CN114591954B - 一种miRNA、衍生物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种miRNA、衍生物及其应用，所述miRNA的核酸序列如Seq ID No.1所示或为Seq ID No.1所示的核酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个碱基获得核酸序列。本发明方案所用的miRNA来源于大豆，对人类安全，也不作用于水稻；所改造得到的miRNA衍生物也保留了该miRNA的作用与特性，可用作安全有效的防治褐飞虱的新型杀虫剂，可直接使用及转基因植物，对褐飞虱防治将有着实际的应用价值。

Description

一种miRNA、衍生物及其应用
技术领域
本发明属于昆虫防治技术领域，具体涉及一种miRNA、衍生物及其应用。
背景技术
RNA干扰(RNAi)是一种首次在线虫(秀丽隐杆线虫)中发现的高度保守的细胞机制。自首次报道以来，RNAi已经迅速成为研究细胞和组织水平上基因功能、调控和互作的强大反向遗传学工具。同时，RNAi在害虫防治领域也展现出了巨大的应用价值和潜力。
在昆虫和其它物种中，目前存在已知三种不同的小RNA(sRNA)能触发三种不同类型的RNAi途径，分别是siRNA、miRNA和piRNA。其中，siRNA和miRNA介导的基因转录后沉默是当前害虫防治领域的主要研究手段。siRNA长度为19-21bp，由外源或内源产生的长的dsRNA加工而成，以高度特异性的结合方式结合靶mRNA，并进一步使其降解。miRNA是一类长度为19-24bp的单链RNA，来源于内源性的初级miRNA(pri-miRNA)，经加工后形成小的单链RNA，在动植物中主要以介导靶mRNA降解和抑制靶基因表达为主要功能。与siRNA不同的是，在动物中，miRNA依靠种子区序列与靶mRNA结合配对，这意味着miRNA与靶mRNA的配对结果是多样化的。总而言之，基于siRNA和miRNA的作用机制，可以起到抑制目标害虫重要基因的效果，进而达到害虫防治的目的。
褐飞虱是一种单食性的半翅目昆虫，具备远距离迁飞的习性，是当前水稻上的首要害虫，主要通过其刺吸式口器吸食水稻的韧皮部汁液，同时还会传播多种水稻病害。目前对防治褐飞虱的靶标基因开发已有很多，但可用于防治褐飞虱的miRNA小分子极少，更没有以植物源miRNA形式对褐飞虱进行防治的研究报道。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种miRNA，该miRNA能够有效应用于昆虫防治。
本发明还提出一种上述miRNA的衍生物。
本发明还提出一种上述miRNA的衍生物的制备方法。
本发明还提出一种与上述miRNA和上述miRNA的衍生物相关的生物材料。
本发明还提出一种上述miRNA、上述miRNA的衍生物及上述生物材料的应用。
本发明还提出一种昆虫防治方法。
根据本发明的一个方面，提出了一种miRNA，所述miRNA的核酸序列如Seq ID No.1所示或为Seq ID No.1所示的核酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个碱基获得核酸序列。
在本发明的一些实施方式中，所述miRNA为大豆源的miRNA。
根据本发明的第二方面，提出了一种上述miRNA的衍生物，所述miRNA生物衍生物的核酸序列如Seq ID No.2～3任一种所示或为Seq ID No.2～3任一种所示的核酸序列经修饰、取代、缺失或添加至少一个碱基获得核酸序列。
根据本发明的第三方面，提出了一种上述miRNA的衍生物的制备方法，所述方法包括以下步骤：将上述miRNA的核酸序列构建到载体中，得到重组载体；将重组载体导入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；将重组大肠杆菌进行诱导表达后，进行破碎即得。
在本发明的一些实施方式中，所述载体为L4440载体。
在本发明的一些实施方式中，所述大肠杆菌为HT115、DH5α和BL21中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，用于扩增miRNA序列的引物核苷酸序列如Seq IDNo.4、Seq ID No.5所示。
