CN109748962B

CN109748962B - 东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN109748962B
Application number: CN201910186796.7A
Authority: CN
Inventors: 王广君; 李贝贝; 郭隆隆; 纳齐尔·艾哈迈德·阿布罗; 农向群; 涂雄兵; 张泽华
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2019-03-13
Filing date: 2019-03-13
Publication date: 2021-01-15
Anticipated expiration: 2039-03-13
Also published as: CN109748962A

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1及其编码基因和应用。东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明克隆了东亚飞蝗的serpin1基因的cDNA，并通过连接，转化步骤将基因转入大肠单菌体内。通过饲喂serpin1纯化蛋白，绿僵菌侵染的蝗虫的死亡率大大降低，并测定蝗虫体内POD和SOD的酶活力，经serpin1处理后较绿僵菌的处理组相比，蝗虫体内的两者酶活力都降低到与对照无显著性差异，因此，serpin1基因能够作为负调控因子控制病菌的侵入引起的过度免疫反应。

Description

东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1及其编码基因和应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1及其编码基因和应用。

背景技术

丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpins)蛋白家族是一个成员众多、分布广泛的蛋白酶抑制剂家族，能够抑制丝氨酸蛋白酶活性，参与调节生物体内多种生理反应，包括血液凝集、纤维蛋白溶解、补体激活、免疫黑化、生长发育过程中组织构建等。serpins蛋白家族中的Serpin-6与家蚕表皮黑化、蜕皮变态、先天性免疫等生理过程有关。烟草天蛾serpin3a可以与丝氨酸蛋白酶PAP1和PAP3形成共价复合物而抑制酚氧化酶原(PPO)的激活，烟草天蛾serpin4,5抑制PPO激活是通过抑制上游血淋巴蛋白酶而完成的。在革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染时，serpin又涉及不同的调节方式，只有革兰氏阳性菌感染时，serpin4与HP-21形成共价复合物，serpin_5与HP1和HP6结合成共价复合物来抵御感染；在革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌感染时，serpin4与血淋巴蛋白酶HP1和HP6形成共价复合物抑制PPO激活，烟草天蛾serpin6也可以通过调节PAP3和HP8来抑制PPO激活。

发明内容

本发明的目的在于提供一种东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1。

本发明的再一目的在于提供上述东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1的基因。

本发明的再一目的在于提供包含上述基因的重组表达载体。

本发明的再一目的在于提供包含上述基因的重组菌株。

本发明的再一目的在于提供包含上述基因的应用。

本发明提供的东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1，其氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示：

上述蛋白的分子质量为46.9KD，等电点为6.51。

本发明提供东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1基因，其核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示：

本发明的丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1的cDNA序列长度为1228bp，完整的开放阅读框长为1040bp，完整开放阅读框位于188-1228bp。

本发明提供包含serpin1基因的重组表达载体，表达载体优选为pMD19-T Vector载体。

本发明提供包含丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1编码基因的重组菌株，重组菌株优选为大肠杆菌BL21。

本发明还提供上述丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1及其编码基因的应用。

绿僵菌的侵染能使蝗虫体内的酶发生一系列的变化，会导致蝗虫体内的保护酶的酶活性持续提高而导致蝗虫体内的过度免疫，导致蝗虫的死亡。本发明的丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1编码基因能够有效控制这种现象，通过对serpin1基因表达的蛋白与绿僵菌混合后的毒力测定，表明serpin基因能够有效降低绿僵菌的毒力。serpin1能有效抑制绿僵菌对蝗虫的侵染；绿僵菌侵染会造成蝗虫体内的保护酶的活力升高，丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1与绿僵菌混合处理后，蝗虫体内的POD和SOD酶活力下降，因此，本发明丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1能够通过控制蝗虫体内蛋白酶的活性有效抑制绿僵菌侵染。

附图说明

图1显示Serpin1基因的SDS-PAGE电泳结果；

图2显示serpin1的产物电泳分析结果；

图3显示不同饵剂处理后东亚非蝗的死亡率情况；

图4显示不同饵剂处理后POD酶活的变化情况；

图5显示不同饵剂处理后SOD酶活的变化情况。

具体实施方式

供试绿僵菌菌株接种到添加马铃薯琼脂培养基(PDAY)平板上，25℃下培养14d。收集分生孢子粉，密封贮存于4℃冰箱，备用。

东亚飞蝗卵采集于河北省沧州市，在人工气候培养箱中孵化温度(30士2)℃，相对湿度(60士5)％，光周期14L:10D.孵化后，将同一时问孵化的蝗蛹转移到60cm X 50cm X70cm规格的养虫笼中饲养，光周期14L:10D，温度为(30士2)℃。

实施例1克隆serpin1基因

用trizol溶液提取东亚飞蝗中肠中的总RNA，反转录合成cDNA的一条链，并以此为模板进行PCR克隆，已去除信号肽的目的基因的引物序列为F:5'CGCGGATCCCATGGCAGAGGAAGTG 3'(下划线表示设计的BamHⅠ酶切位点)；R:5'CCCAAGCTTAACGCCAACCACAGC 3'(下划线表示设计的HindⅢ酶切位点)。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化，经分析其序列大小为1228bp，完整的开放阅读框长1040bp。

