ES2557512T3

ES2557512T3 - Métodos basados en plantas transgénicas para plagas de plantas usando ARNi

Info

Publication number: ES2557512T3
Application number: ES10186026.0T
Authority: ES
Inventors: Romaan Raemaekers; Pascale Feldmann; Geert Plaetinck; Irene Nooren; Els Van Bleu; Frédéric PECQUEUR; Thierry Bogaert
Original assignee: Devgen NV
Current assignee: Devgen NV
Priority date: 2005-09-16
Filing date: 2006-09-18
Publication date: 2016-01-26
Anticipated expiration: 2026-09-18
Also published as: EP2275562A3; US8853489B2; CA2622660A1; PT2275562E; WO2007074405A3; JP2009508481A; EP2275563A2; ES2545093T3; EP2295584B1; US20090300796A1; BRPI0615791B1; EP2281896A3; EP2275562B1; EP1929020A2; WO2007074405A2; EP2295584A2; AU2006329563B2; AU2006329563A1; EP2275563A3; BRPI0615791A2

Abstract

Una célula de planta transformada con y que comprende un polinucleótido que codifica un ARN bicatenario, comprendiendo dicho ARN bicatenario hebras complementarias hibridadas, en el que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleótido seleccionado entre el grupo que consiste en: (i) polirribonucleótidos complementarios a al menos 21 nucleótidos contiguos de un gen diana representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061, (ii) polirribonucleótidos complementarios a al menos 21 nucleótidos contiguos de un gen diana que codifica la secuencia de aminoácidos representado por cualquiera de las SEC ID Nº: 1114, 24, 260 y 897, y (iii) polirribonucleótidos que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con los polirribonucleótidos de (i) o (ii).

Description

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DESCRIPCION

Metodos basados en plantas transgenicas para plagas de plantas usando ARNi Campo de la invencion

La presente invencion se refiere en general al control genetico de infestaciones por plagas. Mas espedficamente, la presente invencion se refiere a tecnologfas recombinantes de ARN bicatenario para suprimir o inhibir la expresion de una secuencia codificante diana en una plaga.

Introduccion

El ambiente esta repleto de plagas y se han probado numerosos metodos para controlar las infestaciones por plagas de las plantas. Las composiciones para controlar infestaciones por plagas microscopicas se han proporcionado en forma de composiciones antibioticas, antivirales y antifungicas. Los metodos para controlar las infestaciones por plagas mayores, tales como los nematodos, han estado tipicamente en forma de composiciones qmmicas que se aplican a las superficies sobre las que residen las plagas, o se han administrado a los animales infestados en forma de granulos, polvos, comprimidos, pastas, o capsulas.

Los cultivos comerciales son a menudo dianas para el ataque de insectos. Se ha logrado un progreso sustancial en las ultimas decadas hacia el desarrollo de metodos y composiciones mas eficientes para controlar las infestaciones por insectos en plantas. Los pesticidas qmmicos han sido muy eficaces para erradicar las infestaciones por plagas. Sin embargo, hay varias desventajas en cuanto al uso de agentes pesticidas qmmicos. Los pesticidas qmmicos no son solo potencialmente perjudiciales para el ambiente, sino que los pesticidas qmmicos no son selectivos y son daninos para varios cultivos y para fauna no diana. Los pesticidas qmmicos persisten en el ambiente y generalmente se metabolizan lentamente, o no se metabolizan. Se acumulan en la cadena alimentaria y particularmente en las especies de depredadores superiores. La acumulacion de estos agentes pesticidas qmmicos da como resultado el desarrollo de resistencia a los agentes y en especies mas arriba en la escala evolutiva, pueden actuar como agentes mutagenicos y/o carcinogenicos causando modificaciones geneticas irreversibles y perjudiciales.

