CN111849980B - 一类抑制小菜蛾PPO激活的miRNAs及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一类抑制小菜蛾PPO激活的miRNAs及其应用，本发明通过饲喂苏云金芽孢杆菌侵染小菜蛾三龄幼虫，从小菜蛾中肠体内筛选到一类可抑制酚氧化酶原激活蛋白酶PAP1的转录和表达的miRNAs，所述miRNAs可以降低或中断害虫的酚氧化酶途径的激活，导致小菜蛾天然免疫降低或者消失，导致害虫更易感染病原物而快速死亡。本发明提供了一种新的控制害虫免疫系统的分子靶标，可开发成调节害虫免疫系统的生物农药。本发明提供的方法，尤其是杀鳞翅目害虫小菜蛾的杀虫剂组合物，发明具有特异性强、不杀伤有益生物、无残留、无毒副作用等优点，是一种新型的生物防治策略。

Description

一类抑制小菜蛾PPO激活的miRNAs及其应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，更具体地，涉及一类抑制小菜蛾PPO激活的miRNAs及其应用。

背景技术

酚氧化酶(Phenoloxidase，PO)是昆虫体内的一种重要的免疫蛋白，PO介导的黑化反应不仅在昆虫先天免疫中起着重要作用，而且在昆虫伤口愈合、表皮糅化等生理过程也有重要作用(Tanji et al.,2005；Lemaitre and Hoffmann,2007；Cerenius et al.,2010)。PO在昆虫血淋巴中往往以无活性的多酚氧化酶原(prophenoloxidase，PPO)形式存在。对烟草天蛾等昆虫研究表明，在昆虫遭受病原微生物侵染或创伤等刺激时，昆虫体内的模式识别蛋白(pattern recognition proteins，PRPs)识别并结合病原物表面特有的病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，依赖丝氨酸蛋白酶(Serine proteases，SPs)或在丝氨酸蛋白酶同系物(Serine protease homologs，SPHs)的辅助下，通过一系列级联反应，激活酚氧化酶原活化蛋白酶(PPO-activatingproteinases，PAPs)在特异位点切割PPO释放出有活性的PO，介导了黑化反应。

酚氧化酶原激活蛋白酶(Prophenoloxidase activating proteinase，PAP)是酚氧化酶原激活系统中的重要一员，属于丝氨酸蛋白酶家族。在激活系统中，PAP自身或者在辅助因子(丝氨酸蛋白酶同系物，SPH)的作用下，无活性的酚氧化酶原被微生物细胞壁成分激活的丝氨酸蛋白酶逐步激活生成有活性的酚氧化酶发挥作用，被激活的酚氧化酶将酪氨酸羟基化为多巴，多巴发生氧化生成多巴色素，黑素前体(吲哚醌)被二羟吲哚氧化产生，黑色素在多巴脱羧以及多巴色素转化酶的共同作用下形成，其对昆虫的生长具有保护的作用，使昆虫避免受外来物的入侵。

