CN104357447A - 使用RNAi控制有害生物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及使用双链RNA分子来控制有害生物侵袭的方法。本发明提供了产生表达所述双链RNA分子的转基因细胞的方法，以及含有此类分子或经此类分子处理过的组合物和商品产品。

Description

使用RNAi控制有害生物的方法

本申请为2006年9月18日提交的、发明名称为“使用RNAi控制有害生物的方法”的PCT申请PCT/IB2006/004008的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2008年5月16日，申请号为200680042927.5。

发明领域

一般而言，本发明涉及对有害生物(pest)侵袭的遗传学控制。更具体地，本发明涉及重组技术，用于阻遏或抑制有害生物中靶编码序列的表达。

导论

昆虫和其它有害生物可能通过其叮咬或刺导致损伤甚至死亡。此外，很多有害生物传播导致疾病的细菌和其它病原体。例如，蚊子传播导致疟疾、黄热病、脑炎和其它疾病的病原体。腹股沟结鼠疫或黑死病是感染大鼠和其它啮齿动物的细菌导致的。用于控制显微有害生物侵袭的组合物已经以抗生素、抗病毒和抗真菌组合物的形式提供。通常地，其被应用于有害生物驻留的表面，或者以小丸、散剂、片剂、糊剂或胶囊剂的形式施用给受侵袭的动物。。

商业作物通常是昆虫攻击的目标。过于数十年来已经做出了相当的进展，开发出了高效的方法和组合物用于控制植物中的昆虫侵袭。化学杀虫剂对于根除有害生物侵袭非常有用。然而，使用化学杀虫剂有若干种缺点。它们不仅有可能对于环境有害，而且，化学杀虫剂还不是选择性的，其对于非靶标动物群和植物群可能造成损害。化学杀虫剂持续存在于环境中，通常代谢得很慢(如果有代谢)。它们在食物链中积累，特别是高等食肉动物物种中。这些化学杀虫物质的积累导致对这些物质抗性的发展，并且它们可能在进化梯中高等的物种中，成为诱变剂和/或致癌物，导致不可逆的和有害的遗传修饰。

因为与化学杀虫剂相关的这些危险，已经开发了生物学手段来控制有害生物侵袭。例如，使用来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的Cry3A蛋白质进行生物学控制已能有效控制马铃薯甲虫幼虫，其可作为喷雾到叶上的制剂或者作为在马铃薯叶中表达的制剂来使用。备选的生物剂是双链RNA(dsRNA)。过去数年来，通过RNA干扰在多细胞生物中对基因的下调(也称“基因沉默”)已成为良好完善的技术。

RNA干扰(RNAi)提供了用于控制基因表达的潜在的强大工具，因为其能特异性靶向选择，并且以显著高的效率进行靶向mRNA遏制。RNAi指通过短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默(Zamore，P.等人，Cell 101：25-33(2000)；Fire，A.等人，Nature 391：806(1998)；Hamilton等人，Science 286，950-951(1999)；Lin等人，Nature 402：128-129(1999))。虽然RNAi的机制还没有获得完全表征，但是人们认为，细胞中dsRNA的存在通过激活核糖核酸酶III切酶来触发RNAi(Zamore，P.等人，(2000)；Hammond等人，Nature 404，293(2000))。切酶将的dsRNA加工为短片段，其被称为短干扰RNA(siRNA)，其为大约21至大约23个核苷酸长，包含约19个碱基对双链体(Zamore等人，(2000)；Elbashir等人，GenesDev.，15，188(2001))。递送进细胞后，siRNA分子与内切核酸酶复合物相关联，该复合体通常被称为RNA诱导性沉默复合物(RISC)，其将siRNA的反义链和细胞mRNA基因靶带到一起。RISC切割mRNA，然后所述mRNA释放并被降解。重要地，然后RISC能降解靶mRNA的额外拷贝。

因此，本发明提供了通过阻遏、延迟或降低特定有害生物中的基因表达来控制有害生物侵袭的方法和组合物。

发明内容

在一个方面，本发明提供了经分离的多核苷酸序列，其包含SEQ IDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481中示出的核酸序列。在一种实施方案中，从多核苷酸序列的表达产生双链核糖核苷酸序列，其中，有害生物与所述核糖核苷酸序列的接触能抑制所述有害生物的生长。在又一实施方案中，所述序列的接触抑制与所述序列充分互补的核苷酸序列的表达。在另一实施方案中，用该多核苷酸转化细胞。在还一实施方案中，所述细胞是细菌、酵母或藻类细胞。在再一实施方案中，食物产品，例如，贮藏谷类、宠物食品或粉末巧克力，包含经该多核苷酸转化的细胞。在又一实施方案中，组合物，例如喷雾剂、粉末、团块(pellet)、凝胶、胶囊、食物产品、衣物袋和图书包含该多核苷酸。在又一实施方案中，本发明提供了包含该多核苷酸的杀虫剂。在另一实施方案中，本发明提供了保护物体免受有害生物侵袭的方法，所述物体例如木材、树、图书粘合物、布和食物贮藏容器，所述方法包括用包含所述多核苷酸的组合物处理所述表面。

在另一实施方案中，本发明提供了与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481示出的核酸序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸序列。在一种实施方案中，从多核苷酸序列的表达产生双链核糖核苷酸序列，其中，有害生物与所述核糖核苷酸序列的接触能抑制所述有害生物的生长。在又一实施方案中，所述序列的接触抑制与所述序列充分互补的核苷酸序列的表达。在另一实施方案中，用该多核苷酸转化细胞。在还一实施方案中，所述细胞是细菌、酵母或藻类细胞。在再一实施方案中，食物产品，例如，贮藏谷类、宠物食品或粉末巧克力，包含经该多核苷酸转化的细胞。在又一实施方案中，组合物，例如喷雾剂、粉末、团块、凝胶、胶囊、食物产品、衣物袋和图书包含该多核苷酸。在又一实施方案中，本发明提供了包含该多核苷酸的杀虫剂。在另一实施方案中，本发明提供了保护物体免受有害生物侵袭的方法，所述物体例如木材、树、图书粘合物、布和食物贮藏容器，所述方法包括用包含所述多核苷酸的组合物处理所述表面。

在另一个方面，本发明提供了控制有害生物侵袭的方法，所述方法包括：将有害生物暴露给下述组合物，所述组合物包含能抑制有害生物生物学活性的多核苷酸序列。在一种实施方案中，所述多核苷酸序列是SEQ IDNO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481示出的任意序列。

在另一实施方案中，本发明提供了经分离的核苷酸序列、双链核糖核苷酸序列、细胞、组合物或杀虫剂用于预防或处理侵袭，例如昆虫、线虫或真菌侵袭的用途。

附图说明

图1-LD：马铃薯叶甲在用dsRNA处理过的人工食物上的存活。向第二幼虫期的昆虫喂饲用50μl局部应用的dsRNA(靶或gfp对照)溶液处理过的膳食。膳食在7天后被含有局部应用dsRNA的新鲜膳食替换。在第2、5、7、8、9和13天评定存活昆虫的数量。计算相对于第0天(检测开始时)的存活幼虫百分比。靶LD006：(SEQ ID NO：178)；靶LD007(SEQ ID NO：183)；靶LD010(SEQ ID NO：188)；靶LD011(SEQ ID NO：193)；靶LD014(SEQ ID NO：198)；gfp dsRNA(SEQ ID NO：235)。

图2-LD：马铃薯叶甲在用dsRNA处理过的人工膳食上的存活。向第二幼虫期的昆虫喂饲用50μl局部应用的dsRNA(靶或gfp对照)溶液处理过的膳食。膳食仅在7天后被新鲜膳食替换。在第2、5、6、7、8、9、12和14天评定存活昆虫的数量。计算相对于第0天(检测开始时)的存活幼虫百分比。靶LD001：(SEQ ID NO：163)；靶LD002(SEQ ID NO：168)；靶LD003(SEQ ID NO：173)；靶LD015(SEQ ID NO：215)；靶LD016(SEQID NO：220)；gfp dsRNA(SEQ ID NO：235)。

图3-LD：在用dsRNA处理过的马铃薯叶盘上的马铃薯叶甲幼虫平均重量。向第二幼虫期的昆虫喂饲用20μl局部应用的dsRNA(靶LD002或gfp对照)溶液(10ng/μl)处理过的叶盘。2天后，每天都将昆虫转移到未经处理的叶上。

图4-LD：马铃薯叶甲在用靶LD014dsRNA的较短形式和多联体dsRNA处理过的人工膳食上的存活。向第二幼虫期的昆虫喂饲经50μl局部应用的dsRNA(gfp或靶)溶液处理过的膳食。在第3、4、5、6和7天评定存活昆虫的数量。计算相对于第0天(检测开始时)的存活幼虫百分比。

图5-LD：马铃薯叶甲幼虫在用不同浓度的靶LD002(a)、靶LD007(b)、靶LD010(c)、靶LD011(d)、靶LD014(e)、靶LD015(f)、LD016(g)和靶LD027(h)的dsRNA处理过的人工膳食上的存活。向第二幼虫期的昆虫喂饲经50μl局部应用的dsRNA溶液处理过的膳食。膳食在7天后被含有局部应用dsRNA的新鲜膳食替换。以常规间隔评定存活昆虫的数量。计算相对于第0天(检测开始时)的存活幼虫百分比。

图6-LD：表达dsRNA靶LD010的大肠杆菌(E.coli)菌株对马铃薯甲虫——马铃薯叶甲幼虫存活随时间的影响。在单独的基于人工膳食的生物测定中，对两种细菌菌株进行了测试：(a)AB309-105；针对pGBNJ003和pGN29的数据点代表了来自5个不同细菌克隆的平均死亡率的值，(b)BL21(DE3)；针对pGBNJ003和pGN29的数据点代表了分别来自5个不同和1个单细菌克隆的平均死亡率的值。误差条代表标准差。

图7-LD：侵袭后12天，大肠杆菌菌株的不同克隆(a)AB309-105和(b)表达dsRNA靶LD010的BL21(DE3)对马铃薯甲虫——马铃薯叶甲幼虫存活的影响。数据点是针对pGN29和pGBNJ003而言每个克隆的平均死亡率的值。携带有质粒pGBNJ003的AB309-105的克隆1在该时间点显示出针对CPB的100％死亡率。误差条代表标准差。

图8-LD：侵袭后7天，大肠杆菌菌株的不同克隆(a)AB309-105和(b)表达dsRNA靶LD010的BL21(DE3)对马铃薯甲虫——马铃薯叶甲幼虫存活者的生长和发育的影响。数据点是基于表10的数据针对每个克隆(对于pGN29而言1个克隆，对于pGBNJ003而言5个克隆)的％平均幼虫重量值。仅给予膳食的处理代表100％正常的幼虫重量。

图9-LD：在侵袭后7天用产生双链RNA的细菌喷雾过的马铃薯植物上，马铃薯甲虫——马铃薯叶甲幼虫的存活。对幼虫存活者的数量加以计数，表示为％死亡率的形式。所用的细菌宿主菌株是RNaseIII-缺陷型菌株AB309-105。昆虫基因靶是LD010。

图10-LD：在侵袭后11天用产生dsRNA的细菌喷雾的马铃薯植物上喂饲的马铃薯甲虫——马铃薯叶甲幼虫存活者的生长/发育延迟。所用的细菌宿主菌株是RNaseIII-缺陷型菌株AB309-105。数据图表示为正常幼虫重量的百分比；仅给予膳食的处理被视为正常幼虫重量的100％。昆虫基因靶是LD010。误差条代表标准差。

图11-LD：在侵袭后7天通过产生双链RNA的细菌导致的、对马铃薯甲虫——马铃薯叶甲幼虫引起的马铃薯损伤的抗性。左边是用7个单位的含pGN29质粒的细菌AB309-105喷雾的植物；右边是用7个单位的含pGBNJ003质粒的细菌AB309-105喷雾的植物。一个单位被定义为在600nm处OD值为1的1ml细菌悬浮液的等同物。昆虫基因靶是LD010。

图12-LD：在用dsRNA处理过的马铃薯叶盘上马铃薯叶甲成虫的存活。最初两天用双链RNA处理过的叶盘来喂饲年轻的昆虫成虫，之后将它们放在未经处理的马铃薯叶子上。常规评定存活昆虫的数量；活着并且看起来正常移动的昆虫被记为可移动的昆虫；活着但是看起来病态并且移动缓慢的昆虫被记为濒死的昆虫——这些昆虫一旦被背朝下放置无法自己翻过身来。靶LD002(SEQ ID NO：168)；靶LD010(SEQ ID NO：188)；靶LD014(SEQ ID NO：198)；靶LD016(SEQ ID NO：220)；gfp dsRNA(SEQ IDNO：235)。

图13-LD：产生靶双链RNA的细菌对马铃薯叶甲幼虫的影响。将50μlOD为1的经热处理细菌(表达dsRNA(SEQ ID NO：188))的悬浮液局部应用到48孔板每个孔中的固体人工膳食上。将L2期的CPB幼虫放置于每个孔中。在第7天，对于含有下述物质的板中的CPB幼虫取图，其中含有(a)含有表达靶10双链RNA的细菌的膳食，(b)具有携带有空载体pGN29的细菌的膳食以及(c)仅膳食。

图14-LD：在昆虫侵袭之前，局部应用到马铃薯叶上的不同量的灭活大肠杆菌AB309-105菌株(携带质粒pGBNJ003)对于CPB幼虫存活和生长的影响。向10只L1幼虫喂饲经处理的马铃薯，喂饲7天。喷雾到植物上的细菌悬浮液的量为：0.25U、0.08U、0.025U、0.008U的靶10以及0.25U的pGN29(阴性对照，还包括Milli-Q水)。一个单位(U)被定义为：与在600nm光密度值为1的1ml培养物中存在的细菌等同的量。喷雾到每株植物上的总体积为1.6ml。昆虫基因靶是LD010。

图15-LD：侵袭后7天，携带质粒pGBNJ003的灭活大肠杆菌AB309-105菌株导致的CPB幼虫对马铃薯损伤的抗性。(a)水，(b)0.25U携带pGN29的大肠杆菌AB309-105，(c)0.025U携带pGBNJ003的大肠杆菌AB309-105，(d)0.008U携带pGBNJ003的大肠杆菌AB309-105。一个单位(U)被定义为：与在600nm光密度值为1的1ml培养物中存在的细菌等同的量。喷雾到每株植物上的总体积为1.6ml。昆虫基因靶是LD010。

图1-PC：摄入的靶dsRNA对辣根猿叶甲幼虫存活和生长的影响。向新生(neonate)幼虫喂饲用25μl局部应用的0.1μg/μl dsRNA(靶或gfp对照)溶液处理过油菜叶盘。2天后，将昆虫转移到新鲜的用dsRNA处理过的叶盘上。第4天，针对每种处理收集来自一份重复的幼虫，将其放进含有新鲜的未经处理的油菜叶子的Petri培养皿中。在第2、4、7、9和11天，对昆虫加以评定。(a)墨西哥豆瓢虫幼虫在用dsRNA处理过的油菜叶盘上的存活。计算相对于第0天(检测开始时)的存活幼虫百分比。(b)在用dsRNA处理过的油菜叶盘上辣根猿叶甲幼虫的平均重量。将来自每份重复实验的昆虫一起称重，确定每只幼虫的平均重量。误差条代表标准差。靶1：SEQID NO：473；靶3：SEQ ID NO：478；靶5：SEQ ID NO：483；靶10：SEQID NO：488；靶14：SEQ ID NO：493；靶16：SEQ ID NO：498；靶27：SEQID NO：503；gfp dsRNA：SEQ ID NO：235。

图2-PC：在用不同浓度的(a)靶PC010和(b)靶PC027的dsRNA处理过的油菜叶盘上辣根猿叶甲的存活。将新生幼虫放到用25μl局部应用的dsRNA溶液处理过的叶盘上。在第2天将昆虫转移到新鲜的经处理叶盘上。对靶PC010而言在第4天，对靶PC027而言在第5天，将昆虫转移到未经处理的叶上。针对PC010在第2、4、7、8、9和11天，针对PC027在第2、5、8、9和12天，评定存活昆虫的数量。计算相对于第0天(检测开始时)的存活幼虫百分比。

图3-PC：表达dsRNA靶PC010的大肠杆菌菌株AB309-105对白芥叶甲虫——辣根猿叶甲幼虫存活随时间的影响。针对每种处理的数据点代表来自3份不同重复的平均死亡率的值。误差条代表标准差。靶10：SEQ ID NO：488。

图1-EV：墨西哥豆瓢虫幼虫在用dsRNa处理过的豆叶盘上的存活。向新生幼虫喂饲用25μl局部应用的1μg/μl dsRNA(靶或gfp对照)溶液处理过的豆叶盘。2天后，将昆虫转移到新鲜的用dsRNA处理过的叶盘上。第4天，收集来自一种处理的幼虫，将其放进含有新鲜的未经处理的豆叶的塑料盒中。在第2、4、6、8和10天，对昆虫的死亡率加以评定。计算相对于第0天(检测开始时)的存活幼虫百分比。靶5：SEQ ID NO：576；靶10：SEQ ID NO：586；靶15：SEQ ID NO：591；靶16：SEQ ID NO：596；gfp dsRNA：SEQ ID NO：235。

图2-EV：摄入的靶dsRNA对于墨西哥豆瓢虫成虫存活以及对食荚菜豆叶的昆虫损伤的抗性的影响。(a)墨西哥豆瓢虫成虫在用dsRNA处理过的豆叶上的存活。向成虫喂饲用75μl局部应用的0.1μg/μl dsRNA(靶或gfp对照)溶液处理过的豆叶盘。24小时后，将昆虫转移到新鲜的用dsRNA处理过的叶盘上。再24小时后，收集来自一种处理的成虫，将其放进含有盆栽的新鲜未经处理整株豆植株的塑料盒里。在第4、5、6、7、8和11天评定昆虫的死亡率。计算相对于第0天(检测开始时)的存活成虫百分比。靶10：SEQ ID NO：586；靶15：SEQ ID NO：591；靶16：SEQ ID NO：596；gfp dsRNA：SEQ ID NO：235。(b)通过dsRNA导致的对墨西哥豆瓢虫成虫引起的豆叶损伤的抗性。在第9天，针对叶的损伤对含有来自一种处理(见(a))的昆虫的整株植物进行目视检查。(i)靶10；(ii)靶15；(iii)靶16；(iv)gfp dsRNA；(v)未经处理的。

图1-TC：赤拟谷盗幼虫在用靶14的dsRNA处理过的人工膳食上的存活。向新生幼虫喂饲含有1mg dsRNA靶14的基于面粉/奶混合物的膳食。对照是膳食中的水(没有dsRNA)。针对每种处理采用四份重复，每份重复为10只第一龄虫。在第6、17、31、45和60天，评定昆虫的存活(作为平均百分比值)。计算相对于第0天(检测开始时)的存活幼虫百分比。误差条代表标准差。靶TC014：SEQ ID NO：878。

图1-MP：摄入的靶27dsRNA对于桃蚜蛹的存活的影响。将第一龄虫放进喂饲室中，其中含有50μl具2μg/μl dsRNA(靶27或gfp dsRNA对照)的液体膳食。对每种处理而言，使用5个喂饲室，每个喂饲室中10只龄虫。在生物测定开始后8天评定存活者的数量。误差条代表标准差。靶MP027：SEQ ID NO：1061；gfp ds RNA：SEQ ID NO：235。

图1-NL：褐飞虱在用dsRNA处理过的液体人工膳食上的存活。在分别的生物测定中，向第一至第二幼虫期的蛹喂饲补充有2mg/ml dsRNA靶溶液的膳食：(a)NL002、NL003、NL005、NL010；(b)NL009、NL016；(c)NL014、NL018；(d)NL013、NL015、NL021。将昆虫在靶上的存活与仅用膳食以及用含有同样浓度的gfp dsRNA对照的膳食时的情况相比。膳食每两天被含有dsRNA的新鲜膳食替换。每天评定存活昆虫的数量。

图2-NL：褐飞虱在用不同浓度的靶dsRNA NL002处理的液体人工膳食上的存活。向第一至第二幼虫期的蛹喂饲补充有1、0.2、0.08和0.04mg/ml(最终浓度)NL002的膳食。膳食每两天被含有dsRNA的新鲜膳食替换。每天评定存活昆虫的数量。

发明详述

本发明提供了控制有害生物侵袭的手段，这是通过将有害生物暴露给靶编码序列来实现的，所述序列能对有害生物中必要的生物学功能造成转录后阻遏或抑制。在暴露给靶序列之后，靶形成了dsRNA，所述dsRNA对应于重要的有害生物基因的部分或全部，其引起了通过RNA干扰(RNAi)对有害生物靶的下调。作为对mRNA下调的结果，dsRNA防止了靶有害生物蛋白的表达，进而导致有害生物的死亡、生长停止或不育。

本发明可用于想要抑制有害生物的生存能力、生长、发育或繁殖，或者想要减少有害生物的病原性或感染性的任何领域。实践中的应用包括但不限于，(1)保护植物免受有害生物侵袭，(2)用于人和动物的药物或兽医学用途(例如，用于控制、治疗或预防人类和动物中的有害生物侵袭)；(3)保护材料免遭有害生物导致的损伤；以及(4)保护易腐烂材料(例如，食物、种子等)免遭有害生物导致的损伤。

向有害生物施用双链核糖核酸分子或者将有害生物暴露给所述分子产生下述性质中的一种或多种：有害生物进食减少；有害生物生存能力降低；有害生物死亡；对有害生物分化和发育的抑制；有害生物的有性繁殖，肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素调节，离子调节和转运，细胞膜电位保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素感知，触角形成，翅膀形成，腿形成、发育和分化，卵形成，幼虫成熟，消化酶形成，血淋巴合成，血淋巴保持，神经传递，细胞分裂，能量代谢，呼吸，凋亡以及真核细胞细胞骨架结构的任何组分(例如，肌动蛋白和微管蛋白)能力的消失或降低。这些性质中的任何一种或任何组合能导致对有害生物侵袭的有效抑制。

本申请文件中使用的所有技术术语是通常用于生物化学、分子生物学和农学领域中的，因此，它们是本发明所属领域的技术人员所理解的。这些技术术语可在，例如MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第3版，卷1-3，编著，Sambrook和Russel，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001、CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，编著Ausubel等人，Greene Publishing Associatesand Wiley-Interscience，New York，1988(及定期更新)、SHORT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY：A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第5版，卷1-2，编著Ausubel等人，John Wiley&Sons，Inc.，2002、GENOME ANALYSIS：A LABORATORYMANUAL，卷1-2，编著Green等人，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1997中找到。

使用PCR的多种技术被描述于，例如，Innis等人，PCR PROTOCOLS：AGUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS，Academic Press，San Diego，1990和Dieffenbach和Dveksler，PCR PRIMER：A LABORATORY MANUAL，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2003中。可通过已知技术从已知序列获得PCR-引物对，所述技术例如使用用于该目的的计算机程序，例如Primer，版本0.5，1991，Whitehead Institute forBiomedical Research，Cambridge，MA。用于核酸化学合成的方法在例如Beaucage&Caruthers，Tetra.Letts.22：1859-62(1981)和Matteucci&Caruthers，J.Am.Chem.Soc.103：3185(1981)中讨论过。

限制性酶消化、磷酸化、连接和转化按照Sambrook等人，MOLECULARCLONING：A LABORATORY MANUAL，第2版(1989)，Cold Spring HarborLaboratory Press所述来进行。如无其它指明，用于细菌细胞生长和保持的所有试剂和材料都从阿尔德里克化学公司(Aldrich Chemicals)(Milwaukee，Wis.)、DIFCO实验室(DIFCO Laboratories)(Detroit，Mich.)、英杰生命科学公司(Invitrogen)(Gaithersburg，Md.)或西格玛化学公司(Sigma Chemical Company)(St.Louis，Mo.)获得。

生物学活性指蛋白质或肽的生物学行为和影响及其对有害生物的表现。例如，本发明的RNAi可防止特定mRNA的翻译，由此抑制所述mRNA编码的蛋白质的生物学活性或者有害生物的其它生物学活性。

在本说明书中，RNAi分子可抑制有害生物中的生物学活性，产生下述性质中的一种或多种：有害生物进食减少；有害生物生存能力降低；有害生物死亡；对有害生物分化和发育的抑制；有害生物的有性繁殖，肌肉形成，保幼激素形成，保幼激素调节，离子调节和转运，细胞膜电位保持，氨基酸生物合成，氨基酸降解，精子形成，信息素合成，信息素感知，触角形成，翅膀形成，腿形成、发育和分化，卵形成，幼虫成熟，消化酶形成，血淋巴合成，血淋巴保持，神经传递，细胞分裂，能量代谢，呼吸，凋亡以及真核细胞细胞骨架结构的任何组分(例如，肌动蛋白和微管蛋白)能力的消失或降低。

互补DNA(cDNA)指从成熟的mRNA模板合成的单链DNA。虽然有若干种方法，但是最通常是使用逆转录酶这种酶从成熟(经完全剪接的)mRNA来合成cDNA。该酶在mRNA的单链上进行操作，基于RNA碱基对(A、U、G、C)与其DNA互补体(T、A、C、G)的配对产生所述mRNA的互补DNA。两条核酸链的碱基中有至少85％配对时，这两条链就是充分 互补的。

想要的多核苷酸：本发明的想要的多核苷酸是遗传元件，例如启动子、增强子或终止子，或将在其基因组中包含想要的多核苷酸的经转化细胞中转录和/或翻译的基因或多核苷酸。如果想要的多核苷酸包含编码蛋白质产物的序列，编码区域可与调控元件(例如，启动子和终止子)有效地连接，所述调控元件能使得相关联的信使RNA转录本和/或想要的多核苷酸编码的蛋白质产物表达。因此，“想要的多核苷酸”可包含这样的基因：其以5′-至3′-方向有效地连接启动子、编码蛋白质的基因和终止子。或者，想要的多核苷酸可包含“正义”或“反义”方向的基因或其片段，其转录产生可能影响到宿主细胞中内源基因表达的核酸。想要的多核苷酸还可基于转录产生双链RNA产物，在此基础上起始对所述想要的多核苷酸相关联的基因的RNA干扰。本发明的想要的多核苷酸可被放置于载体中，使得左右边界序列侧翼连接于想要的多核苷酸或在其任何一侧。本发明设想将一种或多种想要的多核苷酸稳定整合进至少一种宿主细胞的基因组。想要的多核苷酸可经突变或者是其野生型序列的变体。应当理解，想要的多核苷酸的全部或部分可整合进宿主的基因组。还应当理解，术语“想要的多核苷酸”包括一种或多种此类多核苷酸。因此，本发明的载体可包含一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种想要的多核苷酸。

“暴露”包括下述任何方法，通过所述方法，使得有害生物与dsRNA相接触，其中，所述dsRNA包含经退火的互补链，其中之一具有与将被下调的有害生物靶基因核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。可通过直接摄取(例如通过进食)将有害生物暴露给dsRNA，这不需要dsRNA在有害生物中表达。或者，有害生物可与包含dsRNA的组合物接触。例如，有害生物可与用包含dsRNA的组合物处理过的表面或材料接触。dsRNA可以被原核(例如但不限于，细菌)或真核(例如但不限于，酵母)宿主细胞或宿主生物表达。

外源：在提到核酸时，“外源”表示核酸源自非宿主生物。根据本发明，外源DNA或RNA表示天然存在于病毒、哺乳动物、鱼或鸟的遗传构成中但是在待转化的宿主中并非天然存在的核酸。因此，外源核酸是这样的核酸，其编码例如经转化宿主并不天然产生的多肽。外源核酸不一定编码蛋白质产物。

基因指这样的多核苷酸序列，其包含对于多肽或前体的生产来说必要的控制和编码序列。多肽可由全长编码序列或编码序列的任何部分所编码。基因可组成连续的编码序列，或者其可包括通过合适的剪接点结合的一个或多个内含子。此外，基因可在编码或非翻译区域含有一种或多种修饰，这可能会影响到表达产物的生物学活性或化学结构、表达速率或表达控制方式。此类修饰包括但不限于：一个或多个核苷酸的突变、插入、缺失和取代。在这方面，此类经修饰的基因可被称为“天然”基因的“变体”。

遗传元件：“遗传元件”是任何重要的(discreet)核苷酸序列，其例如但不限于，启动子、基因、终止子、内含子、增强子、间隔区、5′-非翻译区域、3′-非翻译区域或重组酶识别位点。

遗传修饰：通过应用分子生物学和细胞生物学的方法，将核酸稳定引入某些生物的基因组。

“基因遏制”或“对基因表达的下调”或“对基因表达的抑制”可互换使用，其指：在来自靶基因的蛋白质产物和/或mRNA产物的水平上可测量的或可观察到的基因表达的降低，或可探测到的基因表达的完全消失。当靶基因的下调或抑制发生但对有害生物的其它基因没有明显影响的时候，对基因表达的下调或抑制是“特异性的”。

根据靶基因的性质，可通过使用分子技术，例如，RNA溶液杂交、核酸酶保护、Northern杂交、逆转录、微阵列基因表达监测、抗体结合、酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、放射性免疫测定(RIA)、其它免疫测定或荧光活化细胞分析(FACS)测量mRNA或蛋白质表达，或通过对细胞或整个有害生物进行表型分析，来验证对有害生物细胞中基因表达的下调或抑制。

在本文中使用时，裸子植物指产生种子但没有子房的种子植物。裸子植物的实例包括针叶树、苏铁、银杏和麻黄。

在本文中使用时，同源性涉及序列；如果蛋白质或核苷酸序列显示出“显著”水平的序列相似性或更优选地序列同一性，那么所述蛋白或核酸序列就可能是同源的。真正同源的序列通过来自共同祖先基因的趋异相关联。序列同源物可以是两种类型的：(i)同源物存在于不同物种中时，它们被认为是直向同源物，例如，在小鼠和人中的α-珠蛋白基因是直向同源物；(ii)旁系同源物(paralogue)是在单种物种中的同源基因，例如，小鼠中的α-珠蛋白和β-珠蛋白基因是旁系同源物。

宿主细胞指这样的微生物、原核细胞、真核细胞或作为单细胞实体培养的细胞系，其可以或已经用作为重组载体或其它多核苷酸传递的受体，包括已被转染的原始细胞的子代。由于天然的、偶然的或刻意的突变，单个细胞的子代在形态，或基因组DNA或总DNA互补的方面并不一定与原始亲本完全相同。

引入：在本文中使用时，指核酸序列插入细胞，这通过包括感染、转染、转化或转导在内的方法来实现。

本文中使用的昆虫有害生物包括但不限于：来自鳞翅目(Lepidoptera)的，例如，长翅卷蛾属物种(Acleris spp.)、褐带卷蛾属物种(Adoxophyesspp.)、透翅蛾属物种(Aegeria spp.)、地虎属物种(Agrotis spp.)、棉叶虫(Alabama argillaceae)、Amylois spp.、梨豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)、黄卷蛾属物种(Archips spp)、卷蛾属物种(Argyrotaeniaspp.)、银纹夜蛾属物种(Autographa spp.)、Busseola fusca、干果斑螟(Cadra cautella)、桃蛀果蛾(Carposina nipponensis)、禾草螟属物种(Chilo spp.)、色卷蛾属物种(Choristoneura spp.)、葡萄果蠹蛾(Clysiaambiguella)、纵卷叶野螟属物种(Cnaphalocrocis spp.)、云卷蛾属物种(Cnephasia spp.)、Cochylis spp.、鞘蛾属物种(Coleophora spp.)、大菜螟(Crocidolomia binotalis)、苹果异形小卷蛾(Cryptophlebia leucotreta)、小卷蛾属物种(Cydia spp.)、杆草螟属物种(Diatraea spp.)、苏丹棉铃虫(Diparopsis castanea)、金刚钻属物种(Earias spp.)、粉斑螟属物种(Ephestia spp.)、花小卷蛾属物种(Eucosma spp.)、女贞细卷蛾(Eupoecilia ambiguell)、黄毒蛾属物种(Euproctis spp.)、切夜蛾属物种(Euxoa spp.)、小食心虫属物种(Grapholita spp.)、Hedya nubiferana、实夜蛾属物种(Heliothis spp.)、菜心野螟(Hellula undalis)、美国白蛾(Hyphantria cunea)、番茄蠹蛾(Keiferia lycopersicella)、旋纹潜蛾(Leucoptera scitella)、柯扁蚜属物种(Lithocollethis spp.)、葡萄花翅小卷蛾(Lobesia botrana)、毒蛾属物种(Lymantria spp.)、潜蛾属物种(Lyonetia spp.)、天幕毛虫属物种(Malacosoma spp.)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、烟草天蛾(Manduca sexta)、秋尺蛾属物种(Operophtera spp.)、玉米螟(Ostrinia Nubilalis)、超小卷蛾属物种(Pammene spp.)、褐卷蛾属物种(Pandemis spp.)、小眼夜蛾(Panolisflammea)、红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella)、马铃薯麦蛾(Phthorimaea operculella)、菜粉蝶(Pieris rapae)、粉蝶属物种(Pierisspp.)、菜蛾(Plutella xylostella)、Prays spp.、白禾螟属物种(Scirpophagaspp.)、蛀茎野蛾属物种(Sesamia spp.)、长须卷蛾属物种(Sparganothisspp.)、灰翅夜蛾属物种(Spodoptera spp.)、Synanthedon spp.、异舟蛾属物种(Thaumetopoea spp.)、卷蛾属物种(Tortrix spp.)、粉斑夜蛾(Trichoplusia ni)和巢蛾属物种(Yponomeuta spp.)；

来自鞘翅目(Coleoptera)的，例如，叩头虫属物种(Agriotes spp.)、花象属物种(Anthonomus spp.)、甜菜隐食甲(Atomaria linearis)、甜菜胫跳甲(Chaetocnema tibialis)、根颈象甲属物种(Cosmopolites spp.)、象虫属物种(Curculio spp.)、皮蠹属物种(Dermestes spp.)、食植瓢虫属物种(Epilachna spp.)、Eremnus spp.、马铃薯叶甲(Leptinotarsadecemlineata)、稻水象属物种(Lissorhoptrus spp.)、鳃金龟属物种(Melolontha spp.)、Orycaephilus spp.、耳喙象属物种(Otiorhynchusspp.)、Phlyctinus spp.、弧丽金龟属物种(Popillia spp.)、十节跳甲属物种(Psylliodes spp.)、蛀长蠹属物种(Rhizopertha spp.)、金龟甲科(Scarabeidae)、米象属物种(Sitophilus spp.)、Sitotroga spp.、粉虫属物种(Tenebrio spp.)、拟谷盗属物种(Tribolium spp.)和斑皮蠹属物种(Trogoderma spp.)；

来自直翅目(Orthoptera)的，例如蠊属物种(Blatta spp.)、小蠊属物种(Blattella spp.)、蝼蛄属物种(Gryllotalpa spp.)、马德拉蜚蠊(Leucophaea maderae)、飞蝗属物种(Locusta spp.)、大蠊属物种(Periplaneta ssp.)和沙漠蝗属物种(Schistocerca spp.)；

来自等翅目(Isoptera)的，例如散白蚁属物种(Reticulitemes ssp)；

来自啮虫目(Psocoptera)的，例如虱啮属物种(Liposcelis spp.)；

来自虱目(Anoplura)的，例如血虱属物种(Haematopinus spp.)、毛虱属物种(Linognathus spp.)、虱属物种(Pediculus spp.)、瘿绵蚜属物种(Pemphigus spp.)和倭蚜属物种(Phylloxera spp.)；

