KR19990021938A - 향상된 생물학적 효능을 갖는 키메릭 지방체-프로-지알에프 유사체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 증가된 생물학적 효능을 가지는 키메릭 지방체에 관한것으로, 동화제 및 성장 홀몬 결핍의 진단 및 치료에의 적용에 관한 것이다. 키메릭 지방체-프로-GRF 유사체는 소수성 테일을 포함하고, GRF에 하나 또는 여러개의 소수성 테일을 고정하거나 GRF의 화학 합성에서 가미세포 잔유물에 의한 하나 또는 여러개의 아미노산을 치환함으로서 제조될 수 있다. 본 발명의 GRF 유사체는 생체분해할수 있고, 면역유전이 아니며 감소된 용량과 연장된 활성을 가진 개선된 동화 효능을 나타낸다.

Description

향상된 생물학적 효능을 갖는 키메릭 지방체-프로-지알에프 유사체
발명의 배경
(a) 발명의 분야
본 발명은, 향상된 생물학적 효능과 연장된 활성을 갖는 키메릭 지방체-프로-지.알.에프 유사체(chimeric fatty body-pro-GRF analog)와, 동화제제 및 성장 홀몬 결핍 치료제로서의 그것의 응용에 관한 것이다.
(b) 종래기술의 설명
뇌하수체에 의해 분비되는 성장 홀몬(growth hormone: GH) 또는 소마토트로핀(somatotropin)은 , 그성의 생물학적 활성이 어린 유기체의 선형적 성장 뿐만 아니라, 그것의 성숙 상태에서 보전을 지속하기 위해 필수적인 홀몬 족을 구성한다. GH는 성장인자[인슐린과 유사한 성장인자(insulin-like growth factor)-I, 즉, IGF-I]와 그것의 수용체(표피 성장인자(epidermal growth factor), 즉, EGF)의 합성을 자극함으로써 말초기관에 간접 또는 직접적으로 영향을 미친다. GH의 직접적인 영향은 항인슐린적으로 불리는 형태를 갖는데, 이는 지방조직의 레벨에서 지방분해를 촉진한다. IGF-I(소마토메딘 C) 합성 및 분비에 미치는 그것의 작용을 통해, GH는 연골과 뼈의 성장을 자극하고(구조적 성장), 근육 및 표피를 포함하는 다수의 말초기관 내부의 단백질 합성 및 세포증식을 자극한다. 그것의 생물학적 활성을 통해, GH는 어른에게 있어서는 단백질 동화 상태의 유지에 개입하고, 외상을 입은 후에는 조직의 재생현상에 중요한 기능을 수행한다.
인간 및 동물에게서 밝혀진 연령에 따른 GH 분비의 감소는 유기체의 노화를 개시하거나 노화에 참여하는 이화작용을 향한 대사 이동을 촉진한다. 중년에서 관찰되는, 근육의 감소, 지방조직의 누적, 뼈의 탈광물질화 및 상처를 입은 후의 조직 재생능력의 감소는 GH 분비의 감소와 관련이 있다.
따라서, GH는 어린아이의 선형적 성장을 위해 절대적으로 필요한 생리학적 동화제제인 동시에, 성인에게 있어서는 단백질의 대사작용을 조절한다.
뇌하수체에 의한 GH의 분비는 주로 2가지 시상하부 펩티드인, 소마토스타틴과 성장홀몬 발생인자(growth hormone-releasing factor: GRF)에 의해 조절된다. 소마토스타틴은 그것의 분비를 저해하는 반면, GRF는 그것을 자극한다.
인간 GH는 약 10년간 유전공학을 사용하여 제조되어 왔다. 최근까지 GH의 대부분의 용도는 어린아이의 성장 지연과 관련된 것으로, 현재에는 성인에 대한 GH의 사용이 연구되고 있다. GH 및 GRF의 약리학적 용도는 다음과 같은 3가지 주요한 범주로 분류될 수 있다.
어린아이의 성장
재조합 인간 성장홀몬으로의 치료는, 뇌하수체성 난장이, 신부전증, 터너 증후군(Turner's syndrom) 및 작은 신장을 갖는 어린아이에 있어서의 성장을 자극하는 것으로 밝혀졌다. 재조합 인간 GH는 현재 유럽 및 미국에서 GH 결핍에 의한 어린아이의 성장 지연과 어린아이의 신부전증에 대해 희소질병용 약으로 상업화되어 있다. 기타의 용도에 대해서는 의학적으로 시험 연구되고 있는 중이다.
성년 및 중년 환자에 대한 장기간의 치료
GH 분비의 감소는 노화동안 체성분의 변화를 야기한다. 재 조합형 인체 GH로서 1년을 처리한 연구는 근육 매스 및 피부두께의 증가 및 고령의 환자의 약간의 골격 밀도 증가를 가진 지방 매스에의 감소를 보고한다. 골다공증에 대하여, 근래의 연구는 재조합형 인체 GH는 골격 무기화를 증가하지 않고 폐경기의 여성에서 골격 무력화를 방지한다는 것을 보고한다. 본 이론을 나타내기 위하여 연구가 진행중이다.
성년 및 중년 환자에 대한 단기간의 치료
임상전 및 임상에서, 성장 홀몬은 프로테인 동화작용 및 상처 및 골격 치료에서 화상, 에이즈 및 암의 치료를 촉진하는 것으로 보인다.
GH 및 GRF는 또한 가축에의 약학적인 사용이 시도된다. GH 및 GRF는 동물의 건강에 해를 주는 원치 않는 부작용 및 생산된 고기 및 우유에 어떠한 잔유물없이 성장 기간 동안 지방 조직 대신에 근육 조직의 침착을 기함으로서 피그의 성장을 촉진하며 젖소의 우유생산량을 증가한다. 소의 소마토트로핀(BST)은 현재 미국에서 상업화되어 있다.
대부분의 현재 진행되는 임상 연구는 재조합형 GH로서 행해진다. GRF는 대부분의 경우에 GH의 사용을 미래에 대체하도록 한정된 제2의 세대 생산물로서 간주된다. 따라서, GRF의 사용은 본질적으로 GH사용을 넘는 많은 이득이 있다.
생리학적 이득
상기 리듬의 분비는 정상 생물학적 활동에서 매우 중요하기에 성장 홀몬(GH)은 펄스 패션에서 뇌하수체에 의하여 분비된다. 자연 형태의 분비에 상응하게 GH를 적용하는 것은어렵다. GRF가 저 용해 제제 또는 주입으로서 연속적 패션에서 적용될 때, 박동하는 동안 GH분비를 증가한다.
GRF가 더 넓은 범위의 생물학적 활성을 가지는 GH의 모든 화학적 이성체의 뇌하수체로부터 합성 및 분비를 유도하는 반면 현재 시판되는 재 조합형 GH는 22 kDa형태이다.
GH로서의 처리는 내인성 성장 홀몬을 분비하기 위하여 뇌하수체의 용량이 감소되게 되고, GRF에 대한 GH 응답은 상기 처리후 감소된다. 반대로, GRF로서의 처리는 상기 불이익이 나타나지 않아, 뇌하수체 상의 속성의 활동은 정상 동물 및 소마토트로프 부전인 환자에서 상기 그랜드 분비 용량을 증가한다
경제적 이득
유전 공학에 의한 GH의 생산은 임상 사용용을 매우 비싸다. 특별히, 사용된 세균으로부터의 물질을 가진 상기 상업적 제제의 오염의 위험이 있다. 상기 세균 오염물은 파이로겐일 수 있고 또는 환자에서 면역학적 반응을 야기할 수 있다. 재조합형 산물은 아래의 많은 연속적 크로마토그라피 단계에 의해 정화한다. 과감한 정화 기준은 다량 제재 단계를 요한다.
GRF 합성은 화학적 본성에 속한다. 합성은 고체상에서의 되고 정화는 고 성능 액체 크로마토그라피(HPLC)를 사용하는 단일 단계로 수행된다. 또한 적용되어질 GRF의 양은 동일 결괴과의 생물학적 활성용 GH의 양보다 매우 적다.
