WO2007058360A1 - デスアシルグレリン及びその誘導体を有効成分とする皮膚修復促進治療剤 - Google Patents

デスアシルグレリン及びその誘導体を有効成分とする皮膚修復促進治療剤 Download PDF

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peptide
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terminal
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Noboru Murakami
Keiko Nakahara
Kenji Kangawa
Yujiro Hayashi
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University Of Miyazaki
Japan As Represented By President Of National Cardiovascular Center
Asubio Pharma Co., Ltd.
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor

Definitions

  • Non-patent Document 6 a substance that promotes cell proliferation and differentiation.
  • Some clinical applications such as IGF, TGF- ⁇ , and FGF are also wary of causing abnormalities in the cell division of other parts of the human body. Discovery of highly safe substances with such activity * Development is desired.
  • Ghrelin is a hormone whose gastric strength was also discovered in 1999. It has an amino acid sequence consisting of 28 residues, and the third amino acid from the N-terminus of the sequence is glycated with a fatty acid. It is a peptide having an extremely unusual chemical structure (Non-patent Document 8, Patent Document 1). Ghrelin acts as a growth hormone secretagogue receptor la (GHS— Rla) (Non-patent Document 9), and promotes endogenous brain digestion that enhances the secretion of growth hormone (GH) from the pituitary gland.
  • GGS— Rla growth hormone secretagogue receptor la
  • Non-Patent Document 8 It has been shown to be a tubal hormone (Non-Patent Document 8), and recent studies have shown that darrelin increases appetite, increases body weight and fat by subcutaneous administration, and improves cardiac function It has also been clarified that it has actions such as (Non-Patent Documents 10 to 14).
  • darrelin has a GH secretion-promoting action and an appetite-enhancing action, an effect of burning fat through the action of GH and converting it into energy, or an effect of enhancing the muscles by expressing the anabolic action of GH. It is expected that can be extracted more effectively by increasing appetite (Non-patent Document 15).
  • Darrelin is an endogenous GHS against GHS—Rla, and was first isolated and purified from rats, then vertebrates other than rats, such as humans, mice, pigs, chickens, eels, eels, horses,
  • the amino acid sequence of darrelin having a similar primary structure is also known from Higgie, Rikiru, -Zimas, and Inu. Human (Human)
  • GSS n-octanoyl FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 1): GSS (n-octanoyl FLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 2) Rat (Rat)
  • GSS n-octanoyl FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 3): GSS (n-octanoyl FLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR (SEQ ID NO: 4) mouse (Mouse)
  • GSS n-octanoyl FLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR (SEQ ID NO: 6)
  • GSS n-octanoyl FLSPEHQKLQRKEAKKPSGRLKPR (SEQ ID NO: 7) Hedge (Ovine)
  • GSS n-octanoyl FLSPEHQKLQRKEPKKPSGRLKPR (SEQ ID NO: 8) Inu (Canine)
  • GSS (n-octanoyl! FLSPTQKPQNRGDRKPPRV-NH 2 (SEQ ID NO: 1 9): GSS (n- octanoyl: FLSPTQKPQNRGDRKPPRVG (SEQ ID NO: 2 0) horse (Equine)
  • Non-Patent Document 2 Takamura: Bio Venture, 1: 58 (2001)
  • Non-Patent Document 6 Ueda: Bio Venture, 1: 32 (2001)
  • Non-Patent Document 7 Hohfeld et al .: Lancet. 366: 788-790 (2005)
  • Non-Patent Document 8 Kojima et al .: Nature, 402, 656-660 (1999)
  • Non-Patent Document 9 Howard et al: Science 273: 974-977 (1996)
  • Non-Patent Document 10 Wren et al .: Endocrinology 141: 4325-4328 (2000)
  • Non-Patent Document 13 Lely et al .: Endocr. Rev., 25, 426-457 (2004)
  • Non-Patent Document 17 Muccioli et al. Eur. J. Pharmacol, 498: 27-35 (2004)
  • the present invention relates to providing a skin damage therapeutic agent, a skin regeneration promoting agent, a skin cell culturing method, and the like in the treatment of skin damage using a substance having a skin cell proliferating action.
  • the present inventors have reported a desacyldalelin force that has been reported as a metabolite produced by the decomposition of the acyl group at the modification site of darellin (for example, the octanoyl group of the serine residue at position 3). It was found in rat amniotic fluid and fetal blood. When considering the function and role of desacyl ghrelin in amniotic fluid and fetal blood, desacyl ghrelin was expected to show proliferative effects on fetal skin cells.
  • the present inventors examined the action of desacyldarellin on skin cells. As a result, it was confirmed that desacyldarellin receptors exist in skin cells, and desacyldarellin is present in skin cells. It has been found that it acts to promote intracellular calcium production, and that desacyldalelin exhibits a proliferative action on skin cells.
  • the present invention also relates to a method for treating skin damage comprising administering desacyldarellin, a method for promoting the formation of a cultured skin cell sheet by culturing skin cells, and skin during transplantation of cultured skin.
  • the present invention relates to a method for promoting the repair of the above-mentioned diseases and a method for treating the above-mentioned diseases by promoting the repair.
  • the present invention provides a skin regeneration promoter in the treatment of skin damage, a formation promoter of a cultured skin cell sheet by culturing skin cells, and a skin repair promoter and therapeutic agent during transplantation of cultured skin. It relates to the use of deciacdaleleline for manufacturing.
  • the present invention specifically relates to the following matters.
  • Desacyldalelin or has substantially the same physiological effects as desacyldalelin A therapeutic agent for skin damage comprising as an active ingredient a peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the active ingredient is (1) a peptide having the amino acid sequence described in SEQ ID NOS: 1 to 21, and (2) the amino acid sequence described in SEQ ID NOS: 1 to 21 has an N-terminal force up to the fourth amino acid residue. And a peptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and Z or added in the amino acid sequence from the N-terminal to the 5th to C-terminal, and (3) the above (1) and (2)
  • the therapeutic agent according to the above-mentioned [1] which is a selected peptide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a peptide in which the active ingredient has an amino acid residue from the N-terminal to the 15th amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the 15th amino acid is an amide, or a pharmaceutically acceptable peptide thereof
  • the active ingredient is (1) a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 1 to 21, and (2) the N-terminal force of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOs: 1 to 21 is the amino acid residue up to the fourth. And a peptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and Z or added in the amino acid sequence from the N-terminal to the fifth to C-terminal, and (3) the above (1) and (2)
  • Desacyldalelin a peptide having substantially the same physiological action as desacyl ghrelin, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered as an active ingredient to a mammal in need of skin regeneration.
  • a method of promoting skin regeneration comprising:
  • the active ingredient is (1) a peptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOS: 1 to 21, and (2) the N-terminal force of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NOS: 1 to 21 is the amino acid residue up to the fourth position. And a peptide having an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted and Z or added in the amino acid sequence from the N-terminal to the fifth to C-terminal, and (3) the above (1) and (2)
  • the peptide is a peptide selected from the group consisting of peptide strengths in which the C-terminus is an amide or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a peptide in which the active ingredient has an amino acid residue from the N-terminal to the 15th amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the 15th amino acid is an amide, or a pharmaceutically acceptable peptide thereof
  • desacyldarellin has an action of proliferating skin cells, and when cultivating skin cells, the substance is added to promote cell proliferation, thereby promptly It can be used for treatment.
  • skin cells are cultured to produce sheet-like artificial skin, and skin repair treatment is performed by covering the skin damage surface, artificial skin sheets are supplied to patients more quickly using cultured skin cells. It becomes possible to do.
  • the medicament of the present invention can be used as a medicament for mammals (individuals) including humans.
  • Examples of the substance that can be used in the present invention include desacyldarelin in which the acyl group at the site of modification of darrelin (eg, the otatanyl group of the 3-position serine residue) does not exist.
  • desacyldarelin includes peptides having the same amino acid sequences as those of human-derived darrelin and other animal-derived darrelin, such as rat, mouse, pig, and ushi, and derivatives thereof. Can be used.
  • desacyldarellin derived from the individual for each individual.
  • desacyldarellin having the same amino acid sequence as human-derived darelin is desirable to use.
  • the desacyldarellin is a peptide consisting of 28 amino acids (SEQ ID NO: 1).
  • an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, inserted, or deleted in the fifth to 28th amino acid residues from the N-terminus And peptides having an activity to increase intracellular calcium ion concentration is preferably a basic amino acid, particularly lysine.
