KR100474868B1 - 생물학적 효능이 증가된 지알에프 아나로그 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 증가된 생물학적 효능을 가지는 키메릭 지방체-GRF 아나로그에 관한것으로, 동화제 및 성장 호르몬 결핍의 진단 및 치료에의 적용에 관한 것이다. 키메릭 지방체-GRF 아나로그는 소수성 테일을 포함하고, GRF에 하나 또는 여러개의 소수성 테일을 고정하거나 GRF의 화학 합성에서 제조될 수 있다. 본 발명의 GRF 아나로그는 생체분해될수 있고, 면역유전이 아니며 감소된 용량과 연장된 활성을 가진 개선된 동화 효능을 나타낸다.
Description
도 1은 돼지 혈청 IGF-1상에 피하로 주입된 hGRF(1-29) NH2 아나로그의 효과 그래프;
도 2는 돼지 혈청 GH상에 (4㎍/kg) hGRF(1-29) NH2 및 (4㎍/kg) (헥사노일 트랜스-3)0 hGRF(1-29) NH2 (TT-01024) + 아나로그의 정맥내 주입 효과 커브,
도 3은 I.V. 투여(기본 기간 -60∼0 분과 비교되었을때 **P<0.01 및 ***P<0.001)에 따르는 300분이상의 커브아래의 GH지역상에 다양한 용량의 hGRF(1-29) NH2 대 (헥사노일 트랜스-3)0 hGRF(1-29) NH2 (TT-01024)의 효과를 나타내는 그라프,
도 4는 돼지 혈청상에 5㎍/kg hGRF(1-29) NH2 및 (5㎍/kg) (헥사노일 트랜스-3)0 hGRF(1-29) NH2 (TT-01024) 아나로그의 피하 주입 효과 커브,
도 5는 S.C. 투여(기본 기간 -60∼0 분과 비교되었을때 **P<0.01 및 ***P<0.001)에 따르는 420분이상의 커브아래의 GH지역상에 다양한 용량의 hGRF(1-29) NH2 대 (헥사노일 트랜스-3)0 hGRF(1-29) NH2 (TT-01024)의 효과를 나타내는 그라프,
도 6A∼6C는 본 발명에 따른 바람직한 래디칼 R을 가진 GRF 아나로그의 X-포션의 특수 합성의 예,
도 7A 및 7B는 돼지에서 IGF-1 레벨상에 본 발명의 8가지의 다른 hGRF(1-44) NH2 아나로그의 효과를 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 새로운 과(family)의 고도로 효능있는 키메릭 지방체-GRF 아나로그를 생산하기 위하여 지방체, 즉 가미세포 잔유물 및/또는 소수성 테일의 사용에 관한 것이다.
본 발명에따라서, 지방체-GRF 아나로그는 GRF 또는 그의 아나로그중의 하나의 N-말단 포션에서 하나 또는 여러개의 소수성 테일을 고정함으로서 화학적으로 합성될 수 있다
화학적으로 더욱 효율적으로 고정하기 위하여, 산 형태하에서 기능화된 소수성이 사용된다. 이러한 조건에서, 종래 기술(B. Castro et al., 1975, Tetrahedron letters, Vol. 14:1219)에서 알려진 벤조트리아졸-1-일록시트리스(디메틸아미노) 포스포늄 헥사플로로포스페이트와 같은 극도의 활성적인 시약을 사용하여 고체상(Merrifield R.B., 1963, J. Am. Chem. Soc., 85:2149; 1964 J. Am. Chem. Soc., 86:304)에서 효율적이다.
이러한 경우에 소수성 테일은 지방산내에 고정되어 지고, 고정은 원 위치에서 활성화된다. 사용된 합성 방법에 따라서, 펩티드 고정 사이트는 종래의 디프로텍트 조건(Gross et Meienhofer, 981, the peptides, vol. 3, Academic press: pages 1-341)에서 고정하기 바로 앞서 릴리스된다. 소수성 테일(Ht)은 에테르(테트라하이드로퓨란), 알리파틱 할로겐화 용매(디클로로메탄), 니트릴(악토니트릴) 또는 아미드(디메틸포름아미드)와 같은 유기 용매에서 고정 시약으로서 농축된다.
고정 다이내믹에 있어서, 바람직한 작업 온도는 20∼60℃이다. 사용된 소수성 테일이 더욱 더 소수성일때의 고정 작용은 온도에 역으로 변화하나, 0.1∼24 시간 사이에서 변화한다.
상기에 설명된 바와 같이, 아래의 트리아실 라이신 합성은 반응 방법에서 소수성 테일의 고정 원리의 모든 것을 설명한다.
일반 GRF 아나로그 합성 단계는 밀리포어(Millipore)에 의한 Fmoc 방식 및 합성 싸이클을 사용하는 9050TM 플러스 펩티드 신시사이저(plus peptide synthesizer, Millipore Corporation, Milford, MA)상에서 고체상 방법론에 의해 수행된다. Fmoc 아미노산은 바켐 캘리포니아(Bachem California) 및 다른 상업적 소스에 의해 공급된다. 결합 방법론으로서 BOP/HOBt를 사용하는 연속 Fmoc 화학은 C-말단 카르복스아미드를 생산하기 위하여 스타팅 Fmoc-Pal-PEG 수지(Millipore, catalog number: GEN 913383)로 적용된다. Fmoc 디프로텍션은 DMF내 20% 피페리딘으로 이루어진다. 합성후, 수진는 건조에 앞서 DMF 및 에테르로서 잘 세척한다. 그룹 및 펩티드-수지 본드를 보호하는 사이드 체인의 마지막 분절은 다음의 화합물: TFA, 물, 페놀, 트리이소프로필실란(88:5:5:2)으로 이루어지는 밀리포어 공급 과정을 사용하여 수행된다. 펩티드는 다음 침전되고 건조에 앞서 에테르로 세척한다. 탈염 단계(버퍼 C:0.1% H2O내 TFA; D:0.1% CH3CH/H2O내 TFA 80:20)다음의 워터 프렙(water prep) 4000, 흡수도 214nm, 디텍터 모델 486, 유속(50ml/min.; 105분에 25∼60%B 리니어 성분)을 사용하는 역 위상 HPLC 정제(버퍼A: TEAP 2.5; 버퍼 B: A내 80% CH3CN)는 HPLC(millenium/photodiode array detection)으로 측정된 97%이상의 균일성을 가진 10∼30% 수율의 펩티드를 얻는다.
본 발명에 따라서, 시험 종으로서 GRF 아나로그의 발전용 임상전 모델로 적합하므로 돼지가 선택된다. 인체 및 돼지 GRF(1-29)NH2는 구조의 유사성이 100%이며, GH분비의 생리적 패턴도 두종에서 거의 동일하다.
GRF 아나로그의 효능은 그의 급성 GH 릴리스 효능보다는 IGF-I 혈액 레벨을 증가시키는 능력으로 평가된다. 실제로, GH 또는 GH가 유도된 GRF의 동화 및 치료 효과는 IGF-I 합성 및 분비의 증가에 의해 성립된다. 그러므로, IGF-I 상승이 유도된 GRF의 측정은 치료 효율의 최고의 지표이다.
본 발명을 제한하기 보다는 발명을 설명하는 아래의 실시예를 참조하여 본 발명은 더욱 쉽게 이해될 것이다.
실시예1
돼지에서 혈청 IGF-I 레벨상의 (부틸 0 ), (옥타노일 0 )-, (헥사노일 0 )- (헥사노일 30 ), (헥사노일 0,30 ), HGRF(1-29)NH 2 및 (헥사노일 0 ) HGRF(1-44)NH 2 대 HGRF(1-29)NH
2
의 반복 투여 효과
본 실시예의 목적은 동화제로서 GRF 아나로그의 능력을 평가하기 위함이다. GH 또는 GH 분비가 유도된 GRF는 인슐린과 같은 성장 인자 I(IGF-I)합성 및 분비의 증가를 통하여 그의 동화 효과를 발휘하고, IGF-I의 순환 레벨을 상승한다. GRF 아나로그 치료에의 동화 응답의 강도는 돼지에서 IGF-I레벨의 증가에 비례한다는 것은 앞에서 기술하였다(Dubreuil P. et al., 1990, J. Anim. Sci., 68:1254-1268).
그러므로, 지방산-프로-GRF 아나로그의 동화 능력을 조사하기 위하여, 돼지에서 다음의 반복된 S.C. 투여후의 IGF-I 레벨을 증가하는 능력이 평가된다.
실험 1
26 랜드레이스 x 요크샤이어 거세된 수 돼지(40-45kg BW)가 4 실험 그룹으로 무작위로 분포된다:
1- hGRF(1-29)NH2 (20㎍/kg, n=7)
2- [옥타노일0] hGRF(1-29)NH2
(20㎍/kg, n=6)
3- [헥사노일0] hGRF(1-29)NH2
(20㎍/kg, n=6)
4- [부티릴0] hGRF(1-29)NH2
(20㎍/kg, n=7)
각각의 동물은 연속적인 4일동안 피하로 BID(하루에 두 번)가 주입된다. 하나의 혈액 샘플은 IGF-I측정을 위하여, 각일의 일차 주사에 앞서 매일 아침에, 마지막 주사의 다음날에 수집된다.
실험 2
40 랜드레이스 x 요크샤이어 거세된 수 돼지(40-45kg BW)가 5 실험 그룹으로 무작위로 분포된다:
1- saline (n=8)
2- hGRF(1-29)NH2 (40㎍/kg, n=8)
3- [헥사노일0] hGRF(1-29)NH2
(10㎍/kg, n=8)
4- [헥사노일0] hGRF(1-29)NH2
(20㎍/kg, n=8)
5- [헥사노일0] hGRF(1-29)NH2
(40㎍/kg, n=8)
각각의 동물은 연속적인 5일동안 피하로 BID(하루에 두 번)가 주입된다. 하나의 혈액 샘플은 IGF-I측정을 위하여, 각일의 일차주사에 앞서 매일 아침에, 마지막 주사의 다음날에 수집된다.
실험 3
48 랜드레이스 x 요크샤이어 거세된 수 돼지(40-45kg BW)가 6 실험 그룹으로 무작위로 분포된다:
1- saline (n=8)
2- hGRF(1-44)NH2 (30㎍/kg, n=8)
3- [헥사노일0] hGRF(1-44)NH2
(30㎍/kg, n=8)
4- [헥사노일0] hGRF(1-29)NH2
(20㎍/kg, n=8)
5- [헥사노일30] hGRF(1-29)NH2
(20㎍/kg, n=8)
6- [헥사노일0, 30] hGRF(1-29)NH2
(20㎍/kg, n=8)
선택된 용량은 몰을 기초로 동일한 용량인, hGRF(1-44)NH2 아나로그용 30㎍/kg 및 hGRF(1-29)NH2 아나로그용 20㎍/kg이다. 각각의 동물은 연속적인 5일동안 피하로 BID(하루에 두 번)가 주입된다. 하나의 혈액 샘플은 IGF-I측정을 위하여, 각일의 일차주사에 앞서 매일 아침에, 마지막 주사의 다음날에 수집된다.
IGF-I 측정
IGF-I 레벨은 전에 기재된(Abribat T. et al., 1993, J. Endocrinol., 39:583-589) 것과 같이, 포름산-아세톤 추출후에 더블 항체 방사면역분석(double antibody radioimmunoassay)으로서 돼지 혈청에서 측정된다. 방사면역 분석에 앞서 내생의 IGF-결합 프로테인을 제거하기 위하여 추출은 필요한 단계이다.
통계적 분석
모든 실험에서, IGF-I 데이터는 변수의 소스로 일(day) 및 처리(GRF 아나로그)로서, 변이의 2가지 반복 측정 분석에 의해 분석된다. 많은 비교 과정이 행해진다(Student-Newman Keuls method). P < 0.05이 통계적 유효하다.
결과
실험 1
IGF-I 레벨의 증가는 시험된 아나로그에 의한다라는 것이 표시되며, P=0.0004인 날과 P=0.011인 특별 처리 x 일 상호작용에서 현저한 효과를 보인다(표 1). IGF-I 측정용 혈액 샘플은 혼합물의 일차 주입에 앞서 매일 수집된다. 데이터는 그룹 당 6-7 가의 평균 ± SEM으로서 나타난다.
| 처리(BID, 20μg/kg SC) | 1일예비처리(ng/ml) | 2일(ng/ml) | 3일(ng/ml) | 4일(ng/ml) | 5일(ng/ml) |
| hGRF(1-29)NH2 | 252±28 | 235±19 | 263±16 | 258±17 | 262±24 |
| [octanoyl0]hGRF(1-29)NH2 | 316±22 | 287±20 | 301±37 | 301±37 | 318±39 |
| [hexanoyl0]hGRF(1-29)NH2 | 248±20 | 281±28 | 299±26 | 319±22a | 342±21a,b |
| [butyril0]hGRF(1-29)NH2 | 278±20 | 281±24 | 302±26 | 289±26 | 293±23 |
처리 P=0.42
일 P=0.0004
처리 × 일 P=0.011
a P<0.05 1일과 비교할때
b P<0.05 2일과 비교할때
복수 비교는 단지 [헥사노일0] hGRF(1-29)NH2 만이 IGF-I 레벨에서의 증가를 유도하고, 4일(29%, P < 0.05) 및 5일(38%, P < 0.05)에서 현저하게 나타낸다. 인체 GRF(1-29)NH2는 시험된 용량에서 IGF-I상에 영향을 주지 않았다.