모든 상기 이득에도 불구하고, GRF는 화학적 불안정성 때문에 요법제로서 현재까지 시판되지 않고 있다. 인체 GRF는 아래 배열의 44 아미노산의 펩티드이다:
많은 펩티드에서, hGRF (1-29)NH2는 혈청 배지에서 재빨리 분해되고 대사산물은 잔여 생물학 활성이 없다. 혈액 배지에서 효소의 활동, 즉 디펩티딜아미노펩티다제 형 IV은 GRF의 펩티드 결합 Ala2-Asp3의 가수분해를 야기한다. 상기 가수분해는 문헌에서 보고된 많은 연구의 제목이었던 많은 음성 결론을 가져온다. 필수적으로, 상기 가수분해는 생물 활성의 1/1000보다 적게 감소된 특이 활성의 끝을 짜른 펩티드 형태를 유도한다.
어린이 및 성인에의 임상 연구는 자연 hGRF (1-44)NH2또는 활성 단편 hGRF (1-29)NH2는 재조합형 GH에 상응하는 동일한 효과를 생산하기에 충분한 양이 아닌 것이 확인된다.
많은 GRF유사체가 기술되었으나, 모두 다른 아미노산 배열을 가지는 또는 첨가된 합성 아미노 산(D시리즈)을 가지는 변형된 GRF인 불이익을 가진다. 상기 GRF유사체는 실제적으로 면역학적이고 인체로의 적용은 면역 독성 문제 및 실질적 부작용을 야기한다.
펩티드 배영의 C-터미날에 -NEt2와 같이, 소수성 그룹이 붙는 것은 특별히 증가된 특이 활성을 야기한다. 소수성에서, 상기 결과는 적은 펩티드 유사체의 합성에서 사용된 소수 그룹으로서 로릴 그룹의 무효과를 강조하는 무라니치(S. Muranichi et al., 1991, Pharm. Res., 8:649-652)와 같은 근래 연구에 의해 반전되었다. 반대로, 종래 기술의 역 발견은 소수성 잔유물을 사용하는 더욱 효능있는GRF 유사체를 발견하는 이슈를 찾는데 실패했다.
가우드류 등(P. Gaudreau et al., 1992, J. Med. Chem., 35(10), 1864-1869)은 쥐의 뇌하수 수용체와 아세틸-, 6-아미노헥사노일-, 및 8-아미노옥타노일-GRF(1-29)NH2의 친화력을 기술한다. 본 보고에서, 시험된 지방산-GRF 화합물의 어느 것도 hGRF(1-29)NH2자체보다 더 높은 친화력을 나타내지 않았고, 저자는 hGRF(1-29)NH2의 N 말단 에서 소수성 을 증가하기 위한 변형은 수용체 친화력을 증가하기 위한 적절한 접근이 아니다라고 결론하였다.
코이 등(D.H. Cow et al., 1987, J. Med. Chem., 30:219-222)은 쥐 모델, 더욱 상세하게 소디움 페노바바비탈로 마취시킨 래트(rat)에서 생물학적 활성이 증가된 아세틸-GRF 펩티드를 기술하였다. 배양된 래트 뇌하수체 세포에 의한 시험관내 GH 응답 또한 분석되었다. 그러나, 상기 저자들은 GRF의 N말단 지역에서 추가된 2(아세틸)보다 긴 탄소 체인으로 지방산-GRF 유사체를 합성하고 시험하지 않았다.
지금까지, 기술된 대부분의 GRF유사체(가우드류 및 코이 등을 포함한)는 시험관내 또는 생체내 모두 래트 모델에서 시험되었다. 인체 및 래트의 GRF(1-29)NH2가 현저히 틀리기 때문에, 두 종류에서 GRF의 구조-활성 관계는 다르다. 그러므로, 래트에서 얻어진 결과를 인체에 외삽하는 것은 불가능하다.
따라서, 개선된 동화력 및 연장된 활성을 가지는 GRF 유사체를 설계하는 것이 필요하다. 상기 증가된 힘은 혈청 저하에의 저항 및/또는 무리한 성분으로부터 기인한다.
인체 및 동물에 만성적으로 주입될 때 면역 반응을 방지하기 위하여, 생채분해가능하고 구조적으로 자연 GRF에 가까운 반면에, 증가된 동화력을 가진 GRF 유사체를 제공하는 것이 바람직하다.
발명의 요약
본 발명의 첫 번째 목적은 개선된 생물학적 잠재력 및 연장된 활성을 가지는 새로운 생채분해가능 비-면역유전 프로-GRF 유사체를 제공하기 위함이다.
본 발명의 두 번째 목적은 개선된 동화력 및 연장된 활성, 즉 인체 및 동물에 만성적으로 투여될 때 인슐린과 같은 성장 인자 I (IGF-I)레벨을 실제적으로 올릴수 있는 프로-GRF 유사체를 제공하기 위함이다.
본 발명의 세 번째 목적은 프로-GRF 유사체에 더욱 많은 생물학적 잠재력 및 연장된 활성을 누여할 수 있는 수단을 제공함에 있다.
본 발명의 네 번째 목적은 개선된 동화력 및 연장된 활성을 가지는 활성프로-GRF 유사체를 생산하는 방법을 제공하기 위함이다.
본 발명은 키메릭 지방체-GRF 유사체의 제조에 관련한다. 상기 키메릭 유사체는 소수성 반족(테일)을 포함하고, 하나 또는 여러개의 소수성 테일이 GRF에 달림(anchor)으로서 또는 프로-GRF의 화학 합성의 가세포 잔유물에 의해 하나 또는 여러개의 아미노산을 치환함으로서 제조될 수 있다. 본 발명의 프로-GRF 유사체는 다음의 특성을 가진다:
a) 상기 유사체는 향상된 생물학적 활성을 함유하고; 특별히, 인체와 밀접하
게 관련된 동물체에 투여될 때 GH 및 IGF-I 레벨을 현저하게 증가시킬수 있
다. 상기 특성은 환자에게 투여되는 과활성 화합물의 용량이 감소되게 하
여, 처리 효능을 개선하고 처리 비용이 감소하는 특별한 이익을 가져온다.
b) 지방산과 같은 자연 아미노산 및 소수성 대사가능 물질은 프로-GRF 유사
체의 화학 합성에서 사용된다. 전체적으로 대사가능한 자연 물질의 사용은
즉 여러번 투여하는 경우에 실제적 제 2 효과를 방지한다.
c) 무한대로 적은 용량에서 높은 생물학적 활성을 나타낸다.
d) 높은 생물학적 활성으로 오랜 기간동안 활성적이다.
본 발명의 지방산의 사용은 종래 기술의 모든 결점을 극복한 프로-GRF를 가져온다. 본 발명의 프로-GRF 유사체는 생체 분해가능하고, 비 면역유전이고 감소된 용량의 개선된 동화력을 보이며 연장된 활성을 가진다. 더구나, 본 발명은 생략되거나 치환된 GRF 및 그의 어떤 유사체에 관한다.
본 발명의 결과는 성장하는 래트에 만성적으로 투여될 때 N-부틸 또는 N-옥타노일-GRF(1-29)NH2이 아닌, N-헥사노일은 통계적으로 IGF-I레벨이 증가하는 것이 보인다. 상기 결과는 GRF의 N말단지역에서 C4 또는 C8의 추가는 N-헥사노일-GRF(C6-GRF)와 비교할 때 낮은 생물학적 활성을 가진 화합물을 생성한다는 것이 나타난다. 그러므로, 본 발명은 생물학적 활성을 증가하기 위하여 GRF로 달기위한(anchor) 탄소 체인의 적정 길이는 C5-C7이라는 것을 알수 있다. 상기 결과는 GRF의 N-아세틸레이션(C2 체인의 첨가)이 래트에서 생물활성을 증가시키고, C2 보다 긴 탄소 체인을 가진 화합물의 활성이 보고되지 않은, 코이 등에 의해 공고된 연구에 기초하여는 기대할 수 없었다.
본 발명의 방법에 따라, 상기 유사체는 GRF 또는 그의 유사체의 N- 또는 C-말단 부분에 하나 또는 여러개의 소수성테일을 달므로서(고정함으로서), 또는 GRF 또는 그의 유사체의 화학 합성의 어느 단계에서 하나 또는 몇 개의 가미세포 잔유물을 결합함으로서 생산될 수 있다. 분할 및 정화후, 결과 변형 펩티드는 매우낮은 용량에 투여되었을 때 향상된 생물 활성을 나타낸다.