来自食毛目(Mallophaga)的，例如Damalinea spp.和啮毛虱属物种(Trichodectes spp.)；

来自缨翅目(Thysanoptera)的，例如花蓟马属物种(Franklinella spp.)、篱蓟马属物种(Hercinothrips spp.)、带蓟马属物种(Taeniothrips spp.)、节瓜蓟马(Thrips palmi)、烟蓟马(Thrips tabaci)和南非黄硬蓟马(Scirtothrips aurantii)；

来自异翅目(Heteroptera)的，例如，臭虫属物种(Cimex spp.)、狄盲蝽(Distantiella theobroma)、棉红蝽属物种(Dysdercus spp.)、Euchistusspp.、扁盾蝽属物种(Eurygaster spp.)、稻缘蝽属物种(Leptocorisa spp.)、绿蝽属物种(Nezara spp.)、皮蝽属物种(Piesma spp.)、红猎蝽属物种(Rhodnius spp.)、可可褐盲蝽(Sahlbergella singularis)、黑蝽属物种(Scotinophara spp.)、锥猎蝽属物种(Triatoma spp.)、盲蝽科物种(Miridae family spp.)，例如豆荚草盲蝽(Lygus hesperus)和美洲牧草盲蝽(Lygus lineoloris)、长蝽科物种(Lygaeidae family spp.)例如美洲谷杆长蝽(Blissus leucopterus)和蝽科物种(Pentatomidae family spp.)；

来自同翅目(Homoptera)的，例如，棉粉虱(Aleurothrixusfloccosus)、菜粉虱(Aleyrodes brassicae)、肾圆盾蚧属物种(Aonidiella spp.)、蚜科(Aphididae)、蚜属物种(Aphis spp.)、圆盾蚧属物种(Aspidiotus spp.)、甘薯粉虱(Bemisia tabaci)、蜡蚧属物种(Ceroplaster spp.)、Chrysomphalus aonidium、网籽草叶圆蚧(Chrysomphalus dictyospermi)、褐软蜡蚧(Coccus hesperidum)、绿小叶蝉属物种(Empoasca spp.)、Eriosoma larigerum、斑叶蝉属物种(Erythroneura spp.)、Gascardia spp.、灰飞虱属物种(Laodelphax spp.)、Lacanium corni、蛎盾蚧属物种(Lepidosaphes spp.)、Macrosiphus spp.、瘤蚜属物种(Myzus spp.)、Nehotettix spp.、褐飞虱属物种(Nilaparvata spp.)、Paratoria spp.、瘿绵蚜属物种(Pemphigus.spp)、臀纹粉蚧属物种(Planococcus spp.)、白盾蚧属物种(Pseudaulacaspis spp.)、粉蚧属物种(Pseudococcus spp.)、木虱属物种(Psylla ssp.)、Pulvinaria aethiopica、笠圆盾蚧属物种(Quadraspidiotus spp.)、缢管蚜属物种(Rhopalosiphum spp.)、珠蜡蚧属物种(Saissetia spp.)、带叶蝉属物种(Scaphoideus spp.)、二叉蚜属物种(Schizaphis spp.)、谷网蚜属物种(Sitobion spp.)、温室粉虱(Trialeurodes vaporariorum)、非洲木虱(Trioza erytreae)和矢尖蚧(Unaspis citri)；

来自膜翅目(Hymenoptera)的，例如Acromyrmex、美切叶蚁属物种(Atta spp.)、麦茎蜂属物种(Cephus spp.)、松叶蜂属物种(Diprionspp.)、松叶蜂科(Diprionidae)、Gilpinia polytoma、李实蜂属物种(Hoplocampa spp.)、毛蚁属物种(Lasius sppp.)、小家蚁(Monomoriumpharaonis)、新松叶蜂属物种(Neodiprion spp)、火蚁属物种(Solenopsisspp.)和胡蜂属物种(Vespa ssp.)；

来自双翅目(Diptera)的，例如，伊蚊属物种(Aedes spp.)、Antherigonasoccata、全北毛蚁(Bibio hortulanus)、红头丽蝇(Calliphoraerythrocephala)、蜡实蝇属物种(Ceratitis spp.)、金蝇属物种(Chrysomyiaspp.)、库蚊属物种(Culex spp.)、黄蝇属物种(Cuterebra spp.)、寡鬃实蝇属物种(Dacus spp.)、黑尾果蝇(Drosophila melanogaster)、厕蝇属物种(Fannia spp.)、胃蝇属物种(Gastrophilus spp.)、舌蝇属物种(Glossinaspp.)、牛蝇属物种(Hypoderma spp.)、Hyppobosca spp.、斑潜蝇属物种(Liriomysa spp.)、绿蝇属物种(Lucilia spp.)、黑潜蝇属物种(Melanagromyza spp.)、家蝇属物种(Musca ssp.)、狂蝇属物种(Oestrusspp.)、Orseolia spp.、欧洲麦秆蝇(Oscinella frit)、天仙子泉蝇(Pegomyiahyoscyami)、草种蝇属物种(Phorbia spp.)、苹绕实蝇(Rhagoletispomonella)、蕈蚊属物种(Sciara spp.)、廄蝇属物种(Stomoxys spp.)、虻虫属物种(Tabanus spp.)、Tannia spp.和大蚊属物种(Tipula spp.)；

来自蚤目(Siphonaptera)的，例如角叶蚤属物种(Ceratophyllus spp.)和鼠疫蚤(Xenopsylla cheopis)；以及

来自缨尾目(Thysanura)的，例如衣鱼(Lepisma saccharina)。

单子叶植物(monocotyledonous plant，英文也作monocot)是开花植物，其具有含一片子叶的胚，平行叶脉，花的各部分为3的倍数。单子叶植物的实例包括但不限于：草坪草、玉米、稻、燕麦、小麦、大麦、高粱、红门兰、鸢尾、百合、葱和棕榈。

有害生物或靶有害生物是指：昆虫、蜘蛛类、甲壳类、真菌、细菌、病毒、线虫、扁形动物、蛔虫、蛲虫、钩虫、绦虫、锥虫、血吸虫、狂蝇、跳蚤、壁虱、螨和虱等，它们是人类环境中遍布的。有害生物可摄入或接触用双链基因遏制剂转化的植物产生的一种或多种细胞、组织或产物，以及用双链基因遏制剂处理过的材料或表面。

线虫或蛔虫是最常见的动物门之一，其具有超过20,000种不同的已知物种(超过15,000种是寄生的)。它们在淡水、海洋和陆地环境中普遍存在，在这些环境中，它们在个体数量和物种数量上通常都超过其它动物，在远至南极和海沟的地方都能发现它们。此外，有大量的寄生形式，包括大多数植物和动物中的病原体。

特别感兴趣的线虫有害生物包括，例如犬钩口线虫(A.caninum)、锡兰钩口线虫(A.Ceylancium)、捻转血矛线虫(H.Contortus)、奥斯特线虫(O.Ostertagi)、漂亮新小杆线虫(C.elegans)、C.briggsae、P.pacificus、粪类圆线虫(S.Stercoralis)、鼠类圆线虫(S.Ratti)、P.trichosuri、花生根结线虫(M.Arenaria)、奇氏根结线虫(M.Chitwoodi)、北方根结线虫(M.Hapla)、南方根结线虫(M.Incognita)、爪哇根结线虫(M.Javanica)、M.paraensis、马铃薯金线虫(G.Rostochiensis)、马铃薯白线虫(G.Pallida)、大豆胞囊线虫(H.Glycines)、甜菜胞囊线虫(H.Schattii)、穿刺短体线虫(P.Penetrans)、伤残短体线虫(P.Vulnus)、香蕉穿孔线虫(R.Similis)、Z.punctata、猪蛔虫(A.Suum)、犬弓蛔虫(T.Canis)、马来丝虫(B.Malayi)、犬恶丝虫(D.Immitis)、旋盘尾丝虫(O.Volvulus)、狐毛首线虫(T.Vulpis)、旋毛线虫(T.Spiralis)、标准剑线虫(X.Index)、十二指肠钩口线虫(A.Duodenale)、人蛔虫(A.Lumbricoides)以及来自下述属的物种：滑刃线虫属(Aphelenchoides)、珍珠线虫属(Nacobbus)、茎线虫属(Ditylenchus)、长针线虫属(Longidorus)、毛刺线虫属(Trichodorus)和伞滑刃线虫属(Bursaphelenchus)。

正常细胞是指未转化表型的细胞或表现出待检测组织类型的未转化细胞形态的细胞。

有效地连接：将两个或多个分子以下述方式组合起来，所述方式使得在组合中它们可以在细胞中正确发挥功能。例如，当启动子能控制结构基因的转录时，启动子就是与结构基因有效地连接的。

直向同源物是通过来自共同祖先的垂直演化相关的基因，它们编码在不同物种中具有相同功能的蛋白质。由于它们在物种形成事件后分离，因此，直向同源物可能有所差异，但是通常具有序列和结构水平上的相似性。源自共同祖先并且编码具有相似功能的蛋白质的两个基因被称为直向同源物。对直向同源物的鉴定对于可靠预测新测序基因组中基因的功能来说是关键的。

“有害生物控制剂”或“基因遏制剂”指包含第一RNA片断和第二RNA片断的特定RNA分子，其中，第一和第二RNA片断之间的互补性导致两条片断能在体内和体外杂交，形成双链分子。通常，其优选可以包括连接和稳定第一和第二序列的第三RNA片断，从而可形成茎，其中通过第三片段将第一和第二片段的各一端连接在一起以形成环，从而整个结构形成茎环结构，甚至更紧密地杂交结构可形成茎环有结(stem-loop knotted)结构。或者，可在没有第三片断的情况下形成对称发夹，其中，没有设计的环，但是就立体理由来说，当茎足够长到能稳定自身的时候，发夹将产生其自身的环。通常，第一和第二RNA片断将处于RNA分子的长度内，是各自的充分倒置重复序列，并通过第三RNA片断连到一起。对于在被dsRNA分子的摄入所遏制的靶昆虫有害生物中从靶基因转录来的靶RNA而言，第一和第二片断总是(并非分别)对应于所述靶RNA的正义和反义序列。

有害生物控制剂还可以是经充分纯化(或分离)的核酸分子，更具体地，来自基因组DNA(gDNA)或cDNA文库的核酸分子或其核酸片段分子。或者，片段可包含具有大约15至大约250个核苷酸残基(更优选地，大约15至大约30个核苷酸残基)的更小的寡核苷酸。

杀虫剂指意欲用来防止、破坏、击退或减轻任何有害生物的任何物质或物质的混合物。杀虫剂可以是化学物质或生物剂，其用于抵抗与人类竞争食物、破坏财产、传播疾病或令人讨厌的有害生物，包括昆虫、病原体、杂草、线虫和微生物。

表型是生物的区别特性或特征，可根据本发明通过将一种或多种“想要的多核苷酸”和/或可筛选/选择标记整合进经转化生物的至少一个细胞来对其加以改变。“想要的多核苷酸”和/或标记可通过对经转化细胞或整个生物的大量遗传、分子、生物化学、生理或形态特征或属性中的任何一种加以修饰，向经转化的生物表型赋予变化。

植物和植物组织：“植物”是植物界的多种光合、真核、多细胞生物中的任何生物，其特征性地产生胚，含有叶绿体并且具有纤维素细胞壁。可根据本发明的方法，对植物的一部分，即“植物组织”加以处理，以预防植物或植物部分上的有害生物侵袭。可根据本发明，来处理很多合适的植物组织，其包括但不限于：体细胞胚、花粉、叶、茎、愈伤组织、匍匐茎、微块茎(microtubers)和枝条。因此，本发明预想对被子植物和裸子植物的处理，所述植物例如，金合欢、苜蓿、苹果、杏、朝鲜蓟、白蜡树、天门冬、鳄梨、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、桦木、山毛榉、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、卡诺拉油菜、甜瓜、胡萝卜、木薯、花椰菜、雪松、谷类、芹菜、栗、樱、大白菜、柑橘、克莱门氏小柑橘、三叶草、咖啡、谷物、棉、豇豆、黄瓜、柏木、茄子、榆、苣荬菜、桉树、茴香、无花果、冷杉、老鹳草、葡萄、葡萄柚、落花生、酸浆、橡胶铁杉、山核桃、羽衣甘蓝、猕猴桃、擘蓝、落叶松、莴苣、韭葱、柠檬、来檬、洋槐、松、铁线蕨、玉米、芒果、槭树、瓜、黍、蘑菇、白芥、坚果、橡树、燕麦、秋葵、葱、桔、观赏植物或花或树、番木瓜、棕榈、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃、花生、梨、沼泽植物、胡椒、柿树、木豆、松、凤梨、车前草、李、石榴、马铃薯、西葫芦、菊苣、萝卜、油菜、悬钩子、稻、黑麦、高粱、柳树、大豆、菠菜、云杉、南瓜、草莓、糖萝卜、甘蔗、向日葵、甘薯、甜玉米、红桔、茶、烟草、番茄、树、黑小麦、草坪草、芜青、蔓生植物、核桃、豆瓣菜、西瓜、小麦、薯蓣、红豆杉和夏南瓜。

根据本发明，“植物组织”还包括植物细胞。植物细胞包括悬浮培养物、胼胝体、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、枝条、配子体、孢子体、花粉、种子和小孢子。植物组织可以是多种成熟期的，其可生长于液体或固体培养物中，或者生长于罐、温室或田间的土壤或适当的培养基中。植物组织还可指此类植物、种子、子代、繁殖体(无论有性还是无性产生的)以及任何这些的后续传代物(descendent)(例如插条或种子)的任何克隆。

启动子意欲表示与RNA聚合酶和/或其它转录调控元件结合的核酸，优选地，DNA。和任何启动子一样，本发明的启动子将协助或控制DNA或RNA的转录，以从与所述启动子有效地连接的核酸分子产生mRNA分子。如前文所述，产生的RNA可编码蛋白质或多肽，或者编码RNA干扰或反义分子。

多核苷酸是这样的核苷酸序列，其包含基因编码序列或其片段、启动子、内含子、增强子区域、聚腺苷酸化位点、翻译起始位点、5′或3′非翻译区域、报道基因、可选择标记等。多核苷酸可包含单链或双链DNA或RNA。多核苷酸可包含经修饰的碱基或经修饰的主链。多核苷酸可以是基因组、RNA转录本(例如mRNA)或经加工的核苷酸序列(例如cDNA)。多核苷酸可包含正义或反义方向的序列。

经分离的多核苷酸是并非处于其天然状态的多核苷酸序列，例如，所述多核苷酸包含并非在自然界中发现的核苷酸序列，或者所述多核苷酸与其通常接近的核苷酸序列分开，或者所述多核苷酸与其通常不接近的核苷酸序列相邻。

重组核苷酸序列指这样的核酸分子，其含有通过诱变、限制性酶等进行的操作产生的遗传工程修饰。

RNA干扰(RNAi)指通过短干扰RNA(siRNA)介导的、对基因表达(蛋白质合成)的序列特异性或基因特异性遏制。

序列同一性：在本文中使用时，在提到两条核酸序列的上下文中，“序列同一性”或“同一性”包括指：当在特定区域上为最大程度对应而比对时两条序列中相同的残基。

在本文中使用时，序列同一性百分比表示：通过在比较窗口上比较两条最优比对的序列所确定的值，其中，为了对两条序列进行最优比对，比较窗口中多核苷酸序列的部分较之对照序列(不包含添加或缺失)而言可包含添加或缺失(即，空位)。通过下述方法来计算百分比：测定在两条序列中出现相同核酸碱基的位置数量，以产生匹配的位置，用所述匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并将结果乘以100，产生序列同一性百分比。

“序列同一性”具有本领域认可的含义，可使用公开的技术来计算。见COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY，Lesk，编著(OxfordUniversity Press，1988)、BIOCOMPUTING：INFORMATICS AND GENOMEPROJECTS，Smith，编著(Academic Press，1993)、COMPUTER ANALYSIS OFSEQUENCE DATA，部分I，Griffin&Griffin，编著，(Humana Press，1994)、SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY，Von Heinje编著，Academic Press(1987)、SEQUENCE ANALYSIS PRIMER，Gribskov&Devereux，编著.(Macmillan Stockton Press，1991)和Carillo&Lipton，SIAM J.Applied Math.48：1073(1988)。通常用来测定两条序列间同一性或相似性的方法包括但不限于GUIDE TO HUGE COMPUTERS，Bishop，编著，(Academic Press，1994)和上文Carillo&Lipton中公开的。用于测定同一性和相似性的方法被编码为计算机程序。用于测定两条序列间同一性和相似性的优选计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux等人，Nucleic Acids Research 12：387(1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人。J.Mol.Biol.215：403(1990))和FASTDB(Brutlag等人，Comp.App.Biosci.6：237(1990))。

短发夹RNA(shRNA)是这样的短单链RNA，其具有高度二级结构，使得RNA链的一部分可形成发夹环。

短干扰RNA(siRNA)指大约10至大约30个核苷酸长的双链RNA分子，其具有特异性干扰基因蛋白质表达的能力并由此得名。

靶序列指有害生物中被选来通过双链RNA技术遏制或抑制的核苷酸序列。靶序列编码有害生物中重要的特性或生物学活性。

转录终止子：通常，本发明的表达DNA构建体具有转录终止区域，其位于转录起始调控区域的反向端。可就mRNA的稳定性(以增强表达)和/或就加到基因转录产物上的聚腺苷酸化尾的添加，来选择转录终止区域。当三链终止密码子中的任何一个进入核糖体上的A位点时，刚产生的多肽的翻译就终止了。翻译终止密码子是UAA、UAG和UGA。

转化：通过其将核酸稳定插入进生物基因组的工艺。可使用本领域公知的多种方法，在天然或人工条件下进行转化。转化可能依赖于用于将核酸序列插入原核或真核宿主细胞的任何已知方法，其包括：微生物介导的转化、病毒感染、whiskers、电穿孔、显微注射、聚乙二醇处理、热激、脂质体转染和粒子轰击。

转基因生物包含至少一个其中已稳定整合了外源核酸的细胞。根据本发明的转基因生物例如是细菌或真核(例如酵母)宿主细胞或宿主生物。细菌可以选自革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌，例如但不限于埃希氏菌属物种(Escherichia spp.)(例如大肠杆菌(E.coli))、芽孢杆菌属物种(Bacillusspp.)(例如苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis))、根瘤菌属物种(Rhizobiumspp.)、乳杆菌属物种(Lactobacilllus spp.)、乳球菌属物种(Lactococcusspp.)等。酵母可以选自酵母属物种(Saccharomyces spp.)。

变体：在本文中使用时，“变体”应当被理解为表示与特定基因或蛋白质的标准或给定核苷酸或氨基酸序列有所不同的核苷酸序列。术语“同等型(isoform)”、“同种型(isotype)”和“类似物”也表示核苷酸序列的“变体”形式。“变体”还可指“经改组的基因”，例如Maxygen名下的专利中描述的。

应当理解，本发明并不限于本文描述的特定方法、方案、载体和试剂等，这些都可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而非意欲限制本发明的范围。应当注意，除非上下文明确另外指示，在本文和所附权利要求中使用时，单数形式“一个/一种”和“这个/这种”(“a”、“an”和“the”)包括复数。因此，例如，提到“一种基因/基因”时也表示一种或多种基因，并且包括本领域技术人员已知的其等同物等。

I.靶有害生物

本发明提供了控制有害生物侵袭的方法和构建体，这是通过向有害生物施用(或暴露于)靶编码序列来实现的，所述序列能对有害生物中必要的生物学功能加以转录后阻遏或抑制。在本文中使用时，术语“有害生物”指昆虫、蜘蛛类、甲壳类、真菌、细菌、病毒、线虫、扁形动物、蛔虫、蛲虫、钩虫、绦虫、锥虫、血吸虫、狂蝇、跳蚤、壁虱、螨和虱等，其是人环境中普遍存在的。有害生物可摄入或接触用双链基因遏制剂转化的生物产生的一种或多种细胞、组织或产物，以及用双链基因遏制剂处理过的表面或材料。

“有害生物抗性”性状是使得宿主对有害生物攻击(通常，造成宿主的损伤)有抗性的转基因宿主的特征。此类有害生物抗性可以是天然突变导致的，或者，更通常是赋予有害生物抗性的重组DNA的掺入导致的。为向转基因宿主给予有害生物抗性，可以例如将重组DNA转录为RNA分子，其在重组宿主的组织或液体中形成dsRNA分子。所述dsRNA分子部分地由RNA片段组成，所述RNA片段与喜好在重组宿主上进食的有害生物中DNA序列编码的相应RNA片断相同。靶有害生物中的基因表达被所述dsRNA遏制，并且对靶有害生物中基因表达的遏制导致宿主对有害生物具有抗性。

合适的有害生物包括导致对另一生物的损伤的任何生物。本发明特别包括昆虫、线虫和真菌有害生物。

在本文中使用时，昆虫可以是任何昆虫，这表示属于动物界的任何生物，更具体地，属于节肢动物门(Arthropoda)任何生物、以及属于昆虫纲(Insecta)或蛛形纲(Arachnida)的任何生物。本发明的方法可应用于所有昆虫，所述昆虫对于RNA干扰导致的基因沉默来说是易感的，并且能使得双链RNA从它们的直接环境被内在化。

在本发明的一种实施方案中，昆虫可以属于下述的目：螨目(Acari)、蜘蛛目(Araneae)、虱目(Anoplura)、鞘翅目(Coleoptera)、弹尾目(Collembola)、革翅目(Dermaptera)、网翅目(Dictyoptera)、双尾目(Diplura)、双翅目(Diptera)、纺足目(Embioptera)、蜉蝣目(Ephemeroptera)、蛩蠊目(Grylloblatodea)、半翅目(Hemiptera)、同翅目(Homoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、等翅目(Isoptera)、鳞翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、长翅目(Mecoptera)、脉翅目(Neuroptera)、蜻蜓目(Odonata)、直翅目(Orthoptera)、竹节虫目(Phasmida)、襀翅目(Plecoptera)、原尾目(Protura)、啮虫目(Psocoptera)、蚤目(Siphonaptera)、虱目(Siphunculata)、缨尾目(Thysanura)、捻翅目(Strepsiptera)、缨翅目(Thysanoptera)、毛翅目(Trichoptera)和缺翅目(Zoraptera)。

在本发明的优选但非限制性的实施方案和方法中，昆虫选自

(1)是植物有害生物的昆虫，其例如但不限于：褐飞虱属物种(Nilaparvata spp.)(例如褐飞虱(N.Lugens)(褐稻虱))；灰飞虱属物种(Laodelphax spp.)(例如灰飞虱(L.Striatellus)(灰飞虱))；黑尾叶蝉属物种(Nephotettix spp.)(例如二点黑尾叶蝉(N.Virescens)或黑尾叶蝉(N.Cincticeps)(青叶蝉)或二条黑尾叶蝉(N.nigropictus)(稻叶蝉))；白背飞虱属物种(Sogatella spp.)(例如白背飞虱(S.Furcifera)(白背飞虱))；杆长蝽属物种(Blissus spp.)(例如美洲谷杆长蝽(B.leucopterus leucopterus)(美洲谷杆长蝽))；黑蝽属物种(Scotinophoraspp.)(例如S.vermidulate(稻黑蝽))；绿蝽属物种(Acrosternum spp.)(例如拟绿蝽A.hilare(拟绿蝽))；稻弄蝶属物种(Parnara spp.)(例如直纹稻弄蝶(P.Guttata)(直纹稻弄蝶))；禾草螟属物种(Chilo spp.)(例如二化螟(C.Suppressalis)(稻二化螟(rice striped stem borer))、台湾稻螟(C.Auricilius)(金线二化螟(gold-fringed stem borer))或C.polychrysus(黑头二化螟(dark-headed stem bored)))；Chilotraea spp.(例如C.polychrysa(水稻蛀心虫(rice stalk borer)))；蛀茎夜蛾属物种(Sesamia spp.)(例如稻蛀茎夜蛾(S.Inferens)(大螟))；蛀禾螟属物种(Tryporyza spp.)(例如T.innotata(白稻三化螟(white rice borer))或三化螟(T.Incertulas)(三化螟))；纵卷叶野螟属物种(Cnaphalocrocisspp.)(例如稻纵卷叶野螟(C.Medinalis)(稻纵卷叶野螟))；潜蝇属物种(Agromyza spp.)(例如日本稻潜蝇(A.Oryzae)(日本稻潜蝇)或美洲黍潜叶蝇(A.Parvicornis)(潜叶蝇))；杆草螟属物种(Diatraea spp.)(例如小蔗螟(D.Saccharalis)(小蔗螟)或西南玉米杆草螟(D.Grandiosella)(玉米杆草螟))；螟蛉夜蛾属物种(Narnaga spp.)(例如N.aenescens(稻螟蛉))；黄夜蛾属物种(Xanthodes spp.)(例如犁纹黄夜蛾(X.Transversa)(犁纹黄夜蛾))；灰翅夜蛾属物种(Spodopteraspp.)(例如草地贪夜蛾(S.Frugiperda)(秋天行军虫)、甜菜夜蛾(S.Exigua)(甜菜夜蛾)、灰翅夜蛾(S.Littoralis)(月斑虎甲(climbingcutworm))或S.praefica(西部黄条行军虫(western yellowstripedarmyworm)))；秘夜蛾属物种(Mythimna spp.)(例如粘虫(Mythmna(Pseudaletia)seperata(行军虫))；铃夜蛾属物种(Helicoverpaspp.)(例如谷实夜蛾(H.Zea)(棉铃虫(corn earworm)))；肖叶甲属物种(Colaspis spp.)(例如C.brunnea(葡萄肖叶甲))；稻水象属物种(Lissorhoptrus spp.)(例如稻水象甲(L.Oryzophilus)(稻水象甲))；稻象属物种(Echinocnemus spp.)(例如稻象(E.Squamos)(稻象))；Diclodispa spp.(例如D.armigera(稻铁甲))；禾谷负泥虫属物种(Oulemaspp.)(例如水稻负泥虫(O.Oryzae)(叶甲)；米象属物种(Sitophilus spp.)(例如米象(S.Oryzae)(稻象虫))；瘿蚊属物种(Pachydiplosis spp.)(例如稻瘿蚊(P.Oryzae)(稻瘿蚊))；水蝇属物种(Hydrellia spp.)(例如麦叶毛眼水蝇(H.Griseola)(大麦水蝇)或日稻毛眼水蝇(H.Sasakii)(稻杆潜蝇(rice stem maggot)))；黄潜蝇属物种(Chlorops spp.)(例如稻黄潜蝇(C.Oryzae)(秆蝇))；杆野螟属物种(Ostrinia spp.)(例如玉米螟(O.Nubilalis)(欧洲玉米钻心虫))；地虎属(Agrotis spp.)(例如小地老虎(A.ipsilon)(小地老虎))；Elasmopalpus spp.(例如南美玉米苗斑螟(E.Lignosellus)(小玉米茎蛀虫(lesser cornstalk borer)))；梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)(金针虫)；圆头犀金龟属物种(Cyclocephala spp.)(例如C.borealis(北方假面金龟子(northern maskedchafer))，或C.immaculata(南方假面金龟子(southern masked chafer)))；弧丽金龟属物种(Popillia spp.)(例如日本弧丽金龟(P.Japonica)(日本弧丽金龟))；跳甲属物种(Chaetocnema spp.)(例如玉米铜色跳甲(C.Pulicaria)(玉米铜色跳甲))；龙颈象属物种(Sphenophorus spp.)(例如玉米长喙象(S.Maidis)(玉米长喙象))；缢管蚜属物种(Rhopalosiphum spp.)(例如玉米蚜(R.Maidis)(玉米蚜))；圆尾蚜属物种(Anuraphis spp.)(例如A.maidiradicis(玉米根蚜(corn rootaphid)))；黑蝗属物种(Melanoplus spp.)(例如红足黑蝗(M.Femurrubrum)(红足黑蝗)、特异黑蝗(M.Differentialis)(特异黑蝗)或迁飞黑蝗(M.Sanguinipes)(迁飞黑蝗))；种蝇属物种(Hylemya spp.)(例如灰地种蝇(H.Platura)(灰地种蝇))；呆蓟马属物种(Anaphothripsspp.)(例如黄呆蓟马(A.Obscrurus)(黄呆蓟马))；火蚁属物种(Solenopsisspp.)(例如窃蚁(S.Milesta)(盗窃蚁))；或叶螨属物种(Tetranychusspp.)(例如二点叶螨(T.Urticae)(二点叶螨)、朱砂叶螨(T.Cinnabarinus)(朱砂叶螨))；铃夜蛾属物种(Helicoverpa spp.)(例如谷实夜蛾(H.Zea)(棉铃虫(cotton bollworm))，或棉铃虫(H.Armigera)(美洲棉铃虫))；Pectinophora spp.(例如红铃麦蛾(P.Gossypiella)(棉花红铃虫))；金刚钻属物种(Earias spp.)(例如翠纹金刚钻(E.Vittella)(翠纹金刚钻))；实夜蛾属物种(Heliothis spp.)(例如烟芽夜蛾(H.Virescens)(烟青虫))；花象属物种(Anthonomus spp.)(例如墨西哥棉铃象(A.Grandis)(棉子象鼻虫))；Pseudatomoscelis spp.(例如棉伪斑腿盲蝽(P.Seriatus)(棉伪斑腿盲蝽))；结翅粉虱属物种(Trialeurodes spp.)(例如结翅粉虱(T.Abutiloneus)(结翅粉虱)、温室粉虱(T.Vaporariorum)(温室粉虱))；小粉虱属物种(Bemisia spp.)(例如银叶粉虱(B.Argentifolii)(银叶粉虱))；蚜属物种(Aphis spp.)(例如棉蚜(A.Gossypii)(棉蚜)、A.mellifera)；草盲蝽属物种(Lygus spp.)(例如美国牧草盲蝽(L.Lineolaris)(美国牧草盲蝽)或豆荚草盲蝽(L.Hesperus)(西牧草盲蝽(western tarnished plant bug)))；美洲蝽属物种(Euschistus spp.)(例如斑点美洲蝽(E.conspersus)(斑点美洲蝽))；Chlorochroa spp.(例如赛氏蝽(C.Sayi)(赛氏蝽))；绿蝽属物种(Nezaraspp.)(例如稻绿蝽(N.Viridula)(稻绿蝽))；蓟马属物种(Thrips spp.)(例如葱蓟马(T.Tabaci)(葱蓟马(onion trips)))；花蓟马属物种(FranMiniella spp.)(例如烟褐蓟马(F.Fusca)(烟褐蓟马)，或西方花蓟马(F.Occidentalis)(西方花蓟马))；马铃薯叶甲属物种(Leptinotarsaspp.)(例如马铃薯叶甲(L.Decemlineata)(马铃薯叶甲)、伪马铃薯叶甲(L.Juncta)(伪马铃薯叶甲)或L.texana(泰克斯伪马铃薯叶甲(Texanfalse potato beetle)))；合爪负泥虫属物种(Lema spp.)(例如三条负泥虫(L.Trilineata)(三条负泥虫))；跳甲属物种(Epitrix spp.)(例如马铃薯跳甲(E.Cucumeris)(马铃薯跳甲)、烟草跳甲(E.Hirtipennis)(跳甲)或块茎跳甲(E.Tuberis)(块茎跳甲))；豆芫菁属物种(Epicautaspp.)(例如北美豆芫菁(E.Vittata)(北美豆芫菁))；绿小叶蝉属物种(Empoasca spp.)(例如蚕豆小绿叶蝉(E.Fabae)(黑豆蚜))；瘤蚜属物种(Myzus spp.)(例如桃蚜(M.Persicae)(桃蚜))；薯个木虱属物种(Paratrioza spp.)(例如马铃薯木虱(P.Cockerelli)(木虱))；单叶叩甲属物种(Conoderus spp.)(例如C.falli(南方马铃薯铁线虫(sourthern potato wireworm))或叩头甲(C.Vespertinus)(烟草铁线虫(tobacco wireworm)))；Phthorimaea spp.(例如马铃薯麦蛾(P.Operculella)(马铃薯麦蛾))；长管蚜属物种(Macrosiphum spp.)(例如大戟长管蚜(M.Euphorbiae)(马铃薯蚜))；Thyanta spp.(例如T.pallidovirens(redshouldered stinkbug))；Phthorimaea spp.(例如马铃薯麦蛾(P.Operculella((马铃薯麦蛾))；铃夜蛾属物种(Helicoverpa spp.)(例如谷实夜蛾(H.Zea)(美洲柿铃虫(tomato fruitworm))；Keiferiaspp.(例如番茄蠹蛾Klycopersicella(番茄蠹蛾))；Limonius spp.(铁线虫(wireworm))；天蛾属物种(Manduca spp.)(例如烟草天蛾(M.Sexta)(烟草天蛾)，或番茄天蛾(M.Quinquemaculata)(番茄天蛾))；斑潜蝇属物种(Liriomyza spp.)(例如蔬菜斑潜蝇(L.Sativae)、三叶草斑潜蝇(L.Trifolli)或南美斑潜蝇(L.Huidobrensis)(斑潜蝇))；果蝇属物种(Drosophilla spp.)(例如黑尾果蝇(D.Melanogaster)、D.yakuba、D.pseudoobscura或D.simulans)；步甲属物种(Carabus spp.)(例如粒步甲(C.granulatus))；摇蚊属物种(Chironomus spp.)(例如C.tentanus)；栉头蚤属物种(Ctenocephalides spp.)(例如猫栉头蚤(C.Felis)(猫蚤))；非耳喙象属物种(Diaprepes spp.)(例如甘蔗根螟虫(D.Abbreviatus)(根象鼻虫))；齿小蠹属物种(Ips spp.)(例如美松齿小蠹(I.Pini)(美松齿小蠹))；拟谷盗属物种(Tribolium spp.)(例如赤拟谷盗(T.Castaneum)(赤拟谷盗))；舌蝇属物种(Glossina spp.)(例如刺舌蝇(G.Morsitans)(采采蝇))；按蚊属物种(Anopheles spp.)(例如冈比亚按蚊(A.Gambiae)(疟蚊))；铃夜蛾属物种(Helicoverpa spp.)(例如棉铃虫(H.Armigera)(非洲棉铃虫))；无网长管蚜属物种(Acyrthosiphon spp.)(例如豆无网长管蚜(A.pisum)(豌豆蚜))；蜜蜂属物种(Apis spp.)(例如意大利蜂(A.Melifera)(蜜蜂))；Homalodiscaspp.(例如玻璃叶蝉(H.coagulate)(玻璃翅叶蝉))；伊蚊属物种(Aedesspp.)(例如埃及伊蚊(Ae.Aegypti)(埃及伊蚊))；蚕蛾属物种(Bombyxspp.)(例如家蚕(B.Mori)(家蚕)、野桑蚕(B.Mandarina))；飞蝗属物种(Locusta spp.)(例如飞蝗(L.Migratoria)(飞蝗))；牛蜱属物种(Boophilus spp.)(例如微小牛蜱(B.Microplus)(具环牛蜱))；A canthoscurria spp.(例如A.gomesiana(红毛褐鸟虫(red-haired chololatebird eater)))；Diploptera spp.(例如D.Punctata(太平洋甲虫蟑螂(pacificbeetle cockroach)))；毒蝶属物种(Heliconius spp.)(例如瓦氏袖蝶(H.Erato)(红型花蝶(red passion flower butterfly))或墨尔波蝶(H.Melpomene)(邮差蝶(postman butterfly)))；象虫属物种(Curculiospp.)(例如欧洲栎象(C.glandium)(橡实象甲(acorn weevil)))；菜蛾属物种(Plutella spp.)(例如菜蛾(P.Xylostella)(菜蛾(diamontbackmoth)))；钝眼蜱属物种(Amblyomma spp.)(例如彩饰钝眼蜱(A.Variegatum)(具环牛蜱))；柞蚕属物种(Anteraea spp.)(例如半目大蚕蛾(A.Yamamai)(蚕蛾(silkmoth)))；Belgica spp.(例如南极百吉卡蚊(B.Antartica))、Bemisa spp.(例如B.Tabaci)、Bicyclus spp.、Biphillus spp.、瘤背豆象属物种(Callosobruchus spp.)、色卷蛾属物种(Choristoneura spp.)、虎甲属物种(Cicindela spp.)、库蚊属物种(Culexspp.)，库蠓属(Culicoides spp.)、桔木虱属物种(Diaphorina spp.)、非耳喙象属物种(Diaprepes spp.)、Euclidia spp.、舌蝇属物种(Glossinaspp.)、蟋蟀属物种(Gryllus spp.)、纹石蛾属物种(Hydropsyche spp.)、土吉丁属物种(Julodis spp.)、Lonomia spp.、罗蛉属物种(Lutzomyiaspp.)、Lysiphebus spp、Meladema spp、蕈甲属物种(Mycetophagusspp.)、金小蜂属物种(Nasonia spp.)、Oncometopia spp.、凤蝶属物种(Papilio spp.)、虱属物种(Pediculus spp.)、谷斑螟属物种(Plodiaspp.)、Rhynchosciara spp.、Sphaerius spp.、声蚜属物种(Toxopteraspp.)、Trichoplusa spp.、和阿蚊属物种(Armigeres spp.)(例如骚扰阿蚊(A.Subalbatus))；

