JP2002524472A - 強化した生物的効力を有するｇｒｆ類似体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】増強された生物的効力を有するＧＲＦ類似体 【構成】本発明は強化された生物的効力を有するキメラ脂肪体−ＧＲＦ類似体と、その同化作用剤として及び成長ホルモン欠乏症の診断や治療における応用に関する。キメラ脂肪体−ＧＲＦ類似体は疎水性部分（末端）を含み、ＧＲＦの化学的合成において少なくとも１つの末端部をＧＲＦに固定することで調製することができる。本発明のＧＲＦ類似体は生分解され、非免疫原性であり、少ない用量及び持続性活性で改善された同化作用効力を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

発明の背景 （ａ）発明の分野 本発明は強化された生物的効力及び持続活性を有し、同化作用薬及び成長ホル
モン欠乏症の治療薬として応用できる疎水性ＧＲＦ類似体に関する。

【０００２】

【従来の技術】

（ｂ）先行技術の説明 下垂体から分泌される成長ホルモン（ＧＨ）又はソマトトロピンは、その生物
的活性が幼い生物の順調な発育だけでなく成熟期においても全体の維持に重要な
役割を果たしているホルモン類を構成している。ＧＨは成長因子（インシュリン
様成長因子−１又はＩＧＦ−Ｉ）やそれらのレセプター（表皮成長因子又はＥＧ
Ｆ）の合成を刺激して、直接的または間接的に末梢器官に作用している。ＧＨの
直接作用は抗インシュリン様の形式であり、脂肪性組織レベルでの脂肪分解を促
進する。ＩＧＦ−Ｉ（ソマトメジンＣ）合成及び分泌への作用を通してＧＨは軟
骨及び骨（構造的成長）の成長と、筋肉や皮膚を含めた末梢器官におけるタンパ
ク質合成及び細胞増殖を刺激している。その生物的活性を通じてＧＨは成体のタ
ンパク質同化作用の維持に関与し、外傷後の組織再生現象において主な役割りを
果たしている。

【０００３】 ヒトや動物に見られる加齢によるＧＨ分泌の減少は、器官の加齢を開始又加齢
に関与する異化作用へ代謝が移行するのを促進する。年を重ねると共に見られる
筋肉量の損失、脂肪組織の蓄積、骨の脱ミネラル、創傷後における組織再生能の
損失もＧＨ分泌の減少に相関している。

【０００４】 ＧＨはこのように子供の順調な成長発育に必須な生理的同化作用薬で、成人に
おいてもタンパク質代謝を制御している。 下垂体でのＧＨの分泌は、ソマトスタチン及び成長ホルモン放出因子という主
に２つの視床下部ペプチドにより制御されている。ソマトスタチンはその分泌を
阻害するのに対しＧＲＦは刺激する。

【０００５】 ヒトＧＨはここ約１０年間は遺伝子工学により生産されている。最近まで、Ｇ
Ｈは成長が遅れている子供に関し使用されることが多かったが、現在は成人での
使用が検討されている。ＧＨ及びＧＲＦの薬学的使用は以下の三大分野に分類で
きるだろう。

【０００６】 子供の発育 組換えヒト成長ホルモンによる治療は下垂体こびと症、腎臓不全症、ターナー
症候群及び短躯の子供で、成長を刺激することが示されてきた。組換えヒトＧＨ
は、現在欧州や米国ではＧＨ欠乏で起こった子供の成長遅延及び子供の腎臓不全
に対する“オーファンドラッグ（希用薬）"として市販されている。他の使用に
ついては臨床試験研究中である。

【０００７】 成人及び老年患者に対する長期治療 GH分泌の減少は加齢と共に身体構成に変化を起こす。組換えヒトＧＨの一年間
治療の予備試験では、老年患者集団において筋肉量の増加及び皮膚厚の増加、骨
密度の僅かな増加と共に脂肪量の減少が報告されていた。骨粗しょう症に関して
の最近の研究では、組換えヒトＧＨは骨ミネラル化を増進はしないが閉経後の女
性の骨脱ミネラルを防ぐということが示唆された。更なる研究がこの説を示すた
めに現在実施中である。

【０００８】 成人及び老年患者における短期治療 前臨床及び臨床試験では、成長ホルモンは火傷、エイズ（ＡＩＤＳ）及びガン
の場合、創傷及び骨治癒においてタンパク質同化作用を刺激することが今までに
示されている。

【０００９】 ＧＨ及びＧＲＦの獣医学での薬学的利用も意図されている。ＧＨ及びＧＲＦは
ブタの生育期において脂肪組織の代わりに筋肉の定着を促進して成長を刺激した
り、牝牛でも乳量を増加させたりするが、これにより動物の健康を損なうなどの
望ましくない副作用もなく、生産される肉や乳の中に残留することもない。ウシ
のソマトトロピン（ＢＳＴ）は現在米国で市販されている。

【００１０】 実施された臨床研究の多くは組換えＧＨを用いて行われた。ＧＦＲは将来多く
の例において、ＧＨに取って代わる第二世代の製品と考えられている。従って、
ＧＲＦの使用はＧＨ使用よりも多くの利点を本質的に提供する。

【００１１】 生理的利点 成長ホルモン（ＧＨ）は下垂体によりパルス状に分泌される。分泌のこのリズ
ムは最適な生物的活動に重要なので、分泌の自然な方式に一致するＧＨの投与は
困難である。ＧＲＦが緩和放出調剤又は浸剤として連続的に投与されるとパルス
性を妨害しないでＧＨの分泌を増加させる。

【００１２】 現在市販されている組換えＧＨは２２ｋDa形であるが、ＧＲＦは広い範囲の生
物活性に関わる全てのＧＨ化学的異性体につき下垂体からの合成および分泌を誘
導する ＧＨによる処置は下垂体の内分泌成長ホルモン分泌能力を低下させ、ＧＨのＧ
ＲＦへの応答はその処置の後では弱くなる。これとは反対に、ＧＲＦによる処置
にはこの欠点がなく、下垂体へのその滋養行為は健常な動物及び成長ホルモン欠
乏症患者での下垂体分泌能を向上させる。

【００１３】 経済的利点 遺伝工学によるＧＨの生産では臨床での使用は非常に高価である。特に、これ
ら市販の調剤には使用した細菌株からの成分が混入する危険性がある。これら細
菌混入物は患者にとって発熱原又は免疫反応を起こすことがある。組換え産物の
精製は以下の複数の連続的クロマトグラフィー手段により行なわれている。規制
当局により課せられた極度な純度規準は多数の品質管理段階が必要である。

【００１４】 一方ＧＲＦの合成は化学的範疇に属する。合成は固相で行なわれ、その精製は
高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて単回で行なわれる。また投与され
るＧＲＦの量は同じ生物的結果を求めるＧＨの量より格段に少なくてすむ。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】

この全ての利点にも関わらず、ＧＲＦは依然として現在まで治療薬として市販
されていないのはその不安定さに主な原因がある。ヒトＧＲＦは以下のような配
列のアミノ酸４４個からなるペプチドである： Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ １ ５ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ １０ １５ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｍｅｔ ２０ ２５ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｎ Ｇｌｎ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｎ Ｇｌｎ ３０ ３５ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｒｇ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｅｕ−ＮＨ２ ４０ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１） 最小活性中心はｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２ Ｔｙｒ Ａｌａ Ａｓｐ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｐｈｅ Ｔｈｒ Ａｓｎ Ｓｅｒ １ ５ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ １０ １５ Ａｌａ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ａｓｐ Ｉｌｅ Ｍｅｔ ２０ ２５ Ｓｅｒ Ａｒｇ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２） 多くのペプチドのように、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２は血清の中で急速に分
解し、その代謝物は残存生物活性を保持しない。血液培地での酵素の作用、即ち
ジペプチジルアミノペプチダーゼIV型の作用はＧＲＦのＡｌａ²−Ａｓｐ³ペプチ
ド結合を加水分解することが確認されている。この加水分解が多くの負の結果を
もたらすので、文献で報告された多くの検討はこれが主題とされている。本質的
には、この加水分解により、生物活性が１０００分の１以下に減少した特異活性
の切断ペプチドが生成する。

【００１６】 子供と成人についての臨床研究によれば、天然ｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ２或
いは活性断片ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２は組換えＧＨに匹敵する効果を生じる
効力はない。

【００１７】 ペプチド配列のC末端における−ＮＥｔ２のような疎水基の固定は顕著に特異
活性を増加させることが良く知られている。疎水性に関していえば、これらの結
果は、望ましい生物活性を有する小ペプチド類似体を作り出すにはN末端に疎水
基としてのラウロイル基は効果ないことを強調しているＭｕｒａｎｉｃｈｉの研
究（Ｍｕｒａｎｉｃｈｉ ｅｔａｌ．，１９９１，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，８：
６４９から６５２）のような数多くの最近の研究による異論がある。これにより
、先行技術の相反する研究のため疎水残基を用いてより可能性あるGRF類似体を
見出すという課題に注意を向けることがなくなってしまった。

【００１８】 Ｇａｕｄｒｅａｕ等（Ｐ．Ｇａｕｄｒｅａｕ et ａｌ． １９９２， Ｊ．
Med．Ｃｈｅｍ．， ３５（１０）：１８６４〜１８６９）はアセチル−、６
−アミノヘキサノイル−及び８−アミノオクタノイル−ＧＲＦ（１−２９）ＮＨ
２のラット下垂体への親和性について記述している。この報告では、試験を行な
った脂肪酸−ＧＲＦ化合物はどれもｈＧＲＦ（１−２９）ＧＲＦ自体より高い親
和性を示さず、著者等は“ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２のＮ末端で疎水性を増大
する修飾はレセプター親和性を高める適切な方法ではない"と結論している。

【００１９】 Ｃｏｙ等（Ｄ．Ｈ．Ｃｏｗ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ
．，３０：２１９〜２２２）はラットモデルにつき、とりわけペントバルビター
ルナトリウムで麻酔をしたラットにつき生物活性を増加したアセチル−ＧＲＦペ
プチドについて記述した。培養ラット下垂体細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧ
Ｈ応答についても分析した。しかし、この著者等はＧＲＦのN末端領域に炭素鎖
が２（アセチル基）以上を持つ脂肪酸−ＧＲＦ類似体についての合成も試験もし
なかったし、またアセチル基が疎水性とはいえない。

【００２０】 現在まで、記載された多くのＧＲＦ類似体（Ｇａｕｄｒｅａｕ ｅｔ ａｌ．
やCｏｙ ｅｔ ａｌ．の類似体を含む）については、ラットモデルによってｉ
ｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏで試験されてきた。ヒトとラットのＧＲＦ（
１−２９）ＮＨ２は極度に違うので、ＧＲＦの構造−活性の関係は両方の種では
異なる。そこで、ラットで得た結果をヒトに外挿することはできない。

【００２１】 従って、改良された同化作用効力及び持続活性を持ったＧＲＦ類似体を設計す
る必要が生じる。この強化された効能は、血清中での分解に対しての抵抗性及び
／又は高作動薬の性質により得られる。

【００２２】 強化された同化作用効力を持つＧＲＦ類似体を提供することは大変望まれてい
ることである。 発明の概要 本発明の目的は、改善した生物的効力及び持続的活性を有する新規生物分解性
ＧＲＦ類似体を提供することにある。

【００２３】 本発明の他の目的は、強化した同化作用効力及び持続性活性を有する、即ち長
期間ヒト及び動物に投与したときインシュリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）レベ
ルを実質的に向上する事ができるＧＲＦ類似体を提供することにある。

【００２４】 本発明の他の目的は任意のＧＲＦ類似体に、より高い生物的効力及び持続性活
性を持たせる方法を提供することにある。 本発明の他の目的は、改善された同化作用効力及び持続的活性を備えた活性Ｇ
ＲＦ類似体を製造する方法を提供することにある。

【００２５】 本発明は、疎水性ＧＲＦ類似体の調製法に関する。これらキメラな類似体は疎
水性部分（末端）を含み、ＧＲＦの化学的合成において一つ又は数個の疎水性末
端をＧＲＦに固定するか、一つ又は数個のアミノ酸を擬似ミセル残基で置換して
調製することができる。本発明によるＧＲＦ類似体は以下のような特性を有する
ものである： （ａ）これらの類似体は強化された生物的活性を有する；即ちとりわけそれらを
ヒトに密接に関連した動物モデルに投与するとき、顕著にＧＨ及びＩＧＦ−Ｉの
血液レベルを上昇できる。この特性は患者に投与する高活性化合物の用量を削減
することができ、治療効果及び治療費用の改善がはかれるという点で特に有利で
ある。 （ｂ）天然アミノ酸及び脂肪酸などの疎水性物質の両方がＧＲＦ類似体の化学合
成で使用される。 （ｃ）これらは非常に少ない用量で高い生物的活性を示す。 （ｄ）これらは長い期間活性を維持し、高い生物的活性を有する。

【００２６】 本発明通りの脂肪体を用いると、先行技術における全ての欠点を克服したＧＲ
Ｆ類似体となる。本発明のＧＲＦ類似体は減量した用量で改善された同化作用効
力を示し、持続性活性を有する。更に本発明は、ＧＲＦ及び切断されたもの又は
置換されたものなどその類似体の全てに関する。