본 발명에 따라서, 아래 일반식의증가된 생물학적 효능을 가진 키메릭 지방-GRF 유사체가 생산된다:
여기서,
A2는 발린 또는 알라닌;
A15는 알라닌 또는 글리신;
A24는 글루타민산 또는 히스티딘;
A27는 메티오닌, 이소류신 또는 노르류신
A28는 세린 또는 아스파르트산;
A30는 n=1∼12인 아미노 알킬 카르복스아미드-NH-(CH2)n-CONH-,; 또는 1∼15
잔유물의 어떤 아미노산 배열; 및
Al는 티로신 또는 히스티딘; A8는 아스파라긴 및 A18는 세린 또는 티로신이고, 여기서 A1는 아래 화학식 1의 소수성 테일이 N-또는 O-에 달려있다:
여기서,
G는 a=0 또는 1인 카르보닐, 포스포닐, 설퓨릴 또는 설퓨릴 그룹;
X는 b=0 또는 1인 산소 분자, 황 도는 아미노 그룹 (-NH-);
R1, R2, 및 R3라디칼은 같거나 다르고, 하이드록실 그룹, 수소 분자 및 낮은
리니어 또는 가지난 알킬 그룹으로부터 선택되고;
-(W=Y)- 및 -(W'=Y')-는 R5및 R6=H 또는 C1-C4알킬; d 및 f=0 또는 1인 시
스 또는 트랜스 더블 결합 -(CH=CR5)- -(CH=CR6)-
R4는 하이드록시 그룹, 수소 분자 또는 C5-C9알킬이고;
Z는 R4가 수소일 때 a, b, c, d, e, f, g 및 h가 동일하거나 다르고 모두 0 이아니고, 그리고 a, b, c, d, e, f, g 및 h의 합이 식 I의 소수성 테일이 5와 8분자사이(C, O 및/또는 S)의 리니어 주요 체인을 가지는 조건의 h=0∼1이고; 산소 또는 유황 분자이다.
본 발명의 바람직한 이상 지방 바디-프로-GRF 유사체는 아래의 그룹으로부터 선택된다:
a) 여기서 A1은 식I의 소수성 테일에 의해 달린 티로신 또는 히스티딘 N-알
파이고, a 및 b= 1; 각각의 d, f 및 h= 0; G= 카르보닐; X= 산소 분자; R1,
R2, R3, R4=산소분자 및 합 c+ e + g=3, 4, 5 또는 6;
b) 여기서 A1은 식I의 소수성 테일에 의해 달린 티로신 또는 히스티딘 N-알
파이고, a= 1; 각각의 b, d, f 및 h= 0; G= 카르보닐; R1, R2, R3, R4=하이드
록실 그룹 및 합 c+ e + g= 4, 5, 6 또는 7;
c) 여기서 A1은 식I의 소수성 테일에 의해 달린 티로신 또는 히스티딘 N-알
파이고, a= 1; 각각의 b 및 h= 0; 합 d + f = 1; G= 카르보닐; R1, R2, R3,
R4=수소분자 및 합 c+ e + g=3, 4, 5 또는 6;
d) 여기서 A1은 식I의 소수성 테일에 의해 달린 티로신 또는 히스티딘 N-알
파이고, a= 1; 각각의 b 및 h= 0; 합 d + f = 2; G= 카르보닐; R1, R2, R3,
R4=수소 분자 및 합 c+ e + g= 0, 1, 2, 또는 3;
e) 여기서 A1은 식I의 소수성 테일에 의해 달린 티로신 또는 히스티딘 N-알
파이고, a= 1; 각각의 b, h, d 및 f= 0; G= 카르보닐; R1, R2, R3, R4=수소
분자 및 합 c+ e + g= 4, 5, 6 또는 7.
본 발명을 위하여, 용어 소수성 테일 또는 Ht는 지방산, 지방아민, 지방족 알코올, 콜레스테롤 유도체 등의 기능화된 지방 바디를 의미한다. 용어가미세포 잔유물 도는 Pr은 잔유물이 그의 양쪽성 이온 형태에 미세포 구조를 형성하거나 적응할수 있도록 설계된 사이드 체인을 가진 어떠한 α 아미노산을 의미한다.
본 발명에 따라서, 활성 성분으로서 약학적으로 적합한 담체, 부형제 또는 희석제와 결합한 GRF 유사체로 구성되는 성장 홀몬 릴리스를 유도하기 위한 약학 제제를 제공한다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 GRF 유사체의 효율적인 양을 상기 환자에게 투여하는 것으로 구성되는 환자에서 성장 홀몬의 레벨을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 GRF 유사체를 상기 환자에게 투여하는 것과 성장 홀몬 응답을 측정하는 것으로 구성되는 환자에서 성장 홀몬 결핍증의 진단을 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 GRF 유사체의 효율적인 양을 상기 환자에게 투여하는 것으로 구성되는, 환자에서 뇌하수체성 난장이 또는 성장 지체의 치료를 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 GRF 유사체의 효율적인 양을 상기 환자에게 투여하는 것으로 구성되는, 환자에서 상처 치료 또는 골격 치유를 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 GRF 유사체의 효율적인 양을 상기 환자에게 투여하는 것으로 구성되는, 환자에서 골다공증 치료를 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 GRF 유사체의 효율적인 양을 상기 인체 또는 동물에게 투여하는 것으로 구성되는, 인체 또는 동물에서 프로테인 동화(프로테인 절약 효과)를 개선하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명에서 아미노산은 아래에 표시된 것과 같이 종래의 3-글짜 약자로서 간주되고, 생화학 명명법에서 IUPAC-IUB 코미션에 의해 추천된 것과 같이 펩티드 기술에서 일반적으로 허용된다:
알라닌 Ala
알기닌 Ala
아스파라긴 Asn
아스파르트 산 Asp
시스테인 Cys
글루탐산 Glu
글리신 Gly
히스티딘 His
류신 Leu
라이신 Lys
메치오닌 Met
오르니친 Orn
페닐알라닌 Phe
프롤린 Pro
세린 Ser
트레오닌 Thr
트립토판 Trp
티로신 Tyr
D-티로신 tyr
발린 Val
용어 자연 아미노산은 자연에서 발생하거나 자연적으로 발생한 펩티드내의 아미노산 잔유물로서 결합되는 아미노산을 의미한다. 추가로, Nle는 노르류신을 의미한다.
사용되는 약자는 다음과 같다:
TFA 트리플루오르아세트산
HOBt 1-하이드록시벤조트리아졸
DIC 디이소프로필카르보딜미드
DMF 디메틸포름아미드
Pip 피페리딘
DMAP 4-디메틸아미노피리딘
Boc t-부틸옥시카르보닐
Fmoc 플루오레닐메틸옥시카르보닐
BOP 벤조트리아조-1-일록시트리스(디메틸아미노) 포스포니움 헥사 플루오로포스페이트
Me 메틸
HF 하이드로플루오르산
NEt3트리에틸아민
TEAP 트리에틸암모니움 포스페이트 (버퍼)
여기에 설계된 모든 펩티드 배열은 N말단 아미노산은 왼쪽 C말단은 오른쪽상에 있는 종래에 일반적으로 허용된 대로 쓰여진다.
도 1은 피그 혈청 IGF-1상에 피하로 주입된 hGRF(1-29) NH2유사체의 효과 그래프;
도 2는 피그 혈청상에 (4㎍/kg) hGRF(1-29) NH2및 (4㎍/kg) (헥사노일 트랜스-3)0hGRF(1-29) NH2(TT-01024) + 유사체의 정맥내 주입 효과 커브,
도 3은 I.V. 투여(기본 기간 -60∼0 분과 비교되었을때 **P0.01 및 ***P0.001)에 따르는 300분이상의 커브아래의 GH지역상에 다양한 용량의 hGRF(1-29) NH2대 (헥사노일 트랜스-3)0hGRF(1-29) NH2(TT-01024)의 효과를 나타내는 그라프,
도 4는 피그 혈청상에 5㎍/kg hGRF(1-29) NH2및 (5㎍/kg) (헥사노일 트랜스-3)0hGRF(1-29) NH2(TT-01024) 유사체의 피하 주입 효과 커브,
도 5는 S.C. 투여(기본 기간 -60∼0 분과 비교되었을때 **P0.01 및 ***P0.001)에 따르는 420분이상의 커브아래의 GH지역상에 다양한 용량의 hGRF(1-29) NH2대 (헥사노일 트랜스-3)0hGRF(1-29) NH2(TT-01024)의 효과를 나타내는 그라프이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 생체분해 가능하고 비유전면역이나 새로운 과(family)의 고도로 효능있는 키메릭 지방체-프로-GRF 유사체를 생산하기 위하여 지방체, 즉 가미세포 잔유물 및/또는 소수성 테일의 사용에 관한 것이다.