  • the amino acid sequence of the derivative should have a homology of 70%, preferably 80%, more preferably 90%, particularly preferably 95%, and most preferably 97% compared to the natural amino acid sequence. .
  • desacyldarellin SEQ ID NOs: 2 to 21
  • the C-terminus is amidated in the above derivatives, it is also included as a derivative of desacyldalelin in the present invention.
  • Examples of vectors into which genes are incorporated include E. coli vectors (pBR322, pUC18, pUC19, etc.), Bacillus subtilis vectors (pUB110, pTP5, pC194, etc.), yeast vectors (YEp type, YRp type, Yip type), Alternatively, any other force such as animal cell vectors (retrovirus, vaccinia virus, etc.) may be used as long as the target gene can be stably maintained in the host cell. it can.
  • the vector is introduced into a suitable host cell.
  • the method described in Molecular Cloning (Sambrook et al., 1989) can be used as a method for incorporating a target gene into a plasmid or a method for introducing it into a host cell.
  • a promoter is connected upstream of the gene so as to function.
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host cell used for expression of the target gene.
  • lac promoter, trp promoter, lpp promoter, ⁇ PL promoter, recA promoter, etc. can be used when the host cell to be transformed is of the genus Escherichia, and SPOl promoter, SP02 promoter, etc. if it is of the genus Bacillus.
  • yeast GAP promoter, PH05 promoter, ADH promoter, etc.
  • SV40-derived promoter, retrovirus-derived promoter, etc. can be used. .
  • the host cell is transformed using the vector containing the gene of interest obtained as described above.
  • Host cells include bacteria (eg, Escherichia genus, Bacillus genus, etc.), yeast (Saccharomyces genus, Pichia genus, Candida genus, etc.), animal cells ( CHO cells, COS cells, etc.) can be used.
  • a liquid medium is suitable as a medium for culturing, and it is particularly preferable that the medium contains a carbon source, a nitrogen source, and the like necessary for the growth of the transformed cells to be cultured. Vitamins, growth promoting factors, serum, etc. can be added as desired.
  • the peptide according to the present invention is separated and purified from the culture by a conventional method.
  • the cells or cells are collected after culturing and collected. Is suspended in a buffer solution containing a protein denaturant (eg, guanidine hydrochloride), and the cells or cells are disrupted by ultrasonic waves, followed by centrifugation.
  • a protein denaturant eg, guanidine hydrochloride
  • various chromatographies are performed in consideration of the molecular weight, solubility, charge (isoelectric point), affinity, etc. of the target substance. Separation and purification methods such as chromatography can be appropriately combined.
  • Desacyldalelin and its derivatives according to the present invention can be chemically synthesized by a conventional method. For example, condensing amino acids with protecting groups by liquid phase method and Z or solid phase method, extending the peptide chain, removing all protecting groups with acid, and purifying the resulting crude product by the above purification method Can be obtained.
  • peptide according to the present invention can be easily produced according to a known method, for example, according to a classical peptide synthesis method! However, it can also be easily produced according to a solid phase method.
  • salts relating to desacyldalelin and derivatives thereof that can be used in the present invention are preferred, for example, salts with inorganic bases, salts with organic bases, inorganic acids and And salts with organic acids, salts with basic or acidic amino acids, and the like.
  • salts with inorganic bases include, for example, alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts; and aluminum salts and ammonium salts. Is mentioned.
  • Preferable examples of the salt with an organic base include, for example, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexamine, ⁇ , ⁇ '-di And salts with benzylethylenediamine and the like.
  • salt with inorganic acid include salts with hydrochloric acid, hydrobromic acid, nitric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
  • salts with basic amino acids include salts with arginine, lysine, ornithine and the like, and preferable examples of salts with acidic amino acids include, for example, asparagine. And salts with acid, glutamic acid and the like.
  • Physiological action of desacyldarellin! / Using rat fetal skin cells that have been found to have a receptor for desacyldarellin as an indicator of intracellular calcium elevation It is possible to select derivatives.
  • FLIPR Fluorometric Imaging Plate Reader, Molecular
  • Fluo-4 AM Fluo-4 AM
  • a known method can be used to confirm whether it has acyldalelin activity.
  • the skin regeneration promoter in the treatment of skin damage for example, wounds, abrasions, burns, etc.
  • skin damage for example, wounds, abrasions, burns, etc.
  • An agent for promoting the formation of cultured skin cell sheets by culturing skin cells e.g. epidermis, dermis and skin
  • burns refractory skin ulcers, congenital epidermolysis bullosa, pressure ulcers, hypertrophic scars, nevi, allergy
  • It can be used as an active ingredient in skin repair promoters and therapeutic agents during transplantation of cultured skin in severe skin diseases and hair loss.
  • desacyldarellin a derivative thereof or a pharmacologically acceptable drug thereof according to the present invention.
  • skin damage e.g., wounds, abrasions, burns, etc.
  • formation of a cultured skin cell sheet by culturing skin cells (e.g., epidermis, dermis and skin) How to promote and promote skin repair during transplantation of cultured skin in burns, refractory skin ulcers, congenital epidermolysis bullosa, pressure sores, obesity scars, nevi, allergic skin diseases and hair loss etc. It can be used for the method and the method for treating the above-mentioned disease by promoting the repair.
  • preparation additives such as preservatives, antioxidants, coloring agents, and sweeteners can be used.
  • disintegrant examples include starch, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl cellulose calcium, croscarmellose sodium, carboxymethyl starch sodium and the like.
  • Preferable examples of the solvent include water for injection, alcohol, propylene glycol, macrogol, sesame oil, corn oil and the like.
  • solubilizer examples include, for example, polyethylene glycol, propylene glycol, D-manntol, benzyl benzoate, ethanol, trisaminomethane, cholesterol, triethanolamine, sodium carbonate. And sodium quenate.
  • hydrophilic polymers such as polybutylpyrrolidone, sodium carboxymethylcellulose, methylcellulose, hydroxymethylenoresenorelose, hydroxyethinoresenorelose, and hydroxypropinoresenorelose.
  • the pharmaceutical dosage form of the invention is preferably a dosage form suitable for parenteral administration.
  • suitable dosage forms for parenteral administration include, for example, intravenous administration, intradermal administration, subcutaneous administration, or intramuscular administration. Injections, drops, suppositories, transdermal absorption agents, transmucosal absorption agents or inhalants, etc. are preferred. In this case, preparation forms such as transmucosal absorbent, inhalant, suppository and the like are also preferable.
  • These formulation forms are variously known to those skilled in the art, and those skilled in the art appropriately select a formulation form suitable for the desired administration route, and if necessary, one or more formulation additives available in the art. Can be used to produce a preparation in the form of a pharmaceutical composition.

