CN110903382B - 一种罗非鱼胃饥饿素成熟肽及其表达应用 - Google Patents

一种罗非鱼胃饥饿素成熟肽及其表达应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种罗非鱼胃饥饿素成熟肽及其表达应用，属于生物化学与分子生物学领域。本发明的罗非鱼Ghrelin成熟肽的合成序列为GSSFLSPSQKPQNKVKSSRIGR，根据Fmoc‑固相多肽合成法合成罗非鱼Ghrelin成熟肽粗品，采用色谱法进行纯化，得到的罗非鱼Ghrelin成熟肽的纯度为90‑95％。本发明用合成的罗非鱼Ghrelin成熟肽对罗非鱼进行注射，调节罗非鱼HSP70、IL‑1β、TGF‑β和TNF‑α基因表达，以预防罗非鱼感染嗜水气单胞菌。

Description

一种罗非鱼胃饥饿素成熟肽及其表达应用
技术领域
本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种罗非鱼胃饥饿素成熟肽及其表达应用。
背景技术
胃饥饿素(Ghrelin)是大鼠胃粘膜中分离出来的一种新型肽类激素，含有28个氨基酸残基，通过结合生长激素促分泌素受体(GHS-R)，激活位于弓状核的神经肽Y/刺豚鼠相关蛋白神经元，刺激神经肽Y(NPY)和刺鼠相关蛋白(AGRP)的表达，达到促进摄食和调节内分泌激素的作用。此外，Ghrelin可有效抗炎，主要作用于细胞因子的免疫调节功能。其发挥抗炎作用的主要途径是抑制促炎因子的表达。前期的研究结果均显示，Ghrelin除了调节鱼类食欲和生长以外，还对免疫系统有调控作用。
在鱼类中，Ghrelin蛋白主要在胃组织中表达。Ghrelin能与生长激素促分泌素受体(GHS-R)结合并刺激促生长素(GH)释放。生长激素促分泌素受体(GHS-R)在罗非鱼组织中的广泛表达提示Ghrelin可能具有多种功能。生长激素促分泌素受体(GHS-R)是一种G蛋白偶联受体，含有7个跨膜结构域，能促进生长激素的合成。Ghrelin在炎症反应和致瘤性疾病中也发挥着重要作用，主要通过调节细胞因子的产生来增强对炎症的抵抗力。Ghrelin作为鱼类中的一种自表达蛋白，可以通过发酵工程技术以较低的成本大量表达。因此，Ghrelin作为一种新型的免疫调节因子，在养鱼业中具有潜在的治疗作用。
罗非鱼是联合国粮农组织向全世界推广养殖的优良品种之一，具有生长速度快，繁殖能力强，耐低氧等优良性状。罗非鱼现已成为我国主要淡水养殖鱼类之一。近年来我国罗非鱼产业发展较为迅速，已成为全球第一大罗非鱼养殖国。目前，我国罗非鱼产业主要集中于广东、广西和海南三省，并且以出口为主，内销为辅。然而尽管养殖条件改善，养殖罗非鱼感染嗜水气单胞菌的现象仍然存在，引起罗非鱼品质下降，产量降低等问题。因此，研究一种有效抗嗜水气单胞菌感染的药物对提高养殖鱼的健康显得尤为重要。目前未见有Ghrelin成熟肽在提高罗非鱼免疫功能上的应用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种罗非鱼胃饥饿素成熟肽及其表达应用，根据Fmoc-固相多肽合成法合成罗非鱼胃饥饿素成熟肽粗品，采用色谱法进行纯化，得到罗非鱼胃饥饿素成熟肽，用于对罗非鱼进行注射，能有效预防罗非鱼受嗜水气单胞菌感染。
本发明通过以下技术方案来实现：
本发明的罗非鱼胃饥饿素(Ghrelin)成熟肽的合成序列为GSSFLSPSQKPQNKVKSSRIGR。本发明合成的罗非鱼Ghrelin成熟肽为含有22个氨基酸残基的小分子多肽，相对分子质量是2.39KD。
罗非鱼的Ghrelin前体蛋白含有107个氨基酸残基，N端的前26个氨基酸为信号肽，Ghrelin的成熟肽为22个氨基酸，从第27个氨基酸开始，直接与信号肽连接，C端的59个氨基酸为C末端肽。