본 발명에따라서, 지방체-프로- GRF 유사체는 다음과 같이 화학적으로 합성될 수 있다:
- GRF 또는 그 유사체중의 하나의 C- 및/또는 N-말단에 하나 또는 여러 개의 소수성 테일을 고정(anchor)하거나,
- GRF 또는 그 유사체중의 하나의 화학 합성에서 하나 또는 여러개의 가미세포 α 아미노산 유도체(가미세포 잔유물)를 결합한다.
본 발명에 따라서, GRF 및 그 유도체의 합성에 링크로서 사용된 가미세포 잔유물(Pr)의 구조는 다음의 방식으로 표시될 수 있다:
여기서,
W는 -CO2Q3, -PO3Q3및 -SO3Q3로 구성되는 그룹으로부터 선택된 그룹이고;
Q3는 수소 분자, 암모니움 이온, 멘델레프 주기율표의 1A 그룹의 원소를 포함하는 그룹으로부터 선택된 원소 또는 아래의 지방체, 펜테노익산, 헥세노익산, 헵테노익산 도는 그의 포화 형태로부터 유래된 기능 그룹이고;
Q1는 알케닐, 아라킬, 아릴 및 알킬(COn1H2n1+1) 으로 구성된 그룹으로부터 선택된 라디칼이고, 여기서 n1은 1∼8사이의 숫자이다. Q1은 아래의 리스트로부터 선택될 수 있고, 본 발명의 범위를 제한하기 보다 본 발명을 설명하기 위하여 제공된다:
여기서,
P1∼P9은 수소 원자; 메틸 그룹; 아래의 리스트로부터 선택될수 있는 리니어 또는 가지친, 주요 지방족, 지방족 고리 또는 방향족 체인을 가진 기능 소수성 테일; 4∼12가인 m을 가진 일반식 (CmH2mO2)의 포화 지방산; 또는 P1이 벤질 그룹, 브로모-2 벤질, 디클로로-2,6 벤질 또는 t-부틸인 그로스 및 마이엔호퍼(1981, The Peptides, vol. 3, Academic press: pages 1-341) 에 의해 기술된 것과 같이 측면 체인 보호 그룹; P2는 벤질 그룹 또는 t-부틸이고; P3는 벤질 그룹, t-부틸, 트리틸, 아세트아미도메틸 또는 벤즈아미도메틸이고; P4는 트리플루오르아세틸, t-부틸옥시카르보닐 (Boc), 벤질옥시카르보닐 (Z) 또는 플루오레닐메틸옥시카르보닐 (Fmoc)이고; P5는 니트로 그룹, p-메톡시벤젠술포닐, 메시틸렌술포닐, 또는 펜타메틸크로만이고; P6는 수소, 또는 P5 및 P6는 아다만틸옥시카르보닐이고; P7은 페나실 그룹, 벤질옥시메틸 또는 t-부톡시메틸이고; P8은 벤즈하이드릴 그룹, 디메톡시벤즈하이드릴, 트리틸 또는 크산테닐이다;
n은 0∼6사이의 인테거이고;
Y는 아래의 일반식이다:
Y=-A-Pz
여기서:
A는 2가의 헤테로 원자, 바람직하게 산소, 황, -NH- 그룹 또는 -N(Me)- 그룹이고;
PZ은 Z가 1∼4사이의 인테거인상기에 한정된 P1∼P4와 같고;
Q2는 수소원자이다. Q1=H 또는 저 알킬, Q2는 알킬, 알콕시, 알케닐, 아랄킬, 또는 아릴 그룹이 될 수 있다. 상기 조건에서 Q1용 상기에 한정된 것과 같은 동일한 화학식을 가진다.
(Q1) 및 (Q2)가 부착된 탄소 원자는 L 또는 D 배위이다. 상기는 비대칭이나 (Q1)=(Q2) 또는 (W)=(Y)일때는 비대칭이 아니다.
하나 또는 더 많은 소수성 테일 (Ht) 비가미세포(non-pseudomicellar)에 고정된 경우에 상기 테일의 전체 구조는 다음과 같다:
(Ht): R-XOfQ5
여기서,
R은 가지친 또는 리니어 체인의 알킬 알케닐, 아릴 또는 아라킬 라디칼이고, 일반식 CmH2mO2,바람직하게는 4와 6사이의 인테거인 m을 가지는 포화 지방산; 모노 또는 폴리 불포화 지방산, 지방 아민 및 알코올로 구성된 대사가능 지방체 그룹으로부터 유래될 수 있다;
X는 인, 탄소 또는 황 원자를 나타내고;
f는 1과 3사이의 인테거이고;
Q5는 수소 원자, 암모니움 이온 또는 알칼린 금속 이온을 나타내고; f가 1과 2사이의 인테거일 때, Q5는 적어도 아래 기능의 원자단중의 하나를 가지는 조건을 가진 R용으로서 규정된다:
상기에 규정된 것과 같은 X 및 f를 가진; 아미노(-NH-); 알코올(-OH), 티오(-SH), 또는 애시드(-XOfH).
화학 고정반응(chemical anchoring reaction)을 더욱 잘 수행하기 위하여 산 형태하에서 기능화된 소수성 테일 또는 가미세포 잔유물이 우선적으로 사용된다. 상기 조건에서, 고정 반응은 종래 기술(B. Castro et al., 1975, Tetrahedron letters, Vol. 14:1219)에서 알려진 벤조트리아졸-1-일록시트리스(디메틸아미노) 포스포니움 헥사플로로-포스페이트와 같은 극도의 활성 시약을 사용하는 고체 상(Merrifield R.B., 1963, J.Am. Chem. Soc., 85:2149; 1964, J. Am. Chem. Soc., 86:304)에서 우선적으로 행해진다.
고정되어질 가미세포 잔유물은 말론산 염, 바람직하게는 디에틸아세트아미도메틸 말로네이트, 및 디메틸포름아마드와 같은 극성 용매내 알킬, 알케닐, 아릴 또는 아랄킬 할라이드의 직접 반응에 의해 제조된다. 상기 반응은 산 또는 알칼리 가수분해에뒤에 행해지고 결과 라세미 혼합물의 용액(바람직하게는 효소의)이다.
어떤 경우에서, 가미세포 잔유물의 제조는 다음으로 구성된다:
a) 제 1 단계; 직각 패션내에서 보호하고 새스린(sasrin) 타입(M. Mergler et al., 1988, Peptides, Chemistry and Biology, Proceedings of the 10th American peptide symposium, St. louis, p.259, G.R. marshall, Ed., Escom, leiden), 라이신, 글루탐산 또는 아스파르트 산의 고체 지지상에 부착하기 위한 단계
b) 제 2 단계; 측면 체인을 특별히 디프로텍트하고 상기에 기술된 것과 같이 대사가능 소수성 테일 (Ht)을 프리 위치에 고정하는 단계. 가미 세포 잔유물(Pr)은 정화 단계에 따르는, 지지-잔유물 결합의 분절 (0.5% TFA/CH2Cl2)후에 얻어진다.
가미세포 잔유물은 산의 선택적 착화 및 삼작용(trifunctional) 프리 아미노산의 알파내 아민 작용에 의해, 초산 구리와 같은 광물 시약을 착화함으로서 제조될 수 있다. 상기 조건에서, 대사가능 소수성 테일의 고정은 형성된 혼합물 및 그의 아실 할라이드 형태 또는 그의 산의, 형성된 화합물 및 상기 테일 또는 농축 시약하의 아민 형태의 직접 반응으로 행해진다.
고정되어질 소수성 테일이 지방산에 있을때, 고정으로부터의 활성은 원 위치에서 행해질 수 있다. 사용된 합성방법에 따라, 펩티드 고정 위치는 종래의 디프로텍션 조건에서 고정에 앞서유리된다(Gross et Meienhofer, 1981, The Peptides, vol. 3, Academic press: pages 1-341). 소수성 테일 (Ht) 또는 가미세포 잔유물 (Pr)는 에테르(테트라하이드로퓨란), 지방족 할로겐화 용매(디크롤로메탄), 니트릴(아세토니트릴) 또는 아미드(디메틸포름아미드)와 같은 유기 용매에서 고정 시약으로 농축된다.
고정 다이내믹(anchoring dynamic)에 대하여, 바람직한 작업 온도는 20℃∼60℃이다. 사용된 소수성 테일이 더욱 더 소수성이 되는 고정 반응시간은 온도에 따라 역으로 변화하고, 0.1과 24시간 사이에서 변화한다.
