PT828758E

PT828758E - Analogos quimericos de corpo gordo-pro-grf com potencia biologica aumentada

Info

Publication number: PT828758E
Application number: PT96914826T
Authority: PT
Inventors: Thierry Abribat; Michel Ibea; Paul Brazeau
Original assignee: Theratechnologies Inc
Priority date: 1995-05-26
Filing date: 1996-05-22
Publication date: 2002-02-28
Also published as: KR100543190B1; ATE204881T1; BRPI9608799B8; DK0828758T3; AU5683396A; WO1996037514A1; DE69614849T2; DE69614849D1; JPH11505807A; ES2163020T3; AU697119B2; US5861379A; MX9709098A; BR9608799B1; EP0828758B1; JP3576170B2; US5939386A; EP0828758A1; BR9608799A; KR19990021938A

Description

DESCRIÇÃO "Análogos quiméricos de corpo gordo-pro-GRF com potência biológica aumentada"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO (a) Campo da invenção A invenção refere-se a análogos quiméricos de corpo gordo-pro-GRF com potência biológica aumentada e actividade prolongada. (b) Descricão da arte anterior A hormona do crescimento (GH) ou somatotropina, segregada pela glândula pituitária constitui uma família de hormonas cuja actividade biológica é fundamental para o crescimento linear de um organismo jovem mas também para a manutenção da integridade no seu estado adulto. A GH actua directa ou indirectamente sobre os órgãos periféricos estimulando a síntese de factores de crescimento (factor de crescimento-l semelhante a insulina ou IGF-I) ou dos seus receptores (factor de crescimento epidérmico ou EGF). A acção directa da GH é do tipo referido como anti-insulínico, que favorece a lipólise ao nível dos tecidos adiposos. Através da sua acção sobre a síntese e secreção de IGF-I (somatomedina C), a GH estimula o crescimento da cartilagem e dos ossos (crescimento estrutural), a síntese de proteínas e a proliferação celular em múltiplos órgãos periféricos, incluindo os músculos e a pele. Através da sua actividade biológica, a GH participa, nos adultos, na manutenção de um estado de anabolismo proteico, e desempenha um papel principal no fenómeno de regeneração de tecidos após um traumatismo. A diminuição da secreção de GH com a idade, demonstrada em humanos e animais, favorece um desvio metabólico no sentido do catabolismo que inicia ou participa no envelhecer de um organismo. A perda de massa muscular, a acumulação de tecidos adiposos, a desmineralização óssea, a perda de capacidade de regeneração de tecidos após uma lesão, que se observam nos idosos, correlacionam-se com a diminuição da secreção de GH. 07 41S ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 2

A GH é assim um agente anabólico fisiológico absolutamente necessário para o crescimento linear de crianças e que controla o metabolismo das proteínas nos adultos. A secreção de GH pela glândula pituitária é controlada principalmente por dois péptidos hipotalâmicos, a somatostatina e o factor de libertação da hormona do crescimento (GRF). A somatostatina inibe a sua secreção, enquanto o GRF a estimula. A GH humana tem sido produzida por engenharia genética desde há cerca de dez anos. Até recentemente, a maior parte das utilizações da GH eram relacionadas com o atraso do crescimento em crianças e agora estudam-se as utilizações da GH em adultos. As utilizações farmacológicas da GH e do GRF podem ser classificadas nas seguintes três categorias principais.

Crescimento de crianças

Mostrou-se que os tratamentos com hormona do crescimento humana recombinante estimulam o crescimento em crianças com nanismo pituitário, insuficiências renais, síndroma de Turner e estatura baixa. A GH humana recombinante é presentemente comercializada na forma de uma "droga órfã" na Europa e nos Estados Unidos para o retardamento do crescimento de crianças provocado por uma deficiência em GH e para insuficiências renais em crianças. As outras utilizações estão em investigação, ensaios clínicos.

Tratamento de longo prazo para pacientes adultos e idosos

Uma diminuição da secreção de GH causa alterações na composição corporal durante o envelhecimento. Estudos preliminares de um tratamento de um ano com GH humana recombinante reportaram um aumento da massa muscular e da espessura da pele, uma diminuição da massa gorda com um ligeiro aumento da densidade óssea, numa população de pacientes idosos. Em relação à osteoporose, estudos recentes sugerem que a GH humana recombinante não aumenta a mineralização óssea mas é sugerido que pode evitar a desmineralização óssea em mulheres no período pós-menopausa. Estão presentemente a decorrer estudos adicionais para demonstrar esta teoria.

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Tratamento de curto prazo em pacientes adultos e idosos

Em estudos pré-clínicos e clínicos, tem-se verificado que a hormona do crescimento estimula o anabolismo de proteínas e a cicatrização em casos de queimaduras, SIDA e cancro, na cicatrização óssea e de ferimentos. A GH e o GRF destinam-se também a utilizações farmacológicas veterinárias. Tanto a GH como o GRF estimulam o crescimento em porcos durante o seu período de engoda favorecendo a deposição de tecidos musculares em vez de tecidos adiposos e aumentam a produção de leite em vacas, e isto sem quaisquer efeitos secundários indesejados que poderiam por em perigo a saúde dos animais e sem quaisquer resíduos na carne ou no leite produzidos. A somatotropina bovina (BST) é presentemente comercializada nos Estados Unidos. A maioria dos estudos clínicos presentemente a decorrer foram conduzidos com GH recombinante. O GRF é considerado como um produto de segunda geração destinado a substituir num futuro próximo as utilizações da GH na maioria dos casos. Em acordo, a utilização de GRF apresenta várias vantagens sobre a utilização de GH per se.

Vantagens fisiológicas A hormona do crescimento (GH) é segregada pela glândula pituitária de uma maneira pulsada, uma vez que este ritmo de secreção é crucial para uma actividade biológica óptima. A administração de GH, para corresponder ao seu modo de secreção natural, é difícil de conseguir. Quando se administra o GRF de uma maneira contínua tal como numa preparação de libertação lenta ou na forma de uma infusão, este aumenta a secreção de GH respeitando ao mesmo tempo a sua característica pulsátil. A GH recombinante que é presentemente comercializada está na forma de 22 kDa enquanto o GRF induz a síntese e a secreção a partir da glândula pituitária de todos os isómeros químicos da GH que participam numa gama mais vasta de actividades biológicas.

Um tratamento com GH resulta numa capacidade diminuída da glândula pituitária para segregar hormona do crescimento endógena, e a resposta de GH ao GRF diminui após um tal tratamento. Pelo contrário, um tratamento com GRF

87415 , ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 4 1 não apresenta estas desvantagens, a sua acção trófica sobre a glândula pituitária aumenta a capacidade de secreção desta glândula em animais normais e em pacientes com insuficiência de somatotrofos.

Vantagens Económicas A produção de GH por engenharia genética é muito dispendiosa para utilização clínica. Em particular, existem riscos de contaminação destas preparações comerciais com material da estirpe bacteriana utilizada. Estes contaminantes bacterianos podem ser pirogénios ou podem resultar erh reacções imunogénicas nos pacientes. A purificação do produto recombinante é efectuada seguindo uma pluralidade sucessivos de passos de cromatografia. Os φ drásticos critérios de pureza originam múltiplos passos de controlo de qualidade. A síntese de GRF é de natureza química. A síntese efectuada numa fase sólida e a sua purificação são realizadas num único passo utilizando cromatografia líquida de alta resolução (HPLC). Também a quantidade de GRF a administrar é muito inferior à quantidade de GH para a mesma actividade biológica resultante.

Mesmo com todas estas vantagens, o GRF ainda não é comercializado até à data como agente terapêutico devido, principalmente, à sua instabilidade química. O GRF humano é um péptido de 44 aminoácidos com a seguinte sequência:

Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Vai Leu Gly Gin 15 10 15

Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Met Ser Arg Gin Gin Gly 20 25 30

Glu Ser Asn Gin Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu- NH2 35 40 (SEQ ID NO:1). O núcleo mínimo activo é o hGRF (1-29)NH2

Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Vai Leu Gly Gin 15 10 15

Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Met Ser Arg 20 25 (SEQ ID NO:2). 1 87 415 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 5

Tal como muito péptidos, o hGRF (1-29)NH2 é rapidamente degradado num meio sérico e os seus metabolitos não têm actividade biológica residual. Foi bem estabelecido que a acção de enzimas, nomeadamente a da dipeptidilaminopeptidase do tipo IV, num meio sanguíneo resulta na hidrólise da ligação peptídica Ala2-Asp3 de GRF. Esta hidrólise resulta numa multiplicidade de consequências negativas que foram o objecto de muitos estudos reportados na literatura. Essencialmente, esta hidrólise conduz à formação de péptidos truncados de actividade específica reduzida para menos de 1/1000 da actividade biológica.

