBP-1 (Fig. 10).

Activación in vitro (KIRA)

Se ensayó la capacidad de varios péptidos sintéticos para bloquear la unión de IGF-1 a IGFBP y liberar IGF-1 funcional en un ensayo de KIRA de actividad de IGF-1, como se ha descrito anteriormente. Se trataron células con péptidos solo, péptido más IGF-1 más IGFBP-1, péptido más IGF-1 y péptido más IGF-1 más IGFBP-3. Los resultados se muestran en las Figuras 11A-D, respectivamente.

Mientras que BP3-01-ox tiene una afinidad menor por la IGFBP que las otras moléculas ensayadas en este ensayo, el hecho de que BP3-01-ox inhibe la unión de IGFBP-3 a IGF-1 es, en sí, útil para diversos finos, incluyendo para la LIFA y otros ensayos indicados anteriormente. Además, el ensayo de KIRA sólo usaba IGF-1; no usaba IGF-2 y se descubrió que BP3-01-ox inhibía la unión de IGFBP-3 a IGF-2, como se indica en el ensayo de competición que se describe a continuación.

Ensayo de competición de BIACORE^{TM} (para agentes de unión a IGFBP-3)

Se inmovilizó IGF-2 sobre una microplaca de dextrano para ensayos de inhibición usando un dispositivo de resonancia de plasmón superficial de BIACORE^{TM} 2000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) para medir proteína de unión libre. Se biotiniló IGF-2 como se ha descrito anteriormente y se inyectó sobre una microplaca a la que se había acoplado estreptavidina (BIAcore, Inc.) para dar aproximadamente 1500 RU de IGF-2 inmovilizado. El IGF-2 no mostró una disociación detectable durante el curso de tiempo de cada experimento. Se mezclaron diluciones seriadas de péptido con una concentración constante (20 nM) de IGFBP-3. Después de una incubación durante \geq1 hora a temperatura ambiente, se inyectó una alícuota de 20 \mul a una velocidad de flujo de 20 \mul/min sobre la microplaca de IGF-2. Después de la inyección, se tomó una lectura de la respuesta para medir la cantidad relativa de IGFBP-3 unida al IGF-2.

Los resultados (por ejemplo, véase la Fig. 12) muestran una curva de dosis-respuesta para la inhibición de cada péptido de la unión de IGFBP-3 a IGF-2. Los péptidos BP3-01-ox, BP3-14, BP3-15 y BP3-17 mostraron CI_{50} de 0,92 \muM, 1,0 \muM, 0,78 \muM y 5,1 \muM, respectivamente. Por lo tanto, estos péptidos inhiben la unión de IGFBP-3 tanto a IGF-1 como a IGF-2.

Ejemplo 2 Desplazamiento de IGF-1 de IGFBP usando BP3-15

Este ejemplo ensaya un péptido específico de IGFBP-3, BP3-15, para determinar su capacidad para bloquear la unión de ^{125}I-IGF-1 en suero humano. Se incubó suero humano con ^{125}I-IGF-1 \pm el péptido y se midió la cantidad de indicador unido a IGFBP mediante cromatografía de exclusión por tamaños. La adición del péptido dio como resultado una disminución de aproximadamente el 42% en ^{125}I-IGF-1 asociado con el complejo IGF/IGFBP-3/ALS de 150 kD y una disminución del 59% en la cantidad de ^{125}I-IGF-1 libre. El péptido no disminuyó la unión de ^{125}I-IGF-1 a las IGFBP de 44 kD (de hecho, la aumentó ligeramente), indicando que el péptido sólo compite con IGF-1 por la unión a IGFBP-3.

Estos resultados indican que el análogo (a 0,2 mM) puede competir con IGF-1 por la unión a IGFBP-3 en suero humano.

Ejemplo 3 Afinidad relativa de variantes de péptidos de unión a IGFBP-3

Se midieron las afinidades relativas de diversas variantes de BP3-01-ox mediante el ensayo de competición de BIACORE^{TM}. Los resultados se muestran en la Tabla VI. Puede observarse que 4D3.3P (SEC ID Nº: 6), BP3-30 (SEC ID Nº: 20), BP3-41 (SEC ID Nº: 23), BP3-40 (SEC ID Nº: 22), BP3-39 (SEC ID Nº: 21), BP3-28 (SEC ID Nº: 19), BP3-27 (SEC ID Nº: 18) y BP3-25 (SEC ID Nº: 17) tienen afinidades similares a o superiores a las de BP3-01-ox y se espera que aumenten la disponibilidad de IGF-1 en un ensayo de cultivo celular in vitro. La falta de una actividad medible para el péptido BP3-24 (SEC ID Nº: 126) indica el papel crítico que desempeña el disulfuro intacto en el mantenimiento de una conformación peptídica favorable para la unión a IGFBP-3, para esta serie de péptidos.

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Ejemplo 4 Exploración de bibliotecas adicionales para unión a IGFBP-3

Se diseñaron y se seleccionaron bibliotecas de péptidos en fagos polivalentes (g8) adicionales que produjeron dos péptidos que inhibían la unión IGFBP-3 a IGF-1. Los resultados, que se muestran en la Tabla VII, indican que BP3-107 (SEC ID Nº: 24) y BP3-108 (SEC ID Nº: 25) son inhibidores y se espera que aumenten la disponibilidad de IGF-1 en un ensayo de cultivo celular in vitro.

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TABLA VII Inhibición peptídica de la unión de IGFBP-3 a IGF-1 mediante competición de BIACORE^{TM}

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Ejemplo 5 Estructura/función de BP1-01 y maduración por afinidad A. Cinética de la unión de BP1-01 a IGFBP-1

El documento WO 98/45247, publicado el 15 de octubre de 1998, describe la preparación y caracterización del péptido desplazador de IGFBP-1 BP1-01 (CRAGPLQWLCEKYFG) (SEC ID Nº: 26). Se examinaron las cinéticas de variantes del péptido BP1-01 en un ensayo de BIACORE^{TM} (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) usando IGFBP-1 acoplada covalentemente mediante EDC/NHS (como se describe por el fabricante) a una microplaca de dextrano. El péptido BP1-01 presentaba cinéticas de disociación demasiado rápidas como para mediarlas. Sin embargo, BP1-02, la variante de 19 monómeros (SEVGCRAGPLQWLCEKYFG) (SEC ID Nº: 27) presentaba cinéticas medibles. La constante de velocidad de asociación fue de 2,30 x 10^{5} M^{-1} s^{-1} y la constante de velocidad de disociación fue de 5,03 x 10^{-2} s^{-1}. Esta última implica una vida media para la disociación del péptido de IGFBP-1 de aproximadamente 28 s. La constante de velocidad de asociación es moderadamente rápida, coherente con la idea de que el péptido puede no experimentar un cambio conformacional significativo tras la unión a IGFBP-1.

B. Mutagénesis por detección de péptidos BP1-01

Se generaron dos series de variantes de péptidos sintéticos para determinar qué cadenas laterales del péptido BP1-01 podían contribuir directamente a la unión a IGFBP-1. En la primera serie, se usó un enfoque de detección de alanina (Cunningham y Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)) para eliminar la porción de cada cadena lateral al otro lado del carbono beta. Después, se evaluó la contribución de estos átomos a la energía libre de unión del péptido a IGFBP-1 mediante la medición de la potencia (CI50) de la variante para inhibir la unión de IGFBP-1 a IGF-1 o IGF-2 en un ensayo de competición de BIAcore^{TM} análogo al que se ha descrito para IGFBP-3. Los resultados se muestran en la Tabla VIII.

Una segunda serie de péptidos hacía uso de aminoácidos no naturales para investigar si otras características estructurales tales como un grupo metilo añadido en el carbono alfa o un isómero (D-alanina) podrían afectar a la unión del péptido a IGFBP-1. Las potencias de estos péptidos se midieron mediante ensayo de ELISA de IGFBP-1 biotinilada, mostrándose los resultados en la Tabla IX. Estos resultados confirman la importancia de las cadenas laterales L6, L9, W8 e Y13 en la unión de BP1-01 a IGFBP-1. También se sugieren contribuciones estructurales por los efectos de sustituciones en R2 y A3.

Por el contrario, algunas sustituciones, tales como sustituciones aib en G4, Q7, E11, K12 y F14 tenían un escaso o ningún efecto sobre la afinidad de unión. No obstante, pueden ser útiles péptidos que incluyen una o más de estas sustituciones porque los aminoácidos no naturales a menudo confieren a un péptido una mayor resistencia a proteolisis (véase Schumacher et al., Science, 271: 1854 (1996) y la bibliografía de la misma). Dichos péptidos pueden conseguir una vida media más larga en suero que los que sólo tienen aminoácidos naturales.

En vista de los resultados que se muestra en la Tabla IX, se espera que los péptidos con una D-alanina sustituida en la posición 2, 3 ó 6 de BP1-01 o con un alfa-aminoisobutirato sustituido en la posición 7, 8, 9, 11, 12, 13 ó 14 aumentarán la disponibilidad de IGF-1 en un ensayo de cultivo celular in vitro.

Por último, se determinaron las afinidades relativas de diversas variantes C-terminales de BP1-01 mediante ELISA, como se muestra en la Tabla X. Estos datos muestran que la región C-terminal del péptido es importante para la unión. Sólo el péptido BP1-18 (SEC ID Nº: 37) conservó una actividad inhibidora medible para la unión IGF-1:IGFBP-1. Se espera que este péptido aumentará la disponibilidad de IGF-1 en un ensayo de cultivo celular in vitro.

Tomados en conjunto, los datos de estructura-función sugieren que podría diseñarse un compuesto más pequeño, incluyendo un no peptidilo, para mimetizar la acción del péptido BP1-01 mediante la inclusión de elementos en el extremo C-terminal de este péptido junto con las cadenas laterales L6, L9, W8 e Y13.

TABLA VIII Afinidades relativas de variantes peptídicas por mutación mediante alanina de BP1-01 por BIACORE^{TM}

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TABLA IX Afinidades relativas de variantes peptídicas no naturales de BP1-01 por ELISA (a = D-alanina; aib = alfa-aminoisobutirato)

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TABLA X Afinidades relativas de variantes C-terminales de BP1-01 por ELISA

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C. Selección polivalente (g8) de bibliotecas secundarias de BP1-01

Se usaron codones NMS para generar diversas bibliotecas de péptidos como se ha descrito anteriormente. Se realizaron selecciones por afinidad mediante la unión en solución de fagos a IGFBP-1 biotinilada (preparada como se ha descrito anteriormente) en solución para minimizar los efectos de avidez. Se usó una estrategia similar para selecciones anticuerpos en fagos en Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889 (1992). Para cada vuelta de selección, se redujo la cantidad de diana para seleccionar para variantes de afinidad mejorada. Típicamente, se bloquearon previamente 10^{9}-10^{10} fagos purificados con MPBST (leche desnatada al 5% en PBS + TWEEN^{TM} 20 al 0,05%) durante 1 h a temperatura ambiente y se exploraron para determinar la unión a diana biotinilada. Se describen a continuación las condiciones de unión. Se capturaron los fagos que se unían a la diana mediante incubación con perlas magnéticas con estreptavidina (Promega Corp., Madison, Wl) durante 2-5 minutos a temperatura ambiente. Después de la unión, las perlas se lavaron con PBS-TWEEN^{TM}/MPBST diez veces antes de eluir con HCl 0,1 M. El eluido se neutralizó inmediatamente con 1/3 de volumen de TRIS 1 M a pH 8,0. El fago eluido se propagó por infección de XL1 para el siguiente ciclo de selección. Las vueltas 1, 2 y 3 se llevaron a cabo con 400 nM, 200 nM y 20 nM de diana, respectivamente, con incubaciones de 1 h. La vuelta 4 se llevó a cabo con 4 nM de diana durante una noche. Todas las reacciones de unión se realizaron a temperatura ambiente.

Las mutaciones identificadas se muestran en la Tabla XIII del documento WO 98/45247 y las afinidades relativas mediante ensayo en placa de ELISA o BIAcore^{TM} se muestran en la tabla XI a continuación. Puede observarse que BP1-10 (SEC ID Nº: 29), BP1-11 (SEC ID Nº: 30), BP1-12 (SEC ID Nº: 31), BP1-13 (SEC ID Nº: 32), BP1-15 (SEC ID Nº: 34), BP68 (SEC ID Nº: 45), BP1027 (SEC ID Nº: 48), BP1028 (SEC ID Nº: 49), BP1029 (SEC ID Nº: 50) y BP1030 (SEC ID Nº: 51) tienen una afinidad comparable o superior a la de BP1-02 y BP1-01 y, por lo tanto, se espera que aumenten la disponibilidad de IGF-1 en un ensayo de cultivo celular in vitro.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA XI Afinidades relativas de BP1-01 en g8 seleccionadas mediante ensayo en placa de ELISA o BIAcore^{TM}*

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D. Selección monovalente (g3) de bibliotecas secundarias de BP1-01

Se llevaron a cabo selecciones monovalentes (g3) de bibliotecas secundarias de BP1-01 esencialmente como se ha descrito en la parte C anterior. Los moldes contenían el codón de terminación TAA en los sitios de dirección para la aleatorización o una secuencia de unión de BP1-01 no relacionada en absoluto. Las condiciones de selección fueron como se describen a continuación, reemplazando la leche con BSA en el tampón de bloqueo. Se capturaron los complejos fago-diana mediante perlas magnéticas con estreptavidina (Promega Corp., Madison, WI). Se preincubó diana biotinilada con fago durante 1-3 h a temperatura ambiente en cada vuelta, reduciéndose las concentraciones de diana desde 200-500 nM en la vuelta 1, hasta 50-100 nM en la vuelta 2, 10-50 nM en la vuelta 3 y 1-20 nM en la vuelta 4.

Las mutaciones identificadas se muestran en la Tabla XV del documento WO 98/45427 y las afinidades relativas, determinadas mediante ensayo de competición de BIAcore^{TM} o mediante ensayo en placa de ELISA (llevado a cabo como anteriormente, excepto por que se usó acetonitrilo al 5% para la solubilidad del péptido), de varios péptidos seleccionados se muestran en la Tabla XII a continuación. BP1-16 (SEC ID Nº: 35), una versión de 13 restos de BP1-01 (que carece de la Gly C-terminal), tenía una afinidad similar a la de BP1-01. Sustituciones en los extremos N-terminal o C-terminal produjeron mejoras de la afinidad. Por ejemplo, en comparación con BP1-16, la adición de la secuencia STY en el extremo C-terminal produjo aproximadamente una mejora de afinidad de 3 veces para el péptido BP1-21B. Se observó un efecto similar en el contexto del de 18 monómeros: en concreto, se observó una mejora de 3 veces entre BP1-14 y BP1-21A. La sustitución del motivo S N-terminal por G también mejoró la afinidad en 2 a 3 veces en los péptidos BP1-19 y BP1-20. Todos estos péptidos tenían una afinidad aparente similar o mejorada por IGFBP-1 en comparación con BP1-01 y BP1-02 y, por lo tanto, se espera que aumenten la disponibilidad de IGF-1 en un ensayo de cultivo celular in vitro.