설명된 예와 같이, 아래에 도시된 것과 같은 트리아실 라이신 합성은 도표방식에서 소수성 지방산 테일의 고정 원리를 설명한다.
일반 GRF 유사체 합성 단계는 밀리포어(Millipore)에 의한 Fmoc 방식 및 합성 싸이클을 사용하는 9050TM플러스 펩티드 신테싸이저(plus peptide synthesizer, Millipore Corporation, Milford, MA)상에서 고체상 방법론에 의해 수행된다. Pmoc 아미노산은 바켐 캘리포니아(Bachem California) 및 다른 상업적 소스에 의해 공급된다. 카풀링 방법론으로서 BOP/HOBt를 사용하는 연속 Fmoc 화학은 C-말단 카르복스아미드를 생산하기 위하여 스타팅 Fmoc-Pal-PEG 레진(Millipore, catalog number: GEN 913383)으로 적용된다. Fmoc 디프로텍션은 DMF내 20% 피페리딘으로 이루어진다. 합성완료후, 레진(resin)은 건조에 앞서 DMF 및 에테르로서 잘 세척한다. 그룹 및 펩티드-레진 결합을 보호하는 사이드 체인의 마지막 분절은 다음의 화합물: TFA, 물, 페놀, 트리이소프로필실란(88:5:5:2)으로 이루어지는 밀리포어 공급 과정을 사용하여 수행된다. 펩티드는 다음 침전되고 건조에 앞서 에테르로 세척한다. 탈염 단계(버퍼 C:0.1% H2O내 TFA; D:0.1% CH3CH/H2O내 TFA 80:20)다음의 워터 펩(water pep) 4000, 흡수도 214nm, 디텍터 모델 486, 유속(50ml/min.; 105분에 25∼60%B 리니어 성분)을 사용하는 역 페이스 HPLC 정화(버퍼A: TEAP 2.5; 버퍼 B: A내 80% CH3CN)는 HPLC(millenium/photodiode array detection)으로 측정된 97%이상의 균일성을 가진 10∼30% 수득율 펩티드를 얻는다.
본 발명에 따라서, 시험 종으로서 GRF 유사체의 발전용 임상전 모델로 적합하므로 피그가 선택된다. 인체 및 피그 GRF(1-29)NH2는 구조의 유사성이 100%이며, GH분비의 생리적 패턴도 두종에서 거의 동일하다.
GRF 유사체의 효능은 그의 급성 GH 릴리스 효능보다는 IGF-I 혈액 레벨을 증가시키는 능력으로 평가된다. 실제로, GH 또는 GH가 유도된 GRF의 동화 및 치료 효과는 IGF-I 합성 및 분비의 증가에 의해 성립된다. 그러므로, IGF-I 상승이 유도된 GRF의 측정은 치료 효율의 최고의 지표이다.
본 발명을 제한하기 보다는 발명을 설명하는 아래의 실시예를 참조하여 본 발명은 더욱 쉽게 이해될 것이다.
실시예1
피그에서 혈청 IGF-I 레벨상의 (부틸0), (옥타노일0)-, (헥사노일0)- (헥사노일30), (헥사노일0,30), HGRF(1-29)NH2및 (헥사노일0) HGRF(1-44)NH2대 HGRF(1-29)NH2의 반복 투여 효과
본 실시예의 목적은 동화제로서 GRF 유사체의 능력을 평가하기 위함이다. GH 또는 GH 분비가 유도된 GRF는 인슈린과 같은 성장 인자 I(IGF-I)합성 및 분비의 증가를 통하여 그의 동화 효과를 발휘하고, IGF-I의 순환 레벨을 상승한다. GRF 유사체 치료에의 동화 응답의 강도는 피그에서 IGF-I레벨의 증가에 비례한다는 것은 앞에서 기술하였다(Dubreuil P. et al., 1990, J. Anim. Sci., 68:1254-1268).
그러므로, 지방산-프로-GRF 유사체의 동화 능력을 조사하기 위하여, IGF-I 레벨을 증가하는 능력이 피그에서 다음의 반복된 S.C. 투여가 평가된다.
실험 1
26 랜드레이스 x 요크샤이어 거세된 수 피그(40-45kg BW)가 4 실험 그룹으로 무작위로 분포된다:
1- hGRF(1-29)NH2(20㎍/kg, n=7)
2- [옥타노일0] hGRF(1-29)NH2 (20㎍/kg, n=6)
3- [헥사노일0] hGRF(1-29)NH2 (20㎍/kg, n=6)
4- [부티릴0] hGRF(1-29)NH2 (20㎍/kg, n=7)
각각의 동물은 연속적인 4일동안 피하로 BID(하루에 두 번)가 주입된다. 하나의 혈액 샘플은 IGF-I측정을 위하여, 각일의 일차 주사에 앞서 매일 아침에, 마지막 주사의 다음날에 수집된다.
실험 2
40 랜드레이스 x 요크샤이어 거세된 수 피그(40-45kg BW)가 5 실험 그룹으로 무작위로 분포된다:
1- saline (n=8)
2- hGRF(1-29)NH2(40㎍/kg, n=8)
3- [헥사노일0] hGRF(1-29)NH2 (10㎍/kg, n=8)
4- [헥사노일0] hGRF(1-29)NH2 (20㎍/kg, n=8)
5- [헥사노일0] hGRF(1-29)NH2 (40㎍/kg, n=8)
각각의 동물은 연속적인 5일동안 피하로 BID(하루에 두 번)가 주입된다. 하나의 혈액 샘플은 IGF-I측정을 위하여, 각일의 일차주사에 앞서 매일 아침에, 마지막 주사의 다음날에 수집된다.
실험 3
48 랜드레이스 x 요크샤이어 거세된 수 피그(40-45kg BW)가 6 실험 그룹으로 무작위로 분포된다:
1- saline (n=8)
2- hGRF(1-44)NH2(30㎍/kg, n=8)
3- [헥사노일0] hGRF(1-44)NH2 (30㎍/kg, n=8)
4- [헥사노일0] hGRF(1-29)NH2 (20㎍/kg, n=8)
5- [헥사노일30] hGRF(1-29)NH2 (20㎍/kg, n=8)
6- [헥사노일0, 30] hGRF(1-29)NH2 (20㎍/kg, n=8)
선택된 용량은 몰을 기초로 동일한 용량인, hGRF(1-44)NH2유사체용 30㎍/kg 및 hGRF(1-29)NH2유사체용 20㎍/kg이다. 각각의 동물은 연속적인 5일동안 피하로 BID(하루에 두 번)가 주입된다. 하나의 혈액 샘플은 IGF-I측정을 위하여, 각일의 일차주사에 앞서 매일 아침에, 마지막 주사의 다음날에 수집된다.
IGF-I 측정
IGF-I 레벨은 전에 기재된(Abribat T. et al., 1993, J. Endocrinol., 39:583-589) 것과 같이, 포름산-아세톤 추출후에 더블 항체 방사면역검정(double antibody radioimmunoassay)으로서 피그 혈청에서 측정된다. 방사면역 검정에 앞서 내생의 IGF-결합 프로테인을 제거하기 위하여 추출은 필요한 단계이다.
통계적 분석
모든 실험에서, IGF-I 데이터는 변수의 소스로 날(day) 및 처리(GRF 유사체)로서, 변이의 2가지 반복된 측정 분석에 의해 분석된다. 많은 비교 과정이 행해진다(Student-Newman Keuls method). 통계적 유효로서 A P 0.05가 간주된다.
결과
실험 1
IGF-I 레벨의 증가는 시험된 유사체에 의한다라는 것이 표시되며, P=0.0004인 날과 P=0.011인 특별 처리 x 일 상호작용에서 현저한 효과가 보인다(표 1). IGF-I 측정용 혈액 샘플은 혼합물의 일차 주입에 앞서 매일 수집된다. 데이터는 그룹 당 6-7 가의 평균 ± SEM으로서 나타난다.