在本发明的一些实施方式中，所述破碎采用超声细胞破碎。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞破碎后还包括miRNA的提取纯化步骤，所述提取纯化采用Trizol法提取RNA。
根据本发明的第四方面，提出了一种与上述miRNA和上述miRNA的衍生物相关的生物材料，所述生物材料为1)～4)中任一种：
1)上述的miRNA或上述miRNA的衍生物前体；
2)上述的miRNA或上述miRNA的衍生物模拟物；
3)编码上述的miRNA、上述miRNA的衍生物、1)中上述的miRNA或上述miRNA的衍生物前体的DNA分子；
4)含有3)中所述的DNA分子的表达盒、重组载体或转基因细胞。
根据本发明的第五方面，提出了一种上述miRNA和上述miRNA的衍生物的应用，所述应用为在昆虫防治中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述应用为杀灭昆虫虫体和/或抑制昆虫虫体的生长。
在本发明的一些实施方式中，所述昆虫为水稻害虫。
在本发明的一些实施方式中，所述水稻害虫为褐飞虱。
根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：所述miRNA为来源于大豆的Gma-miR482a(NR_048614.1)，可能靶向多个不同的褐飞虱已报道的致死靶基因，分别注射人工合成的Gma-miR482a，Gma-miR482a的衍生sRNA482a-228和sRNA482a-542进入虫体，在7天内存活率相比于对照组明显降低。由于Gma-miR482a是大豆源的miRNA，大豆是人日常生活食物，因此，该片段对人是安全的，可用作为安全有效的防治褐飞虱的新型杀虫剂，可直接使用及转基因水稻进行害虫防治。同时，Gma-miR482a为豆科特有miRNA，因此，Gma-miR482a及sRNA482a-228和sRNA482a-542对水稻安全，不影响水稻的生长和发育。
在本发明的一些实施方式中，所述应用为杀灭昆虫虫体和/或抑制昆虫虫体的生长。
在本发明的一些实施方式中，所述昆虫为水稻害虫。
在本发明的一些实施方式中，所述水稻害虫为褐飞虱。大豆的miRNA(Gma-miR482a)及其Gma-miR482a的衍生物sRNA482a-228和sRNA482a-542对水稻害虫半翅目单食性昆虫褐飞虱生长具有抑制作用。由于Gma-miR482a来源于大豆，一种主要的农作物，sRNA482a-228和sRNA482a-542为Gma-miR482a的衍生物，因此sRNA482a、sRNA482a-228和sRNA482a-542对人类安全，可用作安全有效的防治褐飞虱的新型杀虫剂，可直接使用及转基因植物对褐飞虱防治将有着实际的应用价值。
在本发明的一些实施方式中，所述应用为在杀虫剂制备中的应用。
一种杀虫剂，所述杀虫剂中含有上述miRNA、上述miRNA的衍生物或生物材料；优选地，所述杀虫剂中还包括表面活性剂。
在本发明的一些实施中，所述表面活性剂为吐温80。
在本发明的一些实施方式中，所述吐温80的浓度为1w/v％-10w/v％；优选地，所述吐温80的浓度为2.5w/v％-10w/v％；更优选地，所述吐温80的浓度为5w/v％-10w/v％。
根据本发明的第六方面，提出了一种昆虫防治方法，包括如下步骤：将上述miRNA或上述miRNA的衍生物导入到昆虫体内或将上述杀虫剂喷洒于植物体。
在本发明的一些实施方式中，所述导入操作通过注射的方式。
在本发明的一些实施方式中，所述导入操作还可以通过喷施的方式。
在本发明的一些实施方式中，所述植物体选自水稻。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例1中的Gma-miR482a的序列信息及与豇豆转录组比对结果图；
图2为本发明实施例1中的Gma-miR482a的序列信息及与大豆转录组比对结果图；
图3为本发明实施例1中褐飞虱注射Gma-miR482a和PBS(对照)后1-7天的存活率结果图，其中A为注射Gma-miR482a和PBS后的褐飞虱的存活率结果图，图B为注射Gma-miR482a后的褐飞虱的形态图；
图4为本发明实施例2中的载体L4440-Gma-miR482a构建示意图；
图5为本发明实施例2中的质粒L4440的图谱；