실험 2
IGF-I 레벨의 증가는 시험된 아나로그에 의한다라는 것이 표시되며, P< 0.0001인 날과 P< 0.0001인 특별 처리 x 일 상호작용에서 현저한 효과를 가 보인다(표 2). IGF-I 측정용 혈액 샘플은 혼합물의 일차 주입에 앞서 매일 수집된다. 데이터는 그룹 당 8 가의 평균 ± SEM으로서 나타난다.
| 처리(BID, SC) | 1일예비처리(ng/ml) | 2일(ng/ml) | 3일(ng/ml) | 4일(ng/ml) | 5일(ng/ml) | 6일(ng/ml) |
| saline | 282±33 | 266±30 | 281±34 | 293±30 | 287±32 | 289±33 |
| hGRF(1-29)NH2 (40μg/kg) | 244±24 | 243±16 | 267±20 | 275±27 | 267±17 | 256±15 |
| [hexanoyl0]hGRF(1-29)NH2(10μg/kg) | 303±31 | 327±20 | 337±25 | 338±25 | 366±37a | 350±34a |
| [hexanoyl0]hGRF(1-29)NH2(20μg/kg) | 302±38 | 341±37 | 368±43a | 362±40a | 362±45a | 368±57a |
| [hexanoyl0]hGRF(1-29)NH2(40μg/kg) | 252±35 | 275±32 | 319±31a | 354±41a,b | 350±34a,b | 374±33a,b,c |
처리 P=0.23 ; 일 P=0.0001
처리 × 일 P=0.0001
a P<0.05 1일과 비교할때
b P<0.05 2일과 비교할때
c P<0.05 3일과 비교할때
복수 비교는 모든 세가지 시험된 용량의 [헥사노일0] hGRF(1-29)NH2 가 IGF-I 레벨에서 증가되는 것을 나타낸다. 10㎍/kg에서, IGF-I 레벨은 5일 및 6일(16-21%, P < 0.05)에 현저하게 증가되었다. 20㎍/kg에서, IGF-I 레벨은 3, 4, 5일 및 6일(20-22%, P < 0.05)에 증가되었다. 40㎍/kg에서, IGF-I 레벨은 3, 4, 5일 및 6일(27-48%, P < 0.05)에 증가되었다. 혈청 IGF-I 레벨은 생리 식염수내-hGRF(1-29)NH2-처리된 돼지에서 안정하게 남아있다.
마지막으로, 역 분석은 1일에서 6일까지 IGF-I 농도의 증가는 [헥사노일0] hGRF(1-29)NH2(△IGF-I = 11.9 + (2.77 * dose); r = 0.68, P < 0.0001)의 용량에 의한다는 것을 나타낸다.
실험 3
IGF-I 레벨의 증가는 시험된 아나로그에 의한다라는 것이 표시되며, P< 0.0001인 날과 P< 0.0001인 특별 처리 x 일 상호작용에서 현저한 효과를 보인다(표 IV). 복수 비교는 GRF의 N말단 위치에 가지친 헥사노일 기능기를 가진 아나로그는 매우 효력이 있다는 것을 나타낸다:
- [헥사노일0] hGRF(1-29)NH2는 IGF-I 레벨을 5일 및 6일(28% 및 31%, P < 0.05)에 현저하게 증가시킨다.
- [헥사노일0, 30] hGRF(1-29)NH2는 IGF-I 레벨을 4일, 5일 및 6일(32%, 35% 및 43%, P < 0.05)에 현저하게 증가시킨다.
- [헥사노일0] hGRF(1-44)NH2는 IGF-I 레벨을 3, 4, 5일 및 6일(41%, 54%, 50% 및 61%, P < 0.05)에 현저하게 증가시킨다.
hGRF(1-29)NH2를 위하여 전에 관찰된 바와 같이(시험 1 및 2), 전체 길이 hGRF(1-44)NH2는 IGF-I레벨에 조금 또는 영향을 주지 않았다(5일의 현저한 효과를 제외, 6일에는 지속되지 않음). 마지막으로, hGRF(1-29)NH2의 C말단 위치에서 헥사노일 기능기의 고정은 hGRF(1-29)NH2(6일 IGF-I 레벨 21% 증가)와 비교하여 증가된 효능을 가진 아나로그를 얻었으나, [헥사노일0, 30] hGRF(1-29)NH2보다는 낮았다.
인체 GRF(1-29)NH2 및 hGRF(1-29)NH2는 동일 몰농도를 얻기 위하여 각각 20㎍/kg 및 30㎍/kg에서 주입된다. 나타난 데이터는 그룹 당 8 가의 평균 ± SEM으로서 나타난다.
| 처리(BID, SC) | 1일예비처리(ng/ml) | 2일(ng/ml) | 3일(ng/ml) | 4일(ng/ml) | 5일(ng/ml) | 6일(ng/ml) |
| saline | 215±21 | 215±28 | 219±25 | 226±28 | 249±30 | 234±24 |
| hGRF(1-44)NH2 (30μg/kg) | 245±21 | 254±22 | 285±26 | 297±28 | 303±26a, | 296±26 |
| [hexanoyl0]hGRF(1-29)NH2(20μg/kg) | 272±45 | 292±52 | 292±57 | 315±57 | 347±44a,b,c | 356±44a,b,c |
| [hexanoyl30]hGRF(1-29)NH2(20μg/kg) | 297±30 | 270±25 | 287±24 | 278±18 | 276±20 | 327±24b |
| [hexanoyl0,30]hGRF(1-29)NH2(20μg/kg) | 205±24 | 212±26 | 253±33 | 271±36a,b | 277±29a,b | 294±26a,b |
| [hexanoyl0]hGRF(1-44)NH2(30μg/kg) | 241±30 | 290±33 | 340±41a | 372±40a,b | 361±46a,b | 388±49a,b,c |
처리 P=0.16 a P<0.05 1일과 비교할때
일 P<0.0001 b P<0.05 2일과 비교할때
처리 × 일 P<0.0001 c P<0.05 3일과 비교할때
결론
20∼40㎍/kg의 용량에서 hGRF(1-29)NH2도 hGRF(1-29)NH2도 IGF-I레벨을 조절할 수 없다. 그러나, 지방산의 고정은 GRF를 더욱 효능있게 하고 IGF-I분비에서 현저하게 개선된 활성을 가진 아나로그를 얻는다. 지방산의 고정은 hGRF(1-29)NH2 및 hGRF(1-44)NH02의 동화 효능을 개선하는데 효과적이다. 상기 결과로부터, 사용하기에 이상적인 지방산은 헥사노익 산 또는 C6 지방 유도체이고, 최고로 효능있는 아나로그를 얻기 위하여 바람직하게 GRF의 N말단 위치에 고정되어야 한다.
실시예 II
돼지에서 IGF-I 레벨상의 GRF 아나로그의 비교 효과
본 실시예는 5일 처리, 1일 두 번 식염수 대 각 시험 품목의 하나의 단일용량의 S.C. 투여이다. 본 실시예는 [헥사노일]0 hGRF(1-29)NH의 효능과 [아미노헥사노일]0 hGRF(1-29)NH2, [헥실포르미에이트]0 hGRF(1-29)NH2, [헥사노일 트랜스-2]0 hGRF(1-29)NH2, [헥사노일 트랜스-3]0 hGRF(1-29)NH2 및 [뮤코노일]
0 hGRF(1-29)NH2의 효능을 비교하기 위하여 행해진다.
모든 시험되는 화합물은 GRF 아나로그의 같은 패밀리에 속하고: 분자의 활성을 개선하기 위하여 설계된, 자연 GRF 및 자연 지방산의 결합이다.
시험된 아나로그의 동정
in saline
TT-01015 (헥사노일)0 hGRF (1-29) NH2 20 ㎍/kg
TT-01021 (아미노헥사노일)0 hGRF (1-29) NH2 20 ㎍/kg
TT-01022 (헥실포르미에이트)0 hGRF (1-29) NH2 20 ㎍/kg
TT-01023 (헥사노일 트랜스-2)0 hGRF (1-29) NH2 20 ㎍/kg
TT-01024 (헥사노일 트랜스-3)0 hGRF (1-29) NH2 20 ㎍/kg
TT-01025 (뮤코노일)0 hGRF (1-29) NH2
20 ㎍/kg
시험된 품목의 루트 및 도수
투여 : 하루 2번 피하주입
시험 시스템 : 랜드레이스 X 요크샤이어 돼지
동물 종류 : 56마리의 구매시 35kg 중량의 성장 바로우 돼지
레이션 : 임의로 공급된 시판 먹이 농도(18% 프로테인)
시험 설계 : 56마리의 돼지는 7 시험 그룹(그룹 당 n= 8 돼지)으로 분포된다. 각각의 그룹은 하루에 두 번 아래 처방의 S.C.가 투여된다(volume: 3ml, S.C. 주입).
group 1 : saline 2 x/day
group 2 : TT-01015 20㎍/kg 2 x/day
group 3 : TT-01021 20㎍/kg 2 x/day
group 4 : TT-01022 20㎍/kg 2 x/day
group 5 : TT-01023 20㎍/kg 2 x/day
group 6 : TT-01024 20㎍/kg 2 x/day
group 7 : TT-01025 20㎍/kg 2 x/day
처방은 1일에서 5일까지 투여된다. 주사 바로 전에, 하나의 혈액 샘플은 각각의 동물에서 채취되고, 추가의 혈액 샘플은 6일에 채취된다.
혈액 샘플은 응고되게 하고, 혈청은 원심분리로서 채취되고 IGF-I 분석을 한다.
결과는 D-IGF-I로서 도 1에 나타나고, 1일(전처리 레벨)에서 6일(GRFs 투여 5일 후)까지 IGF-I레벨의 증가로서 규정된다. 시험된 모든 아나로그중에, 아미노헥사노일- 및 뮤코노일-hGRF (1-29) NH2는 증가하지 않았으나, 단지 헥사노일-, 헥실포르미에이트-, 헥세노일 트랜스2- 및 헥세노일 트랜스3-hGRF (1-29) NH2만은 6일 연구 기간에서 IGF-I 레벨이 현저히 증가하였다. hGRF (1-29) NH2는 전의 분석(실시예 I을 보라)에서 동일 조건의 같은 용량에서 비효과적으로 나타났기 때문에, 상기 결과는 GRF의 N말단 위치에서 다양한 C6 탄소의 첨가는 생물활성을 증가시키는 것을 나타낸다.
실시예 III
돼지에서 [헥사노일 트랜스-3]
0
hGRF(1-29)NH
2
대 hGRF(1-29)NH
2
의 정맥내 GH-릴리싱 효능
본 실시예는 인체와 생리적으로 유사한 모델에서 [헥사노일 트랜스-3]0 hGRF(1-29)NH2, 프로-GRF 아나로그의 I.V. 급성 GH-릴리싱 효능을 시험하고 hGRF(1-29)NH의 효능과 비교하기 위하여 행해진다.
[헥사노일 트랜스-3]0 hGRF(1-29)NH2는 자연 hGRF(1-29)NH2와 자연 지방산의 결합이다. 본 연구는 멀티도스, 단일 I.V. 주사연구이다.
시험된 아나로그의 동정
TT-01024 (헥사노일 트랜스-3)0 hGRF (1-29) NH2 0.25㎍/kg
TT-01024 (헥사노일 트랜스-3)0 hGRF (1-29) NH2 1㎍/kg
TT-01024 (헥사노일 트랜스-3)0 hGRF (1-29) NH2 4㎍/kg
hGRF(1-29)NH2 0.25㎍/kg
hGRF(1-29)NH2 1㎍/kg
hGRF(1-29)NH2 4㎍/kg
시험된 품목의 루트 및 도수
투여 : 정맥내 급성주입
시험 시스템 : 랜드레이스 X 요크샤이어 돼지
동물 종류 : 56마리의 구매시 35kg 중량의 성장 바로우 돼지
레이션 : 임의로 공급된 시판 먹이 농도(18% 프로테인)
시험 설계 : 56마리의 돼지(4 스페어 동물)은 연구전에, 일주일이내에 삽관(한 경정맥에 외과적으로 이식된 카테테르)된다. 1일 및 7일에, 삽관된 동물은 7 그룹으로 임의로 분포된다((그룹 당 = 4 돼지).
group 1 : saline
group 2 : TT-01024 0.25㎍/kg
group 3 : TT-01024 1㎍/kg
group 4 : TT-01024 4㎍/kg
group 5 : hGRF(1-29)NH2 0.25㎍/kg
group 6 : hGRF(1-29)NH2 1㎍/kg
group 7 : hGRF(1-29)NH2 4㎍/kg
pGH 분석용 혈액 샘플은 GRF주입후 5시간전에 매 20분에서 1시간에 채취되고, 주입(n=21 샘플)후 10분 및 30분의 추가 채취한다. 혈액은 +4℃에서 응고되게 한다. 혈청은 원심분리로서 채취되고, -20℃에 저장하고 pGH 분석에 따른다.