혈청IGF-I 레벨 상의 GRF 아나로그의 (20㎍/kg BID×4일) 반복된 SC주입의 효과
처리(BID, 20μg/kg SC) 1일예비처리(ng/ml) 2일(ng/ml) 3일(ng/ml) 4일(ng/ml) 5일(ng/ml)
hGRF(1-29)NH2 252±28 235±19 263±16 258±17 262±24
[octanoyl0]hGRF(1-29)NH2 316±22 287±20 301±37 301±37 318±39
[hexanoyl0]hGRF(1-29)NH2 248±20 281±28 299±26 319±22a 342±21a,b
[butyril0]hGRF(1-29)NH2 278±20 281±24 302±26 289±26 293±23
처리 P=0.42
일 P=0.0004
처리 × 일 P=0.011
a P0.05 1일과 비교할때
b P0.05 2일과 비교할때
복수 비교는 단지 [헥사노일0] hGRF(1-29)NH2만이 IGF-I 레벨에서의 증가를 유도하고, 4일(29%, P 0.05) 및 5일(38%, P 0.05)에서 현저한 것을 나타낸다. 인체 GRF(1-29)NH2는 시험된 용량에서 IGF-I상에 영향을 주지 않았다.
실험 2
IGF-I 레벨의 증가는 시험된 유사체에 의한다라는 것이 표시되며, P 0.0001인 날과 P 0.0001인 특별 처리 x 일 상호작용에서 현저한 효과가 보인다(표 2). IGF-I 측정용 혈액 샘플은 혼합물의 일차 주입에 앞서 매일 수집된다. 데이터는 그룹 당 8 가의 평균 ± SEM으로서 나타난다.
혈청IGF-I 레벨 상의 GRF 아나로그의 (BID × 5 일) 반복된 SC주입의 효과.
처리(BID, SC) 1일예비처리(ng/ml) 2일(ng/ml) 3일(ng/ml) 4일(ng/ml) 5일(ng/ml) 6일(ng/ml)
saline 282±33 266±30 281±34 293±30 287±32 289±33
hGRF(1-29)NH2(40μg/kg) 244±24 243±16 267±20 275±27 267±17 256±15
[hexanoyl0]hGRF(1-29)NH2(10μg/kg) 303±31 327±20 337±25 338±25 366±37a 350±34a
[hexanoyl0]hGRF(1-29)NH2(20μg/kg) 302±38 341±37 368±43a 362±40a 362±45a 368±57a
[hexanoyl0]hGRF(1-29)NH2(40μg/kg) 252±35 275±32 319±31a 354±41a,b 350±34a,b 374±33a,b,c
처리 P=0.23 ; 일 P=0.0001
처리 × 일 P=0.0001
a P0.05 1일과 비교할때
b P0.05 2일과 비교할때
c P0.05 3일과 비교할때
복수 비교는 모든 세가지 시험된 용량의 [헥사노일0] hGRF(1-29)NH2가 IGF-I 레벨에서 증가되는 것을 나타낸다. 10㎍/kg에서, IGF-I 레벨은 5일 및 6일(16-21%, P 0.05)에 현저하게 증가되었다. 20㎍/kg에서, IGF-I 레벨은 3, 4, 5일 및 6일(20-22%, P 0.05)에 증가되었다. 40㎍/kg에서, IGF-I 레벨은 3, 4, 5일 및 6일(27-48%, P 0.05)에 증가되었다. 혈청 IGF-I 레벨은 생리 식염수내-hGRF(1-29)NH2-처리된 피그에서 안정하게 남아있다.
마지막으로, 역 분석은 1일에서 6일까지 IGF-I 농도의 증가는 [헥사노일0] hGRF(1-29)NH2(△IGF-I = 11.9 + (2.77 * dose); r = 0.68, P 0.0001)의 용량에 의한다는 것을 나타낸다.
실험 3
IGF-I 레벨의 증가는 시험된 유사체에 의한다라는 것이 표시되며, P 0.0001인 날과 P 0.0001인 특별 처리 x 일 상호작용에서 현저한 효과가 보인다(표 IV). 복수 비교는 GRF의 N말단 위치에 가지친 헥사노일 기능기를 가진 유사체는 매우 효력이 있다는 것을 나타낸다:
- [헥사노일0] hGRF(1-29)NH2는 IGF-I 레벨을 5일 및 6일(28% 및 31%, P 0.05)에 현저하게 증가시킨다.
- [헥사노일0, 30] hGRF(1-29)NH2는 IGF-I 레벨을 4일, 5일 및 6일(32%, 35% 및 43%, P 0.05)에 현저하게 증가시킨다.
- [헥사노일0] hGRF(1-44)NH2는 IGF-I 레벨을 3, 4, 5일 및 6일(41%, 54%, 50% 및 61%, P 0.05)에 현저하게 증가시킨다.
hGRF(1-29)NH2용으로 전에 관찰된 바와 같이(시험 1 및 2), 전체 길이 hGRF(1-44)NH2는 IGF-I레벨에 조금 또는 영향을 주지 않았다(5일의 현저한 효과를 제외, 6일에는 지속되지 않음). 마지막으로, hGRF(1-29)NH2의 C말단 위치에서 헥사노일 기능기의 고정은 hGRF(1-29)NH2(6일 IGF-I 레벨 21% 증가)와 비교하여 증가된 효능을 가진 유사체를 얻었으나, [헥사노일0, 30] hGRF(1-29)NH2보다는 낮았다.
인체 GRF(1-29)NH2및 hGRF(1-29)NH2는 동일 몰농도를 얻기 위하여 각각 20㎍/kg 및 30㎍/kg에서 주입된다. 나타난 데이터는 그룹 당 8 가의 평균 ± SEM으로서 나타난다.
피그성장에서 혈청IGF-I 레벨 상의 GRF 아나로그의 (BID×5일) 복합된 SC주입의 효과.
처리(BID, SC) 1일예비처리(ng/ml) 2일(ng/ml) 3일(ng/ml) 4일(ng/ml) 5일(ng/ml) 6일(ng/ml)
saline 215±21 215±28 219±25 226±28 249±30 234±24
hGRF(1-44)NH2(30μg/kg) 245±21 254±22 285±26 297±28 303±26a, 296±26
[hexanoyl0]hGRF(1-29)NH2(20μg/kg) 272±45 292±52 292±57 315±57 347±44a,b,c 356±44a,b,c
[hexanoyl30]hGRF(1-29)NH2(20μg/kg) 297±30 270±25 287±24 278±18 276±20 327±24b
[hexanoyl0,30]hGRF(1-29)NH2(20μg/kg) 205±24 212±26 253±33 271±36a,b 277±29a,b 294±26a,b
[hexanoyl0]hGRF(1-44)NH2(30μg/kg) 241±30 290±33 340±41a 372±40a,b 361±46a,b 388±49a,b,c
처리 P=0.16 a P0.05 1일과 비교할때
일 P0.0001 b P0.05 2일과 비교할때
처리 × 일 P0.0001 c P0.05 3일과 비교할때
결론
20∼40㎍/kg의 용량에서 hGRF(1-29)NH2도 hGRF(1-29)NH2도 IGF-I레벨을 조절할 수 없다. 그러나, 지방산의 고정은 GRF를 더욱 효능있게 하고 IGF-I분비에서 현저하게 개선된 활성을 가진 유사체를 얻는다. 지방산의 고정은 hGRF(1-29)NH2및 hGRF(1-44)NH02의 동화 효능을 개선하는데 효과적이다. 상기 결과로부터, 사용하기에 이상적인 지방산은헥사노익 산 또는 C6 지방 유도체이고, 최고로 효능있는 유사체를 얻기 위하여 바람직하게 GRF의 N말단 위치에 고정되어야 한다.
실시예 II
피그에서 IGF-I 레벨상의 프로-GRF의 비교 효과
본 실시예는 5일 처리, 1일 두 번 식염수 대 각 시험 품목의 하나의 단일용량의 S.C. 투여이다. 본 실시예는 [헥사노일]0hGRF(1-29)NH의 효능과 [아미노헥사노일]0hGRF(1-29)NH2, [헥실포르미에이트]0hGRF(1-29)NH2, [헥사노일 트랜스-2]0hGRF(1-29)NH2, [헥사노일 트랜스-3]0hGRF(1-29)NH2및 [뮤코노일]0hGRF(1-29)NH2의 효능을비교하기 위하여 행해진다.
모든 시험되는 화합물은 GRF 유사체의 같은 패밀리에 속하고: 분자의 활성을 개선하기 위하여 설계된, 자연 GRF 및 자연 지방산의 결합이다.