实施例2构建重组表达载体

将纯化产物连接到Pmd19-T Vector载体，并将连接产物加入感受态细胞BL21中，将LB固体培养基上培养的阳性克隆菌株送去测序。将测序成功的重组基因提取质粒，用BamHⅠ和HindⅢ进行酶切，将酶切的产物连接到PET-21b质粒载体中，即PET-21b-serpin1转入大肠杆菌BL21中，经过SDS-PAGE凝胶电泳验证，结果如图1所示。

实施例3诱导重组蛋白表达

取重组基因的单克隆接种于新鲜的LB含Amp培养液，震荡过夜，转接培养至OD值为0.5-0.6，然后加IPTG(终浓度为0.5mmol/L)，27℃诱导过夜后，用5％浓缩胶和12％分离胶进行SDS-PAGE电泳分析蛋白样品。将诱导蛋白5OOOXg离心10min收集菌体。加入预冷的Binding BufferI重悬菌体，加入PMSF至终浓度0.25mg/ml。冰上超声裂解菌体(300w，超声持续5s，暂停5s，重复99个循环)。4℃,12000Xg，离心10min，回收上清。沉淀加入预冷的Binding Buffer II重悬，4℃轻柔振荡1h以溶解包涵体。用SDS-PAGE电泳检测目的蛋白，结果如图2所示。

实施例4验证serpin1的功能

4.1测定serpin1和绿僵菌混合后的毒力

将预先饥饿了12h的东亚飞蝗3龄蝗蛹每15头放入无菌的塑料筐中，加入处理好的饵剂(含有5％植物油的无菌麦麸)5g，24h后将饵剂取出，以新鲜麦苗饲喂至实验结束，每日检测蝗虫的死亡率。试验在35℃,16L:8D下室内进行，重复五次。饵剂中绿僵菌和serpin1的浓度见下表：

表1不同处理饵剂成分及浓度

死亡率测定结果如表2，图3所示：

表2 Serpin1处理后东亚飞蝗的死亡率

经绿僵菌处理后的第3天开始直到第8天，东亚飞蝗的死亡率显著高于对照(P＜0.05)，serpin1处理组与对照无显著差异(P＞0.05)，经过serpin1和绿僵菌混合处理后的死亡率在第三天和第四天与对照无显著差异(P＞0.05)，第五天至第八天与对照差异显著，与绿僵菌处理组相比其死亡率显著降低。

4.2测定serpin1处理POD和SOD的酶活

将3-4龄的蝗虫分装，每个处理3个重复，每筐装30头蝗虫，饥饿处理24小时。按照不同的处理，进行饲喂不同处理的饵剂，饵剂的浓度和组成如表1所示。饲喂24h后正常喂食无处理的饵剂，从第二天开始每组处理取3头，于液氮中研磨均匀，用POD试剂盒和SOD试剂盒分别测定POD和SOD的活性。

Pod酶活结果如图4所示，总体呈先升高再降低的趋势。绿僵菌处理后第一天，东亚飞蝗体内的POD酶活力与对照无差异(p＜0.05)，处理第三天时，蝗虫体内的pod酶活力显著上升，第四天酶活力降低，与对照无显著差异。而serpin1与绿僵菌的混合处理后，蝗虫体内的酶活自第二天开始较绿僵菌处理组持续降低，且与对照组无显著性差异。

绿僵菌处理后SOD酶活力结果如图5所示，总体呈先降低再升高再降低的趋势。绿僵菌处理后第一天，东亚飞蝗体内的SOD酶活力较对照显著上升(p＞0.05)，处理第二天时，蝗虫的酶活力显著下降，处理第三天时，蝗虫体内的SOD酶活力显著上升，第四天是酶活力降低，与对照无显著差异。而serpin1与绿僵菌的混合处理后，第一天蝗虫体内的酶活力较对照明显升高，但自第二天开始较绿僵菌处理组酶活力降低，且与对照组无显著性差异。

4.3中肠提取液总可溶性蛋白含量测定

参照Bradford方法测定，以0.1％的牛血清蛋白BSA为标准蛋白，检测纯化的serpin1蛋白的蛋白含量，用SDS-PAGE电泳检测serpin1蛋白和BSA的蛋白含量。根据两者蛋白条带对比测出serpin1蛋白含量，对比处理和对照均重复3次。实验结果表明serpin1的蛋白含量为0.7mg/ml。

序列表

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1及其编码基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 363

<212> PRT

<213> 东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis )

<400> 1

Met Glu Thr Ala Gly Gly Val Ala Leu Ala Leu His Ala Ile Ser Gly

1 5 10 15

Ala Ala His Leu Pro Thr Pro Ala Leu Thr Leu Thr Leu Ala Ala Gly

20 25 30

Pro Gly Ala Leu Pro Pro Ser Pro Leu Ser Ile Gly Val Ile Leu Ala

35 40 45

Leu Thr Pro Leu Gly Ala Leu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Met Glu Thr