图6为本发明实施例2中褐飞虱分别注射含有L4440空载体的HT115菌株诱导后Trizol法提取的总RNA(sRNACK)、含有L4440-Gma-miR482a载体的HT115菌株诱导后Trizol法提取的总RNA(sRNA482a)、含有L4440-Gma-miR482a载体的HT115菌株诱导后超声波法提取的总RNA(sRNA482a-Ultrasonication)和磷酸盐缓冲液(PBS)后1-7天的存活率结果图；
图7为本发明实施例3中Gma-miR482a和sRNA482a-228对α-N-acetylgalactosaminidase、JH-acid-O-methyltransferase、kayak、AP-1、krh1、CP16.5、FAD、Aminopeptidase Q、P450 4c3、P450 4c1基因的抑制作用检测结果图；
图8为本发明实施例3中褐飞虱注射人工合成的Gma-miR482a、sRNA482a-228和sRNA482a-542以及磷酸盐缓冲液(PBS)后的杀虫效果图；
图9为本发明测试例中的吐温80降低褐飞虱表面液体张力的结果图；
图10为本发明测试例中的吐温80有助于荧光标记黏附于褐飞虱表面的结果图；
图11为本发明测试例中的吐温80的杀虫效果检测结果图；其中A为3mL的喷施量的杀虫效果检测结果图，B为8mL的喷施量的杀虫效果检测结果图；
图12为本发明测试例中的sRNA482a(由L4440-Gma-miR482a载体在HT115菌株中诱导生成，以超声破碎方法提取的sRNA482a)+2.5％吐温80、褐飞虱农药烯啶·吡蚜酮和L4440空载体+2.5％吐温80的杀虫效果检测结果图；
图13为本发明测试例中的1月份sRNA482a+2.5％吐温80与褐飞虱农药烯啶·吡蚜酮对褐飞虱的户外杀虫效果检测结果图；
图14为本发明测试例中的4月份sRNA482a+2.5％吐温80与褐飞虱农药烯啶·吡蚜酮对褐飞虱的户外杀虫效果检测结果图；
图15为本发明测试例中的7月份sRNA482a+2.5％吐温80与褐飞虱农药烯啶·吡蚜酮对褐飞虱的户外杀虫效果检测结果图；
图16为本发明测试例中的10月份sRNA482a+2.5％吐温80与褐飞虱农药烯啶·吡蚜酮对褐飞虱的户外杀虫效果检测结果图；
图17为本发明测试例中的全年综合sRNA482a+2.5％吐温80与褐飞虱农药烯啶·吡蚜酮对褐飞虱的户外杀虫效果的检测结果图；
图18为本发明测试例中的测试水稻的表型图；
图19为本发明测试例中的sRNA482a+2.5％吐温80对植物生长的影响结果图；
图20为本发明测试例中的sRNA482a+2.5％吐温80对植物生长的影响结果图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
为了筛选既能防治褐飞虱又安全环保的抗虫miRNA，将植物源的miRNA库作为小分子库，将筛选后的褐飞虱已报道的致死基因作为靶基因库，进行植物源miRNA的褐飞虱靶基因预测。经过预测发现，Gma-miR482a可能靶向的致死靶基因有33个。注射人工合成的Gma-miR482a后褐飞虱若虫的存活率相比于对照组在7天内显著降低，证明了Gma-miR482a具备潜在的抗虫价值。由于人工合成的成本偏高，为了解决实际生产并在田间应用的问题，将Gma-miR482a构建进入L4440载体(一种用于生产长的双链RNA的载体)，利用可工业化生产的细菌体系，生成小分子RNA(sRNA)。经实验验证，sRNA482a基本保留了Gma-miR482a的下游基因和抗虫效果。并且通过预测，Gma-miR482a与水稻转录组没有连续18bp以上的同源区域，因此可认为Gma-miR482a不影响水稻基因的表达。
由于Gma-miR482a来源于大豆，属于人类主食植物中的一类，对人类安全，也对水稻安全。因此，基于Gma-miR482a、sRNA482a-228和sRNA482a-542的直接喷施和转基因植物进行害虫防治有着实际的应用价值。
实施例1
本实施例提供了一种Gma-miR482a，核酸序列为：GGAATGGGCTGATTGGGAAGCA(SeqID No.1)，来源于大豆，Gma-miR482a的序列分别与豇豆、大豆转录组比对结果图如图1-2所示，在褐飞虱防治中的应用。
1、Gma-miR482a防治褐飞虱的机理研究：