(2)能侵袭或损伤人和/或动物的昆虫，例如但不限于具有穿刺吸吮型口器的那些，如半翅目和一些膜翅目和双翅目中发现的，例如，蚊、蜂、黄蜂、虱、蚤和蚂蚁，以及节肢类的成员，例如壁虱和螨，螨(Arcarina)(壁虱和螨)目、纲或科的，例如代表性的科软蜱科(Argasidae)、皮刺螨科(Dermanyssidae)、硬蜱科(Ixodidae)、瘁螨科(Psoroptidae)或疥螨科(Sarcoptidae)以及代表性的物种钝眼蜱属属物种(Amblyommaspp.)、暗眼蜱属物种(Anocentor spp.)、锐缘蜱属物种(Argas spp.)、牛蜱属物种(Boophilus spp.)、姬螯螨属物种(Cheyletiella spp.)、皮螨属物种(Chorioptes spp.)、蠕形螨属物种(Demodex spp.)、革蜱属物种(Dermacentor spp.)、皮刺螨属物种(Dermanyssus spp.)、Haemophysalisspp.、璃眼蜱属物种(Hyalomma spp.)、硬蜱属物种(Ixodes spp.)、Lynxacarus spp.、Mesostigmata spp.、耳螨属物种(Notoedres spp.)、钝缘蜱属物种(Ornithodoros spp.)、禽刺螨属物种(Ornithonyssus spp.)、耳壁虱属物种(Otobius spp.)、耳螨属物种(otodectes spp.)、肺刺螨属物种(Pneumonyssus spp.)、瘁螨属物种(Psoroptes spp.)、扇头蜱属物种(Rhipicephalus spp.)、疥螨属物种(Sarcoptes spp.)或恙螨属物种(Trombicula spp.)；虱目(Anoplura)(吸吮和叮咬虱)，例如，代表性的物种种牛羽虱属物种(Bovicola spp.)、血虱属物种(Haematopinusspp.)、毛虱属物种(Linognathus spp.)、禽虱属物种(Menopon spp.)、虱属物种(Pediculus spp.)、瘿绵蚜属物种(Pemphigus spp.)、木虱属物种(Phylloxera spp.)或盲虱属物种(Solenopotes spp.)；双翅目(蝇)，例如，代表性的物种伊蚊属物种(Aedes spp.)、按蚊属物种(Anopheles spp.)、丽蝇属物种(Calliphora spp.)、金蝇属物种(Chrysomyia spp.)、斑虻属物种(Chrysops spp.)、锥蝇属物种(Cochliomyia spp.)、库蚊属物种(Culex spp.)、库蠓属物种(Culicoides spp.)、黄蝇属物种(Cuterebraspp.)、皮蝇属物种(Dermatobia spp.)、胃蝇属物种(Gastrophilus spp.)、舌蝇属物种(Glossina spp.)、黑角蝇属物种(Haematobia spp.)、麻虻属物种(Haematopota spp.)、虱蝇属物种(Hippobosca spp.)、牛蝇属物种(Hypoderma spp.)、绿蝇属物种(Lucilia spp.)、扰角蝇物种(Lyperosiaspp.)、蜱蝇属物种(Melophagus spp.)、狂蝇属物种(Oestrus spp.)、绿蝇属(Phaenicia spp.)、白蛉属Phlebotomus spp.、玻璃蝇属Phormiaspp.、麻蝇属物种(Sarcophaga spp.)、蚋属物种(Simulium spp.)、廄蝇属物种(Stomoxys spp.)、虻虫属物种(Tabanus spp.)、Tannia spp.或大蚊属物种(Tipula spp.)；食毛目(羽虱)，例如，代表性的物种Damalinaspp.、猫羽虱属物种(Felicola spp.)、袋鼠虱属物种(Heterodoxus spp.)或啮毛虱属物种(Trichodectes spp.)；或蚤目(无翅昆虫)，例如，代表性的物种角叶蚤属物种(Ceratophyllus spp.)、spp.、蚤属物种(Pulex spp.)或客蚤属物种(Xenopsylla spp)；臭虫科(Cimicidae)(臭虫(true bugs))，例如，代表性的种臭虫属物种(Cimex spp.)、Tritominae spp.、Rhodiniusspp.或锥猎蝽属物种(Triatoma spp)；

以及

(3)导致不想看到的对基底或材料的损伤的昆虫，例如，攻击食物、种子、木材、画、塑料、布等的昆虫。

本发明的方法可应用于所有线虫，其对于RNA干扰导致的基因沉默来说是易感的，并且能使得双链RNA从它们的直接环境被内在化。

在本发明的一种实施方案中，线虫可以属于异皮科(Heteroderidae)，包括胞囊线虫属(Heterodera)和球胞囊线虫属(Globodera)。

在本发明的优选但非限制性的实施方案和方法中，昆虫选自下述组，该组包括但不限于：

(1)是植物病原性线虫的线虫，例如但不限于：根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)(例如南方根结线虫(M.Incognita)、爪哇根结线虫(M.Javanica)、禾草根结线虫(M.Graminicola)、花生根结线虫(M.Arenaria)、奇氏根结线虫(M.Chitwoodi)、北方根结线虫(M.Hapla)或M.paranaensis)；胞囊线虫属物种(Heterodera spp.)(例如水稻胞囊线虫(H.oryzae)、大豆胞囊线虫(H.Glycines)、玉米胞囊线虫(H.Zeae)或甜菜胞囊线虫(H.Schachtii))；球胞囊线虫属物种(Globodera spp.)(例如马铃薯白线虫(G.Pallida)或马铃薯金线虫(G.Rostochiensis))；肾形线虫属物种(Rotylenchulus spp.)(例如肾形线虫(R.Reniformis))；短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)(例如咖啡短体线虫(P.coffeae)、玉米短体线虫(P.Zeae)或古迪短体线虫(P.goodeyi))；穿孔线虫属物种(Radopholus spp.)(例如香蕉穿孔线虫(R.Similis))；潜根线虫属物种(Hirschmaniella spp.)(例如稻潜根线虫(H.Oryzae))；钩口线虫属物种(Ancylostoma spp.)(例如犬钩口线虫(A.caninum)、锡兰钩口线虫(A.Ceylanicum)、十二指肠钩口线虫(A.Duodenale)或管形钩口线虫(A.Tubaeforme))；异尖(Anisakid)；滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)(例如水稻干尖线虫(A.Besseyi))；猫蛔虫(Ascarids)；蛔虫属物种(Ascaris spp.)(例如猪蛔虫(A.suum)或A.lumbridoides)；刺线虫属物种(Belonolaimus spp.)；布鲁丝虫属物种(Brugia spp.)(例如马来丝虫(B.Malayi)或彭亨丝虫(B.Pahangi))；伞滑刃线虫属物种(Bursaphelenchus spp.)；新杆状线虫属物种(Caenorhabditis spp.)(例如漂亮新小杆线虫(C.elegans)、C.briggsae或C.remanei)；梭菌属物种(Clostridium spp.)(例如丙酮丁醇梭菌(C.Acetobutylicum))；古柏线虫属物种(Cooperia spp.)(例如肿孔古柏线虫(C.Oncophora))；轮线虫属物种(Criconemoides spp.)；杯口属物种(Cyathostomum spp.)(例如碗状杯口线虫(C.Catinatum)、冠状杯口线虫(C.Coronatum)或C.pateratum)；杯环属物种(Cylicocyclus spp.)(例如鲜明杯环线虫(C.Insigne)、细颈杯环线虫(C.Nassatus)或C.radiatus)；杯冠属物种(Cylicostephanus spp.)(例如高氏杯冠线虫(C.Goldi)或长伞杯冠线虫(C.Longibursatus))；裂头属(Diphyllobothrium)；恶丝虫属物种(Dirofilaria spp.)(例如犬恶丝虫(D.Immitis))；茎线虫属物种(Ditylenchus spp.)(例如续断双垫刃线虫(D.Dipsaci)、马铃薯腐烂线虫(D.Destructor)或水稻茎线虫(D.Angustus))；蛲虫属物种(Enterobius spp.)(例如蠕形住肠蛲虫(E.Vermicularis))；血矛线虫属物种(Haemonchus spp.)(例如捻转血矛线虫(H.Contortus))；螺旋线虫属物种(Helicotylenchus spp.)；纽带线虫属物种(Hoplolaimusspp.)；光丝虫属物种(Litomosoides spp.)(例如棉鼠丝虫(L.Sigmodontis))；长针线虫属物种(Longidorus spp.)(例如大体长针线虫(L.Macrosoma))；板口线虫属物种(Necator spp.)(例如美洲板口线虫(N.Americanus))；日本圆线虫属物种(Nippostrongylus spp.)(例如巴西钩虫(N.Brasiliensis))；盘尾丝虫属物种(Onchocerca spp.)(例如旋盘尾丝虫(O.Volvulus))；胃线虫属物种(Ostertagia spp.)(例如奥斯特线虫(O.Ostertagi))；Parastrongyloides spp.(例如P.trichosuri)；类毛刺线虫属物种(Paratrichodorus spp.)(例如较小类毛刺线虫(P.Minor)或圆形类毛刺线虫(P.Teres))；拟马鹿圆线虫属物种(Parelaphostrongylusspp.)(例如薄副麂圆线虫(P.Tenuis))；Radophulus spp.；盾线虫属物种(Scutellonerna.spp.)；类圆线虫属物种(Strongyloides spp.)(例如鼠类圆线虫(S.Ratti)或粪类圆线虫(S.Stercoralis))；背带线虫属物种(Teladorsagia spp.)(例如T.circumcincta)；弓蛔线虫属物种(Toxascarisspp.)(例如狮弓蛔线虫(T.leonina))；弓蛔虫属物种(Toxocara spp.)(例如犬弓蛔虫(T.Canis)或猫弓蛔虫(T.Cati)；毛线虫属物种(Trichinella spp.)(例如T.britovi、旋毛线虫(T.Spiralis)或T.spirae)；毛刺线虫属物种(Trichodorus spp.)(例如相似毛刺线虫(T.Similis))；鞭虫属物种(Trichuris spp.)(例如鼠鞭虫(T.Muris)、狐毛首线虫(T.Vulpis)或鞭形鞭虫(T.Trichiura))；小垫刃线虫属物种(Tylenchulusspp.)；矮化线虫属物种(Tylenchorhynchus spp.)；钩虫属物种(Uncinariaspp.)(例如小头钩虫属(U.Stenocephala))；吴策线虫属物种(Wuchereriaspp.)(例如班氏吴策线虫(W.Bancrofti))；剑线虫属物种(Xiphinemaspp.)(例如标准剑线虫(X.Index)或美洲剑线虫(X.Americanum))。

(2)能侵袭人的线虫，例如但不限于蠕形住肠线虫(Enterobiusvermicularis)，这是能导致蛲虫病的蛲虫；似引蛔线虫(Ascarislumbridoides)，导致蛔虫病的大肠道蛔虫；板口线虫属(Necator)和钩口线虫属(Ancylostoma)，两种类型的钩虫，其导致钩虫病；鞭形鞭虫(Trichuris trichiura)，导致鞭虫病的鞭虫；导致类圆线虫病的粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)；以及导致旋毛虫病的Trichonella spirae；马来丝虫(Brugia malayi)和班氏吴策线虫(Wuchereria bancrofti)，它们是与虫感染(已知有淋巴性丝虫病及其多种表现，象皮肿)相关的丝虫线虫，以及旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)，其导致盘尾丝虫病。线虫向人的转移还可通过在受感染的动物或人上进食的食血蚊虫发生；

(3)能感染动物的线虫，所述动物包括但不限于：狗(钩虫，例如犬钩虫(Ancylostoma caninum)或小头钩虫属(Uncinaria stenocephala)，蛔虫，例如犬弓蛔线虫(Toxocara canis)或狮弓蛔线虫(Toxascaris leonina)或鞭虫，例如狐毛首线虫(Trichuris vulpis))、猫(钩虫，例如管形钩口线虫(Ancylostoma tubaeforme)，蛔虫，例如猫弓蛔虫(Toxocara cati))、鱼(鲱鱼虫或鳕鱼虫，例如异尖(Anisakid)，或绦虫，例如裂头属(Diphyllobothrium))、绵羊(金针虫，例如捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus))和牛(胃肠道虫，例如，奥斯特线虫(Ostertagia ostertagi)、肿孔古柏线虫(Cooperia oncophora))；

(4)导致不想看到的对基底或材料的损伤的线虫，例如，攻击食物、种子、木材、画、塑料、布等的线虫。此类线虫的例子包括但不限于根结线虫属物种(Meloidogyne spp.)(例如南方根结线虫(M.Incognita)、爪哇根结线虫(M.Javanica)、禾草根结线虫(M.Graminicola)、花生根结线虫(M.Arenaria)、奇氏根结线虫(M.Chitwoodi)或北方根结线虫(M.Hapla))；胞囊线虫属物种(Heterodera spp.)(例如水稻胞囊线虫(H.oryzae)、大豆胞囊线虫(H.Glycines)、玉米胞囊线虫(H.Zeae)或甜菜胞囊线虫(H.Schachtii))；球胞囊线虫属物种(Globodera spp.)(例如马铃薯白线虫(G.Pallida)或马铃薯金线虫(G.Rostochiensis))；茎线虫属物种(Ditylenchus spp.)(例如续断双垫刃线虫(D.Dipsaci)、马铃薯腐烂线虫(D.Destructor)或水稻茎线虫(D.Angustus))；刺线虫属物种(Belonolaimus spp.)；肾形线虫属物种(Rotylenchulus spp.)(例如肾形线虫(R.Reniformis))；短体线虫属物种(Pratylenchus spp.)(例如咖啡短体线虫(P.coffeae)、古迪短体线虫(P.goodeyi)或玉米短体线虫(P.Zeae))；穿孔线虫属物种(Radopholus spp.)(例如香蕉穿孔线虫(R.Similis))；潜根线虫属物种(Hirschmaniella spp.)(例如稻潜根线虫(H.Oryzae))；滑刃线虫属物种(Aphelenchoides spp.)(例如水稻干尖线虫(A.Besseyi))；轮线虫属物种(Criconemoides spp.)；长针线虫属物种(Longidorus spp.)；螺旋线虫属物种(Helicotylenchus spp.)；纽带线虫属物种(Hoplolaimus spp.)；剑线虫属物种(Xiphinema spp.)；类毛刺线虫属物种(Paratrichodorus spp.)(例如较小类毛刺线虫(P.Minor))；矮化线虫属物种(Tylenchorhynchus spp.)；

(5)传播病毒的线虫(例如，大体长针线虫(Longidorus macrosoma)：传播樱属坏死环斑病毒(prunus necrotic ring spot virus)，美洲剑线虫(Xiphinema americanum)：传播烟草环斑病毒(tobacco ring spot virus)，Paratrichadorus teres：传播豌豆早枯病毒(pea early browning virus)，或者相似毛刺线虫(Trichodorus similis)：传播烟草脆裂病毒(tobacco rattlevirus))。

特别感兴趣的真菌有害生物包括但不限于下述这些。在本发明的一种实施方案中，真菌可以是霉菌，或者更特别地，丝状真菌。在本发明的其它一些实施方案中，真菌可以是酵母。

在一种实施方案中，真菌可以是子囊菌真菌，即，属于子囊菌(Ascomycota)门的真菌。

在本发明的优选但非限制性的实施方案中，真菌细胞选自：

(1)源自植物病原性真菌的细胞或植物病原性真菌细胞，其例如但不限于：小枝顶孢属物种(Acremoniella spp.)、链格孢属物种(Alternariaspp.)(例如芸苔生链格孢(Alternaria brassicola)或索兰尼(氏)链格孢(Alternaria solani))、壳二孢属物种(Ascochyta spp.)(例如豌豆壳二孢(Ascochyta pisi))、葡萄孢属物种(Botrytis spp.)(例如灰葡萄孢(Botrytis cinerea)或富克葡萄孢(Botryotinia fuckeliana))、枝孢属物种(Cladosporium spp.)、尾孢属物种(Cercospora spp.)(例如菊池尾孢(Cercospora kikuchii)或Cercospora zaea-maydis)、枝孢属物种(Cladosporium spp.)(例如黄枝孢(Cladosporium fulvum))、刺盘孢属物种(Colletotrichum spp.)(例如豆刺盘孢(Colletotrichumlindemuthianum))、弯孢属物种(Curvularia spp.)、色二孢属物种(Diplodiaspp.)(例如玉米色二孢(Diplodia maydis))、白粉菌属物种(Erysiphespp.)(例如Erysiphe graminis f.sp.graminis、大麦白粉菌(Erysiphegraminis f.sp.hordei)或豌豆白粉菌(Erysiphe pisi))、Erwinia armylovora、镰孢属物种(Fusarium spp.)(例如雪腐镰孢(Fusarium nivale)、拟分支孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、尖镰孢(Fusarium oxysporum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、Fusarium germinearum、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、腐皮镰孢(Fusarium solani)、串珠镰孢(Fusarium moniliforme)或粉红镰孢(Fusarium roseum))、顶囊壳属物种(Gaeumanomyces spp.)(例如小麦禾顶囊壳(Gaeumanomycesgraminis f.sp.tritici))、赤霉属物种(Gibberella spp.)(例如玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae))、长蠕孢属物种(Helminthosporium spp.)(例如Helminthosporium turcicum、炭色长蠕孢(Helminthosporiumcarbonum)、玉蜀黍长蠕孢(Helminthosporium mavdis)或水稻小球菌核病菌(Helminthosporium sigmoideum))、稻小球腔菌(Leptosphaeriasalvinii)、壳球孢属物种(Macrophomina spp.)(例如菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina))、Magnaportha spp.(例如稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae))、球腔菌属物种(Mycosphaerella spp.)、从赤壳属物种(Nectria spp.)(例如Nectria heamatococca)、霜霉属物种(Peronospora spp.)(例如东北霜霉(Peronospora manshurica)或烟草霜霉(Peronospora tabacina))、茎点霉属物种(Phoma spp.)(例如菾菜茎点霉(Phoma betae))、层锈菌属物种(Phakopsora spp.)(例如豆薯层锈菌(Phakopsora pachyrhizi))、瘤梗孢属物种(Phymatotrichumspp.)(例如多主瘤梗孢(Phymatotrichum omnivorum))、疫霉属物种(Phytophthora spp.)(例如樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)、恶疫霉(Phytophthora cactorum)、菜豆疫霉(Phytophthora phaseoli)、寄生疫霉(Phytophthora parasitica)、柑桔褐腐疫霉(Phytophthoracitrophthora)、Phytophthora megasperma f.sp.soiae或致病疫霉(Phytophthora infestans))、单轴霉属物种(Plasmopara spp.)(例如葡萄生单轴霉(Plasmopara viticola))、叉丝单囊壳属物种(Podosphaeraspp.)(例如白叉丝单囊壳(Podosphaera leucotricha))、柄锈菌属物种(Puccinia spp.)(例如高粱柄锈菌(Puccinia sorghi)、条形柄锈菌(Pucciniastriiformis)、小麦禾柄锈菌(Puccinia graminis f.sp.tritici)、天门冬属柄锈菌(Puccinia asparagi)、隐匿柄锈菌(Puccinia recondita)或落花生柄锈菌(Puccinia arachidis))、腐霉属物种(Pythium spp.)(例如瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum))、核腔菌属物种(Pyrenophora spp.)(例如偃麦草核腔菌(Pyrenophora tritici-repentens)或圆核腔菌(Pyrenophora teres))、梨孢属物种(Pyricularia spp.)(例如稻梨孢(Pyricularia oryzae))、腐霉属物种(Pythium spp.)(例如终极腐霉(Pythium ultimum))、Rhincosporium secalis、丝核菌属物种(Rhizoctoniaspp.)(例如立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、稻枯斑丝核菌(Rhizoctoniaoryzae)或禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis))、根霉属物种(Rhizopusspp.)(例如华根霉(Rhizopus chinensid))、Scerotium spp.(例如Scerotiumrolfsii)、核盘菌属物种(Sclerotinia spp.)(例如核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum))、壳针孢属物种(Septoria spp.)(例如番茄壳针孢(Septorialycopersici)、大豆壳针孢(Septoria glycines)、颖枯壳针孢(Septorianodorum)或小麦壳针孢(Septoria tritici))、根串珠霉属物种(Thielaviopsisspp.)(例如根串珠霉(Thielaviopsis basicola))、腥黑粉菌属物种(Tilletiaspp.)、木霉属物种(Trichoderma spp.)(例如绿色木霉(Trichodermavirde))、钩丝壳属物种(Uncinula spp.)(例如葡萄钩丝壳(Uncinulanecator))、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)(例如玉蜀黍黑粉病)、黑星菌属物种(Venturia spp.)(例如苹果黑星菌(Venturia inaequalis)或梨黑星菌(Venturia pirina))、或轮枝孢属物种(Verticillium spp.)(例如大丽花轮枝孢(Verticillium dahliae)或黄萎轮枝孢(Verticilliumalbo-atrum))；

(2)源自能侵袭人类的真菌的细胞或能侵袭人类的真菌细胞，其例如但不限于：假丝酵母属物种(Candida spp.)，特别是白假丝酵母(Candidaalbicans)；皮肤真菌(Dermatophytes)，包括，表皮癣菌属物种(Epidermophyton spp.)、发癣菌属物种(Trichophyton spp)和小孢霉属物种(Microsporum spp.)；曲霉属物种(Aspergillus spp.)(特别是黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或土曲霉(Aspergillusterreus))；皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)；巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)；粗球孢子菌(Coccidioides immitis)；新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)；荚膜组织胞浆菌荚膜变种(Histoplasma capsulatum Var.Capsulatum)或荚膜组织胞浆菌杜波氏变种(Histoplasma capsulatum Var.Duboisii)；申克孢子丝菌(Sporothrixschenckii)；镰孢属物种(Fusarium spp.)；短柄帚霉(Scopulariopsisbrevicaulis)；产色芽生菌属物种(Fonsecaea spp.)；青霉属物种(Penicilliumspp.)或接合菌纲(Zygomycetes)组的真菌(特别是伞枝犁头霉(Absidiacorymbifera)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)或少根根霉(Rhizopusarrhizus))；

(3)源自能侵袭动物的真菌的细胞或能侵袭动物的真菌细胞，其例如但不限于：假丝酵母属物种、小孢霉属物种(特别是狗小孢霉(Microsporumcanis)或石膏状小孢霉(Microsporum gypseum))、须发癣菌(Trichophytonmentagrophytes)、曲霉属物种或新型隐球酵母；

和

(4)导致不想看到的对基底或材料的损伤的真菌，例如，攻击食物、种子、木材、画、塑料、布等的真菌的细胞或源自所述真菌的细胞。此类真菌的实例是霉菌，其包括但不限于葡萄穗霉属物种(Stachybotrys spp.)、曲霉属物种、链格孢属物种(Alternaria spp.)、枝孢属物种(Cladosporiumspp.)、青霉属物种或白腐真菌(Phanerochaete chrysosporium)。

II.鉴定靶序列

本发明提供了一种方法，用于鉴定和获得包含用于生产dsRNA或siRNA的核苷酸序列的核酸。例如，此类方法包括：(a)用包含来自被靶向有害生物的核苷酸序列或其同源物的全部或一部分的杂交探针去探测cDNA或基因组DNA文库；(b)鉴定出与杂交探针杂交的DNA克隆；(c)分离出步骤(b)中鉴定的DNA克隆；以及(d)对包含步骤(c)中分离出的克隆的cDNA或基因组DNA片段测序，其中，被测序的核酸分子转录RNA核苷酸序列或其同源物的全部或相当大部分。

此外，本发明包括获得下述核酸片段的方法，所述核酸片段包含用于生产dsRNA或siRNA的相当大部分的核苷酸序列，所述方法包括：(a)合成第一和第二寡核苷酸引物，其对应于来自被靶向有害生物的核苷酸序列之一的一部分；以及(b)使用步骤(a)的第一和第二寡核苷酸引物，扩增克隆载体中的cDNA或基因组DNA模板，其中，被扩增的核酸分子转录本发明的dsRNA或siRNA的相当大部分。

在对本发明的实践中，靶基因可源自导致对另一生物的损伤的任何有害生物。采用若干种标准来选择优选的靶基因。所述基因是这样的：其蛋白质产物具有迅速的周转率，使得dsRNA抑制导致蛋白质水平上的迅速减少。在某些实施方案中，选用下述基因是有好处的，所述基因表达水平的小降低就会对受体有害生物造成有害影响。如果想要靶向宽范围的昆虫物种，则例如，选择在这些物种间高度保守的基因。相反，为了赋予特异性的目的而言，在本发明的某些实施方案中，选用这样的基因，其含有在各昆虫物种间，或昆虫与其它生物间保守程度较低的区域。在某些实施方案中，可能想要选用在其它生物中没有已知同源物的基因。

本文中使用的术语“源自”指可从特定来源或物种获得的特定的核苷酸序列，但是不一定要直接从该特定来源或物种获得。

在一种实施方案中，选用在昆虫肠中表达的基因。靶向在肠中表达的基因避免了对在昆虫内部扩散dsRNA的需求。用于本发明的靶基因可包括，例如，与已知肠表达的、编码质膜质子V-ATPase的蛋白质组分(Dow等人，1997，；Dow，1999)的基因的核苷酸序列享有充分同源性的那些。该蛋白质复合体是上皮离子转运的唯一增能剂(energizer)，并且负责中肠腔的碱化。V-ATPase还在马氏管中表达，马氏管是昆虫后肠的突起，其作用于液体平衡以及以类似于哺乳动物肾脏器官的方式针对外来化合物解毒。

在另一实施方案中，选用以重要方式参与昆虫生长、发育和繁殖的基因。示例性的基因包括但不限于：核糖体蛋白的结构亚基和β-coatamer基因，CHD3基因。核糖体蛋白如S4(RpS4)和S9(RpS9)是参与蛋白质生物合成的核糖体的结构组成成分，它们是胞质小核糖体亚基的组分，核糖体蛋白如L9和L19是参与定位到核糖体上的蛋白质生物合成的核糖体的结构组成成分。漂亮新小杆线虫中的β-coatamer基因编码蛋白质，其是形成膜小泡外壳的多聚复合体的亚基。已在不同的生物体(例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、黑尾果蝇和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))中发现了相似的序列。还在不同生物体(例如，马铃薯叶甲(Leptinotarsadecemlineata)、辣根猿叶甲(Phaedon cochleariae)、墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivetis)、墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、桃蚜(Myzus persicae)、褐飞虱(Nilaparvatalugens)、二化螟(Chilo suppressalis)、菜蛾(Plutella xylostella)和居屋艾蟋(Acheta domesticus))中发现了相关序列。用于本发明的其它靶基因可包括，例如，在生存能力、生长、发育、繁殖和侵染性方面具有重要作用的那些基因。这些靶基因包括，例如持家基因、转录因子以及昆虫特异性基因或新杆状线虫属(Caenorhabditis)或果蝇属(Drosophila)中的致死敲除突变。用于本发明的靶基因还可以是来自其它生物体的那些，例如，来自线虫(例如，根结线虫属物种或胞囊线虫属物种)、其它昆虫或蛛形纲(例如，马铃薯叶甲属物种(Leptinotarsa spp.)、猿叶甲属物种(Phaedon spp.)、食植瓢虫属物种(Epilachna spp.)、花象属物种(Anthonomus spp.)、拟谷盗属物种(Tribolium spp.)、瘤蚜属物种、褐飞虱属物种(Nilaparvata spp.)、禾草螟属物种(Chilo spp.)、菜蛾属物种(Plutella spp.)或Acheta spp.)。此外，在本发明中用作为靶序列的核苷酸序列还可源自下述病毒、细菌、真菌、昆虫或真菌基因，所述基因的功能已从文献中建立，其核苷酸序列与昆虫基因组中的靶基因共享充分相似性。

对于可能成为本发明控制的靶的很多昆虫来说，在关于大多数基因的序列方面或特定基因突变导致的表型方面信息有限。因此，可基于模式生物(例如新杆状线虫属(Caenorhabditis)或果蝇属(Drosophila))中或其它一些昆虫物种中的相应基因的可获得的可用信息来选择基因。还可基于其基因已被表征过的其它物种(例如线虫或真菌物种)的可获得的序列信息来选择基因。在一些情况下，可能通过使用基因名或基因序列的检索数据库(例如GenBank)来获得来自靶昆虫的相应基因的序列。一旦获得了序列，就可以使用PCR来扩增昆虫中被适当选出的基因片断，以用于本发明。

为获得来自昆虫物种的相应基因的DNA片断，例如，可基于在漂亮新小杆线虫或果蝇属中，或其基因已被克隆的昆虫中发现的序列，来设计PCR引物。对引物加以设计，以扩增足够长的DNA片断，以用于本发明。选择扩增条件使得即使引物并不精确匹配靶序列但扩增仍能进行。或者，可使用已知的昆虫基因作为探针，从制备自昆虫有害生物物种的基因组DNA或cDNA文库，克隆出基因或其部分。用于进行PCR和从文库克隆的技术是已知的。在实施例中提供了关于基于以前从昆虫物种中克隆出的基因序列来从靶昆虫有害生物物种分离出DNA片断的工艺的详细细节。本领域普通技术人员将认识到，可以用多种技术来从昆虫有害生物物种中分离出对应于以前从其它物种分离出的基因的基因片断。

III.用于抑制或遏制靶基因的方法

本发明提供了使用稳定的dsRNA方法抑制一种或多种靶基因在靶有害生物中的基因表达的方法。本发明特别可用于调节真核基因表达，特别是对下述有害生物中存在的基因的表达加以调节，所述有害生物展示出大约4.5至大约9.5的消化系统pH水平，更优选地，大约5.0至大约8.0，进一步更优选地，大约6.5至大约7.5。对于具有展示出上述范围之外的pH水平的消化系统的有害生物来说，可能需要使用无须摄入dsRNA分子的递送方法。

本发明的方法包括将两种或多种不同的双链RNA或RNA构建体同时或顺序提供给同一昆虫，使得实现对多条靶基因的下调或抑制，或者使得实现对单个靶基因的更有效的抑制。

或者，通过提供击中多条靶序列的一种双链RNA来击中多个靶，以及通过对应于靶基因的双链RNA片段的超过一个拷贝的存在，来更高效地抑制单个靶。因此，在本发明的一种实施方案中，双链RNA构建体包含多个dsRNA区域，每个dsRNA区域中的至少一条链包含与昆虫靶基因的靶核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列。根据本发明，RNA构建体中的dsRNA区域可与相同或不同的靶基因互补和/或dsRNA区域可与来自相同或不同昆虫物种的靶互补。由此，在植物宿主细胞中使用此类dsRNA构建体，在植物中建立对单种或多种昆虫物种的更为有效的抗性。在一种实施方案中，双链RNA区域包括与靶基因互补的核苷酸序列的多个拷贝。或者，dsRNA击中同一靶基因的超过一个靶序列。本发明由此包括下述经分离的双链RNA构建体，其包含与昆虫靶的核苷酸序列的至少一部分互补的所述核苷酸的至少两个拷贝。开发了击中多于一个上述靶的dsRNA或者针对不同的上述靶的不同dsRNA的组合，并将它们用于本发明的方法。申请人在WO2006/046148中描述了合适的dsRNA核苷酸和dsRNA构建体，该文献以其全文引入本文。

术语“击中”及其各种时态形式是表示dsRNA的至少一条链与靶基因或核苷酸序列互补(以及从而可以结合)的替换性措辞方式。

dsRNA的调节作用可应用于有害生物中表达的多种基因，例如，负责细胞代谢或细胞转化的内源基因，包括持家基因、转录因子和编码涉及细胞代谢的多肽的其它基因。

在本文中使用时，短语“对基因表达的抑制”或“抑制靶基因在有害生物细胞中的表达”指来自所述靶基因的mRNA产物和/或蛋白质水平不存在(或可观察到的减少)。特异性指能抑制靶基因但不会对细胞的其它基因造成影响以及不会对产生所述dsRNA分子的细胞中的任何基因造成任何影响的能力。对靶基因在有害生物中的基因表达的抑制可能导致有害生物中产生新的表型性状。

“基因遏制”指用于降低基因转录为mRNA的水平和/或随后mRNA的翻译水平的任何公知方法。基因遏制还意欲表示来自基因或编码序列的蛋白质表达的降低，这包括转录后基因遏制和转录遏制。转录后基因遏制由从被靶向遏制的基因或编码序列转录来的mRNA的全部或部分与相应的用于遏制的双链RNA之间的同源性介导，其指细胞中可获得来与核糖体结合的mRNA可获得的量的充分并且可测量到的降低。转录的RNA可以是正义向的，实现所谓的共遏制，或者是反义向的，实现所谓的反义遏制，或者是双向的，产生dsRNA，实现所谓的RNA干扰(RNAi)。

转录遏制由细胞中dsRNA基因遏制剂的存在介导，所述遏制剂展示出与启动子DNA序列或其互补序列的充分序列同一性，以实现被称为启动子反式遏制的效果。基因遏制可对与性状相关的天然宿主基因有效，例如，提供给宿主降低的蛋白质(天然基因编码的)水平，或增强或降低的受影响代谢物水平。基因遏制还可对下述有害生物中的靶基因有效，所述有害生物可摄入或接触含有基因遏制剂的材料，所述基因遏制剂具体地设计用来抑制或遏制在有害生物细胞中一种或多种同源或互补序列的表达。

在宿主中进行转录后基因遏制的有益方法既利用了正义方向也利用了反义方向的转录RNA，它们作为例如发夹和茎和环结构是稳定的。用于实现转录后基因遏制的优选DNA构建体是这样的：其中，第一片断编码展示出反义方向的RNA，其展示出与被靶向遏制的基因片断的充分同一性，其与正义方向的第二片断相连，所述第二片断编码展示出与第一片断充分互补的RNA。此类构建体通过第一片断与第二片断的杂交以及来自连接两条片断的核苷酸序列的环结构形成茎环结构(见，WO94/01550、WO98/05770、US 2002/0048814和S 2003/0018993)。

根据本发明的一种实施方案中，提供了下述核苷酸序列，其体外表达导致下述稳定的RNA序列的转录，所述RNA序列与有害生物中被靶向基因的RNA分子充分同源，所述有害生物其包含有害生物基因组中核苷酸序列编码的RNA序列)。在有害生物摄入稳定的RNA序列或暴露给dsRNA之后，对应于靶有害生物细胞中靶基因的核苷酸序列即被下调。