microRNA是真核生物体内一类非编码的核苷酸，在调节基因表达方面具有重要作用，其长度一般为18～25个核苷酸，对于基因转录后的mRNA的抑制或降解其翻译或者调控组蛋白修饰具等从而对转录后调控表达具有重要的调控意义；一般来说，miRNA可以通过miRNA介导的mRNA降解和P小体的螯合、翻译起始后抑制蛋白形成、翻译延伸前抑制等来下调靶基因的表达(陈楠菁，2016)。通过调控靶基因的表达而进一步表现出对昆虫的生长发育、细胞凋亡与分化、激素的分泌、抗病毒、免疫防卫等重要生物过程具有重要的调控作用。许多研究都显示着miRNA具有巨大的作用和潜力，可以通过miRNA来研究基因功能和摸索基因、生物进化以及人类疾病防治与治理的探索等都具有极大的研究价值与意义和无穷的潜力(俞焙秦等，2007)。对于miRNA与基因互作或者调控基因水平表达研究的成果日益增多，2013年鲁莎等，通过研究被半闭弯尾姬蜂寄生后的小菜蛾，发现其miR-8与丝氨酸蛋白酶抑制剂转录水平具有正向调控关系。这研究表明在被半闭弯尾姬蜂寄生后的小菜蛾其miR-8表达水平降低而与之对应的Serpin27转录水平显著下降。可见miRNA能够在一定程度上调控昆虫的免疫应答反应(鲁莎等，2019)。在农作物上通过基因工程把害虫的特定miRNA转入到农作物内，结果发现害虫表现出脱皮过程不正常而致死，可见转特定miRNA在未来有可能成转基因作物的一种新选择(鲁莎等，2019)。但是，目前还未见有可抑制小菜蛾PAP1基因表达，抑制小菜蛾PPO激活的miRNAs的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一类抑制小菜蛾PPO激活的miRNAs。

本发明的第二个目的在于提供一种提高上述miRNAs表达的miRNA模拟物。

本发明的第三个目的在于抑制所述miRNAs表达的miRNA抑制剂。

本发明的第四个目的在于提供所述miRNAs和miRNA模拟物的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一类抑制小菜蛾PPO激活的miRNAs，包含如下所述miRNAs中的中的一种或多种：miR-210-5p_3，miR-210-5p_5、miR-4448-y、miR-965-x、miR-3286-y、miR-8799-y、pxy-miR-279b-3p、pxy-miR-14b-5p、pxy-miR-279a-3p、pxy-miR-375-5p，其序列依次如SEQ ID NO:1～10所示。

miRNA通过控制转录后mRNA的剪切或者抑制mRNA的翻译负控调控靶基因来调控宿主的生长发育，消化吸收，免疫反应，抗病毒，激素分泌等重要的生物过程。这些miRNA具有靶基因沉默效应(silence effect)作用。本发明通过饲喂苏云金芽孢杆菌侵染小菜蛾三龄幼虫，筛选到小菜蛾中肠体内与免疫相关的上述miRNAs，所述miRNA都靶向酚氧化酶原激活蛋白酶(Prophenoloxidase activating proteinase，PAP)PAP1基因，所述PAP1基因核苷酸序列如SEQ ID NO：41所示。

本发发明还提供一种提高上述miRNAs表达的miRNA模拟物(miRNA mimics)，miRNAmimics是模拟生物体内源的miRNAs，运用化学合成的方法合成，能增强内源性miRNA的功能。

优选地，所述miR-210-5p_3，miR-210-5p_5、miR-4448-y、miR-965-x、miR-3286-y、miR-8799-y、pxy-miR-279b-3p、pxy-miR-14b-5p、pxy-miR-279a-3p和pxy-miR-375-5p的miRNA模拟物的正义链和反义链依次如SEQ ID NO:11～30所示。

本发明还提供一种抑制上述miRNAs表达的miRNA抑制剂(miRNA inhibitor)，miRNA inhibitor是化学修饰的专门针对细胞中特异的靶miRNA的抑制剂；所述miR-210-5p_3，miR-210-5p_5、miR-4448-y、miR-965-x、miR-3286-y、miR-8799-y、pxy-miR-279b-3p、pxy-miR-14b-5p、pxy-miR-279a-3p和pxy-miR-375-5p的miRNA抑制剂序列如SEQ ID NO:31～40所示。

本发明进一步利用上述10个miRNAs模拟物和抑制物来验证miRNA与PAP1的靶向关系及在细胞水平如何调控PAP1的表达。通过将上述10个miRNA的抑制物和模拟物分别饲喂小菜蛾，24h后取出血淋巴测定其PO活力。并将不同的miRNA的模拟物添食小菜蛾后，分别感染不同的微生物杀虫剂，观察死亡率。结果表明，上述miRNAs可抑制酚氧化酶原激活蛋白酶PAP1的转录和表达，降低或中断害虫的酚氧化酶途径的激活，导致小菜蛾天然免疫降低或者消失，增效微生物杀虫剂的作用，提高害虫死亡率。