결과는 도 2 및 도 3에 나타난다. 도 2에 보여지듯이, hGRF(1-29)NH2(4㎍/kg)는 주입후 약 60분의 빠른 GH 릴리스를 유도한다. 반대로, 동일한 용량이 주입된 헥세노일 트랜스3-hGRF(1-29)NH2는 더 긴 기간, 약 260분 동안 GH 레벨이 증가하였다. 추가로, 첫 번째 60분의 GH응답은 완만하여, 이 아나로그가 GRF로서 작용함을 암시하고, 주입후 분 또는 시간내에 혈청에서 자연 GRF로 발전한다.
도 3에 나타난 것과 같이, 커브(주입후 0-300분)하의 GH지역상에 다양한 용량의 GRF 및 아나로그의 효과를 나타내고, hGRF(1-29)NH2는 4㎍/kg에서 GH분비에 현저한 효과가 있고, 0.25 또는 1㎍/kg에서는 효과가 없고, 헥세노일 트랜스3-hGRF(1-29)NH2는 모든 시험된 3가지 용량에서 현저한 응답을 유도한다.
결론적으로, 상기 결과는 헥세노일 트랜스3-hGRF(1-29)NH2는 GH분비상 증가된 효능을 가진 GRF 아나로그이고, GRF로서 작용하고 혈청내 효소분해로부터 보호되는 것을 나타낸다.
실시예 IV
돼지에서 [헥사노일 트랜스-3]
0
hGRF(1-29)NH
2
대 hGRF(1-29)NH
2
의 피하 GH-릴리싱 효능
본 실시예는 인체와 생리적으로 유사한 모델에서 [헥사노일 트랜스-3]0 hGRF(1-29)NH2, GRF 아나로그의 S.C. 급성 GH-릴리싱 효능을 시험하고 hGRF(1-29)NH의 효능과 비교하기 위하여 행해진다.
시험된 아나로그의 동정
TT-01024 (헥세노일 트랜스-3)0 hGRF (1-29) NH2 0.31㎍/kg
TT-01024 (헥세노일 트랜스-3)0 hGRF (1-29) NH2 0.25 ㎍/kg
TT-01024 (헥세노일 트랜스-3)0 hGRF (1-29) NH2 5㎍/kg
TT-01024 (헥세노일 트랜스-3)0 hGRF (1-29) NH2 20㎍/kg
hGRF(1-29)NH2 1.25㎍/kg
hGRF(1-29)NH2 5㎍/kg
hGRF(1-29)NH2 20㎍/kg
시험된 품목의 루트 및 도수
투여 : 피하 급성주입
시험 시스템 : 랜드레이스 X 요크샤이어 돼지
동물 종류 : 64마리의 성장바로우 돼지 구매시 35kg 중량
레이션 : 임의로 공급된 시판 먹이 농도(18% 프로테인)
시험 설계 : 36마리의 돼지(4 스페어 동물)은 연구전에, 일주일이내에 삽관(한 경정맥에 외과적으로 이식된 카테테르)된다. 1일 및 7일에, 삽관된 동물은 8 그룹으로 임의로 분포된다((그룹 당 n= 4 돼지).
group 1 : saline
group 2 : TT-01024 0.31㎍/kg
group 3 : TT-01024 1.25㎍/kg
group 4 : TT-01024 5㎍/kg
group 5 : hGRF(1-29)NH2 20㎍/kg
group 6 : hGRF(1-29)NH2 1.25㎍/kg
group 7 : hGRF(1-29)NH2 5㎍/kg
group 8 : hGRF(1-29)NH2 20㎍/kg
pGH 분석용 혈액 샘플은 GRF주입(n=25 샘플)후 7시간전에 매 20분에서 1시간에 채취된다. 혈액은 +4CC에서 응고되게 한다. 혈청은 원심분리로서 얻고, -20℃에 저장하고 pGH 분석에 따른다.
결과는 도 4 및 도 5에서 보여진다. 도 4에 보여진 것과 같이, hGRF(1-29)NH2(5㎍/kg)의 피하 주입은 주입후 약 60분에서 GH 응답을 유도하고, 동일 용량 주입의 헥세노일 트랜스3-hGRF(1-29)NH2는 240분 동안 유지되는 GH 응답을 유도하였다. 도 5는 연구기간의 커브, 주입후 0-420분하에서 GH지역상에 다양한 용량의 시험된 GRF 의 효과를 설명한다. 상기 기간동안, hGRF(1-29)NH2는 어떠한 시험된 용량에서도 현저한 GH 응답을 유도하지 않았고, 헥세노일 트랜스3-hGRF(1-29)NH2는 5 및 20㎍/kg에서 GH AUC의 현저한 증가를 유도하였다. 상기 결과는 헥세노일 트랜스3-hGRF(1-29)NH2는 피하로 투여될때에도 매우 효능있는 GH분비촉진 물질이라는 것을 나타낸다.
실시예 V
본 발명의 바람직한 실시예에 따라서, 일반식 A의 소수성 GRF 아나로그가 제공된다:
X-------GRF-peptide (A)
여기서,
GRF 펩티드는 일반식 B의 펩티드이다:
여기서,
A1는 타이로신 또는 히스티딘;
A2는 발린 또는 알라닌;
A8는 아스파라긴 또는 세린;
A13는 발린 또는 이소류신;
A15는 알라닌 또는 글리신;
A18는 세린 또는 티로신;
A24는 글루타민 또는 히스티딘;
A25는 아스파르트산 또는 글루탐산
A27는 메티오닌, 이소류신 또는 노르류신;
A28는 세린 또는 아스파라긴;
A30는 본드 또는 1∼15 잔유물의 어떤 아미노산 배열;
R0는 n=1∼12의 NH2 또는 NH-(CH2)n-CONH2; 그리고
X는 시스 또는 트랜스 CH3-CH2-CH=CH-CH2-CO, 또는
시스 또는 트랜스 에난시오머 또는 아래의 라세미 혼합물로부터 선택된다:
여기서 R은 수소 또는 저 알킬이다.
도 6A∼6C는 본 발명에 따르는 바람직한 라디칼 R을 가진 GRF 아나로그의 X-포션의 특수 합성의 예를 나타낸다.
10 (R=CH3) 및 11 (R=CH3)를 가진 상기에 확인된 아실 라디칼 X는 카타로그 번호 T3,808-3 및 T3,809-1의 알드리히로서 판매되는 전구체 카르복실산 (X-OH)로부터 유래된다.
실시예 VI
(+,-)-시스-2-에틸사이클로프로필아세트산(
15
)의 합성
(+,-)-시스-2-에틸사이클로프로필아세트산(15)은 도 1에서 설명된 것과 같이 합성된다. 먼저 시스-3-헥센-1-o1은 92%의 수율에서 희망하는 사이클로프로필 알코올 14를 얻기 위하여 0℃ 디클로로메탄내 클로로요도메탄 (Scott E. Denmark and James P. Edwards J. Org. Chem. 1991, 56, 6974-6981)의 존재하에 디에틸 징크와 반응한다. 드라이 DMF내 피리디늄 디크로메이트 (Corey, E. J/ amnd Schmidt, G. Terahedron Lett. 1979, 399-402)를 가진 알코올 14를 산화하여 66% 수율의 (+,-)-시스-2-에틸사이클로프로필아세트산(15)을 얻는다.
(+,-)-시스-2-에틸사이클로프로필아세트산(
15
)의 제조
1. 사이클로프로필 알코올
14
의 제조
250 ml 플라스크의 드라이 디클로로메탄 (70ml)내 Et2Zn (4.0 ml; 40mmol; 2 eq.)은 0℃로 냉각되고, CICH2I(5.8 ml; 80 mmol; 4 eq.)은 주사기로 첨가한다. 용액은 침전물이 형성되는 동안의 5분동안 0℃에서 진탕하고 CH2CI2 (32 ml)내 시스-3-헥센-1-o1 (2.0g, 20 mmol)용액은 배관으로 첨가한다. 반응 혼합물은 90분동안 0℃에서 진탕하고 NH4CI (100ml) 포화 수용액으로 식힌다. 다음, 용액은 실온에 방치하고, 10분동안 격렬하게 진탕하고, 디클로로메탄 (3 x 60 ml)으로 추출한다. 추출물은 H2O (1 x 20 ml) 및 소금물 (1 x 20 ml)로 세척하고, 화합하고, 건조되고(MgSO4), 감압하에서 농축된다. 잔유물은 맑고 무색의 용액의 원하는2.10 (92.3%)의 산물 14를 얻기 위하여 실리카 겔 크로마토그라피 (헥산/AcOEt, 8/2)로서 정제된다.
Rf = 0.22 (헥산/AcOEt, 8/2)
특성: Nmr (1H, 13C), ir, ms
2. (+,-)-시스-2-에틸사이클로프로필아세트산(
15
)의 제조
알코올 14(2,30 g; 19.8 mmol) 는 드라이 DMF (96 ml)에 용해되고 피리디늄 디크로메이트 (PDC) (3.5 eq., 26g)이 하나의 포션에 첨가된다. 반응 혼합물은 실온에서 밤새 진탕되고 다음 300 ml 물에 부어 넣고 (4 x 80 ml)의 에테르로 추출된다. 유기층은 화합되고, 소금물로 세척되고 감압하에서 농축된다. 잔유물은 클로로포름 (30 ml)에 용해되고 용액은 25 ml의 NaOH 10% 수용액으로 2번 추출된다. 화합된 수용액상은 클로로포름 (2 x 25 ml)으로 추출되고 에테르 (4 x 40 ml)로 추출한후 10% 수용성의 HCl로서 산성화된다. 화합된 유기상은 MgSO4에서 건조되고, 여과되고 무색의 오일(1.7 g, 66%)로서 원하는 산물 (+,-)-시스-2-에틸사이클로프로필아세트산 (14)를 얻기 위하여 감압하에서 농축된다.
특성: Nmr (1H, 13C), ir, ms
실시예 VII
(1R,2S)-2-에틸사이클로프로필아세트산(
22
) 및 (1R,2R)-2-에틸사이클로프로필아세트산(
24
)의 합성
광학적으로 순수한 (1R,2S)-2-에틸사이클로프로필아세트산(
22
) 및 (1R,2R)-2-에틸사이클로프로필아세트산(
24
)의 합성은 샤레트(Charette, A. B.; Juteau, H; Lebel, H.; and Molinaro C.J.Am. Chem. Soc. 1998, 120, 11943-11952)의 프로토콜에 따라 수행된다. 상기를 얻기 위하여, 키랄 디옥사보롤란 리간드 20가 필요하다.
1. 디옥사보롤란 리간드
20
의 합성
합성(스킴 2)은 산성 가수분해후 트리메틸 보레이트로서 부틸 마그네슘 브로마이드를 처리하여 부틸 보론산의 제조로 시작된다. 부틸 보론산 의 탈수와 보록신으로의 전환을 막기 위하여, 그의 디에탄올아민 혼합물 19로 변화시킨다. (R,R)-(+)-N,N,N,'N,'-테트라메틸 타르타르산 디아미드 16은 디메틸 아민으로 (R,R)-(+)-N,N,N,'N,'-테트라메틸 타르타르산을 농축함으로 시바흐의 공정(Seebach, D.; Kalinowski, H.-O.; Langer, W.; Wilka, E-M. Organic Sysnthesis; Wiley: New York, 1990; Coll. Vol. VII, pp41-50)으로 용이하게 제조된다.
이위상 배지내의 약간 과도한 (R,R)-(+)-N,N,N,'N,'-테트라메틸 타르타르산 디아미드로서 처리될 때, 디에탄올아민 혼합물 19는 93% 수율로 원하는 키랄 디옥사보롤란 리간드를 얻기 위하여 반응한다.