使用本发明的稳定的dsRNA技术对靶基因的抑制是序列特异性的，因为对应于RNA的双链体区域的核苷酸序列被靶向进行遗传抑制。对于抑制而言，含有与靶基因的一部分相同的核苷酸序列的RNA是优选的。相对于靶序列而言具有插入、缺失和单点突变的RNA序列也被认为是有效于抑制的。在对本发明的实施中，优选地，抑制性dsRNA和靶基因的部分至少享有大约80％的序列同一性，或者大约85％的序列同一性，或者大约90％的序列同一性，或者大约95％的序列同一性，或者大约99％的序列同一性或者甚至大约100％的序列同一性。或者，可将RNA的双链体区域功能性定义为：能与靶基因转录本的一部分杂交的核苷酸序列。展示出更高同源性但短于全长的序列能够抵补较长但同源性较少的序列。相同核苷酸序列的长度可以为至少大约25、50、100、200、300、400、500或者至少大约1000个碱基。通常，应当使用超过20-100个核苷酸的序列，虽然超过大约200-300个核苷酸的序列将是优选的，并且超过大约500-1000个核苷酸的序列将是尤其优选的，这取决于靶基因的大小。本发明具有如下优点：能耐受可能由于遗传突变、株系多态性或进化趋异性预期的序列变异。相对于靶基因的初级转录产物或经完全加工的mRNA来说，引入的核酸分子可以无需是绝对同源的，可以无需是全长的。因此，本领域技术人员需要认识到，如本文所公开的，为实践本发明，RNA和靶基因之间无需100％的序列同一性。

IV.制备dsRNA的方法

可体内或体外合成dsRNA分子。可通过单条自身互补的RNA链或从两条互补的RNA链来形成dsRNA。细胞的内源RNA聚合酶可介导体内转录，或者，可用克隆的RNA聚合酶来用于体内或体外转录。可通过在器官、组织或细胞类型中的特异性转录；环境条件(例如，感染、胁迫、温度、化学诱导物)的刺激；和/或在发育期或年龄的工程转录(engineeringtranscription)来靶向抑制。RNA链可被聚腺苷酸化或者可不被聚腺苷酸化；RNA链可以能够通过细胞的翻译设备翻译为多肽，或者可以不能这样。

本领域技术人员可通过人工或自动反应以化学或酶促方式产生本发明的RNA、dsRNA、siRNA或miRNA，或在另一生物体中体内产生。还可通过部分或全部的有机合成来产生RNA；可以通过体外酶促或有机合成引入任何经修饰的核糖核苷酸。可通过细胞RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶(例如，T3、T7、SP6)来合成RNA。表达构建体的使用和产生都是本领域已知的(见，例如，WO 97/32016；美国专利No.5,593,874、5,698,425、5,712,135、5,789,214和5,804,693)。如果RNA是通过化学合成或者通过体外酶促合成的话，那么可在引入细胞之前对RNA进行纯化。例如，可使用溶剂或树脂萃取、沉淀、电泳、色谱或其组合从混合物中纯化出RNA。可选地，可在不纯化或尽量少纯化的条件下使用RNA，以避免由于样品加工造成的损失。RNA可被干燥用于贮存，或者可溶解于水溶液中。溶液可含有缓冲液或盐，以促进双链体的退火和/或稳定。

V.多核苷酸序列

根据本发明提供了下述核苷酸序列，其表达产生了与有害生物中被靶向基因的RNA分子(包含有害生物基因组中核苷酸序列编码的RNA序列)充分同源的RNA序列。因此，dsRNA序列被摄入后，可获得对有害生物细胞中靶基因的核苷酸序列的下调，这导致对有害生物的保持、生存能力、增殖、繁殖和侵袭来说有害的影响。

本文示出的每条“核苷酸序列”都表示为脱氧核糖核苷酸(缩写为A、G、C和T)序列。但是，核酸分子或多核苷酸的“核苷酸序列”对于RNA分子或多核苷酸而言表示脱氧核糖核苷酸的序列，但是对于RNA分子或多核苷酸而言，其表示相应的核糖核苷酸(A、G、C和U)的序列，其中，给定的脱氧核苷酸序列中的每个胸苷脱氧核苷酸(T)被核糖核苷酸尿苷(U)替换。

在本文中使用时，“核酸”表示从5′到3′末端阅读的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。任选地，核酸还可含有下述非天然存在的核苷酸碱基或改变的核苷酸碱基，其允许聚合酶的正确连读，并且不会降低所述核酸编码的多肽的表达。“核苷酸序列”或“核酸序列”既指核酸的正义链也指其反义链，并且无论是单个单链状态或处于双链体中的。

术语“核糖核酸”(RNA)包括RNAi(抑制性RNA)、dsRNA(双链RNA)、siRNA(小干扰RNA)、mRNA(信使RNA)、miRNA(微小RNA)、tRNA(转移RNA，无论是否被相应的酰基化氨基酸加上电荷或卸掉电荷)和cRNA(互补RNA)，术语“脱氧核糖核酸”(DNA)包括cDNA和基因组DNA和DNA-RNA杂交体。

本领域技术人员应当将词汇——“核酸片断”、“核苷酸片断”或更一般性的“片断”理解为功能性术语，其包括基因组序列、核糖体RNA序列、转移RNA序列、信使RNA序列、操纵子序列以及更小的经过改造的核苷酸序列，所述核苷酸序列表达或被改造来表达蛋白质、多肽或肽。

因此，本发明涉及经分离的核酸分子，其包含下述多核苷酸，所述多核苷酸具有选自SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481的任何多核苷酸序列的序列。本发明还提供了SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481的多核苷酸序列的功能性片段。本发明还提供了SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481的任何多核苷酸序列的互补核酸或其片段，以及包含至少15个连续碱基的核酸，其与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481的任何多核苷酸序列杂交。

本发明还提供了本发明的SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481的多核苷酸序列的直向同源物序列及其互补序列和片段。因此，本发明包括下述靶基因，它们是包含下述核苷酸序列的基因的昆虫直向同源物，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481中任何所示。举例而言，昆虫直向同源物可包含SEQ ID NO：49-123、275-434、533-562、621-738、813-852、908-1010、1161-1437、1730-1987、2120-2290、2384-2438中任何所示的核苷酸序列，或其至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸的片段。包含本发明的序列之一的至少15bp(优选至少17bp)片段的、昆虫或蛛形纲直向同源物基因或序列的非限制性列表在表4中给出。

本发明还包括下述靶基因，它们是包含下述核苷酸序列的基因的线虫直向同源物，所述核苷酸序列如本发明的任何SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481中所示。举例而言，线虫直向同源物可包含本发明的SEQ ID NOs：124-135、435-446、563、564、739-751、853、854、1011-1025、1438-1473、1988-2001、2291-2298、2439-2440中任何所示的核苷酸序列，或者其至少15、16、17、18、19、20或21个核苷酸的片段。根据另一方面，本发明由此包括本文所述的、用于控制生物体中线虫生长或者用于防止线虫侵袭对线虫感染易感的生物体的任何方法，所述方法包括：将线虫细胞与下述双链RNA相接触，其中，所述双链RNA包含退火的互补链，其中之一具有与下述靶基因的核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列，所述靶基因包含SEQ ID NOs：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481所示的任何序列的至少17、18、19、20或21个核苷酸的片段，由此，所述双链RNA被真菌摄取，并由此控制了生长或防止了侵袭。本发明还涉及线虫抗性转基因植物，其包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481所示的任何序列的至少17、18、19、20或21个核苷酸的片段。包含本发明的序列之一的至少15bp(优选至少17bp)的片段的、线虫直向同源物基因或序列的非限制性列表在表5中给出。

根据另一实施方案，本发明包括下述靶基因，它们是包含下述核苷酸序列的基因的真菌直向同源物，所述核苷酸序列如本发明的SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481中任何所示。举例而言，真菌直向同源物可包含SEQ ID NO：136-158、447-472、565-575、752-767、855-862、1026-1040、1474-1571、2002-2039、2299-2338、2441-2460中任何序列所示的核苷酸序列，或者其至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个核苷酸的片段。根据另一方面，本发明由此包括本文所述的、用于控制细胞或生物体上真菌生长或者用于防止真菌侵袭对真菌感染易感的细胞或生物体的任何方法，所述方法包括：将真菌细胞与下述双链RNA相接触，其中，所述双链RNA包含退火的互补链，其中之一具有与下述靶基因的核苷酸序列的至少一部分互补的核苷酸序列，所述靶基因包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481所示的任何序列的至少17、18、19、20或21个核苷酸的片段，由此，所述双链RNA被真菌摄取，并由此控制了生长或防止了侵袭。本发明还涉及真菌抗性转基因植物，其包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481所示的任何序列的至少17、18、19、20或21个的片段。包含本发明的序列之一的至少15bp(优选至少17bp)的片段的、真菌直向同源物基因或序列的非限制性列表在表6中给出。

在又一实施方案中，本发明的dsRNA分子包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481中的任何序列，虽然SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481中示出的序列是非限制性的。本发明的dsRNA分子可包含来自有害生物物种的任何连续的靶基因(例如，大约15至大约25或更多，或大约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25或更多个连续的核苷酸)。

“经分离的”核酸分子表示已从其天然环境移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，就本发明的目的而言，DNA构建体中含有的重组DNA分子就被认为是经分离的。经分离的DNA分子的另外实例包括在异源宿主细胞中保持的重组DNA分子，或溶液中经(部分或充分)纯化的DNA分子。经分离的RNA分子包括本发明的DNA分子的体外RNA转录本。根据本发明，经分离的核酸分子还包括合成生产的那些分子。

本发明的核酸分子可以是RNA(例如mRNA)的形式或DNA的形式，包括，例如，cDNA或基因组DNA，它们是通过克隆获得的或合成产生的。DNA或RNA可以是双链或单链的。单链DNA可以是编码链，其也被称为正义链，或者其可以是非编码链，这也被称为反义链。

VI.序列分析

除非另有指明，本文中通过对DNA分子进行测序测定的所有核苷酸序列都是用自动DNA测序仪(例如来自应用生物系统公司(AppliedBiosystems，Inc.)的373型)测定的。因此，如本领域中关于通过该自动手段测定的任何DNA序列而言已知的那样，本文测定的任何核苷酸序列可能含有一些错误。通常，通过自动方法测定的核苷酸序列与被测序DNA分子的实际核苷酸序列有至少大约95％同一，更通常，至少大约96％至至少大约99.9％同一。可以通过本领域公知的其它手段，包括手动DNA测序法，来更为精确地测定实际序列。如本领域中还已知的那样，测定的核苷酸序列中较之实际序列的单个插入或缺失将引起在核苷酸序列翻译中移码，从而，测定的核苷酸序列编码的预测氨基酸序列可能从此类插入或缺失之处开始与被测序DNA分子实际编码的氨基酸序列完全不同。

在另一方面，本发明提供了经分离的核酸分子，其包含在严格杂交条件下与上文所述的本发明核酸分子中多核苷酸的一部分杂交的多核苷酸。与多核苷酸的“一部分”杂交的多核苷酸意指：与参照多核苷酸的至少大约15个核苷酸，更优选地，至少大约20个核苷酸，仍更优选地，至少大约30个核苷酸，甚至更优选地，超过30个核苷酸杂交的多核苷酸(DNA或RNA)。与参照片段杂交的这些片段可用作为诊断探针和引物。就本发明的目的而言，当两条序列能在6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt’s溶液和100μg非特异性运载体(carrier)DNA的杂交溶液中形成双链复合体时，那么两条序列就是能杂交的。见，Ausubel等人，2.9部分，supplement增刊27(1994)。序列可在“中等严格度”下杂交，其被定义为：在6×SSC，0.5％SDS，5×Denhardt’s溶液和l00μg非特异性载体DNA的杂交溶液中，温度为60℃。对“高严格度”杂交而言，温度增加至68℃。中等严格度杂交反应之后，于室温下，在2×SSC加0.05％SDS中的溶液中对核苷酸洗涤5次，随后在60℃用0.1×SSC加0.1％SDS洗1小时。对于高严格度而言，洗涤温度增加至68℃。就本发明的目的而言，杂交的核苷酸是使用1ng具有10,000cpm/ng的特异放射性的经放射标记的探针探测到的那些，其中，在-70℃暴露给X-射线胶片不超过72小时后，杂交的核苷酸清晰可见。

本申请涉及下述核酸分子，它们与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481中任何序列所示的核酸序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。但是，优选的是与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481所示的核酸序列至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的核酸分子。两条核酸序列间的差异可能发生于参照核苷酸序列的5′或3′末端的位置，或者这些末端位置之间的任何地方，它们可以各自单独地散布于参照序列的核苷酸中，或者散布在参照序列中的一个或多个连续的组中。

在实践方面而言，任何特定核酸分子是否与参照核苷酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％同一是指使用本领域公知的标准算法在两个分子间进行的比较，这可以使用公众可获得的计算机程序，例如BLASTN算法方便地测定。见，Altschul等人，Nucleic Acids Res.25：3389-3402(1997)。

在本发明的一种实施方案中，核酸包含具有大约15至大约30(例如，大约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)个核苷酸的反义链，其中，所述反义链与编码下述蛋白质的RNA序列或其一部分互补，所述蛋白质能控制细胞周期或同源重组，并且，其中，所述siNA还包含具有大约15至大约30(例如，大约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)个核苷酸的正义链，并且，其中，所述正义链和所述反义链是不同的核苷酸序列，其中，每条链中至少大约15个核苷酸与另一条链互补。

在一种实施方案中，本发明提供了能介导RNA干扰基因沉默的双链核酸分子。在另一实施方案中，本发明的siNA分子由下述双链体核酸分子构成，所述核酸分子在包含大约15至大约30(例如，大约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)个核苷酸的寡核苷酸之间含有大约15至大约30个碱基对。在再一实施方案中，本发明的siNA分子包含具有大约1至大约32(例如，大约1、2或3)个核苷酸的突出末端的双链体核酸分子，例如，大约21-核苷酸双链体，其具有大约19个碱基对和3′端单核苷酸、二核苷酸或三核苷酸突出端。在再一实施方案中，本发明的siNA分子包含具有平端的双链体核酸分子，其中两端均是平端，或者可选地，其末端之一是平末端。

本发明的siNA分子可包含经修饰的核苷酸，并且同时保留介导RNAi的能力。经修饰的核苷酸可用于改善体外或体内特征，例如，稳定性、活性和/或生物利用性。例如，本发明的siNA分子可包含占siNA分子中存在的核苷酸总数百分比的经修饰核苷酸。同样地，一般而言，本发明的siNA分子可包含大约5％至大约100％的经修饰核苷酸(例如，大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的经修饰核苷酸)。给定的siNA分子中存在的经修饰核苷酸的实际百分比将取决于siNA中存在的核苷酸的总数。如果siNA分子是单链的，那么百分比修饰可基于单链siNA分子中存在的核苷酸的总数。类似地，如果siNA分子是双链的，那么，百分比修饰可基于正义链、反义链或正义和反义两条链中存在的核苷酸的总数。

VII.核酸构建体

重组核酸载体，可以例如是线性质粒或闭合环状质粒。载体系统可以是单个载体或质粒或一起含有将引入细菌宿主基因组中的全部核酸的两个或多个载体或质粒。此外，细菌载体可以是表达载体。例如，可在合适启动子的控制下，将SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、49-158、159、160、161、162、163、168、173、178、183、188、193、198、203、208、215、220、225、230、240-246、247、249、251、253、255、257、259、275-472、473、478、483、488、493、498、503、508-512、513、515、517、519、521、533-575、576、581、586、591、596、601、603、605、607、609、621-767、768、773、778、783、788、793、795、797、799、801、813-862、863、868、873、878、883、888、890、892、894、896、908-1040、1041、1046、1051、1056、1061、1066-1070、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1089、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1161-1571、1572、1577、1582、1587、1592、1597、1602、1607、1612、1617、1622、1627、1632、1637、1642、1647、1652、1657、1662、1667、1672、1677、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、1730-2039、2040、2045、2050、2055、2060、2065、2070、2075、2080、2085、2090、2095、2100、2102、2104、2106、2108、2120-2338、2339、2344、2349、2354、2359、2364、2366、2368、2370、2372、2384-2460、2461、2466、2471、2476和2481示出的核酸分子或其片段适当地插入载体，所述启动子在一种或多种微生物宿主中发挥作用，以驱动所连的编码序列或其它DNA序列的表达。就此目的而言，很多种载体都是可获得的，对合适的载体的选择主要取决于将插入载体的核酸的大小以及将用载体转化的特定宿主细胞。每种载体都含有多种组分，这取决于其功能(扩增DNA或表达DNA)和与其相容的特定宿主细胞。对于细菌转化而言，载体组分通常包括但不限于下述中的一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种可选择标记基因和诱导型启动子，以允许外源DNA的表达。

启动子

提到调控序列和结构核苷酸序列时使用的“有效地连接”表示，调控序列能使得所连接的结构核苷酸序列受调控表达。“调控序列”或“控制元件”指位于结构核苷酸序列上游(5′非编码序列)、内部或下游(3′非翻译序列)的核苷酸序列，其能影响转录的时间选择和水平或量、RNA加工或稳定性或相关联的结构核苷酸序列的翻译。调控序列可包括启动子、翻译前导序列、内含子、增强子、茎环结构、阻抑物结合序列和聚腺苷酸化识别序列等。

用于生产mRNA的表达载体还可含有诱导型启动子，其可被宿主细菌生物体识别，并且其与感兴趣的核酸有效地连接，所述核酸编码，例如，编码玉米根萤叶甲(D.v.virgifera)mRNA的核酸分子或其片段。适用于细菌宿主的诱导型启动子包括：β-内酰胺酶启动子、大肠杆菌λ噬菌体PL和PR启动子和大肠杆菌半乳糖启动子、阿拉伯糖启动子、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子和乳糖操纵子启动子及其变异以及杂合启动子，例如tac启动子。但是，已知的其它细菌诱导型启动子也是合适的。

在某些实施方案中，基因可源自不同的昆虫，以拓宽所述剂有效的昆虫的范围。当为了遏制或为了表达和遏制的组合靶向了多种基因时，可按照Fillatti，申请公开文本No.US 2004-0029283的阐述和公开，来制造多顺反子DNA元件。

可选择标记基因

通常，本发明的重组DNA载体或构建体将包含可选择标记，其赋予经转化的细胞可选择的表型。可选择标记还可用于选出含有编码本发明的多肽或蛋白质的外源核酸的细胞。所述标记可编码杀生物剂抗性，例如抗生素抗性(例如，卡那霉素、G418、博来霉素、潮霉素等)。可选择标记的实例包括但不限于：neo基因，其编码卡那霉素抗性，可使用卡那霉素、G418等来加以选择；bar基因，其编码双丙氨膦抗性；腈水解酶基因，其赋予对溴苯腈的抗性；以及氨甲蝶呤抗性的DHFR基因。此类可选择标记的实例在美国专利5,550,318、5,633,435、5,780,708和6,118,047中有所阐述。

本发明的重组载体或构建体还可包括可筛选标记。可筛选标记可用于监测表达。示例性的可筛选标记包括：β-葡糖醛酸糖苷酶或uidA基因(GUS)，已知有多种显色底物可用于其编码的酶(Jefferson，1987；Jefferson等人，1987)；β-内酰胺酶基因(Sutcliffe等人，1978)，已知有多种显色底物可用于该基因编码的酶(例如，PADAC，显色的头孢菌素)；荧光素酶基因(Ow等人，1986)；xylE基因(Zukowsky等人，1983)，其编码儿茶酚加双氧酶，该酶可转化显色的儿茶酚；α-淀粉酶基因(Ikatu等人，1990)；酪氨酸酶基因(Katz等人，1983)，其编码能将酪氨酸氧化为DOPA和多巴醌(进而缩合为黑色素)的酶；和α-半乳糖苷酶，其催化显色的α-半乳糖底物。

可使用本领域中可获得的方法，来容易地制备转化载体。转化载体包含一种或多种下述核苷酸序列，所述序列能被转录为RNA分子并且与昆虫基因组编码的一种或多种核苷酸序列充分同源和/或互补，从而，吸收所述RNA后，有害生物基因组中分别的核苷酸序列中的至少一种的表达被下调。

VIII.用于遗传工程的方法

本发明包括将核苷酸序列引入生物，以使得一种或多种dsRNA分子以能抑制有害生物的水平表达。可通过本领域已知用来将重组序列引入靶宿主细胞的标准流程，来将本发明的多核苷酸和多肽引入宿主细胞，例如细菌或酵母细胞。此类流程包括但不限于：转染、感染、转化、天然摄取、磷酸钙、电穿孔、显微注射生物射弹和微生物介导的转化方案。选用的方法随宿主生物而变化。

本发明的转基因生物是这样的生物，其包含其基因组中已稳定整合了外源核酸的至少一个细胞。因此，转基因生物可仅在其结构的某些部分含有经遗传修饰的细胞。

因此，本发明还包括包含本文所述的任何核苷酸序列或重组DNA构建体的转基因细胞或生物。本发明还包括原核细胞(例如但不限于，革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌细胞)和真核细胞(例如但不限于，酵母细胞或植物细胞)。

例如，本发明包括将靶基因引入细菌，例如乳杆菌属。可用整合型载体将核酸构建体整合进细菌基因组。通常，整合型载体含有与细菌染色体同源的至少一条序列，这允许载体整合。整合看起来是载体和细菌染色体的同源DNA之间的重组导致的。例如，用来自多种芽孢杆菌属菌株的DNA构建的整合型载体能整合进芽孢杆菌属染色体(EP 0 127，328)。整合型载体还可包含噬菌体或转座子序列。自杀载体也是本领域已知的。

对含有上面列出的一种或多种组分的合适载体的构建利用标准重组DNA技术来进行。对经分离的质粒或DNA片段进行切割、加尾和重新连接，成为产生所需质粒的理想形式。可获得的细菌表达载体的实例包括但不限于：多功能大肠杆菌克隆和表达载体，例如Bluescript^TM(Stratagene，LaJolla，CA)，其中，例如，玉米根萤叶甲蛋白质或其片段可与β-半乳糖苷酶的氨基末端Met和随后的7个残基的序列符合读框地连接进载体，由此产生杂种蛋白质；pIN载体(Van Heeke and Schuster，1989)等。

本发明还包括向酵母细胞中引入靶基因。通常，酵母重组构建体包括下述中的一种或多种：启动子序列、融合伴侣序列、前导序列、转录终止序列、可选择标记。这些元件可组合进表达盒，表达盒可以保持于复制子中，例如，能在宿主，例如酵母或细菌中稳定保持的染色体外元件(例如，质粒)。复制子可具有两套复制系统，由此允许其保持于，例如酵母中(用于表达)，以及保持于原核宿主中(用于克隆和扩增)。此类酵母-细菌穿梭载体的例子包括YEp24(Botstein等人，1979)、pCl/1(Brake等人，1984)和YRp17(Stinchcomb等人，1982)。此外，复制子可以是高拷贝数或低拷贝数的质粒。通常，高拷贝数质粒将具有大约5至大约200之间的拷贝数，典型地，大约10至大约150。含有高拷贝数质粒的宿主将优选具有至少大约10，更优选至少大约20。

有用的酵母启动子序列可源自编码代谢途径的酶的基因。此类基因的实例包括：醇脱氢酶(ADH)(EP 0 284044)、烯醇化酶、葡糖激酶、葡糖-6-磷酸异构酶、甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAP或GAPDH)、己糖激酶、果糖磷酸激酶、3-磷酸甘油酸变位酶和丙酮酸激酶(PyK)(EP 0 3215447)。编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因还提供了有用的启动子序列(Myanohara等人，1983)。此外，天然不存在的合成启动子也可作为酵母启动子发挥作用。此类杂种启动子的实例包括与GAP转录激活区域相连的ADH调控序列(美国专利No.4,876,197和4,880,734)。转录终止子序列和其它酵母识别终止序列(例如，编码糖酵解酶的那些)的实例是本领域技术人员已知的。

或者，可用整合型载体将表达构建体整合进酵母基因组。通常，整合型载体含有与酵母染色体同源的至少一条序列，以允许载体整合，并且优选在表达构建体侧翼含有两条同源序列。整合看起来是载体中和酵母染色体中同源DNA之间的重组产生的(Orr-Weaver等人，1983)。整合型载体可被引至酵母中的特定基因座，这通过选择合适的同源序列包括进载体来实现。见上文的Orr-Weaver等人。一种或多种表达构建体可以整合，这可能影响产生的重组蛋白的水平(Rine等人，1983)。

IX.定量对靶基因表达的抑制

可通过测量内源靶RNA或通过靶RNA的翻译产生的蛋白质，来定量对靶基因表达的抑制，并且可以通过检查细胞或生物的外部性质来验证抑制的结果。用于对RNA和蛋白质进行定量的技术是本领域普通技术人员公知的。可获得赋予对氨苄青霉素、博来霉素、氯霉素、庆大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、氨甲蝶呤、膦丝菌素、嘌呤霉素、壮观霉素、利福霉素和四环素等的抗性的多种可选择标记。

在某些实施方案中，基因表达被抑制至少10％，优选地，至少33％，更优选地，至少50％，还更优选地，至少80％。在本发明的特别优选的实施方案中，有害生物的细胞中，基因表达被抑制至少80％，更优选地，至少90％，更优选地，至少95％，或者至少99％，所以发生显著的抑制。显著的抑制意欲指这样的显著抑制，其产生可探测到的表型(例如，幼虫生长的停止、瘫痪或死亡等)或可探测到的、对应于被抑制的靶基因的RNA和/或蛋白质的减少。虽然在本发明的某些实施方案中，抑制在有害生物的几乎所有细胞中发生，但是在其它一些优选的实施方案中，抑制仅在表达该基因的细胞亚群中发生。例如，如果将靶基因在昆虫消化道的细胞中发挥重要作用，那么对这些细胞中基因的抑制就足以向昆虫施加有害作用。

X.将有害生物暴露给dsRNA

可以以允许将dsRNA施用给有害生物的任何合适方法将有害生物暴露给dsRNA。例如，可将有害生物与纯的或充分纯的形式的dsRNA(例如，含有dsRNA的水溶液)接触。在一种实施方案中，用包含dsRNA的水溶液对昆虫进行简单“浸泡”或“喷雾”。可选地，可用包含dsRNA的溶液对有害生物进行“喷雾”。

或者，可将dsRNA与有害生物的食物组分(例如，针对哺乳动物病原性有害生物的食物组分)相连，以增加昆虫对dsRNA的摄取。有害生物的摄入允许有害生物控制剂被递送给有害生物，并且导致宿主中靶基因的下调。用于口服引入的方法可包括，例如，将dsRNA与有害生物的食物直接混合，以及经过改造的方案，其中，将用作为食物的物种改造为表达dsRNA或siRNA，然后将其喂饲给待被影响的有害生物。例如，可用靶序列转化细菌，例如，乳杆菌属，然后将其喂饲给有害生物。在一种实施方案中，例如，可将dsRNA或siRNA分子掺入昆虫膳食，或者置于其上。

在其它实施方案中，可将有害生物与含有本发明dsRNA的组合物接触。除了包含dsRNA之外，组合物还可含有赋形剂、稀释剂或载体。

还可将dsRNA掺入有害生物生长或侵袭的介质中。例如，可将dsRNA掺入到食物容器或保护包装中，作为抑制有害生物侵袭的手段。例如可用包含dsRNA的溶液处理木材，以预防有害生物侵袭。

在其它实施方案中，dsRNA在细菌或真菌细胞中表达，并且所述细菌或真菌细胞被昆虫物种摄取或吃掉。

如实施例所阐述的，可对细菌进行改造，以产生本发明的任何dsRNA或dsRNA构建体。这些细菌可被昆虫物种吃掉。当被摄取时，dsRNA可启动RNAi应答，导致靶mRNA的降解，并且削弱或杀死进食的昆虫。可选地，可将产生dsRNA的细菌或酵母细胞直接喷雾到作物上。

一些细菌与宿主植物有着非常紧密的相互作用，例如但不限于，共生的根瘤菌属(Rhizobium)和豆科(Legminosea)(例如，豆)。此类重组细菌科与种子混合(例如作为涂层)，以及用作为土壤改良物。

特异性感染昆虫的病毒，例如杆状病毒也可使用。这确保了对哺乳动物(尤其是人)的安全性，因为病毒将不会感染哺乳动物，因此将不存在不想要的RNAi作用。

可能的应用包括密集型温室培养物，例如，从GMO的观点来看较少兴趣的作物，以及范围更广的田间作物，例如豆类。

该手段具有若干种优点，例如，因为植物宿主可能切割的问题不存在，因此允许将较大的dsRNA片段运送进进食的有害生物的肠腔；使用细菌作为杀昆虫剂不涉及转基因作物的产生，尤其是对于难于获得转基因变体的某些作物而言；其具有宽广的、灵活的应用，因为可在同一田间同时处理不同的作物和/或可同时靶向不同的有害生物，例如通过将产生不同dsRNA的不同细菌组合起来。

XI.产品

本发明提供了包含用于控制有害生物的dsRNA的多种产品。例如，本发明提供了药物或兽医组合物，分别用于治疗或预防人或动物的有害生物疾病或感染。此类组合物包含：适于药物用途的至少一种载体、赋形剂或稀释剂以及至少一种dsRNA或RNA构建体，或编码dsRNA或RNA构建体的重组DNA构建体或核苷酸序列，其中，所述RNA包含经退火的互补链，其中之一具有对应于有害生物靶基因(导致疾病或感染)的靶核苷酸序列的核苷酸序列。

或者，药物或兽医组合物可用作为适于局部应用的组合物，例如在动物或人的皮肤上应用。例如，dsRNA可用于将作为滴剂、凝胶剂、气雾剂、乳膏剂、软膏剂等应用到皮肤上的液体组合物中。此外，dsRNA可整合进透皮帖剂或其它医药设备，用于治疗或预防疾病或病症。还可生产其它常规药物剂量形式，包括片剂、胶囊剂、阴道栓、透皮贴剂、栓剂等。选用的形式将取决于靶有害生物的性质，以及因此也取决于想要治疗的疾病的性质。

例如，可使用本发明的构建体和方法来生产口服疫苗。例如，可通过在细菌(例如，乳杆菌属)中生产dsRNA(其可被包括进食物，并作为针对昆虫侵袭的口服疫苗发挥作用)来构建疫苗。因此，本发明提供了用于治疗和/或预防有害生物疾病或病症的构建体和方法，所述方法包括向需要此类治疗和/或预防的受试者施用本文所述的任何组合物，所述组合物包含至少一种双链RNA或双链RNA构建体，其包含经退火的互补链，其中之一具有与有害生物靶基因(导致疾病或病症)的核苷酸序列至少一部分互补的核苷酸序列。

虽然本发明的组合物可用于在受试患者中治疗疾病或病症，但是组合物和方法还可用作为保护基底或材料免受有害生物侵袭的手段。包括进组合物的赋形剂的性质和组合物的物理形式可根据想要处理的基底的性质变化。

例如，此类组合物可以是涂层或粉末，其可应用到基底上，作为保护基底免受昆虫侵袭以及由此预防有害生物导致的对基底或材料的损伤的手段。因此，在一种实施方案中，组合物是合适表面上的涂层形式，其黏附到与所述涂层接触的昆虫上并最终被其摄入。此类组合物可用于保护对于有害生物导致的侵袭或损伤易感的任何基底或材料，例如食物或其它易坏的材料以及基底，例如木材。

例如，组合物可以是液体，其被刷到或喷雾到待处理的材料或基底上或烙印进其中。因此，人类使用者可用该组合物对昆虫或基底直接喷雾。

例如，房屋和其它木质产品可以被白蚁、栖粉甲虫和木蚁损坏。可以通过用包含dsRNA的组合物处理木材或房屋墙板，来降低有害生物的侵袭。同样，可用包含dsRNA的组合物来处理树干。

粉甲虫、谷类象鼻虫、大斑粉螟和其它有害生物在贮藏谷类、谷物、宠物食品、粉末巧克力以及厨房食品室中不受保护的几乎所有其它物品上进食。因此，本发明提供了用包含靶dsRNA的组合物处理谷物盒和其它食物贮藏容器以及包装的手段。

衣蛾幼虫取食用动物产品，例如皮毛、丝和毛线制造的衣物。因此，可能想要用本发明的dsRNA的来处理衣架、衣橱和衣物袋。书虱和蠹虫是图书馆的有害生物，因为它们吃图书粘合物中的淀粉胶。因此，本发明提供了处理图书免遭有害生物侵袭和破坏的组合物。

在一种实施方案中，组合物是饵料形式。饵料被设计来引诱昆虫与组合物接触。与其接触后，组合物被昆虫内在化(例如通过摄入来实现)，并介导RNAi，由此杀死昆虫。饵料可以取决于被靶向的物种。还可使用引诱剂。引诱剂可以是信息素，例如雄性或雌性信息素。引诱剂作用于将昆虫引诱到饵料上，其可以靶向特定的昆虫，或者可以吸引全范围的昆虫。饵料可以是任何合适的形式，例如，固体、糊状、团块或粉末状形式。

饵料还可以被昆虫运回其群落。然后饵料可用作群落中其它成员的食物来源发挥作用，由此提供对大量昆虫以及有可能整个昆虫有害生物群落的有效控制。这是与使用双链RNA或表达本发明的dsRNA的细菌相关的优点，因为RNAi介导的对有害生物的影响的延迟作用允许饵料被运回群落，由此在暴露给昆虫的方面带来了最大的作用。

饵料可以以合适的“屋(housing)”或“陷阱”提供。此类屋和陷阱是商业可获得的，现有的陷阱可被改造以包括进本发明的组合物。屋或陷阱可以是盒形的，例如，可以以预先成型的条件提供，或者可以是例如可折叠的卡纸板的形式。用于屋或陷阱的合适材料包括塑料和卡纸板，特别是波状卡片板。陷阱的内表面可以带有粘性物质，从而昆虫一旦进入陷阱行动即受限制。屋或陷阱可含有合适的槽状内部，其可将饵料保持于合适的位置。陷阱与屋不同，因为昆虫在进入之后不能轻易离开陷阱，而屋则扮演“进食站”的作用，其向昆虫蜘蛛类提供优选的环境，在那里它们进食并且有安全感(没有捕食者)。

显而易见，可用本发明的组合物处理大量的产品和基底，以降低有害生物侵袭。当然，赋形剂的性质和组合物的物理形式可根据想要处理的基底的性质变动。例如，组合物可以是液体，其被刷到或喷雾到待处理的材料或基底上或烙印进其中，或者是涂层，其被应用到待处理的材料或基底上。

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下文提供了关于鉴定靶序列，以及将所述序列引入多种细胞和组合物的方法的特定实施例。它们仅作示例用，而非对本发明加以限制。

实施例1：在高通量筛选中沉默漂亮新小杆线虫中的漂亮新小杆线虫靶基因

在pGN9A载体(WO 01/88121)中制备漂亮新小杆线虫全基因组文库，其处于两个相同的T7启动子和终止子之间，在T7聚合酶表达(被IPTG诱导)的情况下驱动其在正义和反义方向上的表达。

将该文库转化进96孔板形式中的细菌菌株AB301-105(DE3)中。为进行全基因组筛选，将这些细菌细胞喂饲给核酸酶缺陷型漂亮新小杆线虫nuc-1(e1392)株系。