【００２７】 本発明によれば、構造式Ａの疎水性ＧＲＦ類似体が提供される： Ｘ―――ＧＲＦ−ペプチド （Ａ） ここで； ＧＲＦ−ペプチドは構造式Ｂのペプチドである； Ａ１−Ａ２−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａ８−Ｓｅｒ−Ｔｙ
ｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａ１３−Ｌｅｕ−Ａ１５−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａ１８−Ａｌ
ａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ２４−Ａ２５−Ｉｌｅ−Ａ２７−Ａ２
８−Ａｒｇ−Ａ３０−Ｒ０ （Ｂ） ここで、 Ａ１はＴｙｒ又はＨｉｓ； Ａ２はＶａｌ又はＡｌａ； Ａ８はＡｓｎ又はＳｅｒ； Ａ１３はＶａｌ又はＩｌｅ； Ａ１５はＡｌａ又はＧｌｙ； Ａ１８はＳｅｒ又はＴｙｒ； Ａ２４はＧｌｎ又はＨｉｓ； Ａ２５はＡｓｐ又はＧｌｕ； Ａ２７は Ｍｅｔ、Ｉｌｅ又はＮｌｅ； Ａ２８はＳｅｒ又はＡｓｎ； Ａ３０は結合或いは１から１５残基までの任意のアミノ酸配列 Ｒ０はＮＨ２又はＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＨ２でｎ＝１から１２、 Ｘは疎水性末端であり、アミド結合によりペプチドのN末端に固定されており、
その疎水性末端は５から７原子の背骨部分を持つ；ここでその背骨部分はＣ１−
６アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル又はＣ６−１２アリールで置換されていて
もよい；そして少なくとも背骨部分の２原子に結合した１つの剛直化部分を有し
ている；その部分は二重結合、三重結合、飽和又は不飽和Ｃ３−９シクロアルキ
ル及びＣ６−１２アリールからなる群基から選ばれる。

【００２８】 剛直化部分という言葉は疎水性末端に硬さを付与する部分を意味する。剛直化
部分は疎水性末端の背骨の部分である少なくとも２原子に結合している。例えば
、疎水性末端の背骨部分とは以下のようなものである：

【００２９】

【化２】

【００３０】 好ましくは、背骨部分は二重結合、三重結合、飽和Ｃ３−７シクロアルキル及
びＣ６アリールからなる群から選択された１つの剛直化部分で置換されている。 また好ましくは、背骨部分は二重結合或いは飽和又は不飽和Ｃ３−９シクロア
ルキルからなる群から別々に選択された２つの剛直化部分で置換されている。

【００３１】 更に好ましくは、背骨部分は二重結合、三重結合、飽和Ｃ３−７シクロアルキ
ル及びＣ６アリールからなる群から別々に選択された２つの剛直化部分で置換さ
れている。

【００３２】 別の態様においては、背骨部分は二重結合、三重結合、飽和Ｃ３−７シクロア
ルキル及びＣ６アリールからなる群から選択された１つの剛直部分で置換されて
いて、それらは背骨部分の３，４−位置、３，５−位置又は３，６−位置に存在
している。

【００３３】 好ましくは、疎水性末端は以下の群から選択される。

【００３４】

【化３】

【００３５】

【００３６】 本発明によれば、本発明のＧＲＦ類似体の効果量を患者に投与することを含ん
だ患者における成長ホルモンのレベルを増加させる方法が提供される。 本発明によれば、本発明のＧＲＦ類似体を患者に投与し、成長ホルモンの応答
を測定することを含んだ患者における成長ホルモン欠乏症の診断を行なう方法が
提供される。

【００３７】 本発明によれば、本発明のＧＲＦ類似体の効果量を患者に投与することを含ん
だ下垂体こども症又は成長遅延の患者の治療法が提供される。 本発明によれば、本発明のＧＲＦ類似体の効果量を患者に投与することを含ん
だ患者の創傷又は骨治癒の方法が提供される。

【００３８】 本発明によれば、本発明のＧＲＦ類似体の効果量を患者に投与することを含ん
だ患者の骨粗しょう症の治療法が提供される。 本発明によれば、本発明のＧＲＦ類似体の効果量を患者又はヒトに投与するこ
とを含んだヒト又は動物におけるタンパク質同化作用（タンパク質節約効果を含
め）を改良する方法が提供される。

【００３９】 本発明によれば、本発明のＧＲＦ類似体の効果量をヒト又は動物に投与するこ
とを含んだ臨床的肥満に悩むヒト又は動物における脂肪分解効果を誘起する方法
が提供される。

【００４０】 本発明によれば、本発明のＧＲＦ類似体の効果量をヒト又は動物に投与するこ
とを含んだヒト又は動物における成長ホルモン産生細胞機能を全体的に亢進する
方法が提供される。

【００４１】 本発明では、アミノ酸は下に示すように従来の３文字省略体で識別するが、こ
れは生化学命名法でのＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ委員会の推奨に従うものとしてペプチ
ド分野で一般的に受け入れられているものである： アラニン Ａｌａ アルギニン Ａｒｇ アスパラギン Ａｓｎ アスパラギン酸 Ａｓｐ システイン Ｃｙｓ グルタミン酸 Ｇｌｕ グリシン Ｇｌｙ ヒスチジン Ｈｉｓ ロイシン Ｌｅｕ リジン Ｌｙｓ メチオニン Ｍｅｔ オルニチン Ｏｒｎ フェニルアラニン Ｐｈｅ プロリン Ｐｒｏ セリン Ｓｅｒ トレオニン Ｔｈｒ トリプトファン Ｔｒｐ チロシン Ｔｙｒ Ｄ−チロシン Ｔｙｒ バリン Ｖａｌ “天然アミノ酸"という言葉は、自然の中で生じた又は自然の中で生じたペプ
チドにアミノ酸残基として組み込まれているアミノ酸を意味する。加えて、略字
Ｎｌｅはノルロイシンを意味する。

【００４２】 他の使用した略字は： ＴＦＡ トリフルオロ酢酸 ＨＯＢｔ １−ヒドロキシベンゾトリアゾール ＤＩＣ ジイソプロピルカルボジイミド ＤＭＦ ジメチルホルムアミド Ｐｉｐ ピペリジン ＤＭＡＰ ４−ジメチルアミノピリジン Ｂｏｃ ｔ−ブチルオキシカルボニル Ｆｍｏｃ フルオレニルメチルオキシカルボニル ＢＯＰ ヘキサフルオロりん酸ベンゾトリアゾ−１−イルオキシトリス
（ジメチルアミノ）ホスホニウム Ｍｅ メチル ＨＦ フッ化水素酸 ＮＥｔ３ トリエチルアミン ＴＥＡＰ りん酸トリエチルアンモニウム（緩衝液） ここで述べる全てのペプチド配列は、Ｎ末端アミノ酸は左でＣ末端アミノ酸は
右にするという一般的に受け入れられている取決めに従って記述する。 発明の詳細な説明 本発明は、脂肪体即ち擬似ミセル残基及び／また疎水性末端を用いて高い効力
のキメラな脂肪体−ＧＲＦ類似体の新しい化合物群を製造することに関する。

【００４３】 本発明によれば、脂肪体−ＧＲＦ類似体は、ＧＲＦ又はその類似体のN末端部
で一つ又は幾つかの疎水性末端を固定することによって化学的合成することがで
きる。

【００４４】 化学的固定反応を良好に実施するには、酸型による疎水性機能化が良く用いら
れる。これらの条件において、固定化反応は好ましくは固定相において（Ｍｅｒ
ｒｉｆｉｅｌｄ Ｒ．Ｂ．，１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．， ８５
:２１４９；１９６４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８６：３０４）、ヘキ
サフルオロりん酸ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ
）ホスホニウム（Ｂ．Ｃａｓｔｒｏ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｔｅｔｒａｈｅ
ｄｒｏｎ ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌ．１４：１２１９）のような、先行技術で
知られる極端に活性な試薬を用いて達成される。

【００４５】 固定する疎水性末端が脂肪酸である場合、固定化における活性化はｉｎ ｓｉ
ｔｕで実施される。用いる合成方法によりペプチド固定化部位は、固定化の直前
に慣用の脱保護条件で遊離状態にする（Ｇｒｏｓｓ ｅｔ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅ
ｒ，１９８１，Ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｖｏｌ．３，Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐ
ｒｅｓｓ：１〜３４１ページ）。疎水性末端（Ｈｔ）はエーテル（テトラヒドロ
フラン）、塩素化脂肪族溶媒（ジクロロメタン）、ニトリル（アセトニトリル）
又はアミド（ジメチルホルムアミド）などの有機溶媒中で固定化試薬により縮合
する。

【００４６】 固定化の動力学に関し、好ましい実施温度は２０〜６０℃である。固定化反応
時間は、用いる疎水性末端がより疎水性であれば温度と逆に変化するが、０．１
〜２４時間での変化である。

【００４７】 例として、以下に説明するトリアシルリジン合成で疎水性脂肪酸末端の固定化
原理全体をスキーム方式で説明する。

【００４８】

【化４】

【００４９】 通常のＧＲＦ合成はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社から提供されたＦｍｏｃ法及び合成
サイクルを用い、９０５０^TMプラスペプチド合成装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃ
ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍｉｌｆｏｒｄ， ＭＡ）による固相法で行なった。
Ｆｍｏｃアミノ酸はＢａｃｈｅｍ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ及び他の市販品から供
給された。Ｃ末端カルボキサミドの生産するために、ＢＯＰ／ＨＯＢｔを結合法
とした連続的Ｆｍｏｃ化学を、出発Ｆｍｏｃ−Ｐａｌ−ＰＥＧ樹脂（Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ， ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ： ＧＥＮ ９１３３８３）に適用
した。Ｆｍｏｃ脱保護は２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液で実施した。合成完了後
、樹脂はＤＭＦ及びエーテルで充分洗浄してから乾燥した。側鎖保護基及びペプ
チド−樹脂結合の最終分解はＭｉｌｌｉｐｏｒｅが提供した以下の混合物からな
る方法で行なった：ＴＦＡ，水、フェノール、トリイソプロピルシラン（８８：
５：５：２）。次いでペプチドは沈殿させ、エーテルで洗浄してから乾燥した。
Ｗａｔｅｒｓ ｐｒｅｐ４０００、吸光度 ２１４ｎｍ、検出器モデル ４８６
、流速 ５０ｍｌ／分による１０５分で２５から６０％Ｂの直線的傾斜を用いた
逆相ＨＰＬＣ精製（緩衝液Ａ：ＴＥＡＰ ２．５；緩衝液Ｂ：８０％ＣＨ３ＣＮ
のＡ溶液）に次いで脱塩工程（緩衝液Ｃ：０．１％ＴＦＡの水溶液；緩衝液Ｄ：
０．１％ＴＦＡのアセトニトリル／水（８０：２０）溶液）を行なうとＨＰＬＣ
（ミレニウム／ホトダイオードアレイ検出）での計算では均質性９７％以上、回
収率１０〜３０％でペプチドが得られた。

【００５０】 本発明によれば、ＧＲＦ類似体の開発用の前臨床モデルに有益なブタを試験種
として選んだ。実に、ヒトとブタＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２は構造で１００％相
同性であり、ＧＨ分泌の生理的パターンは両種で殆ど同一である。

【００５１】 しかも、ＧＲＦ類似体の効力はＧＨの急性放出効力よりＩＧＦ−Ｉ血液レベル
を顕著に上昇させる能力で評価された。確かに、ＧＨやＧＲＦが誘起したＧＨの
同化作用及び治癒効果は、ＩＧＦ−Ｉ合成及び分泌における増加が仲介すること
が知られている。そこで、ＧＦＲにより誘導されたＩＧＦ−Ｉ上昇の測定は処置
効力の最も良い指標である。

【００５２】

【実施例】

本発明は以下の実施例を参照すればより容易に理解することができるが、それ
は発明の応用範囲を制限するのではなく、発明の例を示しているものである。

【００５３】 実施例１ ブタの血清ＩＧＦ−Ｉレベルに対する［ブチリル⁰］、［オクタノイル⁰］、［ヘ
キサノイル⁰］、［ヘキサノイル³⁰］、［ヘキサノイル^0,30］、ＨＧＲＦ（１−
２９）ＮＨ２及び［ヘキサノイル０］ＨＧＲＦ（１−４４）ＮＨ２に対するｈＧ
ＲＦ（１−２９）ＮＨ２の反復投与の効果対比 これらの実験の目的は、ＧＲＦ類似体の同化作用剤としての可能性を評価する
ものである。ＧＨ又はＧＲＦ−誘導ＧＨ分泌は、インシュリン様成長因子（ＩＧ
Ｆ−Ｉ）合成及び分泌を増加させて循環ＩＧＦ−Ｉの上昇を起こすことによりそ
の同化効果を発揮することは知られている。ＧＲＦ類似体処置に対する同化作用
応答の強さは、ブタでのＩＧＦ−Ｉレベルの増加に比例することは以前に示され
ている（Ｄｕｂｒｅｕｉｌ Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９９０，Ｊ．Ａｎｉｍ．
Ｓｃｉ．，６８：１２５４−１２６８）。

