CN111647599B - 东亚飞蝗serpin1基因的干扰序列及其应用 - Google Patents

东亚飞蝗serpin1基因的干扰序列及其应用 Download PDF

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及东亚飞蝗的serpin1基因的干扰序列及其应用。本发明合成了Serpin1双链RNA并通过注射入东亚飞蝗体内，在通过饲喂绿僵菌孢子粉的方法，检测了东亚飞蝗死亡率及体内Toll通路相关基因的表达量，明确了dsSerpin1在金龟子绿僵菌侵染东亚飞蝗中的作用。

Description

东亚飞蝗serpin1基因的干扰序列及其应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及东亚飞蝗serpin1基因的干扰序列及其应用。
背景技术
丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpins)是研究最为广泛的蛋白酶抑制剂家族。对于Serpins蛋白家族的研究已经超过60多年，目前已发现的serpins有1500多种，且广泛存在于在动植物和病毒等体内，Serpins家族中的大部分成员具有抑制丝氨酸蛋白酶的活性，还有的Serpin充当激素的前体，激素的转运体，以及辅助蛋白折叠的分子伴侣。
东亚飞蝗是我国发生危害的3类飞蝗之一，蝗虫的防治主要采取化学防治，随着数十年来，有机磷等高毒广谱性杀虫剂的滥用，暴露出一系列致命的问题：污染环境，昆虫的抗药性增加和天敌被杀害等，因此寻找安全有效的防治措施迫在眉睫。
RNAi技术的核心点是利用非编码小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA) 分子切割靶标mRNA分子，从而达到部分沉默或完全抑制靶标基因的效果。利用转基因技术在植物体表达dsRNA，当昆虫取食带有dsRNA的植物，dsRNA随食物进人到昆虫体内，使昆虫某些功能丧失造成损伤或者死亡，从而达到防治害虫的效果。利用RNAi防治害虫的设想已经在鳞翅目和鞘翅目昆虫上实现。
当干扰序列进入了microRNA途径时，通过microRNA途径，其可以不受完全互补的限制而调控大量靶基因的表达。原本需要19～23nt的RNA序列完全互补才能发生干扰作用，而如果进入microRNA途径，只需要11～15nt互补就可以产生干扰效果，这使得干扰可能与非靶基因结合而导致非靶基因沉默，造成脱靶。
发明内容
本发明的目的是提供东亚飞蝗的serpin1基因的有效干扰序列。
本发明的再一目的是提供上述东亚飞蝗的serpin1基因的有效干扰序列的应用。
本发明的再一目的是提供有效防止蝗虫的方法。
根据本发明的东亚飞蝗的serpin1基因的有效干扰序列，其核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
本发明提供了上述东亚飞蝗的serpin1基因的有效干扰序列用于防治蝗虫的应用。通过在使蝗虫摄入serpin1基因的干扰序列有效降低了蝗虫对生防菌的抗性，从而实现防治蝗虫的目的。本发明提供了防止蝗虫的方法，所述方法包括利用核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示的dsRNA序列干扰蝗虫体内serpin1基因的步骤。
本领域技术人员可以理解，通过向植物中导入serpin1基因的有效干扰序列，在蝗虫食用植物后，或者直接食用含有serpin1基因的有效干扰序列的饵剂，干扰体内 serpin1基因表达，从而降低蝗虫的免疫力，有效增强绿僵菌侵染力。
本发明过克隆serpin1基因并合成双链RNA，通过与绿僵菌共同处理东亚飞蝗，并检测各处理组东亚飞蝗的死亡率，可知在处理的第5天开始，dsSerpin1和绿僵菌混合处理组和绿僵菌处理组的死亡率均显著高于对照组，dsSerpin1和绿僵菌混合处理组的死亡率显著高于绿僵菌单独处理组。表明干扰掉东亚飞蝗的serpin1基因，可有效增强绿僵菌侵染力，减弱东亚飞蝗的免疫力。
附图说明
图1显示干扰序列dsSerpin1-1在中肠和虫体的干扰效率；
图2显示干扰序列dsSerpin1-2在中肠和虫体的干扰效率；
图3显示干扰序列dsSerpin1-3在中肠和虫体的干扰效率；
图4显示干扰序列dsSerpin1-4在中肠和虫体的干扰效率；
图5显示干扰蝗虫Serpin1后，Toll通路不同基因的相对表达量；
图6显示干扰蝗虫Serpin1后，不同处理组中东亚飞蝗的死亡率。
具体实施方式
