CN112358536B

CN112358536B - 拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物及其应用

Info

Publication number: CN112358536B
Application number: CN202011083369.5A
Authority: CN
Inventors: 刘光明; 李梦思; 夏菲; 陈一瑜; 云肖
Original assignee: Jimei University
Current assignee: Jimei University
Priority date: 2020-10-12
Filing date: 2020-10-12
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2040-10-12
Also published as: CN112358536A

Abstract

本发明提供了一种拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物及其应用，所述衍生物的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。根据本发明的拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物，其是将野生型Scy p 1氨基酸序列的N端、C端及2个关键线性表位区域删除。通过重叠延伸PCR技术扩增获得Scy p 1衍生物基因序列；连接转化BL21宿主细胞中诱导表达；表达的衍生物经Ni柱纯化，分析改造前后的Scy p 1对肥大细胞脱颗粒的影响。与野生型Scy p 1相比，Scy p 1衍生物能显著性降低LAD2细胞β‑氨基己糖苷酶的释放，有望用于免疫治疗或免疫预防，减少免疫治疗中的副作用，以提高治疗的安全指数。

Description

拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种拟穴青蟹过敏蛋白Scy p 1衍生物及其应用。

背景技术

食物过敏是由IgE介导的速发型超敏反应。目前，食物过敏在全球的发病率与死亡率呈现逐年增加的趋势，已经成为全球性的公共卫生问题。联合国粮农组织及世界卫生组织指出：90％以上的食物过敏都是由奶、蛋、鱼、豆、花生、小麦、坚果以及甲壳类水产品这八大类食物引起的。

甲壳类水产品中拟穴青蟹(Scylla Paramamosain)又名青蟹，是具有重要的经济价值和营养价值，深受广大消费者喜欢，但每年有很多人因食用水产品而过敏。与其它食物过敏不同，甲壳类水产品通常会伴随终生，严重影响着易感人群的生活状态。

目前，过敏原特异性免疫治疗法已成为治疗由IgE介导的过敏性疾病的常用方法，其主要是借助于脱敏制剂的使用。简单地说，就是通过脱敏制剂产生的特异性抗体来起到竞争阻断的作用，从而达到改善过敏病人过敏症状的目的。利用低致敏性的过敏原制剂，可以大大减少免疫治疗中的副作用，提高治疗的安全指数。

近年来，抗原特异性疗法已相继在虾、鱼、花粉致敏蛋白改造中被报道，但关于蟹中致敏蛋白的改造少见报道。Scy p 1是蟹类主要过敏原，且作为无脊椎动物中的广泛过敏原，能够引起不同物种间的交叉反应。因此，对蟹中致敏蛋白的改造仍有待研究。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本发明的第一个目的在于提供一种拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物。

本发明的第二个目的是提出一种编码拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物的基因。

本发明的第三个目的是提出一种重组载体。

本发明的第四个目的是提出一种制备拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物的方法。

本发明的第五个目的是提出一种拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物的应用。

在本发明的第一个方面中，提供了一种穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物，所述衍生物的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。根据本发明的实施例，利用分子改造技术对Scy p 1的IgE线性表位进行表位删减，该衍生物能显著性降低LAD2细胞β-氨基己糖苷酶的释放，可用于免疫治疗或免疫预防。

可选地，所述衍生物是将Scy p 1氨基酸序列的N端、C端及2个关键线性表位区域删除。

在本发明的第二方面中，提供了一种编码拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；野生型变应原相比，其碱基数1-36，301-375，830-858处被删减了。

在本发明的第三个方面中，提供了一种重组载体，其包含编码上述拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物的基因。

在本发明的第四方面中，根据本发明实施例，提供了一种制备拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物的方法，包括以下步骤：

(1)以pET-28a-Scy p 1菌株提取的质粒为模板，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6为引物进行重叠延伸PCR第一轮扩增，获得第一产物；

(2)以所述第一产物模板，SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4为引物进行重叠延伸PCR第二轮扩增，获得第二产物，所述第二产物经切胶回收，获得衍生物基因；

