CN101516400A

CN101516400A - 以生长素释放肽及其衍生物或作用于GHS-R1a的物质作为有效成分的脊髓神经修复促进治疗剂

Info

Publication number: CN101516400A
Application number: CNA2007800348304A
Authority: CN
Inventors: 村上昇; 中原桂子; 桥本美穗; 林友二郎; 寒川贤治
Original assignee: JAPAN GOVERNMENT; NIVERSITY OF MIYAZAKI; Asubio Pharma Co Ltd
Current assignee: JAPAN GOVERNMENT; NIVERSITY OF MIYAZAKI; Asubio Pharma Co Ltd
Priority date: 2006-08-11
Filing date: 2007-08-10
Publication date: 2009-08-26
Also published as: JPWO2008018600A1; CA2660517A1; WO2008018600A1; US20100143310A1; BRPI0715809A2; IL196896A0; EP2052738A1; KR20090060291A; RU2009108643A; AU2007282343A1

Abstract

本发明提供一种用于治疗脊髓神经损伤的脊髓神经损伤治疗剂、培养脊髓神经前驱细胞时的脊髓神经前驱细胞增殖促进剂、移植培养的脊髓神经前驱细胞时的脊髓神经再生促进剂等。提供以作用于生长激素促分泌素受体的物质(例如生长素释放肽)作为有效成分的、用于治疗脊髓神经损伤的脊髓神经损伤治疗剂、培养脊髓神经前驱细胞时的脊髓神经前驱细胞增殖促进剂、以及移植培养的脊髓神经前驱细胞时的脊髓神经再生促进剂等。

Description

以生长素释放肽及其衍生物或作用于GHS-R1a的物质作为有效成分的脊髓神经修复促进治疗剂

技术领域

本发明涉及一种作用于生长激素促分泌素受体的物质的脊髓神经前驱细胞增殖作用。更具体地讲，涉及以该物质作为有效成分的、用于治疗脊髓神经损伤的脊髓神经损伤治疗剂、培养脊髓神经前驱细胞时的脊髓神经前驱细胞增殖促进剂、移植培养的脊髓神经前驱细胞时的脊髓神经再生促进剂等。

背景技术

因交通事故或体育运动中的事故、劳动灾害，使每年有6000以上的人遭受脊髓损伤，其总数全国多达约11万人。据统计其社会损失每年高达3000亿日元，但却没有治疗方法(非专利文献1)。迄今为止，脊髓神经不能再生或移植，近年来，对胎儿脊髓细胞的移植等进行了实验水平的研究，揭示脊髓神经是有移植治疗可能性的组织。进一步地，展望今后的移植再生研究，认为通过脊髓神经形成的研究、使用培养的胎儿脊髓神经细胞的再生研究等，今后可以期待脊髓神经是其形成、再生过程等得到证实的组织。而且，期待脊髓神经移植再生研究对脊髓损伤、脊髓肿瘤、脑肿瘤或脑神经障碍将起到重要的作用。

实际上，神经再生的基础研究正处在日新月异的发展中。作为有神经修复和再生可能性的细胞和物质，有人干细胞、鼻粘膜细胞、骨髓间质细胞等骨髓系细胞、脐带血、巨噬细胞、4-氨基吡啶(正在进行大规模III期临床试验)等。最近2、3年，显示有神经修复和再生可能性的新的细胞和物质的研究报告相继发表。这些研究中，有些已从动物实验水平的研究进入对人的临床研究阶段，为了其稳健地发展，使基础研究与临床研究相结合、开设具有综合性研究体制的脊髓再生医疗中心已成为我国的急迫课题(非专利文献2)。

现在，使用动物对脊髓细胞移植进行了实验性研究，为了应用于人的脊髓损伤治疗而开始了临床研究。基础研究或临床研究使用的细胞有人干细胞、鼻粘膜细胞、骨髓系细胞、脐带血、巨噬细胞、来自胎儿的组织等(非专利文献2)。

另外，作为神经再生研究使用的资源之一有来自胎儿的组织。动物实验中作为显示高再生能力的资源受到关注，从猴胎儿脊髓取出神经干细胞，移植到脊髓损伤的猴，成功地恢复了功能(非专利文献3)，但是，通常由于胎儿细胞的增殖速度缓慢，因此期望开发促进增殖的技术。

而且，神经再生治疗使用的GM-CSF和凝集素衍生物等的临床应用中，也担心人体其他部位的细胞分化及副作用，期望发现和开发具有这种活性的安全性高的物质(非专利文献4)。

生长素释放肽(Ghrelin)是1999年从胃中发现的激素，它是具有由28个残基组成的氨基酸序列、并且具有自该序列的氨基末端起第3位的氨基酸被脂肪酸酰化的非常罕见的化学结构的肽(非专利文献5、专利文献1)。生长素释放肽作用于生长激素促分泌素受体1a(Growth HormoneSecretagogue-Receptor 1a：GHS-R1a)(非专利文献6)，是促进垂体分泌生长激素(GH)的内源性脑-胃肠道激素(非专利文献5)。

另外，已知生长素释放肽作为作用于GHS-R1a的内源性GHS，最先从大鼠中分离纯化出来，从大鼠以外的脊椎动物，例如人、小鼠、猪、鸡、鳗鱼、牛、马、绵羊、蛙、虹鳟鱼、犬中也发现了具有类似的一级结构的生长素释放肽的氨基酸序列(专利文献1)。

人

：GSS(正辛酰基)FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR(对应于序列编号1)

：GSS(正辛酰基)FLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR(对应于序列编号2)

大鼠

：GSS(正辛酰基)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR(对应于序列编号3)

：GSS(正辛酰基)FLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR(对应于序列编号4)

小鼠

：GSS(正辛酰基)FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR(对应于序列编号5)

猪

：GSS(正辛酰基)FLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR(对应于序列编号6)

牛

：GSS(正辛酰基)FLSPEHQKLQRKEAKKPSGRLKPR(对应于序列编号7)

绵羊

：GSS(正辛酰基)FLSPEHQKLQRKEPKKPSGRLKPR(对应于序列编号8)

犬

：GSS(正辛酰基)FLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR(对应于序列编号9)

鳗鱼

：GSS(正辛酰基)FLSPSQRPQGKDKKPPRV-NH₂(对应于序列编号10)

虹鳟鱼

：GSS(正辛酰基)FLSPSQKPQVRQGKGKPPRV-NH₂(对应于序列编号11)

：GSS(正辛酰基)FLSPSQKPQGKGKPPRV-NH₂(对应于序列编号12)

鸡

：GSS(正辛酰基)FLSPTYKNIQQQKGTRKPTAR(对应于序列编号13)

：GSS(正辛酰基)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTAR(对应于序列编号14)

：GSS(正辛酰基)FLSPTYKNIQQQKDTRKPTARLH(对应于序列编号15)

牛蛙

：GLT(正辛酰基)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM(对应于序列编号16)

：GLT(正癸酰基)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM(对应于序列编号16)

：GLT(正辛酰基)FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMN(对应于序列编号17)

罗非鱼

：GSS(正辛酰基)FLSPSQKPQNKVKSSRI-NH₂(对应于序列编号18)

鲶鱼

：GSS(正辛酰基)FLSPTQKPQNRGDRKPPRV-NH₂(对应于序列编号19)

：GSS(正辛酰基)FLSPTQKPQNRGDRKPPRVG(对应于序列编号20)

马

：GSS(正丁酰基)FLSPEHHKVQHRKESKKPPAKLKPR(对应于序列编号21)

(上述表达中，氨基酸残基用单字符表示法表示)。

上述肽具有3位的丝氨酸残基(S)或苏氨酸残基(T)的侧链羟基被辛酸、癸酸等脂肪酸酰化的特异性结构，除了生长素释放肽以外，一直没有从生物体中分离出具有这种疏水性修饰结构的生理活性肽的情况。

另外，作为作用于GHS-R1a的物质，除了上述肽化合物以外，例如可以举出肽化合物GHRP-2和低分子化合物MK-0677等。

最近的研究还表明，生长素释放肽增进食欲、通过皮下给药可增加体重及体脂肪(非专利文献7～9)、以及具有改善心脏功能等的作用(非专利文献10～12)。

而且，生长素释放肽具有GH分泌促进作用和增进食欲作用，期待通过增进食欲更加有效地发挥通过GH的作用燃烧脂肪转换成能量的作用、或者通过GH的合成代谢作用增强肌肉的效果(非专利文献13)。

另外，本发明人等发现，将生长素释放肽给予妊娠母体动物(大鼠)时可促进胎儿的生长，并且给予的该物质转移到胎儿的同时也转移到羊水中。考虑作用于羊水中的生长激素促分泌素受体(GHS-R1a)的物质的功能和作用，进行了研究，结果发现：胎儿的皮肤细胞中存在GHS-R1a，并且生长素释放肽具有胎儿皮肤细胞的增殖作用(非专利文献14)。

已知生长素释放肽在大鼠肾上腺褐色细胞瘤PC12细胞系中具有神经突起伸展作用(专利文献2)。PC12细胞作为神经细胞的模型，广泛应用于神经生长因子(NGF)等各种神经作用物质的机理研究。但是，由于PC12细胞是来自肾上腺褐色细胞瘤的癌细胞，为表达儿茶酚胺以及PACAP(垂体腺苷酸环化酶激活肽，pituitary acenylate cyclase activatingpeptide)等神经递质以及生理活性肽、各种生物体活性物质腺苷受体等多种活性物质和受体等的癌细胞，因此，生理学作用的研究中，需要在原代培养体系中、体内(in vivo)或体外(extra vivo)等更接近生理条件的条件下的研究。另外，据报道，生长素释放肽通过GHS-R1a使细胞内钙上升，显示迷走神经的背侧运动核(DMNV)和孤束核的神经细胞增殖作用(非专利文献15、16)。但是，没有关于作用于GHS-R1a的物质(例如生长素释放肽)对于移植到中枢神经系统、通过神经细胞生长发育有望治疗脊髓损伤的胎儿脊髓神经前驱细胞的作用的阐述，作为以脊髓神经细胞的再生及移植为目标的技术期望得到进一步研究进展。而且，本发明人等发现，本发明中L型钙通道阻滞剂地尔硫