本发明根据Fmoc-固相多肽合成法合成罗非鱼Ghrelin成熟肽粗品。所述Fmoc-固相多肽合成法为：首先将一个用Fmoc基团对α-氨基进行保护的氨基酸通过一个支臂连结到一个不溶性载体上，随后将α-氨基脱保护，用溶液洗涤氨基酸-支臂-载体。然后将第二个预先活化的α-氨基保护的氨基酸通过耦联反应连接上去。此外，也可以α-N端及侧链保护的肽片断代替单个的氨基酸进行耦联反应，反应完成后用溶液洗涤，重复进行脱保护，耦联，直到得到目的肽，最后将肽-支臂-载体裂解。
本发明采用色谱法对罗非鱼Ghrelin成熟肽粗品进行纯化。本发明合成的罗非鱼Ghrelin成熟肽的纯度为90-95％。
本发明的罗非鱼Ghrelin成熟肽的表达应用，用罗非鱼Ghrelin成熟肽对罗非鱼进行腹腔注射，调控罗非鱼HSP70、IL-1β、TGF-β和TNF-α基因表达，以预防罗非鱼感染嗜水气单胞菌。
作为技术方案的优选，所述罗非鱼Ghrelin成熟肽对罗非鱼的使用量为0.1-10ng/g鱼体重。
用本发明的罗非鱼Ghrelin成熟肽调控罗非鱼HSP70、IL-1β、TGF-β和TNF-α基因表达的检测步骤如下：
(1)RNA逆转录：取出罗非鱼肝脏、肾脏和脾脏，提取RNA，将提取的RNA逆转录为模板cDNA；
(2)PCR扩增：以步骤(1)得到的cDNA为模板，以HSP70-正向引物、HSP70-反向引物、IL-1β-正向引物、IL-1β-反向引物、TGF-β-正向引物、TGF-β-反向引物、TNF-α-正向引物、TNF-α-反向引物为特异性引物，采用β-actin作为内参，进行实时定量PCR扩增反应，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。
本发明中的引物：
HSP70-正向引物：GTGTCCAACGCTGTCATCAC，
HSP70-反向引物：CTACGGTCTGGACAAAGGCA，
IL-1β-正向引物：TGCACTGTCACTGACAGCCAA，
IL-1β-反向引物：CCGCAAAGTGCACCTGAACAT，
TGF-β-正向引物：TGCGGCACCCAATCACACAAC，
TGF-β-反向引物：GCCAACGGGTTACTATGCTAAC，
TNF-α-正向引物：GAGGCCAACAAAATCATCATCCC，
TNF-α-反向引物：CGCTACTCAGAGTCTATGGGAAG。
本发明的有益效果：
(1)本发明以罗非鱼的肝脏、肾脏和脾脏为原料，根据Fmoc-固相多肽合成法合成罗非鱼Ghrelin成熟肽粗品，采用色谱法进行纯化，得到罗非鱼Ghrelin成熟肽，经鉴定，本发明得到的罗非鱼Ghrelin成熟肽的纯度为90-95％，与已知的Ghrelin的氨基酸序列相匹配。本发明的方法价格低廉、原料易获得，灵敏度高、稳定性强且操作简便，可大规模应用。
(2)本发明将合成的罗非鱼Ghrelin成熟肽用于对罗非鱼进行注射，将注射量控制在0.1-10ng/g鱼体重，注射Ghrelin后的罗非鱼肝脏、脾脏和肾脏的HSP70、IL-1β、TGF-β和TNF-α的表达均显著高于没有注射Ghrelin的罗非鱼，可见罗非鱼Ghrelin成熟肽可以通过调节四种相关抗炎蛋白和基因HSP70、IL-1β、TGF-β和TNF-α的表达，增强罗非鱼对嗜水气单胞菌的免疫和抗病性，有效地保护杂交罗非鱼幼鱼免受嗜水气单胞菌感染。
附图说明
图1是实施例1合成的罗非鱼Ghrelin成熟肽的纯度检测结果；
图2是实施例1合成的罗非鱼Ghrelin成熟肽的质谱法鉴定结果；
图3是本发明C组、Ah组、L组、M组和H组的罗非鱼10天的死亡率统计结果；
图4是本发明合成的罗非鱼Ghrelin成熟肽的血清指标检测结果；
图5为本发明C组、Ah组、L组、M组和H组的罗非鱼注射5h和10h后肝脏的HSP70、IL-1β、TGF-β和TNF-α的qPCR检测结果；
图6为本发明C组、Ah组、L组、M组和H组的罗非鱼注射5h和10h后脾脏的HSP70、IL-1β、TGF-β和TNF-α的qPCR检测结果；
图7为本发明C组、Ah组、L组、M组和H组的罗非鱼注射5h和10h后肾脏的HSP70、IL-1β、TGF-β和TNF-α的qPCR检测结果。
具体实施方式