因此，本发明提供所述miRNAs或所述miRNA模拟物在抑制酚氧化酶原激活蛋白酶PAP1的转录和表达，降低或中断害虫的酚氧化酶途径的激活中的应用。

本发明还提供所述miRNAs或所述miRNA模拟物在防治十字花科蔬菜害虫或在制备防治十字花科蔬菜害虫药剂中的应用。

本发明还提供一种防治十字花科蔬菜害虫的方法，是将上述miRNAs的模拟物中的一种或多种施用害虫。

一种防治十字花科蔬菜害虫的药剂，包含权利求上述miRNAs的模拟物中的一种或多种。可通过上述miRNAs的模拟物降低害虫的天然免疫力，使害虫更易感染病原物，害虫死亡率提高，死亡时间缩短。

优选地，所述药剂还包含微生物杀虫剂，miRNAs的模拟物作为微生物杀虫剂的增效剂使用，提高微生物杀虫剂的使用效率和使用范围，扩大杀虫谱，降低微生物杀虫剂耐药性出现。

本发明还提供所述miRNAs在制备抗十字花科蔬菜害虫的转基因植物中的应用。通过将miRNA前体转到十字花科蔬菜后，当小菜蛾或者其他鳞翅目害虫为害转miRNA十字花科蔬菜时，导致天然免疫失活，害虫死亡率大大提高。

优选地，所述十字花科蔬菜害虫为小菜蛾。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本专利提供了一类抑制小菜蛾PPO激活的miRNAs，所述miRNA靶向并抑制了酚氧化酶原激活蛋白酶PAP1基因的表达，降低了对PPO的激活，最终抑制了PO的活力。从而使得在病原物侵染害虫的同时，害虫体内由于PO活力下降，减弱或中断害虫对外物的黑化反应，使害虫更易感染病原物，害虫死亡率提高，死亡时间缩短。而且，还能作为增效剂使用，提高了微生物杀虫剂的使用效率和使用范围，扩大了杀虫谱，降低微生物杀虫剂耐药性出现，是一种有害生物综合治理(IPM)推崇的综合生物防治方法。本发明以害虫免疫系统为靶标，研发能抑制害虫天然免疫系统、对人畜安全、环境健康的生物杀虫剂，有效提高自然界存在的病原微生物对害虫的自然控制作用，延缓微生物耐药性的出现。

附图说明

图1为miRNA与其靶标基因PAP1的位点结合示意图。

图2为苏云金芽孢杆菌处理小菜蛾后中肠组织PAP1与miRNA靶标对应关系。

图3为双荧光表达质粒的构建。注：M1：DNA标准分子量DL5000；1：PAP1全长的PCR鉴定；2：psi-CHECK2双荧光质粒的双酶切鉴定；3：psi-CHECK2-PAP1重组双荧光质粒的双酶切鉴定；M2：DNA标准分子量DL10000。

图4为双荧光素的测定。

图5为小菜蛾PO活力测定。将10条miRNA模拟物和10miRNA抑制剂添食小菜蛾24h后，分别收集血淋巴，获得各个添食后的miRNA血浆。采用DOPA法对小菜蛾血浆中PO活力进行测定，小菜蛾血浆孵育10min，每孔加入200μL2mM L-DOPA，轻轻震荡10s，使用酶标仪测定10min內，490nm波长下吸光值的变化，每30s测定一次。每min吸光值的变化0.01为1U；作图数值为平均值±SEM(n＝3)，柱上字母表示通过SPSS 25对组内数值进行LSD及Duncan差异显著性分析，显著水平p≤0.05。