不抑制生长素释放肽的脊髓神经细胞增殖作用，由此认为，DMNV中的神经增殖作用与脊髓神经细胞增殖作用为不同的作用。

专利文献1：国际公开号WO 01/07475

专利文献2：特开2005-239712

非专利文献1：医疗焦点，第2部再生医疗，6.“脊髓神经”再生(日文原文：医療ィン·フオ一カス、第2部再生医療、6.「脊髓神経」再生)，2005年5月21日(URL：http://www.ubenippo.co.jp/infocus/saisei/saisei_6.html)

非专利文献2：关于神经再生研究中利用胎儿组织的见解(日文原文：神経再生研究にぉける胎児組織利用に関する見解)，2005年4月5日，NPO法人日本脊髓基金(URL：http://www.jscf.org/jscf/SIRYOU/igaku-1/saiboisyoku/jscf050405.html)

非专利文献3：用神经干细胞恢复脊髓损伤(日文原文：神経幹細胞で脊髓损傷回復)，2001年12月10日，东京新闻记事(URL：http://www.normanet.ne.jp/~JSCF/SIRYOU/tokyo-2.htm)

非专利文献4：神经再生治疗(日文原文：神経再生治療)(Regeneration of Central Nerves System)(URL：http://www.ins-gbs.co.jp/nerve.html)

非专利文献5：Kojima等人：Nature，402，pp.656-660(1999)

非专利文献6：Howard等人：Science，273，pp.974-977(1996)

非专利文献7：Wren等人：Endocrinology，141，pp.4325-4328(2000)

非专利文献8：Nakazato等人：Nature，409，194-198(2001)

非专利文献9：Shintani等人：Diabetes，50，pp.227-232(2001)

非专利文献10：Nakazato等人：Nature，409，pp.194-198(2001)

非专利文献11：Lely等人：Endocr.Rev.，25，pp.656-660(2004)

非专利文献12：Korbonits等人：Front Neuroendocrinol.，25，pp.27-68(2004)

非专利文献13：Kangawa等人：J.Pharmacol.Sci.，100，pp.398-410(2006)

非专利文献14：Nakahara等人：Endocrinology，147，pp.1333-1342(2006)

非专利文献15：Zhang等人：J Physiol.，559，pp.729-737(2004)

非专利文献16：Zhang等人：Peptides，26，pp.2280-2288(2005)

发明的内容

本发明涉及提供一种使用具有脊髓神经前驱细胞增殖作用的物质的、用于治疗脊髓神经损伤的脊髓神经损伤治疗剂、培养脊髓神经前驱细胞时的脊髓神经前驱细胞增殖促进剂、移植培养的脊髓神经前驱细胞时的脊髓神经再生促进剂等。

如上所述，本发明人等发现，将作用于生长激素促分泌素受体的物质生长素释放肽给予妊娠母体动物(大鼠)时可促进胎儿的生长，以及给予的该物质转移到胎儿的同时也转移到羊水中。发现在胎儿的皮肤细胞中存在生长激素促分泌素受体(GHS-R 1a)，并且生长素释放肽具有胎儿皮肤细胞的增殖作用。

进一步地，本发明人等为了研究作用于胎儿(大鼠)的生长激素促分泌素受体的物质的作用，用RT-PCR法检测生长激素促分泌素受体的存在部位时，发现脊髓神经前驱细胞中存在生长激素促分泌素受体。而且发现，使作用于生长激素促分泌素受体的物质作用于脊髓神经前驱细胞时，促进BrdU的摄入，以及该物质显示脊髓神经前驱细胞的增殖作用。进一步地，根据使用大鼠脊髓损伤模型的试验确认，与移植培养的脊髓神经前驱细胞一起局部给予生长素释放肽，脊髓损伤引起的下肢功能降低得到恢复。即，本发明人等已经发现皮肤细胞中有生长激素促分泌素受体表达(非专利文献14)，进一步通过本发明发现脊髓神经前驱细胞中也有生长激素促分泌素受体表达，发现作用于生长激素促分泌素受体的物质生长素释放肽及其衍生物作用于脊髓神经前驱细胞，使该细胞增殖，可以应用于神经再生医疗。

即，本发明涉及一种以作用于生长激素促分泌素受体的物质或其药学上可接受的盐作为有效成分的、用于治疗脊髓神经损伤的脊髓神经损伤治疗剂、培养脊髓神经前驱细胞时的培养脊髓神经前驱细胞增殖促进剂、以及移植培养的脊髓神经前驱细胞时的脊髓神经再生促进剂。

另外，本发明涉及一种包含给予作用于生长激素促分泌素受体的物质或其药学上可接受的盐的方法，所述方法是个体的脊髓神经损伤的治疗方法；培养脊髓神经前驱细胞时，促进培养的脊髓神经前驱细胞增殖的方法；以及个体移植培养的脊髓神经前驱细胞时，促进脊髓神经再生的方法。

进一步地，本发明涉及一种作用于生长激素促分泌素受体的物质或其药学上可接受的盐的应用，所述应用包括制备用于治疗脊髓神经损伤的脊髓神经损伤治疗剂、制备用于培养脊髓神经前驱细胞时的培养脊髓神经前驱细胞增殖促进剂、以及制备用于移植培养的脊髓神经前驱细胞时的脊髓神经再生促进剂。

据此，本发明具体涉及以下内容：

[1]一种脊髓神经损伤治疗剂，其中，所述治疗剂以作用于生长激素促分泌素受体的物质或其药学上可接受的盐作为有效成分。

[2]如上述[1]所述的治疗剂，其中，上述物质为选自由以下(1)、(2)以及(3)构成的组的肽或其衍生物：

(1)序列编号1～21的任一个所示的氨基酸序列中，自氨基末端起第3位的氨基酸残基是一个在该氨基酸残基的侧链上引入了脂肪酸的修饰氨基酸残基的肽；

(2)序列编号1～21的任一个所示的氨基酸序列中，具有自氨基末端起至第5～28位的氨基酸序列中缺失、取代及/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列以及自氨基末端起第3位的氨基酸残基是一个在该氨基酸残基的侧链上引入了脂肪酸的修饰氨基酸残基的、具有脊髓神经前驱细胞增殖作用的肽；以及

(3)具有自序列编号1～21的任一个所示的氨基酸序列的氨基末端起至少至第4位的序列、且自氨基末端起第3位的氨基酸残基是一个在该氨基酸残基的侧链上引入了脂肪酸的修饰氨基酸残基的、具有脊髓神经前驱细胞增殖作用的肽。

[3]如上述[2]所述的治疗剂，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基是一个在该残基的侧链的羟基上引入了脂肪酸的修饰氨基酸残基的肽。

[4]如上述[3]所述的治疗剂，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基的侧链的羟基被正辛酰基酰化的肽。

[5]如上述[1]～[4]所述的治疗剂，其中，所述治疗剂含有0.001mg～100mg上述物质或其药学上可接受的盐。

[6]一种培养脊髓神经前驱细胞时的脊髓神经前驱细胞增殖促进剂，其中，所述增殖促进剂以作用于生长激素促分泌素受体的物质或其盐作为有效成分。

[7]如上述[6]所述的促进剂，其中，上述物质为选自由以下(1)、(2)以及(3)构成的组的肽或其衍生物：

[8]如上述[7]所述的促进剂，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基是一个在该残基的侧链的羟基上引入了脂肪酸的修饰氨基酸残基的肽。

[9]如上述[8]所述的促进剂，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基的侧链的羟基被正辛酰基酰化的肽。

[10]如上述[6]～[9]所述的促进剂，其中，脊髓神经前驱细胞的培养基中，上述物质或其盐的含量为0.0000001mg/L～0.1mg/L。

[11]一种移植培养的脊髓神经前驱细胞时的脊髓神经再生促进剂，其中，所述的促进剂以作用于生长激素促分泌素受体的物质或其药学上可接受的盐作为有效成分。

[12]如上述[11]所述的促进剂，其中，上述物质为选自由以下(1)、(2)以及(3)构成的组的肽或其衍生物：

[13]如上述[12]所述的促进剂，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基是一个在该残基的侧链的羟基上引入了脂肪酸的修饰氨基酸残基的肽。

[14]如上述[13]所述的促进剂，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基的侧链的羟基被正辛酰基酰化的肽。

[15]如上述[11]～[14]所述的促进剂，其中，所述促进剂含有0.001mg～100mg上述物质或其药学上可接受的盐。

[16]一种脊髓神经损伤的治疗方法，其中，所述方法包含将作用于生长激素促分泌素受体的物质或其药学上可接受的盐给予个体。

[17]如上述[16]所述的方法，其中，上述物质为选自由以下(1)、(2)以及(3)构成的组的肽或其衍生物：

[18]如上述[17]所述的方法，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基是一个在该残基的侧链的羟基上引入了脂肪酸的修饰氨基酸残基的肽。

[19]如上述[18]所述的方法，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基的侧链的羟基被正辛酰基酰化的肽。