TABLA XII Afinidades relativas de BP1-01 en g3 seleccionadas mediante BIACORE^{TM} o ensayo en placa de ELISA*

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Ejemplo 6 Mutagénesis mediante alanina de IGF-1 y análogos estructurales de IGF-1 Introducción

Se usó un procedimiento de mutagénesis mediante alanina (Cunningham y Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989); Patente de Estados Unidos Nº 5.834.250) para eliminar la porción de cada cadena lateral de IGF-1 al otro lado del carbono beta. Después, se evaluó la contribución de estos átomos a la energía libre de unión del análogo de IGF-1 a IGFBP-1 o a IGFBP-3 mediante ELISA de fagos competitivo. En este ensayo, se usa IGFBP-1 o IGFBP-3 para inhibir la unión de mutantes de fagos de IGF a una placa inmunoabsorbente revestida con IGFBP-1 o IGFBP-3. Puede calcularse la unión (CI_{50}) a partir de una serie de titulación de proteína de unión. También se evaluaron algunos mutantes para determinar su unión directa en ensayos de BIACORE^{TM}.

Materiales y métodos Construcción de un vector fagémido y mutagénesis

Se amplificó el gen que codifica el IGF-1 humano maduro a partir de pBKIGF2B (Patente de Estados Unidos Nº 5.342.763) usando cebadores de PCR 5'-AGC TGC TTT GAT ATG CAT CTC CCG AAA CTC TGT GCG GT-3' (SEC ID Nº:127) y 5'-GAG CGA TCT GGG TCT AGA CAG ATT TAG CGG GTT TCA G-3' (SEC ID Nº: 128). El fragmento resultante se cortó con NsiI y XbaI y se ligó en un pH0753 digerido previamente con NsiI y XbaI. El pH0753 es un derivado de phGHam-g3 (Lowman et al., Biochemistry, 30: 10832-10838 (1991)) en el que se ha delecionado el sitio XbaI adicional en la región del promotor de la fosfatasa alcalina (PhoA) usando el oligonucleótido 5'-AAA AGG GTA TGT AGA GGT TGA GGT-3' (SEC ID Nº: 129). El vector pH0753 ligado que contenía la fase de lectura abierta del IGF-1 se denominó pIGF-g3. Codifica un IGF-1 que lleva una doble mutación G1S-A70V fusionada a un fragmento de la proteína del gen III (restos 249-406) del bacteriófago de E. coli M13. Se descubrió que la unión de esta variante de IGF-1 a IGFBP-1 e IGFBP-3 era indistinguible de la del IGF-1 de tipo silvestre. Se realizó mutagénesis mediante alanina usando un plásmido pIGF-g3 de cadena sencilla como molde (Kunkel et al., Methods Enzymol., 204: 125-139 (1991)). Todos los restos de IGF-1, excepto las cisteínas y alaninas, se reemplazaron individualmente por alanina. Las construcciones resultantes se verificaron mediante secuenciación de ADN.

Unión de mutantes de IGF presentados en fagos a IGFBP-1 e IGFBP-3 (ELISA de fagos)

Se revistieron placas inmunoabsorbentes (Nunc, MAXISORP^{TM}, 96 pocillos) con 100 \mul/pocillo de IGFBP-1 o IGFBP-3 1 \mug/ml en tampón PBS a pH 7,2 a 4ºC durante una noche. Después, las placas se bloquearon con TWEEN20^{TM} al 0,5%/PBS (también usado como tampón de unión) durante 2 horas a temperatura ambiente (se evitaron agentes bloqueantes proteináceos como albúmina de suero bovino para evitar una contaminación potencial de IGF o IGFBP). Se cultivaron células de E. coli (XL1-Blue, Stratagene) recién transformadas con vector fagémido durante una noche en 5 ml de medio 2YT (Sambrook et al., anteriormente) en presencia de fago auxiliar M13-VCS (Stratagene). Se recogieron las partículas de fago y se resuspendieron en tampón PBS como se describe en Lowman, H. B., "Phage Display of Peptide Libraries on Protein Scaffolds", en Cabilly, S. (ed.), Combinatorial Peptide Library Protocols (Humana Press Inc.: Totowa, NJ, 1998), págs. 249-264. Después, se normalizaron las concentraciones de fago para producir una señal máxima de ELISA de 0,2-0,4 para cada mutante (Lowman, en Cabilly, S. (ed.), anteriormente). Se prepararon diluciones seriadas de 3 veces de competidor soluble sobre placas de microtitulación no absorbentes (Nunc, F, 96 pocillos) con tampón de unión (TWEEN^{TM} al 0,5%/PBS) que contenía fagos a las concentraciones determinadas anteriormente. El intervalo de dilución de proteína competidora abarcaba seis órdenes de magnitud partiendo de 5 \muM para IGFBP-1 y 500 nM para IGFBP-3. Después del bloqueo, las placas que contenían diana inmovilizada se lavaron con tampón TWEEN^{TM} al 0,5%/PBS y posteriormente se incubaron con 80 \mul/pocillo de las soluciones de fago-competidor premezcladas durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se detectó el fago unido con 80 \mul/pocillo de una solución que contenía un anticuerpo primario policlonal de conejo anti-fago y un conjugado de anticuerpo monoclonal secundario de cabra anti-conejo con peroxidada de rábano rusticano en TWEEN 20^{TM} al 0,5%/PBS. Se usaron o-fenilendiamina (Sigma) y tetrametilbenzidina (Kirkegaard and Perry) como sustratos cromogénicos, dando como resultado la detección de producto a 492 y 450 nm respectivamente. Se determinaron los valores de CI_{50} ajustando los datos de unión a una curva de saturación genérica (Lowman, en Cabilly, S. (ed.), anteriormente). Se ensayaron al menos dos clones individuales de cada mutante de IGF-1. Los números de la Tabla XIII representan la media \pm la desviación típica de valores de CI_{50} evaluados individualmente.

Expresión y purificación de IGFBP-1 e IGFBP-3

Se expresó IGFBP-1 humana en células CHO y se purificó a partir del medio condicionado como se describe en Mortensen et al., Endocrinology, 138: 2073-2080 (1997). También se ha clonado y expresado en células de mamíferos IGFBP-3 humana recombinante (Wood et al., Mol. Endocrinology, 2: 1176-1185 (1988)). La purificación a partir del medio condicionado siguió esencialmente el procedimiento que se describe para IGFBP-1, con el uso de una columna de afinidad de IGF (Martin y Baxter, J. Biol. Chem., 261: 8754-8760 (1986)).

Expresión y purificación de mutantes de IGF-1 solubles

El plásmido pBKIGF2B (Patente de Estados Unidos Nº 5.342.763) se expresa IGF-1 humano de tipo silvestre fusionado al péptido líder de lamB bajo el control del promotor PphoA. Para facilitar la mutagénesis dirigida se introdujo el origen de replicación f1 de fagos (f1 ori) en un plásmido pBKIGF2B. Con este fin, se escindió de pH0753 un fragmento BamHI de 466 pb que contenía el f1 ori (Lowman et al., anteriormente, 1991), mientras que el plásmido pBKIGF2B se linealizó con EcoRI. Tanto el vector como el fragmento se trataron con enzima Klenow para rellenar los extremos protuberantes de los sitios de restricción antes de la ligación de extremos romos. Se seleccionaron construcciones correctas por su capacidad para producir ADN monocatenario de fagémidos en presencia de fago auxiliar M13VCS. El vector fagémido resultante se denominó pBKIGF2B-f1-ori y se usó como molde para construir los mutantes de alanina de IGF-1 de interés (véase la Tabla XIV) usando el procedimiento de Kunkel et al., Methods Enzymol., 204: 125-139 (1991)). Cada etapa de mutagénesis se confirmó mediante secuenciación de ADN.

La expresión de mutantes de IGF-1 fue como se ha descrito para el IGF-1 de tipo silvestre (Joly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 2773-2777 (1998)), pero sin sobreexpresión transitoria de oxidorreductasas. El procedimiento de purificación se basaba en un protocolo anterior (Chang y Swartz, "Single-Step Solubilization and Folding of IGF-1 Aggregates from Escherichia coli" en Cleland, J. L. (ed.), Protein Folding In Vivo and In Vitro (American Chemical Society, Washington, DC, 1993), págs. 178-188), con adaptaciones minoritarias. Típicamente, se resuspendieron 6 g de pasta celular húmeda (equivalentes a 2 litros de medio bajo en fosfato cultivado durante 24 h) en 150 ml de Tris-HCl 25 mM a pH 7,5 que contenía EDTA 5 mM. Se lisaron las células en un microfluidificador (Microfluidics Corp., Newton, MA) y se recogieron las partículas refractarias que contenían agregados de IGF-1 acumulados mediante centrifugación a 12.000 x g. Las partículas refractarias se lavaron dos veces con tampón de lisis, dos veces con tampón de lisis que contenía N-lauroil-sarcosina al 1% (Sigma), para extraer proteínas de membrana, y dos veces con tampón de lisis de nuevo. Los cuerpos refractarios lavados se resuspendieron a aproximadamente 2mg/ml en tampón CAPS (ácido 3-(ciclohexilamino)-1-propanosulfónico; Sigma) 50 mM a pH 10,4, que contenía urea 2 M, NaCl 100 mM, MeOH al 20% y DTT 2 mM. Este procedimiento combina solubilización de cuerpos refractarios y posterior replegamiento oxidativo de mutantes de IGF-1 (Chang y Swartz, anteriormente). Después de 3 h a temperatura ambiente, las soluciones de replegamiento se filtraron a través de membranas microconcentradoras (Centricon, Amicon) con un peso molecular de corte de 50 kDa. Se recuperó la mayoría del IGF-1 monomérico en el eluido, mientras que los contaminantes de mayor peso molecular se concentraron en el material retenido. En este punto, las fracciones de IGF-1 eran >95% puras, a juzgar por el análisis de SDS-PAGE. Para separar correctamente el IGF-1 unido por disulfuros del IGF-1 modificado (que contiene dos disulfuros no nativos; Hober et al., Biochemistry, 31: 1749-1756 (1992); Miller et al., Biochemistry, 32: 5203-5213 (1993)), las soluciones de replegamiento se acidificaron con ácido acético al 5% y se cargaron en una columna de HPLC semipreparativa Dynamax^{TM} C18 (Varian; 10,0 mm DI) a 4 ml/min. Los tampones eran H_{2}O/TFA al 0,1% (A) y acetonitrilo/TFA al 0,1% (B). La separación de los isómeros disulfuro se consiguió aplicando el siguiente gradiente: B al 0-30% en 20 min, B al 30-45% en 60 min. La proporción de IGF-1 nativo con respecto a IGF modificado era habitualmente de aproximadamente 2:1 para cada mutante, eluyéndose el IGF-modificado antes en el gradiente que el IGF-1 nativo. La masa molecular de cada mutante se verificó por espectrometría de masas. Después de la purificación por HPLC, las muestras se liofilizaron y se reconstituyeron a aproximadamente 1 mg/ml en tampón HEPES 100 mM a pH 7,4.

Mediciones cinéticas en biodetector

Las afinidades de unión de las variantes de IGF para IGFBP-1 e IGFBP-3 se determinaron usando un sistema de análisis de interacción cinética a tiempo real de BIACORE^{TM}-2000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) para medir las velocidades de asociación (ka) y de disociación (kd). Se activaron microplacas biodetectoras de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con EDC (clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) y NHS (N-hidroxisuccinimida) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la inmovilización, se inyectaron mutantes de IGF en acetato sódico 20 mM a pH 4,8 sobre la microplaca biodetectora a una concentración de 50 \mug/ml para producir aproximadamente 450-600 RU (unidades de respuesta de resonancia) de proteína acoplada covalentemente. Los grupos no reactivos se bloquearon con una inyección de etanolamina 1 M. Se llevaron a cabo mediciones cinéticas mediante inyección de diluciones seriadas de 2 veces (partiendo de 1 pM) de IGFBP-1 o IGFBP-3 en tampón de desplazamiento (PBS, TWEEN 20^{TM} al 0,05%, ovoalbúmina al 0,1%, azida sódica al 0,1%) a 25ºC usando una velocidad de flujo de 20 \mul/min. Se calcularon por separado las velocidades de asociación (ka) y de disociación (kd) usando un modelo de asociación de Langmuir^{TM}1:1 en el programa informático de evaluación de BIACORE^{TM} v. 3.0. Se calculó la constante de disociación del equilibrio (K_{D}) como K_{d}/K_{a}.

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Resultados Presentación de fagos monovalente de IGF-1

Para una detección de alanina rápida y completa de los 70 restos aminoacídicos de IGF-1, se determinó primero la proteína podría presentarse de forma monovalente en la superficie del fago M13 (Bass et al., anteriormente). La tecnología de presentación de fagos combina la ventaja de una rápida mutagénesis de ADN monocatenario con una fácil purificación de la proteína mutante resultante, simplemente mediante el aislamiento de las partículas de fago correspondientes (por ejemplo, Cunningham et al., EMBO J., 13: 2508-2515 (1994)). Se construyó un vector en el que se fusionó IGF-1 humano maduro al dominio carboxi-terminal del producto del gen III de M13. Esta construcción incluye la secuencia señal stII que dirige a la proteína de fusión al espacio periplásmico de E. coli y permite la presentación monovalente de la proteína (Bass et al., anteriormente; Lowman et al., anteriormente, 1991). Para los fines de la clonación, se cambiaron el primer y el último aminoácido de IGF-1; el mutante G1S-A70V resultante se usó como la construcción de molde para la posterior mutagénesis mediante alanina.

Cuando se aislaron partículas de fago que presentaban IGF-1 G1S-A70V y se ensayaron en un ELISA de fagos de competición de unión para determinar su afinidad por IGFBP, la CI_{50} determinada en ese experimento fue de 8,5 nM para IGFBP-1 y de 0,5 nM para IGFBP-3 (Fig. 13). Estos valores concuerdan muy bien con las constantes de disociación determinadas mediante BIACORE^{TM} usando IGF-1 de tipo silvestre (Heding et al., J. Biol. Chem., 271: 13948-13952 (1996)). Las afinidades de IGF-1 de tipo silvestre, determinadas mediante inmunoensayos radiactivos (RIA), son de -2,8 nM para IGFBP-1 y de -0,8 nM para IGFBP-3, confirmando adicionalmente los valores de CI_{50}, procedentes de ELISA de fagos. Además, las partículas de fago que presentaban IGF-1 G1S-A70V se capturaron eficazmente por 11 anticuerpos monoclonales independientes de ratón anti-IGF-1 inmovilizados sobre placas de microtitulación. Estos resultados en conjunto sugieren que la variante de IGF presentada está correctamente plegada y accesible en la superficie de las partículas de fago.

Mutagénesis mediante alanina de IGF-1 que se une a IGFBP-1 e IGFBP-3

Todos los restos de G1S-A70V IGF-1, excepto las cuatro alaninas nativas y las seis cisteínas, se sustituyeron individualmente por alanina usando el vector G1S-A70V IGF-1 gIII descrito como molde. Además, se construyeron los mutantes individuales S1G y V70A y la doble mutación que restaura el IGF-1 de tipo silvestre. Cada una de estas construcciones se expresó en E. coli y se presentó en fagos. Se determinaron los valores de CI_{50} para la unión a IGFBP-1 e IGFBP-3 mediante ELISA de fagos competitivo, como se muestra en la Figura 13. Se ensayaron al menos dos clones diferentes de cada mutante. Los valores de CI_{50} resultantes se enumeran en la Tabla XIII y la pérdida o ganancia de CI_{50} para cada mutante con respecto a G1S-A70V se representa en la Figura 14.