【００５４】 そこで、脂肪酸−ＧＲＦ類似体の同化作用効力を検討するのに、ブタへの反復
皮下投与後にそれが示すＩＧＦ−Ｉレベルを増加する能力で評価した。 実験１ ２６匹のＬａｎｄｒａｃｅ ｘ Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ去勢雄ブタ（４０〜４５
ｋｇ ＢＷ）を無作為に4試験群に割り当てた： 第１群−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝７） 第２群−［オクタノイル⁰］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２（２０μｇ／ｋｇ、ｎ
＝６） 第３群−［ヘキサノイル⁰］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２（２０μｇ／ｋｇ、ｎ
＝６） 第４群−［ブチリル⁰］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝７
） 各々の動物にＢＩＤ（１日２回）を４日連続で皮下注射した。血液試料はその
日の最初の注射の前に毎朝及び最後の注射の翌日に採取して、ＩＧＦ−Ｉの測定
を行なった。 実験２ ４０匹のＬａｎｄｒａｃｅ ｘ Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ去勢雄ブタ（４０〜４５ｋ
ｇ ＢＷ）を無作為に５実験群に割り付けた： 第１群−食塩水（ｎ＝８） 第２群−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２（４０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８） 第３群−［ヘキサノイル⁰］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２（1０μｇ／ｋｇ、ｎ＝
8） 第4群−［ヘキサノイル⁰］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝
8） 第５群−［ヘキサノイル⁰］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２（４０μｇ／ｋｇ、ｎ
＝８） 各動物は５日連続でＢＩＤ（１日２回）皮下注射した。血液試料はその日の最
初の注射の前に毎朝及び最後の注射の翌日に採取して、ＩＧＦ−Ｉの測定を行な
った。 実験３ ４８匹のＬａｎｄｒａｃｅ ｘ Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ 去勢雄ブタ（４０〜４
５ｋｇ ＢＷ）を無作為に６実験群に割り付けた。 第１群−食塩水（ｎ＝８） 第２群−ｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ２（３０μｇ／ｋｇ、ｎ＝８） 第３群−［ヘキサノイル⁰］ｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ２（３０μｇ／ｋｇ、ｎ
＝8） 第4群−［ヘキサノイル⁰］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２（２０μｇ／ｋｇ、ｎ＝
8） 第５群−［ヘキサノイル³⁰］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２（２０μｇ／ｋｇ、ｎ
＝８） 第６群−［ヘキサノイル^0,30］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２（２０μｇ／ｋｇ、
ｎ＝８） 選択した用量はモル換算で同じ用量となるよう、ｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ２
類似体で３０μｇ／ｋｇ、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２類似体で２０μｇ／ｋｇ
とした。各動物は５日間連続しＢＩＤ（１日２回）皮下注射した。血液試料はそ
の日の最初の注射の前に毎朝及び最後に注射した翌日に採取して、ＩＧＦ−Ｉの
測定を行なった。 ＩＧＦ−Ｉ測定 ブタ血清中のＩＧＦ−Ｉレベルは以前の報告のように（Ａｂｒｉｂａｔ Ｔ．
ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，３９：５８３〜５８９
）ギ酸−アセトンで抽出した後、二重抗体放射免疫アッセイ法で測定した。放射
免疫アッセイに先立つ抽出は内生ＩＧＦ−結合タンパク質を除去するのに必要な
段階である。 統計的分析 両方の実験において、ＩＧＦ−Iデータは日及び処置（ＧＲＦ類似体）を変化
の原因とし、変動の二元反復測定分析により分析した。多重比較法をそこでは実
施した（Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ Ｋｅｕｌｓ Ｍｅｔｈｏｄ）。Ｐ<０
．０５を統計的有意差ありとした。 試験結果 実験１ 日（Ｐ＝０．０００４）の有意な効果及び有意な処置×日の相互作用（Ｐ＝０
．０１１）の両方が存在し、ＩＧＦ−Ｉレベルの増加は試験を行なった類似体に
依存することを示した（表１）。ＩＧＦ−Ｉ測定用の血液試料は最初の化合物注
射の前に毎日採取した。データは一群６〜７匹の値の平均±ＳＥＭで表してある
。

【００５５】

【表１】

【００５６】 多重比較は［ヘキサノイル⁰］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２のみがＩＧＦ−Ｉ
レベルを増加させるだけで、有意差ありが４日目（２９％、Ｐ<０．０５）と５
日目（３８％，Ｐ<０．０５）であった。ヒトＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２は試験
用量ではＩＧＦ−Ｉのレベルに効果を示さなかった。 実験２ 日（Ｐ<０．０００１）に有意な効果及び処置×日に有意な相互作用（Ｐ<０．
０００１）の両方が存在し、ＩＧＦ−Ｉレベルの増加は試験を行なった類似体に
依存することを示した（表２）。ＩＧＦ−Ｉ測定用の血液試料はその日の最初の
化合物注射の前に毎日採取した。データは一群当たり８匹の値の平均±ＳＥＭで
表してある。

【００５７】

【表２】

【００５８】 多重比較は［ヘキサノイル⁰］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２の全３試験用量で
ＩＧＦ−Ｉレベルを増加させたことを示した。１０μｇ／ｋｇにおいて、ＩＧＦ
−Ｉレベルは５日目と６日目で有意に増加した（１６〜２１％，Ｐ<０．０５）
。２０μｇ／ｋｇではＩＧＦ−Ｉレベルは３，４，５及び６日目に増加した（２
０〜２２％、Ｐ<０．０５）。４０μｇ／ｋｇではＩＧＦ−Ｉレベルは３，４，
５及び６日目に増加した（２７〜４８％、Ｐ<０．０５）。血清ＩＧＦ−Ｉレベ
ルは、食塩水及びｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２処置ブタでは変化せず安定してい
た。

【００５９】 最後に、回帰分析では１日目から６日目のＩＧＦ−Ｉ濃度の増加は［ヘキサノ
イル⁰］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２の用量に依存していることを示した（ΔＩ
ＧＦ−Ｉ＝１１．９＋（２．７７×用量）；ｒ＝０．６８，Ｐ<０．０００１）
。 実験３ 日（Ｐ<０．０００１）の有意な効果及び処置×日の有意な相互作用（Ｐ<０．
０００１）の両方が存在し、ＩＧＦ−Ｉレベルの増加は試験を行なった類似体に
依存することを示した（表４）。多重比較ではＧＲＦのＮ末端領域にヘキサノイ
ル官能基の分岐がある類似体は非常に効力があることを示した。

【００６０】 ［ヘキサノイル⁰］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２はＩＧＦ−Ｉレベルを５及び
６日目に顕著に向上させた（２８％及び３１％で、Ｐ<０．０５）。 ［ヘキサノイル⁰、³⁰］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２はＩＧＦ−Ｉレベルを
４、５及び６日目に顕著に向上させた（３２％、３５％及び４３％で、Ｐ<０．
０５）。

【００６１】 ［ヘキサノイル⁰］ｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ２はＩＧＦ−Ｉレベルを３，４
，５及び６日目に顕著に向上させた（４１％、５４％、５０％及び６１％で、Ｐ
<０．０５）。

【００６２】 ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２に関する前の観察（実験１及び実験２）のように
、全長ｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ２はＩＧＦ−Ｉに対して効果は僅か又は全然な
かった（５日目の顕著な効果を除いてであるが、この効果も６日目までは継続し
なかった）。最終的に、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２のＣ末端領域にヘキサノイ
ル官能基を固定すると、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２に比べ増加した効力を有す
る類似体ができるが（６日目で、ＩＧＦ−Ｉレベルで２１％増加、Ｐ<０．０５
）、［ヘキサノイル⁰］ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２よりは低い効力であった。 ヒトＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２及びｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ２は等モル濃度
にするために、それぞれ２０μｇ／ｋｇ及び３０μｇ／ｋｇ注射を行なった。デ
ータを一群８匹の値の平均±ＳＥＭで表す。

【００６３】

【表３】

【００６４】 結論 ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２もｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ２も２０〜４０μｇ
／ｋｇの範囲ではＩＧＦ−Ｉレベルを調節することはできなかった。しかし、脂
肪酸を固定するとＧＲＦはより効力が向上し、ＩＧＦ−Ｉ分泌に対し顕著に改善
した活性を有する類似体が生じた。脂肪酸の固定化はｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ
２及びｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ２両方の同化作用効力を改良するのに効率的で
あった。上の結果から、使用する理想的な脂肪酸はヘキサン酸又はＣ６脂肪性誘
導体で、最大の効力の類似体を作るにはＧＲＦのＮ末端領域に固定するのが望ま
しいことが結論された。

【００６５】 実施例２ ブタにおけるＩＧＦ−Ｉレベルに対するＧＲＦ類似体の相対的効果 １日２回１用量皮下投与を各試験品と食塩水の比較で５日間処置を行なった。
この実験は（アミノヘキサノイル）０ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２、（ヘキシル
ホルミエート）０ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２、（ヘキセノイル トランス−２
）０ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２、（ヘキセノイル トランス−３）０ｈＧＲＦ
（１−２９）ＮＨ２、及び（ムコノイル）０ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２などの
効率と（ヘキサノイル）０ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２の効率を比較するのに行
なった。

【００６６】 試験した化合物は全てＧＲＦ類似体の同じ族に属し、それらは天然ＧＲＦと天
然脂肪酸の組合せで、分子の活性を改良する目的で設計された。 試験を行なった類似体 食塩水中 ＴＴ−０１０１５ （ヘキサノイル）０ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２ ２０μｇ
／ｋｇ ＴＴ−０１０２１ （アミノヘキサノイル）０ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２ ２
０μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２２ （ヘキシルホルミエート）０ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２
２０μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２３ （ヘキセノイル トランスー２）０ｈＧＲＦ（１−２９）Ｎ
Ｈ２ ２０μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２４ （ヘキセノイル トランス−３）０ｈＧＲＦ（１−２９）Ｎ
Ｈ２ ２０μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２５ （ムコノイル）０ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２ ２０μｇ
／ｋｇ 試験品の経路及び頻度 投与： １日２回皮下注射 試験系： Ｌａｎｄｒａｃｅ × Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ系ブタ 動物の説明：５６匹の成長期去勢ブタで購入時３５ｋｇ 飼料：市販の濃縮飼料（タンパク質量は１８％）を随意に与えた。 実験 計画：５６匹のブタを無作為に７実験群に割り付けた（1群８匹）。各群につき
毎日２回、以下の処置を皮下投与で行なった（容量：３ｍｌ，皮下注射）。 第１群：食塩水 ２×／日 第２群：ＴＴ−０１０１５ ２０μｇ／ｋｇ ２×／日 第３群：ＴＴ−０１０２１ ２０μｇ／ｋｇ ２×／日 第４群：ＴＴ−０１０２２ ２０μｇ／ｋｇ ２×／日 第５群：ＴＴ−０１０２３ ２０μｇ／ｋｇ ２×／日 第６群：ＴＴ−０１０２４ ２０μｇ／ｋｇ ２×／日 第７群：ＴＴ−０１０２５ ２０μｇ／ｋｇ ２×／日 処置は第１日目から第５日目まで行なった。注射の直前に、各動物から１血液
試料を採取し、追加血液試料を６日目に採取した。

【００６７】 血液試料は凝固させ、血清を遠心分離で回収してＩＧＦ−Ｉアッセイに付した
。 結果は図１でＤ−ＩＧＦ−Ｉとして示したが、それは第1日目（前処理レベル
）から第６日目（ＧＲＦ投与５日間）までのＩＧＦ−Ｉレベルにおける増加と定
義される。試験を行なった全ての類似体の中で、ヘキサノイル−、ヘキシルホル
ミエート、ヘキセノイル トランス２−及びヘキセノイル トランス３−ｈＧＲ
Ｆ（１−２９）ＮＨ２だけが顕著にＩＧＦ−Ｉレベルを６日間の試験中に増加さ
せたが、アミノヘキサノイル−及びムコノイル−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２は
増加させなかった。ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２は前のアッセイ（実施例１参照
）で、同じ条件において同じ用量では効果がなかったので、これらの結果はＧＲ
ＦのＮ末端領域に種々なＣ６炭素鎖を加えると生物活性が増加することを示して
いる。

【００６８】 実施例３ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２に対する（ヘキセノイル トランス−３）０ｈＧＲ
Ｆ（１−２９）ＮＨ２のブタにおける静脈ＧＨ−放出効力の対比 本実験は、ヒトに生理的に近似したモデルにおいて、ＧＲＦ類似体である（ヘ
キサノイル トランス−３）０ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２の静脈急性ＧＨ−放
出効力の試験をし、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２の効力と比較するために行なっ
た。