[20]如上述[16]～[19]所述的方法，其中，所述方法包括给予0.001mg～100mg上述物质或其药学上可接受的盐。

[21]一种促进培养的脊髓神经前驱细胞增殖的方法，其特征在于，所述方法使用作用于生长激素促分泌素受体的物质或其盐。

[22]如上述[21]所述的方法，其中，上述物质为选自由以下(1)、(2)以及(3)构成的组的肽或其衍生物：

[23]如上述[22]所述的方法，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基是一个在该残基的侧链的羟基上引入了脂肪酸的修饰氨基酸残基的肽。

[24]如上述[23]所述的方法，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基的侧链的羟基被正辛酰基酰化的肽。

[25]如上述[21]～[24]所述的方法，其中，培养脊髓神经前驱细胞的培养基中，上述物质或其盐的含量为0.0000001mg/L～0.1mg/L。

[26]一种促进移植培养的脊髓神经前驱细胞时的脊髓神经再生的方法，其中，所述方法包含将作用于生长激素促分泌素受体的物质或其药学上可接受的盐给予个体。

[27]如上述[26]所述的方法，其中，上述物质为选自由以下(1)、(2)以及(3)构成的组的肽或其衍生物：

[28]如上述[27]所述的方法，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基是一个在该残基的侧链的羟基上引入了脂肪酸的修饰氨基酸残基的肽。

[29]如上述[28]所述的方法，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基的侧链的羟基被正辛酰基酰化的肽。

[30]如上述[26]～[29]所述的方法，其中，所述方法包括给予0.001mg～100mg上述物质或其药学上可接受的盐。

[31]作用于生长激素促分泌素受体的物质或其药学上可接受的盐用于制备脊髓神经损伤治疗剂的应用。

[32]如上述[31]所述的应用，其中，上述物质为选自由以下(1)、(2)以及(3)构成的组的肽或其衍生物：

[33]如上述[32]所述的应用，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基是一个在该残基的侧链的羟基上引入了脂肪酸的修饰氨基酸残基的肽。

[34]如上述[33]所述的应用，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基的侧链的羟基被正辛酰基酰化的肽。

[35]如上述[31]～[34]所述的应用，其中，上述脊髓神经损伤治疗剂中含有0.001mg～100mg上述物质或其药学上可接受的盐。

[36]作用于生长激素促分泌素受体的物质或其药学上可接受的盐用于制备移植培养的脊髓神经前驱细胞时的脊髓神经再生促进剂的应用。

[37]如上述[36]所述的应用，其中，上述物质为选自由以下(1)、(2)以及(3)构成的组的肽或其衍生物：

[38]如上述[37]所述的应用，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基是一个在该残基的侧链的羟基上引入了脂肪酸的修饰氨基酸残基的肽。

[39]如上述[38]所述的应用，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基的侧链的羟基被正辛酰基酰化的肽。

[40]如上述[35]～[39]所述的应用，其中，上述脊髓神经再生促进剂中含有0.001mg～100mg上述物质或其药学上可接受的盐。

本发明表明，作用于生长激素促分泌素受体的物质具有使脊髓神经前驱细胞增殖的作用。根据此作用，通过将作用于生长激素促分泌素受体的物质给予脊髓神经损伤的个体，能够治疗脊髓神经损伤。另外，培养脊髓神经前驱细胞时，通过添加作用于生长激素促分泌素受体的物质，促进细胞增殖，可将培养的脊髓神经前驱细胞迅速用于治疗。即，通过培养脊髓神经前驱细胞，移植到脊髓神经损伤部位进行脊髓神经的修复治疗时，可将培养的脊髓神经前驱细胞更迅速地供给个体。

而且，通过将培养的脊髓神经前驱细胞移植到直接损害部位，将作用于生长激素促分泌素受体的物质给予移植部位，使得促进愈合成为可能。即，移植培养的脊髓神经前驱细胞时，可促进脊髓神经再生。

附图说明

[图1]图1表示脊髓中的GHS-R1a mRNA的表达。

[图2]图2表示通过免疫染色显示脊髓中GHS-R1a的存在。A表示用抗GHS-R抗体染色；B表示用抗GHS-R抗体处理组织后，使用抗GHS-R抗体染色。另外，图2A’及2B’为根据图2A及2B所作的图。

[图3-1]图3-1表示细胞增殖过程中，通过免疫双重染色显示脊髓神经细胞及脊髓神经前驱细胞中巢蛋白(Nestin)、Map2及GHS-R1a的共存。A表示MAP2和BrdU；B表示巢蛋白和BrdU；C表示Map2和GHS-R；D表示巢蛋白和GHS-R。各双重染色图像以Marge表示。

[图3-2]图3-2的A’、B’、C’及D’为根据图3-1的A、B、C及D所作的图。

[图4]图4表示生长素释放肽对于脊髓神经前驱细胞的BrdU摄入的促进作用。数值表示平均值±SEM。＊：p＜0.05。

[图5]图5表示生长素释放肽的脊髓神经前驱细胞增殖作用。A为不使生长素释放肽作用时，检测BrdU阳性细胞；B为使生长素释放肽作用时，检测BrdU阳性细胞。另外，A’及B’为根据A及B所作的图。

具体实施方式

生长激素促分泌素受体(GHS-R)为生长激素促分泌素(GHS：growthhormone secretagogue)结合的受体，已知存在GHS-R 1a、GHS-R 1b等亚型。上述亚型中，已知只有GHS-R 1a活化磷脂酶C关联的信号转导关联受体，使细胞内钙增加。本说明书中，称作“生长激素促分泌素受体(＝GHS-R)”时，只要没有特别说明，就是指GHS-R 1a。

GHS-R的存在可以由本领域技术人员使用公知的方法进行确认。例如，如后述实施例1所述，本领域技术人员使用公知的方法，从待确认GHS-R存在的组织中提取RNA，由该RNA得到cDNA。使用对GHS-R特异性的正义引物(例如序列编号22)及反义引物(例如序列编号23)，采用PCR法使得到的cDNA扩增，然后进行电泳，通过观察GHS-R mRNA的表达可以确认GHS-R的存在。

另外，如后述实施例2所述，本领域技术人员使用公知的方法，从待确认GHS-R存在的组织制作冰冻切片，使用抗GHS-R抗体进行免疫染色，通过用荧光显微镜观察，可以确认GHS-R的存在。

进一步地，如后述实施例3所述，通过将对于特定细胞的标记物(例如，神经细胞前驱细胞的标记物巢蛋白或神经细胞的标记物Map2(Microtuble-associated protein 2))与GHS-R进行双重染色，可以确认特定细胞中GHS-R是否表达，有助于了解作用于GHS-R的物质的作用。例如，巢蛋白阳性细胞也被抗GHS-R的抗体共染色。另外，在神经细胞中观察到Map2及GHS-R的共定位。

本说明书中，是否是作用于生长激素促分泌素受体的物质，例如可以根据细胞内钙离子浓度的上升等上述出版物记载的、通过GHS-R的生理作用作为指标进行判断。

本说明书中，对于是否“具有使细胞内钙离子浓度上升的活性”，本领域技术人员使用公知的方法，通过测定细胞内钙离子浓度可以判断。例如，可以使用利用钙离子浓度变化引起的Fluo-4 AM(Molecular Probe公司)荧光强度变化的荧光成像读数仪(Fluorometric Imaging PlateReader，FLIPR，Molecular Devices公司)。另外，本领域技术人员可以使用公知的方法确认具有细胞内钙离子浓度上升活性的肽在体外(invitro)及体内(in vivo)是否具有生长激素促分泌素活性。例如，在体外，将肽添加到确认不仅分泌生长激素、还表达GHS-R的脑垂体细胞中，通过使用抗生长激素抗体的放射免疫分析法可以测定细胞培养液中分泌的生长激素。为了确认体内生长激素分泌促进活性，只要将具有细胞内钙浓度上升活性的肽注射到动物的末梢静脉后，测定血清中的生长激素浓度即可。

本说明书中，对于是否是“具有脊髓神经前驱细胞增殖作用的物质”，本领域技术人员可以使用公知的方法进行检查，例如，用胸腺嘧啶脱氧核苷(Thymidine)的类似物、使用细胞周期S期特异性掺入DNA的溴脱氧尿苷(BrdU)，如后述实施例4及实施例5所述，在试验物质的存在下或不存在下，在添加BrdU的培养基中培养细胞，使细胞摄入BrdU后，使用抗BrdU抗体将摄入BrdU的细胞进行染色，可以检查该细胞。

这时，如上所述，也可以将对于特定细胞的标记物(例如神经细胞前驱细胞的标记物巢蛋白或神经细胞的标记物Map2)或特定的受体(例如GHS-R)与BrdU进行双重染色。与试验物质不存在下培养的细胞(对照)相比，试验物质存在下培养的细胞中被染色的摄入BrdU的细胞数多时，可以判断该试验物质为具有脊髓神经细胞增殖作用的物质。只要是与对照相比有明显差别即可，并没有特别限定，例如，与对照相比，试验物质存在下培养的细胞中被染色的摄入BrdU的细胞数优选为105％以上，更优选为110％以上。

另外，例如后述实施例4及实施例5所述，在试验物质存在下或不存在下，在添加BrdU的培养基中培养细胞，使细胞摄入BrdU后，采用ELISA法也可以测定细胞中的BrdU摄入量。与试验物质不存在下培养的细胞(对照)相比，试验物质存在下培养的细胞中的BrdU摄入量多时，可以判断该试验物质为具有脊髓神经前驱细胞增殖作用的物质。只要是与对照相比有明显差别即可，并没有特别限定，例如，与对照相比，试验物质存在下培养的细胞中的BrdU摄入量优选为105％以上，更优选为110％以上。