(3)将所述衍生物基因与pET-22b载体连接，构建重组载体；

(4)将所述重组载体转入宿主菌，诱导其表达并纯化蛋白，以获得所述衍生物。

根据本发明的实施例，重叠延伸PCR的手段对野生型Scy p 1基因进行表位删除，获得衍生物基因与表达载体pET-22b重组后转入E.coli BL21(DE3)中，成功构建具有低致敏性的Scy p 1衍生物基因的重组菌株，诱导重组菌株表达纯化，获得低致敏性的Scy p 1衍生物。

在本发明的第五方面中，根据本发明实施例，本发明还提出了上述拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物在制备预防或治疗甲壳类过敏性疾病的药物中的应用。

根据本发明的实施例，通过上述的拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物制备的药物应用于抗原特异性疗法中，可以大大减少免疫治疗中的副作用，提高治疗的安全指数。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为野生型Scy p 1蛋白经Ni柱纯化后的SDS-PAGE和Western blot分析；

图2为Scy p 1衍生物经Ni柱纯化后的SDS-PAGE和Western blot分析；

图3为肥大细胞模型检测野生型Scy p 1、Scy p 1衍生物对LAD2细胞的脱颗粒效率。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。

下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。

实施例1拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物的分子克隆

(1)引物的设计及合成

根据Scy p 1衍生物的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)，对NCBI中检索得到的拟穴青蟹Scy p 1的基因序列进行删减，并利用Primer 5.0软件设计Scy p 1衍生物的上下游引物(F，R)。同时，在上下游引物的基础上分别加上Nde I和EcoR I限制性内切酶酶切位点。此外，进一步确定用于重叠延伸PCR第一轮扩增衍生物的正反向引物(F_mutants，R_mutants)，实验所用引物均由铂尚生物技术有限公司合成。

F₁：5’-CATATGATGAAGCTGGAGAAGGACA-3’；(SEQ ID NO：3)

R₁：5’-TACGCTCGTCCTCCTCGAGGAGCTG-3’；(SEQ ID NO：4)

F_mutants：5’-GAGGACGAGCGTATGCGTAAGGTGC-3’；(SEQ ID NO：5)

R_mutants：5’-TACGCTCGTCCTCCTCGAGGAGCTG-3’。(SEQ ID NO：6)

(2)pET-28a-Scy p 1菌株的构建

拟穴青蟹总RNA的提取按试剂盒说明书方法，提取的RNA在检测其浓度和纯度后贮存于-70℃备用。按照PrimeScript_TM II 1st Strand cDNA合成试剂盒说明书合成cDNA。以拟穴青蟹cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用DNA纯化试剂盒纯化，回收，备用。将回收后的片段与pET-28a载体在16℃下连接过夜，连接产物转化到大肠杆菌克隆感受态细胞Top 10中，挑取单菌落进行菌落PCR验证，挑取阳性菌测序。

(3)拟穴青蟹Scy p 1衍生物重组克隆质粒以及表达质粒的构建

以上述pET-28a-Scy p 1菌株所得的质粒为模板，分别以F/R_mutant和F_mutant/R为引物，进行重叠延伸PCR第一轮扩增，扩增体系如表1所示。

表1第一轮PCR扩增体系

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用DNA纯化试剂盒纯化，回收，备用。以回收后的产物为模板、F/R为引物，进行重叠延伸PCR第二轮扩增，扩增体系如表2所示。

表2第二轮PCR扩增体系

PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分离后，大量扩增、切胶回收，用试剂盒纯化回收衍生物全长基因。将回收后的衍生物基因与pEASY-T1载体连接。连接体系为pEASY-T1 1μL，衍生物全长基因4μL，充分混匀后将其置于25℃下连接20min，得连接产物。连接产物再转化至Trans-T1感受态细胞中，经过菌落PCR验证后，挑取阳性单菌落送至厦门铂瑞生物科技有限公司测序。

对测序结果正确的菌株以及表达载体pET-22b在37℃下活化过夜，收集菌体，利用质粒提取试剂盒进行质粒提取。在37℃下，用Nde I酶和Sal I酶对阳性菌以及表达载体pET-22b分别进行双酶切，酶切时间为2h。