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Abstract

　新規な皮膚損傷治療剤、皮膚再生促進剤を提供するものである。デスアシルグレリン又はその薬学的に許容される塩を有効成分とする皮膚損傷治療剤又は皮膚再生促進剤。

Description

明 細 書
デスァシルグレリン及びその誘導体を有効成分とする皮膚修復促進治療 剤
技術分野
[0001] 本発明は、ダレリン関連物質の皮膚細胞増殖作用に関する。より具体的には当該 物質を有効成分とする皮膚損傷治療における皮膚損傷治療剤、皮膚再生促進剤、 皮膚細胞の培養方法等に関する。
背景技術
[0002] 皮膚は、長い皮膚移植の歴史を見るまでもなぐ最も早くから移植治療が試みられ た組織である。さらに、今後の移植再生研究を見据えるとき、皮膚発生研究、毛髪を 用いた再生研究などを通して、もっともアクセスしゃすぐまた発生 ·再生過程が十分 検証された組織と考えられる。しかも、皮膚移植再生研究は、熱傷や先天性表皮水 疱症、あるいは男性型脱毛など多彩な皮膚疾患への直接の応用も可能な研究領域 であり、皮膚損傷あるいは皮膚傷害において重要な役割を果たすことが期待される ( 非特許文献 1)。
[0003] 培養皮膚は、疾患、受傷の程度および移植面積などにより、必要とされる移植皮膚 は異なる。中等度までの熱傷などであれば培養表皮のみの移植が適応となり、皮膚 全層欠損の患者では真皮層までを組み込んだ培養皮膚が必要となる。また、糖尿病 患者などでの難治性皮膚潰瘍の治療には、生理活性物質の放出を期待した創傷被 覆剤的な培養皮膚の開発が望まれる (非特許文献 2)。
[0004] 現在、皮膚移植に用いられる培養皮膚シートには、グリーン (Green)らが開発した 方法による正常表皮角化細胞 (非特許文献 3)と、ベル (Bell)らが考案した皮膚等価 組織 (非特許文献 4)がある。グリーンらは、 3T3細胞を支持細胞として用いることで、 表皮角化細胞の分化を抑制し、十分な増殖を得ることに成功した。この方法は培養 中の表皮角化細胞が重層化するため、シート状の構造を呈し、生体に類似の培養細 胞構造体は、皮膚組織の代替物として臨床的有用性が明らかとなっている。また、ベ ルらは、真皮に相当する部分をコラーゲンなどの材料を用いて先に作製しておき、そ の上に表皮角化細胞を培養した。この方法では、人工的な組織構築のために 3次元 的に細胞を組み入れるための材料を用いて 、ることが重要で、コラーゲンゲルはこれ に適した材料であった (非特許文献 5)。
[0005] 細胞と細胞の足場が揃ったら、次に必要なものは細胞の増殖や分化を促すような 物質である（非特許文献 6)。 IGF、 TGF- β、 FGFなどの臨床応用にも、人体他部 位の細胞分ィ匕ゃ発生に異常を来たすとして警戒する向きもあり、安全性の高いこのよ うな活性を持つ物質の発見 *開発が望まれている。
[0006] また、損傷皮膚の移植又は再生医療にお!、て、培養した胎児皮膚細胞を損傷部 位に移植すると正常皮膚に分化'増殖し、皮膚修復能力を持つことから、今後の移 植-再生医療への応用が期待されている（非特許文献 7)が、胎児皮膚細胞の増殖 速度は遅 、ために増殖を促進させる技術の開発が望まれて 、る。
[0007] 一方、ダレリン (Ghrelin)は 1999年に胃力も発見されたホルモンであり、 28残基から なるアミノ酸配列を有し、当該配列の N末端から 3番目のアミノ酸が脂肪酸でァシル ィ匕された極めて珍しいィ匕学構造を有するペプチドである (非特許文献 8、特許文献 1 ；)。グレリンは成長ホルモン分泌促進因子レセプター la (Growth Hormone Secretagog ue-Receptor la: GHS— Rla) (非特許文献 9)に働き、下垂体からの成長ホルモン（ GH)の分泌を亢進させる内因性の脳 消化管ホルモンであることが示され (非特許文 献 8)、最近の研究では、ダレリンが食欲を亢進させること、皮下投与することにより体 重及び体脂肪が増加すること、及び心機能を改善する等などの作用を有することも 明らかにされている（非特許文献 10〜14)。
[0008] 更にダレリンは GH分泌促進作用や食欲亢進作用を持ち、 GHの作用を介して脂 肪を燃焼してエネルギーに変換する作用、あるいは GHのアナボリックな作用を発現 して筋肉を増強させる効果を、食欲亢進によってさらに有効に引き出せることが期待 されている (非特許文献 15)。
[0009] ダレリンは GHS— Rlaに対する内因性の GHSとして、ラットから初めて単離精製さ れた後、ラット以外の脊椎動物、例えばヒト、マウス、ブタ、 -ヮトリ、ゥナギ、ゥシ、ゥマ 、ヒッジ、力エル、 -ジマス、ィヌからも、類似した一次構造を有するダレリンのアミノ酸 配列が知られている。 ヒト (Human)
： GSS(n-octanoyl FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR (配列番号 1 ) ： GSS (n-octanoyl FLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR (配列番号 2 ) ラッ ト（Rat)
： GSS(n-octanoyl FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR (配列番号 3 ) ： GSS (n-octanoyl FLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR (配列番号 4 ) マウス（Mouse)
： GSS (n-octanoyl FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR (配列番号 5 ) ブタ (Pore ine)
： GSS (n-octanoyl FLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR (配列番号 6 ) ゥシ (Bovine)
： GSS(n-octanoyl FLSPEHQKLQRKEAKKPSGRLKPR (配列番号 7 ) ヒッジ (Ovine)
： GSS(n-octanoyl FLSPEHQKLQRKEPKKPSGRLKPR (配列番号 8 ) ィヌ (Canine)
： GSS(n-octanoyl FLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR (配列番号 9 ) ゥナギ（Eel)
： GSS (n-octanoyl FLSPSQRPQGKDKKPPRV-NH2 (配列番号 1 0 ) ニジマス（Trout)
： GSS(n-octanoyl FLSPSQKPQVRQGKGKPPRV-NH2 (配列番号 1 1 ) ： GSS -octanoyl FLSPSQKPQGKGKPPRV-NH2 (配列番号 1 2 ) ニヮトリ （Chicken)
GSS (n-oc t anoy 1 FLSPTYKNIQQQKGTRKPTAR (配列番号 1 3 ) GSS (n-oc t anoy 1 FLSPTYKNIQQQKDTRKPTAR (配列番号 1 4) GSS(n-octanoyl FLSPTYKNIQQQKDTRKPTARLH (配列番号 1 5 ) ゥシガエル (Bullfrog)
GLT (n-oct anoy 1 ) FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM (配列番号 1 6 ) GLT (n- dec anoy 1 ) FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM (配列番号 1 6 ) GLT (n-octanoyl) FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMN (配列番号 1 7 ) テラピア（Tilapia)
： GSS(n - octanoyl: FLSPSQKPQNKVKSSRI-NH2 (配列番号 1 8) ナマズ（Catfish)
： GSS (n-octanoyl! FLSPTQKPQNRGDRKPPRV-NH2 (配列番号 1 9 ) ： GSS (n- octanoyl: FLSPTQKPQNRGDRKPPRVG (配列番号 2 0 ) ゥマ（Equine)
:GSS(n-butanoyl)FLSPEHHKVQHRKESKKPPAKLKPR (配列番号 2 1 )
(上記表記において、アミノ酸残基は一文字標記により表している。 ) [0011] 上記ペプチドは、 3位のセリン残基 (S)又はスレオニン残基 (T)の側鎖水酸基がォ クタン酸、デカン酸などの脂肪酸によりァシル化された特異的な構造を有するぺプチ ドであり、このような疎水性修飾構造を有する生理活性ペプチドは、ダレリン以外に生 体から単離された例はない。
[0012] また、ダレリンの修飾部位におけるァシル基が分解されて生成する代謝物としてデ スァシル体 (デスァシルダレリン）が報告されており、心筋細胞のアポトーシス抑制や 脂肪細胞での脂質分解抑制等の作用が知られている (非特許文献 16、 17)。
[0013] 本発明者らが知る限りでは、デスァシルダレリンが皮膚細胞に作用していること及び 該ペプチドが皮膚細胞に作用して皮膚細胞の増殖作用を示すことに係る報告は未 だ見出されていない。
[0014] 特許文献 1：国際公開 01Z07475号パンフレット
非特許文献 1：京都大学 21世紀 COEプログラム HP「融合的移植再生治療を目指す 国際拠点形成」 皮膚の移植再生に関する研究、 http：〃 www.kuhp.kyoto-u.ac.jp〃 coe/ memberl5.html
非特許文献 2：高村： Bioベンチャー, 1： 58 (2001)
非特許文献 3:Rheinwald and Green: Cell, 6:331(1975)
非特許文献 4: Bell et al: Science, 211:1052(1981)
非特許文献 5：畠：実験医学増刊号， 19:2121 (2001)
非特許文献 6：上田： Bioベンチャー， 1： 32 (2001)
非特許文献 7:Hohfeld et al.:Lancet.366: 788-790 (2005)
非特許文献 8:Kojima et al. :Nature,402, 656-660 (1999)
非特許文献 9: Howard et al: Science 273: 974-977 (1996)
非特許文献 10:Wren et al. : Endocrinology 141:4325-4328 (2000)