Debido a los peligros asociados con los pesticidas qmmicos, se han desarrollado estrategias moleculares para controlar las infestaciones por plagas en plantas. Por ejemplo, las bacterias de Bacillus thuringiensis (B.t.) se han comercializado y usado como insecticidas seguros para el medio ambiente y aceptables durante mas de treinta anos. La disminucion en la aplicacion de agentes pesticidas ha dado como resultado que los suelos y las aguas que efluyen de estos suelos a las corrientes, nos, pozos y lagos esten mas limpios. Ademas de estos beneficios ambientales, ha habido un aumento perceptible en el numero de insectos beneficiosos en los campos de cultivo en los que crecen cultivos transgenicos resistentes a insectos debido a la disminucion en el uso de agentes insecticidas qmmicos.

La interferencia de ARN (ARNi) proporciona una herramienta potencialmente potente para controlar la expresion genica debido a su especificidad de seleccion de la diana y a una eficacia notablemente alta en la supresion del ARNm diana. ARNi se refiere al proceso de silenciamiento genico post-transcripcional espedfico de secuencia mediado por ARN pequenos interferentes (ARNpi) (Zamore, P. et al., Cell 101:25-33 (2000); Fire, A. et al., Nature 391:806 (1998); Hamilton et al., Science 286, 950-951 (1999); Lin et al., Nature 402:128-129 (1999)). Aunque los mecanismos subyacentes a la ARNi no estan completamente caracterizados, se cree que la presencia de ARNbc en una celula activa la ARNi activando la enzima Dicer ribonucleasa III (Zamore, P. et al., (2000); Hammond et al., Nature 404, 293 (2000)). Dicer procesa el ARNbc en pequenos trozos llamados ARN pequenos interferentes (ARNpi), que son de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleotidos de longitud y comprenden aproximadamente 19 duplex de pares de bases (Zamore et al., (2000); Elbashir et al., Genes Dev., 15, 188 (2001)). Despues de la administracion a celulas, las moleculas de ARNpi se asocian con un complejo de endonucleasa, citado comunmente como un complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), que junta la hebra antisentido del ARNpi y la diana genica de ARNm celular. RISC escinde al ARNm, que despues se libera y degrada. De manera importante, RISC es despues capaz de degradar copias adicionales del ARNm diana.

Por consiguiente, la presente divulgacion proporciona metodos y composiciones para controlar la infestacion por plagas reprimiendo, retrasando o de otro modo reduciendo la expresion genica en una plaga particular.

Sumario de la invencion

La presente invencion proporciona una celula de planta transformada con y que comprende un polinucleotido que codifica un ARN bicatenario, comprendiendo dicho ARN bicatenario hebras complementarias hibridadas, en la que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleotido seleccionado entre el grupo que consiste en:

(i) polirribonucleotidos complementarios a al menos 21 nucleotidos contiguos de un gen diana representado por cualquiera de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040y1061,

(ii) polirribonucleotidos complementarios a al menos 21 nucleotidos contiguos de un gen diana que codifica la

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secuencia de aminoacidos representado por cualquiera de las SEC ID N°: 114, 24, 260 y 897, y

(iii) polirribonucleotidos que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con los polirribonucleotidos de (i) o (ii).

La invencion tambien proporciona una planta transformada con y que comprende un polinucleotido que codifica un ARN bicatenario, comprendiendo dicho ARN bicatenario hebras complementarias hibridadas, en la que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleotido seleccionado entre el grupo que consiste en:

(ii) polirribonucleotidos complementarios a al menos 21 nucleotidos contiguos de un gen diana que codifica la secuencia de aminoacidos representado por cualquiera de las SEC ID N°: 1114, 24, 260 y 897, y

(iii) polirribonucleotidos que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con los polirribonucleotidos de (i)

o (ii).

La invencion proporciona ademas una planta que comprende un ARN bicatenario, comprendiendo dicho ARN bicatenario hebras complementarias hibridadas, en la que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleotido seleccionado entre el grupo que consiste en:

o (ii).