表3双酶切体系

大量酶切结束后用DNA纯化回收试剂盒回收载体和目的基因片段。将酶切产物按照目的片段2.5μL，pET-22b酶切片段2.5μL，Solution I 5μL，混合后在16℃下，连接过夜。连接产物转入到E.coli BL21(DE3)中，经过菌落PCR验证后，挑取阳性单菌落送至厦门铂瑞生物科技有限公司测序。

实施例2制备野生型Scy p 1及Scy p 1衍生物

(1)野生型Scy p 1及Scy p 1衍生物诱导表达

分别将野生型Scy p 1、Scy p 1衍生物的菌种于10mL LB培养基中培养过夜。次日按1∶1000的比例将上述培养液转接于500mL的LB培养液中，于37℃培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8，加入终浓度为0.5mmol/L IPTG，37℃继续诱导16h后离心(12000g，15min)，收集菌体；重悬于20mL预冷的超声Buffer(20mmol/L Tris-HCl、0.2mol/L NaCl，pH 8.0)中进行超声破碎，离心(12000g，30min)后收集上清，即为粗酶液。

(2)野生型Scy p 1及Scy p 1衍生物纯化与鉴定

将(1)中的粗酶液按照1mL/min的速度上样于预先用Buffer A(20mmol/L Tris-HCl、0.2mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH 8.0)平衡好的Ni²⁺-NTA亲和层析柱(1.0cm×5.0cm)。继续用Buffer A洗去未结合的杂蛋白后，用Buffer B(20mmol/L Tris-HCl、0.2mol/L NaCl，100mmol/L咪唑，pH 8.0)对目的蛋白洗脱至测定A₂₈₀值在0.05以下，经SDS-PAGE分析及Western blot鉴定后，收集单一条带组分，即获得38kDa的野生型Scy p 1和34kDa的Scy p 1衍生物。具体结果如图1和图2所示。图1中A-B，野生型Scy p 1的SDS-PAGE(A)和Western blot(B)分析；图2中A-B，Scy p 1衍生物的SDS-PAGE(A)和Western blot(B)分析。图1中条带M为标准蛋白，Lane 1为上样前样品，Lane 2-9为纯化过程中洗脱下来的蛋白组分。图2中条带M为标准蛋白，Lane 1为上样前样品，Lane 2-8为纯化过程中洗脱下来的蛋白组分。结果表明，野生型Scy p 1大量表达，上样于Ni柱后目的蛋白几乎被吸附，且在低咪唑浓度下未结合的杂蛋白被洗去。随着咪唑浓度的增加，单一的38kDa的蛋白组分被洗脱下来(图1A)；利用兔抗Scy p 1多克隆抗体对洗脱得到的蛋白组分进行验证，结果显示有强的免疫结合活性，进一步证明纯化得到的蛋白为野生型Scy p 1(图1B)。在图2A中，分子量34kDa的单一蛋白组分在100mmol/L的咪唑浓度下被洗脱下来；在图2B中，纯化得到的目的蛋白与兔抗Scy p 1多克隆抗体有免疫结合活性，表明纯化得到的蛋白为Scy p 1衍生物。

实施例3肥大细胞模型检测野生型Scy p 1、Scy p 1衍生物对LAD2细胞脱颗粒效率

采用人肥大细胞LAD2细胞建立脱颗粒模型，分别取25μL野生型Scy p 1、Scy p 1衍生物(终浓度50μg/mL)加入已被甲壳类过敏患者血清敏化的LAD2细胞中，于37℃细胞培养箱孵育刺激1.0h，离心，收集上清并裂解细胞，检测野生型Scy p 1和Scy p 1衍生物刺激LAD2细胞产生β-氨基己糖苷酶的情况。

结果如图3所示：图中PBS为阴性对照组；CA8/80为阳性对照组。野生型Scy p 1刺激LAD2细胞β-氨基己糖苷酶的释放率达21％，而Scy p 1衍生物能显著降低LAD2细胞释放β-氨基己糖苷酶的能力(LAD2细胞β-氨基己糖苷酶的释放率为15％)，表明Scy p 1衍生物的致敏性显著下降。

综上所述，本申请通过分子改造对Scy p 1基因进行了表位删除，缩短后的基因与表达载体pET-22b重组后转入宿主菌中，成功获得Scy p 1衍生物。Scy p 1衍生物与野生型Scy p 1相比，其致敏性显著降低，可开发制备用于预防或治疗甲壳类过敏疾病的药物，该药物可以大大减少免疫治疗中的副作用，提高治疗的安全指数。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110> 集美大学