시험된 유사체의 동정
in saline
TT-01015 (헥사노일)0hGRF (1-29) NH220 ㎍/kg
TT-01021 (아미노헥사노일)0hGRF (1-29) NH220 ㎍/kg
TT-01022 (헥실포르미에이트)0hGRF (1-29) NH220 ㎍/kg
TT-01023 (헥사노일 트랜스-2)0hGRF (1-29) NH220 ㎍/kg
TT-01024 (헥사노일 트랜스-3)0hGRF (1-29) NH220 ㎍/kg
TT-01025 (뮤코노일)0hGRF (1-29) NH220 ㎍/kg
시험된 품목의 루트 및 도수
투여 : 하루 2번 피하주입
시험 시스템 : 랜드레이스 X 요크샤이어 피그
동물 종류 : 56마리의 성장바로우
구매시 35kg 중량의 피그
레이션 : 임의로 공급된 시판 먹이 농도(18% 프로테인)
시험 설계 : 56마리의 피그는 7 시험 그룹(그룹 당 n= 8 피그)으로 임의 로 분포된다. 각각의 그룹은 하루에 두 번 아래 처방의 S.C. 가 투여된다(volume: 3ml, S.C. 주입).
group 1 : saline 2 x/day
group 2 : TT-01015 20㎍/kg 2 x/day
group 3 : TT-01021 20㎍/kg 2 x/day
group 4 : TT-01022 20㎍/kg 2 x/day
group 5 : TT-01023 20㎍/kg 2 x/day
group 6 : TT-01024 20㎍/kg 2 x/day
group 7 : TT-01025 20㎍/kg 2 x/day
처방은 1일에서 5일까지 투여된다. 주입 바로 전에, 하나의 혈액 샘플은 각각의 동물에서 채취되고, 추가의 혈액 샘플은 6일에 채취된다.
혈액 샘플은 응고되게 하고, 혈청은 원심분리로서 얻고 IGF-I 분석에 따른다.
결과는 D-IGF-I로서 도 1에 나타나고, 1일(전처리 레벨)에서 6일(GRFs의 5일 후)까지 IGF-I레벨의 증가로서 규정된다. 시험된 모든 유사체중에, 아미노헥사노일- 및 뮤코노일-hGRF (1-29) NH2는 증가하지 않았으나, 단지 헥사노일-, 헥실포르미에이트-, 헥세노일 트랜스2- 및 헥세노일 트랜스3-hGRF (1-29) NH2만은 6일 연구 가간에서 IGF-I 레벨이 현저히 증가하였다. hGRF (1-29) NH2는 전의 분석(실시예 I을 보라)에서 동일 조건의 같은 용량에서 비효과적으로 나타났기 때문에, 상기 결과는 GRF의 N말단 위치에서 다양한 C6 탄소의 첨가는 생물활성을 증가시키는 것으로 보인다.
실시예 III
피그에서 [헥사노일 트랜스-3]0hGRF(1-29)NH2대 hGRF(1-29)NH2의 정맥내 GH-릴리싱 효능
본 실시예는 인체와 생리적으로 유사한 모델에서[헥사노일 트랜스-3]0hGRF(1-29)NH2, 프로-GRF 유사체의 I.V. 급성 GH-릴리싱 효능을 시험하고 hGRF(1-29)NH의 효능과 비교하기 위하여 행해진다.
[헥사노일 트랜스-3]0hGRF(1-29)NH2는 자연hGRF(1-29)NH2와 자연 지방산의 결합이다. 본 연구는 멀티도스, 단일 I.V. 주입연구이다.
시험된 유사체의 동정
TT-01024 (헥사노일 트랜스-3)0hGRF (1-29) NH20.25㎍/kg
TT-01024 (헥사노일 트랜스-3)0hGRF (1-29) NH21㎍/kg
TT-01024 (헥사노일 트랜스-3)0hGRF (1-29) NH24㎍/kg
hGRF(1-29)NH20.25㎍/kg
hGRF(1-29)NH21㎍/kg
hGRF(1-29)NH24㎍/kg
시험된 품목의 루트 및 도수
투여 : 정맥내 급성주입
시험 시스템 : 랜드레이스 X 요크샤이어 피그
동물 종류 : 56마리의 성장바로우
구매시 35kg 중량의 피그
레이션 : 임의로 공급된 시판 먹이 농도(18% 프로테인)
시험 설계 : 56마리의 피그(4 스페어 동물)은 연구전에, 일주일이내에 삽 관(한 경정맥에 외과적으로 이식된 카테테르)된다. 1일 및 7 일에, 삽관된 동물은 7 그룹으로 임의로 분포된다((그룹 당 n= 4 피그).
group 1 : saline
group 2 : TT-01024 0.25㎍/kg
group 3 : TT-01024 1㎍/kg
group 4 : TT-01024 4㎍/kg
group 5 : hGRF(1-29)NH20.25㎍/kg
group 6 : hGRF(1-29)NH21㎍/kg
group 7 : hGRF(1-29)NH24㎍/kg
PGH 분석용 혈액 샘플은 GRF주입후 5시간전에 매 20분에서 1시간에 채취되고, 주입(n=21 샘플)후 10분 및 30분의 추가 채취한다. 혈액은 +4℃에서 응고되게 한다. 혈청은 혈청은 원심분리로서 얻고, -20℃에 저장하고 pGH 분석에 따른다.
결과는 도 2 및 도 3에 나타난다. 도 2에 보여진 것과 같이, hGRF(1-29)NH2(4㎍/kg)는 주입후 약 60분의 빠른 GH 릴리스를 유도한다. 반대로, 동일한 용량이 주입된 헥세노일 트랜스3-hGRF(1-29)NH2는 더 긴 기간, 약 260분 동안 GH 레벨이 증가하였다. 추가로, 첫 번째 60분의 GH응답은 완만하여, 이 유사체가 프로-GRF로서 작용함을 암시하고, 주입후 분 또는 시내에 혈청헤서 자연 GRF로 발전한다.
도 3에 나타난 것과 같이, 커브(주입후 0-300분)하의 GH지역상에 다양한 용량의 GRF 및 유사체의 효과를 나타내고, hGRF(1-29)NH2는 4㎍/kg에서 GH분비에 현저한 효과가 있고, 0.25 또는 1㎍/kg에서는 효과가 없고, 헥세노일 트랜스3-hGRF(1-29)NH2는 모든 시험된 3가지 용량에서 현저한 응답을 유도한다.
결론적으로, 상기 결과는 헥세노일 트랜스3-hGRF(1-29)NH2는 GH분비상 증가된 효능을 가진 GRF 유사체이고, 프로-GRF로서 작용하고 혈청내 효소분해로부터 보호되는 것을 나타낸다.
실시예 IV
피그에서 [헥사노일 트랜스-3]0hGRF(1-29)NH2대 hGRF(1-29)NH2의 피하 GH-릴리싱 효능
본 실시예는 인체와 생리적으로 유사한 모델에서[헥사노일 트랜스-3]0hGRF(1-29)NH2, 프로-GRF 유사체의 S.C. 급성 GH-릴리싱 효능을 시험하고 hGRF(1-29)NH의 효능과 비교하기 위하여 행해진다.
시험된 유사체의 동정
TT-01024 (헥사노일 트랜스-3)0hGRF (1-29) NH20.31㎍/kg
TT-01024 (헥사노일 트랜스-3)0hGRF (1-29) NH20.25 ㎍/kg
TT-01024 (헥사노일 트랜스-3)0hGRF (1-29) NH25㎍/kg
TT-01024 (헥사노일 트랜스-3)0hGRF (1-29) NH220㎍/kg
hGRF(1-29)NH21.25㎍/kg
hGRF(1-29)NH25㎍/kg
hGRF(1-29)NH220㎍/kg
시험된 품목의 루트 및 도수
투여 : 피하 급성주입
시험 시스템 : 랜드레이스 X 요크샤이어 피그
동물 종류 : 64마리의 성장바로우
구매시 35kg 중량의 피그
레이션 : 임의로 공급된 시판 먹이 농도(18% 프로테인)
시험 설계 : 36마리의 피그(4 스페어 동물)은 연구전에, 일주일이내에 삽 관(한 경정맥에 외과적으로 이식된 카테테르)된다. 1일 및 7 일에, 삽관된 동물은 8 그룹으로 임의로 분포된다((그룹 당 n= 4 피그).
group 1 : saline
group 2 : TT-01024 0.31㎍/kg
group 3 : TT-01024 1.25㎍/kg
group 4 : TT-01024 5㎍/kg
group 5 : hGRF(1-29)NH220㎍/kg
group 6 : hGRF(1-29)NH21.25㎍/kg
group 7 : hGRF(1-29)NH25㎍/kg
group 8 : hGRF(1-29)NH220㎍/kg
PGH 분석용 혈액 샘플은 GRF주입(n=25 샘플)후 7시간전에 매 20분에서 1시간에 채취된다. 혈액은 +4℃에서 응고되게 한다. 혈청은 혈청은 원심분리로서 얻고, -20℃에 저장하고 pGH 분석에 따른다.