TABLA XIII Afinidades aparentes (CI_{50}) de variantes de IGF-1 para IGFBP-1 e IGFBP-3 determinadas mediante presentación de fagos^{a}

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La mayoría de los mutantes de alanina produjeron únicamente cambios minoritarios en los valores de CI_{50} en el ELISA de fagos. Es importante que el IGF-1 de tipo silvestre mostró las mismas afinidades por IGFBP-1 e IGFBP-3 que G1S-A70V, sobre cuyo fondo se realizaron las sustituciones con alanina (Tabla XIII, Fig. 14). Sólo unos pocos restos causaron pérdidas de afinidad considerables (> 10 veces) cuando se cambiaron a alanina: E3, G7, L10, V11, F25, R36, P39, F49 y P63 para unión a IGFBP-1; V11, R36, P39 y P63 para unión a IGFBP-3. Se ha señalado que las sustituciones con alanina de glicinas y prolinas pueden conducir a alteraciones estructurales de la estructura de la proteína (Di Cera, Chem. Rev., 98: 1563-1591 (1998)).

Sólo se encontraron unas pocas mejoras modestas en la afinidad de unión mediante reemplazos con alanina. S1A, D12A y D45A mostraron un aumento de aproximadamente dos veces en la unión a IGFBP-1, mientras que S35A y T41A mostraron un efecto similar para IGFBP-3. Sin embargo, los cambios de dos veces en los valores de CI_{50} están en el límite de precisión de estos experimentos.

Determinantes de especificidad de IGFBP

E3A, G7A, L10A, F25A y F49A mostraron un efecto diferencial en la unión a IGFBP-1 frente a IGFBP-3. Para estos cinco mutantes de alanina de IGF-1 individuales, la CI_{50} relativa para IGFBP-1 difería en más de cuatro veces de para IGFBP-3 (Fig. 14, Tabla XIII, especificidad relativa). E3A y F49A mostraron los factores de especificidad relativa mayores en este grupo. La sustitución de alanina de E3 no tuvo prácticamente ningún efecto sobre la afinidad de IGFBP-3 (1,4 veces), mientras que la unión a IGFBP-1 se debilitó 34 veces. Aún más espectacular, la afinidad de F49A se redujo más de 100 veces para IGFBP-1 pero sólo 3,6 veces para IGFBP-1. Este resultado se ilustró en una comparación directa mediante ELISA de fagos. Se añadieron partículas de fagos que presentaban IGF-1 F49A a pocillos revestidos con IGFBP-3 en presencia de IGFBP-1 soluble (Fig. 15A) o IGFBP-3 (Fig. 15B). En comparación con los fagos de control que presentaban IGF-1 G1S-A70V, la curva de unión de F49A cambió más de dos órdenes de magnitud en la competición con IGFBP-1 (Fig. 15A). Por el contrario, la curvas de unión fueron similares en la competición con IGFBP-3 y los valores de CI_{50} difirieron en menos de un factor de 4 (Fig. 15B). Por lo tanto, E3 y F49 son los dos determinantes de especificidad principales para la unión de IGFBP-1 en la molécula de IGF-1.

Los restos G7, L10 y F25 aparecían ser importantes para la unión de ambas IGFBP, aunque mostraban una pérdida de afinidad más pronunciada para IGFBP-1 que para IGFBP-3 cuando se sustituyen por alaninas. No se identificó ningún determinante de especificidad significativo para IGFBP-1, tal como un mutante que se una mucho más fuertemente a IGFBP-1 que a IGFBP-3. Sin embargo, las mutaciones E9A, D12A, F23A, Y24A, T29A, S34A y D45A tuvieron efectos ligeramente mayores (de aproximadamente 2 veces) sobre la unión a IGFBP-3 que sobre la unión a IGFBP-1.

Mediciones de BIACORE^{TM} de mutantes de IGF soluble purificado

Para la validación de los resultados obtenidos mediante ELISA de fagos, se expresaron y se purificaron mutantes de alanina específicos para su análisis cinético usando un instrumento de BIACORE^{TM}. Se determinó que la constante de disociación (K_{D}) de IGF-1 de tipo silvestre era de 13 nM para IGFBP-1 y de 1,5 nM para IGFBP-3 (Figs. 17A y 17B; Tabla XIV). La diferencia en afinidad para las IGFBP se debe a una velocidad de asociación (ka) de IGF-1 a IGFBP-3 10 veces más rápida (3,2 x 10^{5} frente a 3,2 x 10^{4} M^{-1} s^{-1}). Estos resultados se corresponden bien con los valores de CI_{50} absolutos determinados mediante ELISA de fagos (Figs. 13A y 13B; Tabla XIII). Como se esperaba, el doble mutante G1S-A70V mostró parámetros cinéticos esencialmente indistinguibles de los del tipo silvestre (Tabla XIV).

Se ensayaron V11A, R36A y P39A porque estas variantes no se habían presentado correctamente en fagos, en base a los experimentos de reconocimiento de anticuerpos (véanse anteriormente). R36A y P39A mostraron cinéticas de tipo silvestre para ambas proteínas de unión, mientras que V11A demostró una reducción de 5 veces en la afinidad tanto por IGFBP-1 como por IGFBP-3.

Además, se decidió examinar la variante soluble de IGF-1 T4A. Este resto se ha implicado en la unión a IGFBP-1 en publicaciones anteriores (Bayne et al., J. Biol. Chem., 263: 6233-6239 (1988); Clemmons et al., J. Biol. Chem., 265: 12210-12216 (1990)), pero había demostrado efectos modestos en los ensayos de fagos de este documento. El aumento en los valores de K_{D} de T4A con respecto al IGF-1 de tipo silvestre fue de aproximadamente 2-3 veces mayor que las proporciones de CI_{50} determinadas mediante ELISA de fagos (Tabla XIV). Se observó una discrepancia mayor entre los resultados obtenidos mediante fagos y el análisis biodetector para F16A. En este caso, los dos métodos difirieron en un factor de 4.

Se ha demostrado que las mutaciones en la primera región de \alpha-hélice tienen un efecto desestabilizante sobre la estructura de la proteína IGF (Jansson et al., Biochemistry, 36: 4108-4117 (1997)). Sin limitarse a teoría alguna, se piensa que la proteína de fusión g3 sobre la superficie del fago podría ser más estable que la proteína soluble purificada y vuelta a plegar. Esto se confirma con los resultados de BIACORE^{TM} obtenidos para F25A y F49A, dos restos localizados fuera de la hélice N-terminal estructuralmente sensible. Los cambios respectivos en los valores de K_{D} y CI_{50} concuerdan muy bien para estos dos mutantes (Tabla XIV). El efecto diferencial de F49A sobre la unión a las IGFBP se confirmó mediante el análisis de BIACORE^{TM}. Se midió una disminución de 70 veces en la afinidad para la unión a IGFBP-1 (Fig. 17C; Tabla XIV), mientras que la unión a IGFBP-3 se redujo sólo 4 veces (Fig. 17D; Tabla XIV).

TABLA XIV Parámetros cinéticos para la interacción de variantes de IGF-1 purificadas con IGFBP-1 e IGFBP-3 determinados mediante análisis de BIACORE^{TM} ^{a} Unión a IGFBP-1

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Papel de los restos N-terminales de IGF-1

Sorprendentemente, la interacción de IGFBP-3 se afectó generalmente mucho menos por las sustituciones de alanina que la interacción con IGFBP-1, a pesar del hecho de que IGFBP-3 se une a IGF-1 con una afinidad aproximadamente 10 veces mayor. Aparte de P63A, ningún mutante de alanina presentó una reducción > 6 veces en la afinidad por IGFBP-3 (Fig. 14; Tabla XIII).

Se ha demostrado anteriormente en experimentos de biodetector que des(1-3)-IGF-1 se une a IGFBP-3 con una afinidad reducida 25 veces (Heding et al., anteriormente). Esta forma de origen natural de IGF-1 carece de los tres primeros restos N-terminales y muestra una potencia mitógena aumentada, presumiblemente debida a su reducción en la unión a IGFBP (Bagley et al., Biochem. J., 259: 665-671 (1989)). Puesto que ninguna de las cadenas laterales de los tres primeros aminoácidos parece contribuir con ninguna energía a la unión de IGFBP-3 (Tabla I) y, sin embargo, des(1-3)-IGF-1 está comprometido en la unión a IGFBP-3, se hipotetiza, sin limitarse a teoría alguna, que podrían estar implicadas interacciones de la cadena principal.

Esta hipótesis se ensayó mediante presentación en fagos de un triple mutante de alanina (Ala(1-3)-IGF-1)), sustituyendo los tres primeros aminoácidos N-terminales. Si la cadena principal en esa región contribuye a la interacción con IGFBP-3, este mutante debería ser capaz de unirse. La unión a IGFBP-1, sin embargo, debería reducirse debido a la falta de la cadena lateral de E3 (Tabla I). Como control, se generó el mutante des(1-2)-IGF-1, que se ensayó para determinar cualquier interacción potencial de la cadena principal con IGFBP-1 en las posiciones 1 y 2. Como se esperaba, Ala(1-3)-IGF-1 mostró una afinidad por IGFBP-1 disminuida similar a E3A pero ningún cambio en su afinidad por IGFBP-3 (Fig. 14; Tabla XIII). Para des(1-2)-IGF-1, no se observó ninguna diferencia en la afinidad por ambas proteínas de unión. Si se combinan con las observaciones sobre des(1-3)-IGF-1 (Heding et al., anteriormente), estos resultados sugieren, sin limitarse a teoría alguna, que la cadena principal del péptido entre el resto 3 y el 4 de IGF-1 media importantes interacciones con IGFBP-3.

Discusión

Los epítopos de unión a IGFBP-1 e GFBP-3 funcionales sobre la superficie de IGF-1 se han investigado por mutagénesis mediante alanina. Ambos epítopos de unión se ilustran en la Figura 18. Las interacciones individuales de las cadenas laterales de IGF-1 desempeñan un papel mucho más importante para la unión a IGFBP-1 que para la unión a IGFBP-3. Se encuentran dos áreas de unión principales para IGFBP-1 (Fig. 18A). Una está situada sobre la cara superior de la hélice N-terminal (compuesta por G7, L10, V11, L14, F25, I43 y V44) y una en la cara inferior (compuesta por E3, T4, L5, F16, V17 y L54). Estas dos áreas de unión están conectadas mediante F49 y R50. Para IGFBP-3, el epítopo de unión es más difuso y se ha modificado para incluir G22, F23 e Y24 (Fig. 18B). La unión de IGFBP-3 es generalmente mucho menos sensible a las sustituciones con alanina. De hecho, la mayor reducción en la afinidad (aparte de P63A, véase a continuación) es una disminución de 6 veces observada para G7A. Este resultado es intrigante ya que IGFBP-3 se une con una afinidad 10 veces mayor a IGF-1 que lo hace IGFBP-1. Más probablemente, sin limitarse a teoría alguna, las interacciones que se originan de la estructura de la cadena principal de IGF-1 están contribuyendo a la unión de IGFBP-3. Esta hipótesis se apoya además en los experimentos con el mutante Ala(1-3)-IGF. Mientras que sustituciones individuales y triples con alanina no tienen ningún efecto sobre la unión de IGFBP-3, la deleción de los tres primeros aminoácidos dio como resultado una disminución de 25 veces en la afinidad (Bagley et al., anteriormente; Clemmons et al., Endocrinology, 131: 890-895 (1992); Heding et al., anteriormente). En resumen, IGF-1 usa diferentes modos de unión para asociarse con IGFBP-1 e IGFBP-3: unas pocas interacciones de las cadenas laterales de los aminoácidos son importantes para la unión a IGFBP-1, mientras que las interacciones de la cadena principal parecen desempeñar un papel energético clave para la unión a IGFBP-3.

Una publicación reciente ha investigado el epítopo de unión sobre IGF-1 para IGFBP-1 mediante espectroscopía de RMN heteronuclear (Jansson et al., J. Biol. Chem., 273: 24701-24707 (1998)). Los autores descubrieron que los restos 29, 30, 36, 37, 40, 41, 63, 65 y 66 de IGF-1, entre otros, experimentaban alteraciones de cambios químicos tras formarse el complejo con IGFBP-1 a 30ºC. Además, Jansson y colaboradores identificaron que R36, R37 y R50 eran parte del epítopo de unión funcional y ensayaron esos mutantes de alanina en experimentos de BIACORE^{TM}. El mayor cambio en la afinidad observado por estos autores fue una disminución de 3 veces para R50A. Sin embargo, debido a la flexibilidad estructural de IGF-1 ya observada en el primer estudio de RMN de la hormona (Cooke et al., anteriormente), Jansson et al. fueron incapaces de fijar completamente muchos restos en el espectro de RMN, incluyendo F49.

En estudios similares de superficies de contacto proteína-proteína se descubrió que sólo algunos restos de cadenas laterales contribuían al grueso de la energía libre de unión (Clackson y Wells, Science, 267: 383-386 (1995); Kelley et al., Biochemistry, 34: 10383-10392 (1995)). Esto mismo se mantiene para la interacción IGF-1-IGFBP-1. Sin embargo, en este documento, como se observó para la unión del factor tisular al factor VIIa, la magnitud de los valores de la energía libre de unión (\Delta\DeltaG) procedentes de importantes cadenas laterales es menor que en el caso de la hormona de crecimiento (Kelley et al., anteriormente). Los restos con contribuciones predominantes a AAG no se agruparon sobre la superficie de IGF-1 como en la superficie de contacto de la hormona de crecimiento-receptor (Clackson y Wells, anteriormente), pero aún formaron un epítopo de unión a IGFBP-1 continuo (Fig. 18A). Por el contrario, el epítopo de unión a IGFBP-3 sobre IGF-1 era discontinuo y las cadenas laterales contribuían con energías de unión individuales muy pequeñas.

La sustitución de P63 mediante alanina en IGF-1 da como resultado una afinidad disminuida para ambas proteínas de unión que no puede medirse en el intervalo de concentración usado en el ELISA de fagos de competición. Sin embargo, el resto P63 se localiza sobre el lado opuesto de la molécula de IGF-1 con respecto al epítopo de unión principal. Además, se ha observado que las sustituciones con alanina de glicinas y prolinas pueden conducir a cambios estructurales (Di Cera, anteriormente). Además, Jansson et al., 1998, anteriormente, concluyeron que la parte C-terminal de IGF-1 no está implicada los contactos directos con IGFBP-1, sino que experimenta cambios conformacionales indirectos tras la formación del complejo. Se ha llevado a cabo una extensa caracterización de sitios de unión a anticuerpos sobre IGF-1 por Mañes et al., Endocrinology, 138: 905-915 (1997). Demostraron la unión simultánea de IGFBP-1 o IGFBP-3 a IGF-1 en complejos con anticuerpos que reconocían el dominio D C-terminal. Estos resultados apoyan adicionalmente observaciones anteriores de que el dominio D, que comienza en el resto P63, no está implicado en la unión de IGFBP-1 o IGFBP-3 (Bayne et al., anteriormente, 1988).

La mayor discrepancia entre una proporción de CI_{50} obtenida mediante ELISA de fagos y un resultado de
BIACORE^{TM} se observó con el resto F16. Como se ha mencionado ya, la sustitución de este resto por alanina indujo cambios estructurales en la molécula de IGF-1 (Jansson et al., anteriormente, 1997). Se ha observado el mismo efecto con la K_{D} en los resultados de BIACORE^{TM}, pero la disminución de afinidad fue menos pronunciada en los experimentos de ELISA de fagos (véase la Tabla II). Ambas mediciones de BIACORE^{TM} usaban IGF-F16A que se había vuelto a plegar durante el procedimiento de purificación (Janssen et al., anteriormente, 1997). En la presentación de fagos, sin embargo, la proteína de interés se transloca de forma natural mediante la maquinaria de secreción de E. coli. La escasa abundancia de proteína en la presentación de fagos monovalente (<1 molécula por partícula de fago) puede desfavorecer la agregación y el plegamiento erróneo. Además, la fusión de IGF-1 a la proteína de fago g3 truncada puede ejercer un efecto estabilizante sobre la estructura nativa del péptido.