Estudos clínicos com crianças e adultos confirmaram que o hGRF (1-44)NH2 natural ou o fragmento activo hGRF (1-29)NH2 não são suficientemente potentes para produzir efeitos iguais correspondentes aos da GH recombinante.

Foram descritos muitos análogos de GRF, mas todos apresentam as desvantagens de serem GRF modificados possuindo uma sequência de aminoácidos diferente ou possuindo aminoácidos sintéticos (série D) adicionados. Estes análogos de GRF são potencialmente imunogénicos e a sua administração a humanos pode causar problemas de imunotoxicidade e potenciais efeitos secundários. É bem conhecido que a ancoragem de grupos hidrófobos, tais como -NEt2 no terminal C de uma sequência peptídica pode resultar numa actividade específica significativamente aumentada. Em termos de hidrofobicidade, estes resultados são contrariados por vários trabalhos recentes tais como os de Muranichi (S. Muranichi et al., 1991, Pharm. fíes., 8:649-652) que sublinham a ineficácia do grupo lauroílo como um grupo hidrófobo utilizado na síntese de pequenos análogos peptídicos. Portanto, as investigações contraditórias da arte anterior não abordam a questão de encontrar um análogo de GRF mais potente utilizando resíduos hidrófobos.

Gaudreau et al. (P. Gaudreau et al., 1992, J. Med. Chem., 35(10),:1864-1869) descrevem a afinidade de acetil-, 6-amino-hexanoil-, e 8-amino-octanoil-GRF(1-29)NH2 com o receptor de pituitária de rato. Neste relatório, nenhum dos compostos ácido gordo-GRF testados exibiu uma afinidade superior à do próprio hGRF(1-29)NH2, e os autores concluíram que "...modificações para aumentar o 87 415 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 6

carácter hidrófobo no terminal N de hGRF(1-29)NH2 não constituem uma abordagem adequada ao aumento da afinidade para com o receptor.".

Coy et a/. (D.H. Coy et al., 1987, J. Med. Chem., 30:219-222; pedido de patente europeia publicado com o número 314 866 em 10 de Maio de 1989) descrevem um péptido acetil-GRF com uma actividade biológica aumentada num modelo de rato, mais particularmente num rato anestesiado com pentobarbital de sódio. A resposta de GH in vitro por células de pituitária de rato em cultura foi também analisada. Contudo, estes autores não sintetizaram nem testaram análogos de ácido gordo-GRF com uma cadeia de carbonos superior a 2 (acetilo) adicionada à região do terminal N do GRF.

Até ao presente, a maioria dos análogos de GRF descritos (incluindo os de Gaudreau et al. e os de Coy et aí.) foram testados em modelos de rato, quer in vitro quer in vivo. Uma vez que o GRF(1-29)NH2 humano e o de rato são marcadamente diferentes, as relações estrutura-actividade do GRF são diferentes nas duas espécies. Portanto, não é possível extrapolar resultados obtidos em ratos para humanos. 0 pedido de patente europeia publicado com o número 314 866 em 10 de Maio de 1989 descreve péptidos GRF mono- e per-alquilados derivados dos péptidos GRF naturais por alquilação redutora.

0 pedido de patente europeia publicado com o número 320 785 em 6 de Junho de 1989 descreve análogos de GRF incluindo uma cadeia seleccionada de entre alquilo(C,-C8); alquiHC^C^carbonilo e carboxialquiloíC^Cg); 0 pedido de patente europeia publicado com o número 511 003 em 28 de Outubro de 1992 descreve análogos de GRF modificados no terminal amino possuindo actividade e potência superiores em relação ao GRF nativo ou a análogos de GRF descritos anteriormente.

Em acordo, é necessário desenhar análogos de GRF com potência anabólica melhorada e possuindo uma actividade prolongada. Esta potência aumentada pode resultar de uma resistência à degradação sérica e/ou de propriedades hiperagonistas.

87 415 : ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 7 1 Seria altamente desejável proporcionar análogos de GRF com potência anabólica aumentada, mantendo-se biodegradáveis e estruturalmente próximos do GRF natural, de modo a evitar reacções imunitárias quando injectados cronicamente em humanos e animais.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objectivo da presente invenção consiste em proporcionar novos análogos de pro-GRF biodegradáveis e não imunogénicos com potência biológica melhorada e actividade prolongada.

Outro objectivo da presente invenção consiste em proporcionar análogos φ de pro-GRF com potência anabólica aumentada e actividade prolongada, i.e. capazes de elevar substancialmente os níveis de factor de crescimento I semelhante a insulina (IGF-I), quando administrado cronicamente em humanos e animais.

Outro objectivo da presente invenção consiste em proporcionar um meio para tornar qualquer análogo de pro-GRF mais biologicamente potente e com uma actividade prolongada.

Outro objectivo da presente invenção consiste em proporcionar um método de produção de análogos de pro-GRF activos com potência anabólica melhorada e actividade prolongada. A presente invenção refere-se à preparação de análogos quiméricos de corpo gordo-GRF. Estes análogos quiméricos incluem uma porção hidrófoba (cauda), e podem ser preparados, por ancoragem de uma ou várias caudas hidrófobas ao GRF. Os análogos de pro-GRF de acordo com a presente invenção são caracterizados pelos factos: a) Estes análogos possuem uma actividade biológica melhorada; especificamente, são capazes de aumentar marcadamente os níveis de GH e IGF-I no sangue, quando administrados a um modelo animal relacionado de forma próxima com os humanos. Esta característica é particularmente vantajosa na medida em que resulta na administração ao paciente de uma dosagem reduzida de um composto hiperactivo, melhorando assim a eficácia do tratamento e reduzindo os custos do tratamento.

87 415 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 8 b) Tanto aminoácidos naturais como substâncias hidrófobas metabolizáveis, tais como ácido gordos, são utilizados para a síntese química dos análogos de pro-GRF. Esta utilização de substâncias naturais completamente metabolizáveis destina-se a evitar os potenciais efeitos secundários, nomeadamente em casos de administrações múltiplas. c) Apresentam uma elevada actividade biológica em dosagens infinitamente pequenas. d) Permanecem activos durante um período de tempo prolongado, com uma elevada actividade biológica. A utilização de corpos gordos de acordo com a presente invenção resulta em análogos de pro-GRF que superam todas as desvantagens da arte anterior. Os análogos de pro-GRF da presente invenção são biodegradáveis, não imunogénicos e exibem uma potência anabólica melhorada com uma dosagem reduzida e têm uma actividade prolongada. Adicionalmente, a presente invenção refere-se ao GRF e a qualquer dos seus análogos, truncados ou substituídos.

Inesperadamente, os resultados da presente invenção mostraram que o N-hexanoil-GRF(1-29)NH2, mas não o N-butiril- nem o N-octanoil-GRF(1-29)NH2, aumentaram estatisticamente os níveis de IGF-I, quando administrados cronicamente em porcos em crescimento. Estes resultados indicam que a adição de uma cadeia C4 ou C8 na região do terminal N de GRF produziu compostos com uma pobre actividade biológica quando comparada com a do N-hexanoil-GRF (C6-GRF). Portanto, a presente invenção ensina que o comprimento óptimo da cadeia de carbonos a ancorar ao GRF para aumentar a sua bioactividade é C5 a C7. Este resultado foi inesperado com base nos estudos publicados por Coy et al., que demonstram que a N-acetilação do GRF (adição de uma cadeia C2) aumentou a sua bioactividade em ratos, e que não documentam a actividade de compostos com uma cadeia de carbonos superior a C2.

De acordo com o método da presente invenção, estes análogos podem ser produzidos por ancoragem de uma ou várias caudas hidrófobas na porção N-terminal ou C-terminal do GRF ou seus análogos. Após clivagem e 9 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ iè L· purificação, ο péptido modificado resultante exibe uma actividade biológica melhorada quando administrado numa dosagem muito pequena.