对褐飞虱已报道的致死基因进行筛选，提取致死基因的3’UTR序列，利用在大豆中获得的miRNA数据进行交集分析，发现了Gma-miR482a。继而分别在miRNA靶基因预测软件网站PITA(https://genie.weizmann.ac.il/pubs/mir07/mir07_exe.html)、miRanda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)和RNAhybrid(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)下载软件在Linux环境中的安装包，并进一步解压安装。在Linux系统中调用Gma-miR482a序列与褐飞虱致死靶标基因的3’UTR序列进行靶基因预测。
预测结果如下表1所示：
表1Gma-miR482a与褐飞虱已报道致死基因3’UTR的结合位点预测
Figure SMS_1
Figure SMS_2
Figure SMS_3
Figure SMS_4
根据表1结果所示，Gma-miR482a可能靶向多个褐飞虱致死靶基因的3’UTR位点。
2、验证Gma-miR482a对褐飞虱的杀虫效果
将褐飞虱5龄若虫分为2组，每组150只，实验进行3次重复，给对褐飞虱5龄若虫分别注射0.5μg人工合成的Gma-miR482a(实验组)和磷酸盐缓冲液(PBS)(对照组)，注射体积为50nL。将注射后的虫体置于分蘖初期的水稻上饲养，分别用透气塑料罩隔开，每24h统计存活率。
观察结果如图3所示，其中，图A为注射Gma-miR482a和PBS后的水稻褐飞虱的存活率结果图，图B为注射Gma-miR482a后的褐飞虱的形态图，从图中可以看出，注射Gma-miR482a后第7天后，实验组的存活率为51.2％，而对照组的存活率为92％。结果表明，Gma-miR482a能明显降低褐飞虱的存活率，使得褐飞虱无法蜕皮而死亡。
实施例2
本实施例提供了一种Gma-miR482a的衍生产物sRNA482a。
1、Gma-miR482a的衍生产物sRNA482a制备方法
Gma-miR482a的衍生产物sRNA482a制备方法包括以下步骤：
(1)用Kpn I和Bgl II对L4440空载体(购自TIANDZ北京天恩泽基因科技有限公司)进行双酶切，去除两个T7启动子之间的所有酶切位点，再通过一对引物T7-482a-F和T7-482a-R以引物本身为模板扩增出包含两端部分T7启动子序列和Gma-miR482a序列的片段，以同源重组的方法将Gma-miR482a序列组装至两个T7启动之间，构建得到L4440-Gma-miR482a载体。同源重组的引物为：T7-482a-F：TAATACGACTCACTATAGGGGAATGGGCTGATTGGGAAGCA(SEQ ID NO.4)；T7-482a-R：TAATACGACTCACTATAGGTGCTTCCCAATCAGCCCATTCC(SEQ IDNO.5)。L4440-Gma-miR482a载体构建过程如图4所示，L4440的质粒图谱如图5所示。
(2)将构建得到的L4440-Gma-miR482a载体导入HT115菌株后，对重组HT115菌株进行诱导表达，具体包括如下步骤：将含有L4440-Gma-miR482a的HT115在37℃条件下过夜活化，按1:100的比例加入含有氨苄青霉素(100μg/ml)和四环素(12.5μg/ml)的培养基中，在37℃条件下扩大培养至菌液OD值为0.6，然后按体积比1：1000的比例加入0.1mol/L的IPTG诱导sRNA合成6小时后，以11000rpm的转速收集细菌。按700ml菌液重悬至16ml的菌液浓度，用超声波20-22W输出功率破碎28min(工作10s停10S)，对诱导表达后的重组HT115菌株进行破碎，用Trizol试剂盒(购自上海生工生物有限公司)提取得到菌体合成的Gma-miR482a的衍生产物sRNA482a。
2、sRNA482a的杀虫效果验证
验证细菌体系生成的sRNA482a利用Trizol所提取的RNA以及利用超声破碎细菌获得的RNA对褐飞虱的防治作用。包括以下步骤：对5龄褐飞虱若虫分别注射含有L4440空载体的HT115菌株诱导后Trizol法提取的总RNA(sRNACK)、含有L4440-Gma-miR482a载体的HT115菌株诱导后Trizol法提取的总RNA(sRNA482a)、含有L4440-Gma-miR482a载体的HT115菌株诱导后超声波法提取的总RNA(sRNA482a-Ultrasonication)和磷酸盐缓冲液(PBS)(对照组)，注射体积为100nL，注射剂量为每头100ng。将注射后的虫体置于分蘖初期的水稻上饲养，分别用透气塑料罩隔开，每24h统计存活率。实验结果如图6所示，从图中可以看出，7天后，超声波法与Trizol法两种方法获得的sRNA482a的杀虫效果相似，褐飞虱的死亡率皆比对照组高。