Los niveles de IGFBP-3 están regulados positivamente por IGF-1. El papel de IGFBP-1, por el contrario, está menos claro. Esta clase de proteínas de unión es generalmente menos abundante que IGFBP-3 y sus niveles están regulados negativamente por la insulina (Bach y Rechler, anteriormente; Clemmons, anteriormente, 1997; Jones y Clemmons, anteriormente).

Basándose en los resultados de este documento, se obtienen variantes de IGF-1 específicas de IGFBP. La combinación de varias mutaciones de alanina genera una variante que se une a IGFBP-1 muy débilmente aunque conserva una alta afinidad de unión por IGFBP-3. El diseño de variantes específicas de IGFBP-1, que no se unan más a IGFBP-3, puede implicar la presentación en fagos de IGF-1 y la aleatorización de aminoácidos en posiciones específicas (Cunningham et al., 1994, anteriormente; Lowman y Wells, J. Mol. Biol., 243: 564-578 (1993)).

Conclusión

Se han identificado restos en IGF-1 importantes para la unión a IGFBP-1 e IGFBP-3. Se descubrieron varios restos que determinan la especificidad de unión para una IGFBP en particular. Publicaciones recientes (Loddick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 1894-1898 (1998); Lowman et al., anteriormente, 1998) han descrito estudios animales en los que se generaron combinaciones aumentadas de IGF-1 biodisponible "libre" mediante desplazamiento del IGF-1 endógeno de proteínas de unión. Pueden usarse variantes de IGF-1 específicas de IGFBP para de forma diagnóstica y terapéuticamente, como se describe en este documento.

Ejemplo 7 Caracterización de ciertos análogos de IGF-1 Materiales y métodos Construcción de análogos de IGF-1

En el ejemplo 6 (y en Dubaquié y Lowman, anteriormente) se identifican análogos de IGF-1 en los que se reducía la afinidad de unión a IGFBP-1, IGFBP-3 o a ambas proteínas de unión. En particular, la mutagénesis mediante alanina completa de IGF-1 identificó al ácido glutámico 3 (E3) y a la fenilalanina 49 (F49), así como a la fenilalanina 16 (F16) y a la fenilalanina 25 (F25) en cierto grado, como determinantes de especificidad para la unión a IGFBP-1. Los resultados de la presentación en fagos de la detección de alanina sugerían que las cadenas laterales en las posiciones tanto 3 como 49 contribuían selectivamente de forma considerable a la energía de unión para la formación del complejo con IGFBP-1 (pérdida de afinidad de 30 veces para E3A, de 100 veces para F49A), aunque su contribución a la energía de unión para IGFBP-3 no es detectable (E3A) o es minoritaria (de 4 veces para F49A) (véase el Ejemplo 1 y Dubaquié y Lowman, anteriormente).

Era probable conseguir una especificidad mejorada adicional por IGFBP-3 mediante mutación acumulativa de IGF-1, puesto que los efectos de mutaciones puntuales son frecuentemente aditivos con respecto a su contribución a la energía libre de unión (Wells, Biochemistry 29: 8509 (1990)). Por lo tanto, se construyó un doble mutante de IGF-1, E3A/F49A, combinando las mutaciones puntuales E3A y F49A en un sola molécula. Aunque F16A mostraba un efecto de especificidad por IGFBP menor (Ejemplo 1 y Dubaquié y Lowman, anteriormente), también se construyó el doble mutante F16A/F49A.

También se construyó un nuevo mutante puntual de IGF-1, Y31C, que contenía un único supuesto cisteinil tiol no emparejado para facilitar la inmovilización específica de sitio de IGF-1 para los ensayos de unión. Se seleccionó Y31C porque está fuera de los epítopos de unión para IGFBP-1 e IGFBP-3 (Dubaquié y Lowman, anteriormente). Esta técnica de inmovilización asegura una población de ligando uniforme (Cunningham y Wells, J. Mol. Biol., 234: 554 (1993)) para la unión mediante el analito inyectado (es decir, proteína de unión a IGF). La ventaja de este método sobre el acoplamiento con amina empleado anteriormente es que el extremo N-terminal de IGF-1 no está bloqueado y está libre de cualquier enlace amina potencial con la matriz de la microplaca. Esto puede ser especialmente importante para el análisis de unión de IGFBP-1, que se piensa que interactúa con las cadenas laterales del extremo N-terminal de IGF-1 (Dubaquié y Lowman, anteriormente). El Y31C presentado en fagos mostraba afinidades similares a las de tipo silvestre para tanto IGFBP-1 como IGFBP-3, apoyando la idea de que la región alrededor del resto 31 es importante en la unión a receptor pero no forma contactos con las proteínas de unión (Bayne et al., J. Biol. Chem., 264: 11004 (1988); Bayne et al., J. Biol. Chem., 265: 15648 (1989)).

Variantes de IGF-1 con una sola mutación de alanina, incluyendo F49A, así como el doble mutante E3A/F49A, se expresaron, se purificaron y se volvieron a plegar para dar el isómero disulfuro apropiado, a juzgar por el análisis de HPLC (Ejemplo 1 en este documento y Dubaquié y Lowman, anteriormente). Estas variantes se evaluaron en ensayos de unión específica a proteínas de unión y de activación de receptor.

Resultados Afinidad de unión de IGFBP-1 e IGFBP-3

Las afinidades de unión de estas variantes por IGFBP-1 e IGFBP-3 se compararon con la del IGF-1 de tipo silvestre usando un análisis de BIACORE^{TM}. Se llevaron a cabo experimentos cinéticos con unión de IGFBP-3 a IGF-1 o variantes inmovilizadas (Tabla III), como se ha descrito en el Ejemplo 1 y en Dubaquié y Lowman, anteriormente, y se compararon con F49A IGF-1 e IGF-1 de tipo silvestre. En este ensayo, el doble mutante E3A/F49A era aproximadamente 20 veces más débil en su afinidad de unión a IGFBP-3 que el de tipo silvestre y el doble mutante F16A/F49A era aproximadamente 66 veces más débil (Tabla XV).

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TABLA XV Cinética de unión de IGFBP-3 a IGF-1 (* datos de la Tabla II del Ejemplo 1)

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Para mediciones de la unión de IGFBP-1 a IGF-1, se realizaron experimentos de cinética usando una variante de IGF-1 con una sola mutación de cisteína, Y31C, que se inmovilizó sobre la superficie de una microplaca detectora mediante un enlace disulfuro (BIACORE^{TM} System Manual Supplement, 5a-1, Pharmacia (1991)). Los resultados son coherentes (Tabla XVI) con la afinidad de unión medida usando IGF-1 de tipo silvestre inmovilizado mediante acoplamiento con amina inespecífico a la microplaca biodetectora (Ejemplo1 y Dubaquié y Lowman, anteriormente).

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TABLA XVI Cinética de unión de IGFBP-1 a IGF-1 (* datos de la Tabla XIV del Ejemplo 6)

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La unión de F49A y E3A/F49A a IGFBP-1 era demasiado débil para unas mediciones cinéticas precisas. Por lo tanto, se realizó un ensayo de unión competitiva (documento WO 98/45927, publicado el 15 de octubre de 1998) para estimar las afinidades correspondientes. Se usó la variante de IGF-1 con una sola mutación de cisteína, Y31C, que se inmovilizó sobre una superficie de microplaca biodetectora de BIACORE^{TM}, como se ha descrito anteriormente. Se realizaron experimentos de unión competitiva que producían valores de concentración inhibitoria semimáxima (CI_{50}) de la forma siguiente: se incubó IGFBP-1 50 nM con una dilución seriada de la variante de IGF deseada. Estas soluciones de mezcla de proteínas se inyectaron a 5 \mul/min sobre una microplaca de B1 que contenía IGF-1 Y31C acoplado con cisteína (200 unidades de respuesta). Se determinó la cantidad de IGFBP-1 unida restándole la unión inespecífica después de una inyección de 20 minutos y se representó frente a la concentración de variante de IGF (Fig. 19). Los resultados se muestran en la tabla XVII.

TABLA XVII Inhibición de la unión de IGFBP-1 a Y31C IGF-1 inmovilizado

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En comparación con el IGF-1 de tipo silvestre, F49A y E3A/F49A tenían afinidades de unión gravemente disminuidas para IGFBP-1. F49A se unía a IGFBP-1 con una CI_{50} de 1,6 \pm 0,2 \muM (Tabla XVII) aunque conservando una constante de disociación de alta afinidad (K_{D}) de 6,3 \pm 1,7 nM para IGFBP-3 (Tabla XV). Se descubrió que la unión de E3A/F49A a IGFBP-1 era todavía más débil, con una CI_{50} estimada de 64 \pm 9 \muM (Tabla XVII), aunque tenía una afinidad sólo moderadamente disminuida (K_{D} = 22,2 \pm 10,3 nM) para IGFBP-3 (Tabla XV). Estas mediciones in vitro sugieren que ninguna de las variantes de IGF debería asociarse de forma estable con IGFBP-1 en condiciones fisiológicas.

Ensayos de KIRA de activación de receptor de IGF de Tipo I

El ensayo de activación del receptor de quinasa (KIRA) controla específica y cuantitativamente el grado de fosforilación del receptor de IGF citoplasmático tras una estimulación extracelular mediante ligando (Sadick et al., J. Pharm. Biomed. Analysis, 19 (6): 883-891 (1998)). Se ensayaron varias variantes de IGF, G1S/A70V, T4A, V11A, F16A, F25A, F16A/F49A, R36A, P39A y F49A, en ensayos de activación de receptor de una sola concentración. Las afinidades de unión a IGFBP-1 y a IGFBP-3 de estas variantes, excepto para F16A/F49A, se exponen en la Tabla XIV y en Dubaquié y Lowman, anteriormente. La Tabla XVIII resume las afinidades y especificidades relativas a partir de mediciones de BIACORE^{TM}.

Para el ensayo de KIRA, se estimaron aproximadamente las concentraciones de variante a 13 nM ("concentración elevada") o a 1,3 nM ("concentración baja"), basándose en mediciones de la densidad óptica. La señal obtenida para cada variante de IGF se comparó con la de una dilución seriada patrón de IGF-1 de tipo silvestre y se describió en términos de una concentración de IGF-1 aparente que se corresponde con la actividad observada en el ensayo de KIRA (Figs. 20A y 20B). Aunque no se midieron las potencias relativas exactas, estos resultados muestran que todos los mutantes ensayados mantienen la capacidad de activar al receptor de IGF-1 de tipo I.

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TABLA XVIII Afinidades relativas por IGFBP-1 e IGFBP-3 de variantes de IGF-1. NDB, sin unión detectable; ND, no determinada; * datos de la Tabla XIV del Ejemplo 6)

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La Tabla XVIII muestra que, además de F49A, tanto F16A como F25A se reducen sustancialmente en afinidad por IGFBP-1, pero menos por IGFBP-3. Ambos conservan todavía la actividad biológica, basándose en ensayos de KIRA (Fig. 20).

Para determinar la potencia relativa de F49A y E3A/F49A, se midió su capacidad para activar el receptor de IGF de tipo I usando diluciones seriadas en ensayos de KIRA. Como se muestra en las Figs. 21A-21B, tanto como F49A como E3A/F49A presentan curvas de activación del receptor de IGF que son indistinguibles de las del IGF-1 de tipo silvestre. Las concentraciones eficaces semimáximas (CE_{50}) eran de 20,0 \pm 1,3 ng/ml para F49A, 19,8 \pm 0,5 ng/ml para E3A/F49A y 18,9 \pm 0,2 ng/ml y 19,8 \pm 0,6 ng/ml para IGF-1 de tipo silvestre. Estos resultados sugieren firmemente que ambas mutantes de IGF son por completo biológicamente activas.

Eliminación de sangre y acumulación renal de variantes de IGF-1 en ratas

Para evaluar de forma preliminar las propiedades farmacológicas de IGF-1 F49A y E3A/F49A, ambas proteínas se radiomarcaron y se administraron por vía intravenosa en ratas. La Figura 22A muestra un curso de tiempo de la velocidad a la que se eliminan ambas moléculas de la sangre de los animales. Como se esperaba, debido a sus afinidades disminuidas por IGFBP, ambas variantes se eliminaron a una velocidad más rápida en comparación con el IGF-1 humano de tipo silvestre. Es interesante que el doble mutante (E3A/F49A) se eliminó más rápido que el mutante individual (F49A), lo que se correlaciona bien con las afinidades respectivas por la proteína de unión principal en el suero, IGFBP-3 (Tabla XV). La Figura 22B muestra la relación tisular con respecto a sanguínea para las variantes de IGF en diferentes órganos. La mayoría de las moléculas de IGF marcadas radiactivamente se detectaron en el riñón, mientras que los niveles de radiactividad en el hígado, bazo, corazón y páncreas fueron mucho menores. Es evidente que las variantes F49A y E3A/F49A se acumulan a niveles mayores estadísticamente significativos en el riñón, en comparación con el IGF-1 de tipo silvestre.

Análisis del dicroísmo circular de variantes de IGF-1

Se analizó el espectro de dicroísmo circular de IGF-1 F49A y E3A/F49A para ensayar si las mutaciones introducidas causaban cambios importantes en la estructura de la proteína. La desestabilización estructural podría conducir a una susceptibilidad proteolítica aumentada, proporcionando una explicación alternativa a las velocidades de eliminación de sangre más rápidas de las variantes de IGF. Sin embargo, como se muestra en la Figura 23, ambos mutantes tenían espectros prácticamente idénticos a los de uno registrado para IGF-1 de tipo silvestre. El espectro de DC revela elementos tanto de \alpha-hélice como de enrollamientos aleatorios, como se espera a partir de la espectroscopía de RNM de IGF-1 (Cooke et al., anteriormente). La estabilidad térmica de IGF-1 no pudo determinarse con precisión mediante el dicroísmo circular, presumiblemente debido al contenido relativamente elevado (-30%) de enrollamientos aleatorios (Jansson et al., anteriormente, 1997) ya presentes a temperatura ambiente. El hecho de que el espectro de DC de ambas variantes no mostrase una desviación significativa del de IGF-1 de tipo silvestre es una indicación de que las mutaciones introducidas no alteran la estructura global de IGF-1.

Conclusión

A partir de las pruebas presentadas anteriormente, se esperaría que los mutantes individuales y dobles de IGF-1 F16A, F16G, F16S, F25A, F25G, F25S, F49A, F49G, F49S, E3A/F49A, E3A/F49G, E3G/F49A, E3G/F49G, E3A/F49S, E3S/F49A, E3S/F49S, E3G/F49S y E3S/F49G fueran eficaces en el tratamiento de trastornos del cartílago, puesto que los mutantes sustituidos con alanina presentan una afinidad reducida por IGFBP-1 sin una pérdida sustancial de la capacidad para unirse a IGFBP-3 y son biológicamente activos en base a muchos ensayos. Además, se espera que dichos mutantes sean eficaces en el tratamiento de trastornos del cartílago, puesto que los mutantes sustituidos con alanina se unen tan sólo débilmente a IGFBP-1 y existe una desregulación de IGFBP-3 en trastornos artríticos (Martel-Pelletier et al., anteriormente).También se esperaría que BP3-01 y BP3-15 fueran también eficaces para este fin en vista de su papel en el desplazamiento de IGFBP-3 (Lowman et al., anteriormente, 1998; documento WO 98/45427).