关于上述确认的具有脊髓神经前驱细胞增殖作用的物质，例如后述实施例6所述，通过与大鼠脊髓损伤模型移植脊髓神经前驱细胞一起给予该物质，可以确认是对个体脊髓损伤恢复有用的物质。

本发明的药物可以作为包括人在内的动物(个体)用药物使用。本发明中，“作用于生长激素促分泌素受体的物质”是指作用于生长激素促分泌素受体(GHS-R)的物质(配体)，优选通过与GHS-R结合、具有使细胞内钙离子浓度上升活性的物质，更加优选具有促进尿苷摄入作用的物质。例如可以举出生长激素促分泌素(GHS)。进一步地，作为GHS，可以使用公知的肽化合物或低分子化合物，特别优选生长素释放肽。

“肽”是指由多个氨基酸通过肽键连接在一起的化合物。这里，氨基酸(或者也表现为氨基酸残基)是指通式：NH₂-CH(R′)-COOH的氨基酸中，除了R′具有天然存在的取代基的天然氨基酸外，还包含其D，L-光学异构体等。天然氨基酸有时也被修饰氨基酸(或者表现为修饰氨基酸残基)取代。修饰氨基酸不只是上述通式的取代基R′进一步被修饰的氨基酸及其D，L-光学异构体，例如也包含上述通式的取代基R′中，通过或不通过酯、醚、硫酯、硫醚、酰胺、脲或硫脲等与各种取代基结合的非天然氨基酸。另外，也包含氨基酸的氨基被低级烷基取代的非天然氨基酸。

本说明书中，“肽衍生物”例如包含肽中至少有1个氨基酸被非氨基酸化合物取代的化合物、肽的氨基末端及/或羧基末端被修饰的化合物(例如羧基末端被酰胺化的化合物)、肽中至少有1个氨基酸被非氨基酸化合物取代且氨基末端及/或羧基末端被修饰的化合物，上述“肽”及“肽衍生物”在本说明书中总称为“肽化合物”。

本说明书中，“氨基酸”包含L-氨基酸、D-氨基酸、α-氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸、天然氨基酸、合成氨基酸等所有氨基酸。

本说明书中，“修饰氨基酸”是指上述氨基酸的任意基团被化学修饰的氨基酸。特别优选α-氨基酸中的α碳原子被化学修饰的修饰氨基酸。

本说明书中，“生长素释放肽”是指具有序列编号1～21的任一个序列以及自氨基末端起第3位的氨基酸残基的侧链的羟基被脂肪酸酰化的肽。脂肪酸的碳原子数优选为2、4、6、8、10、12、14、16或18，更加优选辛酸及癸酸或其单烯脂肪酸或其多烯脂肪酸，特别优选辛酸(碳原子数为8的辛酰基)。关于各序列编号，优选分别具有“背景技术”部分所述的脂肪酸的序列编号。

作为生长素释放肽，如上所述，以来自人的生长素释放肽为主，可以使用来自大鼠、小鼠、猪、牛等其他动物的生长素释放肽及其衍生物。

对于各个体，优选使用来自该个体所属的种属的生长素释放肽，例如对于人，优选使用来自人的生长素释放肽。作为来自人的生长素释放肽，例如可以举出具有由28个氨基酸构成的序列编号1的序列以及自氨基末端起第3位的丝氨酸残基的侧链的羟基被脂肪酸(正辛酰基)酰化的肽。另外，作为生长素释放肽的衍生物，例如只要是下述肽就可以使用：序列编号1～21所示的氨基酸序列中，具有自氨基末端起第5～28位(优选第11～28位)的氨基酸残基中取代、插入、或缺失1个或多个氨基酸的氨基酸序列、且作用于生长激素促分泌素受体(GHS-R)的肽。

即，序列编号1～21所示的氨基酸序列中，只要是具有自氨基末端起至第4位的序列、例如至少至第5位、优选至第10位的序列，且自氨基末端起第3位的氨基酸残基的侧链的羟基被脂肪酸酰化的物质，便可以作为生长素释放肽衍生物使用，例如，如实施例5所述的生长素释放肽(1-5)-Lys-NH₂(GSS(正辛酰基)FLK-NH₂)及生长素释放肽(1-7)-Lys-NH₂(GSS(正辛酰基)FLSPK-NH₂)，可以使用具有自生长素释放肽的氨基末端起至少至第5位的序列的物质。

这种衍生物，通过添加碱性氨基酸，GHS-R表达细胞中的类似于生长素释放肽的活性(细胞内钙浓度上升活性)增强，或氨基酸的羧基末端不用羧酸终止，而是将酰胺化的肽键作为模拟形式，可以发现更短的氨基酸序列中的最小活性单位，因此，根据需要，也可以是在羧基末端添加碱性氨基酸的物质，或者是引入-Lys-NH₂这种酰胺体氨基酸的物质。

本说明书中，关于氨基酸“1个或多个被取代、缺失、插入、及/或添加”时的被取代等的氨基酸个数，只要由其氨基酸序列构成的肽或其衍生物具有所希望的功能，没有特别限定，例如为1～9个或1～4个左右。只要是性质(电荷及/或极性)相似的氨基酸的取代等，即使多个氨基酸被取代，可能也不会失去所希望的功能。

另外，作为肽或其衍生物的氨基酸序列，与天然型的氨基酸序列相比，希望具有70％以上的同源性，优选80％以上、更加优选90％以上、特别优选95％以上、最优选97％以上的同源性。来自其他动物的生长素释放肽(序列编号2～21)也同样。

关于其他肽或其衍生物，例如可以参照上述专利文献1的描述设计。例如，作为优选的肽或其衍生物有：

具有序列编号1～21、优选序列编号1～9、更加优选序列编号1所示的氨基酸序列的任一个以及自氨基末端起第3位的氨基酸为侧链上引入了脂肪酸的修饰氨基酸的肽或其衍生物；

生长素释放肽的氨基末端起第2位或第3位的氨基酸残基，为氨基酸的α碳原子上通过或不通过碳原子数为1～10的亚烷基，经酯、醚、硫醚、硫酯、酰胺、脲、硫脲或二硫键等引入了碳原子数1～35的饱和或不饱和烷基链的修饰氨基酸残基，或氨基酸的α碳原子上引入了碳原子数1～35的饱和或不饱和烷基链的修饰氨基酸残基的肽或其衍生物；

生长素释放肽的侧链上引入的脂肪酸为选自碳原子数为2、4、6、8、10、12、14、16及18的脂肪酸(优选辛酸及癸酸或其单烯脂肪酸或其多烯脂肪酸)构成的组中的脂肪酸的肽或其衍生物；

生长素释放肽的羧基末端引入了酸性的掩蔽剂(masking)及碱性基团的肽或其衍生物；

生长素释放肽的3位的氨基酸为疏水性氨基酸(例如色氨酸、环己基丙氨酸、萘基丙氨酸等芳香族疏水性氨基酸；或亮氨酸、异亮氨酸、带有取代基的亮氨酸(ylleucine)、缬氨酸等脂肪族疏水性氨基酸)的肽或其衍生物；

生长素释放肽的3位的氨基酸为碱性的肽或其衍生物；

生长素释放肽的2位的氨基酸为侧链较小、不束缚邻近残基自由度的氨基酸(例如丝氨酸、丙氨酸、正缬氨酸)的肽或其衍生物；

生长素释放肽的3位和4位的氨基酸均为L-型的肽或其衍生物；

生长素释放肽或其衍生物的羧基末端为酰胺体的肽或其衍生物等。

除了上述以外，作为本发明的作用于生长激素促分泌素受体的物质，可进一步使用肽化合物生长激素释放肽-2(GHRP-2)(D-Ala-D-βNal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂)及GHRP-6(His-D-Trp-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH₂)(Muccioli，G等人：J.Endocrino，157，99-106(1998))及其衍生物。进一步地，作为低分子化合物，可以使用L-692，429(MK-0751)及L-163，191(MK-0677)等(Patchett等人：Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，92，pp.7001-7005(1995))。

本发明的作用于生长激素促分泌素受体的物质可以通过常规方法得到(例如，参照J.Med.Chem.，43，pp.4370-4376，2000以及专利文献1)。例如，可以从天然原料分离得到，或者可以通过重组DNA技术及/或化学合成制备。进一步地，生长素释放肽及其衍生物等肽化合物中，氨基酸残基上需要修饰(酰化)时，可以按照公知的方法进行修饰反应。例如使用重组DNA技术的制备方法中，培养通过表达载体转化的宿主细胞，其中该表达载体具有编码本发明肽化合物的DNA，从该培养物中获取目的肽化合物，也可以得到本发明的肽化合物。通过选择该宿主细胞，可以得到该细胞内目的肽化合物被修饰(例如酰化)的化合物。另外，当该肽化合物没有被修饰时，也可以根据要求，按照公知的方法进行酰化等修饰反应。

作为掺入基因的载体，例如有大肠杆菌载体(pBR322、pUC18、pUC19等)、枯草杆菌载体(pUB110、pTP5、pC194等)、酵母载体(YEp型、YRp型、YIp型)、或动物细胞载体(逆转录病毒、痘苗病毒等)等。可以使用任何其他的载体，只要它们在宿主细胞内能够稳定地保持目的基因。将载体导入到合适的宿主细胞中。作为将目的基因掺入到质粒的方法及导入到宿主细胞的方法，例如可以使用Molecular Cloninng(Sambrook等人，1989)中记载的方法。