实施例3
本实施例提供了一种Gma-miR482a的衍生产物sRNA482a-228和sRNA482a-542，其中，sRNA482a-228的核苷酸序列为：ACTCACTATAGGGGAATGGGCTGATTGGGAAGCACCTATAGTGAGT(SEQ ID NO.2)；sRNA482a-542的核苷酸序列为：GGCTGATTGGGAAGCACCTATAGTGAGTCG(SEQID NO.3)。
1、Gma-miR482a的衍生产物sRNA482a-542和sRNA482a-228制备包括以下步骤：将实施例2得到的细菌体系生成的衍生产物sRNA482a进行测序分析，测序分析如表1所示，主要含2种sRNA(sRNA482a-228和sRNA482a-542)。其中sRNA482a-228含全长Gma-miR482a加上载体上的两端T7启动子部分序列，sRNA482a-542包含部分的Gma-miR482a序列和T7启动子部分序列。
表1
Figure SMS_5
2、Gma-miR482a和sRNA482a-228杀虫的分子机理研究
因为sRNA482a-542的count值，仅占sRNA482a-228和sRNA482a-542的count值37.59％。所以主要以sRNA482a-228代表sRNA482a的作用机制进行杀虫机理研究。通过转录组测序分析，PBS VSGma-miR482a：上调291个，下调265个基因；PBS VSsRNA482a-228：上调455个，下调505个基因。由于小分子RNA以负调控基因为主。分析了下调基因，发现Gma-miR482a所下调的基因几乎都出现在sRNA482a-228下调基因中，而仅在sRNA482a-228下调基因中出现的多为相对不会导致死亡的基因。说明sRNA482a-228主要执行了Gma-miR482a的杀虫机理。在两转录组中交集的基因主要包括了：转录因子kayak和AP-1、表皮蛋白家族基因、细胞色素P450家族基因、内表皮结构糖蛋白、几丁质酶、保幼激素合成及下游基因的保幼激素酸O-甲基转移酶、Krueppel homolog 1(krh1)和Krueppel-like factor 10。这些皆为昆虫的结构、生长发育和应对植物次生物质等的重要基因。
分别注射0.5μg人工合成的Gma-miR482a和sRNA482a-228，对照组采用PBS缓冲液于褐飞虱5龄若虫，注射体积为100nL。qRT-PCR验证Gma-miR482a和sRNA482a-228对这些基因的抑制作用，qRT-PCR采用试剂盒Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix进行，引物如表2所示。qRT-PCR结果如图7所示，从图中可以看出Gma-miR482a和sRNA482a-228对α-N-acetylgalactosaminidase、JH-acid-O-methyltransferase、kayak、AP-1、krh1、CP16.5、FAD、Aminopeptidase Q、P450 4c3、P450 4c1基因的抑制作用。
表2
Figure SMS_6
/>
Figure SMS_7
3、sRNA482a-228和sRNA482a-542的杀虫效果验证
由于细菌体系获得的小分子RNA含有sRNA482a-228和sRNA482a-542，为了验证两者的抗虫作用，分别进行了人工合成以验证。实验方法：将褐飞虱5龄若虫分为4组，每组各150只，分别注射200ng人工合成的Gma-miR482a、sRNA482a-228、sRNA482a-542和磷酸盐缓冲液(PBS)(对照组)，注射体积为100nL。将注射后的虫体置于分蘖初期的水稻上饲养，分别用透气塑料罩隔开，每24h统计存活率。
实验结果如图8所示，结果表明，7天后，sRNA482a-542对水稻褐飞虱的防治作用比Gma-miR482a的效果更好，Gma-miR482a和sRNA482a-228的杀虫效果相似，三者皆能明显降低褐飞虱的存活率，使得褐飞虱无法蜕皮而死亡。
实施例4