Ejemplo 8 Ensayo en explantes de cartílago articular de análogos de IGF-1 con afinidad selectivamente reducida por IGFBP-1 frente a IGFBP-3 Introducción

Los experimentos de este ejemplo examinan el potencial tanto sintético como profiláctico de los análogos de IGF-1 E3A/F49A y F49A sobre la matriz de cartílago.

Materiales y métodos Explantes de cartílago articular

Se diseccionó asépticamente la articulación metacarpofalángica de vacas de 18-24 meses de edad y se extrajo el cartílago articular mediante seccionamiento a mano alzada, teniendo cuidado de evitar el hueso subyacente. El cartílago se picó, se lavó y se cultivó en masa durante al menos 24 horas en una atmósfera humidificada de aire al 95% y CO_{2} al 5% en medio LG DMEM/F12 sin suero (SF) con BSA al 0,1%, penicilina/estreptomicina 100 U/ml (Gibco), L-glutamina 2 mM, MEM con piruvato sódico 0,1 mM (Gibco), antibiótico GENTAMICIN^{TM} (Gibco) 20 \mug/ml y antibiótico AMPHOTERICIN B^{TM} (Sigma) 1,25 mg/ml. Se repartieron alícuotas de cartílago articular en tubos MICRONICS^{TM} (aproximadamente 55 mg por tubo) y se incubaron durante al menos 24 horas en los medios anteriores. Después, se añadió a cada tubo control (medio sólo), IGF-1 de tipo silvestre, E3A/F49A o F49A (a una concentración final de 40 ó 400 ng/ml, como se indica). Los medios se recogieron y se cambiaron a diversos puntos de tiempo (0, 24, 48 y 72 horas).

Liberación de proteoglicano

Se ensayaron medios recogidos a diversos puntos de tiempo para determinar el contenido de proteoglicano usando el ensayo colorimétrico de azul de 1,9-dimetilmetileno (DMMB) de Farndale y Bustle. Biochem. Bhiophys. Acta, 883: 173-177 (1985). Se preparó una curva patrón de sulfato de condroitina que variaba de 0,0 a 5,0 \mug.

Síntesis de proteoglicano

Después del cambio de medio a las 48 horas, se añadió ^{35}S-sulfato (a una concentración final de 10 \muCi/ml) a los cultivos de explantes de cartílago. Después de 17 horas adicionales de incubación a 37ºC, se midió la cantidad de proteoglicanos en los medios usando el ensayo de DMMB. Las propias piezas de cartílago se lavaron dos veces con medio de explantes y se digirieron durante una noche a 50ºC en un volumen de reacción de 900 \mul de EDTA 10 mM, fosfato sódico 0,1 M y proteinasa K 1 mg/ml (Gibco BRL). Se mezclaron 600 \mul de la reacción de digestión (2:1) con cloruro de acetilpiridinio al 10% p/v (Sigma) y se centrifugaron a 1000 x g durante 15 minutos. El sobrenadante se retiró y se añadió ácido fórmico (500 \mul, Sigma) para disolver los sedimentos. Después, las muestras se transfirieron a viales de centelleo que contenían 10 ml de líquido de centello (ICN) y se leyeron en un contador de centelleo.

Proteoglicano restante en tejidos cartilaginosos

Después de 72 horas, se digirieron los explantes de cartílago articular restantes, como se ha descrito anteriormente en la Síntesis de proteoglicano, y se ensayaron para determinar el contenido de proteoglicano usando el ensayo colorimétrico de DMMB (mencionado anteriormente en la Liberación de proteoglicano).

Ensayo de oxido nítrico

Se mezclaron medios de cartílago articular guardados de los explantes de cartílago a diversos tiempos (24, 48 y 72 horas) con 10 \mul de 2,3-diaminonaftaleno (DAN) 0,05 mg/ml en HCl 0,62 M y se incubaron a temperatura ambiente durante 10-20 minutos en la oscuridad. La reacción se terminó con 5 \mul de NaOH 2,8 N. La cantidad de fluorescencia de 2,3-diaminonaftotriazol se midió con un lector de placas fluorescentes CYTOFLOR^{TM} a 365 nm de excitación y a 409 nm de emisión.

Resultados

Los datos presentados en las Figuras 24-27 muestran que los dos análogos de IGF-1 ensayados disminuyen la degradación de la matriz de cartílago (medida por la liberación de proteoglicano), bloquean la inducción de la degradación de la matriz de cartílago por IL1-\alpha, inducen la síntesis de matriz de cartílago (medida por la síntesis de proteoglicano) y evitan la inhibición de la síntesis de matriz por IL1-\alpha.

Estos efectos son similares a los de IGF-1 de tipo silvestre. Sin embargo, puesto que se emplea IGF-1 humano con tejido bovino, las diferencias entre especies pueden enmascarar un efecto inhibidor de proteínas de unión endógenas sobre la actividad de IGF-1 de tipo silvestre.

Los análogos de IGF-1 disminuyeron significativamente la liberación de óxido nítrico (Fig. 28). Además, los análogos de IGF-1 bloquearon la inducción de óxido nítrico por IL1-\alpha (Fig. 29).

Discusión

Se demuestra en este documento que análogos de IGF-1 son capaces de inhibir la degradación de la matriz, estimular la síntesis de nueva matriz e inhibir la liberación de óxido nítrico. Además, estos análogos de IGF-1 inhiben los efectos perjudiciales de la interleucina 1, que está elevada en las articulaciones enfermas.

El papel del óxido nítrico en la degradación del cartílago articular, especialmente la destrucción asociada con osteoartritis, se ha descrito en Ashok et al., Curr. Opin. Rheum., 10: 263-268 (1998). Puesto que el óxido nítrico también tiene efectos sobre otras células, la presencia de óxido nítrico en el interior de la articulación podría aumentar la vasodilatación y la permeabilidad, potenciar la liberación de citocina por leucocitos y estimular la actividad angiogénica por monocitos-macrófagos. El cartílago normal no produce óxido nítrico a menos que se estimule con citocinas tales como IL-1, mientras que los explantes de cartílago osteoartrítico continúan liberando óxido nítrico durante más de 3 días en cultivo a pesar de la ausencia de estímulos añadidos. Por lo tanto, la producción de óxido nítrico por el cartílago se correlaciona con una patología y, puesto que el óxido nítrico parece desempeñar un papel tanto en los componentes erosivos como inflamatorios de las enfermedades de las articulaciones, una proteína o péptido que disminuyera la producción de óxido nítrico sería probablemente beneficioso para el tratamiento de trastornos cartilaginosos degenerativos. De hecho, los modelos animales in vivo sugieren que la inhibición de la producción de óxido nítrico reduce el avance de la artritis (Pelletier et al., Arthritis Rheum., 7: 1275-1286 (1998); van de Loo et al., Arthritis Rheum., 41: 634-646 (1998); Stichtenoth y Frolich, Br. J. Rheumatol., 37: 246-257 (1998)).

El ensayo descrito en este documento está basado en el principio de que el 2,3-diaminonaftaleno (DAN) reacciona con nitrito en condiciones ácidas para formar 1-(H)-naftotriazol, un producto fluorescente. Como el óxido nítrico se metaboliza rápidamente hacia nitrito (NO_{2}^{-1}) y nitrato (NO_{3}^{-1}), la detección de nitrito es un medio para detectar (aunque a la baja) el óxido nítrico real producido en tejido cartilaginoso.

Como se ha descrito anteriormente, el óxido nítrico tiene efectos perjudiciales sobre los condrocitos, así como sobre otros tipos celulares dentro de la articulación. Puesto que se ha demostrado que la inhibición del óxido nítrico inhibe el avance de la artritis en mamíferos, el efecto de los análogos de IGF sobre el óxido nítrico sugiere además que los análogos de IGF ensayados serían protectores para tejidos articulares in vivo. Finalmente, se espera que estos análogos, o los péptidos desplazadores de IGFBP, tengan efectos anabólicos en tejidos, tales como cartílago artrítico, que de otro modo son resistentes a IGF-1.

En resumen, dos variantes selectivas de IGFBP (F49A y E3AF49A) demostraron una reducción aparente de 700 veces y de 80.000 veces en la afinidad por IGFBP, aunque conservando una baja afinidad nanomolar por IGFBP-3, la principal transportadora de IGF-1 en plasma. Ambas variantes presentaron una potencia similar a la del tipo silvestre en ensayos de receptor celular de quinasa, estimularon la síntesis de matriz de cartílago humano y conservaron su capacidad para asociarse con ALS formando un complejo con IGFBP-3. Por lo tanto, la vida media de estas variantes está todavía determinada por IGFBP-3, pero su actividad no está más regulada por IGFBP-1. Además, los parámetros farmacocinéticos y la distribución tisular de estas dos variantes de IGF-1 en ratas difieren del IGF-1 de tipo silvestre, como función de sus afinidades por IGFBP.

Ejemplo 9 Generación de análogos de IGF-1 con afinidad selectivamente reducida por IGFBP-3 frente a IGFBP-1 y ensayo en explantes de cartílago articular para los mismos Introducción

Generalmente se piensa que las IGFBP inhiben la actividad biológica de IGF-1 secuestrando el factor de crecimiento en complejos de alta afinidad y, por lo tanto, impidiendo su asociación con su receptor (Jones y Clemmons, Endocr. Rev. 16: 3-34 (1995)). Se descubrió que los niveles de IGFBP-3 (e IGFBP-4) estaban aumentados en el líquido sinovial inflamatorio humano (Kanety et al., J. Rheumatol. 23: 815-818 (1996)). Se piensa que este cambio en la homeostasis de IGFBP contribuye a la afección patológica privando a las células de la señal de supervivencia IGF-1. En este ejemplo, se generaron moléculas de IGF-1 con una afinidad selectivamente reducida por IGFBP-3 sin alterar la actividad sobre el receptor de IGF-1 de tipo I. Se esperaría que dichas moléculas fueran más biológicamente potentes que el IGF-1 de tipo silvestre en presencia de niveles de IGFBP-3 patofisiológicos elevados. Además, puesto que IGFBP-3 es la principal transportadora de IGF-1 en suero, presumiblemente, la vida media y la distribución biológica de dichas variantes de IGF-1 se alterarían enormemente.

Los epítopos de unión de IGFBP-1 e IGFBP-3 se han mapeado mediante detección de alanina sobre la superficie de IGF-1 (Dubaquié y Lowman, Biochemistry, 38: 6386-6396 (1999)). Cada cadena lateral individual de IGF-1 contribuye sólo con cantidades modestas a la energía de unión para IGFBP-3. Basándose en esta observación, parece imposible disminuir sustancialmente la afinidad por IGFBP-3 introduciendo sólo unas pocas mutaciones de alanina específicas en IGF-1. Una estrategia diferente para interrumpir interacciones de proteína-proteína implica la introducción de un resto cargado en la superficie de contacto de unión, conduciendo a una repulsión electrostática de los compañeros de unión. Se ha señalado por Jansson et al. (Biochemistry, 36: 4108-4117 (1997)) que IGF-1 es una proteína electrostáticamente polarizada con un área continua cargada negativamente en el extremo N-terminal (incluyendo la hélice de la región B), mientras que la región C está básicamente cargada positivamente. Basándose en estas observaciones, se seleccionó el resto D12, puesto que no contribuye con ninguna energía de unión para IGFBP-1 y parece ser parte del epítopo estructural de unión a IGFBP-3 (Dubaquié y Lowman, anteriormente). Se argumentó que el reemplazo del resto 12 con una carga positiva interrumpiría el área continua cargada negativamente que podría estar posiblemente implicada en la interacción con IGFBP-3.

Materiales y métodos Generación de análogos

Se construyeron partículas de fagos que presentaban variantes de IGF-1 en las que el resto de aspartato de la posición 12 se mutó a lisina (D12K) o arginina (D12R), como se describe en Dubaquié y Lowman, anteriormente. Además, estas variantes proteicas se expresaron en E. coli y se purificaron como se describe en Dubaquié y Lowman, anteriormente.

Explantes de cartílago articular

Se cultivó la articulación metacarpofalángica de un cerdo de seis meses de edad como se ha descrito anteriormente para el cartílago articular bovino en el Ejemplo 8. Este explante se cultivó en medios solos o en medios con D12K, D12R o IGF-1 de tipo silvestre (a 10 nM) solos o en presencia de IL-1\alpha a 1 ng/ml, como se ha descrito anteriormente. Los explantes humanos eran de pacientes que se sometían a una cirugía de reemplazo de la articulación. Se recogió el cartílago articular, se repartió en alícuotas (40-45 mg/tubo) y se cultivó como anteriormente. Veinticuatro horas después, los explantes se trataron con IGF-1, F16A/F49A, E3A/F49A o F49A 40 ng/ml cada día durante cinco días. Se añadió medio fresco los días 0, 1, 2 y 3. Se determinó la degradación de la matriz mediante la medición de la cantidad de proteoglicanos en los medios usando el ensayo de DMMB, como se ha descrito anteriormente. Se determinó la síntesis de matriz (proteoglicano) mediante la medición de la captación de ^{35}S-sulfato, como se ha descrito anteriormente.

Además, con fines comparativos, se ensayaron F49A, E3A/F49A, F16A/F49A, D12K, D12R o IGF-1 de tipo silvestre (a 40 ng/ml) para determinar la síntesis de matriz de cartílago en tejido humano, como se ha descrito anteriormente. Se cultivó cartílago articular humano de articulaciones enfermas en medios solos o con F49A, E3A/F49A, F16A/F49A, D12K, D12R o IGF-1 de tipo silvestre (a 40 ng/ml) y se determinó la síntesis de matriz midiendo la captación de ^{35}S-sulfato, como se ha descrito anteriormente.

Resultados

La Figura 30 muestra las curvas de unión de partículas de fagos que presentan IGF-1 de tipo silvestre, D12K o D12R unidos a IGFBP-1 (Fig. 30A) o IGFBP-3 (Fig. 30B) inmovilizadas. Las partículas de fagos de IGF-1 de tipo silvestre unidas a IGFBP-1 o IGFBP-3 generaron intensidades similares de señal de detección. Sin embargo, D12K y D12R presentaron menores intensidades de señal cuando se unían a IGFBP-3 en comparación con IGFBP-1. Este resultado sugiere que estas variantes tienen una afinidad selectivamente reducida por IGFBP-3 en comparación con el IGF-1 de tipo silvestre.

Como IGF-1, D12K y D12R inhibieron la degradación de la matriz de cartílago (Fig. 31A) y aumentaron la síntesis de matriz (Fig. 31C). Además, como IGF-1, D12K o D12R inhibieron los efectos catabólicos de IL-1\alpha (Fig. 31B) e impidieron la inhibición de la síntesis de proteoglicano inducida por IL-1\alpha (Fig. 31D). Por lo tanto, estos mutantes conservan una actividad completa y se espera que sean buenos agentes terapéuticos para trastornos del cartílago, tales como artritis, que están caracterizados por una degradación de la matriz aumentada y una síntesis de matriz disminuida. Además, puesto que se encuentran altos niveles de IL-1 en articulaciones enfermas, la capacidad estos mutantes para inhibir los efectos perjudiciales de IL-1\alpha sobre el cartílago sugieren además la utilidad de estas variantes de IGF como tratamientos para la artritis.