本发明用下列实施例进行说明，但不是对本发明的使用范围的限制。
实施例1
一、罗非鱼Ghrelin成熟肽的合成
本发明的罗非鱼Ghrelin成熟肽的合成序列为GSSFLSPSQKPQNKVKSSRIGR，根据Fmoc-固相多肽合成法合成罗非鱼Ghrelin成熟肽粗品，采用色谱法对罗非鱼Ghrelin成熟肽粗品进行纯化。本发明合成的罗非鱼Ghrelin成熟肽为含有22个氨基酸残基的小分子多肽，相对分子质量是2.39KD。
罗非鱼的Ghrelin前体蛋白含有107个氨基酸残基，N端的前26个氨基酸为信号肽，Ghrelin的成熟肽为22个氨基酸，从第27个氨基酸开始，直接与信号肽连接，C端的59个氨基酸为C末端肽。
对得到的罗非鱼Ghrelin成熟肽进行纯度检测，检测结果如图1所示。由图1可知，本发明合成的罗非鱼Ghrelin成熟肽的纯度为90.1％。
另外，还使用质谱法鉴定合成肽，结果如图2所示。由图2可知，本发明所合成的罗非鱼Ghrelin成熟肽与已知的Ghrelin的氨基酸序列相匹配。
二、罗非鱼Ghrelin成熟肽的应用
(一)材料准备
挑选体重为20.0±5.0g的罗非鱼作为试验用鱼，分别放养于5个连续流动系统的水槽中，水槽规格为1m×1m×1.5m，每一个水槽放养15尾。
(二)注射
将选好的罗非鱼随机分为5组(每组15尾)，包括PBS缓冲液注射组(C组)、嗜水气单胞菌注射组(Ah组)、低剂量Ghrelin组(L组)、中剂量Ghrelin组(M组)和高剂量Ghrelin组(H组)。各组鱼的注射成分及用量按表1进行腹腔注射。注射前，将注射材料稀释至0.1mL的PBS缓冲液中。注射后，每天记录各组的死鱼数量，连续10天，当观察到死鱼时，立即把它们从水槽里移走。
PBS缓冲液组成为：称取8g NaCl，0.2g KCl，3.63g Na2HPO4·12H2O和0.24g KH2PO4溶于900mL双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加双蒸水定容至1L，4℃保存备用。
表1各组注射成分及用量
C组 Ah组 L组 M组 H组
PBS缓冲液(mL/尾) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
嗜水气单胞菌(CFU/尾) 0.0 0.5×10<sup>6</sup> 0.5×10<sup>6</sup> 0.5×10<sup>6</sup> 0.5×10<sup>6</sup>
Ghrelin(ng/尾) 0.0 0.0 2.0 20.0 200.0
(三)获取血清样本和肝、肾、脾组织
在注射后5h和10h，用鱼安定MS-222(市场购买得到)对罗非鱼进行麻醉并处死，取尾静脉全血，切除肝、肾、脾。
全血在4℃下过夜后，以3000rpm离心10min获得的上清液作为血清样本进行血清指标分析。肝、肾、脾组织被保存在-80℃下进行基因表达分析。
(四)血清指标检测
在A6半自动生化仪(Sino-UK，北京，中国)上分析谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)和活性氧(ROS)水平的酶活性。用溴甲酚绿和缩二脲法在BS-420全自动生化分析仪(深圳迈瑞)上测定白蛋白(ALB)和总蛋白(TP)。
(五)基因HSP70、IL-1β、TGF-β和TNF-α的表达分析
1.RNA逆转录：
取待检罗非鱼肝脏5mg，用研钵磨碎后用RNATrizol裂解提取肝脏总RNA。RNA浓度和纯度用分光光度计检测，并通过1.2％琼脂糖凝胶电泳检验RNA是否降解。将提取的RNA样本用PrimeScriptTM RT reagent Kit 047A(TakaRa)进行反转录，得到肝脏的模板cDNA。
用上述同样的方法对肾脏和脾脏进行处理，获得肾脏和脾脏的模板cDNA。
2.PCR扩增及胶回收：