De acordo com a presente invenção, proporciona-se um análogo quimérico de corpo gordo-GRF com potência biológica aumentada, com a seguinte fórmula geral: A1 -A2-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-A8-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-A1 5-Gln-Leu-A1 8-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-A24-Asp-lle-A27-A28-Arg-A30 em que, A2 é Vai ou Ala; A1 5 é Ala ou Gly; A24 é Gin ou His; A27 é Met, lie ou Nle; A28 é Ser ou Asp; A30 é qualquer aminoalquilcarboxamido-NH-(CH2)n-CONH-, com n = 1 a 12; ou qualquer sequência de aminoácidos de 1 a 15 resíduos; e A1 é Tyr ou His; A8 é Asn ou Ser e A18 é Ser ou Thr, em que A1 é ancorado em N ou 0 por uma cauda hidrófoba com a seguinte fórmula geral I: R3 ^2 Ri

R4-(Z)h-(CH)g-(W'-Y')f-(CH)e-(W = Y)d-(CH)c-(X)b-(G)a- I em que, G é um grupo carbonilo, fosfonilo, sulfurilo ou sulfinilo, com a= 0 ou 1; X é um átomo de oxigénio, enxofre ou um grupo amino (-NH-), com b= 0 ou 1 ; os radicais R1( R2 e R3 são iguais ou diferentes e são seleccionados de entre um grupo hidroxilo, um átomo de hidrogénio, e um grupo alquilo inferior, linear ou ramificado; -(W = Y)- e -(W’=Y’)- representam as ligações duplas cis ou trans -(CH = CR5)- e -(CH = CR6)- com R5 e R6= H ou alquilo C,-^; com d ef = 0 ou 1 ; R4 é um grupo hidroxilo, um átomo de hidrogénio ou um alquilo C5-C9; e Z é um átomo de oxigénio ou de enxofre; com h = 0 a 1

87 415 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 10 com a condição de que a, b, c, d, e, f, g e h sejam iguais ou diferentes e não sejam todos zero quando R4 é hidrogénio, e a soma de a, b, c, d, e, f, g e h seja tal que a cauda hidrófoba de fórmula I tenha uma cadeia principal linear entre 5 e 8 átomos (C, O e/ou S). O análogo quimérico de corpo gordo-pro-GRF preferido da presente invenção é seleccionado de entre o grupo que consiste nos casos: a) em que A1 é Tyr ou His ancorado em N-alfa por uma cauda hidrófoba de fórmula I, em que tanto a como b= 1; cada um de d, f e h = O; G= carbonilo; X= átomo de oxigénio; R1# R2, R3, R4 = átomo de hidrogénio e a soma c + e + g = 3, 4, 5 ou 6; b) em que A1 é Tyr ou His ancorado em N-alfa por uma cauda hidrófoba de fórmula I, em que a= 1; cada um de b, d, f e h= O; G= carbonilo; R1( R2, R3 e R4= grupo hidroxilo e a soma c + e + g = 4, 5, 6 ou 7; c) em que A1 é Tyr ou His ancorado em N-alfa por uma cauda hidrófoba de fórmula I, em que a= 1; cada um de b e h= O; a soma d + f= 1; G= carbonilo; R,, R2, R3 e R4= átomo de hidrogénio e a soma c + e + g = 2, 3, 4 ou 5; e d) em que A1 é Tyr ou His ancorado em N-alfa por uma cauda hidrófoba de fórmula I, em que a= 1; cada um de b e h = 0; a soma d + f= 2; G= carbonilo; R1( R2, R3 e R4= átomo de hidrogénio e a soma c + e + g = 0, 1, 2 ou 3; e e) em que A1 é Tyr ou His ancorado em N-alfa por uma cauda hidrófoba de fórmula I, em que a= 1; cada um de b, h, d e f= 0; G= carbonilo; R,, R2, R3 e R4= átomo de hidrogénio; e a soma c + e + g = 4, 5, 6 ou 7.

Para as finalidades da presente invenção, a expressão "cauda hidrófoba" ou "Ht" pretende significar qualquer corpo gordo funcionalizado, tais como ácidos gordos, aminas gordas, álcoois gordos, derivados de colesterol, etc. A expressão "resíduo pseudomicelar” ou "Pr" pretende significar qualquer α-aminoácido com cadeia lateral desenhada de modo a que o resíduo possa formar ou adoptar uma estrutura micelar na sua forma zwiteriónica.

De acordo com a presente invenção, proporciona-se uma formulação farmacêutica para a indução da libertação da hormona do crescimento que

87 415 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 11 compreende como ingrediente activo um análogo de GRF da presente invenção em associação com um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Na presente invenção os aminoácidos são identificados pelas abreviaturas convencionais de três letras tal como indicado abaixo, que são geralmente aceites na arte dos péptidos como recomendado pela comissão da IUPAC-IUB na nomenclatura bioquímica:

Alanina Ala Arginina Arg Asparagina Asn Ácido aspártico Asp Cisteína Cys Ácido glutâmico Glu Glicina Gly Histidina His Leucina Leu Lisina Lys Metionina Met Ornitina Orn Fenilalanina Phe Prolina Pro Serina Ser Treonina Thr Triptofano Trp Tirosina Tyr D-Tirosina tyr Valina Vai A expressão "aminoácido natural" significa um aminoácido que ocorre na natureza ou que é incorporado como um resíduo de aminoácido num péptido de ocorrência natural.

Em adição, a abreviatura Nle pretende significar Norleucina.

Outras abreviaturas utilizadas são: TFA Ácido trifluoroacético; ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 12

HOBt DIC DMF Pip DMAP Boc Fmoc

BOP Me HF NEt3 TEAP 1 -Hidroxibenzotriazolo; Diisopropilcarbodiimida; Dimetilformamida; Piperidina; 4-dimetilaminopiridina; t-butiloxicarbonilo; Fluorenilmetiloxicarbonilo; Hexafluorofosfato de benzotriazo-1 -iloxitris(dimetilamino)fosfónio; Metilo; Ácido fluorídrico; Trietilamina; e Fosfato de trietilamónio (tampão).

Todas as sequências peptídicas aqui estabelecidas estão escritas de acordo com a convenção geralmente aceite segundo a qual o aminoácido N-terminal está do lado esquerdo e o aminoácido C-terminal está do lado direito.

BREVE DESCRICÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 é um gráfico do efeito de análogos de hGRF(1-29)NH2 injectados subcutaneamente sobre IGF-1 sérico de porco; A Fig. 2 é uma curva do efeito de uma injecção intravenosa de (4 pg/kg) hGRF(1-29)NH2 e (4 pg/kg) análogo (trans-3-hexenoil)0 hGRF (1-29)NH2 (TT-01024) sobre GH sérica de porco; A Fig. 3 é um gráfico que mostra o efeito de várias doses de hGRF(1-29)NH2 vs [trans-3-hexenoil]° hGRF(1-29)NH2 (TT-01024) sobre a área sob a curva de GH ao longo de 300 minutos após administração I.V. (**ρ<0 oi e ***P<0,001 quando comparado com o período de base --60 a 0 min-); A Fig. 4 é uma curva do efeito de uma injecção subcutânea de 5 pg/kg de hGRF(1-29)NH2 e (5 pg/kg) análogo (trans-3-hexenoil)0 hGRF (1-29)NH2 sobre GH sérica de porco; e 87 410 ΕΡ 0 828 758/ΡΤ 13

A Fig. 5 é um gráfico que mostra o efeito de várias doses de hGRF(1 -29)NH2 vs [trans-3-hexenoil]° hGRF(1-29)NH2 (TT-01024) sobre a área sob a curva de GH ao longo de 420 minutos após administração S.C. (**P<0,01 e ***P<0,001 quando comparado com o período de base --60 a 0 min-).

DESCRICÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à utilização de corpos gordos, nomeadamente resíduos pseudomicelares e/ou caudas hidrófobas para produzir uma nova família de análogos quiméricos de corpo gordo-pro-GRF, altamente potentes, mantendo-se biodegradáveis e não imunogénicos.

De acordo com a presente invenção, os análogos de corpo gordo-pro-GRF podem ser sintetizados quimicamente: - por ancoragem de uma ou várias caudas hidrófobas na porção C-terminal e/ou N- terminal do GRF ou um dos seus análogos, ou por incorporação de um ou vários derivados de a-aminoácidos pseudomicelares ("resíduos pseudomicelares") na síntese química do GRF ou de um dos seus análogos.