Es importante que las variantes de IGF-1 tienen actividad sobre cartílago humano obtenido de pacientes que se someten a reemplazo de articulaciones, es decir, con artritis. Como se muestra en la Figura 32, las cinco variantes de IGF ensayadas con preferencia selectiva por IGFBP-3 sobre IGFBP-1 o viceversa (F49A, E3A/F49A, F16A/F49A, D12K y D12R) estimularon la síntesis de matriz en cartílago articular humano enfermo y la actividad de las variantes era tan buena como, o mejor que, la del IGF-1 de tipo silvestre. A diferencia de estudios anteriores que mostraban una resistencia a IGF-1 en el cartílago articular de articulaciones osteoartríticas, el cartílago de estos pacientes en particular continuó siendo sensible a IGF-1.

Discusión

La superficie de contacto proteica entre IGF-1 e IGFBP-3 parece ser sensible a mutaciones que cambian la distribución de cargas. Se espera que la introducción de cargas positivas en la región N-terminal de IGF-1 reduzca selectivamente la afinidad por IGFBP-3.

Las variantes de IGF-1 D12K y D12R son biológicamente activas, como se demuestra en los experimentos de estimulación de la síntesis de matriz articular en este documento.

IGF-1 es un regulador clave de la homeostasis de la matriz del cartílago articular. El desequilibrio metabólico en la osteoartritis que favorece la degradación de la matriz sobre la nueva síntesis de matriz puede deberse, al menos en parte, a la insensibilidad de los condrocitos a la estimulación por IGF-1. Aunque se desconoce el mecanismo que subyace a esta resistencia a IGF-1se piensa, sin limitarse a teoría alguna, que las IGFBP, que están elevadas en muchos pacientes artríticos, desempeñan un papel. En estos pacientes, los análogos de IGF-1 que no se unen a, y que, por lo tanto, no se inhiben por IGFBP, probablemente estimularían la reparación del cartílago en tejidos que, de otro modo, serían resistentes a IGF-1. Como alternativa, los péptidos que bloquean la unión de IGF-1 a proteínas de unión inhibidoras pueden, por lo tanto, liberar a IGF-1 para que actúe sobre los condrocitos vecinos. Además, basándose en el posible papel de las IGFBP (especialmente IGFBP-1) en la modificación de la actividad de IGF-1, los análogos de IGF-1 que se describen en este documento pueden tener una mejor eliminación de y/o transporte a través de los tejidos dentro de las articulaciones humanas con respecto al del IGF-1 de tipo silvestre.

Puesto que la pérdida de proteínas de la matriz de cartílago es una parte temprana y continua de los daños articulares que conducen al fracaso de las articulaciones, la capacidad de estos análogos de IGF-1 para inhibir el catabolismo del cartílago y estimular la síntesis de nueva matriz sugiere firmemente que estos análogos de IGF-1 tendrán efectos beneficiosos sobre articulaciones enfermas o dañadas.

IL-1\alpha tiene efectos catabólicos sobre el cartílago, incluyendo la generación de una inflamación sinovial, regulación positiva de metaloproteinasas de la matriz, estimulación de la degradación de la matriz e inhibición de la síntesis de proteoglicano y colágeno. Además, se encuentra proteína IL-1 en articulaciones enfermas, pero no en articulaciones normales. Por lo tanto, la capacidad de los análogos ensayados para tener efectos positivos sobre el cartílago, así como para contrarrestar los efectos perjudiciales de IL-1\alpha, sugiere firmemente que dichas moléculas tendrían un efecto protector sobre trastornos del cartílago, incluyendo cartílago dañado y/o enfermo. Además, dicha actividad predice que los análogos y péptidos de IGF-1 de ensayo inhibirían la degradación que se produce en afecciones artríticas, puesto que se ha demostrado que el antagonismo de la función de IL-1\alpha reduce el avance de la osteoartritis (Arendt et al., Ann. Rev. Immunol., 16: 27-55 (1998)).

Ejemplo 10 Ensayo en explantes de cartílago articular de análogos de BP3-15 y BP3-40 Materiales y métodos

Se cultivaron explantes de cartílago articular humano en medios o se trataron con IGF-1 en solitario o junto con BP3-40 o BP3-15 a 0,1 mg/ml, como se ha descrito anteriormente. Se determinó la degradación de la matriz por medición de la liberación de proteoglicanos en los medios, como se ha descrito anteriormente. Se determinó la síntesis de matriz mediante el recuento de la cantidad de ^{35}S-sulfato incorporado en el tejido cartilaginoso, como se ha descrito anteriormente.

Resultados y discusión

Puesto que se han encontrado altos niveles de IGFBP en cartílagos enfermos y estas IGFBP pueden inhibir la actividad de IGF-1, se ensayó el efecto de dos péptidos desplazadores de IGFBP-3 sobre la actividad de IGF-1. Se trataron explantes de cartílago articular humano de pacientes artríticos con IGF-1 solo o junto con un péptido desplazador de IGFBP (BP3-15 o BP3-40). Estos péptidos desplazadores parecían potenciar la capacidad de IGF-1 para disminuir la degradación de la matriz (Figs. 33A y 33C) y para estimular la síntesis de matriz (Figs. 33B y 33D). Por lo tanto, se espera que estos péptidos sean útiles para afecciones, tales como artritis, en las que están presentes altos niveles de proteínas de unión inhibidoras. En dichas afecciones, se espera que el tratamiento con un péptido desplazador solo o junto con IGF-1 potencie los efectos anabólicos del IGF-1 endógeno o exógeno y que sea útil en el tratamiento de la artritis.

Ejemplo 11 Formación de un complejo con ALS Materiales y métodos

Se expresó ALS humana en células CHO (Leong et al., Mol. Endocrinol., 6: 870-876 (1992)). La ALS secretada se enriqueció en DEAE-Sepharose, seguido de purificación por afinidad en una columna de IGF-1/IGFBP-3, como se describe en Baxter et al., J. Biol. Chem, 264: 11843-11848 (1989).

Para controlar la formación de complejo trimérico, se inmovilizaron 300 RU de IGFBP-3 biotinilada (Sulfo-NHS-LC-LC-biotin; Pierce Rockford, IL) sobre una microplaca acoplada con estreptavidina (SA; Biacore, Inc., Piscataway, NJ) en PBS, TWEEN^{TM}-20 al 0,05% y azida sódica al 0,01%. La microplaca biodetectora se preparó con tampón de desplazamiento que contenía 1 \muM del análogo de IGF-1 respectivo (F49A o E3A/F49A). Se inyectó ALS en cantidades de 98, 148 y 333 nM a 50 \mul/min durante 2 minutos, seguidos por un periodo de disociación de 2 minutos. La microplaca se regeneró con 10 \mul de KSCN 2 M (en HEPES 50 mM a pH 7,2) a una velocidad de flujo de 20 \mul/min, seguido de un flujo de tampón de 3 minutos para la estabilización en medidas basales.

Resultados F49A y E3A/F49A forman complejos ternarios con IGFBP-3 y ALS

La mayoría del IGF-1 en suero se encuentra en un complejo ternario de 150 kDa compuesto por IGFBP-3 y una glicoproteína denominada ALS. La vida media de este complejo ternario es un orden de magnitud más larga que la del IGF-1 libre (Ferry et al., Horm. Metab. Res., 31: 192-202 (1999)). Por lo tanto, la formación de un complejo ternario es un determinante fundamental para la biodistribución de IGF-1. Para ensayar si las variantes de IGF-1 obtenidas por ingeniería genética todavía eran capaces de formar complejos triméricos con ALS, se realizó un experimento de unión a biodetector. Se inmovilizó IGFBP-3 biotinilada sobre una microplaca biodetectora y se inyectó a ALS que tenía IGF-1 de tipo silvestre (Fig. 34A), F49A (Fig. 34B) o E3A/F49A (Fig. 34C) incluido en el tampón de desplazamiento a una concentración de 1 \muM. Como se muestra en la Figura 34, las curvas de unión a ALS eran esencialmente idénticas para el IGF-1 de tipo silvestre y las dos variantes de IGF-1. La velocidad de disociación para IGF-1 de tipo silvestre y cada variante de IGF-1 se enumera en la Tabla XIX, variando de 4,0 x 10^{-4} s^{-1} a 6,3 x 10^{-4} s^{-1}. En ausencia de ningún IGF-1 en el tampón de desplazamiento, ALS no se asoció con IGFBP-3 sobre la microplaca. Estos experimentos indican que las variantes de IGF-1 conservan la capacidad de formar complejos ternarios y que, por lo tanto, su vida media terminal en suero no debería ser radicalmente más corta que para IGF-1 de tipo silvestre.

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TABLA XIX

38

Eliminación y distribución de F49A y E3A/F49A en ratas

Se radiomarcaron IGF-1 humano de tipo silvestre, F49A y E3A/F49A y se administraron por vía intravenosa en ratas para evaluar sus propiedades farmacocinéticas. Ambas variantes de IGF-1 se eliminaron significativamente más rápido en comparación con el IGF-1 humano de tipo silvestre (Tabla XX). E3A/F49A se eliminó a la velocidad más rápida (1107 \pm 45 ml/h/kg), seguida por F49A (427 \pm 125 ml/h/kg) y wt IGF-1 (151 \pm 24,7 ml/h/kg). Se observó una tendencia similar para la vida media intermedia t_{1/2}\beta: E3A/F49A tuvo la más corta, F49A intermedia y wt IGF-1 la t_{1/2}\beta más larga (Tabla XX). Estos hallazgos se correlacionan bien con las correspondientes afinidades in vitro por la proteína de unión principal en el suero, IGFBP-3. De forma interesante, los volúmenes de distribución en estado estacionario fueron mucho mayores para las variantes de IGF-1, indicando que estaban menos confinadas al compartimento plasmático que IGF-1 de tipo silvestre (Tabla XX). Las mayores relaciones tisulares con respecto a sanguíneas para las moléculas de IGF-1 se detectaron en el riñón, mientras que las proporciones en el hígado, bazo, corazón y páncreas fueron mucho menores. Es evidente a partir de este experimento que F49A y E3A/F49A se acumulan en proporciones mayores estadísticamente significativas en el riñón, en comparación con el IGF-1 de tipo silvestre.

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TABLA XX Parámetros farmacocinéticas después de una sola dosis IV en ratas

39

Discusión

La capacidad de los análogos F49A y E3A/F49A para formar complejos ternarios con ALS e IGFBP-3 tiene consecuencias importantes para la vida media en suero de estas variantes. Se desconoce cómo ALS interactúa con el complejo de IGF-1/IGFBP-3 debido a una falta de información estructural sobre IGFBP-3 y ALS. Un modelo reciente de ALS postula una estructura en forma de rosquilla cuya cavidad interna está revestida con cargas negativas; estas regiones podrían potencialmente interactuar con cargas positivas sobre IGFBP-3 e IGFBP-5 (Janosi et al., J. Biol. Chem., 274: 5292-5298 (1999)). La afinidad de ALS por un complejo de IGF-1/IGFBP-3 entrecruzados es del orden de 0,1 a 0,3 nM, dependiendo del contenido en hidratos de carbono de ALS (Janosi et al., anteriormente). En las mediciones con biodetector que analizaban la unión de ALS a un complejo no covalente de IGF-1/IGFBP-3 (incluyendo cantidades saturantes de IGF-1 en el tampón de desplazamiento), las velocidades de disociación del IGF-1 de tipo silvestre, F49A y E3A/F49A permanecieron constantes entre 4,0 x 10^{-4} s^{-1} y 6,3 x 10^{-4} s^{-1} (Tabla XIX). El experimento confirma que ambas variantes de IGF-1 ensayadas forman complejos temarios con ASL.

Las farmacocinéticas de las variantes de IGF-1 en ratas demostraron características diferentes de las del IGF-1 de tipo silvestre (Tabla XX). Parece que la mayoría de las diferencias se observan en los primeros 60-100 minutos del experimento. En el modelo de análisis farmacocinético, esta fase se caracteriza por las vidas medias inicial e intermedia t_{1/2}\alpha y t_{1/2}\beta, que describen probablemente la distribución de moléculas libres y radiomarcadas totales a tejidos extravasculares y su eliminación (Tabla XX). Después de esta fase inicial, las tres moléculas de IGF-1 se eliminan a velocidades comparables, como sugieren sus valores similares de vida media terminal t_{1/2}\gamma, que probablemente reflejan la eliminación ^{125}I de la rata (Tabla XX). La tendencia en t_{1/2}\alpha y t_{1/2}\beta observada en las tres moléculas es generalmente consistente con una velocidad de distribución y eliminación más rápida para las variantes de IGF-1 que están menos unidas a IGFBP. Además, los volúmenes de distribución en estado estacionario calculados y las velocidades de eliminación también apoyan la interpretación de que la asociación de IGFBP desempeña un papel principal en la distribución y eliminación de las variantes de IGF-1. Por lo tanto, sin limitarse a teoría alguna, esto sugiere que las diferencias iniciales en el perfil farmacocinético reflejan el equilibrio de unión de IGF-1/IGFBP-3, puesto que se correlacionan bien con las afinidades correspondientes de las variantes de IGF-1 para IGFBP-3 in vitro.

Debido a que la IGFBP-3 en la sangre parece estar saturada en condiciones normales (Jones y Clemmons, Endocr. Rev., 16: 3-34 (1995)), se piensa, sin limitarse a teoría alguna, que las variantes de IGF-1 inyectadas tienen que competir con IGF-1 endógeno para unirse a IGFBP-3. Las moléculas de IGF-1 que son incapaces de asociarse con IGFBP-3 podrían difundirse fuera de los vasos sanguíneos y asociarse con otras proteínas de unión o eliminarse a una velocidad rápida (t_{1/2} para IGF-1 libre = 10-15 min^{11}). Sin embargo, las moléculas que consiguen la formación de un complejo ternario con IGFBP-3 y ALS experimentan una vida media en suero más prolongada y quedan "atrapadas" en los vasos sanguíneos. La formación de un complejo ternario de las variantes de IGF-1 se produce con la misma eficacia que el IGF-1 de tipo silvestre in vitro (Fig. 33, Tabla XIX), y esta propiedad parece reflejarse en la fase tardía (>100 minutos) del perfil farmacocinético. El hecho de que ambas variantes del IGF-1 humano y que el IGF-1 humano de tipo silvestre presenten vidas medias terminales del orden de 6-9 horas sugiere firmemente que la formación de complejos con IGFBP-1 y ALS de rata se produce in vivo. Esto es importante, puesto que todos los experimentos in vitro se realizaron exclusivamente con IGFBP-3 y ALS humanas, mientras que los experimentos in vivo dependen de la conservación de las especificidades obtenidas por ingeniería genética para las proteínas de unión homólogas de rata.

Ejemplo 12 Sustituciones en BP1-16

Se ensayaron varias sustituciones de un solo resto en BP1-16 para determinar su efecto sobre la afinidad de unión a IGFBP-1 mediante la síntesis de péptidos y la medición de la inhibición de la unión de IGFBP-1 a IGF-1. Se seleccio-
naron los sitios para la sustitución basándose en el efecto conocido de una alanina u otro resto sustituido en el sitio.

Se había descubierto anteriormente que G4 puede sustituirse por D-alanina. Debido a que los efectos conformacionales de la D-alanina son diferentes de los de la L-alanina, se sustituyó G4 por L-alanina en el péptido BP1-29. Los ensayos de inhibición mostraron una pérdida de 50 veces en la afinidad de unión con esta sustitución (Tabla XXI).

Se había descubierto anteriormente que P5 está muy conservado en bibliotecas de péptidos presentados en fagos; sin embargo, se observaron algunas sustituciones. Por ejemplo, se encontraron tres clones de péptidos en fagos diferentes con arginina en esa posición. Por lo tanto, se ensayó la sustitución de prolina por L-alanina, así como varias sustituciones alternativas (BP1-30, BP1-31 y BP1-14). Los resultados (Tabla XXI) muestran que P5A, P5N y P5R se toleran bien.