根据本发明的具体实施方式，金龟子绿僵菌菌株IMI330189为已知菌株，将菌株接种到PDAY平板上，25℃下培养14d。收集分生孢子粉，密封贮存于4℃冰箱，备用。东亚飞蝗卵采集于河北省沧州市，在人工气候培养箱中孵化，温度(30士2)℃，相对湿度(60士5)％，光周期(14L:10D)，将同一时间孵化的蝗蝻转移到60cm×50cm ×70cm(长×宽×高)规格的养虫笼中饲养，光周期14L:10D，温度为(32士2)℃。
生测筐(长×宽×高＝30cm×12cm×9cm)，玻璃盖板(长×宽＝36cm×16cm)，镊子，培养皿，温湿度计等常规耗材购自华奥宝生科技有限公司。其他生化试剂均为市售可得。PCR引物公司合成。仪器主要包括智能人工气候箱等。
1、serpin1基因的克隆
将飞蝗成虫置于液氮中，后用研钵中研磨成粉状，用Trizol试剂法溶液提取飞蝗的总RNA，进行反转录，合成cDNA。以cDNA为模板，以已去除信号肽的目的基因为引物，以serpin1-F(5'-CGCGGATCCCATGGCAGAGGAAGTG-3'(BamHI))和 serpin1-R(5'-CCCAAGCTTAACGCCAACCACAGC-3'(HindIII))为引物，进行PCR，扩增serpin1基因，并测序。
2、dsRNA的合成
设计4段Serpin1的RNAi的引物和荧光定量的引物，并合成。取已验证成功的菌液提取质粒，将质粒作为模板，各段引物序列如表1，进行PCR扩增，并用 NanoPhotometer微量分光光度计检测各段dsSerpin1浓度，置于-20℃保存待用。
表1 各段dsSerpin1引物序列
名称 引物序列
dsSerpin1-1-F TAATACGACTCACTATAGGGGAGCGAAAGACAATACGG
dsSerpin1-1-R TAATACGACTCACTATAGGTGGAAAGGCACTGGAAAC
dsSerpin1-2-F TAATACGACTCACTATAGGTTTCCAGTGCCTTTCCAC
dsSerpin1-2-R TAATACGACTCACTATAGGGTTCCCTCCTCGTTGACTT
dsSerpin1-3-F TAATACGACTCACTATAGGGCTTGATGTAGCCAACAGG
dsSerpin1-3-R TAATACGACTCACTATAGGTTCGTTAGCACACTCGTCA
dsSerpin1-4-F TAATACGACTCACTATAGGTGACTGGGTAGAAAGCAAGA
dsSerpin1-4-R TAATACGACTCACTATAGGTTCCCTCCTCGTTGACTTC
第一段serpin1的双链RNA，其序列总长为483bp，第二段serpin1的双链RNA，其序列总长为430bp，第三段serpin1的双链RNA，其序列总长为590bp，第四段serpin1 的双链RNA，其序列总长为458bp。
dsSerpin1-1序列
Figure RE-GDA0002614440350000031
dsSerpin1-2序列
Figure RE-GDA0002614440350000032
dsSerpin1-3序列
Figure RE-GDA0002614440350000041
dsSerpin1-4序列
Figure RE-GDA0002614440350000042
3、RNAi干扰后serpin1基因表达量
检测干扰处理后东亚飞蝗的中肠内和整头虫体的serpin1基因的表达量。实验采用分组注射合成的4段Serpin1的双链RNA，取发育一致的三龄蝗蝻分为5组处理，四组为干扰组，一组为对照组，每组蝗虫注射5μL的dsSerpin1溶液，在东亚飞蝗蝗蝻处理后的24小时后，东亚飞蝗中肠的处理为：每个处理共取5头，在冰浴上解剖出东亚飞蝗的中肠，挤出中肠内的残留物采用0.7％的生理盐水冲洗干净后置于匀浆器中，加入500μL trizol，匀浆2分钟后，提取RNA，反转为cDNA。东亚飞蝗整头虫体处理为：将整头虫体置于匀浆器中，加入500μL trizol，匀浆2分钟后，提取RNA，后根据反试剂盒反转为cDNA。以cDNA为模板，并设计dsSerpin1的荧光定量引物，以Actin基因作为对照，采用实时荧光定量PCR方法检测各处理组serpin1基因的表达量。每个样本重复测定3次。
采用通过注射4组serpin1的双链RNA于飞蝗体内，检测五个处理组24小时后飞蝗的中肠和整个虫体内serpin1基因的变化量。24小时处理后的结果如图1-4。当干扰掉第一段serpin1基因后，东亚飞蝗中肠和整个虫体的serpin1的表达量都显著降低，中肠的干扰效率为70％，而虫体的干扰效率高达98％(图1)。干扰掉第二段 serpin1片段后，中肠的干扰效率为58.68％，而虫体的干扰效率高达77.42％(图2)。干扰掉第三段serpin1片段后，中肠的干扰效率为56.02％，而虫体的干扰效率高达 75.08％(图3)。干扰掉第四段serpin1片段后，中肠的干扰效率为56.18％，而虫体的干扰效率高达74.75％(图4)。研究表明第一段dsSerpin1效果最好。后续试验均注射dsSerpin1-1片段并分析结果。