上述质粒中，为了使目的肽基因得以表达，在该基因的上游以可发挥作用的方式连接启动子。

本发明中使用的启动子可以为任何启动子，只要它适合于目的基因表达所使用的宿主细胞。例如，当转化的宿主细胞为埃希氏菌属(Escherichia)时，可以使用lac启动子、trp启动子，lpp启动子、λPL启动子，recA启动子等；当宿主细胞为芽孢杆菌(Bacillus)属时，可以使用SPO1启动子、SPO2启动子等；当宿主细胞为酵母时，可以使用GAP启动子，PHO5启动子、ADH启动子等；当宿主细胞为动物细胞时，可以使用来自SV40的启动子、来自逆转录病毒的启动子等。

使用上述得到的含有目的基因的载体转化宿主细胞。作为宿主细胞，可以使用细菌(例如埃希氏菌属、芽孢杆菌属等)、酵母(酵母菌(Saccharomyces)属、毕赤酵母(Pichia)属、假丝酵母(Candida)属等)、动物细胞(CHO细胞、COS细胞等)等。作为培养时的培养基，优选液体培养基，特别优选该培养基中含有培养的转化细胞生长所需要的碳源、氮源等。根据要求可以添加维生素类、促生长因子、血清等。

为了直接制备脂肪酸修饰(酰化)的肽化合物，优选具有如下活性的细胞，所述活性为能够在适当位置切断该肽化合物的前体多肽的加工蛋白酶活性以及能够将该肽化合物中的丝氨酸残基酰化的活性。这种具有加工蛋白酶活性及丝氨酸酰化活性的宿主细胞，可以通过如下进行挑选：用含有编码该前体多肽的cDNA的表达载体来转化宿主细胞，确认该转化细胞产生具有钙上升活性或促进生长激素分泌活性的脂肪酸修饰肽。

培养后，按照常规方法从培养物中分离纯化本发明的肽化合物。例如，为了从培养菌体或细胞中提取目的物质，培养后，收集菌体或细胞，悬浮在含有蛋白变性剂(盐酸胍等)的缓冲液中，通过超声波等将菌体或细胞粉碎后，进行离心分离。然后，为了从上清液中纯化目的物质，根据目的物质的分子量、溶解度、电荷(等电点)、亲和性等，可以适当组合使用凝胶过滤、超滤、透析、SDS-PAGE、各种色谱法等分离纯化方法进行。

本发明的作用于生长激素促分泌素受体的物质(例如生长素释放肽及其衍生物)可以按照常规方法进行化学合成。例如，将带有保护基的氨基酸通过液相法及/或固相法缩合，使肽链延长，用酸去除全部保护基，将得到的粗产物用上述纯化方法纯化可以得到本发明的作用于生长激素促分泌素受体的物质。也可以用酰化酶或酰基转移酶选择性地将位于目的位置的氨基酸侧链酰化。

另外，肽化合物的制备方法目前已知有各种方法，作为本发明物质的肽化合物也可以用公知的方法容易地制备，例如可以用经典的肽合成法，也可以用固相法容易地制备。

另外，也可以使用将重组DNA技术和化学合成相结合的制备方法，也可以通过化学合成制备含有修饰氨基酸残基的片段，使用重组DNA技术制各不含有修饰氨基酸残基的其他片段，然后通过使各片段融合的方法制备(参照专利文献1)。

作为本发明可以使用的作用于生长激素促分泌素受体的物质(例如，生长素释放肽及其衍生物)的盐，优选药学上可接受的盐，例如与无机碱的盐、与有机碱的盐、与无机酸的盐、与有机酸的盐、与碱性或酸性氨基酸的盐等。

作为与无机碱的盐，优选的例子例如有钠盐、钾盐等碱金属盐；钙盐、镁盐等碱土类金属盐；以及铝盐、铵盐等。

作为与有机碱的盐，优选的例子例如有与三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、N，N’-二苄基乙二胺等的盐。

作为与无机酸的盐，优选的例子例如有与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等的盐。

作为与有机酸的盐，优选的例子例如有与甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、琥珀酸、苹果酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等的盐。

作为与碱性氨基酸的盐，优选的例子例如有与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等的盐。作为与酸性氨基酸的盐，优选的例子例如有与天冬氨酸、谷氨酸等的盐。

上述盐中，最优选钠盐、钾盐。

本发明的作用于生长激素促分泌素受体的物质(例如生长素释放肽)，如本说明书的实施例所具体表示的那样，发现具有脊髓神经前驱细胞增殖作用，特别是可以显著增加胎儿的脊髓神经前驱细胞数。这种细胞增殖作用可以通过或不通过生长激素促分泌素受体产生。

本领域技术人员可以使用公知的方法检查细胞的增殖，例如，可以通过检测BrdU摄入量、摄入BrdU的细胞数来检查细胞的增殖。这种检测例如可以使用上述方法以及后述实施例所述的方法。

即，本发明的作用于生长激素促分泌素受体的物质(例如生长素释放肽)或其药学上可接受的盐，可以用作治疗脊髓神经损伤的脊髓神经损伤治疗剂、培养脊髓神经前驱细胞时的培养脊髓神经前驱细胞的增殖促进剂、及移植培养的脊髓神经前驱细胞时的脊髓神经再生促进剂及治疗剂的有效成分。

另外，通过将本发明的作用于生长激素促分泌素受体的物质(例如生长素释放肽)或其药学上可接受的盐给予个体，可以用于个体的脊髓神经损伤的治疗方法；培养脊髓神经前驱细胞时，促进培养的脊髓神经前驱细胞增殖的方法；以及移植培养的脊髓神经前驱细胞时，促进脊髓神经再生的方法。

进一步地，本发明的作用于生长激素促分泌素受体的物质(例如生长素释放肽)或其药学上可接受的盐，可以用于制备治疗脊髓神经损伤的脊髓神经损伤治疗剂、培养脊髓神经前驱细胞时的培养脊髓神经前驱细胞增殖促进剂、以及移植培养的脊髓神经前驱细胞时的脊髓神经再生促进剂。

含有以作用于生长激素促分泌素受体的物质(例如生长素释放肽)或其药学上可接受的盐作为有效成分的本发明的药物，可以与药理学上可接受的载体、赋形剂、增量剂等混合，用于个体(例如，人、小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、马、猪、猴等)。

本发明的药物(治疗剂、促进剂)对于正在进行脊髓神经再生治疗的个体，优选非经口给药，例如通过静脉内、皮下、肌肉内注射，单次或分多次给予规定量。当个体为成人，特别是家庭治疗的时候，优选经鼻给药、经肺给药、栓剂给药。

本发明中，对药物的给药量没有特别限定，可以根据使用目的以及作为给药对象的个体的年龄、体重、个体的种类、症状、营养状态及并用药物等适当选择，单次或多次给予成人时，以作用于生长激素促分泌素受体的物质(例如生长素释放肽)或其药学上可接受的盐作为有效成分，优选为0.001mg～100mg的范围，更加优选为0.01mg～10mg。

作为给药时间，优选给予上述给药量1日1次～多次、给药4周～24周，更加优选给药4周～12周。

作为药学上可接受的载体，可以使用作为制剂材料常用的各种有机或无机载体物质，作为固体制剂中的赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂；液体制剂中的溶剂、增溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂、无痛化剂等配合。

另外，根据需要，也可以使用防腐剂、抗氧剂、着色剂、甜味剂等制剂添加物。

作为赋形剂，优选的例子例如有乳糖、蔗糖、D-甘露糖醇、淀粉、结晶纤维素、轻质硅酸酐等。

作为润滑剂，优选的例子例如有硬脂酸镁、硬脂酸钙、滑石、胶体二氧化硅等。

作为粘合剂，优选的例子例如有结晶纤维素、蔗糖、D-甘露糖醇、糊精、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。

作为崩解剂，优选的例子例如有淀粉、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠等。

作为溶剂，优选的例子例如有注射用水、醇、丙二醇、聚乙二醇、芝麻油、玉米油等。

作为增溶剂，优选的例子例如有聚乙二醇、丙二醇、D-甘露糖醇、苯甲酸苄酯、乙醇、三羟甲基氨基甲烷(trisaminomethane)、胆固醇、三乙醇胺、碳酸钠、柠檬酸钠等。

作为悬浮剂，优选的例子例如有硬脂酰三乙醇胺、月桂基硫酸钠、月桂基氨基丙酸、卵磷脂、苯扎氯铵、苄索氯铵、单硬脂酸甘油酯等表面活性剂；例如聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素等亲水性高分子等。

作为等渗剂，优选的例子例如有氯化钠、甘油、D-甘露糖醇等。

作为缓冲剂，优选的例子例如有磷酸盐、醋酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐等的缓冲液等。

作为无痛化剂，优选的例子例如有苯甲醇等。

作为防腐剂，优选的例子例如有对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯甲醇、苯乙醇、脱氢乙酸、山梨酸等。

作为抗氧剂，优选的例子例如有亚硫酸盐、抗坏血酸等。

作为本发明的药物的制剂形式，优选适于非经口给药的制剂形式。作为适于非经口给药的制剂形式，例如有静脉内给药、皮内给药、皮下给药、或肌肉内给药用等的注射剂、点滴剂、栓剂、经皮吸收剂、经粘膜吸收剂、或吸入剂等。优选上述注射剂的制剂形式，特别是个体为成人进行家庭治疗的时候；也优选经粘膜吸收剂、吸入剂、栓剂等制剂形式。这些制剂形式本领域技术人员已知道多种，他们可适当选择适于所希望的给药途径的制剂形式，根据需要使用本领域能够使用的1种或2种以上的制剂用添加物，可以制备药物组合物形式的制剂。