L6 y L9 estaban completamente conservadas en 40 de 40 clones secuenciados y 61 de 61 clones secuenciados, respectivamente, de dos bibliotecas de péptidos en fagos diferentes seleccionadas con IGFBP-1. Además, la sustitución de cualquiera de estos restos con L-alanina o cadenas laterales de aib (\alpha-aminoisobutirato) dieron como resultado una pérdida significativa en la afinidad de unión a IGFBP-1. Se ensayaron dos sustituciones adicionales en cada posición: norleucina (Nle), un isómero de la leucina, o arginina (cuya porción alifática de la cadena lateral todavía puede ser capaz de plegarse en la estructura peptídica). Mientras que las sustituciones de Arg dieron como resultado péptidos que tenían una afinidad por IGFBP-1 indetectable (BP1-32 y BP1-26), las sustituciones de Nle se toleraron bien (BP1-36 y BP1-37). Por lo tanto, las sustituciones no naturales de L6(Nle) y L9(Nle) son las únicas sustituciones en estas posiciones conocidas que conservan una afinidad de unión a IGFBP-1 moderada.

W8 también estaba completamente conservado en bibliotecas de péptidos en fagos seleccionadas con IGFBP-1, aunque la sustitución de alanina tenía un efecto menor sobre la unión que en el caso de L6 o L9. Por lo tanto, se ensayaron varias grandes sustituciones de cadenas laterales en esta posición. Es interesante que las sustituciones con arginina, 1-naftilalanina (Nal(1)) o histidina (BP1-22, BP1-23 y BP1-24, respectivamente) tuvieron cada una efectos modestos (<10 veces) sobre la afinidad de unión a IGFBP-1 (Tabla XXI). A partir de estos experimentos, puede formularse una nueva secuencia de consenso para la unión a IGFBP-1 de la forma siguiente:

CysXaa_{(6)}Xaa_{(7)}GlyXaa_{(9)}LeuXaa_{(11)}TrpLeuCysXaa_{(15)}Xaa_{(16)}Xaa_{(17)}Xaa_{(18)} (SEC ID Nº: 130), en la que Xaa_{(6)},
Xaa_{(7)}, Xaa_{(9)}, Xaa_{(11)}, Xaa_{(15}) y Xaa_{(16)} son de forma independiente cualquier aminoácido y Xaa_{(12)}, Xaa_{(17)} y Xaa_{(18)} son de forma independiente Nal(1), His, Phe, Trp, Tyr, Pro, Gln o Met.

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TABLA XXI Afinidades relativas de variantes de BP1-16 medidas mediante ELISA o ensayos de inhibición de BIACORE^{TM} (*)

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Ejemplo 13 Minimización del péptido BP1-01 mediante "hélices estabilizada"

Se ha demostrado anteriormente que la eliminación del enlace disulfuro en BP1-01 es desestabilizante tanto para la estructura como para la función del péptido. Se ha investigado la posibilidad de reemplazar el enlace disulfuro de BP1-01 con una restricción estructural químicamente diferente, manteniendo una afinidad de unión a IGFBP-1 moderada. Estas restricciones se diseñaron para enlazar posiciones de cadenas laterales separadas por 7 (desde la oposición i hasta la posición i+7) u 8 (desde la posición i hasta i+8) restos en el péptido BP1-01.

La estrategia de hélice estabilizada i+7, uno de los enfoques que se usan en este documento, se ha descrito anteriormente en Phelan et al., J. Am. Chem. Soc., 119: 455-460 (1997); documento WO 9B/20036 publicado el 14 de mayo de 1998, como otros enlaces i+7, i+3 e i+4 (revisados en Phelan et al., anteriormente). Además, se han usado otras sustituciones de cadenas laterales que permiten interacciones iónicas o hidrófobas o quelación metálica con el fin de estabilizar una estructura de hélice (revisado en Phelan et al., anteriormente). En este documento se describe una nueva estrategia de hélice estabilizada i+8 que es particularmente útil para la estabilización de la estructura de hélice que se encuentra en la familia de péptidos BP1-01.

Los estudios de mutagénesis indicaban que los determinantes principales para la unión a IGFBP-1 residían principalmente en el segmento de hélice de BP1-01. Estos importantes determinantes de unión se separan principalmente hacia una cara de la hélice e incluyen Leu6 y Leu9 y los restos aromáticos Trp8, Tyr13 y Phe14. Sin limitarse a teoría alguna, el resto del péptido puede actuar principalmente para estabilizar la hélice y para asegurar una presentación apropiada de los determinantes de unión de cadenas laterales principales. Por lo tanto, otros métodos para restringir el segmento de unión del péptido a una conformación en hélice pueden producir potentes péptidos de unión a BP1. Se seleccionó usar entrecruzamientos cadena lateral-cadena lateral en la cara opuesta de la hélice de los determinantes de unión a BP1 principales. Este método se ha descrito en el documento WO 98/20036, anteriormente. En el presente caso, los entrecruzamientos i+7 conectan restos que reemplazan Gln7 con Phe14, que reemplaza uno de los determinantes de unión a IGFBP-1 hidrófobos. El entrecruzamiento i+8 conecta restos que reemplazan Gln7 con Gly15.

La química de entrecruzamiento implica el reemplazo de los dos restos apropiados con restos de ácido glutámico (el primer y el último resto de Glu (E) se muestran en la Tabla XXII), en el que los dos restos de Glu se unen mediante la formación de amidas con 1,5-diaminopentano. Este método de entrecruzamiento se ha descrito en el documento WO 98/20026, anteriormente.

Para desarrollar péptidos activos más cortos que BP1-01, también se decidió delecionar el disulfuro (Cys1-Cys10) y truncar la región del bucle N-terminal en péptidos helicoidales restringidos. La Cys10 se cambió por Ala y la Cys1 se reemplazó con un grupo acetilo (ac en la Tabla XXII). Varias variantes más cortas carecían de uno o más de los otros restos del bucle. Por lo tanto, estos péptidos se ciclaron sólo a través del enlace 1,5-diaminopentano. Dichos péptidos, que carecen de enlaces disulfuro, pueden ser más estables a la degradación in vitro e in vivo. También pueden tener una inmunogenicidad reducida en comparación con los análogos que contienen disulfuros.

Análisis funcional de hélices estabilizadas

Se ensayaron péptidos en un ensayo de BIACORE^{TM} como se describe en el documento WO 98/45427, anteriormente. Estos ensayos de inhibición (Fig. 35) comparaban la potencia relativa de estos péptidos para bloquear la interacción de IGFBP-1 con IGF-1. La adición de "la estabilización de hélice i+7" a una variante de BP1-01 redujo la potencia relativa (Tabla XXII) en 6 veces (péptido (i+8)C) a 8 veces (péptido (i+7)D o (i+8)B) en las variantes de hélices mejor estabilizadas. Estos péptidos demuestran que no es necesario un enlace disulfuro para obtener péptidos funcionales estructurados de la familia BP1-01.

Al contrario que las variantes de hélice estabilizada descritas anteriormente, una variante de hélice estabilizada en la que se perdieron dos de los determinantes de unión a IGFBP-1 clave ((i+7)A; (Tabla XXII), presentaba una pérdida significativa en la actividad de unión con respecto a BP1-01. En este péptido, W8 se reemplazó con el primer resto entrecruzante y Gly15 se reemplazó con el segundo resto entrecruzante; F14 se reemplaza por alanina en este péptido. El enlace disulfuro todavía está presente en este péptido.

Se prevé que ciertas adiciones en los extremos N-terminal y C-terminal de estos péptidos (véase el Ejemplo 3) mejoren su afinidad y potencia de unión, como en el caso de variantes peptídicas restringidas con disulfuros que se analizan a continuación.

Por lo tanto, una secuencia de consenso puede formularse de la forma siguiente: Xaa_{(1-4)}Xaa_{(5)}Xaa_{(6-7)}
ProLeuGluXaa_{(11)}LeuAIaXaa_{(14)}Xaa_{(15)}Xaa_{(16)} Xaa_{(17)}GluXaa_{(19)} (SEC ID Nº: 142), en la que Xaa_{(1-4)} está ausente o está entre 1 y 4 aminoácidos de cualquier clase; Xaa_{(5)} es cualquier aminoácido, Xaa_{(6-7)} está ausente o está entre 1 y 2 aminoácidos, Xaa_{(14)} y Xaa_{(15)} son de forma independiente cualquier aminoácido, Xaa_{11} y Xaa_{16} son de forma independiente Nal(1), His, Phe, Trp, Tyr, Pro, Gln o Met, Xaa_{(17)} está ausente o es 1-naftil-Ala, His, Phe, Trp, Tyr, Pro, Gln o Met y Xaa_{(19)} está ausente o es Gly.

Análisis de RMN de hélices estabilizadas

Se usó exige espectroscopía de RMN H^{1} para determinar que las variantes de hélices estabilizadas de BP1-01 tenían la estructura helicoidal tridimensional deseada. Se adquirieron espectros de una dimensión y de dos dimensiones COSY, TOCSY y ROESY para los péptidos (i+7)A, (i+7)B, (i+7)C, (i+7)D e (i+8)C; los detalles experimentales fueron similares a los descritos para BP1-01 en Lowman et al., anteriormente, 1998. Los análisis preliminares de la estructura de constantes del acoplamiento escalar ^{3}JHN-Ha (procedente del espectro COSY de 2D) y de distancias cortas H^{a}(i)-H^{N}(i+3) (procedentes del espectro ROESY) indicaban que para (i+7)A, (i+7)C, (i+7)D e (i+8)C, la hélice diseñada estaba presente. En el caso (i+7)B, los datos de RMN no eran coherentes con una estructura helicoidal. La falta de una estructura bien plegada explica presumiblemente la baja afinidad de este péptido por IGFBP-1 (>360 veces mas débil que BP1-01).

El acoplamiento escalar y los datos de ROESY para (i+7)A, (i+7)D e (i+8)C se analizaron con más detalle para generar restricciones de entrada para el cálculo de estructuras tridimensionales, como se ha descrito anteriormente para BP1-01 (Lowman et al., anteriormente, 1998). La comparación de las estructuras medias minimizadas de las variantes de hélice estabilizada con la de BP1-01 produjo una RMSD (átomos de N, Ca, C de Leu6-Phe14) de 1,02 A y 0,22 A para (i+7)D e (i+8)C, respectivamente. Además, el empaquetamiento de cadenas laterales hidrófobas de Leu6, Trp8, Leu9 y Tyr13 en estas dos variantes de hélice estabilizada también fue muy similar al empaquetamiento en BP1-01. Por lo tanto, los armazones de hélices estabilizadas de (i,i+7) y (i,i+8) habían mantenido con éxito muchos aspectos de la estructura de BP1-01 sin la necesidad de un enlace disulfuro. Aunque los enlaces covalentes en (i+7)A no produjeron las dos vueltas de hélice deseadas (la RMSD de Id, Ca, C entre medias minimizados de BP1-01 e (i+7)A es 1,06 \ring{A}), algunos rotámeros de cadenas laterales difirieron significativamente de los de BP1-01.

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Los análisis estructurales descritos anteriormente sugieren que los enlaces covalentes (distintos de los enlaces disulfuro observados en BP1-01) pueden usarse para controlar la estructura peptídica. El uso de enlaces i,i+7 o i,i+8 produjo péptidos (i+7)D e (i+8)C que conservaron una elevada afinidad hacia IGFBP-1 en ausencia de un enlace disulfuro. Presumiblemente, la afinidad procede de la estabilización de una estructura que mantiene tanto el plegamiento helicoidal de la estructura como el orden de empaquetamiento de las cadenas laterales de los determinantes de unión clave observados en BP1-01. Aunque el péptido (i+7)A mantiene el plegamiento de la estructura, faltan dos de los determinantes clave (Trp8 y Phe14) y la orientación de los otros (por ejemplo, Tyr1) está alterada; como resultado, este péptido tiene una afinidad reducida. El péptido (i+7)B no consigue adoptar el plegamiento deseado y, por lo tanto, no tiene una afinidad medible por IGFBP-1.

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TABLA XXII Variantes de hélices estabilizadas de BP1-01 (El primer y el último Glu (E) son sitios de "estabilización" por ciclado)

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Ejemplo 14 Variantes N-terminales de BP1-16

Experimentos previos de maduración por afinidad condujeron a una adición peptídica en el extremo C-terminal de BP1-02, incluyendo varios clones de péptidos en fagos (Tabla XXIII) y el péptido sintético BP1-21A, cuya secuencia se muestra en la Tabla XXIII. La Tabla XXIII ilustra las sustituciones C-terminales sobre el fondo de BP1-02.

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TABLA XXIII Sustituciones C-terminales procedentes de la vuelta 3 de selecciones de fagos monovalentes en el fondo peptídico de BP1-02

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En este ejemplo se busca mejorar adicionalmente la afinidad mediante dos métodos: sustitución de los cuatro primeros restos aminoacídicos N-terminales de BP1-20 en BP1-21A y realeatorización de los restos aminoacídicos N-terminales de BP1-21A (en el contexto del extremo C- terminal previamente mejorado).

Se sintetizó el péptido BP1-25 (Tabla XXV) para ensayar la aditividad (Wells, Biochemistry, 29: 8509-8517 (1990)) para las sustituciones N-terminales y C-terminales más preferidas. En comparación con BP1-16 en ensayos de inhibición, BP1-25 mostró aproximadamente una mejora de afinidad de 20 veces. Sin embargo, la afinidad de BP1-25 no se mejoró significativamente sobre la de BP1-21A. Esta mejora de afinidad se confirmó en otros ensayos que se describen a continuación.

En el segundo enfoque, una biblioteca de péptidos en fagos de presentación monovalente que presentaba BP1-21A como una fusión a g3p se aleatorizó ((Lowman, Methods Mol. Biol., 87: 249-264 (1998)) en los cuatro restos N-terminales. Se realizó una selección de unión a IGF-1 permitiendo primero que la biblioteca de fagos se uniera a IGFBP-1 biotinilada en solución, con una concentración inicial de 50 nM, seguida de 28 nM para las siguientes cuatro vueltas de selección. Los péptidos en fagos capaces de unirse a IGFBP-1 se capturaron mediante incubación con perlas magnéticas con estreptavidina (Promega) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Para cada vuelta de selección, el lavado se modificó gradualmente para que fuera más riguroso. La selección por velocidad de disociación se realizó añadiendo IGF 2,5-5 \muM en solución para evitar que se volviera a unir el fago con velocidades de disociación más rápidas. Es de interés señalar que para la última vuelta de selección (vuelta 5), con una incubación durante una noche a 4ºC en presencia de IGF 2,5 \muM, todavía había fagos que permanecían unidos a las perlas (se eluyeron 2,2 x 10^{4} fagos totales). Los datos de secuenciación posteriores revelaron que 14 de los 20 clones seleccionados habían convergido en una sola secuencia de ADN (clon Y0791A; Tabla XXIV). Se produjo sintéticamente un péptido que se correspondía con esta secuencia, BP1-40, para su análisis.