【００６９】 （ヘキサノイル トランス−３）０ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２は天然ｈＧＲ
Ｆ（１−２９）ＮＨ２と天然脂肪酸との組み合わせたものである。本試験は多数
用量、単回静脈注射試験である。 試験した類似体 ＴＴ−０１０２４ （ヘキセノイル トランス−３）０ｈＧＲＦ（１−２９）Ｎ
Ｈ２ ０．２５μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２４ （ヘキセノイル トランス−３）０ｈＧＲＦ（１−２９）Ｎ
Ｈ２ １μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２４ （ヘキセノイル トランス−３）０ｈＧＲＦ（１−２９）Ｎ
Ｈ２ ４μｇ／ｋｇ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２ ０．２５μｇ／ｋｇ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２ １μｇ／ｋｇ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２ ４μｇ／ｋｇ 試験品の経路及び頻度 投与：静脈急性注射 試験系：Ｌａｎｄｒａｃｅ × Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ系ブタ 動物の説明：５６匹成長期去勢ブタで購入時体重が３５ｋｇ 飼料：市販の濃縮飼料（タンパク質１８％）を随意に与えた。 実験 計画：５６匹のブタ（４匹は予備）に試験前１週間内にカニューレを付けた（１
匹の頚部静脈にカテーテルを外科的に埋め込んだ）。１日目及び７日目に、カニ
ューレを付けた動物は無作為に７群に割り付けた（1群４匹）。 第１群：食塩水 第2群：ＴＴ−０１０２４ ０．２５μｇ／ｋｇ 第3群：ＴＴ−０１０２４ １μｇ／ｋｇ 第４群：ＴＴ−０１０２４ ４μｇ／ｋｇ 第５群：ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２ ０．２５μｇ／ｋｇ 第６群：ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２ 1μｇ／ｋｇ 第7群：ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２ 4μｇ／ｋｇ ｐＧＨアッセイ用の血液試料はＧＲＦ注射前から後５時間まで２０分毎に採取
すると共に、注射後１０及び３０分後にも採取した（２１試料）。血液試料は４
℃で凝固させた。血清を遠心して回収し、−２０℃に保存じてｐＧＨアッセイを
行なった。

【００７０】 結果は図２及び３に示した。図２に示すように、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２
（４μｇ／ｋｇ）は急速にＧＨ放出を誘起し、注射後約６０分間は続いた。これ
に対して、同用量のヘキセノイル トランス３−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２を
注射すると、ＧＨレベルを約２６０分間という、より長期間に亘って増加させた
。加えて、ＧＨの最初の６０分での応答は穏やかであるため、この類似体は、注
射後は血清の中において数分か数時間でもとのＧＲＦに処理されて、ＧＲＦとし
て作用していることを示した。図３で示したのは、ＧＲＦや類似体の種々な用量
が曲線下（注射後０から３００分）のＧＨ面積に及ぼす効果であるが、ｈＧＲＦ
（１−２９）ＮＨ２は４μｇ／ｋｇではＧＨ分泌に顕著な効果を示し、０．２５
や１μｇ／ｋｇでは効果を示さなかったが、ヘキセノイル トランス３−ｈＧＲ
Ｆ（１−２９）ＮＨ２は全ての試験をした三つの用量で顕著な応答を導いた。結
論として、これらの結果はヘキサノイル トランス３−ｈＧＲＦ（１−２９）Ｎ
Ｈ２はＧＨ分泌に対し強化された効力を持つＧＲＦ類似体であることを示してお
り、血清中でも酵素的分解から保護されながらＧＲＦとして作用することが示唆
された。

【００７１】 実施例４ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２に対する（ヘキセノイル トランス−３）０ｈＧ
ＲＦ（１−２９）ＮＨ２のブタにおける皮下ＧＨ−放出効力の対比 本実験は、ヒトに生理的に近似したモデルにおいて、ＧＲＦ類似体である（ヘ
キセノイル トランス−３）０ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２の皮下急性ＧＨ−放
出効力の試験をし、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２の効力と比較する目的で行なっ
た。 試験を行なった類似体 ＴＴ−０１０２４ （ヘキセノイル トランス−３）０ｈＧＲＦ（１−２９）Ｎ
Ｈ２ ０．３１μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２４ （ヘキセノイル トランス−３）０ｈＧＲＦ（１−２９）Ｎ
Ｈ２ １．２５μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２４ （ヘキセノイル トランス−３）０ｈＧＲＦ（１−２９）Ｎ
Ｈ２ ５μｇ／ｋｇ ＴＴ−０１０２４ （ヘキセノイル トランス−３）０ｈＧＲＦ（１−２９）Ｎ
Ｈ２ ２０μｇ／ｋｇ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２ １．２５μｇ／ｋｇ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２ ５μｇ／ｋｇ ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２ ２０μｇ／ｋｇ 試験品の経路及び頻度 投与：皮下注射 試験系：Ｌａｎｄｒａｃｅ × Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ系ブタ 動物の説明：６４匹成長期去勢ブタで購入時体重が３５ｋｇ 飼料：市販の濃縮飼料（タンパク質１８％）を随意に与えた。 実験 計画：３６匹のブタ（４匹は予備）に試験前１週間内にカニューレを付けた（１
匹の頚部静脈にカテーテルを外科的に埋め込んだ）。１日目及び７日目に、カニ
ューレを付けた動物は無作為に８群に割り付けた（1群４匹）。 第１群：食塩水 第2群：ＴＴ−０１０２４ ０．３１μｇ／ｋｇ 第3群：ＴＴ−０１０２４ １．２５μｇ／ｋｇ 第４群：ＴＴ−０１０２４ ５μｇ／ｋｇ 第５群：ＴＴ−０１０２４ ２０μｇ／ｋｇ 第６群：ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２ １．２５μｇ／ｋｇ 第７群：ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２ ５μｇ／ｋｇ 第８群：ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２ ２０μｇ／ｋｇ ｐＧＨアッセイ用の血液試料はＧＲＦ注射の１時間前から注射後７時間まで２
０分毎に採取した（２５試料）。血液試料は４℃で凝固させた。血清は遠心分離
で回収し、−２０℃で保存してｐＧＨアッセイにかけた。

【００７２】 結果は図４及び図５に示した。図４で示した如く、５μｇ／ｋｇｈＧＲＦ（１
−２９）ＮＨ２の皮下注射は投与した後最初の６０分でＧＨ放出を誘導したが、
ヘキセノイル トランス３−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２での同じ量の注射では
ＧＨの応答を誘導して２４０分間持続させた。図５では、試験をしたＧＲＦの種
々な用量が試験期間全体、即ち注射後０から４２０分間に曲線下のＧＨ面積（Ａ
ＵＣ）に及ぼす効果を示した。この期間中、ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２は試験
をしたどの用量でもＧＨ応答に少しも顕著な効果を生じなかったが、ヘキセノイ
ル トランス３−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２は５及び２０μｇ／ｋｇでＧＨの
ＡＵＣに顕著な応答を引き出した。全体として、これらの結果はヘキセノイルト
ランス３−ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２は皮下投与においてさえもＧＨ分泌に高
い効力を持つことを示した。

【００７３】 実施例５ 本発明の好ましい態様では、構造式Ａの疎水性ＧＲＦ類似をが提供する。 Ｘ―――ＧＲＦ−ペプチド （Ａ） ここで、 ＧＲＦ−ペプチドは構造式Ｂのペプチドである。

【００７４】 Ａ１−Ａ２−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａ８−Ｓｅｒ−Ｔｙ
ｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａ１３−Ｌｅｕ−Ａ１５−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａ１８−Ａｌ
ａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ２４−Ａ２５−Ｉｌｅ−Ａ２７−Ａ２
８−Ａｒｇ−Ａ３０−Ｒ０ （Ｂ） ここで、 Ａ１はＴｙｒ又はＨｉｓ； Ａ２はＶａｌ又はＡｌａ； Ａ８はＡｓｎ又はＳｅｒ； Ａ１３はＶａｌ又はＩｌｅ； Ａ１５はＡｌａ又はＧｌｙ； Ａ１８はＳｅｒ又はＴｙｒ； Ａ２４はＧｌｎ又はＨｉｓ； Ａ２５はＡｓｐ又はＧｌｕ； Ａ２７はＭｅｔ，Ｉｌｅ又はＮｌｅ； Ａ２８はＳｅｒ又はＡｓｎ； Ａ３０は結合又は１〜１５残基のアミノ酸配列； Ｒ０はＮＨ２又はＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＨ２でｎ＝１〜１２及び、 Ｘはシス又はトランスＣＨ３−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−ＣＯ−又は以下に
示すシスかトランスのエナンチオマ或いはラセミ混合物から選択した成分である
。

【００７５】

【化５】

【００７６】

【００７７】 ここで、Ｒは水素又は低級アルキルである。 図６A，６CはＧＲＦ類似体のＸ部に関する具体的合成を本発明により好ましい
ラジカルＲで行なった例を示した。

【００７８】 上記番号１０（Ｒ＝ＣＨ３），１１（Ｒ＝ＣＨ３）のアシルラジカルＸはＡｌ
ｄｏｒｉｃｈ社のカタログ番号Ｔ３，８０８−３及びＴ３，８０９−１として販
売されている前駆体カルボン酸（Ｘ−ＯＨ）から得た。

【００７９】 実施例６ （＋、−）−シス−２−エチルシクロプロピル酢酸（１５）の合成 （＋、−）−シス−２−エチルシクロプロピル酢酸（１５）の合成はスキーム
１で示すように行なった。初めにジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）溶媒中、０℃
でシス−３−ヘキセン−１−オ−ルとジエチル亜鉛（Ｅｔ２Ｚｎ）をクロロヨー
ドメタン（ＣｌＣＨ２Ｉ）の存在下で反応する（Ｓｃｏｔｔ Ｅ．Ｄｅｎｍａｒ
ｋ ａｎｄ Ｊａｍｅｓ Ｐ． Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９
９１，５６，６９７４〜６９８１）と，目的のシクロプロピルアルコール（１４
）が収率９２％で得られた。このアルコールを乾燥ＤＭＦ中でジクロム酸ピリジ
ニウム（ＰＤＣ）により酸化すると（Ｃｏｒｅｙ，Ｅ．Ｊ．ａｎｄ Ｓｃｈｍｉ
ｄｔ， Ｇ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９７９， ３９９〜４
０２）、（＋、−）−シス−２−エチルシクロプロピル酢酸（１５）が収率６６
％で得られた。

【００８０】

【化６】

【００８１】 （＋、−）−シス−２−エチルシクロプロピル酢酸（１５）の調製 １．シクロプロピルアルコール（１４）の調製 ２５０ｍＬの一口フラスコの中で，乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（７０ｍL）にＥｔ２Ｚ
ｎ（４．０ｍL；４０ｍｍｏｌ；２当量）を溶かした液を０℃まで冷却し、それ
にＣｌＣＨ２Ｉ（５．８ｍL；８０ｍｍｏｌ；４当量）をシリンジで添加する。
溶液は０℃で５分間攪拌すると、沈殿が生じるが、これにシス−３−ヘキセン−
１−オール（２．０ｇ、２０ミリモル）のＣＨ２Ｃｌ２（３２ｍｌ）溶液をカニ
ューラで添加する。反応混合液は０℃で９０分間攪拌した後、飽和塩化アンモニ
ウム（ＮＨ４Ｃｌ）水溶液（１００ｍL）を加えて冷却する。溶液は室温まで温
めた後、１０分間激しく攪拌し、ＣＨ２Ｃｌ２（３×６０ｍL）で抽出した。抽
出物は水（１×２０ｍL）及び塩水（１×２０ｍL）で洗浄した後、合わせて硫酸
マグネシウム（ＭｇＳＯ４）で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣はシリカクロマ
トグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル（ＡｃＯＥｔ）、８／２）で精製すると２
．１０ｇ（９２．３％）の透明無色の液体として目的生成物（１４）が得られた
。 Ｒｆ＝０．２２（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ、８／２） 特性値：核磁気共鳴（Ｎｍｒ）（¹Ｈ、¹³C）、赤外吸収スペクトル（ｉｒ）、質
量分析（ｍｓ） ２．（＋、−）−シス−２−エチルシクロプロピル酢酸（１５）の調製 アルコール（１４）（２．３０ｇ；１９．８ｍミリモル）を乾燥ＤＭＦ（９６
ｍL）に溶解し、これにＰＤＣ（３．５当量、２６ｇ）を一度に加えた。反応混
合物は一昼夜室温で攪拌した後、３００ｍｌの水中に注入し、エーテル（４×８
０ｍL）で抽出した。有機溶媒相は合わせた後、塩水で洗浄し、減圧下で濃縮し
た。残渣はクロロホルム（ＣＨＣｌ３）（３０ｍL）に溶解し、溶液を２５ｍｌ
の１０％水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液で２回抽出した。合わせた水相を
ＣＨＣｌ３（２×２５ｍL）で抽出し、１０％塩酸（ＨＣｌ）水溶液で酸性にし
た後、エーテル（４×５０ｍL）で抽出した。合わせた有機溶媒相をＭｇＳＯ４
で乾燥した後、ろ過し、減圧下で濃縮すると目的生成物（＋、−）−シス−２−
エチルシクロプロピル酢酸（１５）が無色油状物（１．７ｇ、６６％）として得
られた。 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ、¹³C）、ｉｒ、ｍｓ 実施例７ （１Ｒ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル酢酸（２２）及び（１Ｒ，２Ｒ）−
２−エチルシクロプロピル酢酸（２４）の合成 光学的に純粋なシス及びトランス酸（１Ｒ、２Ｒ）−２−エチルシクロプロピ
ル酢酸（２４）及び（１Ｒ、２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル酢酸（２２）の
合成をＣｈａｒｅｔｔｅ（Ｃｈａｒｅｔｔｅ，Ａ．Ｂ．；Ｊｕｔｅａｕ，Ｈ．；
Ｌｅｂｅｌ，Ｈ．；及びＭｏｌｉｎａｒｏ Ｃ． Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ
． １９９８，１２０，１１９４３〜１１９５２）の方法で行なった。これを行
なう際には、キラルなジオキサボロラン配位子（２０）が必要であった。 １．ジオキサボロラン配位子（２０）の合成 この合成（スキーム２）は臭化ブチルマグネシウムをほう酸トリメチルと処理
した後、酸による加水分解でブチルボロン酸（１８）を調製することで開始した
。ブチルボロン酸が脱水してボロキシンになるのを避けるために、それをジエタ
ノールアミン錯体（１９）とした。（Ｒ，Ｒ）−（＋）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テ
トラメチル酒石酸ジアミド（１６）はＳｅｅｂａｃｈの方法（Ｓｅｅｂａｃｈ，
Ｄ．，； Ｋａｌｉｎｎｏｗｓｋｉ，Ｈ．−Ｏ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｗ．； Ｗｉ
ｌｋａ，Ｅ．−Ｍ．Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ；Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ
Ｙｏｒｋ，１９９０；Ｃｏｌｌ．Ｖｏｌ．ＶＩＩ，ｐｐ４１〜５０）を用い（
Ｒ，Ｒ）−（＋）−酒石酸ジメチルとジメチルアミンを縮合して得た。