非特許文献 ll:Nakazato et al: Nature 409:194-8 (2001)
非特許文献 12:Shintani et al: Diabetes 50:227-232 (2001)
非特許文献 13:Lely et al.: Endocr.Rev., 25, 426-457 (2004)
非特許文献 14:Korbonits et al.: Front. Neuroendocrine, 25: 27-68 (2004) 非特許文献 15:赤水、寒川：最新医学， 60: 1569-1573 (2005) 非特許文献 16 : Baldanzi et al. J.Cell Biol, 195: 1029-1037(2002)
非特許文献 17 : Muccioli et al. Eur. J. Pharmacol, 498: 27-35(2004)
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0015] 本発明は、皮膚細胞の増殖作用を有する物質を用いた皮膚損傷治療における皮 膚損傷治療剤、皮膚再生促進剤、皮膚細胞の培養方法等の提供に関する。
課題を解決するための手段
[0016] 本発明者らは、ダレリンの修飾部位におけるァシル基 (例えば、 3位セリン残基のォ クタノィル基）が分解されて生成する代謝物として報告されて ヽるデスァシルダレリン 力 妊娠ラットの羊水中および胎児血中に存在することを見出した。羊水中及び胎児 血中のデスァシルグレリンの機能及び役割を考えるとき、デスァシルグレリンが胎児 皮膚細胞の増殖作用を示すことが期待された。
[0017] そこで、本発明者らは皮膚細胞に対するデスァシルダレリンの作用を検討したとこ ろ、皮膚細胞にデスァシルダレリン受容体が存在すること、デスァシルダレリンが皮膚 細胞に作用して細胞内カルシウム産生を促進すること、及びデスァシルダレリンが皮 膚細胞の増殖作用を示すことを見出した。
[0018] 即ち、本発明はデスァシルダレリンを有効成分とする皮膚損傷の治療における皮膚 再生促進剤、皮膚細胞の培養による培養皮膚細胞シートの形成促進剤、並びに培 養皮膚の移植時の皮膚の修復促進剤及び治療剤に関する。
[0019] また、本発明はデスァシルダレリンを投与することからなる皮膚損傷の治療方法、皮 膚細胞の培養による培養皮膚細胞シートの形成を促進する方法、並びに培養皮膚 の移植時の皮膚の修復を促進する方法及び当該修復促進による上記疾患の治療 方法に関する。
[0020] 更に、本発明は皮膚損傷の治療における皮膚再生促進剤、皮膚細胞の培養によ る培養皮膚細胞シートの形成促進剤、並びに培養皮膚の移植時の皮膚の修復促進 剤及び治療剤を製造するためのデシァシルダレリンの使用に関する。
以上のことから、本発明は具体的には以下の事項に関する。
[0021] [1] デスァシルダレリン、またはデスァシルダレリンと実質的に同一の生理作用を有 するペプチド、或いはそれらの薬学的に許容される塩を有効成分とする皮膚損傷治 療剤。
[2] 有効成分が、（1)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、 (2 )配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列において N末端力も 4番目までのアミノ酸残 基を有し、且つ N末端から 5番目〜C末端までのアミノ酸配列において 1以上のァミノ 酸が欠失、置換及び Z又は付加したアミノ酸配列を有するペプチド、ならびに（3)前 記（1)及び（2)のペプチドにお 、て C末端がアミド体であるペプチド力 なる群力 選 択されたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である上記 [1]記載の治療剤
[3] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はその 薬学的に許容される塩である上記 [2]記載の治療剤。
[4] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列において N末端から 15番 目までのアミノ酸残基を有し、且つ 15番目のアミノ酸がアミド体であるペプチド又はそ の薬学的に許容される塩である上記 [2]記載の治療剤。
[5] 前記有効成分を一単位製剤当たり 0. OOlmg〜： LOOmg含有する上記 [1]〜[ 4]の 、ずれかに記載の治療剤。
[6] デスァシルダレリン、またはデスァシルダレリンと実質的に同一の生理作用を有 するペプチド、或いはそれらの薬学的に許容される塩を有効成分とする皮膚再生促 進剤。
[7] 有効成分が、（1)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、 (2 )配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列において N末端力も 4番目までのアミノ酸残 基を有し、且つ N末端から 5番目〜C末端までのアミノ酸配列において 1以上のァミノ 酸が欠失、置換及び Z又は付加したアミノ酸配列を有するペプチド、ならびに（3)前 記（1)及び（2)のペプチドにお 、て C末端がアミド体であるペプチド力 なる群力 選 択されたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である上記 [6]記載の促進剤
[8] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はその 薬学的に許容される塩である上記 [7]記載の促進剤。 [9] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列において N末端から 15番 目までのアミノ酸残基を有し、且つ 15番目のアミノ酸がアミド体であるペプチド又はそ の薬学的に許容される塩である上記 [7]記載の促進剤。
[10] 前記有効成分を一単位製剤当たり 0. OOlmg〜： LOOmg含有する上記 [6]〜 [9]の 、ずれかに記載の促進剤。
[0023] [11] デスァシルダレリン、またはデスァシルダレリンと実質的に同一の生理作用を 有するペプチド、或いはそれらの薬学的に許容される塩を有効成分として用いた培 養皮膚細胞の増殖を促進する方法。
[12] 有効成分が、（1)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、 ( 2)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列において N末端力も 4番目までのアミノ酸 残基を有し、且つ N末端から 5番目〜C末端までのアミノ酸配列において 1以上のァ ミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加したアミノ酸配列を有するペプチド、ならびに（3) 前記（1)及び（2)のペプチドにお 、て C末端がアミド体であるペプチド力 なる群から 選択されたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である上記 [11]記載の方 法。
[13] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はそ の薬学的に許容される塩である上記 [ 12]記載の方法。
[14] ペプチドが、配列番号 1に記載のアミノ酸配列において N末端から 15番目ま でのアミノ酸残基を有し、且つ 15番目のアミノ酸がアミド体であるペプチド又はその 薬学的に許容される塩である上記 [ 12]記載の方法。
[15] 培養皮膚細胞の増殖を、前記有効成分を 0. 000000 lmgZmL〜0. lmg ZmL含有する培養液中で行う上記 [11]〜 [14]の ヽずれかに記載の方法。
[0024] [16] 皮膚損傷の治療を必要とする哺乳動物に、デスァシルダレリン、またはデスァ シルグレリンと実質的に同一の生理作用を有するペプチド、或!、はそれらの薬学的 に許容される塩を有効成分として投与することからなる皮膚損傷の治療方法。
[17] 有効成分が、（1)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、 ( 2)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列において N末端力も 4番目までのアミノ酸 残基を有し、且つ N末端から 5番目〜C末端までのアミノ酸配列において 1以上のァ ミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加したアミノ酸配列を有するペプチド、ならびに（3) 前記（1)及び（2)のペプチドにお 、て C末端がアミド体であるペプチド力 なる群から 選択されたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である上記 [16]記載の方 法。
[18] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はそ の薬学的に許容される塩である上記 [ 17]記載の方法。
[19] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列において N末端から 15番 目までのアミノ酸残基を有し、且つ 15番目のアミノ酸がアミド体であるペプチド又はそ の薬学的に許容される塩である上記 [ 17]記載の方法。
[20] 前記有効成分を 1回当たり 0. OOlmg〜： LOOmg投与する上記 [16]〜[19] のいずれかに記載の方法。
[21] 皮膚再生を必要とする哺乳動物に、デスァシルダレリン、またはデスァシルグ レリンと実質的に同一の生理作用を有するペプチド、或いはそれらの薬学的に許容 される塩を有効成分として投与することからなる皮膚再生を促進する方法。
[22] 有効成分が、（1)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、 ( 2)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列において N末端力も 4番目までのアミノ酸 残基を有し、且つ N末端から 5番目〜C末端までのアミノ酸配列において 1以上のァ ミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加したアミノ酸配列を有するペプチド、ならびに（3) 前記（1)及び（2)のペプチドにお 、て C末端がアミド体であるペプチド力 なる群から 選択されたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である上記 [22]記載の方 法。