De acordo com a presente invenção, a estrutura dos resíduos pseudomicelares (Pr) utilizados como um elo na síntese de GRF e seus análogos podem ser representados da seguinte maneira:

em que: W é um grupo seleccionado de entre o grupo que consiste em -C02Q3; -PO3U3 e -SO3Q3,' Q3 é um átomo de hidrogénio, um ião amónio, um elemento seleccionado de entre 0 grupo que consiste nos elementos do grupo 1A da Tabela Periódica de Mendeléev, ou um grupo funcional derivado dos seguintes corpos gordos. 07 415 ΕΡ 0 828 758/ΡΤ 14

ácidos pentenóicos, ácidos hexenóicos, ácidos heptenóicos ou suas formas saturadas; Q, é um radical seleccionado de entre o grupo que consiste em alcenilo, aralquilo, arilo e alquilo (Cn1H2n1+1), onde nl é um número entre 1 e 8. Q, pode ser seleccionado de entre a lista seguinte, que é proporcionada para ilustrar a invenção e não para limitar o seu âmbito: P2-0-(CH2)n- P8-NH-CO-(CH2)n- ; P4-NH-(CH2)n-; CH, P3-S-(CH2)n- -ÍCH2)n-C02P9 Pj-oJfc—(CH^ Γ1

em que, P, a P9 representam um átomo de hidrogénio; a grupo metilo; uma cauda hidrófoba funcional com uma cadeia principal alifática, alicíclica ou aromática, linear ou ramificada, que pode ser seleccionada de entre a seguinte lista: ácido gordo saturado de fórmula geral (CmH2m02) sendo m um valor entre 4 e 12; ou um grupo protector de cadeia lateral como descrito por Gross e Meienhofer (1981, The peptides, vol. 3, Academic press: páginas 1-341) tal que P, possa ser um grupo benzilo, 2-bromobenzilo, 2,6-diclorobenzilo ou t-butilo; P2 possa ser um grupo benzilo ou t-butilo; P3 possa ser um grupo benzilo, t-butilo, tritilo, acetamidometilo ou benzamidometilo; P4 possa ser trifluoroacetilo, t-butiloxicarbonilo (Boc), benziloxicarbonilo (Z) ou fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc); P5 possa ser um grupo nitro, p-metoxibenzenossuifonilo, mesitilenossulfonilo ou pentametilcromano; com a condição de que P6 seja hidrogénio, ou que P5 e P6 possam ser adamantiloxicarbonilo; P7 possa ser um grupo fenacilo, benziloximetilo ou t-butoximetilo; P8 possa ser um grupo benzidrilo, dimetoxibenzidrilo, tritilo ou xantenilo;

87 Ί15 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 15 η é um número inteiro entre 0 e 6; Y tem a seguinte fórmula geral: y=-a-p2 em que: A é um heteroátomo bivalente, preferivelmente oxigénio, enxofre, um grupo -NH- ou um grupo -N(Me)-;

Pz é igual a P, a P4 definidos anteriormente onde Z é um número inteiro entre 1 e 4; e Q2 é um átomo de hidrogénio. Quando Q, =H ou alquilo inferior, Q2 pode ser qualquer grupo alquilo, alcoxi, alcenilo, aralquilo, ou arilo. Nestas condições possui a mesma identidade química que se definiu acima para Qv

Os átomos de carbono aos quais (Q,) e (Q2) estão ligados têm configuração L ou D. São assimétricos mas não quando [QJ = (Q2) ou (W) = (Y).

Nos casos em que a ancoragem consiste em uma ou mais caudas hidrófobas (Ht) não pseudomicelares, toda a estrutura das referidas caudas pode ser representada como se segue: (Ht): R-XOfQ5 em que: R é um radical alquilo, alcenilo, arilo ou aralquilo, de cadeias lineares ou ramificadas, e pode ser derivado do grupo de corpos gordos metabolizáveis que consiste em ácidos gordos saturados com a fórmula geral CmH2m02, preferivelmente sendo m um número inteiro entre 4 e 6; ácidos gordos mono-ou poli-insaturados, aminas e álcoois gordos; X representa um átomo de fósforo, carbono ou enxofre; f é um número inteiro entre 1 e 3; Q5 representa um átomo de hidrogénio, um ião amónio, ou um ião de metal alcalino; quando f é um número inteiro entre 1 e 2, Q9 pode ser definido 16 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ como R acima com a condição de que possua pelo menos uma das seguintes funções: amino (-NH-); álcool (-OH), tio (-SH), ou ácido (-XOfH); sendo X e f definidos como acima.

Para melhor realizar a reacção química de ancoragem, utilizam-se preferivelmente caudas hidrófobas ou resíduos pseudomicelares funcionalizados na forma ácida. Nestas condições, a reacção de ancoragem é preferivelmente realizada numa fase sólida (Merrifield R.B., 1963, J. Am. Chem. Soc., 85:2149; 1964, J. Am. Chem. Soc., 86:304) utilizando reagentes extremamente activos tais como por exemplo hexafluorofosfato de benzotriazolo-1-iloxitris(dimetilamino)fosfónio conhecido na arte anterior (B. Castro et a!., 1975, Tetrahedron letters, Vol. 14:1219). O resíduo pseudomicelar a ancorar é geralmente preparado pela acção directa de um sal malónico, preferivelmente um sal de sódio de dietilacetamidometilmalonato, e o halogeneto de alquilo, alcenilo, arilo ou aralquilo num solvente polar tal como dimetilformamida. Esta reacção é usualmente seguida por uma hidrólise ácida ou alcalina e de resolução (preferivelmente enzimática) da mistura racémica resultante.

Em certas condições, a preparação do resíduo pseudomicelar consiste em: a) um primeiro passo; para proteger de maneira ortogonal e para ligar num suporte sólido do tipo sasrin (M. Mergler et ai, 1988, Peptides, Chemistry and Biology, Proceedings of the 10,h American peptide symposium, St. Louis, p.259, G.R. Marshall, Ed., Escom, leiden), um aminoácido com uma cadeia lateral funcionalizada tal como lisina, ácido glutâmico ou ácido aspártico; e b) um segundo passo; para desproteger especificamente a cadeia lateral e para ancorar no local livre uma cauda hidrófoba (Ht) metabolisável tal como descrito anteriormente. O resíduo pseudomicelar (Pr) é assim obtido após uma clivagem (TFA a 0,5%/CH2CI2) da ligação suporte-resíduo, seguindo-se passos de purificação.

07 415 ΕΡ 0 828 758/ΡΤ 0 resíduo pseudomicelar pode também ser preparado por uma complexação selectiva da função ácido e amina em alfa num aminoácido livre trifuncional, por agentes de complexação de origem mineral tais como acetato de cobre. Nestas condições, a ancoragem da cauda hidrófoba metabolisável é efectuada pela acção directa do complexo formado e da referida cauda, quer na sua forma de halogeneto de acilo ou na sua forma de ácido ou amina na presença de um agente de condensação.

No caso em que a cauda hidrófoba a ancorar consiste num ácido gordo, a activação com vista na ancoragem pode ser realizada in situ. Dependendo das estratégias de síntese utilizadas, o local de ancoragem do péptido é libertado imediatamente antes da ancoragem nas condições de desprotecção tradicionais (Gross e Meienhofer, 1981, The peptides, vol. 3, Academic press: páginas 1-341). A cauda hidrófoba (Ht) ou o resíduo pseudomicelar (Pr) é então condensada com o agente de ancoragem em solventes orgânicos tais como um éter (tetra-hidrofurano), um solvente alifático halogenado (diclorometano), um nitrilo (acetonitrilo) ou uma amida (dimetilformamida).

Em relação à dinâmica de ancoragem, as temperaturas de trabalho preferidas estão entre 20 e 60°C. O tempo da reacção de ancoragem quando a cauda hidrófoba utilizada é mais e mais hidrófoba, varia inversamente com a temperatura, mas varia entre 0,1 e 24 horas.

Como exemplo ilustrativo, a síntese de triacil-lisina como estabelecido abaixo, ilustra de uma maneira esquemática todo o princípio de ancoragem de uma cauda hidrófoba de ácido gordo. (Segue Esquema) 07 415 ΕΡ 0 828 758/ΡΤ 18

Os passos de síntese genéricos de análogos de GRF foram realizados através da metodologia em fase sólida num sintetizador de péptidos 9050™ plus (Millipore Corporation, Milford, MA) utilizando a estratégia do Fmoc e ciclos de síntese fornecidos pela Millipore. Os Fmoc-aminoácidos foram fornecidos por Bachem Califórnia e outras fontes comerciais. A química sequencial do Fmoc utilizando BOP/HOBt como metodologia de acoplamento foi aplicada à resina Fmoc-Pal-PEG de partida (Millipore, número de catálogo: GEN 913383) para a produção de carboxamidas C-terminais. As desprotecções de Fmoc foram realizadas com solução de piperidina a 20% em DMF. Depois de completa a síntese, a resina foi bem lavada com DMF e éter antes da secagem. As

87 415 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 19 clivagens finais dos grupos protectores de cadeias laterais e das ligações péptido-resina foram realizadas utilizando o procedimento fornecido pela Millipore que consiste na seguinte mistura: TFA, água, fenol, triisopropilsilano (88:5:5:2). Os péptidos foram então precipitados e lavados com éter antes da secagem. A purificação por HPLC de fase inversa (tampão A: TEAP 2,5; tampão B: CH3CN a 80% em A) utilizando uma água pep 4000, absorvância a 214 nm, detentor modelo 486, caudal de 50 ml/min.; gradiente linear geralmente de 25 a 60% de B em 105 min.) seguido de um passo de dessalinização (tampão C: TFA a 0,1% em H20; tampão D: TFA a 0,1% em CH3CH/H20 80:20) produziram péptidos com rendimentos de 10 a 30% com homogeneidade superior a 97% como estimado por HPLC (detecção com um arranjo milénio/fotodíodo).