例如，注射剂或点滴剂形式的药物可以如下配制：将作为有效成分的作用于GHS-R1a的物质(例如生长素释放肽)与适当的缓冲液、糖溶液、等渗剂、pH调节剂、无痛化剂、防腐剂等1种或2种以上的制剂用添加物，在注射用蒸馏水中溶解，灭菌(过滤器)过滤后，装入安瓿或小瓶，或将灭菌过滤的溶液进行冻干，制成冻干制剂。作为添加剂，例如可以使用葡萄糖、甘露糖醇、木糖醇、乳糖等糖类；聚乙二醇等亲水性聚合物类；甘油等醇类；甘氨酸等氨基酸类；血清白蛋白等蛋白类；NaCl、柠檬酸钠等盐类；醋酸、酒石酸、抗坏血酸等酸类；吐温(Tween)80等表面活性剂；亚硫酸钠等还原剂等。这种制剂通过临用时添加注射用蒸馏水或生理盐水等溶解，可以作为注射剂或点滴剂使用。另外，对于经粘膜给药，也优选滴鼻剂和鼻腔内喷雾剂等鼻腔内给药剂(经鼻给药剂)等；对于经肺给药，也优选吸入剂等。

每单位制剂中的作用于生长激素促分泌素受体的物质(例如生长素释放肽)或其药学上可接受的盐的含量为0.001mg～100mg，优选0.01mg～10mg、希望1日1次～多次给药。

作为分离的脊髓神经前驱细胞的处理方法，可以将分离的脊髓神经前驱细胞在培养液中培育，培养液中添加无菌过滤或高压釜灭菌配制的作用于生长激素促分泌素受体的物质(例如生长素释放肽)或其药学上可接受的盐0.1nM～1μM，优选1nM～100nM进行处理。也可以通过添加作用于生长激素促分泌素受体的物质(例如生长素释放肽)或其药学上可接受的盐0.0000001mg/L～0.1mg/L进行处理。通过进行这种处理，如实施例4及实施例5所示，能够促进本来几乎没有增殖进展的脊髓神经前驱细胞的增殖。

进一步地，如实施例6所示，能够促进个体的脊髓损伤引起的功能障碍的恢复。

本说明书中，关于物质(例如肽化合物)或其盐，说到量的时候(例如“含有物质或其药学上可接受的盐0.001mg～100mg”、“物质或其盐的含量为0.0000001mg/L～0.1mg/L”等)，除了特殊的情况，其量表示作为物质本身(例如肽化合物)的量。也就是说，对于盐，除了特殊的情况，作为相当于对应物质(例如肽化合物)的量记载。

实施例

下面通过实施例具体说明本发明。

实施例1大鼠胎儿脊髓中的GHS-R1a mRNA的表达

从妊娠13～19天的Wistar大鼠胎儿及刚出生后的大鼠胎儿摘除脊髓组织，使用Trizol试剂(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD USA)，根据Nakahara等人：Biochem.Biophys.Res.Commun.303：751-755(2003)中记载的方法，提取总RNA。由总RNA 1μg，通过随机引物反转录，使用Superscript 3预扩增试剂(Life Technologies，Inc.)合成单链cDNA。使用对GHS-R1a特异性的正义引物和反义引物，采用PCR法(使用BDAdvantage^TM 2 PCR Enzyme System，BD Science，CA USA)使得到的cDNA扩增后，使用2％琼脂糖凝胶进行电泳。另外，作为对照mRNA，使用对细胞稳定表达的GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)。

作为对GHS-R1a特异性的PCR引物，正义使用5’-GATACCTCTTTTCCAAGTCCTTCGAGCC-3’(序列编号22)，反义使用5’-TTGAACACTGCCACCCGGTACTTCT-3’(序列编号23)(登录号AB001982中的核苷酸842-869和1001-1025，GenBank)。

作为对GAPDH特异性的引物，正义使用5’-CGGCAAGTTCAACGGCACA-3’(序列编号24)，反义使用5’-AGACGCCAGTAGACTCCACGACA-3’(序列编号25)(登录号AF106860中的核苷酸1002-1020和1125-1147，GenBank)。

结果如图1所示。根据图1确认妊娠13、15、17、19天(ED13，15，17，19)的大鼠胎儿的脊髓以及刚出生后(PD0)的新生儿的脊髓中有GHS-R1a mRNA表达。

实施例2脊髓细胞中的GHS-R1a的存在

从妊娠17天的Wistar大鼠采取胎儿的脊髓，制作厚度14μm冰冻切片。将该切片用4％多聚甲醛/0.1M磷酸缓冲液固定30分钟，用0.1M磷酸缓冲液洗涤后，用处于PBS中的2％正常山羊血清室温培育30分钟。然后，将切片用PBS洗涤3次，与兔抗GHS-R抗体于4℃培育一夜，用PBS洗涤后，与结合Alexa Fluoro 488的山羊抗兔IgG一起培育，进行免疫染色。洗涤残留抗体，包埋切片后，用荧光显微镜观察。

结果如图2所示。根据使用抗GHS-R抗体的免疫染色，表明在存在有神经细胞的细胞体的灰质中，存在GHS-R1a(图2A)。通过抗GHS-R抗体预处理，免疫染色强度明显下降(图2B)。

实施例3细胞增殖时，脊髓神经细胞及脊髓神经前驱细胞中的巢蛋白、 Map2及GHS-R 1a的共存

为了确认细胞增殖的细胞(摄入BrdU的细胞)中，神经细胞前驱细胞的标记物巢蛋白、神经细胞的标记物Map2及GHS-R的共存，进行了免疫双重染色。

从妊娠17天的Wistar系大鼠麻醉下剖腹取出胎儿。从该胎儿采取脊髓，在冷Hanks液内进行木瓜蛋白酶消化，经移液管机械分离，得到胎儿脊髓细胞分散液。将该分散细胞过滤及离心分离后，悬浮在含有NaHCO₃、5％牛胎儿血清、青霉素(100U/mL)及链霉素(100μg/mL)的DMEM培养基中，在层粘连蛋白涂层的96孔多孔板上以10⁵细胞/孔接种细胞。

向其中添加5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)(10μM)，培育4天，使脊髓细胞摄入BrdU。将脊髓细胞用甲醇及冰醋酸于-20℃处理20分钟以进行固定。通过2M HC1使DNA变性，用处于PBS中的2％正常山羊血清室温封闭30分钟。

巢蛋白的染色使用抗巢蛋白小鼠单克隆抗体(1∶1000，ChemiconInternational，Inc.CA，USA)、Map2的染色使用小鼠抗Map2多克隆抗体(1∶1000，Chemicon International，Inc.)，于4℃培育一夜。然后，使用结合FITC的山羊抗小鼠IgG(1∶200，Chemicon International)作为二次抗体，将巢蛋白及Map2均在室温培育1小时。

细胞的洗涤工序后，使用大鼠抗BrdU单克隆抗体(1∶1000，Abcam，Cambridge，UK)作为一次抗体、使用结合Cy^TM 3的驴抗大鼠IgG多克隆抗体(1∶1000，Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，PA，USA)作为二次抗体，进行BrdU的双重染色。将洗涤后的细胞用4％多聚甲醛/0.1M磷酸缓冲液固定后，首先使用上述巢蛋白或Map2的抗体培育，然后使用兔抗GHS-R抗体培育以进行GHS-R的双重染色。

结果如图3-1所示。GHS-R在表达Map2的、形成树突特征的脊髓神经细胞中也有表达(图3-1C)，由此暗示作用于含有生长素释放肽的GHS-R 1a的物质可能使脊髓神经细胞增殖。但是，巢蛋白染色细胞中，GHS-R在细胞质中同时被染色(图3-1D)，由此强烈暗示脊髓神经前驱细胞中有GHS-R表达，作用于含有生长素释放肽的GHS-R 1a的物质可能使脊髓神经前驱细胞增殖。

进一步地，用生长素释放肽处理后，观察Map2染色细胞与用BrdU染色的细胞的双重染色图像，由于两者没有被同时染色，由此可知生长素释放肽显示增殖作用的细胞不是脊髓神经细胞(图3-1A)。另一方面，由于巢蛋白染色细胞显示多形性，其核内摄入BrdU，由此表示该细胞为脊髓神经细胞前驱细胞，表明生长素释放肽具有脊髓神经前驱细胞增殖作用(图3-1B)。

实施例4生长素释放肽对培养的脊髓神经前驱细胞对BrdU摄入的促进作用及脊髓神经前驱细胞增殖作用

从妊娠17天的Wistar系大鼠麻醉下剖腹取出胎儿。从该胎儿采取脊髓，在冷Hanks液内进行木瓜蛋白酶消化，经移液管机械分离，得到胎儿脊髓神经前驱细胞的分散液。将该分散细胞过滤及离心分离后，悬浮在含有NaHCO₃、5％牛胎儿血清、青霉素(100U/mL)及链霉素(100μg/mL)的DMEM培养基中，在层粘连蛋白涂层的96孔多孔板上以10⁵细胞/孔接种细胞。培育4天后，添加5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)(10μM)，培育6小时，再添加大鼠生长素释放肽(0.003～300nM)，培育12小时。

培育结束后，回收细胞，用细胞增殖ELISA试剂盒(Roche DiagnosticGmbH，Mannheim，Germany)测定细胞中的BrdU摄入量，研究了生长素释放肽对BrdU摄入的作用。