[23] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はそ の薬学的に許容される塩である上記 [22]記載の方法。
[24] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列において N末端から 15番 目までのアミノ酸残基を有し、且つ 15番目のアミノ酸がアミド体であるペプチド又はそ の薬学的に許容される塩である上記 [22]記載の方法。
[25] 前記有効成分を 1回当たり 0. OOlmg〜： LOOmg投与する上記 [21]〜[24] のいずれかに記載の方法。 [0026] [26] 皮膚損傷治療剤を製造するための、デスァシルダレリン、またはデスァシルグ レリンと実質的に同一の生理作用を有するペプチド、或いはそれらの薬学的に許容 される塩の有効成分としての使用。
[27] 有効成分が、（1)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、 ( 2)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列において N末端力も 4番目までのアミノ酸 残基を有し、且つ N末端から 5番目〜C末端までのアミノ酸配列において 1以上のァ ミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加したアミノ酸配列を有するペプチド、ならびに（3) 前記（1)及び（2)のペプチドにお 、て C末端がアミド体であるペプチド力 なる群から 選択されたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である上記 [26]記載の使 用。
[28] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はそ の薬学的に許容される塩である上記 [27]記載の使用。
[29] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列において N末端から 15番 目までのアミノ酸残基を有し、且つ 15番目のアミノ酸がアミド体であるペプチド又はそ の薬学的に許容される塩である上記 [27]記載の使用。
[30] 皮膚損傷治療剤が、一単位製剤当たり有効成分を 0. OOlmg〜： LOOmg含有 する上記 [26]〜 [29]の 、ずれかに記載の使用。
[0027] [31] 皮膚再生促進剤を製造するための、デスァシルダレリン、またはデスァシルグ レリンと実質的に同一の生理作用を有するペプチド、或いはそれらの薬学的に許容 される塩の有効成分としての使用。
[32] 有効成分が、（1)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、 ( 2)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列において N末端力も 4番目までのアミノ酸 残基を有し、且つ N末端から 5番目〜C末端までのアミノ酸配列において 1以上のァ ミノ酸が欠失、置換及び Z又は付加したアミノ酸配列を有するペプチド、ならびに（3) 前記（1)及び（2)のペプチドにお 、て C末端がアミド体であるペプチド力 なる群から 選択されたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である上記 [31]記載の使 用。
[33] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はそ の薬学的に許容される塩である上記 [32]記載の使用。
[34] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列において N末端から 15番 目までのアミノ酸残基を有し、且つ 15番目のアミノ酸がアミド体であるペプチド又はそ の薬学的に許容される塩である上記 [32]記載の使用。
[35] 皮膚再生促進剤が、一単位製剤当たり有効成分を 0. OOlmg〜： LOOmg含有 する上記 [31]〜 [34] 、ずれかに記載の使用。
発明の効果
[0028] 本発明により、デスァシルダレリンが皮膚細胞を増殖させる作用を持つことが明らか にされ、皮膚細胞を培養するときに当該物質を添加して細胞増殖を促進させることに より、速やかに治療に使用することが可能となる。即ち、皮膚細胞を培養してシート状 の人工皮膚を作製し、皮膚損傷面を覆うことによって皮膚の修復治療を行う際に、培 養皮膚細胞を用いて人工皮膚シートをより速やかに患者に供給することが可能となる 。更に、皮膚細胞を直接裂傷や創傷部位に移植し、デスァシルダレリンを移植部位 に投与することにより治癒促進を図ることが可能となる。
[0029] 更に、本発明者らは、これまでに報告されていな力つたデスァシルダレリン受容体 力 皮膚細胞に存在することを明らかにした。このことにより、胎児皮膚細胞を用いて デスァシルダレリンの受容体に作用する物質のスクリーニングを行うことができ、また 本細胞を用いてデスァシルダレリン受容体抗体を作製することが可能となった。 図面の簡単な説明
[0030] [図 1]デスァシルダレリンの単一胎児培養皮膚細胞における細胞内カルシウム上昇 作用を示す図である。
[図 2]デスァシルダレリン及びデスァシルダレリン（1— 15) -NHの培養胎児皮膚細
2
胞における増殖作用を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0031] 本発明の医薬はヒトを含む哺乳動物 (個体)の医薬として使用できる。本発明にお いて用いることができる物質としては、ダレリンの修飾部位におけるァシル基 (例えば 、 3位セリン残基のオタタノィル基）が存在しないデスァシルダレリンを挙げることがで きる。 [0032] デスァシルダレリンとしては、上述したようにヒト由来ダレリンをはじめ、ラット、マウス 、ブタ、ゥシ等その他の動物由来のダレリンに係るアミノ酸配列と同じ配列を有するぺ プチド及びその誘導体を用いることができる。
各々の個体に対して当該個体由来のデスァシルダレリンを用いることが望ましぐ例 えばヒトに対してはヒト由来ダレリンと同じアミノ酸配列を有するデスァシルダレリンを 用いることが望ましい。当該デスァシルダレリンは 28個のアミノ酸からなるペプチドで ある (配列番号 1)。
[0033] また、デスァシルダレリンの誘導体としては、例えば (ィ)配列番号 1〜21に記載の アミノ酸配列において N末端力 4番目までのアミノ酸残基を有し、且つ N末端から 5 番目〜C末端までのアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が欠失、置換及び Z又は 付カ卩したアミノ酸配列を有するペプチド、ならびに（口）配列番号 1〜21に記載のアミ ノ酸配列を有するペプチド及び前記 (ィ）のペプチドにお!/、て C末端がアミド体である ペプチドからなる群力も選択されたペプチドであって、デスァシルダレリンと実質的に 同一の生理作用を有するペプチドが挙げられる。これらのうち、好ましくは、例えば配 列番号 1に記載されたアミノ酸配列において N末端から 5番目〜28番目のアミノ酸残 基において 1個又は数個のアミノ酸が置換、挿入、又は欠失したアミノ酸配列を有し 、細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性を有するペプチドが挙げられる。 付加されるアミノ酸残基としては塩基性アミノ酸、特にリジンの付カ卩が好ましい。誘導 体のアミノ酸配列としては天然型のアミノ酸配列と比較して 70%、好ましくは 80%、よ り好ましくは 90%、特に好ましくは 95%、最も好ましくは 97%の相同性を有すること が望ましい。他の動物由来のダレリンと同じアミノ酸配列を有するデスァシルダレリン（ 配列番号 2乃至 21)においても同様である。また、上記誘導体において C末端がアミ ド化された場合も本発明におけるデスァシルダレリンの誘導体として含まれる。
[0034] 本発明に係るデスァシルダレリン及びその誘導体は常法により得ることができる。例 えば、天然の原料から単離することができるし、又は組換え DNA技術及び Z又は化 学的合成によって製造することができる。例えば組換え DNA技術を用いた製法にお いては、本願発明に係るペプチドをコードする DNAを有する発現ベクターにより形 質転換された宿主細胞を培養し、当該培養物から目的のペプチドを採取すること〖こ より本発明に係るデスァシルダレリン及びその誘導体を得ることもできる。
[0035] 遺伝子を組み込むベクターとしては、例えば大腸菌のベクター（pBR322、 pUC18 、 pUC19等）、枯草菌のベクター（pUB110、 pTP5、 pC194等）、酵母のベクター（ YEp型、 YRp型、 Yip型）、又は動物細胞のベクター（レトロウイルス、ワクシニアウイ ルス等)等が挙げられる力 その他のものであっても、宿主細胞内で安定に目的遺伝 子を保持できるものであれば、いずれをも用いることができる。当該ベクターは、適当 な宿主細胞に導入される。 目的の遺伝子をプラスミドに組み込む方法や宿主細胞へ の導入方法としては、例えば、 Molecular Cloning (Sambrook et al.， 1989)に記載さ れた方法が利用できる。
上記プラスミドにおいて目的のペプチド遺伝子を発現させるために、当該遺伝子の 上流にはプロモーターを機能するように接続させる。
[0036] 本願発明において用いられるプロモーターとしては、 目的遺伝子の発現に用いる 宿主細胞に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、形 質転換する宿主細胞がェシエリシァ（Escherichia)属の場合は lacプロモーター、 trp プロモーター， lppプロモーター、 λ PLプロモーター， recAプロモーター等を用いる ことができ、 Bacillus属の場合は SPOlプロモーター、 SP02プロモーター等を用い ることができ、酵母の場合は GAPプロモーター， PH05プロモーター、 ADHプロモ 一ター等を用いることができ、動物細胞の場合は、 SV40由来プロモーター、レトロゥ ィルス由来プロモーター等を用 、ることができる。