2. (1R,2S)-2-에틸사이클로프로필아세트산(
22
)의 합성
디옥사보롤란 리간드 20이 제조되면 스킴 3에서 나타난 것과 같이 (1R,2S)-2-에틸사이클로프로필아세트산(
22
)의 합성을 진행한다. 호모알릴형 알코올 트랜스-3-헥센-1-o1이 -10℃에서 디클로로메탄내 디옥사보롤란 20 리간드 및 징크 시약(Zn(CH2I)2,DME (Et2Zn, CH2I2 및 DME의 혼합물로부터 얻어지는)의 혼합물에 첨가된다. 균일 혼합물은 실온에서 데워지고 밤새도록 진탕된다. 비산화성 작업은 쿠겔로르 증류후, 71% 수율의 원하는 산물 21을 얻었다. 마지막으로, 알코올 21의 피리디늄 디크로메이트 (PDC) 산화는 39.7% 수율의 (1R,2S)-2-에틸사이클로프로필아세트산(
22
)을 얻는다(스킴 3).
3. (1R,2S)-2-에틸사이클로프로필아세트산(
24
)의 합성
광학적으로 순수한 (1R,2S)-2-에틸사이클로프로필아세트산(
24
)은 (1R,2R)-2-에틸사이클로프로필아세트산(
22
)를 생산하기 위하여 사용된 방법을 사용하여 수행된다.
(1R,2S)-2-에틸사이클로프로필아세트산(
22
) 및 (1R,2R)-2-에틸사이클로프로필아세트산(
24
)의 제조
1. 디옥사보롤란 리간드
20
의 제조
1.1 부틸마그네슘 브로마이드
17
의 제조
마그네틱 교반봉, 125 ml, 균등 압력 가압 깔때기, 역류 콘덴서 및 릴리스 마개가 장치된 마개가 3개이고 둥근 바닥인 1L 플라스크에 34.0 g (1.40 mol)의 마그네슘 회전이 첨가된다. 교반이 시작되고 시스템은 2분간 불꽃 건조된다. 플라스크는 다음 질소 흐름하 실온에서 냉각되고 60 ml 에테르는 마그네슘을 커버하기위하여 유입된다. 140 ml 에테르내 48 ml (0.44 mol) 브로모부탄 용액은 균등 압력 가압 깔때기에 방치된다. 혼합물은 반응을 시작하도록 약하게 가열된다. 반응이 시작될 때, 에테르내 브로마이드 용액은 약한 역류를 유지하기에 충분한 속도에서 한방울씩 첨가된다. 첨가가 완료된후, 펀넬은 10 ml 에테르로 세척된다. 회색 용액은 20분간 진탕되고 배관을 통하여 건조된 플라스크로 옮겨진다. 그리그나드 시약은 다음의 표시제로서 1,10-페난트롤린을 사용하는 벤젠내 이소프로파놀 용액으로 적정된다: 마개가 하나이고 둥근 바닥인 건조된 10 ml 플라스크는 1 ml 그리그나드 시약, 드라이 THF 몇 방울 및 1,10-페난트롤린 결정으로 채워진다. 약한 분홍 용액은 드라이 벤젠내 이소프로파놀 0.5 M 용액으로 적정된다. 맑은 무색의 용액 (3 적정)이 되도록 3.8∼4.2 ml을 얻는다. 1.90-2.00 M의 그리그나드 시약 용액을 얻는다.
1.2 부틸 보론산
18
의 제조
마그네틱 교반봉 및 온도계가 장치된 마개가 3개이고 둥근 바닥의 1-L 플라스크에 20 ml(176 mmol) 트리메틸보레이트 다음으로 480 ml 에테르가 첨가된다. 맑은 용액은 -75℃ (내부 온도)로 냉각되고 격렬하게 진탕되고, 에테르내 1.95 M 용액의 부틸마그네슘 브로마이드 90ml (176 mmol)은 내부 온도가 -65℃를 넘지 않는 속도에서 배관을 통하여 한방울씩 첨가된다. 첨가 완료후, 결과 흰색의 슬러리는 질소하 75℃에서 2시간동안 진탕된다. 냉각조는 다음 제거되고 반응 혼합물은 실온에서 데워진다(1 및 2 시간 소요). 염산 10% 수용액 200 ml를 한방울씩 첨가하여 가수분해한다. 흰색 침전물은 용해되고 결과 맑은 이상성 혼합물은 15분간 진탕되고, 진탕후, 두 개의 층이 분리된다. 수용액 층은 에테르 (2 x 100 ml)로 추출되고, 결합된 추출물은 마그네슘 황산염에서 건조된다. 감압하 에테르화 용액의 농축후, 잔여 흰색 고체는 다음의 재결정화로서 정제된다: 온수 (50 ml)에서 용해후, 결과 이상성 용액은 보론산을 재결정화하도록 0℃로 냉각시킨다. 고체는 배지 용융 디스크 깔때기상에 수집되고 100 ml 헥산으로 세척되고 60분간 가압하에 방치한다. 13.6 g 양의 보론산 18은 흰색 고체로 생산되었다.
수율: 74.88%
m.p = 94-96℃ (lit. m.p. = 95-97℃) (Charette, A.B.; Juteau, H.; Lebel, H.; and Molinaro C.J.Am. Chem. Soc. 1998, 120, 11943-11952)
특징: Nmr (1H)
1.3 〔(2-)-N,O,O'〔2,2'-이미노비스〔에탄올라토〕〕〕-2-부틸 보론
19
의 제조
질소하, 마그네틱 교반봉 및 온도계가 장치된 마개가 하나이고 둥근 바닥의 1-L 플라스크는 13.6 g (133 mmol) 부틸 보론산 및 14.0 g (134 mmol) 디에탄올아민으로 채워진다. 약 27 g의 분자체 3Å(분말, 250℃에서 밤새 건조시킴) 다음으로, 133 ml 디클로로메탄 및 265 ml 에테르가 첨가된다. 결과 불균일 용액은 질소하 1일동안 진탕된다. 고체는 다음 디클로로메탄 (2 x 100 ml)으로 분쇄된다. 여과액은 원하는 혼합물을 생산하기 위하여 감압하에서 농축된다. 디에탄올아민 혼합물은 다음의 재결정화로서 정제된다: 흰색 고체는 고온의 디클로로메탄 (40 ml)에 용해되고, 에테르 (100 ml)는 혼합물을 결정화하기 위하여 첨가된다. 혼합물은 0℃로 냉각되고 고체는 배지 용융 디스크 깔때기상에 수집되고 에테르 (2 x 60 ml)로 세척된다. 산물은 흰색 결정 고체로서 18.31 g의 상기 화합물 19를 얻기 위하여 진공에서 건조된다.
수율: 80%
m.p = 143-145℃ (lit. m.p. = 145-148℃) (Charette, A.B.; Juteau, H.; Lebel, H.; and Molinaro C.J.Am. Chem. Soc. 1998, 120, 11943-11952)
특징: Nmr (1H)
1.4 (R,R)-(+)_N,N,N,'N,'-테트라메틸 타르타르산 디아미드
16
의 제조
250 ml 엘런마이어 플라스크내 68 g (381 mmol) 디메틸 타트레이트 및 77 g 메탄올 스펙트로그레이드 혼합물내로 적어도 100 ml의 액체, 무수물의, 냉 (-78℃) 디메틸아민(-78℃에서 디메틸아민 가스의 농축으로 얻어짐)을 넣는다. 혼합물은 회전 혼합되고 건조 튜브로 3일동안 후드에 방치된다. 결정화후, 결정 덩어리는 흡입 여과로서 수집된다. 여과액은 2번째 수확물을 얻기 위하여 농축되고, 시드되고 냉각된다. 결합된 결정은 냉 메탄올(-30℃)로세척되고 압력하 건조된다. 얻어진 디아미드 16은 다음 단계에서 사용되도록 충분히 순수하였다.
수율: 90%
m.p = 188-189℃ (lit.189-190℃) (Seebach, D.; Kalinowski, H.-O.; langer, W.; Wilka, E.-M. Organic Synthesis; Wiley: New York, 1990; Coll. Vol. VII, pp 41-50)
특징: Nmr (1H)
1.5 (4R-트랜스)-2-부틸-N,N,N,'N,'-테트라메틸〔1,3,2〕디옥사-보롤란 〔4,5〕디카르복스아미드
20
의 제조
질소하, 마그네틱 교반봉 및 온도계가 장치된 마개가 하나이고 둥근 바닥의 500 mL 플라스크는 7.00 g (40.9 mmol) 부틸보로네이트 디에탄올아민 19 화합물 및 11 g (53.8 mmol) (R,R)-(+)_N,N,N,'N,'-테트라메틸 타르타르산 디아미드 16으로 채워진다. 고체는 205 ml 디클로로메탄을 첨가하여 용해시키고, 다음 64 ml 소금물을 첨가하고 결과 이상성 용액은 질소하 2시간 45분동안 진탕된다. 두 개의 층은 분리되고 수용액 층은 디클로로메탄 (50ml)으로 추출된다. 결합된 유기층은 소금물(50ml)으로 세척되고, MgSO4상에서 건조되고 여과된다. 여과액은 연황색 오일로서 10.2 g의 상기 화합물 20를 얻기 위하여 감압 및 건조 진공하에서 농축된다.
수율: 92% (lit. 93%) (Charette, A.B.; Juteau, H.; Lebel, H.; and Molinaro C.J.Am. Chem. Soc. 1998, 120, 11943-11952)
특징: Nmr (1H, 13C), ir, ms)
2. (1R,2S)-2-에틸사이클로프로필아세트산
22
의 제조
2.1 (1R,2S)-2-에틸사이클로프로필에탄올
21
의 제조
질소하, 마그네틱 교반봉 및 온도계가 장치된 마개가 셋이고 둥근 바닥의 250 mL 플라스크는 45 ml 드라이 CH2Cl2 및 4.6 ml(45 mmol, 45 eq.)의 드라이 DME로 채워진다. 용액은 아세톤/아이스조로서 -10℃(내부 온도)로 냉각되고 4.6 ml(45 mmol, 45 eq.)의 Et2Zn이 첨가된다. 상기 진탕된 용액에 내부온도가 -8℃∼-12℃를 유지시키면서 1시간동안 7.2 ml(90 mmol, 9 eq.)의 CH2I2를 첨가한다. 첨가후, 결과 용액은 10℃에서 10분간 진탕된다. 10 ml CH2Cl2내 3.36 g (10.8 mmol, 1.22 eq)의 디옥사볼란 리간드 20용액은 내부 온도를 -5℃이하로 유지하면서 5-6 분 주기로 질소하에서 배관을 통하여 첨가된다. 10 ml CH2Cl2내 1.00 g (10 mmol)시스-3-헥센-1-o1 용액은 내부 온도를 -5℃이하로 유지하면서 5-6 분 주기로 질소하에서 즉시로 배관을 통하여 첨가된다. 냉각조는 제거되고 반응 혼합물은 실온에서 데워지고 상기 온도에서 밤새 진탕된다.
반응은 포화 수용성 NH4Cl (10 ml) 및 10% 수용성 HCl (40 ml)로서 식힌다. 두 개의 층은 분리되고 수용액 층은 CH2Cl2 (50ml)로 세척된다. 결합된 유기층은 엘런마이어 플라스크로 옮겨지고 5 M 수용성 KOH (200 ml)가 첨가된다. 결과 이상성 용액은 밤새 격렬하게 진탕된다.
두 개의 층은 분리되고 유기층은 포화 수용성 NH4Cl (3 x 50 ml) 및 소금물(10ml)으로 세척되고, MgSO4상에서 건조되고 여과되고 그리고 감압하 농축된다. 잔유물은 원하는 사이클로프로판 유도체 21(0.9 g)을 얻기 위하여 쿠겔로르 증류(150-160℃)에 따르는 플래시 크로마토그라피 (AcOEt/hexanes 2/8)로서 정제된다.
Rf=0,33 (AcOEt/hexanes 2/8)
수율: 79%
［α］D = +15.6o(c=1.66, CHCl3)
특징: Nmr (1H, 13C), ir, ms
2.2 (1R,2S)-2-에틸사이클로프로필아세트산
22
의 제조
질소하, 마그네틱 교반봉 및 온도계가 장치된 마개가 하나인 둥근 바닥의 250 mL 플라스크는 1.65 g (14.3 mmol) 알코올 21 및 40 ml의 드라이 DMF로 채워진다. 피리디늄 디크로메이트 18.8 g(3.5 eq.; 50.1 mmol)는 하나의 포션에 첨가된다. 반응 혼합물은 25℃에서 밤새 진탕되고 200 ml의 물에 부어 넣고 에테르 (4 x 80 ml)로서 추출된다. 유기층은 감압하에서 농축되고, 잔유물은 클로로포름 (50ml)에 용해되고 10% 수용성 NaOH (2 x 25 ml)로 추출된다. 결합된 수용성 층은 10% 수용성 HCl로 산성화한후 25 ml 클로로포름으로 2번 세척된다. 에테르(4 x 50 ml)로 추출하고, MgSO4상에서의 건조하고, 여과하고 그리고 감압하 농축함으로서 무색 오일 (737 mg)의 원하는 화합물(1R,2S)-2-에틸사이클로프로필아세트산
22 를 얻는다.