将待检cDNA样品以1：40稀释，然后取3.4μL双蒸水，0.4μL正向引物，0.4μL反向引物，0.8μL稀释后的cDNA和5μL TB Green Premix Ex Taq II(TliRNaseH plus)(2×)(Takara,Japan)混匀置于荧光定量96孔板中，
正向引物包括：
HSP70-正向引物：GTGTCCAACGCTGTCATCAC，
IL-1β-正向引物：TGCACTGTCACTGACAGCCAA，
TGF-β-正向引物：TGCGGCACCCAATCACACAAC，
TNF-α-正向引物：GAGGCCAACAAAATCATCATCCC；
反向引物包括：
HSP70-反向引物：CTACGGTCTGGACAAAGGCA，
IL-1β-反向引物：CCGCAAAGTGCACCTGAACAT，
TGF-β-反向引物：GCCAACGGGTTACTATGCTAAC，
TNF-α-反向引物：CGCTACTCAGAGTCTATGGGAAG。
采用β-actin作为内参，β-正向引物：5’-CCACAGCCGAGAGGGAAAT-3’；β-actin-正向引物：5’-CCATCTCCTGCTCGAAGTC-3’。每个样品做3个平行。反应条件为：先95℃预变性7min；随后进行循环95℃变性5s，60℃退火30s，如此循环40次。用Pikoreal 96 Real-Time PCRsystem(Thermo Fisher Scientific,USA)检测HSP70、IL-1β、TGF-β和TNF-α基因的表达量，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。
(六)检测结果
1.罗非鱼死亡率统计结果
对各组罗非鱼10天的死亡率进行统计，结果如图3所示，从图3可以看出，Ah组10天累计死亡率为86.67％；M组10天累计死亡率为33.34％；L组和H组10天累计死亡率分别为53.34％和43.34％；C组的累积死亡率为0.00％。这些结果表明，注射Ghrelin后，罗非鱼感染嗜水气单胞菌后存活率显著提高，其中，Ghrelin注射量为20.0ng Ghrelin/尾的M组的存活率高于注射量为2.0ng Ghrelin/尾的L组和注射量为200.0ng Ghrelin/尾的H组的存活率，注射量为200.0ng Ghrelin/尾的H组的存活率高于注射量为2.0ng Ghrelin/尾的L组。
2.血清指标检测结果
血清指标检测结果如图4所示，从图4可以看出，M组和H组在5h时ROS活性显著增加，与C组的对照罗非鱼相比，Ah组的注射嗜水气单胞菌后的罗非鱼的ALB、GSH-Px、LZM、ROS、SOD和TP没有明显变化。
3.PCR检测结果
对各组样品肝脏、脾脏、肾脏的HSP70、IL-1β、TGF-β和TNF-α的mRNA进行qPCR检测，结果如图5-7所示。
图5为肝脏的HSP70、IL-1β、TGF-β和TNF-α的qPCR检测结果，从图5中的A可以看出，在肝脏中，H组HSP70的表达显著高于C组；从图5中的B可以看出，与C组相比，只有L组IL-1βmRNA表达显著增加；从图5中的C可以看出，与C组相比，M组和H组在5h、Ah组在10h的TGF-β表达显著上调。
图6为脾脏的HSP70、IL-1β、TGF-β和TNF-α的qPCR检测结果，从图6中的B可以看出，H组在5h和10h的IL-1β的表达均显著高于C组和Ah组；从图6中的C可以看出，H组在5h的TGF-β的表达明显高于其他各组，M组和H组在10h的TGF-β的表达明显高于C组；从图6中的D可以看出，只有H组在5h的TNF-α的表达显著增加。
图7为肾脏的HSP70、IL-1β、TGF-β和TNF-α的qPCR检测结果，从图7中的B可以看出，L组在10h的IL-1β的表达比对照组显著增加；从图7中的C可以看出，M组在5h时TGF-β的表达高于其他各组；从图7中的D可以看出，与C组相比，Ah组和H组在5h时的TNF-α表达显著降低，而L组和M组在肾脏中的TNF-α表达无显著变化。
综合来看，注射Ghrelin后的L组、M组和H组的罗非鱼肝脏、脾脏和肾脏的HSP70、IL-1β、TGF-β和TNF-α的表达均显著高于对照组。