本实施例提供了一种杀虫剂，由2.5％吐温80和sRNA482a组成。吐温80添加于实施例2制备得到的sRNA482a水溶液中，其终浓度为2.5％。
测试例
1、吐温80抑制褐飞虱存活率的效果验证
(1)吐温80降低褐飞虱表面液体张力，从而增加小分子RNA黏附于虫的体表
为了促使sRNA的水溶剂能够粘附于昆虫的蜡质表层，进行了表面活性剂吐温80的测试。将褐飞虱5龄若虫分为两组，每组150只，实验组采用含有2.5％吐温80和15μg/mLGma-miR482a的容器，对照组采用含有等量Gma-miR482a的ddH2O的容器，将褐飞虱5龄若虫放入容器中，每组重复5次，6h后的表面观察图结果如图9所示，从图中可以看出，本发明方案的吐温80可以有效的降低褐飞虱表面液体张力。
(2)吐温80增加了Gma-miR482a在体表的聚集效果验证
为了证明吐温80降低褐飞虱表面液体张力后，是否增加了Gma-miR482a在体表的聚集，将Gma-miR482a标记上绿色荧光(5’FAM)。褐飞虱5龄若虫分为4组，每组150只，实验组采用含有2.5％吐温80、15μg/mL Gma-miR482a和DEPC水的容器，对照组1(DEPC组)和实验组的区别仅在于不含有2.5％吐温80、Gma-miR482a；对照组2(DEPC+T组)和实验组的区别仅在于不含有Gma-miR482a，对照组3(DEPC+Gma-miR482a组)和实验组的区别仅在于不含有2.5％吐温80，将褐飞虱5龄若虫放入容器中，每组重复5次。通过扫描，6h的荧光检测结果如图10所示，从图中可以看出，吐温80有助于荧光标记后的Gma-miR482a黏附于褐飞虱表面。
(3)不同浓度吐温80对褐飞虱的杀虫效果验证
吐温80对褐飞虱杀虫效果验证，包括以下步骤：将褐飞虱3龄若虫分为9组，每组150只，分别喷洒3mL ddH2O、3mL 1％的吐温80、3mL 2.5％的吐温80、3mL 5％的吐温80、8mLddH2O、8mL 1％的吐温80、8mL 2.5％的吐温80、8mL 5％的吐温80、8mL10％的吐温80于虫体表面，6h后的结果如图11所示，从图中可以看出，吐温80可以有效的降低褐飞虱的存活率，其抗虫效果与浓度有关，可能与其对害虫的表皮的伤害有关。因此，为了避免对小分子RNA的抗虫效果的影响、以及减少对环境的可能影响，故选用与对照组ddH2O效果接近的2.5％吐温80进行sRNA的制剂制备。
(4)sRNA482a对褐飞虱杀虫效果的室外验证
将本发明方案实施例4制备得到的杀虫剂(sRNA482a+2.5％吐温80)在室外水泥池(4x1米)72株分蘖初期的水稻苗进行害虫中试，测试实施例2制备得到的sRNA482a的杀虫效果。
将褐飞虱3-5龄若虫分为3组，每组约500只，sRNA482a由L4440-Gma-miR482a载体在细菌体系中表达后，经溶菌酶破碎细胞后，用Trizol试剂盒提取获得。实验组为sRNA482a+2.5％吐温80，一个水泥池sRNA482a用量约为30毫克、阳性对照组为褐飞虱农药烯啶吡蚜酮(按推荐剂量使用，浓度为0.15g/L)、阴性对照组为细菌体系的RNA(含L4440载体的细菌)+2.5％吐温80，喷施体积相同，均为20mL，在室外水泥池进行害虫中试，将虫体置于分蘖初期的水稻上饲养，分别用透气塑料罩隔开，实验组和对照组均喷施于虫体上，于0h、24h、72h、120h、168h统计存活率。
实验结果如图12所示，喷施sRNA482a+2.5％吐温80后7天内的杀虫效率比阴性对照明显增加、仅比效果较好的褐飞虱农药烯啶·吡蚜酮(Nitenpyram Pymetrozine)低大约2～10％。
(5)sRNA482a制剂与农药对褐飞虱的杀虫效果比较验证
将本发明方案实施例4制备得到的杀虫剂在室外水泥池进行害虫防治中试，与农药相比，评估sRNA482a的室外杀虫效果。
将褐飞虱3龄若虫分为3组，每组约500只，实验组为sRNA482a(L4440-Gma-miR482a在菌体中生成)+2.5％吐温80，阳性对照组为褐飞虱农药烯啶吡蚜酮(按推荐剂量使用，浓度为0.15g/L)，在室外水泥池进行害虫防治中试，杀虫剂和阳性对照组用量均与(4)sRNA482a对褐飞虱杀虫效果的室外验证相同，将虫体置于分蘖初期的水稻上饲养，分别用透气塑料罩隔开，实验组和对照组均喷施与虫体上，每24h统计存活率。实验在同年的1月、4月、7月、10月分别进行测试，使四次试验时间点覆盖全年。