수율: 39.7%
［α］D = +7.7o(c=3.5, CHCl3)
특징: Nmr (1H, 13C), ir, ms
3. (1R,2S)-2-에틸사이클로프로필아세트산
24
의 제조
3.1 (1R,2S)-2-에틸사이클로프로필에탄올
23
의 제조
질소하, 마그네틱 교반봉 및 온도계가 장치된 마개가 셋이고 둥근 바닥의 250 mL 플라스크는 45 ml 드라이 CH2Cl2 및 4.67 ml(45 mmol, 45 eq.)의 드라이 DME로 채워진다. 용액은 아세톤/아이스조로서 -10℃(내부 온도)로 냉각되고 4.6 ml(45 mmol, 45 eq.)의 Et2Zn이 첨가된다. 상기 진탕된 용액에 내부온도가 -8℃∼-12℃를 유지시키면서 1시간동안 7.2 ml(90 mmol, 9 eq.)의 CH2I2를 첨가한다. 첨가후, 결과 용액은 10℃에서 10분간 진탕된다. 10 ml CH2Cl2내 3.36 g (10.8 mmol, 1.2 eq)의 디옥사볼란 리간드 20용액은 내부 온도를 -5℃이하로 유지하면서 5-6 분 주기로 질소하에서 배관을 통하여 첨가된다. 10 ml CH2Cl2내 1.00 g (10 mmol) 트랜스-3-헥센-1-o1 용액은 내부 온도를 -5℃이하로 유지하면서 5-6 분 주기로 질소하에서 즉시로 배관을 통하여 첨가된다. 냉각조는 제거되고 반응 혼합물은 실온에서 데워지고 상기 온도에서 밤새 진탕된다.
반응은 포화 수용성 NH4Cl (10 ml) 및 10% 수용성 HCl (40 ml)로서 식힌다. 두 개의 층은 분리되고 수용액 층은 CH2Cl2 (50ml)로 세척된다. 결합된 유기층은 엘런마이어 플라스크로 옮겨지고 5 M 수용성 KOH (200 ml)가 첨가된다. 결과 이상성 용액은 밤새 격렬하게 진탕된다.
두 개의 층은 분리되고 유기층은 포화 수용성 NH4Cl (3 x 50 ml) 및 소금물(10ml)으로 세척되고, MgSO4상에서 건조되고 여과되고 그리고 감압하 농축된다. 잔유물은 원하는 사이클로프로판 유도체 23(1.06 g)을 얻기 위하여 쿠겔로르 증류(150-162℃)에 따르는 플래시 크로마토그라피 (AcOEt/hexanes 2/8)로서 정제된다.
Rf=0,33 (AcOEt/hexanes 2/8)
수율: 93%
［α］D = +6.22o(c=2.25, CHCl3) (lit ［α］D = + 9.6o(c=2.25, CHCl3)
(Charette, A. B.; Juteau, H.; Lebel, H,; and Molinaro C.J. Am. Chem.
Soc. 1998, 120, 11943-11952)
특징: Nmr (1H, 13C), ir, ms
3.2 (1R,2S)-2-에틸사이클로프로필아세트산
24
의 제조
질소하, 마그네틱 교반봉 및 온도계가 장치된 마개가 하나인 둥근 바닥의 250 mL 플라스크는 1.7 g (14.9 mmol) 알코올 23 및 40 ml의 드라이 DMF로 채워진다. 피리디늄 디크로메이트 19.6 g(3.5 eq.; 52.1 mmol)는 하나의 포션에 첨가된다. 반응 혼합물은 25℃에서 밤새 진탕되고 200 ml의 물에 부어 넣고 에테르 (4 x 80 ml)로서 추출된다. 유기층은 감압하에서 농축되고, 잔유물은 클로로포름 (50ml)에 용해되고 10% 수용성 NaOH (2 x 25 ml)로 추출된다. 결합된 수용성 층은 10% 수용성 HCl로 산성화한후 25 ml 클로로포름으로 2번 세척된다. 에테르(4 x 50 ml)로 추출하고, MgSO4상에서의 건조하고, 여과하고 그리고 감압하 농축함으로서 무색 오일(1.05 g)의 원하는 화합물(1R,2S)-2-에틸사이클로프로필아세트산
24 를 얻는다.
수율: 55.5%
［α］D = +4.36o(c=1.83, CHCl3)
특징: Nmr (1H, 13C), ir, ms
실시예 VIII
(1S,3R) 및 (1R,3R)-3-메틸사이클로펜틸아세트산(
27
)의 (1:1) 혼합물의합성
(1S,3R) 및 (1R,3R)-3-메틸사이클로펜틸아세트산(23)의 (1:1) 혼합물은 스킴 5의 아웃라인에 따라서 합성된다. (R)(+)-3-메틸 사이클로펜타논 및 트리에틸 포스포노아세테이트를 농축하는 위티그-호너 (Duraiosamy, M. and Walborsky H. M. J. Am. Chem. Soc. 1983, 105, 3252-3264)반응은 에틸(E 및 Z,3R)-(3-메틸 사이클로펜틸리덴) 카르복실레이트 25의 (1:1) 혼합물은 얻는다. 양방향 조절없이 진행된 α,β-불포화 에스테르 25 의 수소 첨가 및 에스테르 26 의 (1:1) 혼합물은 양적 수율로 얻어진다. 알코올성 KOH를 가진 에스테르 26의 가수분해는 92% 수율의 원하는 (1S,3R) 및 (1R,3R)-3-메틸사이클로펜틸아세트산 (27)의 (1:1) 혼합물을 얻는다.
(1S,3R) 및 (1R,3R)-3-메틸사이클로펜틸아세트산(
27
)의 (1:1) 혼합물의제조
1. α,β-불포화 에스테르
25
의 제조
마그네틱 교반봉이 장치된 마개가 하나인 둥근 바닥의 100 mL 플라스크에 미네랄 오일에서의 분산제로서 611 mg (15.8 mmol)의 60% 수소화나트륨이 첨가된다. 오일은 펜탄으로 2번 세척하여 제거한다. 드라이 THF (21 ml)가 첨가되고 현탁액은 질소 대기하에 방치된다. 냉각조에서 플라스크를 0℃로 냉각한후, 3.43 g (15.2 mmol)의 트리에틸 포스포노아세테이트를 천천히 첨가한다. 진탕은 35분간 계속되고, R-(+)-3-메틸사이클로펜타논 (1.51 g; 15.2 mmol)이 첨가되고, 온도는 추가 시간동안 실온으로 유지되고, 젤라틴의 침전물이 생성된다. 반응을 식히기 위하여 에테르 (100 ml) 및 물 (50 ml)이 첨가된다. 혼합물은 분리 깔때기로 옮겨지고 물로 2번, 다음 소금으로 세척한다. 유기 용액은 MgSO4상에서 건조되고 여과되고 그리고 감압하 농축된다. 잔유물은 맑고 무색의 오일로서 원하는 산물 25 2.4 g (96%)을 얻기 위하여 플래시 크로마토그라피 (AcOEt/hexanes 9/1)로서 정제된다.
Rf=0,53 (AcOEt/hexanes 9/1)
특징: Nmr (1H, 13C), ir, ms
2. 에스테르
26
의 제조
무수 에탄올 (68 ml)내 α,β-불포화 에스테르
25 (1.3 g; 7.7 mmol)의 진탕된 용액에 탄소상 10% 팔라듐 163 mg 이 첨가된다. 혼합물은 수소 대기하에서 밤새 진탕된다. 촉매는 실라이트 패드 여과로서 제거된다. 여과액은 농축되고 잔유물, 에스테르 26 , 무색 오일은 다음 단계를 위하여 정제하지 않고 사용된다.
수율: (1.2 g) 92%
특징: Nmr (1H, 13C), ir, ms
3. (1S,3R) 및 (1R,3R)-3-메틸사이클로펜틸아세트산(
27
)의 (1:1) 혼합물의 제조
에탄올 (50 ml)내 에스테르 26 (1.20g; 7.05 mmol)에 수산화칼륨 의 10% 수용액 15 ml가 첨가된다. 반응 혼합물은 5시간동안 역류하에서 진탕된다. 에탄올은 진공에서 증발되고 잔유물은 에테르 (20ml)로서 추출된다. 수용상은 10% 수용성 HCl로서 산성화되고 에테르 (3 x 50 ml)로서 추출된다. 결합된 유기상은 92% 수율의 무색의 오일 (920 mg)로서 (1S,3R) 및 (1R,3R)-3-메틸사이클로펜틸아세트산 27 의 (1:1) 혼합물을 얻기 위하여 MgSO4상에서 건조되고 여과되고 그리고 감압하 농축된다.
특징: Nmr (1H, 13C), ir, ms
실시예 IX
바이사이클로［4.1.0］헵틸아세트산(
31
)의 합성
화합물 31은 스킴 6의 아웃라인에 따라서 4 단계에서 제조된다. 트리에틸 포스포노아세테이트 (NaH, THF)로 사이클로헥사논에 위티그-호너 공정(Duraiosamy, M. and Walborsky H. M. J. Am. Chem. Soc. 1983, 105, 3252-3264)을 적용하여 88% 수율의 α,β-불포화 에스테르 28 을 얻는다. 원하는 β,γ-불포화 에스테르 29 는 -78℃에서 포화된 수용성 NH4Cl로 확산된 에놀레이트 (LDA, THF)의 흐름을 물리적으로 제지함으로서 α,β-불포화 에스테르 28 로부터 제조될 수 있다. 0℃에서 디클로로메탄내 디에틸징크/클로로요도메탄을 사이클로프로판화(Scott E. Denmark and James P. Edwards J. Org. Chem. 1991, 56, 6974-6981)하여 91.5% 수율의 사이클로프로필 30이 생산된다. 연속적으로 산성화한후 KOH/EtOH내 에스테르 30을 사포닌화하여 92% 수율의 31(Kantoroki, E.J.; Eisenberg, S.W. E.; Fink, W.H.; and Kurth, M.J. J. Org. Chem. 1999, 64, 570-580)을 얻는다.
바이사이클로［4.1.0］헵틸아세트산(
31
)의 제조
1. α,β-불포화 에스테르
28
의 제조
마그네틱 교반봉이 장치된 마개가 하나인 둥근 바닥의 200 mL 플라스크에 미네랄 오일에서의 분산제로서 1.22 g (30.5 mmol)의 60% 수소화나트륨이 첨가된다. 오일은 펜탄으로 두 번 세척하여 제거된다. 드라이 THF (50 ml)가 첨가되고 현탁액은 질소 대기하에 방치된다. 냉각조에서 플라스크를 0℃로 냉각한후, 3.43 g (15.2 mmol)의 트리에틸 포스포노아세테이트를 천천히 첨가한다. 진탕은 30분간 계속되고, 사이클로헥사논 (3.00 g; 30.5 mmol)이 첨가되고, 반응 혼합물은 추가 시간동안 실온으로 유지되고, 젤라틴의 침전물이 생성된다. 반응을 식히기 위하여 에테르 (50 ml) 및 물 (50 ml)이 첨가된다. 혼합물은 분리 깔때기로 옮겨지고 물로 2번, 다음 소금물로 세척한다. 유기 용액은 MgSO4상에서 건조되고 여과되고 그리고 감압하 농축된다. 잔유물은 맑고 무색의 오일로서 원하는 산물 28 4.52 g (88%)을 얻기 위하여 플래시 크로마토그라피 (hexane/AcOEt 9.5/0.5)로서 정제된다.
Rf=0,56 (AcOEt/hexanes 9.5/0.5)
특징: Nmr (1H, 13C), ir, ms
2. β,γ-불포화 에스테르
29
의 제조
0℃로 유지된, 드라이 THF(90 ml)내 디이소프로필아민 (3.33 ml; 23.7 mmol)용액에 n-부틸리튬 (11.9 ml; 23.7 mmol)을 천천히 첨가한다. 용액은 20분간 진탕되고 다음 -78℃로 냉각된다. THF (9 ml)내 α,β-불포화 에스테르
28 (2.00 g, 11.9 mmol)은 10분동안 한방울씩 첨가되고 혼합물은 상기 온도에서 30분간 진탕되게 한다. 포화 수용성 NH4Cl (20 ml)은 10분 동안 한방울씩 첨가되고 식혀진 반응물은 물 (10 ml)에 붓기 전에 대기에서 데워지고 에테르 (3 x 50 ml)로 추출된다. 추출물은 건조되고(MgSO4), 여과되고 그리고 황색 오일로서 (4:1)β,γ-불포화 : α,β-불포화 에스테르 (nmr)의 혼합물을 얻기 위하여 농축된다. 맑고 무색의 오일로서 원하는 산물 29 1 g (50%)을 얻기 위하여 플래시 크로마토그라피 (AcOEt/hexanes 9.65/0.35)로서 정제된다.