【００８２】 ジエタノールアミン複合体（１９）を少し過剰の（Ｒ，Ｒ）−（＋）−Ｎ，Ｎ
，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル酒石酸ジアミド（１６）と二相媒体中で処理すると、
反応して目的のキラルなジオキサボロラン配位子（２０）が９3％の収率で得ら
れた。

【００８３】

【化７】

【００８４】 ２．（１Ｒ、２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル酢酸（２２）の合成 ジオキサボロラン配位子（２０）が得られたので、スキーム３で示した如く、
（１Ｒ、２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル酢酸（２２）の合成を行なった。Ｃ
Ｈ２Ｃｌ２の中に入れたジオキサボロラン（２０）配位子及び亜鉛試薬である（
Ｚｎ（ＣＨ２Ｉ）２ＤＭＥ）（Ｅｔ２Ｚｎ，ＣＨ２Ｉ２及びＤＭＥの混合物から
得た）の混合物に−１０℃でホモアリルアルコールであるトランス−３−ヘキセ
ン−１−オルを加えた。均一な溶液は室温まで温め、一晩攪拌した。非酸化的に
混合し、Ｋｕｇｅｌｒｏｈｒ蒸留すると目的の生成物（２１）が収率７９％で得
られた。最後にアルコール（２１）をＰＤＣ酸化すると（１Ｒ、２Ｓ）−２−エ
チルシクロプロピル酢酸が３９．７％の収率で得られた（スキーム３）。

【００８５】

【化８】

【００８６】 ３．（１Ｒ、２Ｒ）−２−エチルシクロプロピル酢酸（２４）の合成 光学的活性な（１Ｒ、２Ｒ）−２−エチルシクロプロピル酢酸（２４）の合成
は（スキーム４）、（１Ｒ、２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル酢酸（２２）を
合成する際に用いたのと同じ方法で行なった。

【００８７】

【化９】

【００８８】 （１Ｒ、２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル酢酸（２２）及び（１Ｒ、２Ｒ）−
２−エチルシクロプロピル酢酸（２４）の調製 １．ジオキサボロラン配位子（２０）の調製 １．１臭化ブチルマグネシウム（１７）の調製 マグネチックスターラー、１２５ｍＬの圧力平衡式滴下ロート、還流冷却器及
びガラス栓を備えた１Ｌの３口丸底フラスコに３４．０ｇ（１．４０ｍｏｌ）の
マグネシウム削りくずを加える。攪拌を開始し、系を２分間炎で乾燥した。フラ
スコを窒素気流中で室温まで冷却し、６０ｍLのエーテルをマグネシウムが覆わ
れるまで加える。１４０ｍLのエーテルに４８ｍL（０．４４ｍｏｌ）のブロモブ
タンを溶かした溶液を圧力平衡式滴下ロートに入れる。混合物はゆっくり加熱し
て反応を開始する。反応開始してから、ゆっくりした還流が保てるようにエーテ
ル中の臭素溶液を滴下する。添加が終了した後、ロートは１０ｍLのエーテルで
洗浄する。灰色の溶液を２０分間攪拌してから窒素気流中、カニューラで乾燥フ
ラスコへ移す。グリニャール試薬は１，１０−フェナントロリンを指示薬として
イソプロパノールのベンゼン溶液で以下のようにして滴定する。即ち乾燥した１
０ｍＬの一口丸底フラスコに１ｍLのグリニャール試薬、乾燥ＴＨＦを数滴及び
１，１０−フェナントロリンの結晶を入れる。僅かにピンクの溶液を乾燥ベンゼ
ンに溶かした０．５Ｍイソプロパノールで滴定する。透明無色溶液になるには３
．８から４．２ｍＬであった（３回の滴定）。１．９０〜２．００Ｍのグリニャ
ール試薬の溶液が得られた。 １．２ブチルボロン酸（１８）の調製 マグネチックスターラー及び温度計を備えた１Ｌの三口丸底フラスコに、４８
０ｍＬのエーテル、次いで２０ｍL（１７６ｍｍｏｌ）のほう酸トリメチルを加
えた。透明な溶液を−７５℃（内部温度）まで冷却し、激しく攪拌しながらエー
テルに溶かした１．９５Ｍ臭化ブチルマグネシウム９０ｍＬ（１７６ｍｍｏｌ）
をカニューラにより内部温度が−６５℃を越えないような速度で滴下した。添加
終了後、得られた白いスラリーを窒素下−７５℃で更に２時間攪拌した。冷却浴
を除去し、反応混合物は室温まで温める（１〜２時間必要）。ＨＣｌの１０％水
溶液を２００ｍＬ滴下して加水分解を行なった。白色沈殿が溶解し、生じた透明
な二相性混合物を１５分間攪拌した後、二相を分離した。水溶液相をエーテルで
抽出（２×１００ｍL）し、合わせた抽出液をＭｇＳＯ４で乾燥した。エーテル
溶液を減圧下で濃縮した後、残留した白色固体を次のように再結晶した：熱水（
５０ｍＬ）に溶解した後、得た二相溶液を０℃まで冷却し、ボロン酸を再結晶し
た。固体を中型フリット円形ロートに集め、１００ｍＬのヘキサンで洗浄し、６
０分間減圧下に放置した。１３．６ｇのボロン酸（１８）が白色固体として生成
した。 収率：７４．８８％ 融点：９４〜９６℃（文献融点：９５〜９７℃）（Ｃｈａｒｅｔｔｅ，Ａ．Ｂ．
；Ｊｕｔｅａｕ，Ｈ．；Ｌｅｂｅｌ，Ｈ．；ａｎｄ Ｍｏｌｉｎａｒｏ Ｃ．Ｊ
．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，１１９４３〜１１９５２） 特性値：Nmｒ（¹Ｈ） １．３［（２−）−Ｎ，Ｏ，Ｏ'［２，２'−イミノビス［エタノラト］］］−２
−ブチルボロン（１９）の調製 マグネチックスターラー及び温度計を備えた１Ｌの一口丸底フラスコに窒素雰
囲気中、ブチルボロン酸（１８）１３．６ｇ（１３３ｍｍｏｌ）及びジエタノー
ルアミン１４．０ｇ（１３４ｍｍｏｌ）を加えた。そしてＣＨ２Ｃｌ２１３３ｍ
Ｌ及びエーテル２６５ｍＬを加え、次いでモレキュラーシーブ３Å（粉末状、一
夜オーブン中２５０℃で乾燥）約２７ｇを加えた。得られた不均一な溶液を窒素
雰囲気中で１日攪拌した。そして固体をＣＨ２Ｃｌ２（２×１００ｍＬ）で粉末
化した。ろ液を減圧下で濃縮すると、粗な目的錯体が生成した。ジエタノールア
ミン錯体は次ぎのように再結晶で精製する：白色固体を熱ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍ
Ｌ）に溶解し、次いでエーテル（１００ｍＬ）を加えて錯体の結晶化を行なう。
混合物を０℃に冷却し、固体を中型フリット円形ロート上に集め、エーテル（２
×６０ｍＬ）で洗浄した。生成物を減圧で乾燥すると、標記化合物（１９）１８
．３１ｇが白色固体として得られた。 収率：８０％ 融点：１４３〜１４５℃（文献値：１４５〜１４８℃）（Ｃｈａｒｅｔｔｅ，Ａ
．Ｂ．，Ｊｕｔｅａｕ，Ｈ．，Ｌｅｂｅｌ，Ｈ．；ａｎｄ Ｍｏｌｉｎａｒｏ Ｃ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，１１９４３〜１１９５２
）。 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ） １．４ （Ｒ，Ｒ）−（＋）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル酒石酸ジアミド
（１６）の調製 ２５０ｍＬエーレンマイヤーフラスコ中に入れた６８ｇ（３８１ｍｍｏｌ）の
酒石酸ジメチル及び７７ｍＬの分光用メタノールに、少なくとも１００ｍＬの液
体無水冷（−７８℃）ジメチルアミン（−７８℃でジメチルアミンガスを濃縮し
て得た）を加えた。混合物を少し回転させ、適当なところに乾燥管を付けてフー
ドの中で３日間放置した。結晶化後、塊状の結晶を吸引ろ過して集めた。ろ液は
濃縮し、種を入れて、冷却して結晶を得た。合わせた結晶は冷メタノール（−３
０℃）で洗浄し、減圧で乾燥した。得られたジアミド（１６）は充分に純粋なの
で次の段階に使えた。 収率：９０％ 融点：１８８〜１８９℃（文献値：１８９〜１９０℃）（Ｓｅｅｂａｃｈ，Ｄ．
；Ｋａｌｉｎｏｗｓｋｉ，Ｈ．−Ｏ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｗ．；Ｗｉｌｋａ，Ｅ．
−Ｍ． Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ；Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ
，１９９０；Ｃｏｌｌ．Ｖｏｌ．ＶＩＩ，ｐｐ４１−５０）。 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ） １．５ （４Ｒ−トランス）−２−ブチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチル［
１，３，２］ジオキサ−ボロラン［４，５］ジカルボキシアミド（２０）の調製 マグネチックスターラーを備えた５００ｍＬの一口丸底フラスコに窒素雰囲気
中、７．００ｇ（４０．９ｍｍｏｌ）のほう酸ブチルジエタノールアミン（１９
）錯体及び１１ｇ（５３．８ｍｍｏｌ）の（Ｒ，Ｒ）−（＋）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，
Ｎ'−テトラメチル酒石酸ジアミド（１６）を加えた。固体は２０５ｍＬのＣＨ
２Ｃｌ２を添加して溶解した。それから６４ｍＬの塩水を加え、生じた二相溶液
を窒素雰囲気中で２時間４５分攪拌した。二相を分離し、水相はＣＨ２Ｃｌ２（
５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を塩水（５０ｍＬ）で洗浄、ＭｇＳＯ４
で乾燥し、ろ過した。ろ液は減圧下で濃縮し、減圧で乾燥すると標記化合物（２
０）が淡黄色油状物として１０．２ｇ得られた。 収率：９２％（文献値９３％）（Ｃｈａｒｅｔｔｅ，Ａ．Ｂ．；Ｊｕｔｅａｕ，
Ｈ．，；Ｌｅｂｅｌ，Ｈ．；ａｎｄ Ｍｏｌｉｎａｒｏ Ｃ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，１１９４３〜１１９５２）。 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ、¹³Ｃ）、ｉｒ，ｍｓ ２．（１Ｒ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル酢酸（２２） ２．１ （１Ｒ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピルエタノール（２１） マグネットスターラー及び温度計を備えた２５０ｍＬの三口丸底フラスコに、
窒素雰囲気中乾燥ジクロロメタン４５ｍＬ及び乾燥ＤＭＥ４．６ｍＬ（４５ｍｍ
ｏｌ、４．５当量）を加えた。溶液をアセトン／氷浴で−１０℃（内部温度）に
冷却し、亜鉛ジエチル（Ｅｔ２Ｚｎ）４．６ｍＬ（４５ミリモル、４．５当量）
を加えた。攪拌しているこの溶液にジヨードメタン（ＣＨ２Ｉ２）７．２ｍＬ（
９０ｍｍｏｌ、９当量）を１時間かけ、内部温度を−８〜−１２℃に保ちながら
加えた。添加後、得た溶液を−１０℃で１０分間攪拌した。ジオキサボロラン（
２０）配位子３．３６ｇ（１０．８ｍｍｏｌ、１．２当量）のＣＨ２Ｃｌ２（１
０ｍＬ）溶液を窒素雰囲気中５〜６分間かけ、内部温度を−５℃以下に保ちなが
らカニューラを通して加えた。直ちに１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２にシス−３−ヘキ
セン−１−オル１．００ｇ（１０ｍｍｏｌ）を溶かした溶液を窒素雰囲気中、内
部温度を−５℃以下に保ったままで５〜６分かけてカニューラを通して加えた。
冷却浴を除去し、反応混合物を室温まで温め、室温で一夜攪拌した。