De acordo com a presente invenção, seleccionou-se o porco como a espécie de teste, pois é um modelo pré-clínico valioso para o desenvolvimento de análogos de GRF. De facto, o GRF(1-29)NH2 humano e o porcino partilham uma homologia de 100% na estrutura, e o padrão fisiológico da secreção de GH é quase idêntico em ambas as espécies.

Além disto, a potência dos análogos de GRF foi avaliada como a sua capacidade para aumentar significativamente os níveis de IGF-I no sangue e não pela sua potência aguda de libertação de GH. De facto, sabe-se que os efeitos anabólico e de cicatrização da GH ou da GH induzida por GRF são mediados por um aumento na síntese e secreção de IGF-I. Portanto, a medição da elevação de IGF-I induzida por GRF é o melhor indicador da eficácia do tratamento. A presente invenção será mais prontamente compreendida por referência aos exemplos seguintes que são fornecidos para ilustrar a invenção e não para limitar o seu âmbito.

EXEMPLO I

EFEITO DE ADMINISTRAÇÕES REPETIDAS DE [BUTIRIL"]-, [OCTANOIL0]-, [HEXANOIL0]- [HEXANOIL30], [HEXANOIL0,30] HGRF(I-29)NH2 E FHEXANOIL0] HGRF(1-44)NH2 VS HGRF(1-29)NH2 SOBRE OS NÍVEIS SÉRICOS

DE IGF-I EM PORCOS

O objectivo destas experiências foi avaliar o potencial dos análogos de GRF como agentes anabólicos. Sabe-se que a secreção de GH ou de GH

ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 20 induzida por GRF exercem o seu efeito anabólico através de um aumento da síntese e da secreção de factor de crescimento I semelhante a insulina (IGF-I), que resulta em níveis elevados de IGF-I em circulação. Foi previamente demonstrado que a intensidade da resposta anabólica a um tratamento com análogo de GRF é proporcional ao aumento dos níveis de IGF-I em porcos (Dubreuil P. et a/., 1990, J. Anim. Sei., 68:1254-1268).

Portanto, de modo a investigar a potência anabólica dos análogos de ácido gordo-pro-GRF, avaliou-se a sua capacidade para aumentar os níveis de IGF-I após administrações S.C. repetidas em porcos.

Experiência 1

Distribuíram-se aleatoriamente 26 porcos Landrace x Yorkshire machos castrados (40-45kg de PC) por 4 grupos experimentais: 1- hGRF(1 -29)NH2 (20 μg/kg, n = 7) 2- [octanoil0] hGRF(1-29)NH2 (20 pg/kg, n = 6) 3- [hexanoil0] hGRF(1-29)NH2 (20 pg/kg, n = 6) 4- [butyryl0] hGRF(1-29)NH2 (20 pg/kg, n = 7)

Cada animal foi injectado BID (duas vezes por dia) subcutaneamente durante 4 dias consecutivos. Recolheu-se uma amostra de sangue todas as manhãs antes da primeira injecção do dia, e no dia após a última injecção, para medição do IGF-I.

Experiência 2

Distribuíram-se aleatoriamente 40 porcos Landrace x Yorkshire machos castrados (40-45 kg de PC) por 5 grupos experimentais: 1- solução salina (n = 8) 2- hGRF(1-29)NH2 (40 pg/kg, n = 8) 3- [hexanoil0) hGRF(1-29)NH2 (10 pg/kg, n = 8) 4- [hexanoil0] hGRF(1-29)NH2 (20 pg/kg, n = 8) 5- [hexanoil0] hGRF(1-29)NH2 (40 pg/kg, n = 8)

Cada animal foi injectado BID (duas vezes por dia) subcutaneamente durante 5 dias consecutivos. Recolheu-se uma amostra de sangue todas as manhãs antes da primeira injecção do dia, e no dia após a última injecção, para medição do IGF-I.

ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 21

Experiência 3:

Distribuíram-se aleatoriamente 48 porcos Landrace x Yorkshire machos castrados (40-45 kg de PC) por 6 grupos experimentais: 1- Solução salina (n = 8) 2- hGRF(1-44)NH2 (30 pg/kg, n = 8) 3- [hexanoil°]hGRF(1-44)NH2 (30 pg/kg, n = 8) 4- [hexannil°]hGRF(1-29)NH2 (20 pg/kg, n = 8) 5- [hexanoil30]hGRF(1-29)NH2 (20 pg/kg, n = 8) 6- [hexanoil0,30]hGRF{1 -29)NH2 (20 pg/kg, n = 8)

As doses seleccionadas foram de 30 pg/kg para os análogos de hGRF(1-44)NH2 e de 20pg/kg para os análogos de hGRF(1-29)NH2, que originam doses idênticas numa base molar. Cada animal foi injectado BID (duas vezes por dia) subcutaneamente durante 5 dias consecutivos. Recolheu-se uma amostra de sangue todas as manhãs antes da primeira injecção do dia, e no dia após a última injecção, para medições do IGF-I.

Medições do IGF-I

Mediram-se os níveis de IGF-I no soro dos porcos por radioimunoensaio de duplo anticorpo após extracção com ácido fórmico-acetona, como previamente descrito (Abribat T. et af., 1993, J. Endocrinol., 39:583-589). A extracção antes do radioimunoensaio é um passo necessário para remover proteínas de ligação a IGF endógenas.

Análise estatística

Em ambas as experiências, os dados de IGF-I foram analisados através de uma análise de variância de medição repetida de duas vias, com o dia e o tratamento (análogo de GRF) como fontes de variação. Correram-se então procedimentos de comparação múltipla (método de Student-Newman Keuls). Um P<0,05 foi considerado como estatisticamente significativo.

Resultados Experiência 1

Houveram um efeito significativo do dia (P = 0,0004) e uma interacção tratamento x dia significativa (P = 0,011), indicando que o aumento dos níveis de IGF-I dependia do análogo testado (Tahela 1). Renolheram-se diariamente

87 415 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 22 amostras de sangue para medições do IGF-I antes da primeira injecção de compostos. Os dados são apresentados como média ± SEM de 6 a 7 valores por grupo.

Tabela 1

Efeito da injecção SC repetida (20 pg/kg BID x 4 dias) de análogos de GRF

sobre os níveis séricos de IGF-I

Tratamento (BID. 20 pg/kg SC) Dia 1 (pré-tratamento) (ng/ml) Dia 2 (ng/ml) Dia 3 (ng/ml) Dia 4 ng/ml) Dia 5 (ng/ml) hGRF(1-29)NHj 252+28 235+19 263+16 258+17 262124 [octanoil0] hGRF(1-29)NH2 316±22 287±20 301137 301137 318139 (hexanoil0) hGRF(1-29)NH2 248+20 281128 299126 319122a 342+21ab [butiril0] hGRF(1-29)NH2 278±20 281124 302126 289+26 293+23

Tratamento P = 0,42

Dia P = 0,0004

Tratamento x Dia P = 0,011 a P<0,05 quando comparado com dia 1 b P<0,05 quando comparado com dia 2

As comparações múltiplas revelaram que apenas o [hexanoil0] hGRF(1 -29)NH2 eliciou um aumento nos níveis de IGF-I, que foi significativo nos dias 4 (29%, P<0,05) e 5 (38%, P<0,05). O GRF(1-29)NH2 humano não teve efeito sobre os níveis de IGF-I na dose testada.

Experiência 2

Houveram um efeito significativo do dia (P<0,0001) e uma interacção tratamento x dia significativa (P<0,0001), indicando que o aumento nos níveis de IGF-I dependia do análogo testado (Tabela 2). Recolheram-se diariamente amostras de sangue para medições do IGF-I antes da primeira injecção do dia. Os dados estão apresentados como média ± SEM de 8 valores por grupo.