实验结果如图13-16所示，从图中可以看出，不同季节喷施sRNA482a+2.5％吐温可以有效降低褐飞虱存活率，其抗虫效果可以达到和褐飞虱农药烯啶·吡蚜酮相似的效果。图17为这4次的平均值，结果相似。
(6)sRNA482a制剂喷施害虫后的水稻表型验证
将水稻分为2组，对照组喷施清水，实验组喷施sRNA482a+2.5％吐温80(实施例4制备的杀虫剂)，每株水稻上接种150只褐飞虱3-5龄若虫。杀虫剂用量与(4)sRNA482a对褐飞虱杀虫效果的室外验证实验相同，喷施害虫。如图18所示，从图中可以看出，7天后，对照的水稻面的叶片已变黄色，而喷施sRNA482a的水稻苗除了一片叶片略黄外(箭头所示)，其余正常，说明减少了害虫的侵食。
2安全性试验验证
(1)水稻表型验证
将水稻分为2组，对照组喷施清水，实验组用大约高于喷施害虫的2.5倍的剂量，对水稻喷施实施例4制备的杀虫剂(sRNA482a+2.5％吐温80)，每周施于水稻根部1次，连续处理4次。
处理结束三周后的水稻的表型和重量检测结果如图19-20所示，结果表明sRNA482a+2.5％吐温80对水稻生长无影响。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
序列表
<110> 华南师范大学
<120> 一种miRNA、衍生物及其应用
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaatgggct gattgggaag ca 22
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
actcactata ggggaatggg ctgattggga agcacctata gtgagt 46
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggctgattgg gaagcaccta tagtgagtcg 30
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taatacgact cactataggg gaatgggctg attgggaagc a 41
<210> 5
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taatacgact cactataggt gcttcccaat cagcccattc c 41
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aagtcaatcc atcgggagtc gtta 24
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atatttgcct gaatgggttg taagg 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tatacgaaga ttggcggaga tgttg 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atctggccac cttgattatg aaaga 25
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccttgttctg agcgccttgg t 21
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cccacgcggt cgaacttga 19
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gctactgcta cctgcccttc agtt 24
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
acgtgggtgg tcagcttgta gttc 24
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggtcatcaaa gaagttctgc ggtta 25
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcctgctggg aacactgtcg a 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tacccgccac tgacggagtc t 21