【００８９】 反応は飽和塩化アンモニウム（ＮＨ４Ｃｌ）水溶液（１０ｍＬ）及び１０％塩
酸（４０ｍＬ）を加えて終了させた。二相は分離し、水相はＣＨ２Ｃｌ２（５０
ｍＬ）で洗浄した。有機相を合わせてエーレンマイヤーフラスコに移し、５Ｍ水
酸化カリウム水溶液（２００ｍＬ）を加えた。得られた二相の溶液につき一晩激
しく攪拌した。

【００９０】 二相は分離し、有機相は飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（３×５０ｍＬ）及び塩水（１
０ｍＬ）で連続して洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥した後、ろ過して減圧下濃縮し
た。残渣はフラッシュクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン、２／８）を
行い、次いでＫｕｇｅｌｒｏｈｒ蒸留（１５０〜１６０℃）すると、目的のシク
ロプロパン誘導体（２１）が得られた（０．９ｇ）。 Ｒｆ：０．３３（ＡｃＯＥｔ／ヘキサン、２／８） 収率：７９％ ［α］Ｄ＝＋１５．６°（ｃ＝１．６６、クロロホルム） 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ、¹³Ｃ）、ｉｒ，ｍｓ ２．２（１Ｒ，２Ｓ）−２−エチルシクロプロピル酢酸（２２）の調製 マグネチックスターラーを備えた２５０ｍＬの一口丸底フラスコに、窒素雰囲
気中でアルコール（２１）１．６５ｇ（１４．３ｍｍｏｌ）及び乾燥ＤＭＦ４０
ｍＬを加えた。ＰＤＤ１８．８ｇ（３．５当量；５０．１ｍｍｏｌ）を一度に加
えた。反応混合物は２５℃で一夜攪拌し、２００ｍＬの水中に投入し、エーテル
（４×８０ｍＬ）で抽出した。有機相は減圧で濃縮し、残渣はＣＨＣｌ３（５０
ｍＬ）に溶解して１０％水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）水溶液（２×２５ｍＬ）
で抽出した。合わせた水相は２５ｍLのＣＨＣｌ３で２回洗浄した後、１０％塩
酸（ＨＣｌ）水溶液で酸性とした。エーテル（４×５０ｍＬ）で抽出、ＭｇＳＯ
４上で乾燥、ろ過した後、減圧で濃縮すると、目的化合物（１Ｒ，２Ｓ）−２−
エチルシクロプロピル酢酸（２２）が無色の油とした得られた（７３７ｍｇ）。 収率：３９．７％ ［α］Ｄ＝＋７．７°（ｃ＝３．５、ＣＨＣｌ３） 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ、¹³Ｃ）、ｉｒ，ｍｓ ３．（１R，２Ｒ）−２−エチルシクロプロピル酢酸（２４）の調製 ３．１（１Ｒ，２Ｒ）−２−エチルシクロプロピルエタノール（２３） マグネチックスターラー及び温度計を備えた２５０ｍＬの三口丸底フラスコに
、窒素雰囲気中で４５ｍＬの乾燥ＣＨ２Ｃｌ２及び４．６７ｇ（４５ｍｍｏｌ、
４．５当量）乾燥ＤＭＥを加えた。溶液をアセトン／氷浴で−１０℃（内部温度
）まで冷却し、４．６ｍＬ（４５ｍｍｏｌ、４．５当量）のＥｔ２Ｚｎを加えた
。攪拌しているこの溶液にジヨードメタン（ＣＨ２Ｉ２）７．２ｍＬ（９０ｍｍ
ｏｌ、９当量）を１時間かけ、内部温度を−８と−１２℃の間に保ちながら加え
た。添加終了後、得られた溶液は１０分間−１０℃で攪拌した。３．３６ｇ（１
０．８ｍｍｏｌ、１．２当量）のジオキサボロラン（２０）配位子のＣＨ２Ｃｌ
２（１０ｍＬ）溶液につきカニューラを通して窒素雰囲気中、内部温度を−５℃
以下に保ちながら５〜６分で添加した。直ちに１．００ｇ（１０ｍｍｏｌ）のト
ランス−３−ヘキセン−１−オールのＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液をカニュー
ラを通して窒素雰囲気下５〜６分間で、内部温度を−５℃以下に保ちながら加え
た。冷却浴を除去し、反応混合液を室温まで温め、その温度で一夜攪拌した。

【００９１】 反応は飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（１０ｍL）及び１０％ＨＣｌ水溶液（４０ｍL）
で終了させた。二相は分離し、水相はＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）で洗浄した。合
わせた有機相をエーレンマイヤーフラスコに移し、５Ｍ水酸化カリウム（ＫＯＨ
）２００ｍＬを加えた。生じた二相溶液を激しく一晩攪拌した。二相を分離し、
有機相は飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（３×５０ｍＬ）及び塩水（１０ｍＬ）で洗浄し
、ＭｇＳＯ４上で乾燥、ろ過した後、減圧で濃縮した。残渣はフラッシュクロマ
トグラフィー（ＡｃＯＥｔ／ヘキサン、２／８）で精製した後、Ｋｕｇｅｌｒｏ
ｈｒ蒸留（１５０〜１６２℃）を行なうと、目的のシクロプロパン誘導体（２３
）が得られた（１．０６ｇ）。 Ｒｆ：０．３３（ＡｃＯＥｔ／ヘキサン、２／８） 収率：９３％ ［α］Ｄ＝＋６．２２°（ｃ＝２．２５、クロロホルム）（文献値［α］Ｄ＝＋
９．６°（ｃ＝０．３、ＣＨＣｌ３）（Ｃｈａｒｅｔｔ，Ａ．Ｂ．，Ｊｕｔｅａ
ｕ，Ｈ．；Ｌｅｂｅｌ，Ｈ．；ａｎｄ Ｍｏｌｉｎａｒｏ Ｃ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈ
ｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，１１９４３〜１１９５２）。 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ、¹³Ｃ）、ｉｒ，ｍｓ （１Ｒ，２Ｒ）−２−エチルシクロプロピル酢酸（２４）の調製 マグネチックスターラーを備えた２５０ｍＬの一口丸底フラスコに、窒素雰囲
気中で１．７ｇ（１４．９ｍｍｏｌ）の アルコール（２３）と４０ｍＬのＤＭ
Ｆを加えた。ジクロム酸ピリジニウム１９．６ｇ（３．５当量；５２．１ｍｍｏ
ｌ）を一度に加えた。反応混合物を２５℃で一夜攪拌した後、２００ｍＬの水に
投入し、エーテル（４×８０ｍＬ）で抽出した。有機相は減圧で濃縮し、残渣は
ＣＨＣｌ３（５０ｍＬ）に溶解した後、１０％ＮａＯＨ水溶液（２×２５ｍＬ）
で抽出した。合わせた水相を２５ｍＬのＣＨＣｌ３で洗浄した後、１０％ＨＣｌ
水溶液で酸性とした。エーテル（４×５０ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥、
ろ過し、減圧で濃縮すると、目的化合物（１Ｒ，２Ｒ）−２−エチルシクロプロ
ピル酢酸（２４）が無色液体で得られた（１．０５ｇ）。 収率：５５．５％ ［α］Ｄ＝＋４．３６°（ｃ＝１．８３、クロロホルム） 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ、¹³Ｃ）、ｉｒ，ｍｓ 実施例７ （１Ｓ，３Ｒ）及び（１Ｒ，３Ｒ）−３−メチルシクロペンチル酢酸（２７）
の（１：１）混合物の合成 （１Ｓ，３Ｒ）及び（１Ｒ，３Ｒ）−３−メチルシクロペンチル酢酸（２７）
の（１：１）混合物をスキーム５の概略に従って合成した。Ｗｉｔｔｉｇ−Ｈｏ
ｒｎｅｒ］（Ｄｕｒａｉｓａｍｙ，Ｍ．ａｎｄ Ｗａｌｂｏｒｓｋｙ Ｈ．Ｍ．
Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ １９８３， １０５， ３２５２〜３２６４）反
応では（Ｒ）（＋）−３−メチルシクロペンタノン及びホスホノ酢酸トリエチル
を縮合すると（Ｅ及びＺ，３Ｒ）−（３−メチルシクロペンチリデン）カルボン
酸エチルが１：１混合物で生成する。α、β−不飽和エステル（２５）の水素添
加は立体制御なしに進み、エステル（２６）の１：１混合物が定量的に得られた
。アルコール性ＫＯＨによるエステル（２６）の加水分解は、目的の（１Ｓ，３
Ｒ）及び（１Ｒ，３Ｒ）−３−メチルシクロペンチル酢酸（２７）の１：１混合
物が収率９２％で得られた。

【００９２】

【化１０】

【００９３】 （１Ｓ，３Ｒ）及び（１Ｒ，３Ｒ）−３−メチルシクロペンチル酢酸（２７）の
（１：１）混合物の調製 マグネチックスターラーを備えた１００ｍＬの一口丸底フラスコに、６１１ｍ
ｇ（１５．８ｍｍｏｌ）の鉱油中に分散した６０％水素化ナトリウム（ＮａＨ）
を６１１ｍｇ（１５．８ｍｍｏｌ）を添加した。鉱油はペンタンで２回洗浄して
除去した。乾燥ＴＨＦ２１ｍLを加え、懸濁液は窒素雰囲気に置いた。フラスコ
を氷浴で０℃に冷却後，ホスホノ酢酸トリエチル３．４３ｇ（１５．２ｍｍｏｌ
）をゆっくり添加した。攪拌を３５分間続け、それにＲ−（＋）−３−メチルシ
クロペンタノン（１．５１ｇ；１５．２ｍｍｏｌ）を加え、更に１時間温度を室
温に維持すると、ゼラチン状沈殿が生じる。エーテル（１００ｍＬ）及び水（５
０ｍＬ）を加えて反応を終了させた。混合物は分液ロートへ移し、水と塩水で２
回洗浄した。有機溶媒をＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過して減圧で濃縮した。残渣は
フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ、９／１）で精製すると
、目的の生成物（２５）が無色透明液体として２．４ｇ（９６％）得られた。 Ｒｆ：０．５３（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ、９／１） 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ、¹³Ｃ）、ｉｒ，ｍｓ ２．エステル（２６）の調製 α，β−不飽和エステル（２５）（１．３ｇ；７．７ｍｍｏｌ）の無水エタノ
ール（６８ｍＬ）溶液を攪拌している中に１０％パラジウム担持炭素（Ｐｄ／Ｃ
）１６３ｍｇを添加した。混合物は一夜、水素雰囲気中で攪拌した。触媒はセラ
イトパッドでろ過して除去した。ろ液は濃縮し、残渣の無色油のエステル（２６
）は精製することなく次の段階に使用した。 収率：１．２ｇ（９２％） 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ、¹³Ｃ）、ｉｒ，ｍｓ ３．（１Ｓ，３Ｒ）及び（１Ｒ，３Ｒ）−３−メチルシクロペンチル酢酸（２７
）の（１：１）混合物の調製 エステル（２６）（１．２０ｇ；７．０５ｍｍｏｌ）のエタノール（５０ｍＬ
）溶液に１０％ＫＯＨ水溶液１５ｍＬを加えた。反応混合物は還流下で５時間攪
拌した。それからエタノールを真空で蒸発させ、残渣をエーテル（２０ｍＬ）で
抽出した。水相は１０％ＨＣｌ水溶液で酸性とし、エーテル（３×５０ｍＬ）で
抽出した。合わせた有機相はＭｇＳＯ４で乾燥、ろ過し、減圧で濃縮すると、無
色油状物として（１Ｓ，３Ｒ）及び（１Ｒ，３Ｒ）−３−メチルシクロペンチル
酢酸（２７）の（１：１）混合物が９２０ｍｇ（収率９２％）得られた。 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ、¹³Ｃ）、ｉｒ，ｍｓ 実施例８ ビシクロ［４．１．０］ヘプチル酢酸（３１）の合成 化合物（３１）はスキーム６で概略した４段階で調製した。Ｗｉｔｔｉｇ−Ｈ
ｏｒｎｅｒの製法（Ｄｕｒａｉｓａｍｙ，Ｍ．ａｎｄ Ｗａｌｂｏｒｓｋｙ Ｈ
．Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９８３，１０５，３２５２〜３２６４）
をシクロヘキサノンに対してホスホノ酢酸トリエチル（ＮａＨ、ＴＨＦ）を応用
すると、α，β−不飽和エステル（２８）が収率８８％で得られた。目的のβ，
γ−不飽和エステル（２９）は、α，β−不飽和エステル（２８）から飽和ＮＨ
４Ｃｌによる−７８℃での拡張エノラート（ＬＤＡ，ＴＨＦ）の動力学的捕獲法
により調製できた。ＣＨ２Ｃｌ２中、０℃でのＥｔ２Ｚｎ／ＣｌＣＨ２Ｉによる
シクロプロパネーション（Ｓｃｏｔｔ Ｅ． Ｄｅｎｍａｒｋ ａｎｄ Ｊａｍ
ｅｓ Ｐ． Ｅｄｗａｒｄｓ Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． １９９１，５６，６９
７４〜６９８１）によりシクロプロピル（３０）が収率９１．５％で生成した。
ＫＯＨ／エタノールによるエステル（３０）のけん化後、酸性にすると（３１）
が収率９２％で得られた（Ｋａｎｔｏｒｏｗｓｋｉ，Ｅ．Ｊ．；Ｅｉｓｅｎｂｅ
ｒｇ，Ｓ．Ｗ．Ｅ．；Ｆｉｎｋ，Ｗ．Ｈ．；ａｎｄ Ｋｕｒｔｈ，Ｍ．Ｊ．Ｊ．
Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９９，６４，５７０〜５８０）。