按照下文所述，在96孔板形式中将细菌菌株AB301-105(DE3)产生的dsRNA喂饲给漂亮新小杆线虫nuc-1(e1392)虫：将nuc-1卵转移至单独的板上，令其同时在20℃孵化，以使得L1世代同步。向96孔板中装入100μL包含IPTG的液体培养基以及10μL漂亮新小杆线虫dsRNA文库的AB301-105(DE3)细菌细胞培养物(OD₆₀₀为1)，所述文库每个都携带有具漂亮新小杆线虫基因组片段的载体，用于表达dsRNA。向每个孔中加入4只同步的L1虫，在25℃孵育至少4至5天。这些实验都采用一式四份来进行。在筛选中使用6个对照：

pGN29＝阴性对照，野生型

pGZ1＝unc-22＝颤搐者表型

pGZ18＝几丁质合酶＝胚胎致死

pGZ25＝pos-1＝胚胎致死

pGZ59＝bli-4D＝急性致死

ACC＝乙酰辅酶A羧化酶＝急性致死

5天后，将用产生dsRNA的细菌喂饲的漂亮新小杆线虫nuc-1(e1392)虫的表型与用空载体(pGN29)和其它对照喂饲的虫的表型相比较。针对致死性(急性或幼虫)，亲本(Po)世代的致死性，第一子代(F1)世代的(胚胎)致死性，或者针对Po的生长延缓，对用dsRNA喂饲的虫加以筛选，这按照下文所述来进行：(i)Po的急性致死性：L1虫没有发育并且死亡，该表型没有产生子代，孔看起来相当地空；(ii)Po的(幼虫)致死性：Po在L1之后的期死亡，该表型也没有产生子代。在孔中发现了死亡的幼虫或死亡的成虫；(iii)F1的致死性：L1虫发育到成年期，并且仍然活着。该表型没有子代。这可能是由于不育、胚胎致死性(在孔底有死亡的卵)、胚胎停止或幼虫停止(最终死亡)；(iv)生长停止或生长延缓/延迟：与具有正常发育或正常子代#的孔比较。

对于表1A中示出的靶序列而言，我们推断出，dsRNA介导的线虫(例如漂亮新小杆线虫)中漂亮新小杆线虫靶基因的沉默对于虫的生长和生存能力具有致命影响。

上述dsRNA沉默实验之后，在24孔板上，以高通量模式，在漂亮新小杆线虫中进行了更为详细的表型实验。按照下文所述，将上文所述的细菌菌株AB301-105(DE3)中产生的dsRNA文库喂饲给24孔板上的漂亮新小杆线虫nuc-1(e1392)虫：将nuc-1卵转移至单独的板上，令其同时在20℃孵化，以使得L1世代同步。随后，将100只同步的L1虫浸泡于500μL S-完全喂饲培养基(包含5μg/mL胆固醇、4μL/mL PEG和1mM IPTG)和500μL漂亮新小杆线虫dsRNA文库的AB301-105(DE3)细菌细胞培养物(OD₆₀₀为1)中，所述文库每个都携带有具漂亮新小杆线虫基因组片段的载体，用于表达dsRNA。在25℃对浸泡的L1虫进行2小时摇晃。

离心并除去950μL上清液之后，将5μL剩余的且重悬的沉淀(包含大约10至15只虫)，转移进24孔板的每个孔的中部，所述孔装有琼脂LB肉汤层。在25℃对经接种的板进行2天孵育。在成年期，单独选出1只成虫并在25℃孵育2天，以观察其子代。对其它成虫的观察在原来的24孔板上原位进行。这些实验一式四份进行。

用第二批虫重复进行这种详细的表型筛选，唯一的不同在于，第二批虫在20℃孵育3天。

将用漂亮新小杆线虫dsRNA喂饲的虫的表型与用空载体喂饲的漂亮新小杆线虫nuc-1(e1392)虫的表型相比较。

基于该实验推断出：对表1A中示出的漂亮新小杆线虫靶基因的沉默对于虫的生长和生存能力有致命影响，该靶基因对线虫生存能力来说是重要的。因此，这些基因是通过dsRNA介导的基因沉默控制(杀死或防止其生长)线虫的良好靶基因。因此，本发明包括上述漂亮新小杆线虫靶基因的线虫直向同源物在多种生物和材料中控制线虫侵袭的用途。

实施例2：对黑尾果蝇直向同源物的鉴定

如上文实施例1中所述，鉴定出了多种漂亮新小杆线虫致死序列，它们可用于鉴定其它物种和属中的直向同源物。例如，可用漂亮新小杆线虫致死序列来鉴定直向同源的黑尾果蝇序列。即，可用每条漂亮新小杆线虫序列就黑尾果蝇中的直向同源序列去检索公共数据库，例如GenBank。选出可能的黑尾果蝇直向同源物，其享有高度序列同源性(E值优选小于或等于1E-30)，并且序列是blast相互最佳击中(hit)，后者表明来自不同生物体(例如漂亮新小杆线虫和黑尾果蝇)的序列是彼此最高的blast击中。例如，使用BLAST，将来自漂亮新小杆线虫的序列C与黑尾果蝇中的序列相比。如果黑尾果蝇序列D是序列C的最佳击中，并且当将D与漂亮新小杆线虫的所有序列进行比较时也得到序列C，那么D和C就是相互最佳击中。该标准通常用于定义直向同源性，这表示不同物种中具有相似功能的相似序列。黑尾果蝇序列标识符示于表1A中。

实施例3：马铃薯叶甲(马铃薯甲虫)

A.从马铃薯叶甲克隆部分基因序列

按照厂商说明书，使用TRIzol试剂(目录Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，从马铃薯叶甲(马铃薯甲虫的来源：Jeroen van Schaik，Entocare CV BiologischeGewasbescherming，Postbus 162，6700AD Wageningen，荷兰)的四种不同幼虫期分离高质量的完整RNA。按照厂商说明书(目录Nr.1700，普洛麦格公司(Promega))，通过DNase处理，除去RNA制备中存在的基因组DNA。按照厂商说明书，使用可商购试剂盒(SuperScript^TMIII逆转录酶，目录Nr.18080044，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，产生cDNA。

为分离出包含LD001、LD002、LD003、LD006、LD007、LD010、LD011、LD014、LD015、LD016和LD018基因的部分的cDNA序列，按照厂商说明书，使用Amplitaq Gold(目录Nr.N8080240，应用生物系统公司(AppliedBiosystems))，用简并引物进行一系列PCR反应。

用于扩增每条基因的简并引物的序列给于表2-LD中，该表展示了马铃薯叶甲靶基因，包括引物序列和获得的cDNA序列。这些引物用于各PCR反应中，其中采用如下条件：95℃10分钟，接着进行40个95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟的循环，接着在72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，将其纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAquick GelExtraction kit)，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，克隆进pCR8/GW/topo载体(目录Nr.K250020，英杰生命科学公司(Invitrogen))，并测序。得到的PCR产物的序列由表2-LD给出的各SEQID NO示出，它们被称为部分序列。相应的部分氨基酸序列由表3-LD中给出的各SEQ ID NO示出，其中，读框的起点用括号示出。

B.马铃薯叶甲基因的dsRNA产生

使用可商购试剂盒T7Ribomax^TMExpress RNAi系统(目录Nr.P1700，普洛麦格公司(Promega))，合成毫克级的dsRNA。首先，在两个分别的PCR反应中产生两种分别的单5′T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有相对T7启动子而言不同方向的靶序列。

就每种靶基因而言，使用特异性的T7正向引物和特异性的反向引物来产生正义T7模板。用于扩增每种靶基因的正义模板的各引物的序列给于表8-LD中。PCR反应条件如下所述：95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟的循环，接着在72℃10分钟。在采用与上述相同的条件的PCR反应中，使用特异性正向引物和特异性T7反向引物来产生反义T7模板。用于扩增每种靶基因的反义模板的各引物的序列给于表8-LD中。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR产物，通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCRPurification Kit，目录Nr.28106，快而精公司(Qiagen))对其进行纯化，并进行NaClO₄沉淀。将产生的T7正向和反向模板混合起来以被转录，将得到的RNA链退火，用DNase和RNase进行处理，并且通过乙酸钠纯化，这都按照厂商说明书来进行。针对每种靶基因得到的dsRNA的正义链示于表8-LD中。表8-LD展示了用于制备马铃薯叶甲靶序列的dsRNA片段和多联体序列的序列，包括引物序列。

C.使用人工膳食，就对马铃薯叶甲的活性来筛选dsRNA靶

用于马铃薯甲虫的人工膳食如下文所述来制备(对Gelman等人，2001，J.Ins.Sc.，卷1，号7，1-10做了一些改变)：对水和琼脂进行高压灭菌，当温度降到55℃时加入剩余的成分(如下表2所示)。在该温度，将成分很好地混合起来，之后将膳食等分到24孔板(纳恩克公司(Nunc))，每孔的量为1ml膳食。通过在室温冷却，令人工膳食固化。将膳食贮存于4℃，可贮存多达3周。

表2：人工膳食的成分

将50μl dsRNA溶液以浓度为1mg/ml局部应用到多孔板孔中的固体人工膳食上。在层流室中干燥膳食。对每种处理而言，对24只马铃薯甲虫幼虫(第2期)进行测试，每孔两只昆虫。将板贮藏于昆虫饲养室中，其中为25±2℃，60％相对湿度和16∶8小时的亮∶暗光周期。每1、2或3天对甲虫做出活或死的评定。7天之后，对靶LD006、LD007、LD010、LD011和LD014而言，膳食被具有局部应用了同样浓度(1mg/ml)的dsRNA的新鲜膳食替换，对靶LD001、LD002、LD003、LD015和LD016而言，膳食被仅新鲜膳食本身替换。将dsRNA靶与仅膳食本身或具有经局部应用了对应于GFP(绿色荧光蛋白)编码序列(SEQ ID NO：235)的片段的dsRNA的膳食相比较。

如两次分别的生物测定所示，向马铃薯叶甲幼虫喂饲含有完整裸dsRNA的人工膳食导致幼虫死亡率显著增加(图1LD-2LD)。

测试的所有dsRNAs都最终导致7-14天后100％的死亡率。在生物测定期间，有或没有GFP dsRNA的膳食使得昆虫得以维持，死亡率非常小或没有死亡率。

通常，在观察的所有测定中，CPB第二期幼虫在有或没有dsRNA的膳食上正常进食2天，并蜕变为第三期幼虫。在该新的幼虫期，观察到CPB显著降低或完全停止了其进食，结果死亡率增加。

D.使用马铃薯叶盘，针对对马铃薯叶甲的活性的dsRNA靶的生物测定

使用马铃薯叶材料而非人工膳食作为CPB的食物来源，进行另一可选的生物测定方法。使用大小合适的穿孔器，从2-3周龄的马铃薯植物叶上切下直径大约为1.1cm(或0.95em²)的盘。通过在近轴叶表面应用20μl10ng/μl的靶LD002dsRNA或对照gfp dsRNA溶液来制备经处理的叶盘。令叶盘干燥，各自放置于24孔板(纳恩克公司(Nunc))的24个孔中。向每个孔中放入一只处于第二幼虫期的CPB，然后用薄纸和多孔塑料盖盖上。将含有昆虫和叶盘的板保持在28℃的昆虫室中，光周期为16小时亮/8小时暗。令昆虫在叶盘上进食2天，之后将昆虫转移至含有新鲜的经处理叶盘的新板上。之后，每天将昆虫转移至含有未经处理的叶盘的板上，直到第7天。记录昆虫死亡率和重量分数。

向马铃薯叶甲幼虫喂饲表面应用了靶LD002完整裸dsRNA的马铃薯叶盘导致幼虫死亡率显著增加(即，在第7天所有昆虫都死亡了；100％死亡率)，而对照gfp dsRNA则对CPB的存活没有影响。在2至3天后，靶LD002dsRNA严重影响到幼虫的生长，而喂饲同样浓度的gfp dsRNA的幼虫却发育正常(图3-LD)。

D.使用人工膳食，就对马铃薯叶甲的活性，来筛选dsRNA的较短版本

本实施例阐述了下述发现：较短的(60或100bp)的dsRNA片段自身或作为多联体构建体足以导致对马铃薯甲虫的毒性。

为本实施例选择LD014，已知能诱导马铃薯甲虫致死的靶。该基因编码V-ATPase亚基E(SEQ ID NO：：15)。

进一步选用100个碱基对的片段——位于SEQ ID NO：：15的第195-294位的LD014_F1(SEQ ID NO：159)和60个碱基对的片段——位于SEQ IDNO：：15的第235-294位的LD014_F2(SEQ ID NO：160)。也见表7-LD。

设计出300个碱基对的两个多联体LD014_C1和LD014_C2(SEQ IDNO：：161和SEQ ID NO：：162)。LD014_C1含有上文所述的100个碱基对的片段(SEQ ID NO：：159)的3次重复，而LD014_C2含有上文所述的60个碱基对的片段(SEQ ID NO：：160)的5次重复。还见表7-LD。

片段LD014_F1和LD014_F2作为正义和反义引物被合成。将这些引物退火，以在克隆前产生双链DNA分子。分别在引物的5′和3′末端包括XbaI和XmaI限制性位点，以协助克隆。

多联体被制备为300个碱基对的合成基因。分别在合成的DNA片段的5′和3′末端包括XbaI和XmaI限制性位点，以协助克隆。

用XbaI和XmaI消化4种DNA分子，即，两种单一单元(LD014_F1和LD014_F2)和两种多联体(LD014_C1和LD014_C2)，并将其亚克隆进通过XbaI和XmaI消化被线性化的pBluescriptII SK+中，分别产生重组质粒p1、p2、p3和p4。

产生双链RNA：使用可商购试剂盒T7Ribomax^TMExpress RNAi系统(目录Nr.P1700，普洛麦格公司(Promega))来合成dsRNA。首先，在两个分别的PCR反应中产生两种分别的单5′T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有相对T7启动子而言不同方向的靶序列。对于LD014_F1而言，使用特异性的T7正向引物oGBM159和特异性的反向引物oGBM164(在本文中被分别示为SEQ ID NO：：204和SEQ ID NO：205)，在PCR反应中产生正义T7模板，所述PCR反应条件如下：95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟的循环，接着在72℃10分钟。在具有与上文所述相同条件的PCR反应中，使用特异性的正向引物oGBM163和特异性的T7反向引物oGBM160(在本文中被分别示为SEQ ID NO：：206和SEQ IDNO：207)，产生反义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR产物，通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，目录Nr.28106，快而精公司(Qiagen))对其进行纯化，并进行NaClO₄沉淀。将产生的T7正向和反向模板混合起来以被转录，将得到的RNA链退火，用DNase和RNase进行处理，并且通过乙酸钠纯化，这都按照厂商说明书来进行。得到的dsRNA的正义链在本文中如SEQ ID NO：203所示。

对于LD014_F2而言，使用特异性的T7正向引物oGBM161和特异性的反向引物oGBM166(在本文中被分别示为SEQ ID NO：：209和SEQ ID NO：210)，在PCR反应中产生正义T7模板，所述PCR反应条件如下：95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟的循环，接着在72℃10分钟。在具有与上文所述相同条件的PCR反应中，使用特异性的正向引物oGBM165和特异性的T7反向引物oGBM162(在本文中被分别示为SEQID NO：：211和SEQ ID NO：212)，产生反义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR产物，通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，目录Nr.28106，快而精公司(Qiagen))对其进行纯化，并进行NaClO₄沉淀。将产生的T7正向和反向模板混合起来以被转录，将得到的RNA链退火，用DNase和RNase进行处理，并通过乙酸钠纯化，这都按照厂商说明书来进行。得到的dsRNA的正义链在本文中如SEQ ID NO：208所示。

此外，对于多联体而言，在两个分别的PCR反应中产生分别的单5′T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有相对T7启动子而言不同方向的靶序列。用XbaI或XmaI对含有LD014_C1和LD014_C2的重组质粒p3和p4线性化，纯化针对每种构建体的两条线性片段，将其作为模板用于体外转录检测，其中使用侧接于克隆位点的T7启动子。通过使用T7RiboMAX^TMExpress RNAi系统(普洛麦格公司(Promega))进行体外转录来制备双链RNA。针对LD014_C1和LD014_C2得到的dsRNA的正义链在本文中被分别示为SEQ ID NO：：213和2114。

靶LD014的较短序列和多联体能在马铃薯叶甲中诱导致死性，如图4-LD所示。

G.使用人工膳食，针对对马铃薯叶甲的活性，筛选不同浓度的dsRNA

将50μl dsRNA溶液(一系列10倍的浓度，从1μg/μl(对于靶LD027而言，0.1μg/μ1)下降到0.01ng/μ1)局部应用到24孔板(纳恩克公司(Nunc))孔中的固体人工膳食上。在层流室中干燥膳食。对每种处理而言，对24只马铃薯甲虫幼虫(第2期)进行测试，每孔两只昆虫。将板贮藏于昆虫饲养室中，条件为25±2℃，60％相对湿度和16∶8小时的亮∶暗光周期。以常规间隔对甲虫做出活或死的评定，直至第14天。7天之后，膳食被局部应用了同样浓度的dsRNA的新鲜膳食替换。将dsRNA靶与仅膳食本身的情况相比较。

以低至0.1至10ng dsRNA/μl的浓度，向马铃薯叶甲幼虫喂饲含有不同靶的完整裸dsRNAs的人工膳食导致幼虫的高死亡率，如图5-LD所示。

H.在适合用于细菌生产昆虫活性双链RNA的载体中克隆CPB基因片段

虽然可以使用任何高效的细菌启动子，在载体中克隆对应于MLB基因靶的DNA片段，用于在细菌宿主中表达双链RNA(见WO 00/01846)。

用于扩增靶基因的特异性引物的序列提供于表8中。使用的模板是含有任何靶序列的pCR8/GW/topo载体。在采用下述条件的PCR反应中使用引物：98℃5分钟，接着是30个98℃10秒、55℃30秒和72℃2分钟的循环，接着在72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，平端克隆进用SrfI线性化过的pGNA49A载体(参考WO00188121A1)中，并进行测序。产生的PCR产物的序列对应于表8给出的分别的序列。携带该序列的重组载体被命名为pGBNJ003。

用于扩增靶基因片段LD010的特异性引物的序列提供于表8中(正向引物SEQ ID NO：：191和反向引物SEQ ID NO：：190)。所用的模板是含有LD010序列的pCR8/GW/topo载体(SEQ ID NO：：11)。在采用下述条件的PCR反应中使用引物：98℃5分钟，接着是30个98℃10秒、55℃30秒和72℃2分钟的循环，接着在72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，平端克隆进用Srf I线性化过的pGNA49A载体(参考WO00/188121A1)中，并进行测序。产生的PCR产物的序列对应于表8给出的SEQ ID NO：：188。携带该序列的重组载体被命名为pGBNJ003。

I.在两种大肠杆菌(Escherichia coli)菌株：(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表达和产生双链RNA靶

为了在细菌中表达合适水平的靶LD010的昆虫活性双链RNA，按照下述流程来进行。将RNAaseIII缺陷型菌株AB309-105与野生型含RNaseIII细菌BL21(DE3)进行比较。

AB309-105和BL21(DE3)的转化

在50μl的冰冷化学感染态大肠杆菌菌株AB309-105或BL21(DE3)的等分试样中加入300ng的质粒，并轻柔混合。细胞在冰上孵育20分钟，之后对它们进行37℃5分钟的热激处理，之后将细胞放回到冰上，再放5分钟。向细胞中加入450μl室温SOC培养基，在摇床(250rpm)上于37℃对悬浮液进行1小时孵育。取100μl细菌细胞悬浮液转移至500ml锥形瓶中，其中含有150ml补充有100μg/ml羧苄青霉素抗生素的液体Luria-Bertani(LB)培养基。在Innova 4430摇床(250rpm)上于37℃对培养物进行过夜(16至18小时)孵育。

双链RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表达的化学诱导

因为存在用于受控表达的所有遗传组分，因此使得在细菌菌株AB309-105或BL21(DE3)中从重组载体pGBNJ003表达双链RNA成为可能。存在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷或IPTG时，T7聚合酶能驱动靶序列以反义和正义方向转录，因为它们侧翼有相反定向的T7启动子。

使用合适的分光光度计来在600nm处测量过夜细菌培养物的光密度，通过加入新鲜的LB培养基将其调节至该值为1。将50ml该培养物转移到50ml Falcon管中，然后于15℃在3000g对培养物离心10分钟。移出上清液，将细菌沉淀重悬于50ml新鲜的S完全培养基(SNC培养基+5μg/ml胆固醇)中，其中补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG。在室温下对细菌进行2至4小时的诱导。

对细菌的热处理

通过热处理杀死细菌，以最小化对测试板中人工膳食造成污染的风险。但是，对表达双链RNA的细菌的热处理并非诱导RNA干扰导致的对昆虫的毒性的先决条件。于室温下在3000g对经诱导的细菌培养物进行10分钟离心，弃去上清液，在水浴中使沉淀进行20分钟的80℃处理。热处理之后，将细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，将悬浮液转移至微离心管。制备若干管，在生物测定中用于每次更新(refreshment)。将管贮存于-20℃直到进一步使用。

J.实验室试验，以测试针对马铃薯叶甲，表达dsRNA靶LD010的大肠杆菌

用两种生物测定方法来测试大肠杆菌中产生的双链RNA针对马铃薯甲虫幼虫的抵挡：(1)基于人工膳食的生物测定，以及(2)基于植物的生物测定。

基于人工膳食生物测定

按照实施例4中前文所述来制备用于马铃薯甲虫的人工膳食。向48孔的多孔测试板(纳恩克公司(Nunc))的每个孔中放入半毫升膳食。对于每种处理而言，将50μl经热处理的表达dsRNA的细菌(等同于大约5×10⁷个细菌细胞)悬浮液(OD为1)局部应用到孔中的固体膳食上，令板在层流室中干燥。对每种处理而言，对48只第2期马铃薯甲虫幼虫进行测试，含有膳食和细菌的每孔一只昆虫。板上每排(即，8个孔)被认为是一份重复。将板保持于昆虫饲养室中，条件为25±2℃，60％相对湿度和16∶8小时的亮∶暗光周期。每4天后，将甲虫转移至含有经局部应用的细菌的新鲜膳食上。侵袭后每一天或每三天对甲虫做出活或死的评定。侵袭后第7天，以幼虫重量形式，记录存活者的生长和发育。

对于RNaseIII缺陷型大肠杆菌菌株AB309-105而言，在生物测定中，针对CPB毒性对含有质粒pGBNJ003的细菌和含有空载体pGN29(参考WO00/188121A1)的那些加以测试。携带pGBNJ003质粒的细菌显示出昆虫死亡率随时间的明显增加，而对pGN29和仅给予膳食的对照而言则只观察到了极少的死亡率或者没有死亡(图6a-LD和7a-LD)。在含有表达dsRNA靶LD010的细菌的人工膳食上进食7天后，马铃薯甲虫幼虫存活者的生长和发育被严重妨碍(表10-LD、图8a-LD)。

对于大肠杆菌菌株BL21(DE3)而言，针对马铃薯甲虫幼虫，对含有质粒pGBNJ003的细菌和含有空载体pGN29的那些加以测试。在喂饲补充有BL21(DE3)细菌的膳食的幼虫上观察到了与RNAseIII缺陷型菌株AB309-105类似的有害作用(图6b-LD和7b-LD)。但是，对BL21(DE3)而言，5个克隆的存活者的数量要高于AB309-105；在第12天，对该菌株而言，平均死亡率的值比RNase III缺陷型菌株更低大约25％。此外，在含有表达对应于靶LD010的dsRNA的BL21(DE3)的膳食上进食的存活者的平均重量严重降低(表10-LD、图8b-LD)。

在含有携带质粒pGBNJ003的两种细菌菌株中任何一种的膳食上进食的CPB幼虫生长和发育的延迟与进食抑制直接相关，因为较之携带空载体pGN29的细菌或仅膳食的板而言，从第4天开始在更新过的板的孔中就看不到虫粪。该观察与CPB在体外转录的双链RNA(局部应用到人工膳食上)上进食的情况(见实施例3D)类似；此时，在经处理的膳食上第2天起进食就停止了。

基于植物的生物测定

在将植物喂饲给CPB幼虫之前，用经化学诱导的表达dsRNA的细菌的悬浮液对整株马铃薯植物喷雾。在植物培养室中，将马铃薯植物品种“5系”从块茎生长到8-12片展开叶的阶段，其中采用下述条件：25±2℃，60％相对湿度，16∶8小时的亮/暗光周期。将500ml塑料瓶顶部向下放到植物上，瓶颈稳固放进盆中的土壤中，瓶底切开，盖上细尼龙网以允许通风、降低内部冷凝以及防止幼虫逃脱，由此为植物搭建笼子。在笼中每株经处理植物上放15只L1期的马铃薯甲虫幼虫。用携带有pGBNJ003质粒(克隆1；图7a-LD)或pGN29质粒(克隆1；见图7a-LD)的大肠杆菌AB309-105的悬浮液来处理植物。向植物应用不同量的细菌：66、22和7个单位，其中，一个单位被定义为：600nm波长下，光密度值为1的1ml细菌悬浮液中，10⁹个细菌细胞。每种情况下，在喷雾器协助下将总体积1.6ml喷雾到植物上。在该试验中，每种处理使用一株植物。对存活者的数量加以计数，记录每只存活者的重量。

用表达来自pGBNJ003的靶dsRNA的大肠杆菌细菌菌株AB309-105的悬浮液对植物进行喷雾，导致昆虫死亡率较之pGN29对照的显著增加。当对细菌细胞悬浮液的量进行9倍稀释时，死亡率数仍然保持(图9-LD)。在用携带pGBNJ003载体的细菌喷雾过的植物上第11天的幼虫存活者的平均重量比pGN29的少大约10倍(图10-LD)。较之在用含有空载体pGN29的细菌喷雾过的马铃薯植物上的导致的损伤相比，CPB幼虫对用含有pGBNJ003质粒的细菌喷雾过的马铃薯植物造成的进食损伤大大降低(图11-LD)。

这些实验显示，在野生型或RNaseIII缺陷型细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，这表现在昆虫死亡率的高度增加以及幼虫存活者生长/发育的延迟上。从这些实验中还显而易见：提供了使用制剂喷雾来有效保护植物/作物免受昆虫损伤的范例，所述制剂由表达对应于昆虫基因靶的双链RNA的细菌组成。

K.针对马铃薯叶甲，对表达dsRNA靶LD010的大肠杆菌的多种培养悬浮液密度加以测试

按照实施例3J所述来制备和处理细菌培养物。将表达靶LD010的双链RNA的大肠杆菌RNAseIII缺陷型菌株AB309-105培养物的三倍系列稀释(从0.25个单位的等同物开始)应用到8-12展开叶阶段的马铃薯植物品种“Bintje”的叶上。在经处理的植物上放10只马铃薯叶甲L1幼虫，每种处理一株植物。在第7天(即，侵袭后7天)针对昆虫死亡率和生长妨碍进行计分。

如图14-LD所示，当向昆虫喂饲通过良好喷雾携带质粒pGBNJ003(用于靶10dsRNA的表达)的大肠杆菌热灭活培养物(密度为0.25、0.08和0.025个细菌单位)进行局部应用处理的马铃薯植物时，在1周后记录到了高CPB幼虫死亡率(90至100％)。0.008个单位时，有大约1/3的昆虫死亡，但是存活的昆虫比对照组(携带空载体pGN29的大肠杆菌以及仅用水的植物)中的那些显著更小。较之用含有空载体pGN29的细菌喷雾的马铃薯植物上招致的损伤而言，CPB幼虫对用包含0.025或0.008个单位浓度的pGBNJ003质粒的细菌喷雾过的马铃薯植物的进食损伤大大降低(图15-LD)。

L.成虫对于口服摄入的对应于靶基因的dsRNA极端易感

下文提供的实施例强调了下述发现：成年昆虫(以及不仅是幼虫期的昆虫)对口服摄入的对应于靶基因的dsRNA极端易感。

选用了四种靶来进行该实验：靶2、10、14和16(分别是SEQ ID NO：168、188、198和220)。GFP片段dsRNA(SEQ ID NO：235)用作为对照。从我们实验室饲养的培养物中随机挑出年轻成虫(2-3日龄)，对昆虫性别无偏向。每种处理选用十只成虫。在处理开始前对成虫进行至少6小时的预饥饿。在处理的第一天，向每只成虫喂饲四片马铃薯叶盘(直径1.5cm²)，所述叶盘每盘用25μl的0.1μg/μl靶dsRNA(按照实施例3A所述合成；按照实施例3E所述进行局部应用)的局部应用处理过。每只成虫被限制在小培养皿(直径3cm)中，以确保所有昆虫都摄入了等量的食物，并且由此获得等剂量的dsRNA。第二天，每只成虫再喂饲四片按照上文所述处理过的叶盘。第三天，收集每种处理的全部10只成虫，将它们一起放到笼子中，所述笼子是具有细尼龙网当盖子(以提供良好通风)的塑料盒(大小为30cm×20cm×15cm)组成的。盒子内部，在底部放有一些打湿的滤纸。一些(未经处理的)马铃薯叶被放到纸上面，以在实验期间保持成虫。从第5天开始，进行常规评定，以对死的、活的(移动的)和濒死的昆虫进行计数。对于昆虫的濒死性而言，将成虫背朝下放置，检查它们是否能在数分钟内自己翻过身来，只要其不能自己翻起来那么该昆虫就被认为是濒死的。

在该实验中显示了对应于不同靶的双链RNA对马铃薯甲虫(马铃薯叶甲)成虫的清楚的、特异性的毒性作用(图12-LD)。在最终评定日(第19天)，对应于gfp片段的双链RNA没有对CPB成虫显示出毒性。该实验清楚显示，口服递送时暴露给dsRNA仅几天后，CPB成虫的存活就被严重降低。例如，对于靶10而言，在第5天，10只成虫中有5只濒死(病态并且移动缓慢)；在第6天，10只成虫中的4只死亡，存活者中有3只濒死；第9天时观察到所有成虫死亡。

作为该实验的结果，针对昆虫有害生物对靶双链RNA的应用可被拓宽为包括昆虫有害生物的两种生命阶段(即，幼虫和成虫)，所述阶段能导致广泛的作物损伤的，如马铃薯甲虫的情况一样。

实施例4：辣根猿叶甲(白芥叶甲虫)

A.通过家族PCR，克隆辣根猿叶甲(白芥叶甲虫)的PC001、PC003、PC005、PC010、PC014、PC016和PC027基因的部分序列

按照厂商说明书，使用TRIzol试剂(目录Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，从辣根猿叶甲(白芥叶甲虫；来源：Dr.Caroline Muller，Julius-von-Sachs-Institute forBiosciences，Chemical Ecology Group，University of Wuerzburg，Julius-von-Sachs-Platz 3，D-97082Wuerzburg，Germany)的第三幼虫期分离高质量的完整RNA。按照厂商说明书，通过DNase(目录Nr.1700，普洛麦格公司(Promega))处理，除去RNA制备中存在的基因组DNA。按照厂商说明书，使用可商购试剂盒(SuperScript^TMIII逆转录酶，目录Nr.18080044，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，产生cDNA。

为分离出包含PC001、PC003、PC005、PC010、PC014、PC016和PC027基因的部分的cDNA序列，按照厂商说明书，使用Amplitaq Gold(目录Nr.N8080240，应用生物系统公司(Applied Biosystems))，用简并引物进行一系列PCR反应。

用于扩增每条基因的简并引物的序列给于表2-PC中。表2-PC展示了辣根猿叶甲靶基因，包括引物序列和获得的cDNA序列。这些引物用于各PCR反应中，其中采用如下条件：95℃10分钟，接着进行40个95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟的循环，接着在72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，将其纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，克隆进pCR4/TOPO载体(目录Nr.K4530-20，英杰生命科学公司(Invitrogen))，并测序。得到的PCR产物的序列由表2-PC给出的各SEQ ID NO示出，它们被称为部分序列。

相应的部分氨基酸序列由表3-PC中给出的各SEQ ID NO示出。表3-PC提供了cDNA克隆的氨基酸序列，读框的起点用括号示出。

B.辣根猿叶甲基因的dsRNA产生

使用可商购试剂盒T7Ribomax^TMExpress RNAi系统(目录Nr.P1700，普洛麦格公司(Promega))，合成毫克级的dsRNA。首先，在两个分别的PCR反应中产生两种分别的单5′T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有相对T7启动子而言不同方向的靶序列。

就每种靶基因而言，使用特异性的T7正向引物和特异性的反向引物来产生正义T7模板。用于扩增每种靶基因的正义模板的各引物的序列给于表8-PC中。表8-PC提供了制备辣根猿叶甲靶序列的dsRNA片段的细节，包括引物序列。

PCR反应条件如下所述：95℃1分钟，接着是20个95℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是15个95℃30秒、50℃30秒和72℃1分钟的循环，接着在72℃10分钟。在采用与上述相同的条件的PCR反应中，使用特异性正向引物和特异性T7反向引物来产生反义T7模板。用于扩增每种靶基因的反义模板的各引物的序列给于表8-PC中。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR产物，通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，目录Nr.28106，快而精公司(Qiagen))对其进行纯化，并进行NaClO₄沉淀。将产生的T7正向和反向模板混合起来以被转录，将得到的RNA链退火，用DNase和RNase进行处理，并且通过乙酸钠纯化，这都按照厂商说明书来进行。针对每种靶基因得到的dsRNA的正义链示于表8-PC中。

C.使用油菜叶盘，针对对辣根猿叶甲幼虫的活性，测试dsRNA靶的实验室试验

下文提供的实施例是对下述发现的示例：白芥叶甲虫(MLB)幼虫对于口服摄入的对应于其自身靶基因的dsRNA易感。

为测试不同的双链RNA样品对MLB幼虫的抵挡，使用油菜(欧洲油菜(Brassica napus)品种SW Oban；来源：Nick Balaam，Sw Seed Ltd.，49North Road，Abington，Cambridge，CB1 6AS，UK)叶材料作为食物来源，进行叶盘测定。将昆虫培养物保持在昆虫室中同品种的油菜上，条件为25±2℃，60±5％的相对湿度和16小时亮/8小时暗的光周期。使用大小合适的穿孔器，从4-6周龄的油菜植物叶上切下直径大约为1.1cm(或0.95cm²)的盘。在含有0.05％Triton X-100的Milli-Q水中，将双链RNA样品稀释至0.1μg/μl。通过在近轴叶表面应用25μl靶PC001、PC003、PC005、PC010、PC014、PC016、PC027dsRNA和对照gfp dsRNA或0.05％Triton X-100的经稀释溶液，来制备经处理的叶盘。令叶盘干燥，单独放置于24孔板的24个孔的每个中，其中含有1ml已胶凝的2％琼脂，帮助防止叶盘干掉。向板的每个孔中放入两只新生MLB幼虫，然后用多孔塑料盖盖上。将板(一种处理含有48只昆虫)分为一式四份重复，每份重复12只昆虫(每排)。将含有昆虫和叶盘的板放置于昆虫室中，条件为25±2℃，60±5％的相对湿度和16小时亮/8小时暗的光周期。令昆虫进食叶盘2天，之后将它们转移至含有新鲜的经处理叶盘的新板上。之后，生物测定开始后4天，收集来自每份重复的昆虫，将其转移至含有未经处理的新鲜油菜叶的培养皿上。在第2、4、7、9和11天，记录幼虫死亡率和平均重量。

对测试的所有靶而言，在用完整裸露的靶dsRNA处理过的油菜叶上喂饲的辣根猿叶甲幼虫都导致幼虫死亡率显著增加，如图1(a)所示。针对靶PC010的测试双链RNA导致第9天时100％幼虫死亡率，对靶PC027而言，在第11天100％幼虫死亡率。对于所有其它靶而言，与对照gfp dsRNA、仅0.05％Trition X-100或仅未经处理的叶相比，在11天时都达到了显著高的死亡率值：(百分比平均值±α0.05置信区间)PC001(94.4±8.2)；PC003(86.1±4.1)；PC005(83.3±7.8)；PC014(63.9±20.6)；PC016(75.0±16.8)；gfp dsRNA(11.1±8.2)；0.05％Triton X-100(19.4±10.5)；仅叶(8.3±10.5)。