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gcgcccacaa taacaaagtc gta 23
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggcaagacgg cgagaccat 19
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
catgttccac catattcgac gaaa 24
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acacgccaga tagaataagg gtcaa 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gcagcttcac tcctctcatc tttcc 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttctacgagg agggttcatt caatc 25
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cacgtttcgc gtcgttgtga 20
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
acctaccagc ctgccagttg tg 22
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tccatcagcg agtcgaagtt ga 22

Claims (12)

1.一种miRNA的衍生物，其特征在于，所述miRNA的衍生物的核酸序列如Seq ID No.2~3任一种所示。
2.一种如权利要求1所述的miRNA的衍生物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将miRNA的核酸序列构建到载体中，得到重组载体；将重组载体导入大肠杆菌，得到重组大肠杆菌；将重组大肠杆菌进行诱导表达后，进行破碎即得；所述miRNA的核酸序列如Seq ID No.1所示。
3.与权利要求1所述的miRNA的衍生物相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为1）～2）中任一种：
1）编码权利要求1所述的miRNA的衍生物的DNA分子；
2）含有1）中所述的DNA分子的表达盒、重组载体或转基因细胞。
4.一种miRNA及其衍生物或生物材料在昆虫防治中的应用，其特征在于，所述miRNA的核酸序列如Seq ID No.1所示；所述衍生物为如权利要求1所述的衍生物，所述生物材料为如权利要求3所述的生物材料；所述昆虫为褐飞虱。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述应用为杀灭昆虫虫体和/或抑制昆虫虫体的生长。
6.一种miRNA及其衍生物或生物材料在杀虫剂制备中的应用，其特征在于，所述miRNA的核酸序列如Seq ID No.1所示；所述衍生物为如权利要求1所述的衍生物，所述生物材料为如权利要求3所述的生物材料。
7.一种杀虫剂，其特征在于，所述杀虫剂中含有如权利要求1所述的miRNA的衍生物或权利要求3所述的生物材料。
8.根据权利要求7所述的杀虫剂，其特征在于，所述杀虫剂中还包括表面活性剂。
9.根据权利要求8所述的杀虫剂，其特征在于，所述表面活性剂为吐温80。
10.根据权利要求9所述的杀虫剂，其特征在于，所述吐温80的浓度为2.5w/v%-10w/v%。
11.一种昆虫防治方法，其特征在于，包括如下步骤：将miRNA、权利要求1所述的miRNA的衍生物或权利要求3所述的生物材料导入到昆虫体内或将权利要求7-10任一项所述的杀虫剂喷洒于植物体；所述miRNA的核酸序列如Seq ID No.1所示；所述昆虫为褐飞虱。
12.根据权利要求11所述的昆虫防治方法，其特征在于，所述植物体选自水稻。
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