87 415 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 23

Tabela 2

Efeito relacionado com a dose da injecção SC repetida (BID x 5 dias) de análogos de GRF sobre os níveis séricos de IGF-i

Tratamento BID,SC Dial (pré-tratamento) (ng/ml) Dia 2 (ng/ml) Dia 3 (ng/ml) Dia 4 (ng/ml) Dia 5 (ng/ml) Dia 6 (ng/ml) Solução salina 282+33 266130 281+34 293130 287132 289133 HGRF(1-29)NH2 (40 μθ/Ι^) 244±24 243116 267120 275+27 267117 256115 (hexanoil°]hGRF (1-29)NH2 (10 μθ/Ι<9) 303±31 327+20 337+25 338125 366137a 350134a [hexanoil°]hGRF (1-29)NH2 (20 μθ/Ι^) 302+38 341137 368143a 362140a 362145a 368157a [hexanoil°]hGRF (1- 29)NH2 (40 pg/kg) 252±35 275132 319131a 354+41ab 350+34ab 374l33ab,e

Tratamento P=0,23; Dia P=0,0001 Tratamento x Dia P=0,0001 a P<0,05 quando comparado com dia 1 b P<0,05 quando comparado com dia 2 c P<0,05 quando comparado com dia 3

As comparações múltiplas revelaram que todas as três doses testadas de [hexanoil°]hGRF(1-29)NH2 aumentaram os níveis de IGF-I. A 10 pg/kg, os níveis de IGF-I aumentaram significativamente nos dias 5 e 6 (16 a 21%, P<0,05). A 20 pg/kg, aumentaram nos dias 3, 4, 5 e 6 (20 a 22%, P<0,05). A 40 pg/kg, aumentaram nos dias 3, 4, 5 e 6 (27 a 48%, P<0,05). Os níveis séricos de IGF-I permaneceram estáveis nos porcos tratados com solução salina e com hGRF(1-29)NH2.

Finalmente, uma análise de regressão revelou que o aumento nas concentrações de IGF-I do dia 1 ao dia 6 dependiam da dose de [hexanoil°]hGRF(1 -29)NH2 (AIGF-I = 11,9 + (2,77*dose); r= 0,68, P<0,0001).

Experiência 3:

Houveram um efeito siyniíiuaLivo do dia (P<0,0001) e uma inleracção significativa de tratamento x dia (P<0,0001), indicando que o aumento nos níveis de IGF I dependia do análogo testado (Tabela IV). A comparação múltipla revelou que os análogos com uma função hexanoílo ramificados na região do terminal N do GRF eram altamente potentes: 87 415 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 24

- ο [hexanoil0] hGRF(1-29)NH2 aumentou significativamente os níveis de IGF-I nos dias 5 e 6 (em 28% e 31%, P<0,05) - o [hexanoil0,30] hGRF(1-29)NH2 aumentou significativamente os níveis de IGF-I nos dias 4, 5 e 6 (em 32%, 35% e 43%, P<0,05) * o [hexanoil0] hGRF(1-44)NH2 aumentou significativamente os níveis de IGF-I nos dias 3, 4, 5 e 6 (em 41 %, 54%, 50% e 61 %, P<0,05)

Tal como previamente observado para o hGRF(1-29)NH2 (experiências 1 e 2), o hGRF(1 -44)NH2 de comprimento completo teve pouco ou nenhum efeito sobre os níveis de IGF-I (excepto um efeito significativo no dia 5, que não foi mantido no dia 6). Finalmente, a ancoragem de uma função hexanoílo na região do terminal C do hGRF(1-29)NH2 produziu um análogo com potência aumentada quando comparada com a do hGRF(1-29)NH2 (21% aumentado nos níveis de IGF-I no dia 6, P<0,05), mas menos potente do que o [hexanoil°]hGRF(1-29)NH2.

Injectaram-se GRF(1-29)NH2 humano e hGRF(1-44)NH2 a 20 μg/kg e 30 pg/kg, respectivamente, de modo a atingir concentrações equimolares. Os dados apresentados são a média ± SEM de 8 valores por grupo.

Tabela 3

Efeito de múltiplas injecções SC de análogos de GRF (BID x 5 dias) sobre os níveis séricos de IGF-I em porcos em crescimento

Tratamento BID, SC Dia 1 (pré-tratamento) (ng/ml) Dia 2 (ng/ml) Dia 3 (ng/ml) Dia 4 (ng/ml) Dia 5 (ng/ml) Dia 6 (ng/ml) solução salina 215±21 215±28 219±25 226128 249130 234124 hGRF(1-44)NH2 (30 pg/kg) 245+21 254±22 285±26 297128 303126a 296126 (hexanoil0] hGRF(1-29)NH2 (20 pg/kg) 272±45 292+52 292±57 315157 347±44abc 356±44a,bc [hexanoil30] hGRF(1-29)NH2 (20 μg/kg) 297±30 270±25 287124 278118 276120 327±24b (hexanoil0,30] hGRF(1-29)NH2 (20 μg/kg) 205±24 212±26 253133 271±36ab 277±29ab 294±26ab [hexanoil0] hGRF(1-44)NH2 (30 μg/kg) 241±30 290±33 340141a 372±40ab 361±46ab 388±49abc ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 25

Tratamento Ρ=0,16 Dia Ρ< 0.0001 Tratamento χ Dia Ρ<0.0001 3 Ρ<0,05 quando b Ρ<0,05 quando c Ρ<0.05 quando comparado com comparado com comparado com dia 1 dia 2 dia 3

Conclusões

Nem o hGRF(1-29)NH2 nem o hGRF(1-44)NH2 em doses que variaram de 20 a 40 pg/kg foram capazes de modular os níveis de IGF-I. Contudo, a ancoragem do ácido gordo tornou o GRF mois potente e produziu análogos com actividade marcadamente melhorada sobre a secreção de IGF-I. A ancoragem de ácidos gordos foi eficiente para melhorar a potência anabólica tanto do hGRF(1-29)NH2 como do hGRF(1-44)NH2. Dos resultados anteriores, conclui-se que o ácido gordo ideal para utilizar é o ácido hexanóico ou qualquer derivado gordo C6, e que este deve ser preferivelmente ancorado na região do terminal N do GRF para produzir análogos maximamente potentes.

EXEMPLO II

Efeitos comparativos de análogos de pro-GRF sobre os níveis de IGF-I em porcos

Este foi um tratamento de 5 dias, com administração S.C., duas vezes por dia, de uma dose única de cada artigo de teste vs solução salina. Esta experiência foi conduzida para comparar a eficácia de (amino-hexanoíl)0 hGRF (1-29)NH2, (hexilformato)0 hGRF (1-29)NH2, (trans-2-hexenoil)0 hGRF (1-29)NH2, (trans-3-hexenoil)0 hGRF (1-29)NH2 e (muconoil)0 hGRF (1-29)NH2, com a de (hexanoil)o hGRF (1-29)NH2.

Todos os compostos testados pertencem à mesma família de análogos de GRF: são uma combinação do GRF natural e ácido gordos naturais, desenhada para melhorar a actividade da molécula.

Identidade de análogos testados: TT-0101 5 (Hexanoil)0 hGRF (1-29)NH2 em solução salina 20 pg/kg TT-01021 (Amino-hexanoíl)0 hGRF (1-29)NH2 20 pg/kg TT-01022 (Hexilformato)0 hGRF (1-29)NH2 20 pg/kg TT-01023 (trans-2-hexenoil)0 hGRF (1-29)NH2 20 pg /kg TT-01024 (trans-3-hexenoil)0 hGRF (1-29)NH2 20 pg/kg TT-01025 (Muconoil)0 hGRF (1-29)NH2 20 pg/kg

07 415 ΕΡ 0 828 758/ΡΤ 26

Via e frequência do artigo de teste ADMINISTRA ÇAO: SISTEMA DE TESTE: DESCRIÇÃO DO ANIMAL: RACAO: DESENHO EXPERIMENTAL:

Duas injecções subcutâneas diárias. Porcos Landrace x Yorkshire. Cinquenta e seis (56) porcos castrados em crescimento pesando 35 kg no momento da aquisição. Alimentação concentrada comercial (18% de proteínas) oferecida ad libitum. Cinquenta e seis (56) porcos foram distribuídos aleatoriamente por 7 grupos experimentais (n = 8 porcos por grupo). Cada grupo recebeu duas administrações S.C. diárias dos seguintes tratamentos (volume: 3 ml, injecção S.C.). grupo 1: solução salina 2 x/dia grupo 2: TT-01015 20 pg /kg 2 x/dia grupo 3: TT-01021 20 pg/kg 2 x/dia grupo 4: TT-01022 20 pg/kg 2 x/dia grupo 5: TT-01023 20 pg /kg 2 x/dia grupo 6: TT-01024 20 pg/kg 2 x/dia grupo 7: TT-01025 20 pg/kg 2 x/dia

Os tratamentos foram administrados do dia 1 ao 5. Imediatamente antes das injecções, recolheu-se uma amostra de sangue de cada animal, e recolheram-se amostras de sangue adicionais no dia 6.