4、Toll路径相关基因表达量
设计Toll通路相关基因toll基因，myd88基因，tube基因，pelle基因，persephone基因，defensin基因引物，并合成(表2)。采用注射5μL已筛选出的dsSerpin1处理飞蝗，分别在取出饵剂后24小时后各处理分别取5头蝗蝻，用4℃预冷的0.1M NaCl 溶液冲去体液，取血淋巴置于匀浆器中，加入500μL trizol，匀浆2分钟后，提取RNA，转为DNA,并以此为模板，采用实时荧光定量PCR方法。以Actin基因作为对照，检测Toll通路相关基因的表达量。每个样本重复测定3次。
表2 各基因引物序列
名称 用处 引物序列
qPCRserpin1-F Serpin1基因表达量 GTTTCCAGTGCCTTTCCAC
qPCRserpin1-R Serpin1基因表达量 TTGCCAATCCGTTTACCTC
Actin-F qRT-PCR GTTACAAACTGGGACGACAT
Actin-R qRT-PCR AGAAAGCACAGCCTGAATAG
Toll-F qRT-PCR TCACGCAGAAACTCGTCA
Toll-R qRT-PCR CCTATCCAGCCGCAATAA
Myd88-F qRT-PCR GGCTGTAATGAATGGGGAA
Myd88-R qRT-PCR CTAAACTGGAACTGGTGGG
Tube-F qRT-PCR AGAAGTATTTGGGACTGCTCG
Tube-R qRT-PCR AGGAAGCCCTCTCAACAGAC
Pelle-F qRT-PCR AACCACTGGCTGATGTCAA
Pelle-R qRT-PCR TCTATTCTCCGTGTTGGCA
persephone-F qRT-PCR CCAACACGGAGAATAGATAGT
persephone-R qRT-PCR TGGTAAAATTCCAAGGTAGA
Defensin-F qRT-PCR CCAGAAAGCGATGATGCCACTA
Defensin-R qRT-PCR CACCACAAATCAACGCCAAAGT
注射第一段serpin1的双链RNA于东亚飞蝗虫体内，在处理后24小时后收集各处理组血淋巴，荧光定量PCR技术检测Toll通路相关基因的变化量如图5。研究发现干扰掉serpin1基因后的24小时，Toll路径相关基因的表达量较对照组均显著降低，其中tube基因下降量最多，为对照组的0.006倍。Myd88基因为对照的0.053466倍， pelle基因的为对照组的0.009786倍，persephone基因为对照的0.049636倍，defensin 基因为对照组的0.071051倍。Toll基因的下降量最少，为对照组的0.49倍。
5、对绿僵菌侵染东亚飞蝗的影响
实验采用注射筛选出的Serpin1的双链RNA，后饲喂绿僵菌孢子粉的方法来测定dsSerpin1对绿僵菌IMI330189的毒力影响，将新鲜收集的绿僵菌IMI330189孢子粉加入到含1％甘油的试管中震荡均匀，显微镜下观察并记录孢子数，并通过稀释制成终浓度为2.5×108spore/mL的孢子悬浮液。将dsSerpin1浓度调整为1000ng/μL，得到dsSerpin1溶液。不同的处理如下：处理1:注射5μLdsSerpin1，后饲喂麦麸。处理2：饲喂含1mL的绿僵菌IMI330189孢子悬浮液的麦麸。处理3：注射5μLdsSerpin1，后饲喂含1mL的绿僵菌IMI330189孢子悬浮液。以不含任何处理的5g麦麸为对照。各处理的终浓度如表3。
将预先饥饿了12h的3龄蝗蝻放入无菌的生测筐中，每筐30头为1个重复，每个处理5筐(重复5次)，每筐中加入相应的1g饵剂，饲喂24h后将饵剂取出，以新鲜麦苗饲喂至实验结束，每日记录死亡和存活数，并计算累计死亡率。试验在30℃, 16L:8D下室内进行。
表3 不同处理饵剂成分及浓度
Figure RE-GDA0002614440350000061
注：饵剂是含有5％植物油的无菌麦麸