Ademas se proporciona una semilla de la planta de la invencion, comprendiendo dicha semilla dicho ARN bicatenario.

Tambien se proporciona un producto de la planta de la invencion, comprendiendo dicho producto dicho ARN bicatenario.

La invencion proporciona ademas un pesticida que comprende la planta de la presente invencion.

En una realizacion de la invencion, se proporciona un metodo para controlar una infestacion por una plaga de insectos, que comprende proporcionar a la plaga material de planta que comprende un ARN bicatenario, comprendiendo dicho ARN bicatenario hebras complementarias hibridadas, en la que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleotido seleccionado entre el grupo que consiste en:

o (ii).

En otra realizacion, se proporciona un metodo para controlar una infestacion por una plaga de insectos, que comprende proporcionar dicho ARN bicatenario en la dieta de dicha plaga o rociar la superficie de una planta con dicho ARN bicatenario.

Tambien se proporciona un metodo para mejorar el rendimiento de una cosecha, que comprende:

a) introducir en la planta un polinucleotido que codifica un ARN bicatenario, comprendiendo dicho ARN bicatenario hebras complementarias hibridadas, en la que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleotido seleccionado entre el grupo que consiste en:

(i) polirribonucleotidos complementarios a al menos 21 nucleotidos contiguos de un gen diana representado por cualquiera de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061,

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(iii) polirribonucleotidos que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con los polirribonucleotidos de (i) o (ii); y

b) cultivar dicha planta para permitir la expresion de dicho ARN bicatenario, en el que dicha expresion inhibe la alimentacion por una plaga de insectos y la perdida de rendimiento debido a la infestacion por la plaga.

Ademas, la invencion proporciona el uso de una planta o una celula de planta de la invencion o un producto producido por una planta de la invencion para tratar las infestaciones por insectos de plantas.

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1-LD: Supervivencia de L. decemlineata con dieta artificial tratada con ARNbc. Se alimento a los insectos en el segundo estado larvario con dieta tratada con 50 pl de solucion aplicada topicamente de ARNbc (dianas o control de gfp). La dieta se sustituyo por una dieta nueva que contema ARNbc aplicado topicamente despues de 7 dfas. El numero de insectos supervivientes se evaluo en los d^as 2, 5, 7, 8, 9 y 13. El porcentaje de larvas supervivientes se calculo en relacion al d^a 0 (comienzo del ensayo). LD006 diana: (SEC ID N°: 178); LD007 diana (SEC ID N°: 183); LD010 diana (SEC ID N°: 188); LD011 diana (SEC ID N°: 193); LD014 diana (SEC ID N°: 198); ARNbc de gfp (SEC ID N°: 235).

Figura 2-LD: Supervivencia de L. decemlineata con dieta artificial tratada con ARNbc. Se alimento a los insectos en el segundo estado larvario con dieta tratada con 50 pl de solucion aplicada topicamente de ARNbc (dianas o control de gfp). La dieta se sustituyo solo por una dieta nueva despues de 7 dfas. El numero de insectos supervivientes se evaluo en los dfas 2, 5, 6, 7, 8, 9, 12 y 14. El porcentaje de larvas supervivientes se calculo en relacion al dfa 0 (comienzo del ensayo). LD001 diana (SEC ID N°: 163); LD002 diana (SEC ID N°: 168); LD003 diana (SEC ID N°: 173); LD015 diana (SEC ID N°: 215); LD016 diana (SEC ID N°: 220); ARNbc de gfp (SEC ID N°: 235).

Figura 3-LD: Peso medio de larvas de L. decemlineata en discos foliares de patata tratados con ARNbc. Se alimento a los insectos en el segundo estado larvario con discos foliares tratados topicamente con 20 pl de una solucion aplicada topicamente (10 ng/pl) de ARNbc (LD002 diana o gfp). Despues de dos dfas se transfirio a los insectos cada dfa a hojas no tratadas.