[0037] 上記のようにして得られた目的遺伝子を含有するベクターを用いて宿主細胞を形 質転換する。宿主細胞としては細菌（例えば、エシ リシァ（Escherichia)属、バチル ス（Bacillus)属等）、酵母（サッカロマイセス (Saccharomyces)属、ピキア（Pichia)属、 キャンディダ (Candida)属等）、動物細胞 (CHO細胞、 COS細胞等)等を用いること ができる。培養時の培地としては液体培地が適当であり、当該培地中には培養する 形質転換細胞の生育に必要な炭素源、窒素源等が含まれることが特に好ましい。所 望によりビタミン類、成長促進因子、血清などを添加することができる。
[0038] 培養後、培養物から本発明に係るペプチドを常法により分離精製する。例えば、培 養菌体又は細胞から目的物質を抽出するには、培養後、菌体又は細胞を集め、これ をタンパク質変性剤 (塩酸グァ-ジンなど）を含む緩衝液に懸濁し、超音波などにより 菌体又は細胞を破砕した後、遠心分離を行う。次に上清から目的物質を精製するに は、 目的物質の分子量、溶解度、荷電 (等電点）、親和性等を考慮して、ゲル濾過、 限外濾過、透析、 SDS-PAGE,各種クロマトグラフィーなどの分離精製方法を適宜 組み合わせて行うことができる。
[0039] 本発明に係るデスァシルダレリン及びその誘導体は常法により化学合成することが できる。例えば、保護基の付いたアミノ酸を液相法及び Z又は固相法により縮合、ぺ プチド鎖を延長させ、酸で全保護基を除去し、得られた粗生成物を上記の精製方法 で精製することにより得られる。
[0040] また、ペプチドの製造法は従来既に種々の方法が知られており、本発明に係るぺ プチドの製造も公知の方法に従って容易に製造でき、例えば古典的なペプチド合成 法に従ってもよ!、し、固相法に従っても容易に製造できる。
[0041] 本発明に用いることができるデスァシルダレリン及びその誘導体に係る塩としては 薬学的に許容される塩が好ましぐ例えば無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸 との塩、有機酸との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との塩などが挙げられる。
[0042] 無機塩基との塩の好適な例としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ 金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；ならびにアルミ二 ゥム塩、アンモニゥム塩などが挙げられる。
[0043] 有機塩基との塩の好適な例としては、例えばトリメチルァミン、トリェチルァミン、ピリ ジン、ピコリン、エタノールァミン、ジエタノールァミン、トリエタノールァミン、ジシクロへ キシルァミン、 Ν,Ν'-ジベンジルエチレンジァミンなどとの塩が挙げられる。
[0044] 無機酸との塩の好適な例としては、例えば塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸 などとの塩が挙げられる。
[0045] 有機酸との塩の好適な例としては、例えばギ酸、酢酸、トリフルォロ酢酸、フマール 酸、シユウ酸、酒石酸、マレイン酸、クェン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸、 ρ-トルエンスルホン酸などとの塩が挙げられる。
[0046] 塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばアルギニン、リジン、オル二チン などとの塩が挙げられ、酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、例えばァスパラギン 酸、グルタミン酸などとの塩が挙げられる。
[0047] 以上の塩の中でも特にナトリウム塩、カリウム塩が最も好まし!/、。
[0048] デスァシルダレリンの生理作用につ!/、ては、デスァシルダレリンの受容体が存在す ることを見出したラット胎児皮膚細胞を用いて細胞内カルシウム上昇作用を指標とし て誘導体を選択することが可能である。細胞内カルシウムイオン濃度の測定法は公 知の方法が利用できる力 例えば、カルシウムイオン濃度変化による Fluo— 4 AM (Molecular Probe社)の蛍光強度の変化を利用した FLIPR (Fluorometric Imaging P late Reader, Molecular Devices社)を用いることができる (Kojima et al: Nature, 402: 656-660(1999)) o また、カルシウム上昇活性を有するペプチド力 イン ビトロ（in vitr 0)及びイン ビボ（in vivo)でデスァシルダレリン活性を有するか確認するためには、 公知の方法を利用することができる。例えばイン ビトロでは、ラット胎児皮膚細胞に [ 12¾標識デスァシルダレリンを結合させ、追い出し実験によるバインディングアツセィ によって測定することができる。イン ビボでのデスァシルダレリン活性を確認するた めには、カルシウム上昇活性を有するペプチドを動物の末梢静脈に注射した後の心 筋細胞アポトーシスあるいは脂肪組織又は血清中の脂質濃度を測定するか、胎児皮 膚細胞中のカルシウム濃度を測定すればよい。また、デスァシルダレリン誘導体及び その調製方法については、例えば、 J. Med. Chem., 43, pp.4370-4376, 2000を参照 することができる。
[0049] 本発明に係るデスァシルダレリン及びその誘導体は、本明細書の実施例に具体的 に示すとおり、皮膚細胞の増殖作用を有することが見出され、特に胎児の皮膚細胞 数を顕著に増カロさせることができる。
[0050] 即ち、本発明に係るデスァシルダレリン、その誘導体またはそれらの薬理学的に許 容される塩を、皮膚損傷 (例えば、創傷、擦過傷および火傷等)の治療における皮膚 再生促進剤、皮膚細胞 (例えば、表皮、真皮及び皮膚)の培養による培養皮膚細胞 シートの形成促進剤、並びに熱傷、難治性皮膚潰瘍、先天性表皮水泡症、褥瘡、肥 満性瘢痕、母斑、アレルギー性皮膚疾患重症例及び脱毛等における培養皮膚の移 植時の皮膚の修復促進剤及び治療剤にぉ 、て有効成分として用いることができる。
[0051] また、本発明に係るデスァシルダレリン、その誘導体またはそれらの薬理学的に許 容される塩を個体に投与することにより、皮膚損傷 (例えば、創傷、擦過傷および火 傷等)の治療方法、皮膚細胞 (例えば、表皮、真皮及び皮膚)の培養による培養皮膚 細胞シートの形成を促進する方法、並びに熱傷、難治性皮膚潰瘍、先天性表皮水 泡症、褥瘡、肥満性瘢痕、母斑、アレルギー性皮膚疾患重症例及び脱毛等における 培養皮膚の移植時の皮膚の修復を促進する方法及び当該修復促進による上記疾 患の治療方法に用いることができる。
[0052] 更に、本発明に係るデスァシルダレリン、その誘導体またはそれらの薬理学的に許 容される塩を、皮膚損傷 (例えば、創傷、擦過傷および火傷等)の治療における皮膚 再生促進剤、皮膚細胞 (例えば、表皮、真皮及び皮膚)の培養による培養皮膚細胞 シートの形成促進剤、並びに熱傷、難治性皮膚潰瘍、先天性表皮水泡症、褥瘡、肥 満性瘢痕、母斑、アレルギー性皮膚疾患重症例及び脱毛等における培養皮膚の移 植時の皮膚の修復促進剤及び治療剤を製造する際に使用することができる。
[0053] デスァシルダレリン、その誘導体またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成 分として含む本発明の薬剤は、薬理学的に許容しうる担体、賦形剤、増量剤などと混 合して個体 (例えば、ヒト、マウス、ラット、ゥサギ、ィヌ、ネコ、ゥシ、ゥマ、ブタ、サル等 )に対して用いることができる。
[0054] 本発明の薬剤は、皮膚再生治療中の個体に対して、非経口的に、例えば静脈内、 皮下、筋肉内への注射により、所定量を単回又は複数回に分けて投与することが好 ましいが、個体がヒト成人であり特に在宅治療の場合には経鼻投与、経肺投与、坐 剤投与が望ましい。
[0055] 本発明にお 、て薬剤の投与量は特に限定されず、使用目的や投与対象の個体の 年齢、体重、個体の種類、症状、栄養状態及び併用薬剤等に応じて適宜選択可能 であるが、単回又は複数回をヒト成人に投与する場合、デスァシルダレリン、その誘 導体またはそれらの薬理学的に許容される塩を有効成分として 0. OOlmg〜： LOOmg の範囲が好ましぐ 0. Olmg〜： LOmgがより望ましい。
[0056] 投与期間としては、上記の投与量を 1日 1回〜数回、 1〜24週間の投与することが 好ましく、より好ましくは 1〜 12週間の投与が好まし!/、。
[0057] 薬学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機 担体物質が用いられ、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤;液状製 剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等として配 合される。
[0058] また必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加物を用い ることちでさる。
[0059] 賦形剤の好適な例としては、例えば乳糖、白糖、 D-マン-トール、デンプン、結晶 セルロース、軽質無水ケィ酸などが挙げられる。
[0060] 滑沢剤の好適な例としては、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシ ゥム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。
[0061] 結合剤の好適な例としては、例えば結晶セルロース、白糖、 D-マン-トール、デキ ストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニ ルピロリドンなどが挙げられる。
[0062] 崩壊剤の好適な例としては、例えばデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボ キシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスタ ーチナトリウムなどが挙げられる。
[0063] 溶剤の好適な例としては、例えば注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マ クロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油などが挙げられる。