Rf=0,44 (hexane/AcOEt 9.5/0.5)
특징: Nmr (1H, 13C), ir, ms
3. 사이클로프로필 에스테르
30
의 제조
100 ml, 마개가 하나인 플라스크의 드라이 디클로로메탄 (20ml)내 Et2Zn (1.27 ml; 11.0 mmol; 2 eq.)용액은 0℃로 냉각되고, ClCH2I (1.6 ml; 22 mmol; 4 eq.)용액은 주사기로 첨가된다. 용액은 5분간 0℃에서 진탕되고, 침전물이 형성되고, CH2Cl2 (8 ml)내 β,γ-불포화 에스테르 29 ( 924 mg, 5,49 mmol)용액은 배관을 통하여 첨가된다. 반응 혼합물은 0℃에서 60분간 진탕되고 NH4Cl (60 ml)의 포화 수용액으로 식혀진다. 용액은 상온에서 데워지고, 10분간 격렬하게 진탕되고, 에테르 (3 x 20 ml)로 추출된다. 추출물은 H2O (1 x 20 ml) 및 소금물 (1x 20 ml)로 세척되고, 결합되고, 건조되고(MgSO4), 감압하 농축된다. 맑고 무색의 액체로서 원하는 산물 30 915 mg (91.5%)을 얻기 위하여 플래시 크로마토그라피 (hexane/AcOEt 9.5/0.5)로서 정제된다.
Rf=0,44 (hexane/AcOEt 9.5/0.5)
특징: Nmr (1H, 13C), ir, ms
4. 바이클로〔4, 1, 0〕헵틸아세트산
31
의 제조
기본 에탄올 (27 ml 95% 에탄올내 2.09 g KOH)내 에스테르 30 은 밤새 실온에서 진탕된다. 반응은 에테르로 희석되고 NaOH (2 M, 2 x 50 ml)로 추출되고, 결합된 추출물은 수용성 10% HCl로 산성화되고, 에테르(3 x 40 ml)로 추출된다. 결합된 유기물은 건조되고(MgSO4), 여과되고 약한 황색 액체(467 mg; 92%)로서 원하는 산물 31 915 mg (91.5%)을 얻기 위하여 농축된다.
특징: Nmr (1H, 13C), ir, ms
실시예 X
(1S,3R)-3-메틸사이클로헥실아세트산［
36
)의 합성
마지막으로 (1S,3R)-3-메틸사이클로헥실아세트산［
36
)은 스킴 7에 묘사된 것과 같이 합성된다. 먼저, N(R)-(+)-3-메틸사이클로헥사논은 (3R,1R)-3-메틸사이클로헥사놀 32 으로 부라운 방법(Brown, H.C.; Jadhav, P.K. In "Asymmetric Synthesis " Morrison, J.D. Ed.; Academic Press: New york, 1983; Vol. Il, Chapter 1; Brown H. C.; Desai, M.C.; Jadhav, P.K. J. Org. Chem. 1982, 47, 5065-5069)에 따라서 75% 수율로 감소되었다.
시각적으로 활성인 32 는 메실화되고 31% 수율의 원하는 디에스테르 34 를 얻기 위하여 80-90℃에서 드라이 DMF내 디메틸 말로네이트의 나트륨염과 반응된다. 알코올성 KOH로 디에스테르 34 를 가수분해하여 다소 극한 상황(2일간 역류하 디옥산/물 혼합물내 농축 H2SO4)하 탈카르복시로서 74.8% 수율에서 원하는 화합물 (1S,3R)-3-메틸사이클로헥실아세트산［
36
)을 얻는 이산 35 을 얻는다.
(1S,3R)-3-메틸사이클로헥실아세트산［
36
)의 제조
1. 알코올
32
의 제조
-78℃에서 드라이 THF (40 ml)내 R-(+)-3-메틸사이클로헥사논 (3.50 g; 31.1 mmol)의 진탕된 용액은 THF (63 ml; 63 mmol)내 L-실렉트리드 1,0 M과 반응된다. 상기 온도에서 2시간동안 진탕한후, 30% H2O2 23 ml 다음으로 2 M 수용성 수산화나트륨이 첨가된다. 실온에서 데워진후 반응 혼합물은 10% 수용성 HCl로 처리되고 산물은 에테르(3 x 80 ml)로 추출하여 분리된다. 추출물은 결합되고, 건조되고(MgSO4), 여과되고 진공하 농축된다. 잔유물은 맑고 무색의 오일로서 원하는 산물 32 2.70 g (75%)을 얻기 위하여 플래시 크로마토그라피 (hexane/AcOEt 8/2)로서 정제된다.
Rf=0,52 (hexane/AcOEt 8/2)
［a］D = -2.90 (c= 7.9 chloroform)
특징: Nmr (1H, 13C), ir, ms
2. 메실레이트
33
의 제조
드라이 디클로로메탄 (45 ml)내 (1R,3R)-(-)-3-메틸 사이클로헥사놀 32 (1.27 g; 11.1 mmol)의 진탕된 용액으로 Et3N (2.3 eq.; 25.7 mmol; 3.58 ml) 및 메탄술포닐 클로라이드 (1.2 eq; 13.4 mmol; 100 ml)를 0℃에서 한방울씩 첨가한다. 반응 혼합물은 1시간동안 0℃에서 진탕되고, 디클로로메탄 (80 ml) 및 10% HCl 50 ml로 희석된다. 수용성 상은 CH2Cl2(50 ml)로 추출된다. 결합된 유기층은 다음 단계용으로 정제하지 않고 사용되던 황색 오일로서 메실레이트 33 2.13 g을 얻기 위하여 NaHCO3 (1 x 20 ml) 및 소금물 (1 x 20 ml)로서 연속적으로 세척되고 MgSO4상에 건조되고, 여과되고 진공하 농축된다.
Rf=0,52 (hexane/AcOEt 8/2)
특징: Nmr (1H, 13C)
3. 디에스테르
34
의 제조
마그네틱 교반봉이 장치된 마개가 하나인 둥근 바닥의 200 mL 플라스크에 미네랄 오일에서의 분산제로서 3.5 eq; 39 mmol; 1.16 g의 60% 수소화나트륨이 첨가된다. 오일은 펜탄으로 두 번 세척하여 제거된다. 드라이 DMF (30 ml)가 첨가되고 현탁액은 질소 대기하에 방치된다. 냉각조에서 플라스크를 0℃로 냉각한후, 3.5 eq; 39 mmol; 5.16 g의 디메틸 말로네이트를 첨가한다. 진탕은 10분간 계속되고, DMF (58 ml)내 메실레이트 33 용액은 배관을 통하여 첨가된다. 혼합물은 진탕되고 3일간 80-90℃에서 가열된다. 다음 물(50 ml)이 첨가되고 혼합물은 분리 깔때기로 옮겨지고 에테르 (3 x 100 ml)로 추출된다. 유기 용액은 MgSO4상에서 건조되고 여과되고 그리고 감압하 농축된다. 잔유물은 맑고 무색의 오일로서 원하는 산물 34 800 g (31%)을 얻기 위하여 플래시 크로마토그라피 (hexane/AcOEt 8/2)로서 정제된다.
Rf=0,49 (hexane/AcOEt 8/2)
특징: Nmr 1H
4. 이산
35
의 제조
에탄올 53 ml 내 디에스테르 34 (800 mg; 3.50 mmol) 용액에 8 ml의 10% 수산화나트륨 수용액이 첨가된다. 혼합물은 5시간동안 역류로 가열되고, 밤새 진탕시킨다. 에탄올은 감압하에서 증발되고 잔유물은 물(10 ml)로 희석되고 에테르 (20 ml)로 추출된다. 수용성 상은 10% 수용성 HCl로서 산성화되고 에테르(3 x 30 ml)로서 추출된다. MgSO4상에 건조되고, 여과되고 진공하 농축된후, 다음 단계용으로 정제없이 사용되는 흰색 결정성 고체를 얻는다.
수율:(600 mg) 85.6%
특징: Nmr 1H(CD3OD)
5. (1S,3R)-3-메틸사이클로헥실아세트산［
36
)의 제조
이산 35 (800 mg; 4.00 mmol)에 15 ml의 디옥산, 5 ml의 물 및 2 ml 황산이 첨가된다. 혼합물은 3일동안 역류로 가열된다. 실온에서 냉각하고 에테르 (3 x 30 ml)로 추출한후, 결합된 유기상은 황색 오일로서 (1S,3R)-3-메틸사이클로헥실아세트산 ( 36 )을 얻기 위하여 MgSO4상에 건조되고, 여과되고 농축된다.
수율:(467 mg) 74.8%
특징: Nmr (1H, 13C), ir, ms
실시예 XI
소수성 GRF 아나로그의 형성
본 발명의 소수성 GRF 아나로그를 형성하기 위하여 GRF-펩티드로 X 부분의 결합은 상기에 기술한 것과 같이 GRF 또는 그의 아나로그중의 하나 의 N-말단 포션에서 하나 또는 여러개의 소수성 테일을 고정함으로서 화학적으로 합성된다.
더욱 상세하게, 화학적 고정 반응이 잘 되기 위하여, 산 형태하에서 소수성으로 기능화되는 것이 바람직하다. 이러한 조건에서, 고정 반응은 종래 기술(B. Castro et al., 1975, Tetrahedron letters, Vol. 14:1219)에서 알려진 벤조트리아졸-1-일록시트리스 (디메틸아민) 포스포늄 헥사플루오로포스페이트와 같은 극도의 활성 시약을 사용하는 고체상(Merrifield R.B., 1963, J.Am. Chem. Soc. 85:2149; 1964, J. Am. Chem. Soc. 86:304)에서 효율적이다.
소수성 테일이 고정되어 지는 것은 지방산에서 이루어지고, 고정 관점에서 원 위치에서 활성화된다. 사용된 합성에 따라서, 펩티드 고정 지역은 종래의 디프로텍션 조건(Gross et Meienhofer, 1981, The Peptides, vol. 3, Academic pressw: pages 1-341)에서 고정하기에 앞서 릴리스된다. 소수성 테일(Ht)은 에테르(테트라하이드로퓨란), 지방성 할로겐화 용매(디클로로메탄), 니트릴(아세토니트릴) 또는 아미드(N,N-디메틸포름아미드)와 같은 유기 용매에서 고정 시약으로 농축된다.
고정 동력에 있어서, 바람직한 온도는 20-60℃이다. 사용된 소수성 테일이 더욱더 소수성이 되는 고정 반응 시간은 온도에 따라, 그러나 0.1에서 24시간 사에에서 역으로 변화한다.
일반 GRF 아나로그 합성 단계는 밀리포어의 합성 사이클 및 Fmoc 방법을 사용하는 9050TM 플러스 펩티드 신시사이저(Millipore Corporation, Milford, MA)에서 고체상 방법론으로 수행된다. Fmoc 아미노산은 바켐 갤리포니아 및 다른 시판 경로로서 공급된다. BOP/HOBt 방법으로 결합하는 연속 Fmoc 화학은 C-말단 카르복스아미드의 생산용으로 Fmoc-Pal-PEG 수지(Nillipore, catalog number: GEN 913383)에 적용된다. Fmoc 디프로텍션은 DMF내 피페리딘 20%로서 수행된다. 합성후, 수지는 건조전에 DMF 및 에테르로서 세척된다. 그룹 및 펩티드-수지를 보호하는 측쇄는 TFA, 물, 페놀, 트리이소프로필실란(8:5:5:12)의 혼합물로 이루어지는 밀리포어 공급 과정을 사용하여 마지막으로 분할된다. 펩티드는 침전되고 건조하기 전에 세척된다. 염분 제거 단계(buffer C:0.1% TFA in H2O; buffer D:0.1% TFA in CH3CH/H2O 80:20)다음의 물 4000, 흡수도 214nm, 디텍터 모델 486, 유속 50ml/min; 105 min에서 25∼60%B의 선형 경사도를 사용하는 역 위상 HPLC 정제(buffer A: TEAP 2.5: buffer B: 80% CH3CN in A)는 HPLC(밀레늄 포토다이오드 어레이 디텍터)로서 측정한것과 같이 97% 이상의 동질성을 가진 10∼30% 수율의 펩티드를 얻는다.
상기 과정은 일반식 A의 7개의 새로운 GRF 아나로그를 합성하기 위하여 사용된다:
X ------GRF-peptide (A)
여기서 X는 실시예 VI, VII, VIII 및 IX에서 합성된 새로운 카르복실산 X-OH의 아실 포션이다.