Figura 4-LD: Supervivencia de L. decemlineata con dieta artificial tratada con versiones mas cortas de ARNbc de LD014 diana y ARNbc concatemero. Se alimento a los insectos en el segundo estado larvario con dieta tratada con 50 pl de solucion aplicada topicamente de ARNbc (gfp o dianas). El numero de insectos supervivientes se evaluo en los dfas 3, 4, 5, 6 y 7. El porcentaje de larvas supervivientes se calculo en relacion al dfa 0 (comienzo del ensayo).

Figura 5-LD: Supervivencia de larvas de L. decemlineata con dieta artificial tratada con diferentes concentraciones de ARNbc de LD002 diana (a), LD007 diana (b), LD010 diana (c), LD011 diana (d), LD014 diana (e), LD015 diana (f), LD016 (g) y LD027 diana (h). Se alimento a los insectos en el segundo estado larvario con dieta tratada con 50 pl de solucion aplicada topicamente de ARNbc. La dieta se sustituyo por una dieta nueva que contema ARNbc aplicado topicamente despues de 7 dfas. El numero de insectos supervivientes se evaluo a intervalos regulares. El porcentaje de larvas supervivientes se calculo en relacion al dfa 0 (comienzo del ensayo).

Figura 6-LD: Efectos de cepas de E. coli que expresan ARNbc de LD010 diana en la supervivencia de larvas del escarabajo de la patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata, a lo largo del tiempo. Las dos cepas bacterianas se ensayaron en bioensayos separados basados en dieta artificial: (a) AB301-105(DE3); los puntos de datos para pGBNJ003 y pGN29 representan los valores de mortalidad general de 5 clones bacterianos diferentes, (b) BL21(DE3); los puntos de datos para pGBNJ003 y pGN29 representan los valores de mortalidad general de 5 clones bacterianos diferentes y uno individual, respectivamente. Las barras de error representan desviaciones estandar.

Figura 7-LD: Efectos diferentes clones de cepas de E. coli (a) AB301-105 (DE3) y (b) BL21 (DE3) que expresan ARNbc de LD010 diana en la supervivencia de larvas del escarabajo de la patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata, 12 dfas despues de la infestacion. Los puntos de datos son valores de mortalidad media para cada clon para pGN29 y pGBNJ003. El clon 1 de AB301-105 (DE3) que porta el plasmido pGBNJ003 mostro una mortalidad del 100 % para el EPC en ese punto temporal. Las barras de error representan desviaciones estandar.

Figura 8-LD: Efectos diferentes clones de cepas de E. coli (a) AB301-105 (DE3) y (b) BL21 (DE3) que expresan ARNbc de LD010 diana en el crecimiento y desarrollo de los supervivientes larvarios del escarabajo de la patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata, 7 dfas despues de la infestacion. Los puntos de datos son valores de % de peso larvario medio para cada clon (un clon para pGN29 y cinco clones para pGBNJ003) basandose en los datos de la Tabla 10. El tratamiento solo con dieta representa un peso larvario 100 % normal.

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Figura 9-LD: Supervivencia de larvas del escarabajo de la patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata, en plantas de patata rociadas con bacterias productoras de ARN bicatenario 7 dfas despues de la infestacion. Se conto el numero de supervivientes larvarios y se expreso en terminos de % de mortalidad. La cepa bacteriana hospedadora usada fue la cepa deficiente en RNasaIII AB301-105 (DE3). La diana genica de insecto fue LD010.

Figura 10-LD: Retraso de crecimiento/desarrollo de supervivientes larvarios del escarabajo de la patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata, alimentados con plantas de patata rociados con bacterias productoras de ARNbc 11 dfas despues de la infestacion. La cepa bacteriana hospedadora usada fue la cepa deficiente en RNasaIII AB301-105 (DE3). Las cifras de los datos se representan como porcentaje del peso larvario normal; 100 % del peso larvario normal dado para tratamiento solo con dieta. La diana genica de insecto fue LD010. Las barras de error representan desviaciones estandar.