[0064] 溶解補助剤の好適な例としては、例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコ ール、 D-マン-トール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスァミノメタン、コレステロ ール、トリエタノールァミン、炭酸ナトリウム、クェン酸ナトリウムなどが挙げられる。
[0065] 懸濁化剤の好適な例としては、例えばステアリルトリエタノールァミン、ラウリル硫酸 ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコ-ゥム、塩化べンゼ トニゥム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えばポリビニルアルコール
、ポリビュルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒド 口キシメチノレセノレロース、ヒドロキシェチノレセノレロース、ヒドロキシプロピノレセノレロース などの親水性高分子などが挙げられる。
[0066] 等張化剤の好適な例としては、例えば塩ィ匕ナトリウム、グリセリン、 D-マン-トール などが挙げられる。 [0067] 緩衝剤の好適な例としては、例えばリン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クェン酸塩などの 緩衝液などが挙げられる。
[0068] 無痛化剤の好適な例としては、例えばべンジルアルコールなどが挙げられる。
[0069] 防腐剤の好適な例としては、例えばパラォキシ安息香酸エステル類、クロロブタノ一 ル、ベンジルアルコール、フエネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙 げられる。
[0070] 抗酸化剤の好適な例としては、例えば亜硫酸塩、ァスコルビン酸などが挙げられる
[0071] 発明の医薬の製剤形態としては非経口投与に適する製剤形態が好ましぐ非経口 投与に適する製剤形態としては、例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与、又は 筋肉内投与用等の注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤又は吸入剤 などを挙げることができるが、上記注射剤の製剤形態が好ましぐ特に個体がヒト成人 であり在宅治療の場合には経粘膜吸収剤、吸入剤、坐剤等の製剤形態も好ましい。 これらの製剤形態は当業者に種々知られており、当業者は所望の投与経路に適す る製剤形態を適宜選択し、必要に応じて当業界で利用可能な 1又は 2以上の製剤用 添加物を用いて医薬用組成物の形態の製剤を製造することが可能である。
[0072] 例えば、注射剤又は点滴剤の形態の医薬は、有効成分であるデスァシルダレリン、 その誘導体またはそれらの薬学的に許容される塩と共に適切な緩衝液、糖溶液、等 張化剤、 pH調節剤、無痛化剤、防腐剤などの 1又は 2以上の製剤用添加物を注射 用蒸留水に溶解して滅菌（フィルター)濾過後にアンプルまたはバイアル詰めするか 、滅菌濾過した溶液を凍結乾燥して凍結乾燥製剤とすることにより調製し提供するこ とができる。添加剤としては、例えばグルコース、マン-トール、キシリトール、ラタトー スなどの糖類、ポリエチレングリコールなどの親水性ポリマー類、グリセロールなどの アルコール類、グリシンなどのアミノ酸類、血清アルブミンなどのタンパク類、 NaCl、 クェン酸ナトリウムなどの塩類、酢酸、酒石酸、ァスコルビン酸などの酸類、ツイ一ン（ Tween) 80などの界面活性剤、亜硫酸ナトリウムなどの還元剤などを使用することが できる。このような製剤は、用時に注射用蒸留水や生理食塩水などを添加して溶解 することにより注射剤又は点滴剤として使用できる。また、経粘膜投与には、点鼻剤 や鼻腔内スプレー剤などの鼻腔内投与剤 (経鼻投与剤)等も好適であり、経肺投与 には吸入剤等も好適である。
[0073] 一単位製剤中の有効成分 (デスァシルダレリン、その誘導体またはそれらの薬理学 的に許容される塩）の含量は 0. OOlmg〜： LOOmg、好ましくは 0. Olmg〜： LOmgで あり、 1日 1回ないし数回投与することが望ましい。
[0074] 単離した皮膚細胞の処理方法としては、単離した皮膚細胞を培養液中でインキュ ペートし、インキュベート液中に無菌濾過又はオートクレープ滅菌して調製したデス ァシルダレリン、その誘導体またはそれらの薬理学的に許容される塩を 0. 1ηΜ〜1 μ Μ、好ましくは 1ηΜ〜100ηΜを添カ卩することにより行うことができる。すなわち、皮 膚細胞の増殖を、デスァシルダレリン、その誘導体またはそれらの薬理学的に許容さ れる塩を 0. 0000001mgZmL〜0. lmgZmL含有する培養液を用いるのが好ま しい。この処理を行うことによって、実施例 2に示すように、本来は増殖がほとんど進ま な 、皮膚細胞の増殖を促進させることが可能となる。
実施例
[0075] 以下に実施例により本発明を具体的に示す。
[0076] [実施例 1]デスァシルダレリンのラット胎児培養皮膚細胞における細胞内カルシウム 上昇作用
妊娠 17日の Wistar系ラットを麻酔下に開腹して胎児を摘出した。この胎児から、皮 膚の小片を採取し、冷ノヽンタス液内でコラゲナーゼ処理、パパイン消化およびピぺッ ティングによる機械的分離により、胎児皮膚細胞の分散液を得た。この分散液より、 単一細胞を取得してカルシウムイメージングを行った。カルシウムイメージングは、力 ルシゥムイメージング装置（IMACS,浜松ホトニタス）を用いて行った。即ち、 340nm Z380nmで惹起（Excitation)したとき、 5 lOnm (Emission)での励起光の比を取 つた。また、カルシウムイメージング剤として Fura— 2を用いた。デスァシルダレリンは 、配列番号 3のアミノ酸配列を有するラット由来デスァシルダレリンを用いた。
結果を図 1に示す。図 1中、 I、 II、 IIIはこの時点で写真を撮影したものである力 本 明細書には写真は省略している。また、実線表記はダレリンに反応した細胞であり、 破線表記はデスァシルダレリンに反応した別の細胞である。ダレリンおよびデスァシ ルグレリンはそれぞれ別の細胞に添加した。
単一ラット胎児皮膚細胞にデスァシルダレリン（1 X 10_6M)を作用させると、細胞 内カルシウムの上昇が観察された。このことから、ラット胎児皮膚細胞にはデスァシル ダレリンに反応する受容体が存在し、デスァシルダレリン添カ卩によって細胞内カルシ ゥムが上昇し、デスァシルダレリンの作用が誘導されるものと考えられた。
[0077] [実施例 2] デスァシルダレリン及びデスァシルダレリン（1— 15)—NHの培養胎児
2
皮膚細胞における増殖作用
妊娠 17日の Wistar系ラットより実施例 1と同様にして、ラット胎児皮膚細胞分散液を 採取した。この分散細胞を、 2%ゥシ胎児血清、ペニシリン（lOOUZml)、ストレプト マイシン（100 μ g/ml)および表皮増殖因子 EGF (5ngZml)を含有した MCDB1 53HAA培地（F- Peptide Co., Ltd., Yamagata, Japan)に懸濁し、ポリエチレンィミン 被覆の 96 穴マルチウエルプレートに、 3 X 104細胞 Zゥエルを播種した。これに、 デスァシルグレリン（0. 05〜500pmolZmL (nM) )またはデスァシルグレリン（1— 1 5) -NH (配列番号 22) (0. 001〜lpmolZmL (nM) )、 5 ブロモー 2， 一デォキ
2
シゥリジン（BrdU) (10 M)を添カ卩し、 24時間インキュベートした。対照にはデスァ シルグレリンまたはデスァシルグレリン（ 1 15)— NHを含まな 、培地を用 、た。培
2
養終了後、細胞を回収し、 Proliferation ELISA Kit (Roche Diagnostic GmbH. Manhei m, Germany)を用いて胎児皮膚細胞への BrdU取り込み量を測定して皮膚細胞増殖 作用を検討した。
結果を図 2に示す。
培養胎児皮膚細胞にデスァシルダレリンまたはデスァシルダレリン（1 15) -NH
2 を作用させると、 BrdU取り込み量が増加したことから、デスァシルダレリンまたはデス ァシルダレリン（1 15) -NHには胎児皮膚細胞を増殖させる作用があることが確
2
f*i¾ れ 。
産業上の利用可能性
[0078] 本発明の皮膚損傷治療剤、皮膚再生促進剤、培養皮膚細胞の増殖促進方法、皮 膚再生促進方法は製薬分野、医療分野に利用できる。

Claims

請求の範囲
[1] デスァシルダレリン、またはデスァシルダレリンと実質的に同一の生理作用を有する ペプチド、或いはそれらの薬学的に許容される塩を有効成分とする皮膚損傷治療剤 有効成分が、（1)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、（2)配 列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列において N末端力も 4番目までのアミノ酸残基を 有し、且つ N末端から 5番目〜C末端までのアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が 欠失、置換及び Z又は付加したアミノ酸配列を有するペプチド、ならびに（3)前記（1 )及び（2)のペプチドにお 、て C末端がアミド体であるペプチド力 なる群力 選択さ れたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である請求の範囲第 1項記載の治 療剤。
[3] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はその薬 学的に許容される塩である請求の範囲第 2項記載の治療剤。
[4] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列において N末端から 15番目ま でのアミノ酸残基を有し、且つ 15番目のアミノ酸がアミド体であるペプチド又はその 薬学的に許容される塩である請求の範囲第 2項記載の治療剤。
[5] 前記有効成分を一単位製剤当たり 0. OOlmg〜： LOOmg含有する請求の範囲第 1 〜4項の 、ずれかに記載の治療剤。