Deixaram-se coagular as amostras de sangue, recolheu-se o soro por centrifugação e submeteu-se a ensaios ao IGF-I.

Os resultados são apresentados na Fig. 1 como D-IGF-I, que se define como o aumento dos níveis de IGF-I desde o dia 1 (níveis pré-tratamento) ao dia 6 (após 5 dias de administrações de GRF). De entre todos os análogos testados, apenas o hexanoil-, o hexilformato-, o trans-2-hexenoil e o trans-3-hexenoil-hGRF(1-29)NH2 aumentaram significativamente os níveis de IGF-I ao longo do período de estudo de 6 dias, enquanto o amino-hexanoil- e o muconoil-hGRF(1-29)NH2 não o fizeram. Uma vez que se mostrou que o hGRF(1-29)NH2 07 415

ΕΡ 0 828 758/ΡΤ 27 não é eficaz na mesma dose, nas mesmas condições em ensaios anteriores (veja-se o Exemplo I), estes resultados mostram que a adição de várias cadeias de carbonos C6 na região do terminal N do GRF aumenta a sua bioactividade. EXEMPLO 111

Potência intravenosa para libertação de GH, de (trans-3-hexenoil)0 hGRF (1-29)NH2 vs hGRF(1-29)NH2 em porcos

Esta experiência foi conduzida para testar a potência de libertação de GH aguda I.V. de (trans-3-hexenoil)0 hGRF (1-29)NH2, um análogo de pro-GRF, num modelo fisiologicamente próximo do humano e para a comparar com a do hGRF(1-29)NH2. O (trans-3-hexenoil)0 hGRF (1-29)NH2 é uma combinação do hGRF(1-29)NH2 natural e ácido gordos naturais. Este estudo foi um estudo de doses múltiplas, de injecção I.V. única.

Identidade de análogos testados: TT-01024 (Trans-3-hexenoil)° hGRF (1-29)NH2 0,25 pg/kg TT-01024 (Trans-3-hexenoil)° hGRF (1-29)NH2 1 pg/kg TT-01024 (Trans-3-hexenoil)° hGRF (1-29)NH2 4 pg/kg hGRF(1 -29)NH2 0,25 pg/kg hGRF(1 -29)NH2 1 pg /kg hGRF(1 -29)NH2 4 pg/kg

Via e frequência do artigo testado

ADMINISTRAÇAO: SISTEMA DE TESTE: DESCRICÃO DO ANIMAL injecção intravenosa aguda.

Porcos Landrace x Yorkshire.

Cinquenta e seis (56) porcos castrados em crescimento pesando 35 kg no momento da aquisição. RAÇÃO: Alimentação concentrada comercial (18% de proteínas) oferecida ad libitum. DESENHO EXPERIMENTAL: Cinquenta (56) porcos (4 animais sobresselentes) foram canulados (um cateter implantado por cirurgia numa veia jugular) numa semana, antes do 07 415 ΕΡ 0 828 758/ΡΤ

estudo. Nos dias 1 e 7, os animais canulados foram distribuídos aleatoriamente por 7 grupos (n= 4 porcos por grupo). grupo 1: solução salina grupo 2: TT-01024 0,25 pg/kg grupo 3: TT-01024 1 pg /kg grupo 4: TT-01024 4 pg/kg grupo 5: hGRF(1-29)NH2 0,25 pg/kg grupo 6: hGRF(1 -29)NH2 1 pg/kg grupo 7: hGRF(1 -29)NH2 4 pg/kg

Recolheram-se amostras de sangue para o ensaio à pGH de 20 em 20 min desde 1 hora antes a 5 horas após as injecções de GRF, com amostragens adicionais 10 e 30 min após a injecção (n= 21 amostras). Deixaram-se coagular as amostras de sangue a +4°C. O soro será recolhido por centrifugação, armazenado a -20°C e submetido a ensaio à pGH.

Os resultados estão ilustrados nas Figs. 2 e 3. Tal como mostrado na Fig. 2, o hGRF(1-29)NH2 (4 pg/kg) induziu uma rápida libertação de GH que foi mantida durante aproximadamente 60 minutos após a injecção. Em contraste, o trans-3-hexenoil-hGRF(1-29)NH2 injectado na mesma dose aumentou os níveis de GH ao longo de um período maior, aproximadamente 260 minutos. Em adição, a resposta de GH nos primeiros 60 minutos foi moderada, sugerindo que este análogo actua como pro-GRF, sendo processado, no soro, no GRF nativo nos minutos ou horas que se seguem à injecção. Tal como mostrado na Fig. 3, que apresenta os efeitos de várias doses de GRF e do análogo sobre a área sob a curva de GH (0 a 300 minutos após a injecção), o hGRF(1-29)NH2 produziu um efeito significativo sobre a secreção de GH a 4 pg/kg, mas não a 0,25 nem a 1 pg/kg, enquanto o trans-3-hexenoil-hGRF(1-29)NH2 eliciou uma resposta significativa em todas as 3 doses testadas. Em conclusão, estes resultados mostram que o trans-3-hexenoil-hGRF(1-29)NH2 é um análogo de GRF com potência aumentada sobre a secreção de GH, e sugerem que este pode actuar como pro-GRF, estando protegido da degradação enzimática no soro. 87 415 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 29

EXEMPLO IV

Potência subcutânea de libertação de GH, de (trans-3-hexenoil)0 hGRF (1-29) NH2 vs hGRF(1-29)NH2 em porcos

Esta experiência foi conduzida para testar a potência de libertação de GH aguda S.C. de (trans-3-hexenoil)0 hGRF (1-29)NH2, um análogo de pro-GRF, num modelo fisiologicamente próximo do humano e para a comparar com a do hGRF(1-29)NH2.

Identidade de análogos testados: TT-01024 (Trans-3-hexenoil)0 hGRF (1-29)NH2 0,31 pg /kg TT-01024 (Trans-3-hexenoil)0 hGRF (1-29)NH2 1,25 pg/kg TT-01024 (Trans-3-hexenoil)o hGRF (1-29)NH2 5 pg/kg TT-01024 (Trans-3-hexenoil)0 hGRF (1-29)NH2 20 pg/kg hGRF(1 -29)NH2 1,25 pg/kg hGRF(1 -29)NH2 5 pg/kg hGRF(1 -29)NH2 20 pg/kg

Via e frequência do artigo testado ADMINISTRAÇÃO: injecção aguda subcutânea. SISTEMA DE TESTE: Porcos Landrace x Yorkshire. DESCRIÇÃO DO ANIMAL: Sessenta e quatro (64) porcos castrados em t

crescimento pesando 35 kg no momento da aquisição. RAÇÃO: Alimentação concentrada comercial (18% de proteínas) oferecida ad libitum. DESENHO EXPERIMENTAL: Trinta e seis (36) porcos (4 animais sobresselentes) foram canulados (um cateter implantado por cirurgia numa veia jugular) numa semana, antes do estudo. Nos dias 1 e 7, os animais canulados foram distribuídos aleatoriamente por 8 grupos (n= 4 porcos por grupo). grupo 1: solução salina grupo 2: TT-01024 0,31 pg/kg grupo 3: TT-01024 1,25 pg /kg grupo A: TT-01024 5 g/kg

87 415 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 30 grupo 5: ΤΤ-01024 20 g/kg grupo 6: hGRF(1 -29)ΝΗ2 1,25 g/kg grupo 7: hGRF(1 -29)NH2 5 g/kg grupo 8: hGRF(1 -29)NH2 20 g/kg

Recolheram-se amostras de sangue para ensaio à pGH de 20 em 20 min decde 1 hora antes a 7 horas após as injecções de GRF, (n= 25 amostras). Deixaram-se coagular as amostras de sangue a +4°C. O soro é recolhido por centrifugação, armazenado a -20°C e submetido a ensaios à pGH.

Os resultados estão apresentados nas Figs. 4 e 5. Tal como mostrado na Fig. 4, a injecção subcutânea de 5 pg/kg de hGRF(1 -29)NH2 induziu uma resposta de GH nos primeiros 60 minutos após a administração, enquanto que a mesma injecção de trans-3-hexenoil-hGRF(1-29)NH2 induziu uma resposta de GH que foi mantida durante 240 minutos. A Fig. 5 ilustra o efeito de várias doses dos GRF testados sobre a área sob a curva de GH ao longo do período de estudo, i.e. de 0 a 420 minutos após a injecção. Ao longo deste período, o hGRF(1-29)NH2 não induziu qualquer resposta de GH significativa em qualquer das doses testadas, enquanto o trans-3-hexenoil-hGRF(1-29)NH2 eliciou aumentos significativos da AUC de GH a 5 e 20 pg/kg. Em conjunto, estes resultados sugerem que o trans-3-hexenoil-hGRF(1-29)NH2 é um secretagogo de GH altamente potente, mesmo quando administrado subcutaneamente.