Figura 11-LD: Resistencia de la patata al dano causado por larvas del escarabajo de la patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata, por bacterias productoras de aRn bicatenario 7 dfas despues de la infestacion. A la izquierda, planta rociada con 7 unidades de bacteria AB301-105 (DE3) que contiene al plasmido pGN29; a la derecha, planta rociada con 7 unidades de bacteria AB301-105 (DE3) que contiene al plasmido pGBNJ003. Una unidad se define como el equivalente a 1 ml de una suspension bacteriana a un valor de DO de 1 a 600 nm. La diana genica de insecto fue LD010.

Figura 12-LD: Supervivencia de adultos de L. decemlineata en discos foliares de patata tratados con ARNbc. Se alimento a insectos adultos jovenes con discos foliares tratados con ARN bicatenario durante los dos primeros dfas y despues en follaje de patata no tratado. El numero de insectos supervivientes se evaluo de manera regular; se registro a los insectos que se movfan como insectos que estaban vivos y paredan moverse normalmente; los insectos moribundos como insectos que estaban vivos pero que pareda que estaban enfermos y que se movfan lentamente, estos insectos no eran capaces de volver a colocarse tras ponerlos hacia arriba. LD002 diana (SEC ID N°: 168); LD010 diana (SEC ID N°: 188); LD014 diana (SEC ID N°: 198); LD016 diana (SEC ID N°: 220); ARNbc de gfp (SEC ID N°: 235).

Figura 13-LD: Efectos de ARN bicatenario diana producido por bacterias contra larvas de L. decemlineata. Se aplicaron cincuenta pl de una suspension de DO 1 de bacterias tratadas con calor que expresaban ARNbc (SEC ID N°: 188) topicamente sobre la dieta artificial en cada pocillo de una placa de 48 pocillos. Se pusieron larvas de EPC en estado L2 en cada pocillo. En el dfa 7, se tomo una foto de las larvas de EPC en una placa que contema (a) dieta con bacterias que expresan ARN bicatenario 10 diana, (b) dieta con bacterias que portan el vector vado pGN29 y, (c) solo dieta.

Figura 14-LD Efectos en la supervivencia larvaria de EPC y el crecimiento de diferentes cantidades de E. coli de la cepa AB301-105(DE3) inactivadas que portan el plasmido pGBNJ003 aplicadas topicamente al follaje de la patata antes de la infestacion por insectos. Se alimento a diez larvas de L1 con patata tratada durante 7 dfas. Cantidad de suspension bacteriana rociada sobre las plantas: 0,25 U, 0,08 U, 0,025 U, 0,008 U de diana 10 y 0,25 U de pGN29 (control negativo; tambien incluye agua Milli-Q). Una unidad (U) se define como la cantidad bacteriana equivalente presente en 1 ml de cultivo con un valor de densidad optica de 1 a 600nm. Se rocio un volumen total de 1,6 ml sobre cada planta. La diana genica de insecto fue LD010.

Figura 15-LD Resistencia de la patata al dano causado por larvas de EPC por E. coli de cepa AB301-105(DE3) inactivadas que portan el plasmido pGBNJ003 siete dfas despues de la infestacion. (a) agua, (b) 0,25 U de E. coli AB301-105(DE3) que portan pGN29, (c) 0,025 U de E. coli AB301-105(DE3) que portan pGBNJ003, (d) 0,008 U de E. coli AB301-105(De3) que portan pGBNJ003. Una unidad (U) se define como la cantidad bacteriana equivalente presente en 1 ml de cultivo con un valor de densidad optica de 1 a 600nm. Se rocio un volumen total de 1,6 ml sobre cada planta. La diana genica de insecto fue LD010.