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TABLA XXIV Sustituciones N-terminales procedentes de la vuelta 5 de selecciones de fagos monovalentes en el fondo peptídico BP1-21A

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Se han descrito ensayos de inhibición para medir potencias relativas de péptidos para inhibir la unión de IGFBP-1 a IGF-1 (por ejemplo, documento WO 98/45472, anteriormente). Los péptidos que se describen en este documento tuvieron una afinidad de unión suficiente como para permitir la medición directa de afinidades de unión mediante resonancia de plasmón superficial (SPR) usando un sistema de BIAcore^{TM}. Las cinéticas de unión directa de péptidos IGFBP-1 se midieron inyectando una serie de péptidos diluidos dos veces en un tampón de desplazamiento (TWEEN 20^{TM} al 0,05% en PBS) sobre una microplaca biodetectora de carboximetilo (CM) acoplada con aproximadamente 590-1000 RU de IGFBP-1 a una velocidad de flujo de 50 \mul/min sobre un instrumento de BIAcore-2000^{TM} o BIAcore-3000^{TM}. La inmovilización de IGFBP-1 se realizó a través de la química EDC/NHS, como se describe por el fabricante. También se inyectaron péptidos a través de una celda de flujo que contenía IGFBP-3 como control de fondo. Puesto que la velocidad de disociación para la mayoría de los péptidos es relativamente rápida (en el intervalo de 2 x 10^{2} s^{-1}), la medición de la velocidad de disociación se ajustó durante 30 minutos. Esto permitió la regeneración de IGFBP-1 sobre la microplaca por disociación simple, en lugar de por adición de eluyente. Para cada dilución de péptidos, se realizó un ajuste global de los datos del sensograma usando un modelo de unión de Langmuir 1:1. Las velocidades de asociación variaron de 4 x 10^{5} a 1,9 x 10^{6} M^{-1} s^{-1}. Las afinidades de unión, K_{D}, calculadas como k_{off}/k_{on} se resumen en la Tabla XXV. Se descubrió que todos los péptidos BP1-20, BP1-21A, BP1-25 y BP1-40 tenían afinidades de unión similares (K_{D}) de aproximadamente 20 nM a 40 nM.

La conclusión de estos experimentos es que las prolongaciones N-terminales en el péptido BP1-01 puede mejorar la afinidad de unión (como en BP1-02, BP1-20, BP1-21A, BP1-25, BP1-40 y otras variantes identificadas en Tabla XXIV). Algunas sustituciones pueden alterar los niveles de expresión en E. coli, puesto que GQQS (SEC ID Nº: 147) se seleccionó claramente a partir de bibliotecas de péptidos presentados en fagos. Sin embargo, los péptidos que tenían las secuencias SEVG (SEC ID Nº: 148), SEMV (SEC ID Nº: 149), EARV (SEC ID Nº: 150) o GQQS (SEC ID Nº: 151) en sus extremos N-terminales tenían todos afinidades de unión similares. Por lo tanto, la naturaleza de cadenas laterales añadidas en el extremo N-terminal parece tener un efecto pequeño sobre la afinidad de unión del péptido. Esto sugiere que la interacción de la cadena principal del péptido en esta región puede contribuir a la afinidad de unión por IGFBP-1.

Por lo tanto, se espera que una secuencia de consenso mejorada para péptidos de unión a IGFBP-1 sea:

Xaa_{(1-4)}CysXaa_{(6)}Xaa_{(7)}GlyXaa_{(9)}LeuXaa_{(11)}Xaa_{(12)}LeuCysXaa_{(15)}Xaa_{(16)} Xaa_{(17)}Xaa_{(18)} (SEC ID Nº: 152), en la que Xaa(_{1-4}) está ausente o está entre 1 y 4 aminoácidos de cualquier clase, Xaa_{(6),} Xaa_{(7),} Xaa_{(9),} Xaa_{(11),} Xaa_{(15)} y Xaa_{(16)} son de forma independiente cualquier aminoácido y Xaa_{(12),} Xaa_{(17)} y Xaa_{(18)} son de forma independiente Nal(1), His, Phe, Trp, Tyr, Pro, Gln o Met. Como se indicaba en el Ejemplo 1, el truncamiento de los 4 restos amino-terminales (Xaa_{(1-4)}) sólo tiene un efecto pequeño sobre la actividad, dando una secuencia de consenso más corta que todavía conserva la capacidad de unión: CysXaa_{(6)}Xaa_{(7)}GlyXaa_{(9)}LeuXaa_{(11)}TrpLeuCysXaa_{(15)}Xaa_{(16)}Xaa_{(17)}Xaa_{(18)} (SEC ID Nº: 130).

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TABLA XXV Determinaciones de afinidad de péptidos mediante cinética de BIAcore^{TM}

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Ejemplo 15 Ensayo basado en células de actividad peptídica

Se ha descrito anteriormente un ensayo basado en células (KIRA) para medir la cantidad de actividad de tipo IGF desplazada por péptidos de mezclas de IGF-1 y proteínas de unión (Lowman et al., anteriormente, 1998; WO 98/45427, anteriormente). Se usó un ensayo de KIRA para comparar la bioactividad in vitro de BP1-16, BP1-02, BP1-25 y BP1-40. En este ejemplo, se usaron concentraciones muy bajas de IGF-1 e IGFBP-1, es decir, por debajo de la K_{D} del péptido: [IGF-1] 2nM y [IGFBP-1] 1,5 nM, con una serie de titulación de [péptido] = de 0,1 a 200 nM. Se mezclaron IGF-1 y péptido y se añadieron a células que expresaban receptor de IGF durante 30 min y después añadió IGFBP-1 durante 1 h adicional.

Se observó una potencia aumentada para ambos péptidos BP1-25 y BP1-40 sobre los péptidos BP1-16 y BP1-02 (Fig. 36). Sin embargo, en estas condiciones, BP1-02 no era significativamente más activo que BP1-16; y BP1-40 no era significativamente más activo que BP1-25. Los valores de CE_{20} (concentración a la que se observa el 20% de la actividad de IGF-1 máxima) fueron de 10-20 nM para BP1-25 y BP1-40 y de 150-200 nM para BP1-16 y BP1-02.

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Ejemplo 16 Biosíntesis de una variante peptídica de BP1-01

Se diseñó una variante adicional de BP1-21A para la biosíntesis peptídica en E. coli. Para este enfoque, se fusionó una secuencia de ADN que codificaba el péptido mediante mutagénesis dirigida al gen para un dominio de consenso de proteína A conocido como dominio Z (Nilsson et al, anteriormente, 1987). Después de la expresión y secreción a partir de E. coli, la proteína de fusión se escindió enzimáticamente con tripsina para producir el péptido libre, que puede purificarse a partir de la mezcla de reacción enzimática (véase, por ejemplo, Varadarajan et al., anteriormente, Castellanos-Serra et al., anteriormente; Nilsson et al., anteriormente, 1996).

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Se ha descrito un procedimiento detallado para digestiones con tripsina en Smith, anteriormente. Debido a que esta proteasa es muy específica para restos de Arg y Lys, el péptido BP1-40 se modificó mediante mutación de estos restos para la construcción de la fusión. A partir de resultados anteriores de mutagénesis y biblioteca de fagos, se sabía que los restos de Arg y Lys de BP1-01 podían sustituirse sin una pérdida significativa de afinidad de unión. Por lo tanto, se diseñó una proteína de fusión con sustituciones R2A y K12H (numeración de acuerdo con la secuencia de BP1-01). Además, BP1-01, que tenía un resto de Gly después del F14 C-terminal de BP1-16, se sabía que no tenía un efecto significativo sobre la afinidad de unión. Por lo tanto, se añadió una secuencia Gly-Arg en el extremo del péptido para permitir la escisión con tripsina. Las secuencias de la proteína de fusión BP1-625-Z y el péptido BP1-625 (escindido por tripsina) se proporcionan en la tabla XXVI.

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TABLA XXVI Secuencias peptídicas para biosíntesis en E. coli

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La proteína de fusión BP1-625-Z se produjo a partir de cultivos en matraces de agitación de E. coli. Se esterilizaron por filtración sobrenadantes de cultivo y después se aplicaron a una columna de IgG-Sepharose^{TM} (Pharmacia). La fracción unida se eluyó con ácido acético 1 M, después se liofilizó y se resuspendió en tampón de digestión con tripsina: Tris 10 mM (pH 8,0), NaCl 100 mM, CaCl_{2} 1 mM. Se añadió tripsina tratada con TPCK (Sigma) a una proporción peso/peso de 1:100 a 1:200 (tripsina con respecto a sustrato) y se llevó a cabo la digestión a 25ºC durante 1-2 horas. A partir de entonces, se añadió PMSF a 1 mM para detener la reacción. Las muestras se ajustaron a TFA 1 mM y se procesaron en una columna de HPLC analítica con un gradiente de acetonitrilo de 0-60% en TFA al 0,1%. Los dos picos predominantes se recogieron (Fig. 37) y se demostró por espectrometría de masas que se corresponden con un fragmento de dominio Z y el péptido BP1-625.

La fracción del péptido BP1-625 se liofilizó y se resuspendió en tampón HEPES 100 mM, pH 7,2. Se llevaron a cabo experimentos de inhibición en un ensayo de BIAcore^{TM}, como se ha descrito anteriormente, excepto por que se usaron cantidades limitantes (IGFBP-1 9-10 nM) para hacer que el ensayo fuera sensible con respecto a las afinidades en el intervalo de 10^{-8} M. Estos ensayos mostraron que el péptido BP1-625 bloqueaba la unión de IGFBP-1 a IGF-1 inmovilizado y era similar en actividad a BP1-25, que tenía una potencia mejorada aproximadamente 20 veces sobre BP1-01 (Fig. 38).

Puede predecirse que BP1-625 bloqueará la unión de IGF-1 a IGFBP-1 y producirá actividades similares a IGF en células, con una potencia similar a BP1-21A, BP1-25 o BP1-40. También se esperaría que un péptido, BP1-625T, que comprende la secuencia:

GlyGlnGlnSerCysAlaAlaGlyProLeuGlnTrpLeuCysGluHisTyrPheSerThrTyr (SEC ID Nº: 153) actuara de forma similar a BP1-625.

La fusión BP1-625-Z es útil para producir péptidos de unión a IGFBP a partir de E. coli y la parte Z de la fusión puede unirse ventajosamente a otros péptidos de este documento en lugar de sólo a BP1-625.

Ejemplo 17 Explantes de cartílago articular de articulaciones humanas Materiales y métodos

Se usaron los mismos Materiales y métodos (para tejido humano) que se han descrito anteriormente, usando explantes de cartílago articular de articulaciones humanas extirpadas de pacientes que se someten a reemplazo de articulaciones. Estos explantes se cultivaron con IGF-1 solo a 40 ng/ml o IGF-1 con BP1-17, BP3-15 o BP1-16 (0,1 mg/ml) o IGF-1 con tampón (HEPES).

Se midió la degradación y la síntesis de proteoglicano como se ha descrito anteriormente.

Resultados y discusión

Se ensayó el papel de IGFBP específicas en la actividad de IGF-1 tratando los explantes de cartílago articular de pacientes que se someten a reemplazo de articulaciones con IGF-1 en presencia de péptidos que inhiben la unión de IGF-1 a IGFBP particulares. En particular, BP1-16 inhibe la unión de IGF-1 a IGFBP-1 y BP3-15 inhibe la unión de IGF-1 a IGFBP-3. BP1-17 se une con una afinidad mucho menor a IGFBP-1. Además, se incluyó tampón solo (HEPES 100 mM) como control negativo.

Como se muestra en la Figura 39; tanto BP1-15 como BP1-16 y también BP1-17 en menor grado, potencian el efecto protector de IGF-1. En concreto, BP3-15 y BP1-16, y en cierto grado BP1-17, potencian el anabolismo, como se demuestra por el aumento en la síntesis de la matriz. Por lo tanto, estos tres péptidos y, especialmente, BP3-15 y BP1-16, se espera que sean agentes terapéuticos útiles para el tratamiento de la artritis.

Claims

1. Un análogo de IGF-1 con una preferencia de afinidad de unión por la proteína de unión al factor de crecimiento de tipo insulina 3 (IGFBP-3) sobre la proteína de unión al factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGFBP-1) o un análogo de IGF-1 con una preferencia de afinidad de unión por IGFBP-1 sobre IGFBP-3,

en el que el análogo es una variante de IGF-1 en la que el resto aminoacídico en las posiciones 3, 7, 10, 16, 25 ó 49 o los restos aminoacídicos en las posiciones 3 y 49 del IGF-1 humano de secuencia nativa se reemplazan con un resto de alanina, de glicina o de serina o en la que el resto aminoacídico en las posiciones 9, 12, 15 ó 20 del IGF-1 humano de secuencia nativa se reemplaza con un resto de lisina o arginina

para el uso en un método para la prevención o el enlentecimiento de degradación de la matriz de cartílago, en el que dicho método comprende poner en contacto una cantidad eficaz de uno de dichos agentes activos con el cartílago.

2. El análogo de la reivindicación 1, en el que el método se va a realizar en el contexto de un trastorno que se encuentra en un mamífero y el agente activo se va a administrar al mamífero.

3. El análogo de la reivindicación 2, en el que el agente activo se va a administrar localmente en el cartílago.

4. El análogo de la reivindicación 3, en el que el agente activo es un análogo de IGF-1 con una preferencia de afinidad de unión por IGFBP-3 sobre IGFBP-1, en el que el agente activo se va a administrar al mamífero con una cantidad eficaz de IGF-1, subunidad ácido labil (ALS) o IGF-1 y ALS.

5. El análogo de la reivindicación 4, en el que el agente activo e IGF-1 o ALS, o el ingrediente activo, IGF-1 y ALS se van a administrar juntos como un complejo.

6. El análogo de la reivindicación 2, en el que el mamífero es un ser humano.

7. El análogo de la reivindicación 1, en el que el agente activo es F49A, E3A, F16A, E3AF49A, F16AF49A, D12K o D12R.

8. El análogo de la reivindicación 1, en el que el método se va a realizar en el contexto de un trastorno cartilaginoso degenerativo.

9. El análogo de la reivindicación 8, en el que el trastorno es un trastorno del cartílago articular.

10. El análogo de la reivindicación 9, en el que el trastorno del cartílago articular se selecciona del grupo constituido por artritis reumatoide y osteoartritis.

11. El análogo de la reivindicación 1, en el que el agente activo se va a administrar mediante inyección directa en la región o articulación cartilaginosa afectada.

12. El análogo de la reivindicación 1, en el que el agente activo es una formulación de liberación prolongada.

13. El análogo de la reivindicación 1, en el que el agente activo se va a administrar con una cantidad eficaz de un factor de crecimiento de cartílago o un antagonista del catabolismo del cartílago al cartílago.

14. El análogo de la reivindicación 13, en el que el factor de crecimiento de cartílago es IGF-1.

15. Uso de un análogo de IGF-1 con una preferencia de afinidad de unión por la proteína de unión al factor de crecimiento de tipo insulina 3 (IGFBP-3) sobre la proteína de unión al factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGFBP-1) o un análogo de IGF-1 con una preferencia de afinidad de unión por IGFBP-1 sobre IGFBP-3,

en el que el análogo es una variante de IGF-1 en la que el resto aminoacídico en las posiciones 3, 7, 10, 16, 25 ó 49 o los restos aminoacídicos en las posiciones 3 y 49 del IGF-1 humano de secuencia nativa se reemplazan con un resto de alanina, de glicina o de serina, o en la que el resto aminoacídico en las posiciones 9, 12, 15 ó 20 del IGF-1 humano de secuencia nativa se reemplaza con un resto de lisina o arginina

para la preparación de una composición para la prevención o enlentecimiento de la degradación de la matriz de cartílago, en la que una cantidad eficaz de uno de dichos agentes activos se va a poner en contacto con el cartílago.

16. El uso de la reivindicación 15, con las características que se definen en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14.