50 55 60

Ala Leu Gly Leu Ala Ile Pro Gly Ala Thr Ala Val Val Gly Ala Gly

65 70 75 80

Val Gly Ala Leu Met Glu Thr Ala Ala Leu Gly Gly Ile Ala Ala Val

85 90 95

Ala Leu Ala Val Ala Ala Ala Ile Thr Leu Leu Ala Gly Thr Pro Ile

100 105 110

Leu Gly Gly Pro Ala Ser Ser Ala Ser Ala Pro Leu Ala Gly Val Gly

115 120 125

Gly Val Ala Pro Leu Gly Gly Pro Leu Ala Ala Leu Thr Ile Ala Ala

130 135 140

Thr Val Gly Ser Leu Thr Ala His Leu Ile Leu Gly Ile Ile Pro Ser

145 150 155 160

Gly Ile Leu Ala Gly Leu Thr Ala Leu Val Leu Val Ala Ala Ile Thr

165 170 175

Pro Ala Gly Ala Thr Gly Thr Leu Pro Leu Leu His Ala Thr Pro Pro

180 185 190

Val Pro Pro His Ser Ala Ala Gly Ser Thr Leu Ala Val Ala Met Glu

195 200 205

Thr Met Glu Thr Ser Leu Gly Gly His Leu Leu Thr Ser Gly Ala Ser

210 215 220

Ala Leu Ala Cys Gly Val Leu Leu Leu Pro Thr Leu Gly Gly Ala Pro

225 230 235 240

Ser Met Glu Thr Leu Ile Leu Leu Pro Ala Gly Val Ala Gly Leu Ala

245 250 255

Ser Leu Gly Gly Leu Leu Ala Ala Pro Ser Leu Gly Ala Thr Leu Ala

260 265 270

Ala Leu Gly Gly Thr Ala Val His Ala Gly Leu Pro Leu Pro Leu Ile

275 280 285

Gly Thr Ser Leu Gly Leu Thr Ser Val Leu Thr Leu Leu Gly Met Glu

290 295 300

Thr Thr Ala Met Glu Thr Pro Gly Ala Ala Ala Ala Pro Thr Gly Ile

305 310 315 320

Thr Ala Ala Gly His Leu Leu Val Ala Leu Val Leu His Leu Ala Pro

325 330 335

Val Gly Val Ala Gly Gly Gly Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Ala Val

340 345 350

Val Gly Val Pro Thr Ser Leu Thr Ile Thr Leu

355 360

<210> 2

<211> 1041

<212> DNA

<213> 东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis )

<400> 2

atggcagagg aagtgaatct agcattgcat aatatatcgc aagcaaatca tctctttact 60

ttcgacttgt acaagacttt ggcagcggag cctgggaact tgttcttctc tccgttgagt 120

atacaagtaa ttctggcgct cacgtttctt ggagcgaaag acaatacggc caggcagatg 180

gccaaaggac tgcgcatacc agaggacaca gctgtcgtcg aggatggtgt cggcgcttta 240

atgaacagat tacaggaaat caacgacgtg cggcttgatg tagccaacag gatatatctg 300

aaagctggat atcccatcaa ggaaggtttt aattcatcag catctagatt caaggctgga 360

gtagaggaag tagatttcct agaagaaccg aaagcgagaa aaaccataaa tgactgggta 420

gaaagcaaga caaatcataa gataaaggaa ataattccat ctggtatatt gaatggctta 480

actcgattgg tgttggtcaa tgctatttac ttcagaggcg actggcagac aaagtttaaa 540

aagcatagaa cgtttccagt gcctttccac tcagctgacg gatcaacgaa gaatgttgac 600

atgatgtctc tcgaggaaca cttaaagtac agcgagagaa gtgatttgaa ttgccaagtc 660

cttctccttc cttataaggg agagaggttc agcatgctta ttttactacc cagagaggta 720

aacggattgg caagtcttga ggaaaaactt gccgacttca gtcttcaaga tactcttaac 780

aacctgcaag gaacaaatgt acacgcacaa ttaccaaaat ttaaaattga atactcaaaa 840

gaactgacga gtgtgctaac aaagctcgga atgacagaca tgtttgaaaa cgctgctaat 900

ttcactggca ttactgacgc agagcatctg aaggtggaca aagtcctaca taaggctttc 960

gttgaagtca acgaggaggg aacggaagct gctgctgcta ctgctgtggt tggcgttcca 1020

tactcgctaa caatttggaa g 1041

Claims

1.东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1基因，其特征在于，编码权利要求1所述的东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1。

3.根据权利要求2所述的东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.包含东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1基因的重组表达载体。

5.包含东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1基因的重组菌株。

6.权利要求1所述东亚飞蝗丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin1通过控制蝗虫体内蛋白酶的活性抑制绿僵菌侵染的应用。