东亚飞蝗经不同处理后的累计死亡率见图6。dsSerpin1单独处理组，累计死亡率与对照无显著差异(P＞0.05)。IMI330189处理组第4天起飞蝗开始死亡，从第8天至第12天飞蝗大量死亡，第12天的累计死亡率为41.173％；且第5天直到第12天，飞蝗的累计死亡率显著高于对照(P＜0.05)。dsSerpin1和IMI330189混合处理组第5 天开始的累计死亡率显著高于对照组(P＞0.05)，且在第9天后显著高于于绿僵菌 IMI330189单独处理(P＞0.05)；dsSerpin1处理组自第4天开始较对照组明显升高，且差异显著(P＜0.05)，但在第9天后仍低于相同时间点绿僵菌IMI330189单独处理和dsSerpin1和IMI330189混合处理组的累计死亡率，且差异显著(P＜0.05)(图6)。
综上，通过分别干扰掉4段serpin1基因后的24小时后，可知第一段dsSerpin1 处理中肠和整个虫体内的serpin1的干扰效率均超过70％，干扰效率最高。表明serpin1 基因能有效增强东亚飞蝗的先天性免疫反应。当干扰掉serpin1基因后的24小时后， Toll通路相关基因的表达量较对照组显著降低，饲喂绿僵菌组的Toll通路的相关基因的表达量显著升高。表明干扰掉serpin1基因后，体液免疫中的Toll路径受到抑制，表明serpin1可增强东亚飞蝗的体液免疫反应。
本发明过克隆serpin1基因并合成双链RNA，通过与绿僵菌共同处理东亚飞蝗，并检测各处理组东亚飞蝗的死亡率，可知在处理的第5天开始，dsSerpin1和绿僵菌混合处理组和绿僵菌处理组的死亡率均显著高于对照组，且处理的第9天开始，先干扰掉东亚飞蝗体内serpin1基因，再饲喂绿僵菌孢子粉的死亡率显著高于绿僵菌单独处理组。表明干扰掉东亚飞蝗的serpin1基因，可有效降低东亚飞蝗的免疫力。
序列表
<110> 中国农业科学院植物保护研究所
<120> 东亚飞蝗serpin1基因的干扰序列及其应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1041
<212> DNA
<213> 东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)
<400> 1
atggcagagg aagtgaatct agcattgcat aatatatcgc aagcaaatca tctctttact 60
ttcgacttgt acaagacttt ggcagcggag cctgggaact tgttcttctc tccgttgagt 120
atacaagtaa ttctggcgct cacgtttctt ggagcgaaag acaatacggc caggcagatg 180
gccaaaggac tgcgcatacc agaggacaca gctgtcgtcg aggatggtgt cggcgcttta 240
atgaacagat tacaggaaat caacgacgtg cggcttgatg tagccaacag gatatatctg 300
aaagctggat atcccatcaa ggaaggtttt aattcatcag catctagatt caaggctgga 360
gtagaggaag tagatttcct agaagaaccg aaagcgagaa aaaccataaa tgactgggta 420
gaaagcaaga caaatcataa gataaaggaa ataattccat ctggtatatt gaatggctta 480
actcgattgg tgttggtcaa tgctatttac ttcagaggcg actggcagac aaagtttaaa 540
aagcatagaa cgtttccagt gcctttccac tcagctgacg gatcaacgaa gaatgttgac 600
atgatgtctc tcgaggaaca cttaaagtac agcgagagaa gtgatttgaa ttgccaagtc 660
cttctccttc cttataaggg agagaggttc agcatgctta ttttactacc cagagaggta 720
aacggattgg caagtcttga ggaaaaactt gccgacttca gtcttcaaga tactcttaac 780
aacctgcaag gaacaaatgt acacgcacaa ttaccaaaat ttaaaattga atactcaaaa 840
gaactgacga gtgtgctaac aaagctcgga atgacagaca tgtttgaaaa cgctgctaat 900
ttcactggca ttactgacgc agagcatctg aaggtggaca aagtcctaca taaggctttc 960