以上结果表明，Ghrelin作为一种免疫调节激素，在使用量为0.1-10ng/g鱼体重水平下，可以通过改善血液学指标、维持正常组织学和调节细胞因子基因表达，能增强罗非鱼对嗜水气单胞菌的免疫和抗病性，有效地保护杂交罗非鱼幼鱼免受嗜水气单胞菌感染。
序列表
<110> 广西壮族自治区水产科学研究院
<120> 一种罗非鱼胃饥饿素成熟肽及其表达应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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1 5 10 15
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<211> 23
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<400> 9
Cys Gly Cys Thr Ala Cys Thr Cys Ala Gly Ala Gly Thr Cys Thr Ala
1 5 10 15
Thr Gly Gly Gly Ala Ala Gly
20

Claims (6)

1.一种合成的罗非鱼胃饥饿素成熟肽用于制备预防罗非鱼感染嗜水气单胞菌药物中的应用，其特征在于，合成的罗非鱼胃饥饿素成熟肽序列为GSSFLSPSQKPQNKVKSSRIGR。
2.根据权利要求1所述的用于制备预防罗非鱼感染嗜水气单胞菌药物中的应用，其特征在于，所述合成的罗非鱼胃饥饿素成熟肽含有22个氨基酸残基的小分子多肽；其纯度为90-95%。
3.根据权利要求1或2所述的合成的罗非鱼胃饥饿素成熟肽用于制备预防罗非鱼感染嗜水气单胞菌药物中的应用，其特征在于，用所述罗非鱼胃饥饿素成熟肽对罗非鱼进行腹腔注射，调控罗非鱼HSP70、IL-1β、TGF-β和TNF-α基因表达，以预防罗非鱼感染嗜水气单胞菌。
4. 根据权利要求3所述的合成的罗非鱼胃饥饿素成熟肽用于制备预防罗非鱼感染嗜水气单胞菌药物中的应用，其特征在于，所述罗非鱼胃饥饿素成熟肽对罗非鱼的使用量为0.1-10 ng/g鱼体重。
5.根据权利要求3所述的合成的罗非鱼胃饥饿素成熟肽用于制备预防罗非鱼感染嗜水气单胞菌药物中的应用，其特征在于，用所述罗非鱼胃饥饿素成熟肽调控罗非鱼HSP70、IL-1β、TGF-β和TNF-α基因表达的检测步骤如下：
（1）RNA逆转录：取出罗非鱼肝脏、肾脏和脾脏，提取RNA，将提取的RNA逆转录为模板cDNA；
（2）PCR扩增：以步骤（1）得到的cDNA为模板，分别以HSP70-正向引物、HSP70-反向引物、IL-1β-正向引物、IL-1β-反向引物、TGF-β-正向引物、TGF-β-反向引物、TNF-α-正向引物、TNF-α-反向引物为特异性引物，采用β-actin作为内参，进行实时定量PCR扩增反应，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。
6.根据权利要求5所述的合成的罗非鱼胃饥饿素成熟肽用于制备预防罗非鱼感染嗜水气单胞菌药物中的应用，其特征在于，所述引物包括：
HSP70-正向引物：GTGTCCAACGCTGTCATCAC，
HSP70-反向引物：CTACGGTCTGGACAAAGGCA，
IL-1β-正向引物：TGCACTGTCACTGACAGCCAA，
IL-1β-反向引物：CCGCAAAGTGCACCTGAACAT，
TGF-β-正向引物：TGCGGCACCCAATCACACAAC，
TGF-β-反向引物：GCCAACGGGTTACTATGCTAAC，
TNF-α-正向引物：GAGGCCAACAAAATCATCATCCC，
TNF-α-反向引物：CGCTACTCAGAGTCTATGGGAAG。
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