结果如图4所示。使生长素释放肽作用于脊髓神经前驱细胞，通过3nM以上的生长素释放肽，细胞中的BrdU摄入增加(图4)。

另外，培育结束后，将细胞用甲醇、冰醋酸固定，用2N HCl使DNA变性后，将细胞中摄入的BrdU，使用大鼠抗BrdU单克隆抗体(1∶1000，Abcam，Cambridge，UK)作为一次抗体、使用结合Cy^TM 3的驴抗大鼠IgG多克隆抗体(1∶1000，Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.，PA，USA)作为二次抗体，检测BrdU阳性细胞，研究了生长素释放肽对脊髓前驱细胞的增殖作用。

作为对照，使生理盐水代替生长素释放肽进行作用并进行比较。

结果如图5所示。与不使生长素释放肽作用的情况(图5A)相比，使生长素释放肽作用的情况(图5B)检测到的BrdU阳性细胞数多，在细胞水平上确认了生长素释放肽具有使脊髓神经前驱细胞增殖的作用。

实施例5生长素释放肽及其衍生物对于培养的脊髓神经前驱细胞对 BrdU摄入的促进作用

从妊娠16天的Wistar系大鼠麻醉下剖腹取出胎儿。从该胎儿采取脊髓，在冷Hanks液内进行木瓜蛋白酶消化，经移液管机械分离，得到胎儿脊髓神经前驱细胞的分散液。将该分散细胞过滤及离心分离后，悬浮在含有NaHCO₃、5％牛胎儿血清、青霉素(100U/mL)及链霉素(100μg/mL)的DMEM培养基中，在层粘连蛋白涂层的96孔多孔板上以10⁵细胞/孔接种细胞。培育4天后，添加5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)(10μM)，培育6小时，再添加大鼠生长素释放肽、生长素释放肽(1-5)-Lys-NH₂(GSS(正辛酰基)FLK-NH₂)、生长素释放肽(1-7)-Lys-NH₂(GSS(正辛酰基)FLSPK-NH₂)或具有下述结构的MK-0677(0.03～3nM)，培育12小时，研究了生长素释放肽对BrdU摄入的作用。

[化1]

结果如表1所示。使生长素释放肽作用于脊髓神经前驱细胞，通过0.03～3nM以上的生长素释放肽、或0.3～3nM的生长素释放肽(1-5)-Lys-NH₂或生长素释放肽(1-7)-Lys-NH₂，细胞中的BrdU摄入增加，由此确认生长素释放肽及其衍生物具有使胎儿脊髓神经前驱细胞增殖的作用。

另外，在细胞水平上确认了与生长素释放肽及其衍生物相同，化学合成的GHS-R的低分子激动剂低浓度(0.03nM)的MK-0677也具有使脊髓神经前驱细胞增殖的作用。

表1生长素释放肽及其衍生物对培养的脊髓神经前驱细胞BrdU摄入的促进作用

GHS-R激动剂	浓度(nM)	n	平均值±S.D.	t-检验
GHS-R激动剂	浓度(nM)	n	平均值±S.D.	t-检验	生长素释放肽生长素释放肽生长素释放肽(1-5)-Lys-NH₂生长素释放肽(1-7)-Lys-NH₂MK-0677对照	0.030.330.030.330.030.330.030.330	66666666666612	112.5±8.7112.0±15.0120.4±7.9106.9±13.2114.2±11.3103.5±9.6108.3±11.6115.9±14.1140.5±41.9119.5±4.6112.0±13.9105.8±13.0100.0±6.7	p＜0.01NSDp＜0.01NSDp＜0.05NSDNSDp＜0.05p＜0.05p＜0.01NSDNSD-

NSD：无显著性差异

据此，使生长素释放肽及其衍生物作用于胎儿培养脊髓神经前驱细胞，细胞中的BrdU摄入增加的同时，BrdU阳性细胞数增加，由此表明，生长素释放肽或其衍生物具有使脊髓神经前驱细胞增殖的作用。

实施例6对于大鼠脊髓损伤模型的脊髓神经前驱细胞移植及生长素释放肽局部给药的评价

按照Morino，T.等人，Neuroscience Research，2003，vol.46，pp309-318记载的方法，对于大鼠脊髓损伤模型的脊髓神经前驱细胞移植及生长素释放肽局部给药进行了评价。将SD系雄性大鼠(8～9周龄)用戊巴比妥麻醉，切开背部，使露出脊椎骨(L11)。切除椎弓后，用牙科用钻子打开直径约3mm的窗口，将硅橡胶固定在不锈钢针上，将其垂直放上，上部负荷重20g的重物。压迫时间设定为30分钟，最后从上部加入重量相当于约100g的造成损伤的下落物，构建下肢发生运动障碍的模型。组的构成为：1)假手术组、2)脊髓损伤对照组、3)脊髓损伤+细胞移植+生长素释放肽局部给药组。假手术组中，在椎弓切除后对肌肉、皮肤进行了缝合。脊髓损伤后，硬膜下移植培养的脊髓神经前驱细胞10⁵细胞/25μL。硬膜下与细胞一起给予大鼠生长素释放肽1nmol。

手术后24小时，将大鼠转移到透明笼子内，观察站立次数(观察3分钟)。即，评价反映大鼠后肢功能的站立(举起上肢，只用下肢支撑体重的姿势)的次数。结果如表2所示。

表2对于大鼠脊髓损伤模型的脊髓神经前驱细胞移植及生长素释放肽局部给药的效果

组	术前	术后24小时	t-检验^*	t-检验^**
组	术前	术后24小时	t-检验^*	t-检验^**	假手术组脊髓损伤对照组脊髓损伤+细胞移植+生长素释放肽给予组	10.7±3.810.7±2.511.7±2.3	4.3±4.21.3±0.68.7±4.2	-NSNS	-P＜0.05

数字表示单位时间的平均站立次数。

注^*：假手术组(术前)对脊髓损伤组(术前)

注^**：脊髓损伤对照组(术后)对脊髓损伤处理组(术后)

NS：无显著性

如表2所示，脊髓损伤模型对照组中站立次数由术前的10.7次减少到1.3次，通过细胞移植+生长素释放肽局部给药，站立次数恢复。

序列表

<110>University of Miyazaki，

国立大学法人宫崎大学

Asubio Pharma.Co.Ltd.，

阿斯比奥制药株式会社

Japan as represented by President of National Cardiovascular Center

国立循环器病中心总长代表的日本国

<120>SPINAL NERVE REPAIR PROMOTING THERAPEUTICS CONTAINING GHRELINOR ITS DERIVATIVES OR SUBSTANCES THAT ACT ON GHS-R1a AS AN ACTIVEINGREDIENT

<130>FA0011-07112

<150>JP 2006-220573

<151>2006-8-11

<160>25

<210>1

<211>28

<212>PRT

<213>Homo sapiens智人

<221>PEPTIDE肽

<223>Amino acid sequence for human endogenous peptides of growth hormone secretagogue

生长激素促分泌素的人内源性肽的氨基酸序列

<400>1

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Gln Arg Lys

1 5 10 15

Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg

20 25

<210>2

<211>27

<212>PRT

<213>Homo sapiens智人

<220>

<221>PEPTIDE肽

<223>Amino acid sequence for human endogenous peptides(27 amino acids)of growthhormone secretagogue

生长激素促分泌素的人内源性肽(27个氨基酸)的氨基酸序列

<400>2

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Arg Val Gln Arg Lys Glu

1 5 10 15

Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg

20 25

<210>3

<211>28

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus褐家鼠

<221>PEPTIDE肽

<223>Amino acid sequence for rat endogenous peptides of growth hormone secretagogue

生长激素促分泌素的大鼠内源性肽的氨基酸序列

<400>3

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys

1 5 10 15

Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg

20 25

<210>4

<211>27

<212>PRT

<213>Rattus norvegicus褐家鼠

<221>PEPTIDE肽

生长激素促分泌素的大鼠内源性肽的氨基酸序列

<400>4

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Arg Lys Glu

1 5 10 15

Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg

20 25

<210>5

<211>28

<212>PRT

<213>Mus musculus小家鼠

<221>PEPTIDE肽

<223>Amino acid sequence for mouse endogenous peptides of growth hormone secretagogue

生长激素促分泌素的小鼠内源性肽的氨基酸序列

<400>5

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Ala Gln Gln Arg Lys

1 5 10 15

Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg

20 25

<210>6

<211>28

<212>PRT

<213>Sus serofa野猪

<221>PEPTIDE肽

<223>Amino acid sequence for porcine endogenous peptides of growth hormone secretagogue

生长激素促分泌素的猪内源性肽的氨基酸序列

<400>6

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Val Gln Gln Arg Lys

1 5 10 15

Glu Ser Lys Lys Pro Ala Ala Lys Leu Lys Pro Arg

20 25

<210>7

<211>27

<212>PRT

<213>Bos taurus家牛

<221>PEPTIDE肽

<223>Amino acid sequence for bovine endogenous peptides(27 amino acids)of growthhormone secretagogue

生长激素促分泌素的牛内源性肽(27个氨基酸)的氨基酸序列

<400>7

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu

1 5 10 15

Ala Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg

20 25

<210>8

<211>27

<212>PRT

<213>Ovis aries绵羊

<221>PEPTIDE肽

<223>Amino acid sequence for ovine endogenous peptides(27 amino acids)of growthhormone secretagogue

生长激素促分泌素的绵羊内源性肽(27个氨基酸)的氨基酸序列

<400>8

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Arg Lys Glu

1 5 10 15

Pro Lys Lys Pro Ser Gly Arg Leu Lys Pro Arg

20 25

<210>9

<211>28

<212>PRT

<213>Canis familiaris家犬

<221>PEPTIDE肽

<223>Amino acid sequence for dog endogenous peptides of growth hormone secretagogue

生长激素促分泌素的犬内源性肽的氨基酸序列

<400>9

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His Gln Lys Leu Gln Gln Arg Lys

1 5 10 15

Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Gln Pro Arg

20 25

<210>10

<211>21

<212>PRT

<213>Anguilla japonica鳗鲡

<221>PEPTIDE肽

<223>Amino acid sequence for eel endogenous peptides of growth hormone secretagogue.Thispeptide is amidated at C-terminus.