gttgaagtca acgaggaggg aacggaagct gctgctgcta ctgctgtggt tggcgttcca 1020
tactcgctaa caatttggaa g 1041
<210> 2
<211> 483
<212> DNA
<213> 东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)
<400> 2
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accgaaagcg agaaaaacca taaatgactg ggtagaaagc aagacaaatc ataagataaa 360
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caaatgtaca cgcgcaatta ccaaaattta aaattgaata ctcaaaagaa ctgacgagtg 300
tgctaacgaa gctcggaatg acagacatgt ttgaaaacgc tgctaatttc actggcatta 360
ctgacgcaga gcatctgaag gtggacaaag tcctacataa ggctttcgtt gaagtcaacg 420
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gcgagaaaaa ccataaatga ctgggtagaa agcaagacaa atcataagat aaaggaaata 180
attccatctg gtatattgaa tggcttaact cgattggtgt tggtcaatgc tatttacttc 240
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<210> 5
<211> 472
<212> DNA
<213> 东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)
<400> 5
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tcagctgacg gatcaacgaa gaatgttgac atgatgtctc tcgaggaaca cttaaagtac 120
agcgagagaa gtgatttgaa ttgccaagtc cttctccttc cttataaggg agagagattc 180
agcatgctta ttttactacc cagagaggta aacggattgg caagtcttga ggaaaaactt 240
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ttaccaaaat ttaaaattga atactcaaaa gaactgacga gtgtgctaac gaagctcgga 360
atgacagaca tgtttgaaaa cgctgctaat ttcactggca ttactgacgc agagcatctg 420
aaggtggaca aagtcctaca taaggctttc gttgaagtca acgaggaggg aa 472

Claims (5)

1.蝗虫serpin1基因的干扰序列，其特征在于，所述干扰序列的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。
2.核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的dsRNA序列用于防治蝗虫的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，蝗虫食用含有核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的dsRNA序列的饵剂。
4.一种防治蝗虫的方法，其特征在于，所述方法包括利用核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的dsRNA序列干扰蝗虫体内serpin1基因表达的步骤。
5.根据权利要求4所述的防治蝗虫的方法，其特征在于，所述方法包括蝗虫摄取包含核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的dsRNA序列的饵剂的步骤。
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