图6为小菜蛾死亡率。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明是以如下技术方案实现的：构建小菜蛾miRNA文库，利用现代生物信息学软件预测miRNA与靶基因的结合位点，构建双荧光系统，通过测定了荧光强度来反映miRNA与靶基因的结合情况，进一步活体实验，证明了饲喂miRNA抑制物和模拟物后，小菜蛾体内PO变化。发现miRNA模拟物对微生物杀虫剂有增效作用。

实施列1小菜蛾免疫苏云金芽孢杆菌的差异miRNA筛选

用苏云金芽孢杆菌(Bt HD-73)侵染小菜蛾三龄幼虫12h，24h和36h解剖取其中肠样品，未处理的同一批小菜蛾于12h，24h，36h后的小菜蛾解剖取其中肠样品作为对照样品。送华大基因(武汉)利用BGISEQ-500测序技术进行测序。通过生物信息学分析miRNA序列，将高质量序列匹配小菜蛾基因组(GCA_000330985.1)，并将分析得到的序列进行分类注释，以获得样品中包含的各组分及表达量信息。剩余的小分子RNA序列与miRNA数据库(miRBase21)所有动物的miRNA序列进行比对，得到样品中已知miRNA的含量、首位点碱基分布及表达丰度等信息。对于符合差异在两倍及以上且Q-value值小于等于0.001的miRNA认为是显著差异表达miRNA。筛选出1000个差异miRNA。

实施例2小菜蛾miRNA靶基因预测和验证

为了更好地了解这些差异表达miRNA的功能，使用RNAhybrid、miRanda和TargetScan三种软件建立预测靶基因的标准，在小菜蛾基因组中对miRNA的靶基因进行了预测，筛选到我们天然免疫相关的靶基因。进一步匹配到我们感兴趣的免疫靶基因。表1列出了10条miRNA都靶向PAP1基因，对10条miRNA具体序列、长度和在靶基因上的位置预测。

表1小菜蛾靶标基因PAP1家族及其对应的miRNA

图1显示了10条miRNA在PAP1上的结合部位。运用RT-qPCR技术检测miRNA与靶基因PAP1在苏云金芽孢杆菌侵染后小菜蛾的时间表达模式。结果如图2所示。苏云金芽孢杆菌(Bt HD-73)侵染小菜蛾三龄幼虫后，靶标基因PAP1与10条miRNA都存在负调控关系，只是不同miRNA在时间上如12h，36h，48h，72h有不同程度表达的时效性。从图2中可以看出，靶基因PAP1与miRNA在48h存在比较强的负调控关系。

实施例3真核细胞双荧光表达质粒的构建

根据表1所述序列，以小菜蛾cDNA为模板进行PCR克隆，序列包含10条miRNA预测靶位点结合序列。上游引物序列为5’CHECK2PAP1：

5’-CCCTCGAGTCGCATTTATCGCCTCAA-3’，(下划线表示设计的XhoI酶切位点)；下游引物序列3’CHECK2PAP1：

5’ATTTGCGGCCGCGAGATAACTGCGGGCTGA-3’(下划线表示设计的Not I酶切位点)。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳分离并回收纯化，回收得到的PCR产物与psiCHECK-2空载体用XhoI和Not I同时进行双酶切，酶切产物连接到psiCHECK-2Vector并将连接产物转化到感受态细胞DH5α中，抽提质粒XhoI/Not I双酶切鉴定，结果如图3，双酶切鉴定正确，进一步送测序。将测序正确的菌株以甘油菌的形式保存。