<120> 拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物及其应用

<130> 无

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 239

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Lys Leu Glu Lys Asp Asn Ala Met Asp Arg Ala Asp Thr Leu Glu

1 5 10 15

Gln Gln Asn Lys Glu Ala Asn Leu Arg Ala Glu Lys Thr Glu Glu Glu

20 25 30

Ile Arg Ala Thr Gln Lys Lys Met Gln Gln Val Glu Asn Glu Leu Asp

35 40 45

Gln Ala Gln Glu Gln Leu Ser Ala Ala Asn Thr Lys Leu Asp Glu Lys

50 55 60

Glu Lys Ala Leu Gln Asn Ala Glu Gly Glu Val Ala Ala Leu Asn Arg

65 70 75 80

Arg Ile Gln Leu Leu Glu Glu Asp Glu Arg Met Arg Lys Val Leu Glu

85 90 95

Asn Arg Ser Leu Ser Asp Glu Glu Arg Met Asp Ala Leu Glu Asn Gln

100 105 110

Leu Lys Glu Ala Arg Phe Leu Ala Glu Glu Ala Asp Arg Lys Tyr Asp

115 120 125

Glu Val Ala Arg Lys Leu Ala Met Val Glu Ala Asp Leu Glu Arg Ala

130 135 140

Glu Glu Arg Ala Glu Ser Gly Glu Ser Lys Ile Val Glu Leu Glu Glu

145 150 155 160

Glu Leu Arg Val Val Gly Asn Asn Leu Lys Ser Leu Glu Val Ser Glu

165 170 175

Glu Lys Ala Asn Gln Arg Glu Glu Thr Tyr Lys Glu Gln Ile Lys Thr

180 185 190

Leu Ala Asn Lys Leu Lys Ala Ala Glu Ala Arg Ala Glu Phe Ala Glu

195 200 205

Arg Ser Val Gln Lys Leu Gln Lys Glu Val Asp Arg Leu Glu Asp Glu

210 215 220

Leu Val Asn Glu Lys Glu Lys Tyr Lys Ser Ile Thr Asp Glu Leu

225 230 235

<210> 2

<211> 717

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaagctgg agaaggacaa cgctatggac agggccgata ccctggagca gcagaacaag 60

gaggccaacc tcagggcgga aaagaccgag gaggagattc gcgcaaccca gaagaagatg 120

cagcaggttg agaacgagct tgaccaggct caggagcagc tgtccgccgc taacactaag 180

cttgacgaga aggagaaggc cctccagaat gccgagggtg aggtggccgc cctgaaccgc 240

cgcatccagc tcctcgagga ggacgagcgt atgcgtaagg tgcttgagaa ccgctccctg 300

tccgatgaag agcgcatgga cgcccttgag aaccagctga aggaggcccg attcctggct 360

gaggaggccg atagaaaata cgatgaggtc gcccgtaagc tggccatggt tgaggctgac 420

ttggagaggg ctgaggagcg cgccgagagc ggagaatcga agatcgtgga gctggaggag 480

gagctgaggg ttgtgggcaa caacctgaag tctctggagg tgtctgagga gaaggccaac 540

cagcgtgagg agacttacaa ggaacagatc aagaccctgg ccaacaagct gaaggcggct 600

gaggctcgtg ctgagttcgc tgaaaggtct gtgcagaagc tccagaagga ggtcgacagg 660

cttgaagacg aactggttaa cgaaaaggag aagtacaagt caattaccga cgagctg 717

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

catatgatga agctggagaa ggaca 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tacgctcgtc ctcctcgagg agctg 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaggacgagc gtatgcgtaa ggtgc 25

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tacgctcgtc ctcctcgagg agctg 25

Claims

1.一种拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种编码如权利要求1所述的拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.一种重组载体，其特征在于，包含如权利要求2所述的基因。

4.如权利要求1所述的拟穴青蟹致敏蛋白Scy p 1衍生物在制备预防或治疗甲壳类过敏性疾病的药物中的应用。