(Segue Listagem de Sequências)

67 415 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 31

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFOHMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: THERATECHNOLOGIES INC. (B) RUA: 7701 - 17eme Avenue (C) CIDADE: Montreal (D) ESTADO: Quebec (E) PAÍS: Canadá (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): H2A 2S5 (G) TELEFONE: (514) 729-7904 (H) TELEFAX: (514) 593-8142 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: ANÁLOGOS QUIMÉRICOS DE CORPO GORDO-PRO-

GRF COM POTÊNCIA BIOLÓGICA AUMENTADA (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: compatível com PC IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE·. Patentln Release #1.0, Version #1.30 (EPO) (vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/453,067 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 26-MAIO-1995 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 44 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO 32 87 415 Ερ Ο 828 758/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: fyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Vai Leu Gly Gin 1 5 10 15

Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gin Asp lie Met Ser Arg Gln Gin Gly 20 25 30

Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu 35 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Tyr Ala Asp Ala lie Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Vai Leu Gly Gln 15 10 15

Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp lie Met Ser Arg 20 25

Lisboa,

Por THERATECHNOLOGIES INC. - 0 AGENTE OFICIAL -

Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA

Ag. Of. Pr. Ind-

Rua das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA

Claims

87 415 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Análogo quimérico de corpo gordo-pro-GRF com potência biológica aumentada, com a seguinte fórmula geral: A1 -A2-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-A8-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-A1 5-Gln-Leu-A18-Ala-Arg-I ys-l fiii-l_fiii-A24-Asp-lle-A27-A28-Arg-A30-Ro em que, AI é Tyr ou His; A2 é Vai ou Ala; A8 é Asn ou Ser; A15 é Ala ou Gly; A18 é Ser ou Thr; A24 é Gin ou His; A27 é Met, lie ou Nle; A28 é Ser ou Asp; A30 é qualquer sequência de aminoácidos de 1 a 1 5 resíduos ou está ausente; R0 é NH2 ou NH-(CH2)n-CONH2, com n = 1 a 12; e em que A1 está ancorado em N ou O por uma cauda hidrófoba com a seguinte fórmula geral I: R3 R2 R1 I I I R4-(Z)h-(CHÍg-(W'-Y')f-íCH}e-(W = Y)d-(CH)c-IX)b-(G)a- I em que, G é um grupo carbonilo, fosfonilo, sulfurilo ou sulfinilo; X é um átomo de oxigénio, enxofre ou um grupo amino (NH); (W = Y) representa (CH = CR5) cis ou trans; (W* = Y’) representa (CH = CR6) cis ou trans: Z é um átomo de oxigénio ou de enxofre; R1( R2 e R3, independentemente, são seleccionados de entre um grupo hidroxilo, um átomo de hidrogénio, e um grupo alquilo C^Cg, linear ou ramificado;

87 415 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 2/4 R4 é um grupo hidroxilo, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo C5-C9 linear ou ramificado; R5 e R6, independentemente, são um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (VC4, linear ou ramificado; aéOou 1; b é 0 ou 1; c é 0 a 8; a soma d + f é 1; e é 0 a 8; g é 0 a 8; h é 0 ou 1 ; em que a soma de a, b, c, d, e, f, g e h é tal que a caudal hidrófoba de fórmula I tenha uma cadeia principal linear de entre 5 e 7 átomos (C, O e/ou S).
2. Análogo quimérico de corpo gordo-pro-GRF de acordo com a reivindicação 1, em que A1 é Tyr ou His ancorado em N-alfa por uma cauda hidrófoba de fórmula I, em que ambos de a e b= 1; a soma d + f >1; h= 0; G= carbonilo; X= átomo de oxigénio; R,, R2, R3, R4 = átomo de hidrogénio e a soma c + e + g= 3, 4, 5 ou 6.
3. Análogo quimérico de corpo gordo-pro-GRF de acordo com a reivindicação 1, em que A1 é Tyr ou His ancorado em N-alfa por uma cauda hidrófoba de fórmula I, em que a= 1; a soma d + f >1; G= carbonilo; R1# R2, R3 e R4= grupo hidroxilo e a soma c + e + g = 4, 5, 6 ou 7.
4. Análogo quimérico de corpo gordo-pro-GRF de acordo com a reivindicação 1, em que a soma d + f = 1.
5. Análogo quimérico de corpo gordo-pro-GRF de acordo com a reivindicação 4, em que A1 é Tyr ou His ancorado em N-alfa por uma cauda hidrófoba de fórmula I, em que a= 1; cada um de b e h= 0; G= carbonilo; Ru R2, R3 e R4= átomo de hidrogénio e a soma c + e + g = 2, 3, 4 ou 5.
6. Análogo quimérico de corpo gordo-pro-GRF de acordo com a reivindicação 5, em que c é 0. ff éis 87 415 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 3/4
7. Análogo quimérico de corpo gordo-pro-GRF de acordo com a reivindicação 6., em que A30 está ausente ou é Ser-Arg-GIn-GIn-Gly-Glu-Ser-Asn-GIn-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu.
8. Análogo quimérico de corpo gordo-pro-GRF de acordo com a reivindicação 7, em que A30 está ausente e R0é NH2.
9. Análogo quimérico de corpo gordo-pro-GRF de acordo com a reivindicação 8 com a fórmula c/sCH3-(CH2)2-CH = CH-CO-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-NH2 ou fra/7sCH3-(CH2)2-CH = CH-CO-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-GIn-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GIn-Asp-lle-Met-NH2.
10. Análogo quimérico de corpo gordo-pro-GRF de acordo com a reivindicação 7, em que R0 é NH2.
11. Análogo quimérico de corpo gordo-pro-GRF de acordo com a reivindicação 10, com a fórmula c/sCH3-CH2-CH = CH-CH2-CO-Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln-Asp-lle-Met-Ser-Arg-GIn-GIn-Gly-Glu-Ser-Asn-GIn-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2 ou transCH3-CH2-CH = CH-CH2-CO-Tyr-Ala-Asp-Ala-lle-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-GIn-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-GIn-Asp-lle-Met-Ser-Arg-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu-NH2.
12. Análogo quimérico de corpo gordo-pro-GRF de acordo com a reivindicação 1, em que A1 é Tyr ou His ancorado em N-alfa por uma cauda hidrófoba de fórmula I, em que a= 1; cada um de b e h= 0; a soma d + f = 2; G= carbonilo; R1( R2, R3 e R4= átomo de hidrogénio e a soma c + e + g= 0, 1, 2 ou 3.
13. Análogo quimérico de corpo gordo-pro-GRF de acordo com a reivindicação 1, em que A1 é Tyr ou His ancorado em N-alfa por cauda hidrófoba de fórmula I, em que a= 1; a soma d + f >1; h= 0; G= carbonilo; Rv R2, R3 e R4= átomo de hidrogénio; e a soma c + e + g = 4, 5, 6 ou 7. 87 415 ΕΡ Ο 828 758/ΡΤ 4/4
14. Formulação farmacêutica para a indução da libertação da hormona do crescimento que compreende como um ingrediente activo um análogo de GRF de acordo com a reivindicação 1, em associação com um transportador, excipiente ou diluente farmaceuticamente aceitável.
15. Utilização de um análogo de GRF de acordo com a reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para o diagnóstico de deficiências em hormona do crescimento em pacientes.
16. Utilização de um análogo de GRF de acordo com a reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para aumentar o nível de hormona do crescimento num paciente.
17. Utilização de um análogo de GRF de acordo com a reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para o tratamento de nanismo pituitário ou retardação do crescimento num paciente.
18. Utilização de um análogo de GRF de acordo com a reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para o tratamento de ferimentos ou cicatrização óssea num paciente.
19. Utilização de um análogo de GRF de acordo com a reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para o tratamento de osteoporose num paciente.
20. Utilização de um análogo de GRF de acordo com a reivindicação 1 para a preparação de um medicamento para melhorar o anabolismo proteico num humano ou animal. Lisboa, O ADJUNTO Por THERATECHNOLOGIES INC. O AGENTE OFICIAL -

Eng.° ANTÓNIO JOÂO DA CUNHA FERREIRÀ Ag. Hf. Pr Ind. Rua das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA — ------------ -----