生长激素促分泌素的鳗鱼内源性肽的氨基酸序列。该肽的C末端被酰胺化。

<400>10

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Arg Pro Gln Gly Lys Asp Lys

1 5 10 15

Lys Pro Pro Arg Val

20

<210>11

<211>23

<212>PRT

<213>Oncorhynchus mykiss虹鳟鱼

<221>PEPTIDE肽

<223>Amino acid sequence for rainbow trout endogenous peptides(23amino acids)of growthhormone secretagogue.This peptide is amidated at C-terminus.

生长激素促分泌素的虹鳟鱼内源性肽(23个氨基酸)的氨基酸序列。该肽的C末端被酰胺化。

<400>11

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Val Arg Gln Gly

1 5 10 15

Lys Gly Lys Pro Pro Arg Val

20

<210>12

<211>20

<212>PRT

<213>Oncorhynchus mykiss虹鳟鱼

<221>PEPTIDE肽

<223>Amino acid sequence for rainbow trout endogenous peptides(20 amino acids)of growthhormone secretagogue.This peptide is amidated at C-terminus.

生长激素促分泌素的虹鳟鱼内源性肽(20个氨基酸)的氨基酸序列。该肽的C末端被酰胺化。

<400>12

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Gly Lys Gly Lys

1 5 10 15

Pro Pro Arg Val

20

<210>13

<211>24

<212>PRT

<213>Gallus domesticus家鸡

<221>PEPTIDE肽

<223>Amino acid sequence for chicken endogenous peptides of growth hormone secretagogue

生长激素促分泌素的鸡内源性肽的氨基酸序列

<400>13

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys

1 5 10 15

Gly Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg

20

<210>14

<211>24

<212>PRT

<213>Gallus domesticus家鸡

<221>PEPTIDE肽

生长激素促分泌素的鸡内源性肽的氨基酸序列

<400>14

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys

1 5 10 15

Asp Thr Arg Lys Pro Thr Ala Arg

20

<210>15

<211>26

<212>PRT

<213>Gallus domesticus家鸡

<221>PEPTIDE肽

生长激素促分泌素的鸡内源性肽的氨基酸序列

<400>15

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Tyr Lys Asn Ile Gln Gln Gln Lys

1 5 10 15

Asp Thr Art Lys Pro Thr Ala Arg Leu His

20 25

<210>16

<211>27

<212>PRT

<213>Rana catesbeiana牛蛙

<221>PEPTIDE肽

<223>Amino acid sequence for frog endogenous peptides of growth hormone secretagogue

生长激素促分泌素的蛙内源性肽的氨基酸序列

<400>16

Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg

1 5 10 15

Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met

20 25

<210>17

<211>28

<212>PRT

<213>Rana catesbeiana牛蛙

<221>PEPTIDE肽

生长激素促分泌素的蛙内源性肽的氨基酸序列

<400>17

Gly Leu Thr Phe Leu Ser Pro Ala Asp Met Gln Lys Ile Ala Glu Arg

1 5 10 15

Gln Ser Gln Asn Lys Leu Arg His Gly Asn Met Asn

20 25

<210>18

<211>20

<212>PRT

<213>Tilapia nilotica尼罗罗非鱼

<221>PEPTIDE肽

<223>Amino acid sequence for tilapia endogenous peptides of growth hormone secretagogue.This peptide is amidated at C-terminus.

生长激素促分泌素的罗非鱼内源性肽的氨基酸序列。该肽的C末端被酰胺化。

<400>18

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Ser Gln Lys Pro Gln Asn Lys Val Lys

1 5 10 15

Ser Ser Arg Ile

20

<210>19

<211>22

<212>PRT

<213>Silurus asotus鲶鱼

<221>PEPTIDE肽

<223>Amino acid sequence for catfish endogenous peptides of growth hormone secretagogue.This peptide is amidated at C-terminus.

生长激素促分泌素的鲶鱼内源性肽的氨基酸序列。该肽的C末端被酰胺化。

<400>19

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Gln Lys Pro Gln Asn Arg Gly Asp

1 5 10 15

Arg Lys Pro Pro Arg Val

20

<210>20

<211>23

<212>PRT

<213>Silurus asotus鲶鱼

<221>PEPTIDE肽

<223>Amino acid sequence for catfish endogenous peptides of growth hormone secretagogue

生长激素促分泌素的鲶鱼内源性肽的氨基酸序列

<400>20

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Thr Gln Lys Pro Gln Asn Arg Gly Asp

1 5 10 15

Arg Lys Pro Pro Arg Val Gly

20

<210>21

<211>28

<212>PRT

<213>Equus caballus马

<221>PEPTIDE肽

<223>Amino acid sequence for equine endogenous peptides of growth hormone secretagogue

生长激素促分泌素的马内源性肽的氨基酸序列

<400>21

Gly Ser Ser Phe Leu Ser Pro Glu His His Lys Val Gln His Arg Lys

1 5 10 15

Glu Ser Lys Lys Pro Pro Ala Lys Leu Lys Pro Arg

20 25

<210>22

<211>28

<212>DNA

<213>Artificial Sequence人工序列

<220>

<223>Primer(GHS-R 1a)，sense

引物(GHS-R 1a)，正义

<400>22

gatacctctt ttccaagtcc ttcgagcc 28

<210>23

<211>25

<212>DNA

<213>Artificial Sequence人工序列

<220>

<223>Primer(GHS-R 1a)，antisense

引物(GHS-R 1a)，反义

<400>23

ttgaacactg ccacccggta cttct 25

<210>24

<211>19

<212>DNA

<213>Artificial Sequence人工序列

<220>

<223>Primer(GAPDH)，sense

引物(GAPDH)，正义

<400>24

cggcaagttc aacggcaca 19

<210>25

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial Sequence人工序列

<220>

<223>Primer(GAPDH)，antisense

引物(GAPDH)，反义

<400>25

agacgccagt agactccacg aca 23

Claims

1.一种脊髓神经损伤治疗剂，其中，所述治疗剂以作用于生长激素促分泌素受体的物质或其药学上可接受的盐作为有效成分。

2.如权利要求1所述的治疗剂，其中，上述物质为选自由以下(1)、(2)以及(3)构成的组的肽或其衍生物：

3.如权利要求2所述的治疗剂，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基是一个在该残基的侧链的羟基上引入了脂肪酸的修饰氨基酸残基的肽。

4.如权利要求3所述的治疗剂，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基的侧链的羟基被正辛酰基酰化的肽。

5.如权利要求1～4任一项所述的治疗剂，其中，所述治疗剂含有0.001mg～100mg上述物质或其药学上可接受的盐。

6.一种培养脊髓神经前驱细胞时的脊髓神经前驱细胞增殖促进剂，其中，所述增殖促进剂以作用于生长激素促分泌素受体的物质或其盐作为有效成分。

7.如权利要求6所述的促进剂，其中，上述物质为选自由以下(1)、(2)以及(3)构成的组的肽或其衍生物：

8.如权利要求7所述的促进剂，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基是一个在该残基的侧链的羟基上引入了脂肪酸的修饰氨基酸残基的肽。

9.如权利要求8所述的促进剂，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基的侧链的羟基被正辛酰基酰化的肽。

10.如权利要求6～9任一项所述的促进剂，其中，脊髓神经前驱细胞的培养基中，上述物质或其盐的含量为0.0000001mg/L～0.1mg/L。

11.一种移植培养的脊髓神经前驱细胞时的脊髓神经再生促进剂，其中，所述的促进剂以作用于生长激素促分泌素受体的物质或其药学上可接受的盐作为有效成分。

12.如权利要求11所述的促进剂，其中，上述物质为选自由以下(1)、(2)以及(3)构成的组的肽或其衍生物：

13.如权利要求12所述的促进剂，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基是一个在该残基的侧链的羟基上引入了脂肪酸的修饰氨基酸残基的肽。

14.如权利要求13所述的促进剂，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基的侧链的羟基被正辛酰基酰化的肽。

15.如权利要求11～14任一项所述的促进剂，其中，所述促进剂含有0.001mg～100mg上述物质或其药学上可接受的盐。

16.一种促进培养脊髓神经前驱细胞增殖的方法，其特征在于，所述方法使用作用于生长激素促分泌素受体的物质或其盐。

17.如权利要求16所述的方法，其中，上述物质为选自由以下(1)、(2)以及(3)构成的组的肽或其衍生物：

18.如权利要求17所述的方法，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基是一个在该残基的侧链的羟基上引入了脂肪酸的修饰氨基酸残基的肽。

19.如权利要求18所述的方法，其中，上述物质为序列编号1所示的氨基酸序列中，位于自氨基末端起第3位的丝氨酸残基的侧链的羟基被正辛酰基酰化的肽。

20.如权利要求16～19任一项所述的方法，其中，培养脊髓神经前驱细胞的培养基中，上述物质或其盐的含量为0.0000001mg/L～0.1mg/L。