실시예 XII
IGF-1 레벨상 hGRF(1-44)NH
2
아나로그의 효과
본 실시예의 목적은 성장 암퇘지에서 S.C. 만성 투여에 따르는 IGF-1 레벨상에서 TH 9507을 포함하는 8가지의 다른 hGRF(1-44)NH2 아나로그의 효과를 비교하기 위함이다.
동물 과정은 다음의 변형으로 1999년 4월 30일자로 제출된 프로토콜 GRF-30에 기술된 것과 같이 수행되었다: TH 9507을 포함하는 단지 8 GRF 아나로그만이 스폰서에의해 제공되었다. 따라서 30마리의 돼지에서 연구되었다.
실험실 과정은 다음과 같다: 미국 텍사스, 진단 시스템 레보레이토리 인코퍼레이티드에서 판매하는 시판 키트(DSL-5600)를 사용하여 돼지 혈청에서 IGF-1 레벨을 측정하였다. IGF-1 레벨은 산-에탄올 추출후 2-지역 임뮤노레디오메트릭 분석(two-site immunoradiometric assay; IRMA)을 사용하여 정성화되었다.
통계적 분석: IGF-1 데이터는 변화요인으로서 시간(1,3일 또는 6일) 및 처리(A∼J)으로서 투-웨이 반복 측정 분석을 하였고 양방향 다중 비교는 스튜던트-뉴만-코일 방식(Student-Newman-Keuls method)으로서 하였다. 모든 통계적 과정은 컴퓨터화된 시그마스탯 소프트웨어(Jandel Scientific)를 사용하여 수행되었다. P〈0.05가 통계적으로 확실하게 나타났다.
도 7에서 보여지듯이, 식염수 또는 hGRF(1-44)NH2으로 처리한 동물은 연구 기간에서 IGF-1 농도에 어떠한 특별한 변화도 없었다. 이는 돼지에서 피하로 하루에 두 번 10μg/kg로 주사되었을 때 IGF-1 레벨에서 어떠한 증가도 유도하지 않는다는 것을 확인한다.
모든 시험된 아나로그(TH 9507 및 아나로그 1∼7)는 1일의 기본 레벨과 비교할 때, 6일에서 돼지의 IGF-1 레벨이 확실히 증가하였다. 3일에서는 단지 3 및 6 IGF-1 레벨이 확실히 증가되었다. 통계적 분석으로부터 아나로그 사이의 어떠한 특별한 차이도 없었으나, 아나로그 6은 TH 9507 처리 그룹 각각에서 5일간의 주사후(190.1 ±210.0 ng/ml 및 279.1 ±28.4 ng/ml과 비교하였을 때) IGF-1 레벨이 358.3 ±17.1 ng/ml으로 상승되는, 매우 강한 IGF-1 유도 효능을 나타냈다.
이러한 결과는 본 발명에서 시험된 모든 7개의 새로운 hGRF(1-44)NH2 아나로그는 천연 GRF 분자보다 더욱 효능이 있다는 것을 나타낸다. 이는 hGRF(1-44)NH2의 N-말단 포션상의 지방성 체인의 부착은 이의 GH-릴리싱 효능을 성공적으로 증가한다는 것을 암시한다.
발명의 배경
a) 발명의 분야
본 발명은 신진대사 제제 및 성장 호르몬 결핍의 치료에 적용되는, 생물학적 효능이 증가되고 활성이 연장된 소수성 GRF(성장 호르몬 릴리스 인자, Growth hormone Release Factor) 아나로그에 관한 것이다.
b) 종래 기술의 설명
뇌하수체에서 분비되는 성장 호르몬(GH) 또는 소마토트로핀은 어린 생물의 성장뿐아니라 성인 상태에서 통합성을 유지하기 위하여 기본적인 호르몬계를 조성한다. GH는 성장 인자(인슐린 유사 인자-I 또는 IGF-1) 또는 그의 수용체(표피성장인자 또는 EGF)의 합성을 촉진하여 말초 기관에 직접 간접으로 작용한다. GH의 직접 작용은 항인슐린으로 일컫는 타입이고, 지방성 조직의 레벨에서 지방을 분해한다. IGF-I(소마토트로핀 C)합성 및 분비에서의 작용을 통하여, GH는 연골 및 골격의 성장(구조적 성장), 단백질 합성 및 근육 및 피부를 포함한 많은 말초 기관에서의 세포 증식을 촉진한다. 생물학적 작용으로 GH는 성인에서 단백질 동화작용 상태를 유지하고, 외상후의 조직 재생에 초기 역할을 한다.
인체 및 동물에서 보여지는, 나이로 인한 GH 분비의 감소는 생물체의 노화에서 시작하는 이화작용으로 대사를 전환한다. 노년에서 관찰되는 근육 손실, 지방 조직의 축적, 골격의 미네랄 손실, 외상후의 조직 재생 능력의 감소는 GH 분비의 감소와 상관한다.
GH는 어린이의 성장에 절대적으로 필수적이며 성인에서 단백질 대사를 조절하는 생리학적 신진대사 제제이다.
뇌하수체의 GH 분비는 두 개의 사상하부 펩티드, 소마토트로핀 및 성장 호르몬 릴리스 인자(growth hormone releasing factor, GRF)에 의해 조절된다. 소마토트로핀은 GH의 분비를 억제하나 GRF는 촉진한다.
인체 GH는 약 10년동안 유전 공학에 의하여 생산되었다. 근래까지 대부분의 GH는 어린이의 성장 지연에 연계되었으며 현재 성인에서의 GH가 연구되고 있다. GH 및 GRF의 약학적 용도는 하기 세 개의 주요 카테고리에서 분류된다.
어린이 성장
재조합 인체 성장 호르몬으로의 치료는 뇌하수체 소인증, 신장 기능 부전, 터널 증후군 및 단신의 어린이에서 성장을 촉진하는 것으로 나타난다. 재조합 인체 GH는 GH 결핍에 의한 어린이 성장 지연 및 어린이의 신장 기능 부전용으로 유럽 및 미국에서 오르판 드럭(ORPHAN DRUG)으로서 상용화되어 있다. 다른 용도는 임상 시험중에 있다.
성인 및 장년 환자를 위한 장기 치료
GH 분비의 감소는 노화동안 인체 조성을 변화한다. 재조합 인체 GH로서의 1년간의 연구에서 다수의 장년 환자의 근육체 및 피부 두께가 증가하고 골격 밀도에서 약간 증가된 지방체가 감소된 골다공증에 있어서, 재조합 인체 GH는 골격의 광화작용을 증가하지는 않으나 폐경기후의 여성에서 골격 미네랄의 감소를 예방할 수 있는 것으로 보인다. 이러한 이론을 입증하는 연구가 진행중이다.
성인 및 장년 환자를 위한 단기 치료
예비 임상 및 임상 연구에서, 성장 호르몬은 상처의 단백질 동화작용 및 화상, AIDS 및 암의 골격 치유를 촉진하는 것으로 나타났다.
GH 및 GRF는 또한 수의 약학용으로도 시도되고 있다. GH 및 GRF는 돼지에서 지방 조직대신에 근육 조직이 축적됨으로서 지방화 기간동안 성장을 촉진하고 소에서 우유 생산을 증가하며, 이러한 것은 동물의 건강에 해로운 어떠한 부작용도 없고 육류 또는 우유에 어떠한 잔유물도 생산되지 않는다. 소의 소마토트로핀(BST)은 미국에서 현제 시판되고 있다.
현재 대부분은 재조합 GH의 연구가 진행중이다. GRF는 조만간에 대부분에서 GH 사용을 대체할 제 2 세대 산물로서 간주된다. 따라서, GRF의 사용은 GH 사용보다 수많은 이점이 있다.
생리학적 이점
성장 호르몬은 맥박에 따라 뇌하수체에서 분비된다. 이러한 분비의 리듬은 최적의 생물학적 활성에 중대하기 때문에, 분비의 자연 모드에 대응하도록 GH를 투여하기 어렵다. GRF가 지연 릴리스 제제 또는 용해제로서 계속적으로 투여될 때, GRF는 박동하는 동안 GH 분비를 증가한다.
GRF가 더 넓은 범위의 생물학적 활성의 GH의 모든 화학적 이성체의 뇌하수체로부터의 합성 및 분비를 유도하는 반면 현재 시판되는 재조합 GH는 22 kDa 형태이다.
GH로서의 치료는 내성의 성장 호르몬을 분비하기 위하여 뇌하수체의 효능이 감소하며, GRF에 대한 GH 응답은 상기 치료후 감소된다. 반대로, GRF로의 치료는 이러한 불이익이 없으며, 뇌하수체에서의 영양 작용은 정상 동물 및 소마토트로프 결핍 환자에서 놔하수체 분비능을 증가시킨다.
경제적 이점
유전 공학에 의한 GH 생산은 임상적으로 사용하기에 너무 비싸다. 상세하게는, 사용된 미생물 균주로부터의 물질을 가진 이러한 시판 제제의 오염의 위험이 있다. 이러한 미생물 오염은 발열 물질일수도 있고, 환자에서 면역 유전적 작용을 야기할 수도 있다. 재조합 산물의 정제는 다음의 연속 크로마토그라피 단계로서 수행된다. 규제 제제에 의한 정제 범위를 확실하게 하기 위하여 여러번의 퀄리티 콘트롤 단계를 필요로 한다.
반면에, GRF 합성은 화학적 본질이다. 합성은 고체상에서 수행되고 정제화는 고실행 액체 크로마토그라피(HPLC: High Performance Liquid Chromatography)를 사용하여 단일 단계에서 이루어 진다. 또한 투여되어 지는 GRF의 양은 동일한 생물학적 결과용 GH의 양보다 훨씬 적다.
모든 상기 이점에도 불구하고, GRF는 그의 불안정성 때문에, 현재까지 치료 제제로서 시판되지 않고 있다. 인체 GRF는 아래 시퀀스의 44 아미노산의 펩티드이다:
최소 활성 코어는 hGRF (1-29)NH2이다.
많은 펩티드에서, hGRF (1-29)NH2는 혈청 배지에서 급격히 퇴화되고 그의 대사 산물은 잔여 생물학적 활성이 없다. 혈액 배지내의 효소, 디펩티딜아미노펩티다제 타입 IV의 작용은 펩티드 본드 GRF의 Ala2-Asp3의 가수분해를 일으킨다. 이러한 가수분해는 문헌에서 보고된 많은 연구의 주제였던 많은 부정적인 결과를 초래한다. 필수적으로, 이러한 가수분해는 생물학적 활성이 1/1000보다 적게 감소된 특수 활성의 잘려진 펩티드를 형성하게 한다.
천연 hGRF (1-44)NH2 또는 활성 단편 hGRF (1-29)NH2는 재조합 GH에 대응하는 효능을 생산하기에 충분치 못하다는 것이 어린이 및 성인의 임상 연구에서 확인되었다.
펩티드 시퀀스의 C-말단에서 -NEt2와 같은 소수성 그룹의 고정은 특수 활성이 확실히 증가된다. 소수성에서, 원하는 생물학적 활성을 가지는 작은 펩티드 아나로그를 창조하기 위하여 N-말단에서 소수성 그룹으로서 라우로일 그룹의 무효과를 강조한 무라니치(S. Muranichi et al., 1991, Pharm. Res., 8:649-652)등과 같은 근래의 업적에 모순된다. 반면에, 종래 기술의 연구에서는 소수성 잔유물을 사용하는 더욱 효능있는 GRF 아나로그를 발견하는데 실패했다.
가우드류 등(P. Gaudreau et al., 1992, J. Med. Chem., 35(10),:1864-1869)은 쥐의 뇌하수체 수용체로서 아세틸-, 6-아미노헥사노일-, 및 8-아미노옥타노일-GRF (1-29)NH2의 친화력을 기술하였다. 상기 보고에서, 어느 시험된 지방산-GRF 화합물도 hGRF (1-29)NH2보다 더 높은 친화력을 보이지 않았고, 저자는 "hGRF (1-29)NH2의 N-말단에서 소수 특성을 증가하기 위한 변형은 수용체 vclsghkfur을 증가하기 위한 적절한 접근이 아니다"라고 결론하였다.
코이 등(D.H. Cow et al., 1987, J. Med. Chem., 30:219-222)은 쥐 모델, 더욱 상세하게 소디움 페노바비탈로 마취시킨 쥐에서 증가된 생물학적 활성을 가진 아세틸-GRF 펩티드를 기술하였다. 배양된 쥐 뇌하수체 세포에 의한 시험관내 GH 응답 또한 분석되었다. 그러나 상기 저자들은 GRF의 N-말단 지역에 첨가된 2개의 탄소 원자(아세틸 그룹)보다 긴 탄소 체인을 가진 지방산-GRF 아나로그는 합성하지도 시험하지도 않았으며 아세틸은 소수성 그룹으로 간주되지 못하였다.