결과는 도 4 및 도 5에 나타난다. 도 4에 보여진 것과 같이, hGRF(1-29)NH2(5㎍/kg)의 피하 주입은 주입후 약 60분에서 GH 릴리스를 유도하고, 동일 용량 주입의 헥세노일 트랜스3-hGRF(1-29)NH2는 260분에 GH 레벨의 증가를 유도하였다. 도 5는 커브, 주입후 0-420분하의 GH지역상에 다양한 용량의 시험된 GRF 의 효과를 설명한다. 상기 기간동안, hGRF(1-29)NH2는 어떠한 시험된 용량에서도 GH분비에 현저한 효과를 유도하지 않았고, 헥세노일 트랜스3-hGRF(1-29)NH2는 5 및 20㎍/kg에서 GH AUC의 현저한 증가를 유도하였다. 상기 결과는 헥세노일 트랜스3-hGRF(1-29)NH2는 피하로 투여될때에도 매우 효능있는 GH분비촉진 물질이라는 것을 나타낸다.
본 발명은 특히 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하면서 설명되었지만, 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 다양한 변형은 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자로부터 가능하게 된다.
서열 목록
(1) 일반적 정보:
(ⅰ) 출원인:
(A) 명칭: 떼라떼끄놀로지 인코퍼레이티드
(B) 시가: 7701 - 17eme 아브뉘
(C) 도시: 몬트리올
(D) 주: 퀘벡
(E) 국가: 카나다
(F) 우편번호(ZIP): H2A 2S5
(G) 전화번호: (514) 729-7904
(F) 팩스번호: (514) 593-8142
(ⅱ) 발명의 명칭: 향상된 생물학적 효능을 갖는 키메릭 지방체-프로- 지.알.에프. 유사체
(ⅲ) 서열 개수: 2
(ⅳ) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 형태: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환
(C) 운용체계: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn 릴리즈 #1.0, 버전 #1.30
(EPO)
(ⅵ) 선행출원 데이터:
(A) 출원번호: US 08/453,067
(B) 출원일: 1995. 5. 26
(2) 서열 1에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 서열 길이: 44 아미노산
(B) 형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: 펩티드
(ⅲ) 추정 서열: 아니오
[서열 1]
(2) 서열 2에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 서열 길이: 29 아미노산
(B) 형: 아미노산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 직쇄상
(ⅱ) 서열의 종류: 펩티드
(ⅲ) 추정 서열: 아니오
[서열 2]

Claims (13)

  1. 아래의 일반식:
    여기서,
    A2는 발린 또는 알라닌;
    A15는 알라닌 또는 글리신;
    A24는 글루타민산 또는 히스티딘;
    A27는 메티오닌, 이소류신 또는 노르류신
    A28는 세린 또는 아스파르트산;
    A30는 n=1∼12인 아미노 알킬 카르복스아미드-NH-(CH2)n-CONH-,; 또는 1∼15
    잔유물의 어떤 아미노산 배열; 및
    Al는 티로신 또는 히스티딘; A8는 아스파라긴 및 A18는 세린 또는 티로신이
    고, 여기서 A1은 아래의 화학식 1의 소수성 테일이 N-또는 O-에 달려있고:
    [화학식 1]
    여기서,
    G는 a=0 또는 1인 카르보닐, 포스포닐, 설퓨릴 또는 설피닐 그룹;
    X는 b=0 또는 1인 산소 원자, 황 도는 아미노 그룹 (-NH-);
    R1, R2, 및 R3라디칼은 같거나 다르고, 하이드록실 그룹, 수소 원자 및 로우
    어 리니어 또는 가지친 알킬 그룹으로부터 선택되고;
    -(W=Y)- 및 -(W'=Y')-는 R5및 R6=H 또는 C1-C4알킬; d 및 f=0 또는 1인 시
    스 또는 트랜스 더블 결합 -(CH=CR5)- -(CH=CR6)-을 나타내고
    R4는 하이드록시 그룹, 수소 원자 또는 C5-C9알킬이고;
    Z는 R4가 수소일 때 a, b, c, d, e, f, g 및 h가 동일하거나 다르고 모두 0 이 아니고, 그리고 a, b, c, d, e, f, g 및 h의 합이 식 I의 소수성 테일이 5와 8원자사이(C, O 및/또는 S)의 리니어 주요 체인을 가지는 h=0∼1인; 산소 또는 유황 원자인 것을 특징으로하는 증가된 생물학적 효능을 가지는 키메릭 지방체-프로-GRF 유사체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    A1은 식I의 소수성 테일에 달린 티로신 또는 히스티딘 N-알파이고, a=1, b=1; 각각의 d, f 및 h=0; G=카르보닐; X= 산소 원자; R1, R2, R3, R4= 수소 원자 그리고 합 c + e + g= 3, 4, 5 또는 6인 것을 특징으로 하는 키메릭 지방체-프로-GRF 유사체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    A1은 식I의 소수성 테일에 달린 티로신 또는 히스티딘 N-알파이고, a=1; 각각의 b, d, f 및 h=0; G=카르보닐; R1, R2, R3및 R4= 하이드록실 그룹 그리고 합 c + e + g= 4, 5, 6 또는 7인 것을 특징으로 하는 키메릭 지방체-프로-GRF 유사체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    A1은 식 I의 소수성 테일에 달린 티로신 또는 히스티딘 N-알파이고, a=1; 각각의 b 및 h=0; 합 d + f=1; G=카르보닐; R1, R2, R3및 R4= 수소 원자 그리고 합 c + e + g= 2, 3, 4 또는 5인 것을 특징으로 하는 키메릭 지방체-프로-GRF 유사체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    A1은 식 I의 소수성 테일에 달린 티로신 또는 히스티딘 N-알파이고, a=1; 각각의 b 및 h=0; 합 d + f= 2; G=카르보닐; R1, R2, R3및 R4= 수소 원자 그리고 c + e + g= 0, 1, 2 또는 3인 것을 특징으로 하는 키메릭 지방체-프로-GRF 유사체.
  6. 제 1 항에 있어서,
    A1은 식 I의 소수성 테일에 달린 티로신 또는 히스티딘 N-알파이고, a=1; 각각의 b, h, d 및 f= 0; G=카르보닐; R1, R2, R3및 R4= 수소 원자 그리고 c + e + g= 4, 5, 6 또는 7인 것을 특징으로 하는 키메릭 지방체-프로-GRF 유사체.
  7. 활성 성분으로서 제 1,2,3,4 항 또는 제 5 항에서 청구된 것과 같은, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 결합한 GRF 유사체로 구성되는 것을 특징으로 하는 성장 홀몬 릴리스를 위한 약학 제제.
  8. 제 1,2,3,4 항 또는 제 5 항에서 청구된 것과 같은 GRF 유사체의 효율량을 상기 환자에게 투여하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 환자에서 성장 홀몬 레벨을 증가하는 방법.
  9. 제 1,2,3,4 항 또는 제 5 항에서 청구된 것과 같은 GRF 유사체를 상기 환자에게 투여하는 단계 및 성장 홀몬 응답을 측정하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 환자에서 성장 홀몬 결핍증의 진단을 위한 방법.
  10. 제 1,2,3,4 항 또는 제 5 항에서 청구된 것과 같은 GRF 유사체의 효율량을 상기 환자에게 투여하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 뇌하수체성 난장이 또는 성장 지체를 치료하기 위한 방법.
  11. 제 1,2,3,4 항 또는 제 5 항에서 청구된 것과 같은 GRF 유사체의 효율량을 상기 환자에게 투여하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 환자에서 상처의 치료 또는 골격 치유를 위한 방법.
  12. 제 1,2,3,4 항 또는 제 5 항에서 청구된 것과 같은 GRF 유사체의 효율량을 상기 환자에게 투여하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 환자에서 골다공증의 치료를 위한 방법.
  13. 제 1,2,3,4 항 또는 제 5 항에서 청구된 것과 같은 GRF 유사체의 효율량을 인체 또는 동물에게 투여하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 인체 또는 동물에서프로테인 동화작용을 개선하기 위한 방법.
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