Figura 1-PC: Efectos de los ARNbc diana ingeridos en la supervivencia y crecimiento de larvas de P. cochleariae. Se alimento a las larvas neonatas con discos foliares de colza tratados con 25 pl de solucion de ARNbc a 0,1 pg/pl aplicada topicamente (dianas o control de gfp). Despues de 2 dfas, los insectos se transfirieron a nuevos discos foliares tratados con ARNbc. En el dfa 4, las larvas de un replicado por cada tratamiento se recogieron y se pusieron en una placa de Petri que conteman nuevo follaje de colza no tratado. Los insectos se evaluaron en los dfas 2, 4, 7, 9 y 11. (a) Supervivencia de larvas de P. cochleariae en discos foliares de colza tratados con ARNbc. El porcentaje de larvas supervivientes se calculo en relacion al dfa 0 (comienzo del ensayo). (b) Pesos medios de larvas de P. cochleariae en discos foliares de colza tratados con ARNbc. Se peso juntos a los insectos de cada replicado y se determino el peso medio por larva. Las barras de error representan desviaciones estandar. Diana 1: SEC ID N°: 473; diana 3: SEC ID N°: 478; diana 5: SEC ID N°: 483; diana 10: SEC ID N°: 488; diana 14: SEC ID N°: 493; diana 16: SEC ID N°: 498; diana 27: SEC ID N°: 503; ARNbc de gfp: SEC ID N°: 235.

Figura 2-PC: Supervivencia de P. cochleariae en discos foliares de colza tratados con diferentes concentraciones de ARNbc de (a) PC010 diana y (b) PC027 diana. Se colocaron larvas neonatas en discos foliares tratados con 25 pl de solucion de ARNbc aplicada topicamente. Los insectos se transfirieron a nuevos discos foliares tratados en el dfa 2. En el dfa 4 para PC010 diana y en el dfa 5 para PC027 diana, se transfirio a

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los insectos a hojas no tratadas. El numero de insectos supervivientes se evaluo en los dfas 2, 4, 7, 8, 9 y 11 para PC010 y 2, 5, 8, 9 y 12 para PC027. El porcentaje de larvas supervivientes se calculo en relacion al dfa 0 (comienzo del ensayo).

Figura 3-PC: Efectos de E.coli de la cepa AB301-105(DE3) que expresan PC010 diana de ARNbc en la supervivencia del escarabajo de la hoja de la mostaza, P. cochleariae, a lo largo del tiempo. Los puntos de datos para cada tratamiento representan los valores de mortalidad media de 3 replicados diferentes. Las barras de error representan desviaciones estandar. Diana 10: SEC ID N°: 488

Figura 1-EV: Supervivencia de larvas de E. varivestis en discos foliares de alubia tratados con ARNbc. Se alimento a las larvas neonatas con discos foliares de alubia tratados con 25 pl de solucion de ARNbc a 1 pg/pl aplicada topicamente (dianas o control de gfp). Despues de 2 dfas, los insectos se transfirieron a nuevos discos foliares tratados con ARNbc. En el dfa 4, las larvas de un tratamiento se recogieron y se pusieron en una caja de plastico que conteman nuevo follaje de alubia no tratado. Se evaluo la mortalidad de los insectos en los dfas 2, 4, 6, 8 y 10. El porcentaje de larvas supervivientes se calculo en relacion al dfa 0 (comienzo del ensayo). Diana 5: SEC ID N°: 576; diana 10: SEC ID N°: 586; diana 15: SEC ID N°: 591; diana 16: SEC ID N°: 596; ARNbc de gfp: SEC ID N°: 235.