实施例4双荧光素酶活性的测定

10条miRNA模拟物mimic的合成，具体见表2；

表2小菜蛾靶标miRNAs的模拟物和抑制物

将实施例3所制备的重组菌株抽提质粒DNA后，备用。将小菜蛾10条miRNAs，miR-210-5p_3，miR-210-5p_5，miR-4448-y，miR-965-x，miR-3286-y，miR-8799-y，pxy-miR-279b-3p，pxy-miR-14b-5p，pxy-miR-279a-3p，pxy-miR-375-5p，合成各自的模拟物mimic，具体序列见表2。将重组质粒piCHECK-PAP1和不同miRNA的mimic，以及piCHECK-2质粒分别转染HEK293T细胞。转染前1天将HEK293T细胞按5×10⁵的密度接种于48孔板，含10％胎牛血清培养基，置于5％CO₂培养箱37℃过夜培养；转染24h后，加入PBS洗涤细胞，尽可能的弃净各孔内的残留液体。用双荧光素酶报告系统试剂盒检测各组荧光素酶活性。通过Dual-Luciferase报告基因检测系统测定各实验组中萤火虫荧光素酶的荧光值(FLuc)和海肾荧光素酶的荧光值(RLuc)，取F/R为相对活性值进行数据的统计，结果如图4所示。由图4可以看出，10条miR-210-5p_3，miR-210-5p_5，miR-4448-y，miR-965-x，miR-3286-y，miR-8799-y，pxy-miR-279b-3p，pxy-miR-14b-5p，pxy-miR-279a-3p，pxy-miR-375-5p都能负调控靶基因PAP1的表达，都达到差异显著水平(p<0.05)，其中miR-3286-y，miR-8799-y模拟物对靶基因的抑制效果最好。

实施例5小菜蛾活体验证miRNA抑制剂和模拟物的功能

挑取发育历期一致健康的3龄的小菜蛾幼虫，将人工饲料/g与不同miRNA抑制物inhibitor或miRNA模拟物mimic混合。其中两者之间比列为1:500μL(1μM)饲喂小菜蛾，12h更换一次饲料，用DEPC为对照。饲喂48h后收集对照组与处理组miRNA inhibitor和miRNAmimic的小菜蛾，取出血淋巴和解剖中肠，利用qRT-PCR检测miRNA及其靶基因PAP1的转录水平。进一步利用DOPA法测定血浆中PO的活力，结果如图5。由图5可知，小菜蛾饲喂不同miRNA的模拟物mimic后，PAP1的表达被强烈抑制，PO活力下降，所有miRNA的模拟物都可以引起PO的活力下调。说明PAP1激活被抑制后，导致PPO信号途径被中断，PO活力激活被降低。相反地，当小菜蛾饲喂了不同miRNA的抑制剂inhibitor后。由图5可知，所有miRNA的抑制剂都可以激活PO的活力，说明miRNA被抑制后，PAP1表达升高，导致PPO信号途径被强烈激活，PO活力显著增加。

实施例6小菜蛾miRNA模拟物对微生物杀虫剂的增效作用

三种不同病原物的培养成对数生长期，收集菌体，PBS洗涤3次，用PBS悬浮菌体，原始摇菌体积与重悬体积为1：10，将制备好的菌体，保存备用。为了进一步了解小菜蛾miRNA是否对杀虫剂有增效作用。选取发育历期一致的健康小菜蛾3龄第一天幼虫。将人工饲料/g与不同miRNA模拟物mimic/inhibitor混合。其中两者之间比列为1:500μL(1μM)饲喂小菜蛾，12h更换一次饲料。将miRNA mimic、inhibitor饲喂小菜蛾24h后，进一步饲喂不同的病原物84h，按照4g饲料加1mL菌体的比例拌饲料，每组处理100头小菜蛾，饲喂PBS作为阴性对照，以健康的小菜蛾为空白对照。每隔12h观察一次，一致到84h，统计累积死亡率，结果如图6所示。由图6可知，miRNA模拟物可以提高死亡率，而miRNA抑制剂可以提高存活率，对三种微生物都可以提高死亡率。说明miRNA模拟物可以增效杀虫剂的杀虫效率。

本发明筛选到了一类抑制小菜蛾PPO激活的miRNAs，并验证了miRNA与靶基因PAP1的调控关系和结合位点序列，发现miRNA对于生物杀虫剂有增效作用。利用miRNA开发出新的杀虫剂并应用具有重要意义。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一类抑制小菜蛾PPO激活的miRNAs及其应用