【００９４】

【化１１】

【００９５】 ビシクロ［４．１．０］ヘプチル酢酸（３１）の調製 １．α，β−不飽和エステル（２８）の調製 マグネチックスターラーを備えた２００ｍＬの一口丸底フラスコに、鉱油に分
散した６０％ＮａＨ１．２２ｇ（３０．５ｍｍｏｌ）を加えた。鉱油はペンタン
で２回洗浄して除いた。乾燥ＴＨＦ（５０ｍＬ）を加え、懸濁液は窒素雰囲気と
した。氷浴で０℃に冷却した後、ホスホノ酢酸トリエチル６．８５ｇ（３０．５
ミリモル）を徐々に加えた。攪拌を３０分間行い、それからシクロヘキサノン（
３．００ｇ；３０．５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１時間室温に保つと、ゼ
ラチン状の沈殿が生じた。エーテル（５０ｍＬ）及び水（５０ｍＬ）を加えて反
応を終了させた。混合物を分液ロートに移し、水と塩水で２回洗浄した。有機溶
液はＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過、減圧で濃縮した。残渣はフラッシュクロマトグ
ラフィー（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ、９．５／０．５）で精製すると、無色油状の
目的の生成物（２８）が４．５２ｇ（８８％）得られた。 Ｒｆ：０．５６（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ、９．５／０．５） 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ、¹³Ｃ）、ｉｒ，ｍｓ ２．β，γ−不飽和エステル（２９）の調製 乾燥ＴＨＦ（９０ｍＬ）にジイソプロピルアミン（３．３３ｍＬ；２３．７ｍ
ｍｏｌ）を溶かした溶液を０℃に保ち、これにｎ−ブチルリチウム（１１．９ｍ
Ｌ；２３．７ｍｍｏｌ）を徐々に加えた。溶液は２０分攪拌し、−７８℃に冷却
した。ＴＨＦ（９ｍＬ）に溶かしたα，β−不飽和エステル（２８）（２．００
ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）を１０分間で滴下し、混合物はその温度で３０分間攪拌
した。飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（２０ｍＬ）を１０分間で滴下し、反応終了した溶
液は室温まで温めた後、水（１０ｍＬ）に投入し、エーテル（３×５０ｍＬ）で
抽出した。抽出物はＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、濃縮すると、β，γ−不飽和
：α，β−不飽和エステル（ｎｍｒ）の混合物（４：１）が黄色油状物質として
得られた。フラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ、９．６５／
０．３５）により１ｇ（５０％）の目的生成物（２９）が透明無色油状物として
得られた。 Ｒｆ：０．４４（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ、９．５／０．５） 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ、¹³Ｃ）、ｉｒ，ｍｓ ３．シクロプロピルエステル（３０）の調製 Ｅｔ２Ｚｎ（１．２７ｍＬ；１１．０ｍｍｏｌ；２当量）の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２
（２０ｍＬ）溶液を入れた１００ｍＬの一口フラスコを０℃に冷却し、ＣｌＣＨ
２Ｉ（１．６ｍＬ；２２ｍｍｏｌ；４当量）溶液をシリンジで添加した。溶液を
０℃で５分間攪拌して沈殿が生成したときに、β，γ−不飽和エステル（２９）
（９２４ｍｇ，５．４９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）をカニューラを通
して添加した。反応混合物は０℃で６０分間攪拌し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液（６
０ｍＬ）で反応を終了させた。溶液は室温まで温め、１０分間激しく攪拌し、そ
してエーテル（３×２０ｍＬ）で抽出した。抽出物は水（１×２０ｍＬ）及び塩
水（１×２０ｍＬ）で洗浄し、合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、減圧で濃縮した。
残渣はフラッシュクロマトグラフィー（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ、９．５／０．５
）で精製すると、９１５ｍｇ（９１．５％）の目的化合物（３０）が透明無色液
体で得られた。 Ｒｆ：０．４４（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ、９．５／０．５） 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ、¹³Ｃ）、ｉｒ，ｍｓ ４．ビシクロ［４．１．０］ヘプチル酢酸（３１）の調製 塩基性エタノール（２７ｍＬの９５％エタノール中２．０９ｇＫＯＨ）に溶か
したエステル（３０）（６００ｍｇ，３．２９ミリモル）を室温で一夜攪拌した
。反応物はエーテルで希釈し、ＮａＯＨ水溶液（２Ｍ，２×５０ｍＬ）で抽出し
、合わせた抽出物は１０％ＨＣｌ水溶液で酸性にした後、エーテル（３×４０ｍ
L）で抽出した。有機相を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥、ろ過し、濃縮すると、目
的物（３１）が淡黄色液体として得られた（４６７ｍｇ；９２％）。 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ、¹³Ｃ）、ｉｒ，ｍｓ 実施例９ （１Ｓ，３Ｒ）−３−メチルシクロヘキシル酢酸（３６）の合成 最終的に、（１Ｓ，３Ｒ）−３−メチルシクロヘキシル酢酸（３６）の合成を
スキーム７で表したように行なった。最初に、（Ｒ）−（＋）−３−メチルシク
ロヘキサノンをＢｒｏｗｎの方法（Ｂｒｏｗｎ，Ｈ．Ｃ．；Ｊａｄｈａｖ，Ｐ．
Ｋ．Ｉｎ“Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ"Ｍｏｒｉｓｓｏｎ，Ｊ
．Ｄ．，Ｅｄ．，；Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８
３；Ｖｏｌ．ＩＩ，Ｃｈａｐｔｅｒ１；Ｂｒｏｗｎ，Ｈ．Ｃ．；Ｄｅｓａｉ，Ｍ
．Ｃ．；Ｐ．Ｋ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ． １９８２，４７，５０６５〜５０６
９）で還元して（３Ｒ，１Ｒ）−３−メチルシクロヘキサノール（３２）を得た
。

【００９６】 光学活性（３２）はメシラート化し、乾燥ＤＭＦ中でマロン酸ジメチルナトリ
ウム塩と８０〜９０℃で反応すると、目的のジエステル（３４）が収率３１％で
得られた。ジエステル（３４）のアルコール性KOHで加水分解すると、ジカルボ
ン酸（３５）が得られ、比較的強烈な条件（濃硫酸のジオキサン／水混合液中で
２日還流下）で脱カルボニルを行なうと目的の化合物（１Ｓ，３Ｒ）−３−メチ
ルシクロヘキシル酢酸（３６）が収率７４．８％で得られた。

【００９７】

【化１２】

【００９８】 （１Ｓ，３Ｒ）−３−メチルシクロヘキシル酢酸（３６）の調製 １．アルコール（３２）の調製 Ｒ−（＋）−３−メチルシクロヘキサノン（３．５０ｇ；３１．１ｍｍｏｌ）
の乾燥ＴＨＦ（４０ｍＬ）溶液を攪拌し、１．０ＭＬ−セレクトリドのＴＨＦ（
６３ｍＬ，６３ｍｍｏｌ）溶液により−７８℃で処理した。その温度で攪拌を２
時間行なった後、２MＮａＯＨ水溶液（３３ｍＬ）を加え、次いで３０％過酸化
水素（Ｈ２Ｏ２）を２３ｍＬ加えた。室温まで温めた後、反応混合物は１０％Ｈ
Ｃｌ水溶液で処理し、生成物をエーテル（３×８０ｍＬ）で抽出して単離した。
抽出物は合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過して真空で濃縮した。残渣はフラッ
シュクロマトグラフィー（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ、８／２）で精製すると、目的
生成物（３２）が透明無色油状物として２．７０ｇ（７５％）得られた。 Ｒｆ：０．５２（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ、８／２） ［α］Ｄ＝−２．９０°（ｃ＝７．９、クロロホルム） 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ、¹³Ｃ）、ｉｒ，ｍｓ ２．メシラート（３３）の調製 （１Ｒ，３Ｒ）−（−）−３−メチルシクロヘキサノール（３２）（１．２７
ｇ；１１．１ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（４５ｍＬ）溶液に攪拌しながらト
リエチルアミン（Ｅｔ３Ｎ）（２．３当量；２５．７ｍｍｏｌ；３．５８ｍL）
及び塩化メタンスルホニル（１．２当量；１３．４ｍｍｏｌ；１．００ｍＬ）を
０℃で滴下して加えた。反応混合物は０℃で１時間攪拌した後、ＣＨ２Ｃｌ２（
８０ｍＬ）及び１０％ＨＣｌ水溶液（５０ｍＬ）で希釈した。水相をＣＨ２Ｃｌ
２（５０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機相を連続的に飽和ＮａＨＣＯ３（１×
２０ｍＬ）及び塩水（１×２０ｍＬ）で洗浄した後、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過
し、真空で濃縮するとき、粗メリシラート（３３）が黄色油状物質として２．１
３ｇ得られたが、精製することなく次ぎの段階に用いた。 Ｒｆ：０．５２（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ、８／２） 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ、¹³Ｃ） ３．ジエステル（３４）の調製 マグネチックスターラーを備えた２００ｍＬの乾燥させた一口丸底フラスコに
、鉱油中に分散させた６０％ＮａＨ（３．５当量；３９ｍｍｏｌ；１．１６ｇ）
を加えた。油はペンタンで２回洗浄して除去した。乾燥ＤＭＦ（３０ｍL）を加
え、懸濁液は窒素雰囲気とした。フラスコは氷浴中で０℃に冷却した後、マロン
酸ジメチル（３．５当量；３９ｍｍｏｌ；５．１６ｇ）を加える。攪拌を１０分
間行い、メシラート（３３）のＤＭＦ（５８ｍＬ）溶液をカニューラで加えた。
それから混合物は攪拌し、３日間８０〜９０℃で加熱した。水（５０ｍＬ）を加
え、混合物を分液ロートへ移し、エーテル（３×１００ｍＬ）で抽出した。有機
相はＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過した後、減圧で濃縮した。残渣はフラッシュクロ
マトグラフィー（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ、８／２）で精製すると、透明で無色油
状物質として目的精製物（３４）が８００ｍｇ（３１％）得られた。 Ｒｆ：０．４９（ヘキサン／ＡｃＯＥｔ、８／２） 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ） ４．ジカルボン酸（３５）の調製 ジエステル（３４）（８００ｍｇ；３．５０ｍｍｏｌ）のエタノール（５３ｍ
Ｌ）溶液に、１０％ＫＯＨ水溶液８ｍＬを加えた。混合物は５時間加熱還流し、
その後攪拌しながら一夜放置した。エタノールは減圧で除去し、残渣を水（１０
ｍＬ）で希釈した後、エーテル（２０ｍＬ）で抽出した。水相は１０％ＨＣｌ水
溶液で酸性とし、エーテルで抽出した（３×３０ｍＬ）。ＭｇＳＯ４で乾燥した
後、ろ過し、真空で濃縮すると、白色結晶状固体が得られたので，更なる精製は
せずに次ぎの段階で用いた。 収率：８５．６％（６００ｍｇ） 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ）（ＣＤ３ＯＤ） ５．（１Ｓ，３Ｒ）−３−メチルシクロヘキシル酢酸（３６）の調製 ジカルボン酸（３５）（８００ｍｇ，４．００ｍｍｏｌ）に１５ｍＬのジオキ
サン、５ｍＬの水及び２ｍＬの硫酸を加えた。混合物はそれから加熱し３日間還
流した。室温に冷却し、エーテル（３×３０ｍＬ）で抽出後、合わせた有機相は
ＭｇＳＯ４で乾燥、ろ過そして濃縮すると、（１Ｓ，３Ｒ）−３−メチルシクロ
ヘキシル酢酸（３６）が黄色油状物質として得られた。 収率：７４．８％（４６７ｍｇ） 特性値：Ｎｍｒ（¹Ｈ、¹³Ｃ）、ｉｒ，ｍｓ 実施例１０ 疎水性ＧＲＦ類似体の生成 本発明の疎水性ＧＲＦ類似体が生成するＸ部分のＧＲＦ−ペプチドへの結合は
、１つ又は幾つかの疎水性末端部を上記のＧＲＦ又はその類似体のＮ末端部の１
つに化学的合成して行なった。

【００９９】 より詳細に述べると、化学的固定反応のより良い実施においては疎水性官能基
が酸型であるのが好まれて用いられている。これらの条件では、固定反応が好ま
しいことが先行技術で知られていて（Ｂ． Ｃａｓｔｒｏ ｅｔ．ａｌ．， １
９７５，ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ｌｅｔｔｅｒｓ， Ｖｏｌ． １４：１２１
９）、ヘキサフルオロりん酸ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメ
チルアミノ）ホスホニウムのような極度に活性な試薬を用いて固定相で達成され
る（Mｅｒｒｉｆｉｅｌｄ Ｒ．Ｂ．，１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ
．，８５：２１４９；１９６４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８６：３０４
）。