基于其平均重量来评定幼虫存活者。对于测试的所有靶而言，在生物测定的第4天后，白芥叶甲虫都具有显著降低的平均重量；而喂饲对照gfpdsRNA或仅0.05％Triton X-100的昆虫都发育正常，与在仅叶上的幼虫一样(图1(b)-PC)。

D.使用油菜叶盘，针对对辣根猿叶甲幼虫的活性，筛选不同浓度的dsRNA的实验室试验

按照上文实施例4D所述，将25μl来自靶PC010或PC027的dsRNA溶液(一系列10倍的浓度，从0.1μg/μl下降到0.1ng/μl)局部应用到油菜叶盘上。作为阴性对照，向叶盘仅施用0.05％Triton X-100。对每种处理而言，对24只白芥叶甲虫新生幼虫进行测试，每孔两只昆虫。将板贮藏于昆虫饲养室中，条件为25±2℃，60±5％的相对湿度和16∶8小时的亮∶暗光周期。在第2天，将幼虫转移到含有新鲜的经dsRNA处理的叶盘的新板上。对靶PC010而言，在第4天，对靶PC027而言，在第5天，将来自每份重复的昆虫转移到含有丰富的未经处理的叶材料的培养皿上。对靶PC010而言，在第2、4、7、8、9和11天对甲虫做出活或死的评定，对靶PC027而言，在第2、5、8、9和12天进行。

以低至1ng dsRNA/μl溶液的浓度，向辣根猿叶甲幼虫喂饲含有两种不同靶(PC010和PC027)的完整裸dsRNA的油菜叶盘均能导致高死亡率，如图2(a)和(b)所示。针对不同浓度dsRNA的百分比平均死亡率值±α0.05时的置信区间，对靶PC010而言，在第11天，0μg/μl：8.3±9.4；0.1μg/μl：100；0.01μg/μl：79.2±20.6；0.001μg/μl：58.3±9.4；0.0001μg/μl：12.5±15.6；对靶PC027而言，在第12天，0μg/μl：8.3±9.4；0.1μg/μl：95.8±8.2；0.01μg/μl：95.8±8.2；0.001μg/μl：83.3±13.3；0.0001μg/μl：12.5±8.2。

E.在适合用于细菌生产昆虫活性双链RNA的载体中克隆MLB基因片段

虽然可以使用包含T7启动子或用于在细菌中高效转录的任何其它启动子的任何载体，但下面的实施例是在用于在细菌宿主中表达双链RNA的载体中克隆对应于MLB基因靶的DNA片段(参考WO 0001846)。

用于扩增靶基因的特异性引物的序列提供于表8中。使用的模板是含有任何靶序列的pCR8/GW/topo载体。在采用下述条件的PCR反应中使用引物：98℃5分钟，接着是30个98℃10秒、55℃30秒和72℃2分钟的循环，接着在72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，平端克隆进用SrfI线性化过的pGNA49A载体(参考WO00188121A1)中，并进行测序。产生的PCR产物的序列对应于表8给出的分别的序列。携带该序列的重组载体被命名为pGBNJ00(待完成)。

用于扩增靶基因片段PC010的特异性引物的序列提供于表8-PC中。所用的模板是含有PC010序列的pCR8/GW/topo载体(SEQ ID NO：253)。在采用下述条件的递降PCR反应中使用引物：95℃1分钟，接着是20个95℃30秒、60℃30秒(并且每个循环温度降低-0.5℃)和72℃1分钟的循环，接着是15个95℃30秒、50℃30秒和72℃1分钟的循环，接着在72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，平端克隆进用Srf I线性化过的pGNA49A载体(参考WO 00188121A1)中，并进行测序。产生的PCR产物的序列对应于表8-PC给出的SEQ ID NO：：488。携带该序列的重组载体被命名为pGCDJ001。

F.在两种菌株大肠杆菌AB309-105中表达和产生双链RNA靶

为了在细菌中表达合适水平的昆虫靶的昆虫活性双链RNA，按照下述流程来进行。在该实验中，使用RNAaseIII缺陷型菌株AB309-105。

AB309-105的转化

在50μl的冰冷化学感染态大肠杆菌菌株AB309-105的等分试样中加入300ng的质粒，并轻柔混合。细胞在冰上孵育20分钟，之后对它们进行37℃5分钟的热激处理，之后将细胞放回到冰上，再放5分钟。向细胞中加入450μl室温SOC培养基，在摇床(250rpm)上于37℃对悬浮液进行1小时孵育。取100μl细菌细胞悬浮液转移至500ml锥形瓶中，其中含有150ml补充有100μg/ml羧苄青霉素抗生素的液体Luria-Bertani(LB)培养基。在Innova4430摇床(250rpm)上于37℃对培养物进行过夜(16至18小时)孵育。

双链RNA在AB309-105中表达的化学诱导

因为存在用于受控表达的所有遗传组分，因此使得在细菌菌株AB309-105中从重组载体pGBNJ003表达双链RNA成为可能。存在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷或IPTG时，T7聚合酶能驱动靶序列以反义和正义方向的转录，因为它们侧翼有相反定向的T7启动子。

使用合适的分光光度计来在600nm处测量过夜细菌培养物的光密度，通过加入新鲜的LB培养基将其调节至该值为1。将50ml该培养物转移到50ml Falcon管中，然后于15℃在3000g对培养物离心10分钟。移出上清液，将细菌沉淀重悬于50ml新鲜的S完全培养基(SNC培养基+5μg/ml胆固醇)中，其中补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG。在室温下对细菌进行2至4小时的诱导。

对细菌的热处理

通过热处理杀死细菌，以最小化对测试板中人工膳食造成污染的风险。但是，对表达双链RNA的细菌的热处理并非诱导RNA干扰导致的对昆虫的毒性的先决条件。于室温下在3000g对经诱导的细菌培养物进行10分钟离心，弃去上清液，在水浴中使沉淀进行20分钟的80℃处理。热处理之后，将细菌沉淀重悬于总体积50ml 0.05％Triton X-100溶液中。将管贮存于4℃直到进一步使用。

G.实验室试验，以测试针对辣根猿叶甲，表达dsRNA靶的大肠杆菌

叶盘生物测定

用叶盘生物测定方法来测试来自大肠杆菌中产生的靶PC010的双链RNA(来自质粒pGCDJ001)对白芥叶甲虫幼虫的抵挡。按照实施例4所述，从油菜叶制备叶盘。将20μl细菌悬浮液(在600nm波长处测量的光密度为1)移液到每个盘上。将叶盘放置于含有1ml经胶凝琼脂的24多孔板的孔中。每个叶盘上加入两只新生幼虫。对每种处理而言，制备3份重复，每份重复16只新生幼虫。将板放置于昆虫饲养室中，条件为25±2℃，60±5％的相对湿度和16∶8小时的亮∶暗光周期。在第3天(即生物测定开始后3天)，将幼虫转移到含有新鲜的经处理(同样剂量)叶盘的新板上。从第5天起每隔一天更新叶材料。针对死亡率和平均重量对生物测定评分。阴性对照是用携带质粒pGN29(空载体)的细菌处理的叶盘和仅给予叶的情况。

昆虫在用含质粒pGCDJ001的RNaseIII缺陷型大肠杆菌菌株AB309-105的悬浮液处理过的油菜叶上进食后，显示出了辣根猿叶甲幼虫死亡率随时间的明显增加，而在含质粒pGN29的细菌或仅叶对照的情况下仅观察到很少的昆虫死亡率或者没有死亡(图3-PC)。

基于植物的生物测定

在将植物喂饲给MLB之前，用经化学诱导的表达dsRNA的细菌的悬浮液对整株植物喷雾。在植物培养室中种植植物。将500ml塑料瓶顶部朝下放到植物上，瓶颈稳固放进盆中的土壤中，瓶底切开，盖上细尼龙网以允许通风、降低内部冷凝以及防止幼虫逃脱，由此为植物搭建笼子。向笼中每株经处理植物上放上MLB。用携带有pGBNJ001质粒或pGN29质粒的大肠杆菌AB309-105的悬浮液来处理植物。向植物应用不同量的细菌：例如66、22和7个单位，其中，一个单位被定义为：600nm波长下，光密度值为1的1ml细菌悬浮液中，10⁹个细菌细胞。每种情况下，在喷雾器协助下将1至10ml之间的总体积喷雾到植物上。在该试验中，每种处理使用一株植物。对存活者的数量加以计数，记录每只存活者的重量。

用表达来自pGBNJ003的靶dsRNA的大肠杆菌细菌菌株AB309-105的悬浮液对植物进行喷雾，导致昆虫死亡率较之pGN29对照的显著增加。这些实验显示，在野生型或RNaseIII缺陷型细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，这表现在昆虫死亡率的高度增加以及幼虫存活者生长/发育的延迟上。从这些实验中还显而易见：提供了使用制剂喷雾来有效保护植物/作物免受昆虫损伤的范例，所述制剂由表达对应于昆虫基因靶的双链RNA的细菌组成。

实施例5：墨西哥豆瓢虫(墨西哥豆甲)

A.克隆墨西哥豆瓢虫的部分基因序列

按照厂商说明书，使用TRIzol试剂(目录Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，从墨西哥豆瓢虫(墨西哥豆甲；来源：Thomas Dorsey，Supervising Entomologist，NewJersey Department of Agriculture，Division of Plant Industry，Bureau ofBiological Pest Control，Phillip Alampi Beneficial Insect Laboratory，POBox 330，Trenton，New Jersey 08625-0330，USA)的四种不同幼虫期分离高质量的完整RNA。按照厂商说明书(目录Nr.1700，普洛麦格公司(Promega))，通过DNase处理，除去RNA制备中存在的基因组DNA。按照厂商说明书，使用可商购试剂盒(SuperScript^TMIII逆转录酶，目录Nr.18080044，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，产生cDNA。

为分离出包含EV005、EV009、EV010、EV015和EV016基因的部分的cDNA序列，按照厂商说明书，使用Amplitaq Gold(目录Nr.N8080240，应用生物系统公司(Applied Biosystems))，用简并引物进行一系列PCR反应。

用于扩增每条基因的简并引物的序列给于表2-EV中，该表展示了墨西哥豆瓢虫靶基因，包括引物序列和获得的cDNA序列。这些引物用于各PCR反应中，其中采用如下条件：对于EV005和EV009而言，95℃10分钟，接着进行40个95℃30秒、50℃1分钟和72℃1分30秒的循环，接着在72℃7分钟；对EV014而言，95℃10分钟，接着进行40个95℃30秒、53℃1分钟和72℃1分钟的循环，接着在72℃7分钟；对EV010和EV016而言，95℃10分钟，接着进行40个95℃30秒、54℃1分钟和72℃1分40秒的循环，接着在72℃7分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，将其纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，克隆进pCR4/TOPO载体(目录Nr.K4530-20，英杰生命科学公司(Invitrogen))，并测序。得到的PCR产物的序列由表2-EV给出的各SEQ ID NO示出，它们被称为部分序列。相应的部分氨基酸序列由表3-EV中给出的各SEQ ID NO示出，其中，读框的起点用括号示出。

B.墨西哥豆瓢虫基因的dsRNA产生

使用可商购试剂盒T7Ribomax^TMExpress RNAi系统(目录Nr.P1700，普洛麦格公司(Promega))，合成毫克级的dsRNA。首先，在两个分别的PCR反应中产生两种分别的单5′T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有相对T7启动子而言不同方向的靶序列。

就每种靶基因而言，使用特异性的T7正向引物和特异性的反向引物来产生正义T7模板。用于扩增每种靶基因的正义模板的各引物的序列给于表8-EV中。

PCR反应条件如下所述：95℃1分钟，接着是20个95℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是15个95℃30秒、50℃30秒和72℃1分钟的循环，接着在72℃10分钟。在采用与上述相同的条件的PCR反应中，使用特异性正向引物和特异性T7反向引物来产生反义T7模板。用于扩增每种靶基因的反义模板的各引物的序列给于表8-EV中。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR产物，通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，目录Nr.28106，快而精公司(Qiagen))对其进行纯化，并进行NaClO₄沉淀。将产生的T7正向和反向模板混合起来以被转录，将得到的RNA链退火，用DNase和RNase进行处理，并且通过乙酸钠纯化，这都按照厂商说明书来进行。针对每种靶基因得到的dsRNA的正义链示于表8-EV中。

C.使用豆叶盘，针对对墨西哥豆瓢虫幼虫的活性，测试dsRNA靶的实验室试验

下文提供的实施例是对下述发现的示例：墨西哥豆甲(MBB)幼虫对于口服摄入的对应于其自身靶基因的dsRNA易感。

为测试不同的双链RNA样品对MBB幼虫的抵挡，使用食荚菜豆(菜豆(Phaseolus vulgaris)品种Montano；来源：Aveve NV，Belgium)叶材料作为食物来源，进行叶盘测定。用同品种的豆，将昆虫培养物保持在昆虫室中，条件为25±2℃，60±5％的相对湿度和16小时亮/8小时暗的光周期。使用大小合适的穿孔器，从1-2周龄的豆植物叶上切下直径大约为1.1cm(或0.95cm²)的盘。在含有0.05％Triton X-100的Milli-Q水中，将双链RNA样品稀释至1μg/μl。通过在近轴叶表面应用25μl靶Ev005、Ev010、Ev015、Ev016dsRNA和对照gfp dsRNA或0.05％Triton X-100的经稀释溶液，来制备经处理的叶盘。令叶盘干燥，单独放置于24孔板的24个孔的每个中，其中含有1ml已胶凝的2％琼脂，帮助防止叶盘干掉。向板的每个孔中放入一只新生MBB幼虫，然后用多孔塑料盖盖上。将板分为一式三份重复，每份重复8只昆虫(每排)。将含有昆虫和叶盘的板保持于昆虫室中，条件为25±2℃，60±5％的相对湿度和16小时亮/8小时暗的光周期。令昆虫在叶盘上进食2天，之后将昆虫转移至含有新鲜的经处理叶盘的新板上。之后，生物测定开始后4天，每天都将昆虫转移至含有未经处理的新鲜豆叶的培养板上，直到第10天。在第2天以及之后每隔一天，记录昆虫死亡率。

向墨西哥豆瓢虫幼虫喂饲含有表面应用的完整裸露的靶dsRNA的食荚菜豆叶导致幼虫死亡率显著增加，如图1所示。在8天后，测试的靶Ev010、Ev015和Ev016的双链RNA都导致了100％的死亡率，而靶Ev005的dsRNA杀死所有幼虫用了10天。在含有对照gfp dsRNA或仅表面活性Triton X-100的处理过的叶盘上喂饲的昆虫中的大部分都在生物测定中得以维持下来(图1-EV)。

D.使用豆叶盘，针对对墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)成虫的活性，测试dsRNA靶的实验室试验

下文提供的实施例是对下述发现的示例：墨西哥豆甲成虫对于口服摄入的对应于其自身靶基因的dsRNA易感。

在设置与针对墨西哥豆甲幼虫的生物测定类似的生物测定中，针对局部应用给豆叶盘的双链RNA，对成年MBB进行测试。在0.05％TritonX-100中将来自每种靶Ev010、Ev015和Ev016的测试dsRNA稀释至终浓度为0.1μg/μl。通过向每个盘上局部应用30μl测试溶液来处理豆叶盘。令盘完全干燥，之后将每个放到24孔多孔板每个孔中经胶凝的2％琼脂片上。从培养笼中收集三日龄的成虫，禁食7-8小时，之后向生物测定板的每个孔中放入一只成虫(由此每种处理24只成虫)。将板保持于昆虫饲养室中(在与用于MBB幼虫的条件相同的条件下放24小时)，之后将成虫转移到含有新鲜的经dsRNA处理的叶盘的新板中。再24小时之后，收集来自每种处理的成虫，将其放在大小为30cm×15cm×10cm的塑料盒中，所述盒中含有两株罐装的、未经处理的3周龄的豆植物。从第4天到第11天，评定昆虫死亡率。

从第4天开始(生物测定开始后4天)，墨西哥豆瓢虫成虫摄入的所有三种靶dsRNA(Ev010、Ev015和Ev016)都导致死亡率显著增加，如图2(a)-EV所示。从第5天，在最初喂饲经靶dsRNA处理的豆叶盘的昆虫和喂饲含有对照gfp dsRNA或表面活性剂Triton X-100的昆虫之间，观察到进食模式的显著改变。与gfp dsRNA和仅表面活性剂对照相比时，针对所有三种靶都清楚观察到，MBB成虫对未经处理的豆植物的叶损伤有所降低，虽然降低水平有所不同；喂饲靶15的昆虫导致对豆叶的最小损伤(图2(b)-EV)。

E.在适合用于细菌生产昆虫活性双链RNA的载体中克隆MBB基因片段

虽然可以使用包含T7启动子或用于在细菌中高效转录的任何其它启动子的任何载体，但下面的实施例是在用于在细菌宿主中表达双链RNA的载体中克隆对应于MBB基因靶的DNA片段(参考WO 00001846)。

用于扩增靶基因的特异性引物的序列提供于表8-EV中。使用的模板是含有任何靶序列的pCR8/GW/topo载体。在采用下述条件的PCR反应中使用引物：98℃5分钟，接着是30个98℃10秒、55℃30秒和72℃2分钟的循环，接着在72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，平端克隆进用SrfI线性化过的pGNA49A载体(参考WO00188121A1)中，并进行测序。产生的PCR产物的序列对应于表8-EV给出的分别的序列。携带该序列的重组载体被命名为pGBNJ00XX。

F.在两种大肠杆菌菌株：(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表达和产生双链RNA靶

为了在细菌中表达合适水平的昆虫靶的昆虫活性双链RNA，按照下述流程来进行。将RNAaseIII缺陷型菌株AB309-105与野生型含RNaseIII细菌BL21(DE3)进行比较。

转化AB309-105和BL21(DE3)

在50μl的冰冷化学感染态大肠杆菌菌株AB309-105或BL21(DE3)的等分试样中加入300ng的质粒，轻柔混合。细胞在冰上孵育20分钟，之后对它们进行37℃5分钟的热激处理，之后将细胞放回到冰上，再放5分钟。向细胞中加入450μl室温SOC培养基，在摇床(250rpm)上于37℃对悬浮液进行1小时孵育。取100μl细菌细胞悬浮液转移至500ml锥形瓶中，其中含有150ml补充有100μg/ml羧苄青霉素抗生素的液体Luria-Bertani(LB)培养基。在Innova 4430摇床(250rpm)上于37℃对培养物进行过夜(16至18小时)孵育。

双链RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表达的化学诱导

因为存在用于受控表达的所有遗传组分，因此使得在细菌菌株AB309-105或BL21(DE3)中从重组载体pGBNJ003表达双链RNA成为可能。存在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷或IPTG时，T7聚合酶能驱动靶序列以反义和正义方向的转录，因为它们侧翼有相反定向的T7启动子。

使用合适的分光光度计来在600nm处测量过夜细菌培养物的光密度，通过加入新鲜的LB培养基将其调节至该值为1。将50ml该培养物转移到50ml Falcon管中，然后于15℃在3000g对培养物离心10分钟。移出上清液，将细菌沉淀重悬于50ml新鲜的S完全培养基(SNC培养基+5μg/ml胆固醇)中，其中补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG。在室温下对细菌进行2至4小时的诱导。

对细菌的热处理

通过热处理杀死细菌，以最小化对测试板中人工膳食造成污染的风险。但是，对表达双链RNA的细菌的热处理并非诱导RNA干扰导致的对昆虫的毒性的先决条件。于室温下在3000g对经诱导的细菌培养物进行10分钟离心，弃去上清液，在水浴中使沉淀进行20分钟的80℃处理。热处理之后，将细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，将悬浮液转移至微离心管。制备若干管，在生物测定中用于每次更新。将管贮存于-20℃直到进一步使用。

G.实验室试验，以测试针对墨西哥豆瓢虫，表达dsRNA靶的大肠杆菌

基于植物的生物测定

在将植物喂饲给MBB之前，用经化学诱导的表达dsRNA的细菌的悬浮液对整株植物喷雾。在植物培养室中种植植物。将500ml塑料瓶顶部朝下放到植物上，瓶颈稳固放进盆中的土壤中，瓶底切开，盖上细尼龙网以允许通风、降低内部冷凝以及防止幼虫逃脱，由此为植物搭建笼子。向笼中每株经处理植物上放上MMB。用携带有pGBNJ001质粒或pGN29质粒的大肠杆菌AB309-105的悬浮液来处理植物。向植物应用不同量的细菌：例如66、22和7个单位，其中，一个单位被定义为：600nm波长下，光密度值为1的1ml细菌悬浮液中，10⁹个细菌细胞。每种情况下，在喷雾器协助下将1至10ml之间的总体积喷雾到植物上。在该试验中，每种处理使用一株植物。对存活者的数量加以计数，记录每只存活者的重量。

用表达来自pGBNJ003的靶dsRNA的大肠杆菌细菌菌株AB309-105的悬浮液对植物进行喷雾，导致昆虫死亡率较之pGN29对照的显著增加。这些实验显示，在野生型或RNaseIII缺陷型细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，这表现在昆虫死亡率的高度增加以及幼虫存活者生长/发育的延迟上。从这些实验中还显而易见：提供了使用制剂喷雾来有效保护植物/作物免受昆虫损伤的范例，所述制剂由表达对应于昆虫基因靶的双链RNA的细菌组成。

实施例6：墨西哥棉铃象(棉铃象虫甲)

A.克隆墨西哥棉铃象的部分序列

按照厂商说明书，使用TRIzol试剂(目录Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，从墨西哥棉铃象(棉铃象虫甲；来源：Dr.Gary Benzon，Benzon Research Inc.，7KuhnDrive，Carlisle，Pennsylvania 17013，USA)的第三龄虫分离高质量的完整RNA。按照厂商说明书，通过DNase(目录Nr.1700，普洛麦格公司(Promega))处理，除去RNA制备中存在的基因组DNA。按照厂商说明书，使用可商购试剂盒(SuperScript^TMIII逆转录酶，目录Nr.18080044，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，产生cDNA。

为分离出包含AG001、AG005、AG010、AG014和AG016基因的部分的cDNA序列，按照厂商说明书，使用Amplitaq Gold(目录Nr.N8080240，应用生物系统公司(Applied Biosystems))，用简并引物进行一系列PCR反应。

用于扩增每条基因的简并引物的序列给于表2-AG中。这些引物用于各PCR反应中，其中采用如下条件：对AG001、AG005和AG016而言，95℃10分钟，接着进行40个95℃30秒、50℃1分钟和72℃1分30秒的循环，接着在72℃7分钟；对于AG010而言，95℃10分钟，接着进行40个95℃30秒、54℃1分钟和72℃2分30秒的循环，接着在72℃7分钟；对于AG014而言，95℃10分钟，接着进行40个95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分种的循环，接着在72℃7分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，将其纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，克隆进pCR8/GW/TOPO载体(目录Nr.K2500-20，英杰生命科学公司(Invitrogen))，并测序。得到的PCR产物的序列由表2-AG给出的各SEQID NO：示出，它们被称为部分序列。相应的部分氨基酸序列由表3-AG中给出的各SEQ ID NO：示出。

B.墨西哥棉铃象(棉铃象虫甲)基因的dsRNA产生

使用可商购试剂盒T7Ribomax^TMExpress RNAi系统(目录Nr.P1700，普洛麦格公司(Promega))，合成毫克级的dsRNA。首先，在两个分别的PCR反应中产生两种分别的单5′T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有相对T7启动子而言不同方向的靶序列。

就每种靶基因而言，使用特异性的T7正向引物和特异性的反向引物来产生正义T7模板。用于扩增每种靶基因的正义模板的各引物的序列给于表8-AG中。按照下文所述来进行递降PCR：95℃1分钟，接着是20个95℃30秒、60℃30秒(并且每个循环温度降低0.5℃)和72℃1分钟的循环，接着是15个95℃30秒、50℃30秒和72℃1分钟的循环，接着在72℃10分钟。在采用与上述相同的条件的PCR反应中，使用特异性正向引物和特异性T7反向引物来产生反义T7模板。用于扩增每种靶基因的反义模板的各引物的序列给于表8-AG中。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR产物，通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，目录Nr.28106，快而精公司(Qiagen))对其进行纯化，并进行NaClO₄沉淀。将产生的T7正向和反向模板混合起来以被转录，将得到的RNA链退火，用DNase和RNase进行处理，并且通过乙酸钠纯化，这都按照厂商说明书来进行。针对每种靶基因得到的dsRNA的正义链示于表8-AG中。

C.使用人工膳食，针对对家蟋蟀居屋艾蟋幼虫的活性的测试dsRNA靶的实验室试验

将家蟋蟀居屋艾蟋保持于昆虫研究有限公司(Insect InvestigationsLtd.)(来源：Blades Biological Ltd.，Kent，UK)。在麸皮团块和甘蓝叶上饲养昆虫。选出大小等同并且不超过5日龄的混合性别蛹，用于该试验。将双链RNA与基于小麦团块的啮齿动物膳食(大鼠和小鼠标准膳食，B&K总公司(B&K Universal Ltd.)，Grimston，Aldbrough，Hull，UK)混合。膳食BK001P含有下述成分，它们的重量依次降低：小麦、大豆、麸皮粉、大麦、团块粘合剂、啮齿动物5维生素、脂肪掺合物、磷酸二钙、防霉剂(mould carb)。为使得任何酶组分失活，将团块啮齿动物膳食细致碾碎，在微波炉中进行热处理，之后混合起来。所有啮齿动物膳食都取自同一批，以确保一致性。将经碾碎的膳食和dsRNA彻底混合起来，成型为等重小团块，令它们在室温下干燥过夜。

浓度为10μg/μl的、来自靶和gfp对照的双链RNA以1g经碾碎膳食加1ml dsRNA溶液的比例应用，由此使得应用比例为每g团块10mg dsRNA。每周替换团块。试验的前三周向昆虫提供经处理的团块。之后提供未经处理的团块。在有盖塑料容器(9cm直径，4.5cm深)中保持昆虫，每个容器十只昆虫。每片场地含有一份经处理的饵料团块以及一份水源(湿的棉絮球)，每片场地都放在各小称量盘中。整个实验期间水无限制补充。

以每周两次的间隔进行评定，评定之间不超过4天，直到所有对照昆虫都死亡或蜕变为成年期(84天)。在每次评定中，昆虫被评定为活的或死的，针对异常现象对它们加以检查。从第46天起，一旦开始向成虫蜕变，所有昆虫(活的和死的)就被评定为蛹或成虫。在试验的第55天对存活昆虫加以称重。每种处理采用一式四份重复。在试验期间，测试条件为25至33℃，20至25％的相对湿度，以及12∶12小时的亮∶暗光周期。

D.在适合用于细菌生产昆虫活性双链RNA的载体中克隆MLB基因片段

虽然可以使用包含T7启动子或用于在细菌中高效转录的任何其它启动子的任何载体，但下面的实施例是在用于在细菌宿主中表达双链RNA的载体中克隆对应于MBB基因靶的DNA片段(参考WO 00001846)。

用于扩增靶基因的特异性引物的序列提供于表8中。使用的模板是含有任何靶序列的pCR8/GW/topo载体。在采用下述条件的PCR反应中使用引物：98℃5分钟，接着是30个98℃10秒、55℃30秒和72℃2分钟的循环，接着在72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，平端克隆进用SrfI线性化过的pGNA49A载体(参考WO00188121A1)中，并进行测序。产生的PCR产物的序列对应于表8给出的分别的序列。携带该序列的重组载体被命名为pGBNJ00XX。

E.在两种大肠杆菌菌株：(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表达和产生双链RNA靶

为了在细菌中表达合适水平的昆虫靶的昆虫活性双链RNA，按照下述流程来进行。将RNAaseIII缺陷型菌株AB309-105与野生型含RNaseIII细菌BL21(DE3)进行比较。

转化AB309-105和BL21(DE3)

在50μl的冰冷化学感染态大肠杆菌菌株AB309-105或BL21(DE3)的等分试样中加入300ng的质粒，轻柔混合。细胞在冰上孵育20分钟，之后对它们进行37℃5分钟的热激处理，之后将细胞放回到冰上，再放5分钟。向细胞中加入450μl室温SOC培养基，在摇床(250rpm)上于37℃对悬浮液进行1小时孵育。取100μl细菌细胞悬浮液转移至500ml锥形瓶中，其中含有150ml补充有100μg/ml羧苄青霉素抗生素的液体Luria-Bertani(LB)培养基。在Innova 4430摇床(250rpm)上于37℃对培养物进行过夜(16至18小时)孵育。

双链RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表达的化学诱导

因为存在用于受控表达的所有遗传组分，因此使得在细菌菌株AB309-105或BL21(DE3)中从重组载体pGBNJ003表达双链RNA成为可能。存在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷或IPTG时，T7聚合酶能驱动靶序列以反义和正义方向的转录，因为它们侧翼有相反定向的T7启动子。

使用合适的分光光度计来在600nm处测量过夜细菌培养物的光密度，通过加入新鲜的LB培养基将其调节至该值为1。将50ml该培养物转移到50ml Falcon管中，然后于15℃在3000g对培养物离心10分钟。移出上清液，将细菌沉淀重悬于50ml新鲜的S完全培养基(SNC培养基+5μg/ml胆固醇)中，其中补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG。在室温下对细菌进行2至4小时的诱导。

对细菌的热处理

通过热处理杀死细菌，以最小化对测试板中人工膳食造成污染的风险。但是，对表达双链RNA的细菌的热处理并非诱导RNA干扰导致的对昆虫的毒性的必要条件。于室温下在3000g对经诱导的细菌培养物进行10分钟离心，弃去上清液，在水浴中使沉淀进行20分钟的80℃处理。热处理之后，将细菌沉淀团重悬于1.5ml MilliQ水中，将悬浮液转移至微离心管。制备若干管，在生物测定中用于每次更新。将管贮存于-20℃直到进一步使用。

F.实验室试验，以测试针对墨西哥棉铃象，表达dsRNA靶的大肠杆菌

基于植物的生物测定

在将植物喂饲给CBW之前，用经化学诱导的表达dsRNA的细菌的悬浮液对整株植物喷雾。在植物培养室中种植植物。将500ml塑料瓶顶部朝下放到植物上，瓶颈稳固放进盆中的土壤中，瓶底切开，盖上细尼龙网以允许通风、降低内部冷凝以及防止幼虫逃脱，由此为植物搭建笼子。向笼中每株经处理植物上放上CBW。用携带有pGBNJ001质粒或pGN29质粒的大肠杆菌AB309-105的悬浮液来处理植物。向植物应用不同量的细菌：例如66、22和7个单位，其中，一个单位被定义为：600nm波长下，光密度值为1的1ml细菌悬浮液中，10⁹个细菌细胞。每种情况下，在喷雾器协助下将1至10ml之间的总体积喷雾到植物上。在该试验中，每种处理使用一株植物。对存活者的数量加以计数，记录每只存活者的重量。

用表达来自pGBNJ003的靶dsRNA的大肠杆菌细菌菌株AB309-105的悬浮液对植物进行喷雾，导致昆虫死亡率较之pGN29对照的显著增加。这些实验显示，在野生型或RNaseIII缺陷型细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，这表现在昆虫死亡率的高度增加以及幼虫存活者生长/发育的延迟上。从这些实验中还显而易见：提供了使用制剂喷雾来有效保护植物/作物免受昆虫损伤的范例，所述制剂由表达对应于昆虫基因靶的双链RNA的细菌组成。

实施例7：赤拟谷盗(赤拟谷盗)

A.克隆赤拟谷盗的部分序列

按照厂商说明书，使用TRIzol试剂(目录Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，从赤拟谷盗(赤拟谷盗；来源：Dr.Lara Senior，Insect Investigations Ltd.，CapitalBusiness Park，Wentloog，Cardiff，CF3 2PX，Wales，UK)的所有不同昆虫期分离高质量的完整RNA。按照厂商说明书(目录Nr.1700，普洛麦格公司(Promega))，通过DNase处理，除去RNA制备中存在的基因组DNA。按照厂商说明书，使用可商购试剂盒(SuperScript^TMIII逆转录酶，目录Nr.18080044，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，产生cDNA。

为分离出包含TC001、TC002、TC010、TC014和TC015基因的部分的cDNA序列，按照厂商说明书，使用Amplitaq Gold(目录Nr.N8080240，应用生物系统公司(Applied Biosystems))，用简并引物进行一系列PCR反应。

用于扩增每条基因的简并引物的序列给于表2-TC中。这些引物用于各PCR反应中，其中采用如下条件：95℃10分钟，接着进行40个95℃30秒、50℃1分钟和72℃1分30秒的循环，接着在72℃7分钟(TC001、TC014、TC015)；95℃10分钟，接着进行40个95℃30秒、54℃1分钟和72℃2分30秒的循环，接着在72℃7分钟(TC010)；95℃10分钟，接着进行40个95℃30秒、53℃1分钟和72℃1分钟的循环，接着在72℃7分钟(TC002)。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，将其纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，克隆进pCR8/GW/TOPO载体(目录Nr.K2500-20，英杰生命科学公司(Invitrogen))，并测序。得到的PCR产物的序列由表2-TC给出的各SEQID NO：示出，它们被称为部分序列。相应的部分氨基酸序列由表3-TC中给出的各SEQ ID NO：示出。

B.赤拟谷盗基因的dsRNA产生

使用可商购试剂盒T7Ribomax^TMExpress RNAi系统(目录Nr.P1700，普洛麦格公司(Promega))，合成毫克级的dsRNA。首先，在两个分别的PCR反应中产生两种分别的单5′T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有相对T7启动子而言不同方向的靶序列。

就每种靶基因而言，使用特异性的T7正向引物和特异性的反向引物来产生正义T7模板。用于扩增每种靶基因的正义模板的各引物的序列给于表8-TC中。PCR反应条件如下所述：95℃1分钟，接着是20个95℃30秒、60℃30秒(-0.5℃/循环)和72℃1分钟的循环，接着是15个95℃30秒、50℃30秒和72℃1分钟的循环，接着在72℃10分钟。在采用与上述相同的条件的PCR反应中，使用特异性正向引物和特异性T7反向引物来产生反义T7模板。用于扩增每种靶基因的反义模板的各引物的序列给于表8-TC中。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR产物，通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCRPurification Kit，目录Nr.28106，快而精公司(Qiagen))对其进行纯化，并进行NaClO₄沉淀。将产生的T7正向和反向模板混合起来以被转录，将得到的RNA链退火，用DNase和RNase进行处理，并且通过乙酸钠纯化，这都按照厂商说明书来进行。针对每种靶基因得到的dsRNA的正义链示于表8-TC中。

C.使用人工膳食，针对对赤拟谷盗幼虫的活性，测试dsRNA靶的实验室试验

下文提供的实施例是对下述发现的示例：赤拟谷盗(RFB)幼虫对于口服摄入的对应于其自身靶基因的dsRNA易感。

将赤拟谷盗保持于昆虫研究有限公司(Insect Investigations Ltd.)(来源：Imperial College of Science，Technology and Medicine，Silwood Park，Berkshire，UK)。按照公司SOP/251/01来培养昆虫。简言之，将甲虫放在塑料广口瓶或桶中。这些具有敞开的顶端以允许空气流通。在顶部罩上一层网，用弹性条带加固，以防止逃脱。将幼虫饲养培养基(面粉)放在养育甲虫的容器中。在温控室中保持储藏的产物甲虫群落，所述在25±3℃以及16∶8小时的亮∶暗周期下进行。