<141> 2020-06-30

<160> 41

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 1

ucuugugcag uggccagcag cu 22

<210> 2

<211> 23

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 2

aucuugugca guggccagca gcu 23

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 3

auggggaucu gguugcucgg ua 22

<210> 4

<211> 24

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 4

guaugucgcu auauugaaga ggga 24

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 5

uugauaaucu ugugcguguu c 21

<210> 6

<211> 18

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 6

ccgauccucg cgcuacgg 18

<210> 7

<211> 22

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 7

uccuacucac uuuuagauca gu 22

<210> 8

<211> 23

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 8

ucaguucagu uagagagggg ggc 23

<210> 9

<211> 22

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 9

accuacucac accuagauca gu 22

<210> 10

<211> 23

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 10

aucaaacgag uuuggcgagc cca 23

<210> 11

<211> 23

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 11

agcugcuggc cacugcacaa gau 23

<210> 12

<211> 23

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 12

cuugugcagu ggccagcagc uuu 23

<210> 13

<211> 22

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 13

agcugcuggc cacugcacaa ga 22

<210> 14

<211> 23

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 14

cuugugcagu ggccagcagc uuu 23

<210> 15

<211> 22

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 15

auggcucguu ggucuagggg ua 22

<210> 16

<211> 22

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 16

ccccuagacc aacgagccau uu 22

<210> 17

<211> 24

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 17

guaugucgcu auauugaaga ggga 24

<210> 18

<211> 24

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 18

ccucuucaau auagcgacau acuu 24

<210> 19

<211> 21

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 19

cuugugcgug uucuaauagu u 21

<210> 20

<211> 21

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 20

cuauuagaac acgcacaagu u 21

<210> 21

<211> 18

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 21

ggcaucgcgc uccuagcc 18

<210> 22

<211> 20

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 22

ggcuaggagc gcgaugccuu 20

<210> 23

<211> 22

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 23

ugacuagauu uucacucauc cu 22

<210> 24

<211> 22

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 24

gaugagugaa aaucuaguca uu 22

<210> 25

<211> 24

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 25

cggggggaga gauugacuug acuu 24

<210> 26

<211> 22

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 26

caagucaauc ucuccccccg uu 22

<210> 27

<211> 22

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 27

ugacuagauc cacacucauc ca 22

<210> 28

<211> 22

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 28

gaugagugug gaucuaguca uu 22

<210> 29

<211> 23

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 29

acccgagcgg uuugagcaaa cua 23

<210> 30

<211> 23

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 30

guuugcucaa accgcucggg uuu 23

<210> 31

<211> 23

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 31

aucuugugca guggccagca gcu 23

<210> 32

<211> 22

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 32

ucuugugcag uggccagcag cu 22

<210> 33

<211> 22

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 33

uaccccuaga ccaacgagcc au 22

<210> 34

<211> 24

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 34

ucccucuuca auauagcgac auac 24

<210> 35

<211> 21

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 35

aacuauuaga acacgcacaa g 21

<210> 36

<211> 18

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 36

ggcuaggagc gcgaugcc 18

<210> 37

<211> 22

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 37

aggaugagug aaaaucuagu ca 22

<210> 38

<211> 23

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 38

agucaaguca aucucucccc ccg 23

<210> 39

<211> 22

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 39

uggaugagug uggaucuagu ca 22

<210> 40

<211> 23

<212> RNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 40

uaguuugcuc aaaccgcucg ggu 23

<210> 41

<211> 1558

<212> DNA

<213> 小菜蛾(Plutella xylostella)