현재까지, 기술된(가우드류 등 및 코이등을 포함하여) 대부분의 GRF 아나로그는 생체내, 시험관내 쥐 모델에서 시험되었다. 인체 및 쥐 GRF (1-29)NH2는 현저하게 틀리므로, GRF의 구조-활성 관계는 두종에서 서로 다르다. 그러므로, 쥐에서 얻어진 결과를 인체에 추정할 수 없다.
따라서, 개선된 신진대사 효능 및 연장된 활성을 가지는 GRF 아나로그를 설계하는 것이 필요하다. 이러한 증가된 효능은 혈청 퇴화에의 저항력 및/또는 높은 작용의 능력으로부터의 결과일 수 있다.
증가된 신진대사 효능을 가진 GRF 아나로그를 제공하는 것이 매우 바람직하다.
발명의 요약
본 발명의 첫 번째 목적은 개선된 생물학적 효능 및 연장된 활성을 가지는 새로운 미생물 분해 GRF 아나로그를 제공하는 것이다.
본 발명의 두 번째 목적은 인체 및 동물내에 만성적으로 투여될 때 인슐린 유사 성장 인자 I (IGF-I) 레벨을 실제적으로 상승시킬 수 있는, 증가된 신진대사 효능 및 연장된 활성을 가지는 GRF 아나로그를 제공하는 것이다.
본 발명의 세 번째 목적은 GRF 아나로그를 더욱 생물학적으로 효율적으로 그리고 연장된 활성을 가지게 하는 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 네 번째 목적은 개선된 생물학적 효능 및 연장된 활성을 가지는 활성 GRF 아나로그를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 소수성 GRF 아나로그의 제조에 관한 것이다. 이러한 키메릭 아나로그는 소수성 부분(테일)을 포함하고, GRF에 하나 또는 여러개의 소수성 테일을 고정하거나 GRF의 화학적 합성에서 가미세포 잔유물에 의해 하나 또는 여러개의 아미노산을 치환함으로서 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 GRF 아나로그는 아래와 같이 특징된다:
a) 상기 아나로그는 향상된 생물학적 활성을 가지고; 특별히, 인체에 밀접하게 관련된 동물 모델에 투여될 때 GH 및 IGF-I 혈액 레벨을 현저하게 증기시킬 수 있다. 이러한 특성은 환자에게 투여되는 고활성 화합물의 용량을 감소하여 치료 효과를 개선하고 치료 비용이 감소되는 이점이 있다.
b) 지방산과 같은 천연 아미노산 및 소수성 물질은 GRF 아나로그의 화학적 합성에 사용된다.
c) 상기는 무한적으로 소량의 용량에서 높은 생물학적 활성을 가진다.
d) 상기는 높은 생물학적 활성을 가지고, 연장된 기간의 시간 동안 활성적으로 남아있다.
본 발명에 따른 지방산의 사용은 종래 기술의 모든 단점을 극복한 GRF 아나로그를 제공한다. 본 발명의 GRF 아나로그는 감소된 용량의 개선된 신진대사 효능을 보이고 연장된 활성을 가진다. 본 발명은 GRF 및 잘려지거나 치환된, 어떠한 GRF 아나로그를 취급한다.
본 발명에 따라서, 일반식 A의 소수성 GRF 아나로그가 제공된다:
X-------GRF-peptide (A)
여기서,
GRF 펩티드는 일반식 B의 펩티드이다:
여기서,
A1는 타이로신 또는 히스티딘;
A2는 발린 또는 알라닌;
A8는 아스파라긴 또는 세린;
A13는 발린 또는 이소류신;
A15는 알라닌 또는 글리신;
A18는 세린 또는 티로신;
A24는 글루타민 또는 히스티딘;
A25는 아스파르트산 또는 글루탐산
A27는 메티오닌, 이소류신 또는 노르류신;
A28는 세린 또는 아스파라긴;
A30는 1∼15 본드 또는 잔유물의 어떤 아미노산 배열;
R0는 n=1∼12의 NH2 또는 NH-(CH2)n-CONH2; 그리고
X는 아미노 본드를 통하여 펩티드의 N-말단에 고정된 소수성 테일이고 소수성 테일은 5∼7 원자의 주쇄를 규정하고;
여기서 상기 주쇄는 C1-6 알킬, C3-6 사이클로알킬, 또는 C6-12 아릴에 의해 치환될 수 있고;
주쇄의 적어도 두 개의 원자에 연결된 적어도 하나의 경직된 부분으로 구성되고;
상기 부분은 이중 본드, 삼중 본드, 포화되거나 포화되지 않은 C3-9 사이클로알킬 및 C6-12 아릴로부터 선택한다.
경직된 부분은 소수성 테일에 강도를 수여하는 것을 의미한다. 경직된 부분은 소수성 테일의 주쇄 부분인 적어도 두개의 원자를 연결한다. 일례로, 아래의 소수성 테일의 주쇄는 아래와 같다:
바람직하게, 주쇄는 이중 본드, 삼중 본드, 포화된 C3-9 사이클로알킬 및 C6 아릴로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나의 경직된 부분으로 치환된다.
또한 주쇄는 이중 본드 및 포화된 또는 불포화된 C3-9 사이클로알킬로 이루어지는 그룹으로부터 독립적으로 선택된 두개의 경직된 부분으로 치환된다.
더욱 바람직하게, 주쇄는 이중 본드, 삼중 본드, 포화된 C3-7 사이클로알킬 및 C6 아릴로 이루어지는 그룹으로부터 독립적으로 선택된 두 개의 경직된 부분으로 치환된다.
다른 실시예에서, 주쇄는 이중 본드, 삼중 본드, 포화된 C3-7 사이클로알킬 및 C6 아릴로 이루어지는 그룹으로부터 선택된 하나의 경직된 부분으로 치환되고, 주쇄의 3,4-위치, 3,5-위치, 또는 3,6-위치에 있다.
바람직하게, 소수성 테일은 아래의 그룹으로부터 선택된다:
본 발명에 따라서, 본 발명의 GRF 아나로그 효율적인 양을 환자에게 투여하는 것으로 구성되는 환자에서 성장 호르몬의 레벨을 증가하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 GRF 아나로그를 상기 환자에게 투여하는 것과 성장 호르몬 응답을 측정하는 것으로 구성되는 환자에서 성장 호르몬 결핍증의 진단을 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 GRF 아나로그의 효율적인 양을 상기 환자에게 투여하는 것으로 구성되는, 환자에서 뇌하수체성 난장이 또는 성장 지체의 치료를 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 GRF 아나로그의 효율적인 양을 상기 환자에게 투여하는 것으로 구성되는, 환자에서 상처 치료 또는 골격 치유를 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 GRF 아나로그의 효율적인 양을 상기 환자에게 투여하는 것으로 구성되는, 환자에서 골다공증 치료를 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 GRF 아나로그의 효율적인 양을 상기 인체 또는 동물에게 투여하는 것으로 구성되는, 인체 또는 동물에서 단백질 동화(단백질 절약 효과)를 개선하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 GRF 아나로그의 효율적인 양을 상기 인체 또는 동물에게 투여하는 것으로 구성되는, 임상 비만으로 고생하는 인체 및 동물에서 지방 분해를 유도하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따라서, 본 발명의 GRF 아나로그의 효율적인 양을 상기 인체 또는 동물에게 투여하는 것으로 구성되는, 인체 또는 동물에서 소마토트로프 기능을 전체적으로 상승하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명에서 아미노산은 아래에 표시된 것과 같이 종래의 3-글짜 약자로서 간주되고, 생화학 명명법에서 IUPAC-IUB 코미션에 의해 추천된 것과 같이 펩티드 기술에서 일반적으로 허용된다:
알라닌 Ala
알기닌 Ala
아스파라긴 Asn
아스파르트 산 Asp
시스테인 Cys
글루탐산 Glu
글리신 Gly
히스티딘 His
류신 Leu
라이신 Lys
메치오닌 Met
오르니친 Orn
페닐알라닌 Phe
프롤린 Pro
세린 Ser
트레오닌 Thr
트립토판 Trp
티로신 Tyr
D-티로신 tyr
발린 Val
용어 "자연 아미노산"은 자연에서 발생하거나 자연적으로 발생한 펩티드내의 아미노산 잔유물로서 결합되는 아미노산을 의미한다. 추가로, Nle는 노르류신을 의미한다.
사용되는 약자는 다음과 같다:
TFA 트리플루오르아세트산
HOBt 1-하이드록시벤조트리아졸
DIC 디이소프로필카르보디이미드
DMF 디메틸포름아미드
Pip 피페리딘
DMAP 4-디메틸아미노피리딘
Boc t-부틸옥시카르보닐
Fmoc 플루오레닐메틸옥시카르보닐
BOP 벤조트리아조-1-일록시트리스(디메틸아미노) 포스포니움 헥사플루오로포스페이트
Me 메틸
HF 하이드로플루오르산
NEt3 트리에틸아민
TEAP 트리에틸암모니움 포스페이트 (버퍼)
여기에 설계된 모든 펩티드 배열은 N말단 아미노산은 왼쪽 C말단은 오른쪽상에 있는 종래에 일반적으로 허용된 것에 따라서 쓰여진다.
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<210> 1
<211> 44
<212> PRT
<213> Human GRF
<400> 1
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg Gln Gln Gly
20 25 30
Glu Ser Asn Gln Glu Arg Gly Ala Arg Ala Arg Leu
35 40
<210> 2
<211> 29
<212> PRT
<213> Active core of human GRF
<400> 2
Tyr Ala Asp Ala Ile Phe Thr Asn Ser Tyr Arg Lys Val Leu Gly Gln
1 5 10 15
Leu Ser Ala Arg Lys Leu Leu Gln Asp Ile Met Ser Arg
20 25
Claims (20)
- 아래의 일반식 A:X-------GRF-peptide (A)여기서,GRF 펩티드는 일반식 B의 펩티드이고여기서,A1는 타이로신 또는 히스티딘;A2는 발린 또는 알라닌;A8는 아스파라긴 또는 세린;A13는 발린 또는 이소류신;A15는 알라닌 또는 글리신;A18는 세린 또는 티로신;A24는 글루타민 또는 히스티딘;A25는 아스파르트산 또는 글루탐산A27는 메티오닌, 이소류신 또는 노르류신;A28는 세린 또는 아스파라긴;A30는 본드 또는 1∼15 잔유물의 어떤 아미노산 배열;R0는 n=1∼12의 NH2 또는 NH-(CH2)n-CONH2; 그리고X는 펩티드의 N-말단에 아미드 본드를 통하여 고정된 소수성 테일이고 상기 소수성 테일은 5∼7 원자의 주쇄를 규정하고;여기서 상기 주쇄는 C1-6 알킬, C3-6 사이클로알킬, 또는 C6-12 아릴에 의해 치환될 수 있고 상기 주쇄는 주쇄의 적어도 두개의 원자에 연결된 적어도 하나의 경직된 부분으로 되고;상기 부분은 삼중 본드, 포화되거나 포화되지 않은 C3-9 사이클로알킬, C6-12 아릴로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 소수성 GRF 아나로그.
- 삭제
- 제 1 항에서 청구된 것과 같은 GRF 아나로그는 활성성분으로써, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 결합하는 것으로 이루어지는 성장 호르몬 릴리스를 유도하기 위한 것을 특징으로 하는 약학 제제.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서,X는 아래로부터 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 소수성 GRF 아나로그:
- 제 1 항에 있어서,환자에서 성장 호르몬 레벨을 증가하기 위한 약제를 제조하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 소수성 GRF 아나로그.
- 제 1 항에 있어서,성장 호르몬 응답을 측정하여, 성장 호르몬 결핍증을 결정하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 소수성 GRF 아나로그.
- 제 1 항에 있어서,환자에서 뇌하수체성 난장이 또는 성장 지체를 치료하기 위한 약제를 제조하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 소수성 GRF 아나로그.
- 제 1 항에 있어서,환자에서 상처의 치료 또는 골격을 치유하기 위한 약제를 제조하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 소수성 GRF 아나로그.
- 제 1 항에 있어서,환자에서 골다공증을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 소수성 GRF 아나로그.
- 제 1 항에 있어서,인체 또는 동물에서 단백질 동화 작용을 개선하기 위한 약제를 제조하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 소수성 GRF 아나로그.
- 제 1 항에 있어서,임상 비만으로 고생하는 인체 또는 동물에서 지방 분해 효과를 유도하기 위한 약제를 제조하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 소수성 GRF 아나로그.
- 제 1 항에 있어서,인체 또는 동물에서 소마트로프 기능을 전체적으로 상승하기 위한 약제를 제조하기 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 소수성 GRF 아나로그.
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