【０１００】 この場合、固定される疎水性末端部は脂肪酸で、固定化での活性化はｉｎ ｓ
ｉｔｕで行なわれる。用いた合成方法に基づきペプチド固定化部位は従来の脱保
護条件で固定化の前に遊離状態にした（Ｇｒｏｓｓ ｅｔ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅ
ｒ，１９８１，Ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｖｏｌ．３，Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐ
ｒｅｓｓ：ｐａｇｅ１〜３４１）。疎水性末端部（Ｈｔ）はそれからエーテル（
テトラヒドロフラン）、ハロゲン化脂肪族溶媒（ジクロロメタン）、ニトリル（
アセトニトリル）又はアミド（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）のような有機溶
媒中において固定試薬により結合する。

【０１０１】 固定化の動力学については、好ましい実施温度は２０〜６０℃の間である。固
定化反応時間は、用いた疎水性末端部がより疎水性であるほど温度は逆に変化す
るが、０．１〜２４時間の間での変化である。

【０１０２】 一般的ＧＲＦ類似体合成段階は９０５０^TMプラスペプチド合成装置（Ｍｉｌｌ
ｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）での固定相法で
、Ｆｍｏｃ法及びＭｉｌｌｉｐｏｒｅ社から提供された合成サイクルを用いて実
施された。Ｆｍｏｃアミノ酸はＢａｃｈｅｍ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ社及び他の
市販元から供給された。ＢＯＰ／ＨＯＢｔを結合法とした連続Ｆｍｏｃ化学は、
Ｃ末端カルボキシアミドの生産の際において開始時のＦｍｏｃ−Ｐａｌ−ＰＥＧ
樹脂に応用した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ｃａｔａｌｏｇ ｎｕｍｂｅｒ：ＧＥＮ
９１３３８３）。Ｆｍｏｃ脱保護はピペリジン２０％ＤＭＦ溶液を用いた。合
成終了後、樹脂はＤＭＦ及びエーテルで良く洗浄して乾燥した。側鎖保護基及び
ペプチド−樹脂結合の最終分解は、以下の混合物からなるＭｉｌｌｉｐｏｒｅが
供給した手段を用いて実施した：ＴＦＡ，水、フェノール、トリイソプロピルシ
ラン（８５：５：５：２）。ペプチドはこうして沈殿させ、エーテルで洗浄して
乾燥した。Ｗａｔｅｒｓ ｐｒｅｐ４０００を用いた逆相ＨＰＬＣ（緩衝液Ａ：
ＴＥＡＰ ２．５；緩衝液Ｂ：Ａ中の８０％ＣＨ３ＣＮ），吸光度２１４ｎｍ，
検出器モデル４８６，流速５０ｍＬ／分；直線的傾斜法２５から６０％Ｂを１０
５分）での精製に次いで脱塩工程（緩衝液Ｃ：０．１％ＴＦＡ水溶液；緩衝液Ｄ
：０．１％ＴＦＡのメタノール／水（８０：２０）溶液）を行なうと、ペプチド
が１０〜３０％の収率で得られ、ＨＰＬＣ（ミレニアム／ホトダイオードアレイ
検出）による計算における同質性は９７％以上であった。

【０１０３】 上記の手順は構造式Ａである７種の新規ＧＲＦ類似体を合成するのに用いた。 Ｘ――――ＧＲＦ−ペプチド （Ａ） ここで、Ｘは実施例６、７，８及び９で合成したカルボン酸Ｘ−OHのアシル部で
ある。

【０１０４】

【化１３】

【０１０５】

【０１０６】 実施例１１ ８種の異なるｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ２類似体のＩＧＦ−１レベルに対する効
果 本試験の目的はＴＨ９５０７を含む８種の異なるｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ２
類似体のＩＧＦ−１レベルに対する効果を、成長期雄ブタにおける皮下長期間投
与で比較したものである。

【０１０７】 動物に対する手順は、１９９９年４月３０日提出のプロトコールＧＲＦ−３０
に記載した内容に、以下少しの変更を加えて実施された：ＴＨ９５０７を含む８
種のＧＲＦ類似体だけ試験委託者から供与された。従って、試験は３０匹のブタ
で行なった。

【０１０８】 試験施設での手順は以下のように実施された：ＩＧＦ−１レベルはＤｉａｇｎ
ｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｔｘ，
ＵＳＡから購入した市販キット（ＤＳＬ−５６００）を用い、ブタ血清で測定し
た。即ち、ＩＧＦ−１レベルは酸−エタノール抽出した後、２部位放射性免疫ア
ッセイ法（ＩＲＭＡ）で定量した。 統計的処理：ＩＧＦ−１データは、変動因
子として時間（１，３，６日目）及び処置（ＡからＪ）につき分散の二元反復測
定分析を行い、一対様多重比較手順はＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌ
ｓ法で実行した。全ての統計的手順はコンピュータ化ＳｉｇｍａＳｔａｔソフト
ウエア（Ｊａｎｄｅｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。Ｐ<０．０
５を統計的有意差ありとした。

【０１０９】 図７で示したように、試験期間中の食塩水やｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ２処置
動物はそのＩＧＦ−１濃度になにも変動を示さなかった。これは以前、ｈＧＲＦ
（１−４４）ＮＨ２の１０μｇ／ｋｇを１日２回ブタに皮下注射してもＩＧＦ−
１レベルに顕著な増加を誘導できなかったという結果を再確認したものである。 試験を行なった全ての類似体（ＴＨ９５０７及び類似体１〜７）は１日目の基
礎レベルと比較して６日目にブタのIGF−１レベルを増加させた。類似体３と６
のみが３日目にＩＧＦ−１レベルを顕著に増加させた。類似体間については統計
的分析では有意差がなかった。しかし、類似体６は非常に強いＩＧＦ−１誘導効
力を示し、５日間の注射によるＩＧＦ−１レベルで３５８．３±１７．１ｎｇ／
ｍＬ（食塩水及びＴＨ９５０７ＩＧＦ−１処置群ではそれぞれ１９０．１±２１
．０ｎｇ／ｍＬ及び２７９±２８．４ｎｇ／ｍＬであった）まで上昇させた。

【０１１０】 これらの結果は、本発明の試験を行なった７種の新規ｈＧＲＦ（１−４４）Ｎ
Ｈ２類似体は全て、そのままのＧＲＦ分子より強い効力をもつことを示している
。これはＧＲＦ（１−４４）ＮＨ２のＮ末端部における種々の脂肪族鎖を結合さ
せると、そのＧＨ放出効力が増加することを示すものである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、皮下注射したｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２類似体が示すブタの血清Ｉ
ＧＦ−１に対する効果の図である。

【図２】 図２は、一回静脈注射した（４μｇ／ｋｇ）ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２及び
（４μｇ／ｋｇ）（ヘキセノイル トランス−３）⁰ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ
２（ＴＴ−０１０２４）＋類似体が示したブタ血清ＧＨに対する効果の曲線であ
る。

【図３】 図３は、静脈注射した後、３００分に亘る曲線下ＧＨ面積に対する種々な用量
のｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２及び（ヘキセノイル トランス−３）⁰ｈＧＲＦ
（１−２９）ＮＨ２（ＴＴ−０１０２４）が示した効果の対比図である（基礎的
な期間（−６０−０分）と比較したとき、^**Ｐ<０．０１及び^***Ｐ<０．００１
）。

【図４】 図４は、皮下注射した５μｇ／ｋｇのｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２及び（５μ
ｇ／ｋｇ）（ヘキセノイル トランス−３）⁰ｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２類似
体が示したブタ血清ＧＨに対する効果の曲線である。

【図５】 図５は、皮下注射した後、４２０分に亘る曲線下ＧＨ面積に対する種々な用量
のｈＧＲＦ（１−２９）ＮＨ２及び（ヘキセノイル トランス−３）⁰ｈＧＲＦ
（１−２９）ＮＨ２（ＴＴ−０１０２４）が示した効果の対比図である（基礎的
な期間（−６０−０分）と比較したとき、^**Ｐ<０．０１及び^***Ｐ<０．００１
）。

【図６】 図６Ａは、本発明に従った好ましいラジカルＲによるＧＲＦ類似体のＸ−部に
関する特異的合成の例を示す。図６Ｂは、本発明に従った好ましいラジカルＲに
よるＧＲＦ類似体のＸ−部に関する特異的合成の例を示す。図６Ｃは、本発明に
従った好ましいラジカルＲによるＧＲＦ類似体のＸ−部に関する特異的合成の例
を示す。

【図７】 図７Ａは、ブタのＩＧＦ−Ｉレベルに対する本発明の８種の異なるｈＧＲＦ（
１−４４）ＮＨ２類似体が示した効果を示す。図７Ｂは、ブタのＩＧＦ−Ｉレベ
ルに対する本発明の８種の異なるｈＧＲＦ（１−４４）ＮＨ２類似体が示した効
果を示す。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年１０月１７日（２００１．１０．１７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】請求項１

【補正方法】変更

【補正内容】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 5/02 Ａ６１Ｐ 17/02 17/02 19/00 19/00 19/10 19/10 Ａ６１Ｋ 37/36 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ブラゾー，ポール カナダ国ケベック アッシュ２エル ３エ ム８，モントリオール，アヴニュー・デ ュ・パルク・ラフォンテーヌ 4054 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA03 AA07 BA01 BA08 BA19 BA23 BA31 CA59 DB14 NA14 ZA702 ZA892 ZA962 ZA972 ZC042 ZC212 4C085 HH20 KA36 KB82 LL15 4H045 AA10 BA18 BA50 DA46 EA30

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 構造式Ａの疎水性ＧＲＦ類似体： Ｘ――――ＧＲ−ペプチド（Ａ） ここで、 ＧＲＦ−ペプチドは構造式Ｂのペプチドである； Ａ１−Ａ２−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ａ８−Ｓｅｒ−Ｔ
   ｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａ１３−Ｌｅｕ−Ａ１５−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａ１８−Ａ
   ｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａ２４−Ａ２５−Ｉｌｅ−Ａ２７−Ａ
   ２８−Ａｒｇ−Ａ３０−Ｒ０ （Ｂ） ここで、 Ａ１はＴｙｒ又はＨｉｓ Ａ２はＶａｌ又はＡｌａ Ａ８はＡｓｎ又はＳｅｒ Ａ１３はＶａｌ又はＩｌｅ Ａ１５はＡｌａ又はＧｌｙ Ａ１８はＳｅｒ又はＴｙｒ Ａ２４はＧｌｎ又はＨｉｓ Ａ２５はＡｓｐ又はＧｌｕ Ａ２７はＭｅｔ、Ｉｌｅ又はＮｌｅ Ａ２８はＳｅｒ又はＡｓｎ Ａ３０は結合或いは１から１５残基までの任意のアミノ酸配列 Ｒ０はＮＨ２又はＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＮＨ２で、ｎ＝１〜１２であり、
   Ｘは疎水性末端で、アミド結合によりペプチドのN末端に固定しており、その疎
   水性末端は５〜７原子からなる背骨部分である；ここでその背骨部分はＣ１−６
   アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル又はＣ６−１２アリールで置換されていてよ
   い；そして少なくとも背骨部分の２原子に結合している１つの剛直化部分を有し
   ている；その部分は二重結合、三重結合、飽和又は不飽和Ｃ３−９シクロアルキ
   ル及びＣ６−１２アリールからなる群から選択されるものである。
2. 【請求項２】 Ｘが以下の群から選される請求項１の疎水性ＧＲＦ類似体。 【化１】
3. 【請求項３】 請求項１で請求した、ＧＲＦ類似体を活性成分として、薬学
   的に許容できるキャリアー、賦形剤又は希釈剤と共に含む、成長ホルモン放出を
   誘起する薬剤の処方。
4. 【請求項４】 ＧＲＦ類似体の効果量を患者に投与することによって患者の
   成長ホルモンレベルを増加する薬剤のための、請求項１で請求したＧＲＦ類似体
   の使用。
5. 【請求項５】 請求項１で請求したＧＲＦ類似体を患者に投与し、成長ホル
   モン応答を測定することを含む、患者の成長ホルモン欠乏症の診断方法。
6. 【請求項６】 ＧＲＦ類似体の効果量を患者に投与することによって患者の
   下垂体こびと症又は成長遅滞の治療を行う薬剤の製造のための、請求項１で請求
   したＧＲＦ類似体の使用。
7. 【請求項７】 患者にＧＲＦ類似体の効果量を投与することによって患者の
   創傷又は骨回復に対する治療用の薬剤を製造するための、請求項１で請求したＧ
   ＲＦ類似体の使用。
8. 【請求項８】 患者にＧＲＦ類似体の効果量を投与することによって患者の
   骨粗しょう症に対する治療を行う薬剤を製造するための、請求項１で請求したＧ
   ＲＦ類似体の使用。
9. 【請求項９】 ヒト又は動物にＧＲＦ類似体の効果量を投与することによっ
   てヒト又は動物のタンパク質同化作用の改善のための治療を行う薬剤を製造する
   ための、請求項１で請求したＧＲＦ類似体の使用。
10. 【請求項１０】 ヒト又は動物にＧＲＦ類似体の効果量を投与することによ
    って臨床的肥満に悩むヒト又は動物における脂肪分解効果を誘起する薬剤を製造
    するための、請求項１で請求したＧＲＦ類似体の使用。
11. 【請求項１１】 ヒト又は動物にＧＲＦ類似体の効果量を投与することによ
    ってヒト又は動物における成長ホルモン機能を全体的に向上させる薬剤を製造す
    るための、請求項１で請求したＧＲＦ類似体の使用。