<400> 41

gaaatcagta tatgtgaggc gatggtcaga tatcatcgca tttatcacct caagaataaa 60

aatagatata cctatgctta gtgtacataa cacataagag caatacaaca gtttagtgaa 120

taaatgttat agtcaaaagc attttttgtg ttgtgcaaaa tgttgctaat tggagctgtg 180

ttcttgtcac tatggatgag tataaatgcc cagtcctgcg tcaccccgct cggtgcatcg 240

agccagtgcg tgtcactcta cgactgttca gctctgttgc aagcgtttga acagcgcccc 300

ctaccgtcgc acgtggtcac cttcctgagg aagtctcagt gcgggttcga gggatacgtg 360

ccgagggtct gctgcggccc actgcctcag cagcaggctg gtagacctac tcaggctcca 420

cccactgcca gaccaacatc tcaaagcaga cctcagagcg gtcgcgagcc agcagctcca 480

gaagacagca gaccagagtc ggaaggaaaa tgtggagtgg acaccaacgg agacagaatc 540

tatggaggac agttcactga cctcgacgag ttcccgtgga tggctctgct gggataccgc 600

acacgaagcg gtgatatgac gtaccagtgc gggggagtgc tgatcaaccg gcgctacgtg 660

ctgacggctg cgcactgcgt caccggcgcc atcgagacac aagtcggcac cctagccacg 720

gttcgcctcg gagagtacga cacacagacc cccatagact gcatggagaa gacctgtgcg 780

gatcctcctc aagagatagc agtggaccgg ggaatccccc accccggctt cgcagatggc 840

aacaagaatc gacaggatga catcgctcta gtcagaatgg cacagcgggc cgcttacaat 900

tactacatcc agccgatctg cctggtgggc aacaacgcga ggattgacgt cggagtggac 960

gtgttcgtcg ctggctgggg aaaaaccctt aacggacgtt caagtccagt gaaaaccaag 1020

ctcggtctcc ccatcttcag caagagtgac tgcttccaaa agtacaagaa attgggagca 1080

gccttaactg acaagcaact ttgcgctgga ggcgtgttcg cccaagacgc ctgtagggga 1140

gactctggag gccccctgat gaagaggaga ccagacggag tgtgggaggc agtaggtgtg 1200

gtgtctttcg gcaatggatg cggcaacgat ggctggcctg gagtctacac aaacgtggcc 1260

tcctacaaag actggattca atccatgctg agatcgacga acgtgtgagg gataatggat 1320

gtttcgttta ggaatgtttt gactgctgca tctagatctg attgtaagga cttgtaaagt 1380

tgtgattaaa cttttgtaag cgggtgctgt tggagtttaa gattgagatt tgttctatta 1440

taaaaatgga taaaatgctt aggaataaac aatttttgaa agctaagtaa taatgtgtgt 1500

atgagaggaa agaataaaag taatgcatat agtgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1558

Claims (7)

1.一种抑制小菜蛾PPO激活的miRNA，其特征在于，所述miRNA为miR-8799-y，其序列为5’-GGCAUCGCGCUCCUAGCC-3’。

2.一种提高权利要求1所述miRNA表达的miRNA模拟物，其特征在于，所述miRNA模拟物的正义链和反义链依次如SEQ ID NO:21～22所示。

3.一种抑制权利要求1所述miRNA表达的miRNA抑制剂，其特征在于，所述miRNA抑制剂的序列如SEQ ID NO:36所示。

4.权利要求1所述miRNA或权利要求2所述miRNA模拟物在抑制小菜蛾的酚氧化酶原激活蛋白酶PAP1的转录和表达，降低或中断小菜蛾的酚氧化酶途径的激活中的应用。

5.权利要求1所述miRNA或权利要求2所述miRNA模拟物在防治小菜蛾或在制备防治小菜蛾的药剂中的应用。

6.一种防治小菜蛾的方法，其特征在于，将权利要求2所述miRNA模拟物施用于小菜蛾。

7.一种防治小菜蛾的药剂，其特征在于，包含权利要求2所述miRNA模拟物。

Images