[6] デスァシルダレリン、またはデスァシルグレリンと実質的に同一の生理作用を有する ペプチド、或いはそれらの薬学的に許容される塩を有効成分とする皮膚再生促進剤
[7] 有効成分が、（1)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、（2)配 列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列において N末端力も 4番目までのアミノ酸残基を 有し、且つ N末端から 5番目〜C末端までのアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が 欠失、置換及び Z又は付加したアミノ酸配列を有するペプチド、ならびに（3)前記（1 )及び（2)のペプチドにお 、て C末端がアミド体であるペプチド力 なる群力 選択さ れたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である請求の範囲第 6項記載の促 進剤。 [8] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はその薬 学的に許容される塩である請求の範囲第 7項記載の促進剤。
[9] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列において N末端から 15番目ま でのアミノ酸残基を有し、且つ 15番目のアミノ酸がアミド体であるペプチド又はその 薬学的に許容される塩である請求の範囲第 7項記載の促進剤。
[10] 前記有効成分を一単位製剤当たり 0. OOlmg〜： LOOmg含有する請求の範囲第 6 〜9項の 、ずれかに記載の促進剤。
[11] デスァシルダレリン、またはデスァシルダレリンと実質的に同一の生理作用を有する ペプチド、或いはそれらの薬学的に許容される塩を有効成分として用いた培養皮膚 細胞の増殖を促進する方法。
[12] 有効成分が、（1)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、（2)配 列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列において N末端力も 4番目までのアミノ酸残基を 有し、且つ N末端から 5番目〜C末端までのアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が 欠失、置換及び Z又は付加したアミノ酸配列を有するペプチド、ならびに（3)前記（1 )及び（2)のペプチドにお 、て C末端がアミド体であるペプチド力 なる群力 選択さ れたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である請求の範囲第 11項記載の 方法。
[13] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はその薬 学的に許容される塩である請求の範囲第 12項記載の方法。
[14] ペプチドが、配列番号 1に記載のアミノ酸配列において N末端から 15番目までのァ ミノ酸残基を有し、且つ 15番目のアミノ酸がアミド体であるペプチド又はその薬学的 に許容される塩である請求の範囲第 12項記載の方法。
[15] 培養皮膚細胞の増殖を、前記有効成分を 0. 0000001mgZmL〜0. lmg/mL 含有する培養液中で行う請求の範囲第 11〜14項のいずれかに記載の方法。
[16] 皮膚損傷の治療を必要とする哺乳動物に、デスァシルダレリン、またはデスァシル ダレリンと実質的に同一の生理作用を有するペプチド、或 、はそれらの薬学的に許 容される塩を有効成分として投与することからなる皮膚損傷の治療方法。
[17] 有効成分が、（1)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、（2)配 列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列において N末端力も 4番目までのアミノ酸残基を 有し、且つ N末端から 5番目〜C末端までのアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が 欠失、置換及び Z又は付加したアミノ酸配列を有するペプチド、ならびに（3)前記（1 )及び（2)のペプチドにお 、て C末端がアミド体であるペプチド力 なる群力 選択さ れたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である請求の範囲第 16項記載の 方法。
[18] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はその薬 学的に許容される塩である請求の範囲第 17項記載の方法。
[19] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列において N末端から 15番目ま でのアミノ酸残基を有し、且つ 15番目のアミノ酸がアミド体であるペプチド又はその 薬学的に許容される塩である請求の範囲第 17項記載の方法。
[20] 前記有効成分を 1回当たり 0. OOlmg〜： LOOmg投与する請求の範囲第 16〜19項 のいずれかに記載の方法。
[21] 皮膚再生を必要とする哺乳動物に、デスァシルダレリン、またはデスァシルダレリン と実質的に同一の生理作用を有するペプチド、或いはそれらの薬学的に許容される 塩を有効成分として投与することからなる皮膚再生を促進する方法。
[22] 有効成分が、（1)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、（2)配 列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列において N末端力も 4番目までのアミノ酸残基を 有し、且つ N末端から 5番目〜C末端までのアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が 欠失、置換及び Z又は付加したアミノ酸配列を有するペプチド、ならびに（3)前記（1 )及び（2)のペプチドにお 、て C末端がアミド体であるペプチド力 なる群力 選択さ れたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である請求の範囲第 21項記載の 方法。
[23] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はその薬 学的に許容される塩である請求の範囲第 22項記載の方法。
[24] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列において N末端から 15番目ま でのアミノ酸残基を有し、且つ 15番目のアミノ酸がアミド体であるペプチド又はその 薬学的に許容される塩である請求の範囲第 22項の方法。 [25] 前記有効成分を 1回当たり 0. OOlmg〜： LOOmg投与する請求の範囲第 21〜24項 のいずれかに記載の方法。
[26] 皮膚損傷治療剤を製造するための、デスァシルダレリン、またはデスァシルダレリン と実質的に同一の生理作用を有するペプチド、或いはそれらの薬学的に許容される 塩の有効成分としての使用。
[27] 有効成分が、（1)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、（2)配 列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列において N末端力も 4番目までのアミノ酸残基を 有し、且つ N末端から 5番目〜C末端までのアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が 欠失、置換及び Z又は付加したアミノ酸配列を有するペプチド、ならびに（3)前記（1 )及び（2)のペプチドにお 、て C末端がアミド体であるペプチド力 なる群力 選択さ れたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である請求の範囲第 26項記載の 使用。
[28] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はその薬 学的に許容される塩である請求の範囲第 27項記載の使用。
[29] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列において N末端から 15番目ま でのアミノ酸残基を有し、且つ 15番目のアミノ酸がアミド体であるペプチド又はその 薬学的に許容される塩である請求の範囲第 27項記載の使用。
[30] 皮膚損傷治療剤が、一単位製剤当たり有効成分を 0. OOlmg〜： LOOmg含有する 請求の範囲第 26〜29項のいずれかに記載の使用。
[31] 皮膚再生促進剤を製造するための、デスァシルダレリン、またはデスァシルダレリン と実質的に同一の生理作用を有するペプチド、或いはそれらの薬学的に許容される 塩の有効成分としての使用。
[32] 有効成分が、（1)配列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、（2)配 列番号 1〜21に記載のアミノ酸配列において N末端力も 4番目までのアミノ酸残基を 有し、且つ N末端から 5番目〜C末端までのアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸が 欠失、置換及び Z又は付加したアミノ酸配列を有するペプチド、ならびに（3)前記（1 )及び（2)のペプチドにお 、て C末端がアミド体であるペプチド力 なる群力 選択さ れたペプチド又はそれらの薬学的に許容される塩である請求の範囲第 31項記載の 使用。
[33] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するペプチド又はその薬 学的に許容される塩である請求の範囲第 32項記載の使用。
[34] 前記有効成分が、配列番号 1に記載のアミノ酸配列において N末端から 15番目ま でのアミノ酸残基を有し、且つ 15番目のアミノ酸がアミド体であるペプチド又はその 薬学的に許容される塩である請求の範囲第 32項記載の使用。
[35] 皮膚再生促進剤が、一単位製剤当たり有効成分を 0. OOlmg〜： LOOmg含有する 請求の範囲第 31〜34項のいずれかに記載の使用。
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