将来自靶TC014的双链RNA(具有对应于SEQ ID NO：-799的序列)加入到面粉和奶粉混合物(全麦面粉：奶粉比例为4：1)中，令其干燥过夜。每份重复分别制备：向0.1g面粉/奶混合物中加入100μl10μg/μl dsRNA溶液(1mg dsRNA)。将干燥的混合物碾碎为细粉。将昆虫保持在培养皿(55mm直径)中，用双层滤纸作衬里。将经处理的膳食放在两层滤纸之间。每个培养皿(重复)中放入十只第一龄的性别混合的幼虫。对于每种处理而言采用一式四份重复。对照是Milli-Q水。基于常规进行评定(存活者数量)。试验期间，测试条件为25-33℃和20-25％的相对湿度以及12∶12小时的亮∶暗光周期。

如图1所示，较之仅膳食的对照，赤拟谷盗幼虫在经靶TC014dsRNA处理过的人工膳食上的存活随时间显著降低。

D.在适合用于细菌生产昆虫活性双链RNA的载体中克隆RFB基因片段

虽然可以使用包含T7启动子或用于在细菌中高效转录的任何其它启动子的任何载体，但下面的实施例是在用于在细菌宿主中表达双链RNA的载体中克隆对应于RFB基因靶的DNA片段(参考WO 00001846)。

用于扩增靶基因的特异性引物的序列提供于表8-TC中。使用的模板是含有任何靶序列的pCR8/GW/topo载体。在采用下述条件的PCR反应中使用引物：98℃5分钟，接着是30个98℃10秒、55℃30秒和72℃2分钟的循环，接着在72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，平端克隆进用SrfI线性化过的pGNA49A载体(参考WO00188121A1)中，并进行测序。产生的PCR产物的序列对应于表8-TC给出的分别的序列。携带该序列的重组载体被命名为pGBNJ00XX。

E.在两种大肠杆菌菌株：(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表达和产生双链RNA靶

为了在细菌中表达合适水平的昆虫靶的昆虫活性双链RNA，按照下述流程来进行。将RNAaseIII缺陷型菌株AB309-105与野生型含RNaseIII细菌BL21(DE3)进行比较。

转化AB309-105和BL21(DE3)

在50μl的冰冷化学感染态大肠杆菌菌株AB309-105或BL21(DE3)的等分试样中加入300ng的质粒，轻柔混合。细胞在冰上孵育20分钟，之后对它们进行37℃5分钟的热激处理，之后将细胞放回到冰上，再放5分钟。向细胞中加入450μl室温SOC培养基，在摇床(250rpm)上于37℃对悬浮液进行1小时孵育。取100μl细菌细胞悬浮液转移至500ml锥形瓶中，其中含有150ml补充有100μg/ml羧苄青霉素抗生素的液体Luria-Bertani(LB)培养基。在Innova 4430摇床(250rpm)上于37℃对培养物进行过夜(16至18小时)孵育。

双链RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表达的化学诱导

因为存在用于受控表达的所有遗传组分，因此使得在细菌菌株AB309-105或BL21(DE3)中从重组载体pGBNJ003表达双链RNA成为可能。存在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷或IPTG时，T7聚合酶能驱动靶序列以反义和正义方向的转录，因为它们侧翼有相反定向的T7启动子。

使用合适的分光光度计来在600nm处测量过夜细菌培养物的光密度，通过加入新鲜的LB培养基将其调节至该值为1。将50ml该培养物转移到50ml Falcon管中，然后于15℃在3000g对培养物离心10分钟。移出上清液，将细菌沉淀重悬于50ml新鲜的S完全培养基(SNC培养基+5μg/ml胆固醇)中，其中补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG。在室温下对细菌进行2至4小时的诱导。

对细菌的热处理

通过热处理杀死细菌，以最小化对测试板中人工膳食造成污染的风险。但是，对表达双链RNA的细菌的热处理并非诱导RNA干扰导致的对昆虫的毒性的先决条件。于室温下在3000g对经诱导的细菌培养物进行10分钟离心，弃去上清液，在水浴中使沉淀进行20分钟的80℃处理。热处理之后，将细菌沉淀重悬于1.5ml MiniQ水中，将悬浮液转移至微离心管。制备若干管，在生物测定中用于每次更新。将管贮存于-20℃直到进一步使用。

F.实验室试验，以测试针对赤拟谷盗，表达dsRNA靶的大肠杆菌

基于植物的生物测定

在将植物喂饲给RFB之前，用经化学诱导的表达dsRNA的细菌的悬浮液对整株植物喷雾。在植物培养室中种植植物。将500ml塑料瓶顶部朝下放到植物上，瓶颈稳固放进盆中的土壤中，瓶底切开，盖上细尼龙网以允许通风、降低内部冷凝以及防止幼虫逃脱，由此为植物搭建笼子。向笼中每株经处理植物上放上RFB。用携带有pGBNJ001质粒或pGN29质粒的大肠杆菌AB309-105的悬浮液来处理植物。向植物应用不同量的细菌：例如66、22和7个单位，其中，一个单位被定义为：600nm波长下，光密度值为1的1ml细菌悬浮液中，10⁹个细菌细胞。每种情况下，在喷雾器协助下将1至10ml之间的总体积喷雾到植物上。在该试验中，每种处理使用一株植物。对存活者的数量加以计数，记录每只存活者的重量。

用表达来自pGBNJ003的靶dsRNA的大肠杆菌细菌菌株AB309-105的悬浮液对植物进行喷雾，导致昆虫死亡率较之pGN29对照的显著增加。这些实验显示，在野生型或RNaseIII缺陷型细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，这表现在昆虫死亡率的高度增加以及幼虫存活者生长/发育的延迟上。从这些实验中还显而易见：提供了使用制剂喷雾来有效保护植物/作物免受昆虫损伤的范例，所述制剂由表达对应于昆虫基因靶的双链RNA的细菌组成。

实施例10：桃蚜(桃蚜)

A.克隆桃蚜的部分序列

按照厂商说明书，使用TRIzol试剂(目录Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，从桃蚜(桃蚜；来源：Dr.Rachel Down，Insect&Pathogen Interactions，CentralScience Laboratory，Sand Hutton，York，YO41 1LZ，UK)的蛹分离高质量的完整RNA。按照厂商说明书(目录Nr.1700，普洛麦格公司(Promega))，通过DNase处理，除去RNA制备中存在的基因组DNA。按照厂商说明书，使用可商购试剂盒(SuperScript^TMIII逆转录酶，目录Nr.18080044，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，产生cDNA。

为分离出包含MP001、MP002、MP010、MP016和MP027基因的部分的cDNA序列，按照厂商说明书，使用Amplitaq Gold(目录Nr.N8080240，应用生物系统公司(Applied Biosystems))，用简并引物进行一系列PCR反应。

用于扩增每条基因的简并引物的序列给于表2-MP中。这些引物用于各PCR反应中，其中采用如下条件：对MP001、MP002和MP016而言，95℃10分钟，接着进行40个95℃30秒、50℃1分钟和72℃1分30秒的循环，接着在72℃7分钟；对MP027而言，使用递降程序：95℃10分钟，接着是10个95℃30秒、60℃40秒(每个循环温度降低1℃)和72℃1分10秒的循环，接着是30个95℃30秒、50℃40秒和72℃1分10秒的循环，接着是72℃7分钟；对于MP010而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、54℃1分钟和72℃3分钟的循环，接着是72℃7分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，将其纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，克隆进pCR8/GW/TOPO载体(目录Nr.K2500-20，英杰生命科学公司(Invitrogen))，并测序。得到的PCR产物的序列由表2-MP给出的各SEQ ID NO示出，它们被称为部分序列。相应的部分氨基酸序列由表3-MP中给出的各SEQ ID NO示出。

B.桃蚜基因的dsRNA产生

使用可商购试剂盒T7Ribomax^TMExpress RNAi系统(目录Nr.P1700，普洛麦格公司(Promega))，合成毫克级的dsRNA。首先，在两个分别的PCR反应中产生两种分别的单5′T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有相对T7启动子而言不同方向的靶序列。

就每种靶基因而言，使用特异性的T7正向引物和特异性的反向引物来产生正义T7模板。用于扩增每种靶基因的正义模板的各引物的序列给于表8-MP中。如下进行递降PCR：95℃1分钟，接着是20个95℃30秒、55℃30秒(对于MP001、MP002、MP016、MP027和gfp而言)或50℃30秒(对MP010而言)(每个循环温度降低0.5℃)和72℃1分钟的循环，接着是15个95℃30秒、45℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟。在采用与上述相同的条件的PCR反应中，使用特异性正向引物和特异性T7反向引物来产生反义T7模板。用于扩增每种靶基因的反义模板的各引物的序列给于表8-MP中。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR产物，通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，目录Nr.28106，快而精公司(Qiagen))对其进行纯化，并进行NaClO₄沉淀。将产生的T7正向和反向模板混合起来以被转录，将得到的RNA链退火，用DNase和RNase进行处理，并且通过乙酸钠纯化，这都按照厂商说明书来进行。针对每种靶基因得到的dsRNA的正义链示于表8-MP中。

C.使用液体人工膳食，针对对桃蚜的活性，测试dsRNA靶的实验室试验

按照Febvay等人(1988)[Influence of the amino acid balance on theimprovement of an artificial diet for a biotype of A cyrthosiphon pisum(Homoptera：Aphididae).Can.J.Zool.66：2449-2453]所述，稍加一些改变，基于对豌豆蚜(豆无网长管蚜(Acyrthosiphon pisum))合适的膳食来制备用于桃蚜的液体人工膳食。按照下文所述来制备膳食的氨基酸组分：以mg/100ml计，丙氨酸178.71、β-丙氨酸6.22、精氨酸244.9、天冬酰胺298.55、天冬氨酸88.25、半胱氨酸29.59、谷氨酸149.36、谷氨酰胺445.61、甘氨酸166.56、组氨酸136.02、异亮氨酸164.75、亮氨酸231.56、赖氨酸盐酸盐351.09、甲硫氨酸72.35、鸟氨酸(HCl)9.41、苯丙氨酸293、脯氨酸129.33、丝氨酸124.28、苏氨酸127.16、色氨酸42.75、酪氨酸38.63、L-缬氨酸190.85。将氨基酸溶解于30ml Milli-Q水中，除了酪氨酸是在加入到氨基酸混合物之前先溶解于几滴1M HCl中的。按照下文所述，将膳食的维生素混合物组分制备为5x浓缩贮液：以mg/L计，氨基苯甲酸100、抗坏血酸1000、生物素1、泛酸钙50、氯化胆碱500、叶酸10、肌醇420、烟酸100、盐酸吡哆醇25、核黄素5、盐酸硫胺素25。在50℃将核黄素溶解于1mlH₂O中，然后加入到维生素混合物贮液中。将维生素混合物分为每份20ml的等分试样，贮存于-20℃。取一份维生素混合物加入到氨基酸溶液中。按照分别为20g和242mg的量向该混合物中加入蔗糖和MgSO₄.7H₂O。按照下文所述来制备痕量金属贮液：以mg/100ml计，CuSO₄.5H₂O 4.7、FeCl₃.6H₂O 44.5、MnCl₂.4H₂O 6.5、NaCl 25.4、ZnCl₂8.3。向膳食中加入10ml痕量金属溶液和250mg KH₂PO₄，再加入Milli-Q水，至最终液体膳食体积为100ml。用1M KOH溶液将膳食的pH调节为7。通过0.22μm滤盘(密理博公司(Millipore))上对液体膳食进行过滤灭菌。

在环境受控室的铝框笼(含有70μm的网眼)中，在4-6周龄的油菜(欧洲油菜(Brassica napus)品种SW Oban；来源：Nick Balaam，Sw Seed Ltd.，49North Road，Abington，Cambridge，CBl 6AS，UK)上饲养桃蚜(桃蚜；来源：Dr.Rachel Down，Insect&Pathogen Interactions，Central ScienceLaboratory，Sand Hutton，York，YO41 1LZ，UK)，其中采用下述条件：23±2℃和60±5％的相对湿度，以及16∶8小时的亮∶暗光周期。

在生物测定开始前一天，从饲养笼中收集成虫，将它们放在培养皿中新鲜的独立的油菜叶上，留在昆虫室中过夜。第二天，捡出第一龄蛹，转移到喂饲室中。喂饲室包含10只第一龄蛹，它们被放在小培养皿(直径3cm)中，所述培养皿上盖有单层薄的延伸石蜡膜M，其上加有50μl膳食。用第二层石蜡膜密封该室，在与成虫培养相同的条件下进行孵育。每隔一天更新具有dsRNA的膳食，在第8天，即生物测定开始后第8天评定昆虫的存活。对每种处理而言，同时设立5个生物测定喂饲室(重复)。向膳食中加入的测试和对照(gfp)dsRNA溶液至终浓度为2μg/μl。将喂饲室保持于：23±2℃和60±5％的相对湿度，以及16∶8小时的亮∶暗光周期。通过GraphPadPrism第4版来测定Mann-Whitney检验，以确定靶27(MP027)和gfp dsRNA之间中位数是否确实有显著不同。

在生物测定中，使用喂饲室，向桃蚜的蛹喂饲补充有来自靶27(SEQ IDNO：1061)的完整裸dsRNA的液体人工膳食导致死亡率显著增加，如图1所示。对于靶27、gfp dsRNA和仅膳食的处理而言，存活者的平均百分比分别为2、34和82。使用Mann-whitney检验，将靶027与gfp dsRNA组相比较产生了0.004的单侧P值，这表明靶027的中位数与gfp dsRNA的预计更大的中位数显著不同(P＜0.05)。包括有靶27dsRNA的液体膳食上的桃蚜比仅用膳食喂饲或用含有gfp dsRNA对照的膳食喂饲的那些显著更小(数据未示出)。

D.在适合用于细菌生产昆虫活性双链RNA的载体中克隆GPA基因片段

虽然可以使用包含T7启动子或用于在细菌中高效转录的任何其它启动子的任何载体，但下面的实施例是在用于在细菌宿主中表达双链RNA的载体中克隆对应于GPA基因靶的DNA片段(参考WO 00001846)。

用于扩增靶基因的特异性引物的序列提供于表8-MP中。使用的模板是含有任何靶序列的pCR8/GW/topo载体。在采用下述条件的PCR反应中使用引物：98℃5分钟，接着是30个98℃10秒、55℃30秒和72℃2分钟的循环，接着在72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，平端克隆进用SrfI线性化过的pGNA49A载体(参考WO00188121A1)中，并进行测序。产生的PCR产物的序列对应于表8-MP给出的分别的序列。携带该序列的重组载体被命名为pGBNJ00XX。

E.在两种大肠杆菌菌株：(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表达和产生双链RNA靶

为了在细菌中表达合适水平的昆虫靶的昆虫活性双链RNA，按照下述流程来进行。将RNAaseIII缺陷型菌株AB309-105与野生型含RNaseIII细菌BL21(DE3)进行比较。

转化AB309-105和BL21(DE3)

在50μl的冰冷化学感染态大肠杆菌菌株AB309-105或BL21(DE3)的等分试样中加入300ng的质粒，轻柔混合。细胞在冰上孵育20分钟，之后对它们进行37℃5分钟的热激处理，之后将细胞放回到冰上，再放5分钟。向细胞中加入450μl室温SOC培养基，在摇床(250rpm)上于37℃对悬浮液进行1小时孵育。取100μl细菌细胞悬浮液转移至500ml锥形瓶中，其中含有150ml补充有100μg/ml羧苄青霉素抗生素的液体Luria-Bertani(LB)培养基。在Innova 4430摇床(250rpm)上于37℃对培养物进行过夜(16至18小时)孵育。

双链RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表达的化学诱导

因为存在用于受控表达的所有遗传组分，因此使得在细菌菌株AB309-105或BL21(DE3)中从重组载体pGBNJ003表达双链RNA成为可能。存在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷或IPTG时，T7聚合酶能驱动靶序列以反义和正义方向的转录，因为它们侧翼有相反定向的T7启动子。

使用合适的分光光度计来在600nm处测量过夜细菌培养物的光密度，通过加入新鲜的LB培养基将其调节至该值为1。将50ml该培养物转移到50ml Falcon管中，然后于15℃在3000g对培养物离心10分钟。移出上清液，将细菌沉淀重悬于50ml新鲜的S完全培养基(SNC培养基+5μg/ml胆固醇)中，其中补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG。在室温下对细菌进行2至4小时的诱导。

对细菌的热处理

通过热处理杀死细菌，以最小化对测试板中人工膳食造成污染的风险。但是，对表达双链RNA的细菌的热处理并非诱导RNA干扰导致的对昆虫的毒性的先决条件。于室温下在3000g对经诱导的细菌培养物进行10分钟离心，弃去上清液，在水浴中使沉淀进行20分钟的80℃处理。热处理之后，将细菌沉淀重悬于1.5ml MiniQ水中，将悬浮液转移至微离心管。制备若干管，在生物测定中用于每次更新。将管贮存于-20℃直到进一步使用。

F.实验室试验，以测试针对桃蚜，表达dsRNA靶的大肠杆菌

基于植物的生物测定

在将植物喂饲给GPA之前，用经化学诱导的表达dsRNA的细菌的悬浮液对整株植物喷雾。在植物培养室中种植植物。将500ml塑料瓶顶部朝下放到植物上，瓶颈稳固放进盆中的土壤中，瓶底切开，盖上细尼龙网以允许通风、降低内部冷凝以及防止幼虫逃脱，由此为植物搭建笼子。向笼中每株经处理植物上放上GPA。用携带有pGBNJ001质粒或pGN29质粒的大肠杆菌AB309-105的悬浮液来处理植物。向植物应用不同量的细菌：例如66、22和7个单位，其中，一个单位被定义为：600nm波长下，光密度值为1的1ml细菌悬浮液中，10⁹个细菌细胞。每种情况下，在喷雾器协助下将1至10ml之间的总体积喷雾到植物上。在该试验中，每种处理使用一株植物。对存活者的数量加以计数，记录每只存活者的重量。

用表达来自pGBNJ003的靶dsRNA的大肠杆菌细菌菌株AB309-105的悬浮液对植物进行喷雾，导致昆虫死亡率较之pGN29对照的显著增加。这些实验显示，在野生型或RNaseIII缺陷型细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，这表现在昆虫死亡率的高度增加以及幼虫存活者生长/发育的延迟上。从这些实验中还显而易见：提供了对使用制剂喷雾来有效保护植物/作物免受昆虫损伤的范例，所述制剂由表达对应于昆虫基因靶的双链RNA的细菌组成。

实施例11：褐飞虱(褐稻虱)

A.克隆褐飞虱的部分序列

按照厂商方案，使用可商购试剂盒(SuperScript^TMIII逆转录酶，目录N°.18080044，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，从褐飞虱(来源：Dr.J.A.Gatehouse，Dept.Biological Sciences，Durham University，UK)的高质量总RNA，产生cDNA。

为分离出包含褐飞虱NL001、NL002、NL003、NL004、NL005、NL006、NL007、NL008、NL009、NL010、NL011、NL012、NL013、NL014、NL015、NL016、NL018、NL019、NL021、NL022和NL027基因的部分的cDNA序列，按照厂商方案，使用Amplitaq Gold(目录N°N8080240，应用生物系统公司(Applied Biosystems))，用简并引物进行一系列PCR反应。

用于扩增每条基因的简并引物的序列给于表2-NL中。这些引物用于各PCR反应中，其中采用如下条件：对于NL001而言：95℃5分钟，接着是40个95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL002而言，95℃3分钟，接着是40个95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL003而言，95℃3分钟，接着是40个95℃30秒、61℃1分钟和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL004而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、51℃1分钟和72℃1分钟的循环；对于NL005而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、54℃1分钟和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL006而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、55℃1分钟和72℃3分30秒的循环，接着是72℃10分钟；对于NL007而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、54℃1分钟和72℃1分15秒的循环，接着是72℃10分钟；对于NL008而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、53℃1分钟和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL009而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL010而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、54℃1分钟和72℃2分30秒的循环，接着是72℃10分钟；对于NL011而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟的循环；对于NL012而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟的循环；对于NL013而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、54℃1分钟和72℃1分10秒的循环，接着是72℃10分钟；对于NL014而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、53℃1分钟和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL015而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、54℃1分钟和72℃1分40秒的循环，接着是72℃10分钟；对于NL016而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、54℃1分钟和72℃1分40秒的循环，接着是72℃10分钟；对于NL018而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、54℃1分钟和72℃1分35秒的循环，接着是72℃10分钟；对于NL019而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL021而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、54℃1分钟和72℃1分45秒的循环，接着是72℃10分钟；对于NL022而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、54℃1分钟和72℃1分45秒的循环，接着是72℃10分钟；以及对于NL027而言，95℃10分钟，接着是40个95℃30秒、54℃1分钟和72℃1分45秒的循环，接着是72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，将其纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，克隆进pCR8/GW/topo载体(目录Nr.K250020，英杰生命科学公司(Invitrogen))，并测序。得到的PCR产物的序列由表2-NL给出的各SEQ ID NO：示出，它们被称为部分序列。相应的部分氨基酸序列由表3-NL中给出的各SEQ ID NO：示出。

B.通过EST序列克隆褐飞虱NL023基因的部分序列

按照厂商方案，使用可商购试剂盒(SuperScript^TMIII逆转录酶，目录N°.18080044，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，从褐飞虱(来源：Dr.J.A.Gatehouse，Dept.Biological Sciences，Durham University，UK)的高质量总RNA，产生cDNA。

从对应于公共数据库Genbank中登录号为CAH65679.2的褐飞虱EST序列的褐飞虱cDNA，扩增部分的cDNA序列，NL023。为分离出包含NL023基因的部分的分离的cDNA序列，按照厂商方案，使用PerfectShot^TMExTaq(Cat N°.RR005A，塔卡拉生物公司(Takara Bio Inc.))，用基于EST的特异性引物进行一系列PCR反应。

对NL023而言，在两次独立的PCR反应中，使用特异性引物oGBKW002和oGBKW003(在本文中分别示为SEQ ID NO：1157和SEQ IDNO：1158)，其中采用下述条件：95℃3分钟，接着是30个95℃30秒、56℃30秒和72℃2分钟的循环，接着是72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR产物，将其纯化(QIA凝胶提取试剂盒；目录N°.28706，快而精公司(Qiagen))，克隆进pCR4-TOPO载体(Cat N°.K4575-40，英杰生命科学公司(Invitrogen))，并测序。从对两种PCR产物测序获得的共有序列在本文中示为SEQ ID NO：1111，其被称为NL023基因的部分序列。对应的部分氨基酸序列在本文中被示为SEQ ID NO：1112。

C.褐飞虱基因的dsRNA产生

使用可商购试剂盒T7Ribomax^TMExpress RNAi系统(目录Nr.P1700，普洛麦格公司(Promega))，合成毫克级的dsRNA。首先，在两个分别的PCR反应中产生两种分别的单5′T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有相对T7启动子而言不同方向的靶序列。

就每种靶基因而言，使用特异性的T7正向引物和特异性的反向引物来产生正义T7模板。用于扩增每种靶基因的正义模板的各引物的序列给于表4中。PCR反应条件如下所述：对于NL001而言，94℃4分钟，接着是35个94℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL002而言，94℃4分钟，接着是35个94℃30秒、60℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL003而言，94℃4分钟，接着是35个94℃30秒、66℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL004而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、54℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL005而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、57℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL006而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、54℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL007而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、51℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL008而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、54℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL009而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、54℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL010而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、54℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL011而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、53℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL012而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、53℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL013而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL014而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、51℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL015而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL016而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、57℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL018而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL019而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、54℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL021而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL022而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、53℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；对于NL023而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、52℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟；以及对于NL027而言，95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、52℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟。在采用与上述相同的条件的PCR反应中，使用特异性正向引物和特异性T7反向引物来产生反义T7模板。用于扩增每种靶基因的反义模板的各引物的序列给于表4-NL中。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR产物，通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCR Purification Kit，目录Nr.28106，快而精公司(Qiagen))对其进行纯化。将产生的T7正向和反向模板混合起来以被转录，将得到的RNA链退火，用DNase和RNase进行处理，并且通过乙酸钠纯化，这些按照厂商说明书来进行，但具有如下改变：在70％的乙醇中对RNA沉淀洗两次。针对每种靶基因得到的dsRNA的正义链示于表8-NL中。

用于用T7引物在绿色荧光蛋白(gfp)对照上进行的PCR反应的模板DNA是质粒pPD96.12(the Fire Lab，http：//genome-www.stanford.edu/group/fire/)，其含有野生型gfp编码序列，所述序列由3个合成内含子隔开。使用可商购试剂盒T7Ribomax^TMExpressRNAi系统(目录N°.P1700，普洛麦格公司(Promega))，合成双链RNA。首先，在两个分别的PCR反应中产生两种分别的单5′T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有相对T7启动子而言不同方向的靶序列。对gfp而言，使用特异性T7FW引物oGAU183和特异性RV引物oGAU182(在本文中分别示为SEQ ID NO：236和SEQ ID NO：237)，在采用下述条件的PCR反应中来产生正义T7模板：95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟的循环，接着是72℃10分钟。使用特异性FW引物oGAU181和特异性T7RV引物oGAU184(在本文中分别示为SEQ ID NO：238和SEQID NO：239)，在采用与上文所述相同的条件的PCR反应中产生反义T7模板。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR产物，并且纯化(Qiaquick PCRPurification Kit，目录N°.28106，快而精公司(Qiagen))。将产生的T7FW和RV模板混合起来以被转录，将得到的RNA链退火，用DNase和RNase进行处理，并且通过乙酸钠和异丙醇沉淀进行纯化，这些按照厂商方案来进行，但具有如下改变：在70％的乙醇中对RNA沉淀洗两次。得到的dsRNA的正义链在本文中如SEQ ID NO：235所示。

D.使用液体人工膳食，针对对褐飞虱的活性，筛选dsRNA靶的实验室试验

按照Koyama(1988)[Artificial rearing and nutritional physiology ofthe planthoppers and leafhoppers(Homoptera：Delphacidae andDeltocephalidae)on a holidic diet.JARQ 22：20-27](其中略加改变：使用的膳食组分蔗糖的终浓度为14.4％(重量对体积比))所述，来制备用于褐稻虱(褐飞虱)的液体人工膳食(MMD-1)。膳食组分被制备为分别的浓缩物：10×矿物质贮液(贮存于4℃)、2×氨基酸贮液(贮存于-20℃)以及10×维生素贮液(贮存于-20℃)。在开始生物测定之前，将贮液组分现混合为4/3×浓度，以用测试dsRNA溶液(4×浓度)加以稀释，将pH调节为6.5，过滤灭菌为大约500μl的等分试样。

在环境受控室中，在2-3月龄的水稻(台中再来1号水稻(Oryza sativa cvTaichung Native 1))上饲养褐稻虱(褐飞虱)，采用的条件为：27±2℃，80％的相对湿度以及16∶8小时的亮∶暗光周期。喂饲室包含10只第一或第二龄的蛹，它们被放在小培养皿(直径3cm)上，所述培养皿上盖有单层薄的延伸石蜡膜M，其上加有50μl膳食。用第二层石蜡膜密封喂饲室，在与成虫培养相同的条件下进行孵育，只是没有直接的光暴露。每隔一天更新具有dsRNA的膳食，每天对昆虫的存活加以评定。对每种处理而言，同时设立5个生物测定喂饲室(重复)。向膳食中掺入测试和对照(gfp)dsRNA溶液至终浓度为2mg/ml。将喂饲室保持于：27±2℃，80％的相对湿度，以及16∶8小时的亮∶暗光周期。使用Kaplan-Meier存活曲线模型来分析昆虫存活数据，使用logrank检验(Prism，4.0版)来比较组间存活。

使用喂饲室，向褐飞虱体外喂饲补充有完整裸dsRNA的液体人工膳食导致蛹死亡率显著增加，如四次分别的生物测定中所示(图1(a)-(d)-NL；表1a-d-NL)。这些结果证实，对应于不同的重要BPH基因的dsRNA显示出了对褐稻虱的显著毒性。

在这些生物测定中，gfp dsRNA对BPH存活的影响与在仅膳食的情况下的存活相比没有显著不同。

表10a-d-NL显示了补充有2mg/ml(终浓度)下述靶的人工膳食上褐飞虱的存活情况概括；在表10(a)-NL中：NL002、NL003、NL005、NL010；在表10(b)-NL中，NL009、NL016；在表10(c)-NL中，NL014、NL018；以及在表10(d)-NL中，NL013、NL015、NL021。在存活分析柱中，RNAi的影响如下文所示：+＝较之gfp dsRNA对照存活显著减少(α＜0.05)；-＝较之gfp dsRNA对照存活无显著不同。使用logrank检验，对存活曲线加以比较(在仅膳食和补充有测试dsRNA的膳食之间、gfp dsRNA和测试dsRNA之间，以及仅膳食和gfp dsRNA之间进行)。

E.使用人工膳食，针对对褐飞虱的活性筛选不同浓度的dsRNA的实验室试验

将50μl补充有不同浓度(即，1、0.2、0.08和0.04mg/ml(终浓度))的靶NL002dsRNA的液体人工膳食应用到褐稻虱喂饲室中。每隔一天更新具有dsRNA的膳食，每天对昆虫的存活加以评定。对每种处理而言，同时设立5个生物测定喂饲室(重复)。将喂饲室保持于：27±2℃和80％的相对湿度，以及16∶8小时的亮∶暗光周期。使用Kaplan-Meier存活曲线模型来分析昆虫存活数据，使用logrank检验(Prism，4.0版)来比较组间存活。

较之在仅膳食上的存活而言，喂饲补充有不同浓度的完整裸露的靶NL002的dsRNA的液体人工膳食导致：在低至0.04mg dsRNA/ml膳食的终浓度下，仍能导致显著更高的BPH死亡率，如图2-NL和表9-NL所示。表9-NL概括了补充有1、0.2、0.08和0.04mg/ml(终浓度)的靶NL002的褐飞虱人工膳食喂饲试验的存活情况。在存活分析柱中，RNAi的影响如下文所示：+＝较之仅膳食的对照存活显著减少(α＜0.05)；-＝较之仅膳食的对照存活无显著不同。使用logrank检验来比较存活曲线。

F.在适合用于细菌生产昆虫活性双链RNA的载体中克隆BPH基因片段

虽然可以使用包含T7启动子或用于在细菌中高效转录的任何其它启动子的任何载体，但下面的实施例是在用于在细菌宿主中表达双链RNA的载体中克隆对应于BPH基因靶的DNA片段(参考WO 00001846)。

用于扩增靶基因的特异性引物的序列提供于表8中。使用的模板是含有任何靶序列的pCR8/GW/topo载体。在采用下述条件的PCR反应中使用引物：98℃5分钟，接着是30个98℃10秒、55℃30秒和72℃2分钟的循环，接着在72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，平端克隆进用SrfI线性化过的pGNA49A载体(参考WO00188121A1)中，并进行测序。产生的PCR产物的序列对应于表8-NL给出的分别的序列。携带该序列的重组载体被命名为pGBNJ00。

G.在两种大肠杆菌菌株：(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表达和产生双链RNA靶

为了在细菌中表达合适水平的昆虫靶的昆虫活性双链RNA，按照下述流程来进行。将RNAaseIII缺陷型菌株AB309-105与野生型含RNaseIII细菌BL21(DE3)进行比较。

转化AB309-105和BL21(DE3)

在50μl的冰冷化学感染态大肠杆菌菌株AB309-105或BL21(DE3)的等分试样中加入300ng的质粒，轻柔混合。细胞在冰上孵育20分钟，之后对它们进行37℃5分钟的热激处理，之后将细胞放回到冰上，再放5分钟。向细胞中加入450μl室温SOC培养基，在摇床(250rpm)上于37℃对悬浮液进行1小时孵育。取100μl细菌细胞悬浮液转移至500ml锥形瓶中，其中含有150ml补充有100μg/ml羧苄青霉素抗生素的液体Luria-Bertani(LB)培养基。在Innova 4430摇床(250rpm)上于37℃对培养物进行过夜(16至18小时)孵育。

双链RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表达的化学诱导

因为存在用于受控表达的所有遗传组分，因此使得在细菌菌株AB309-105或BL21(DE3)中从重组载体pGBNJ003表达双链RNA成为可能。存在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷或IPTG时，T7聚合酶能驱动靶序列以反义和正义方向的转录，因为它们侧翼有相反定向的T7启动子。

使用合适的分光光度计来在600nm处测量过夜细菌培养物的光密度，通过加入新鲜的LB培养基将其调节至该值为1。将50ml该培养物转移到50ml Falcon管中，然后于15℃在3000g对培养物离心10分钟。移出上清液，将细菌沉淀重悬于50ml新鲜的S完全培养基(SNC培养基+5μg/ml胆固醇)中，其中补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG。在室温下对细菌进行2至4小时的诱导。

对细菌的热处理

通过热处理杀死细菌，以最小化对测试板中人工膳食造成污染的风险。但是，对表达双链RNA的细菌的热处理并非诱导RNA干扰导致的对昆虫的毒性的先决条件。于室温下在3000g对经诱导的细菌培养物进行10分钟离心，弃去上清液，在水浴中使沉淀进行20分钟的80℃处理。热处理之后，将细菌沉淀重悬于1.5ml MiniQ水中，将悬浮液转移至微离心管。制备若干管，在生物测定中用于每次更新。将管贮存于-20℃直到进一步使用。

H.实验室试验，以测试针对褐飞虱，表达dsRNA靶的大肠杆菌

基于植物的生物测定

在将植物喂饲给BPH之前，用经化学诱导的表达dsRNA的细菌的悬浮液对整株植物喷雾。在植物培养室中种植植物。将500ml塑料瓶顶部朝下放到植物上，瓶颈稳固放进盆中的土壤中，瓶底切开，盖上细尼龙网以允许通风、降低内部冷凝以及防止幼虫逃脱，由此为植物搭建笼子。向笼中每株经处理植物上放上BPH。用携带有pGBNJ001质粒或pGN29质粒的大肠杆菌AB309-105的悬浮液来处理植物。向植物应用不同量的细菌：例如66、22和7个单位，其中，一个单位被定义为：600nm波长下，光密度值为1的1ml细菌悬浮液中，10⁹个细菌细胞。每种情况下，在喷雾器协助下将1至10ml之间的总体积喷雾到植物上。在该试验中，每种处理使用一株植物。对存活者的数量加以计数，记录每只存活者的重量。

用表达来自pGBNJ003的靶dsRNA的大肠杆菌细菌菌株AB309-105的悬浮液对植物进行喷雾，导致昆虫死亡率较之pGN29对照的显著增加。这些实验显示，在野生型或RNaseIII缺陷型细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，这表现在昆虫死亡率的高度增加以及幼虫存活者生长/发育的延迟上。从这些实验中还显而易见：提供了对使用制剂喷雾来有效保护植物/作物免受昆虫损伤的范例，所述制剂由表达对应于昆虫基因靶的双链RNA的细菌组成。

实施例10：二化螟(稻二化螟)

A.通过家族PCR克隆二化螟基因的部分序列

按照厂商说明书，使用TRIzol试剂(目录Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，从二化螟(稻二化螟)的4种不同幼虫期来分离高质量的完整RNA。按照厂商说明书(目录Nr.1700，普洛麦格公司(Promega))，通过DNase处理，除去RNA制备中存在的基因组DNA。按照厂商说明书，使用可商购试剂盒(SuperScript^TMIII逆转录酶，目录Nr.18080044，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，产生cDNA。

为分离出包含CS001、CS002、CS003、CS006、CS007、CS009、CS011、CS013、CS014、CS015、CS016和CS018基因的部分的cDNA序列，按照厂商说明书，使用Amplitaq Gold(目录Nr.N8080240，应用生物系统公司(Applied Biosystems))，用简并引物进行一系列PCR反应。

用于扩增每条基因的简并引物的序列给于表2-CS中。这些引物用于各PCR反应中，其中采用如下条件：95℃10分钟，接着进行40个95℃30秒、55℃1分钟和72℃1分钟的循环，接着在72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，将其纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，克隆进pCR4/TOPO载体(目录Nr.K2500-20，英杰生命科学公司(Invitrogen))，并测序。得到的PCR产物的序列由表2-CS给出的各SEQ ID NO：示出，它们被称为部分序列。相应的部分氨基酸序列由表3-CS中给出的各SEQ ID NO：示出。

B.二化螟基因的dsRNA产生

使用可商购试剂盒T7Ribomax^TMExpress RNAi系统(目录Nr.P1700，普洛麦格公司(Promega))，合成毫克级的dsRNA。首先，在两个分别的PCR反应中产生两种分别的单5′T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有相对T7启动子而言不同方向的靶序列。

就每种靶基因而言，使用特异性的T7正向引物和特异性的反向引物来产生正义T7模板。用于扩增每种靶基因的正义模板的各引物的序列给于表8-CS中。PCR反应条件如下所述：95℃4分钟，接着是35个95℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟的循环，接着在72℃10分钟。在采用与上述相同的条件的PCR反应中，使用特异性正向引物和特异性T7反向引物来产生反义T7模板。用于扩增每种靶基因的反义模板的各引物的序列给于表8-CS中。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR产物，通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCRPurification Kit，目录Nr.28106，快而精公司(Qiagen))对其进行纯化，并进行NaClO₄沉淀。将产生的T7正向和反向模板混合起来以被转录，将得到的RNA链退火，用DNase和RNase进行处理，并且通过乙酸钠纯化，这都按照厂商说明书来进行。针对每种靶基因得到的dsRNA的正义链示于表8-CS中。

C.使用人工膳食，针对对二化螟幼虫的活性，测试dsRNA靶的实验室试验

将稻二化螟，二化螟(来源：Syngenta，Stein，Switzerland)保持在经改良的基于Kamano and Sato，1985(在：Handbook of Insect Rearing.Volumes I&II.P Singh和RF Moore，编著，Elsevier Science Publishers，Amsterdam and New York，1985，第448页中)所述的人工膳食上。简言之，按照下述来制备1升膳食：20g琼脂加入到980ml Milli-Q水中并高压灭菌；将琼脂溶液冷却至大约55℃，加入剩余成分并彻底混合：40g玉米粉(普兰达公司(Polenta))、20g纤维素、30g蔗糖、30g酪蛋白、20g麦胚芽(烤过的)、8g Wesson盐混合物、12g Vanderzant维生素混合物、1.8g山梨酸、1.6g尼泊金(对羟基苯甲酸甲酯)、0.3g金霉素、0.4g胆固醇和0.6g L-半胱氨酸。将膳食冷却至大约45℃，倾倒进饲养盘或杯中。将膳食放在水平层流室中。从笼饲成虫取具有产的卵的稻叶切片，钉进饲养杯或盘中的固体膳食上。令卵孵化，新生幼虫可用于生物测定和对昆虫培养物的保持。在试验和饲养期间，条件为：28±2℃和80±5％的相对湿度，以及16∶8小时的亮∶暗光周期。

同样的人工膳食被用于生物测定，但是在这种情况下，将膳食等量倾倒进24孔板中，每孔含有1ml膳食。一旦设置好膳食，将测试制剂以50μl1μg/μl靶dsRNA的比例应用到膳食表面(2cm²)。令dsRNA溶液干燥，在每个孔中放两只第一龄幼虫。7天后，将幼虫转移至多孔板中新鲜的经过处理的膳食上。在第14天(即，生物测定开始后14天)，记录活的和死的昆虫的数量，针对异常性对它们加以检查。每种处理测试了总共24只幼虫。

进行另一项可选的生物测定，其中，向稻二化螟的新生幼虫喂饲经处理的稻叶。将Indica稻品种Taichung native 1的小叶切片浸于含有1μg/μl靶dsRNA的0.05％Triton X-100溶液中，令其干燥，每片切片放在含有经胶凝2％琼脂的24多孔板的孔中。将两只新生幼虫从饲养盘转移到每片经dsRNA处理过的叶切片上(每种处理24只幼虫)。4和8天后，将幼虫转移至新鲜的经处理的稻叶切片上。在第4、8和12天评定活的和死的幼虫的数量；还对任何异常进行记录。

D.在适合用于细菌生产昆虫活性双链RNA的载体中克隆SSB基因片段

虽然可以使用包含T7启动子或用于在细菌中高效转录的任何其它启动子的任何载体，但下面的实施例是在用于在细菌宿主中表达双链RNA的载体中克隆对应于SSB基因靶的DNA片段(参考WO 00001846)。

用于扩增靶基因的特异性引物的序列提供于表8中。使用的模板是含有任何靶序列的pCR8/GW/topo载体。在采用下述条件的PCR反应中使用引物：98℃5分钟，接着是30个98℃10秒、55℃30秒和72℃2分钟的循环，接着在72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，平端克隆进用SrfI线性化过的pGNA49A载体(参考WO00188121A1)中，并进行测序。产生的PCR产物的序列对应于表8-CS给出的分别的序列。携带该序列的重组载体被命名为pGBNJ00XX。

E.在两种大肠杆菌菌株：(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表达和产生双链RNA靶

为了在细菌中表达合适水平的昆虫靶的昆虫活性双链RNA，按照下述流程来进行。将RNAaseIII缺陷型菌株AB309-105与野生型含RNaseIII细菌BL21(DE3)进行比较。

转化AB309-105和BL21(DE3)

在50μl的冰冷化学感染态大肠杆菌菌株AB309-105或BL21(DE3)的等分试样中加入300ng的质粒，轻柔混合。细胞在冰上孵育20分钟，之后对它们进行37℃5分钟的热激处理，之后将细胞放回到冰上，再放5分钟。向细胞中加入450μl室温SOC培养基，在摇床(250rpm)上于37℃对悬浮液进行1小时孵育。取100μl细菌细胞悬浮液转移至500ml锥形瓶中，其中含有150ml补充有100μg/ml羧苄青霉素抗生素的液体Luria-Bertani(LB)培养基。在Innova 4430摇床(250rpm)上于37℃对培养物进行过夜(16至18小时)孵育。

双链RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表达的化学诱导

因为存在用于受控表达的所有遗传组分，因此使得在细菌菌株AB309-105或BL21(DE3)中从重组载体pGBNJ003表达双链RNA成为可能。存在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷或IPTG时，T7聚合酶能驱动靶序列以反义和正义方向的转录，因为它们侧翼有相反定向的T7启动子。

使用合适的分光光度计来在600nm处测量过夜细菌培养物的光密度，通过加入新鲜的LB培养基将其调节至该值为1。将50ml该培养物转移到50ml Falcon管中，然后于15℃在3000g对培养物离心10分钟。移出上清液，将细菌沉淀重悬于50ml新鲜的S完全培养基(SNC培养基+5μg/ml胆固醇)中，其中补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG。在室温下对细菌进行2至4小时的诱导。

对细菌的热处理

通过热处理杀死细菌，以最小化对测试板中人工膳食造成污染的风险。但是，对表达双链RNA的细菌的热处理并非诱导RNA干扰导致的对昆虫的毒性的先决条件。于室温下在3000g对经诱导的细菌培养物进行10分钟离心，弃去上清液，在水浴中使沉淀进行20分钟的80℃处理。热处理之后，将细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，将悬浮液转移至微离心管。制备若干管，在生物测定中用于每次更新。将管贮存于-20℃直到进一步使用。

F.实验室试验，以测试针对二化螟，表达dsRNA靶的大肠杆菌

基于植物的生物测定

在将植物喂饲给SSB之前，用经化学诱导的表达dsRNA的细菌的悬浮液对整株植物喷雾。在植物培养室中种植植物。将500ml塑料瓶顶部朝下放到植物上，瓶颈稳固放进盆中的土壤中，瓶底切开，盖上细尼龙网以允许通风、降低内部冷凝以及防止幼虫逃脱，由此为植物搭建笼子。向笼中每株经处理植物上放上SSB。用携带有pGBNJ001质粒或pGN29质粒的大肠杆菌AB309-105的悬浮液来处理植物。向植物应用不同量的细菌：例如66、22和7个单位，其中，一个单位被定义为：600nm波长下，光密度值为1的1ml细菌悬浮液中，10⁹个细菌细胞。每种情况下，在喷雾器协助下将1至10ml之间的总体积喷雾到植物上。在该试验中，每种处理使用一株植物。对存活者的数量加以计数，记录每只存活者的重量。

用表达来自pGBNJ003的靶dsRNA的大肠杆菌细菌菌株AB309-105的悬浮液对植物进行喷雾，导致昆虫死亡率较之pGN29对照的显著增加。这些实验显示，在野生型或RNaseIII缺陷型细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，这表现在昆虫死亡率的高度增加以及幼虫存活者生长/发育的延迟上。从这些实验中还显而易见：提供了对使用制剂喷雾来有效保护植物/作物免受昆虫损伤的范例，所述制剂由表达对应于昆虫基因靶的双链RNA的细菌组成。

实施例9：菜蛾(菜蛾)

A.克隆菜蛾的部分序列

按照厂商说明书，使用TRIzol试剂(目录Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，从菜蛾(菜蛾；来源：Dr.Lara Senior，Insect Investigations Ltd.，Capital BusinessPark，Wentloog，Cardiff，CF3 2PX，Wales，UK)的所有不同幼虫期分离高质量的完整RNA。按照厂商说明书(目录Nr.1700，普洛麦格公司(Promega))，通过DNase处理，除去RNA制备中存在的基因组DNA。按照厂商说明书，使用可商购试剂盒(SuperScript^TMIII逆转录酶，目录Nr.18080044，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，产生cDNA。

为分离出包含PX001、PX009、PX010、PX015、PX016基因的部分的cDNA序列，按照厂商说明书，使用Amplitaq Gold(目录Nr.N8080240，应用生物系统公司(Applied Biosystems))，用简并引物进行一系列PCR反应。

用于扩增每条基因的简并引物的序列给于表2-PX中。这些引物用于各PCR反应中，其中采用如下条件：95℃10分钟，接着进行40个95℃30秒、50℃1分钟和72℃1分30秒的循环，接着在72℃7分钟(对PX001、PX009、PX015、PX016而言)；95℃10分钟，接着进行40个95℃30秒、54℃1分钟和72℃2分30秒的循环，接着在72℃7分钟(对于PX010而言)。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，将其克隆进pCR8/GW/TOPO载体(目录NrK2500-20，英杰生命科学公司(Invogen))，并测序。得到的PCR产物的序列由表2-PX给出的各SEQ ID NO：示出，它们被称为部分序列。相应的部分氨基酸序列由表3-PX中给出的各SEQ ID NO：示出。

B.菜蛾基因的dsRNA产生

使用可商购试剂盒T7Ribomax^TMExpress RNAi系统(目录Nr.P1700，普洛麦格公司(Promega))，合成毫克级的dsRNA。首先，在两个分别的PCR反应中产生两种分别的单5′T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有相对T7启动子而言不同方向的靶序列。

就每种靶基因而言，使用特异性的T7正向引物和特异性的反向引物来产生正义T7模板。用于扩增每种靶基因的正义模板的各引物的序列给于表8-PX中。PCR反应条件如下所述：95℃1分钟，接着是20个95℃30秒、60℃(-0.5℃/循环)30秒和72℃1分钟的循环，接着是15个95℃30秒、50℃30秒和72℃1分钟的循环，接着在72℃10分钟。在采用与上述相同的条件的PCR反应中，使用特异性正向引物和特异性T7反向引物来产生反义T7模板。用于扩增每种靶基因的反义模板的各引物的序列给于表8-PX中。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR产物，通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCRPurification Kit，目录Nr.28106，快而精公司(Qiagen))对其进行纯化，并进行NaClO₄沉淀。将产生的T7正向和反向模板混合起来以被转录，将得到的RNA链退火，用DNase和RNase进行处理，并且通过乙酸钠纯化，这都按照厂商说明书来进行。针对每种靶基因得到的dsRNA的正义链示于表8-PX中。

C.使用人工膳食，针对对菜蛾幼虫的活性，测试dsRNA靶的实验室试验

将菜蛾保持于昆虫研究有限公司(Insect Investigations Ltd.)(来源：Newcastle University，Newcastle-upon-Tyne，UK)。在甘蓝叶上饲养昆虫。在试验中，选用第一龄的混合性别的幼虫(年龄为大约1天)。将昆虫保持于Eppdendorf管(1.5ml容量)中。将按照厂商说明书制备的可商业获得的菜蛾膳食(生物服务公司(Bio-Serv)，NJ，USA)放进每个管的盖中(0.25ml容量，8mm直径)。虽然仍是液体，但是膳食更加平滑，以除去多余物，并且产生平坦的表面。

一旦已经建立了膳食，将测试制剂以每份重复25μl未经稀释制剂(1μg/μl靶dsRNA)的比例应用到膳食表面。令测试制剂干燥，在每个管中放置一只第一龄幼虫。将幼虫放到盖中膳食的表面上，小心关上管。将管在盖上倒过来储存，使得每只幼虫都保留在膳食表面上。每周两次将幼虫转移到含有新鲜膳食的新Eppendorf管中。在试验的最初两周向昆虫提供经处理的膳食，之后提供未经处理的膳食。

在总共38天(此时所有幼虫都死亡)中，每周进行两次评定。在每次评定时，针对活的或死的对昆虫加以评定，并针对异常性加以检查。对于每种处理而言，进行40只单独幼虫的重复。在试验期间，测试条件为：23至26℃以及50至65％的相对湿度，以及16∶8小时的亮∶暗光周期。

D.在适合用于细菌生产昆虫活性双链RNA的载体中克隆DBM基因片段

虽然可以使用包含T7启动子或用于在细菌中高效转录的任何其它启动子的任何载体，但下面的实施例是在用于在细菌宿主中表达双链RNA的载体中克隆对应于DBM基因靶的DNA片段(参考WO 00001846)。

用于扩增靶基因的特异性引物的序列提供于表8-PX中。使用的模板是含有任何靶序列的pCR8/GW/topo载体。在采用下述条件的PCR反应中使用引物：98℃5分钟，接着是30个98℃10秒、55℃30秒和72℃2分钟的循环，接着在72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，平端克隆进用SrfI线性化过的pGNA49A载体(参考WO00188121A1)中，并进行测序。产生的PCR产物的序列对应于表8-PX给出的分别的序列。携带该序列的重组载体被命名为pGBNJ00XX。

E.在两种大肠杆菌菌株：(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表达和产生双链RNA靶

为了在细菌中表达合适水平的昆虫靶的昆虫活性双链RNA，按照下述流程来进行。将RNAaseIII缺陷型菌株AB309-105与野生型含RNaseIII细菌BL21(DE3)进行比较。

转化AB309-105和BL21(DE3)

在50μl的冰冷化学感染态大肠杆菌菌株AB309-105或BL21(DE3)的等分试样中加入300ng的质粒，轻柔混合。细胞在冰上孵育20分钟，之后对它们进行37℃5分钟的热激处理，之后将细胞放回到冰上，再放5分钟。向细胞中加入450μl室温SOC培养基，在摇床(250rpm)上于37℃对悬浮液进行1小时孵育。取100μl细菌细胞悬浮液转移至500ml锥形瓶中，其中含有150ml补充有100μg/ml羧苄青霉素抗生素的液体Luria-Bertani(LB)培养基。在Innova 4430摇床(250rpm)上于37℃对培养物进行过夜(16至18小时)孵育。

双链RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表达的化学诱导

因为存在用于受控表达的所有遗传组分，因此使得在细菌菌株AB309-105或BL21(DE3)中从重组载体pGBNJ003表达双链RNA成为可能。存在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷或IPTG时，T7聚合酶能驱动靶序列以反义和正义方向的转录，因为它们侧翼有相反定向的T7启动子。

使用合适的分光光度计来在600nm处测量过夜细菌培养物的光密度，通过加入新鲜的LB培养基将其调节至该值为1。将50ml该培养物转移到50ml Falcon管中，然后于15℃在3000g对培养物离心10分钟。移出上清液，将细菌沉淀重悬于50ml新鲜的S完全培养基(SNC培养基+5μg/ml胆固醇)中，其中补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG。在室温下对细菌进行2至4小时的诱导。

对细菌的热处理

通过热处理杀死细菌，以最小化对测试板中人工膳食造成污染的风险。但是，对表达双链RNA的细菌的热处理并非诱导RNA干扰导致的对昆虫的毒性的先决条件。于室温下在3000g对经诱导的细菌培养物进行10分钟离心，弃去上清液，在水浴中使沉淀进行20分钟的80℃处理。热处理之后，将细菌沉淀重悬于1.5ml MiniQ水中，将悬浮液转移至微离心管。制备若干管，在生物测定中用于每次更新。将管贮存于-20℃直到进一步使用。

F.实验室试验，以测试针对菜蛾，表达dsRNA靶的大肠杆菌

基于植物的生物测定

在将植物喂饲给DBM之前，用经化学诱导的表达dsRNA的细菌的悬浮液对整株植物喷雾。在植物培养室中种植植物。将500ml塑料瓶顶部朝下放到植物上，瓶颈稳固放进盆中的土壤中，瓶底切开，盖上细尼龙网以允许通风、降低内部冷凝以及防止幼虫逃脱，由此为植物搭建笼子。向笼中每株经处理植物上放上DBM。用携带有pGBNJ001质粒或pGN29质粒的大肠杆菌AB309-105的悬浮液来处理植物。向植物应用不同量的细菌：例如66、22和7个单位，其中，一个单位被定义为：600nm波长下，光密度值为1的1ml细菌悬浮液中，10⁹个细菌细胞。每种情况下，在喷雾器协助下将1至10ml之间的总体积喷雾到植物上。在该试验中，每种处理使用一株植物。对存活者的数量加以计数，记录每只存活者的重量。

用表达来自pGBNJ003的靶dsRNA的大肠杆菌细菌菌株AB309-105的悬浮液对植物进行喷雾，导致昆虫死亡率较之pGN29对照的显著增加。这些实验显示，在野生型或RNaseIII缺陷型细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，这表现在昆虫死亡率的高度增加以及幼虫存活者生长/发育的延迟上。从这些实验中还显而易见：提供了使用制剂喷雾来有效保护植物/作物免受昆虫损伤的范例，所述制剂由表达对应于昆虫基因靶的双链RNA的细菌组成。

实施例12：居屋艾蟋(家蟋蟀)

A.克隆居屋艾蟋的部分序列

按照厂商说明书，使用TRIzol试剂(目录Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，从居屋艾蟋(家蟋蟀；来源：Dr.Lara Senior，Insect Investigations Ltd.，CapitalBusiness Park，Wentloog，Cardiff，CF3 2PX，Wales，UK)的所有不同昆虫期分离高质量的完整RNA。按照厂商说明书(目录Nr.1700，普洛麦格公司(Promega))，通过DNase处理，除去RNA制备中存在的基因组DNA。按照厂商说明书，使用可商购试剂盒(SuperScript^TMIII逆转录酶，目录Nr.18080044，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，产生cDNA。

为分离出包含AD001、AD002、AD009、AD015和AD016基因的部分的cDNA序列，按照厂商说明书，使用Amplitaq Gold(目录Nr.N8080240，应用生物系统公司(Applied Biosystems))，用简并引物进行一系列PCR反应。

用于扩增每条基因的简并引物的序列给于表2-AD中。这些引物用于各PCR反应中，其中采用如下条件：95℃10分钟，接着进行40个95℃30秒、50℃1分钟和72℃1分30秒的循环，接着在72℃7分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，将其克隆进pCR8/GW/topo载体(目录Nr.K250020，英杰生命科学公司(Invitrogen))，并测序。得到的PCR产物的序列由表2-AD给出的各SEQ ID NO：示出，它们被称为部分序列。相应的部分氨基酸序列由表3-AD中给出的各SEQ ID NO：示出。

B.居屋艾蟋基因的dsRNA产生

使用可商购试剂盒T7Ribomax^TMExpress RNAi系统(目录Nr.P1700，普洛麦格公司(Promega))，合成毫克级的dsRNA。首先，在两个分别的PCR反应中产生两种分别的单5′T7RNA聚合酶启动子模板，每个反应含有相对T7启动子而言不同方向的靶序列。

就每种靶基因而言，使用特异性的T7正向引物和特异性的反向引物来产生正义T7模板。用于扩增每种靶基因的正义模板的各引物的序列给于表8-AD中。PCR反应条件如下所述：95℃1分钟，接着是20个95℃30秒、60℃(-0.5℃/循环)30秒和72℃1分钟的循环，接着是15个95℃30秒、50℃30秒和72℃1分钟的循环，接着在72℃10分钟。在采用与上述相同的条件的PCR反应中，使用特异性正向引物和特异性T7反向引物来产生反义T7模板。用于扩增每种靶基因的反义模板的各引物的序列给于表8-AD中。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR产物，通过PCR纯化试剂盒(Qiaquick PCRPurification Kit，目录Nr.28106，快而精公司(Qiagen))对其进行纯化，并进行NaClO₄沉淀。将产生的T7正向和反向模板混合起来以被转录，将得到的RNA链退火，用DNase和RNase进行处理，并且通过乙酸钠纯化，这都按照厂商说明书来进行。针对每种靶基因得到的dsRNA的正义链示于表8-AD中。

C.使用人工膳食，针对对居屋艾蟋幼虫的活性，检测dsRNA靶的实验室试验

将家蟋蟀居屋艾蟋保持于昆虫研究有限公司(Insect InvestigationsLtd.)(来源：Blades Biological Ltd.，Kent，UK)。在麸皮团块和甘蓝叶上饲养昆虫。选出大小等同并且不超过5日龄的混合性别蛹，用于该试验。将双链RNA与基于小麦团块的啮齿动物膳食(大鼠和小鼠标准膳食，B&K总公司(B&K Universal Ltd.)，Grimston，Aldbrough，Hull，UK)混合。膳食BK001P含有下述成分，它们的重量依次降低：小麦、大豆、麸皮粉、大麦、团块粘合剂、啮齿动物5维生素、脂肪掺合物、磷酸二钙、防霉剂(mould carb)。为使得任何酶组分失活，将团块啮齿动物膳食细致碾碎，在微波炉中进行热处理，之后混合起来。所有啮齿动物膳食都取自同一批，以确保一致性。将经碾碎的膳食和dsRNA彻底混合起来，成型为等重小团块，令它们在室温下干燥过夜。

浓度为10μg/μl的、来自靶和gfp对照的双链RNA以1g经碾碎膳食加1ml dsRNA溶液的比例应用，由此使得应用比例为每g团块10mg dsRNA。每周替换团块。试验的前三周向昆虫提供经处理的团块。之后提供未经处理的团块。在有盖塑料容器(9cm直径，4.5cm深)中保持昆虫，每个容器十只昆虫。每片场地含有一份经处理的饵料团块以及一份水源(湿的棉絮球)，每片场地都放在各小称量盘中。整个实验期间水无限制补充。

以每周两次的间隔进行评定，评定之间不超过4天，直到所有对照昆虫都死亡或蜕变为成年期(84天)。在每次评定中，昆虫被评定为活的或死的，针对异常现象对它们加以检查。从第46天起，一旦开始向成虫蜕变，所有昆虫(活的和死的)就被评定为蛹或成虫。在试验的第55天对存活昆虫加以称重。每种处理采用一式四份重复。在试验期间，测试条件为25至33℃，20至25％的相对湿度，以及12∶12小时的亮∶暗光周期。

D.在适合用于细菌生产昆虫活性双链RNA的载体中克隆HC基因片段

虽然可以使用包含T7启动子或用于在细菌中高效转录的任何其它启动子的任何载体，但下面的实施例是在用于在细菌宿主中表达双链RNA的载体中克隆对应于HC基因靶的DNA片段(参考WO 00001846)。

用于扩增靶基因的特异性引物的序列提供于表8中。使用的模板是含有任何靶序列的pCR8/GW/topo载体。在采用下述条件的PCR反应中使用引物：98℃5分钟，接着是30个98℃10秒、55℃30秒和72℃2分钟的循环，接着在72℃10分钟。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR片段，纯化(QIAquick凝胶提取试剂盒，目录Nr.28706，快而精公司(Qiagen))，平端克隆进用SrfI线性化过的pGNA49A载体(参考WO00188121A1)中，并进行测序。产生的PCR产物的序列对应于表8-AD给出的分别的序列。携带该序列的重组载体被命名为pGBNJ00XX。

E.在两种大肠杆菌菌株：(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表达和产生双链RNA靶

为了在细菌中表达合适水平的昆虫靶的昆虫活性双链RNA，按照下述流程来进行。将RNAaseIII缺陷型菌株AB309-105与野生型含RNaseIII细菌BL21(DE3)进行比较。

转化AB309-105和BL21(DE3)

在50μl的冰冷化学感染态大肠杆菌菌株AB309-105或BL21(DE3)的等分试样中加入300ng的质粒，轻柔混合。细胞在冰上孵育20分钟，之后对它们进行37℃5分钟的热激处理，之后将细胞放回到冰上，再放5分钟。向细胞中加入450μl室温SOC培养基，在摇床(250rpm)上于37℃对悬浮液进行1小时孵育。取100μl细菌细胞悬浮液转移至500ml锥形瓶中，其中含有150ml补充有100μg/ml羧苄青霉素抗生素的液体Luria-Bertani(LB)培养基。在Innova 4430摇床(250rpm)上于37℃对培养物进行过夜(16至18小时)孵育。

双链RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表达的化学诱导

因为存在用于受控表达的所有遗传组分，因此使得在细菌菌株AB309-105或BL21(DE3)中从重组载体pGBNJ003表达双链RNA成为可能。存在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷或IPTG时，T7聚合酶能驱动靶序列以反义和正义方向的转录，因为它们侧翼有相反定向的T7启动子。

使用合适的分光光度计来在600nm处测量过夜细菌培养物的光密度，通过加入新鲜的LB培养基将其调节至该值为1。将50ml该培养物转移到50ml Falcon管中，然后于15℃在3000g对培养物离心10分钟。移出上清液，将细菌沉淀重悬于50ml新鲜的S完全培养基(SNC培养基+5μg/ml胆固醇)中，其中补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG。在室温下对细菌进行2至4小时的诱导。

对细菌的热处理

通过热处理杀死细菌，以最小化对测试板中人工膳食造成污染的风险。但是，对表达双链RNA的细菌的热处理并非诱导RNA干扰导致的对昆虫的毒性的先决条件。于室温下在3000g对经诱导的细菌培养物进行10分钟离心，弃去上清液，在水浴中使沉淀进行20分钟的80℃处理。热处理之后，将细菌沉淀重悬于1.5ml MiniQ水中，将悬浮液转移至微离心管。制备若干管，在生物测定中用于每次更新。将管贮存于-20℃直到进一步使用。

F.实验室试验，以测试针对居屋艾蟋，表达dsRNA靶的大肠杆菌

基于植物的生物测定

在将植物喂饲给HC之前，用经化学诱导的表达dsRNA的细菌的悬浮液对整株植物喷雾。在植物培养室中种植植物。将500ml塑料瓶顶部朝下放到植物上，瓶颈稳固放进盆中的土壤中，瓶底切开，盖上细尼龙网以允许通风、降低内部冷凝以及防止幼虫逃脱，由此为植物搭建笼子。向笼中每株经处理植物上放上HC。用携带有pGBNJ001质粒或pGN29质粒的大肠杆菌AB309-105的悬浮液来处理植物。向植物应用不同量的细菌：例如66、22和7个单位，其中，一个单位被定义为：600nm波长下，光密度值为1的1ml细菌悬浮液中，10⁹个细菌细胞。每种情况下，在喷雾器协助下将1至10ml之间的总体积喷雾到植物上。在该试验中，每种处理使用一株植物。对存活者的数量加以计数，记录每只存活者的重量。

用表达来自pGBNJ003的靶dsRNA的大肠杆菌细菌菌株AB309-105的悬浮液对植物进行喷雾，导致昆虫死亡率较之pGN29对照的显著增加。这些实验显示，在野生型或RNaseIII缺陷型细菌表达系统中产生的对应于昆虫基因靶序列的双链RNA对昆虫有毒性，这表现在昆虫死亡率的高度增加以及幼虫存活者生长/发育的延迟上。从这些实验中还显而易见：提供了使用制剂喷雾来有效保护植物/作物免受昆虫损伤的范例，所述制剂由表达对应于昆虫基因靶的双链RNA的细菌组成。

实施例13：稻瘟病菌(Pyricularia grisea)(稻瘟)

A.克隆稻瘟病菌(P.grisea)的部分序列

按照厂商说明书，使用TRIzol试剂(目录Nr.15596-026/15596-018，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，从稻瘟病菌的不同生长期分离高质量的完整RNA。按照厂商说明书(目录Nr.1700，普洛麦格公司(Promega))，通过DNase处理，除去RNA制备中存在的基因组DNA。按照厂商说明书，使用可商购试剂盒(SuperScript^TMIII逆转录酶，目录Nr.18080044，英杰生命科学公司(Invitrogen)，Rockville，Maryland，USA)，产生cDNA。

为分离出包含靶基因的部分的cDNA序列，按照厂商说明书，使用Amplitaq Gold(目录Nr.N8080240，应用生物系统公司(AppliedBiosystems))，用简并引物进行PCR反应。得到的PCR产物被分级分离并被测序。

B.稻瘟病菌基因的dsRNA产生

按照厂商说明书，使用可商购试剂盒，例如T7Ribomax^TMExpressRNAi系统(目录Nr.P1700，普洛麦格公司(Promega))，合成毫克级的dsRNA。在琼脂糖凝胶上分析得到的PCR产物，通过PCR纯化试剂盒(例如，Qiaquick PCR Purification Kit，目录Nr.28106，快而精公司(Qiagen))对其进行纯化，并进行NaClO₄沉淀。将产生的T7正向和反向模板混合起来，将得到的RNA链退火，然后用DNase和RNase进行处理，并且通过乙酸钠纯化，这都按照厂商说明书来进行。

C.在两种大肠杆菌菌株：(1)AB309-105和(2)BL21(DE3)中表达和产生双链RNA靶

为了在细菌中表达合适水平的真菌靶的真菌双链RNA，按照下述流程来进行。将RNAaseIII缺陷型菌株AB309-105与野生型含RNaseIII细菌BL21(DE3)进行比较。

转化AB309-105和BL21(DE3)

在50μl的冰冷化学感染态大肠杆菌菌株AB309-105或BL21(DE3)的等分试样中加入300ng的质粒，轻柔混合。细胞在冰上孵育20分钟，之后对它们进行37℃5分钟的热激处理，之后将细胞放回到冰上，再放5分钟。向细胞中加入450μl室温SOC培养基，在摇床(250rpm)上于37℃对悬浮液进行1小时孵育。取100μl细菌细胞悬浮液转移至500ml锥形瓶中，其中含有150ml补充有100μg/ml羧苄青霉素抗生素的液体Luria-Bertani(LB)培养基。在Innova 4430摇床(250rpm)上于37℃对培养物进行过夜(16至18小时)孵育。

双链RNA在AB309-105和BL21(DE3)中表达的化学诱导

因为存在用于受控表达的所有遗传组分，因此使得在细菌菌株AB309-105或BL21(DE3)中从重组载体pGBNJ003表达双链RNA成为可能。存在化学诱导物异丙基硫代半乳糖苷或IPTG时，T7聚合酶能驱动靶序列以反义和正义方向的转录，因为它们侧翼有相反定向的T7启动子。

使用合适的分光光度计来在600nm处测量过夜细菌培养物的光密度，通过加入新鲜的LB培养基将其调节至该值为1。将50ml该培养物转移到50ml Falcon管中，然后于15℃在3000g对培养物离心10分钟。移出上清液，将细菌沉淀重悬于50ml新鲜的S完全培养基(SNC培养基+5μg/ml胆固醇)中，其中补充有100μg/ml羧苄青霉素和1mM IPTG。在室温下对细菌进行2至4小时的诱导。

对细菌的热处理

通过热处理杀死细菌，以最小化对测试板中人工膳食造成污染的风险。但是，对表达双链RNA的细菌的热处理并非诱导RNA干扰导致的对昆虫的毒性的先决条件。于室温下在3000g对经诱导的细菌培养物进行10分钟离心，弃去上清液，在水浴中使沉淀进行20分钟的80℃处理。热处理之后，将细菌沉淀重悬于1.5ml MilliQ水中，将悬浮液转移至微离心管。制备若干管，在生物测定中用于每次更新。将管贮存于-20℃直到进一步使用。

Claims (15)

1.经分离的双链RNA分子，其包含经退火的双链，其中所述退火的链的至少一条链包含选自以下的多核苷酸：

(a)与靶基因的至少21个连续核苷酸互补的多核苷酸，所述靶基因通过以下任一所示：SEQ ID NO:11、253、517、605、797、892、1089、1115、2104、1、3、5、7、9、13、15、17、19、21、23、159、160、161、162、247、249、251、255、257、259、513、515、519、521、601、603、607、609、793、795、799、801、888、890、894、896、1071、1073、1075、1077、1079、1081、1083、1085、1087、1091、1093、1095、1097、1099、1101、1103、1105、1107、1109、1111、1113、1682、1684、1686、1688、1690、1692、1694、1696、1698、1700、1702、1704、2100、2102、2106、2108、2364、2366、2368、2370和2372；

(b)与靶基因的至少21个连续核苷酸互补的多核苷酸，所述靶基因编码如下任一所示的氨基酸序列：SEQ ID NO:12、254、518、606、798、893、1090、1116、2105、2、4、6、8、10、14、16、18、20、22、24、248、250、252、256、258、260、514、516、520、522、602、604、608、610、794、796、800、802、889、891、895、897、1072、1074、1076、1078、1080、1082、1084、1086、1088、1092、1094、1096、1098、1100、1102、1104、1106、1108、1110、1112、1114、1683、1685、1687、1689、1691、1693、1695、1697、1699、1701、1703、1705、2101、2103、2107、2109、2365、2367、2369、2371和2373；以及

(c)与(a)或(b)的多核苷酸具有至少85％序列同一性的多核苷酸；

其中有害生物接触所述多核苷酸抑制与所述多核苷酸基本互补的所述有害生物的多核苷酸表达。

2.权利要求1的双链RNA分子，其中有害生物接触所述多核苷酸抑制所述有害生物的生长、发育或繁殖。

3.编码权利要求1或2的双链RNA分子的分离的多核苷酸或多核苷酸组。

4.编码权利要求1或2的双链RNA分子的载体系统。

5.用权利要求3的多核苷酸或多核苷酸组或权利要求4的载体系统转化的细胞，所述细胞不是植物细胞。

6.权利要求5的细胞，其中，所述细胞是细菌、酵母或藻类细胞。

7.包含权利要求6的细胞的食物产品。

8.权利要求7的食物产品，其中所述食物产品是贮藏谷类、宠物食品或粉末巧克力。

9.包含权利要求1或2的双链RNA分子的组合物。

10.权利要求9的组合物，其中，所述组合物是喷雾剂、粉末、团块、凝胶、胶囊、食物产品、衣物袋或图书。

11.控制有害生物侵袭的方法，所述方法包括将有害生物暴露给包含权利要求1或2的双链RAN分子的组合物。

12.包含权利要求1或2的双链RNA分子的有害生物。

13.保护物体免受有害生物侵袭的方法，所述方法包括用包含权利要求1或2的双链RNA分子的组合物来处理所述表面。

14.权利要求13的方法，其中，所述物体是木材、树、图书粘合物、布或食物贮藏容器。

15.根据权利要求1或2的双链RNA分子、根据权利要求3的分离的多核苷酸或多核苷酸组、根据权利要求4的载体系统、根据权利要求5或6的细胞、根据权利要求7或8的食物产品、根据权利要求9或10的组合物或根据权利要求12的有害生物用于预防或处理昆虫侵袭的用途。