Figura 2-EV: Efectos de ARNbc diana ingerido en la supervivencia de adultos de E. varivestis y resistencia al dano foliar por insectos de judfa verde. (a) Supervivencia de adultos de E. varivestis en hojas de alubia tratadas con ARNbc. Se alimento a los adultos con discos foliares de alubia tratados con 75 pl de solucion de ARNbc a 0,1 pg/pl aplicada topicamente (dianas o control de gfp). Despues de 24 horas, los insectos se transfirieron a nuevos discos foliares tratados con ARNbc. Despues de 24 horas adicionales, los adultos de un tratamiento se recogieron y se pusieron en una caja de plastico que contema nuevas plantas de alubia enteras en maceta no tratadas. Se evaluo la mortalidad de los insectos en los dfas 4, 5, 6, 7, 8 y 11. El porcentaje de adultos supervivientes se calculo en relacion al dfa 0 (comienzo del ensayo). Diana 10: SEC ID N°: 586; diana 15: SEC ID N°: 591; diana 16: SEC ID N°: 596; ARNbc de gfp: SEC ID N°: 235. (b) Resistencia al dano foliar de la alubia causado por adultos de E. varivestis por ARNbc. Las plantas enteras que conteman insectos de un tratamiento (vease (a)) se comprobaron visualmente en busca de dano foliar en el dfa 9. (i) diana 10; (ii) diana 15; (iii) diana 16; (iv) ARNbc de gfp: (v) no tratados.

Figura 1-TC: Supervivencia de larvas de T. castaneum con dieta artificial tratadas con ARNbc de diana 14. Se alimento a las larvas neonatas con dieta basada en una mezcla de harina/leche con 1 mg ARNbc de diana 14. El control fue agua (sin ARNbc) en la dieta. Se efectuaron cuatro replicados de 10 larvas en primer estadio por replicado para cada tratamiento. Se evaluo la supervivencia de los insectos como media del porcentaje en los dfas 6, 17, 31, 45 y 60. El porcentaje de larvas supervivientes se calculo en relacion al dfa 0 (comienzo del ensayo). Las barras de error representan desviaciones estandar. TC014 diana: SEC ID N°: 878.

Figura 1-MP: Efecto de ARNbc de diana 27 en la supervivencia de ninfas de Myzus persicae. Aquellas en el primer estadio se pusieron en camaras de alimentacion que conteman 50 pl de dieta lfquida con 2 pg/pl de ARNbc (diana 27 o control de ARNbc de gfp). Por tratamiento, se pusieron 5 camaras de alimentacion con 10 estadios en cada camara de alimentacion. El numero de supervivientes se evaluo a los 8 dfas despues de comenzar el bioensayo. Las barras de error representan desviaciones estandar. MP027 diana: SEC ID N°: 1061; ARNbc de gfp: SEC ID N°: 235.

Figura 1-NL: Supervivencia de Nilaparvata lugens en dieta artificial lfquida tratada con ARNbc. Se alimento a ninfas del primer o segundo estadio larvario con dieta suplementada con solucion de 2 mg/ml de dianas de ARNbc en bioensayos separados: (a) NL002, NL003, NL005, NL010; b) NL009, NL016; c) NL014, NL018; (d) NL013, NL015, NL021. La supervivencia de insectos sobre dianas se comparo con la de solo dieta y dieta con control de ARNbc de gfp a la misma concentracion. La dieta se reemplazo por una dieta nueva que contema ARNbc cada dos dfas. El numero de insectos supervivientes se evaluo cada dfa.

Figura 2-NL: Supervivencia de Nilaparvata lugens en dieta artificial lfquida tratada con diferentes concentraciones de ARNbc de NL002 diana. Se alimento a ninfas del primer o segundo estadio larvario con dieta suplementada con 1, 0,2, 0,08 y 0,04 mg/ml (concentracion final) de NL002. La dieta se reemplazo por una dieta nueva que contema ARNbc cada dos dfas. El numero de insectos supervivientes se evaluo cada dfa.

Descripcion detallada de la invencion

La presente divulgacion proporciona un medio para controlar las infestaciones por plagas administrando a una plaga una secuencia codificante diana que suprime o inhibe de manera post-transcripcional una funcion biologica requerida en la plaga. En un aspecto, la divulgacion contempla alimentar a una plaga con una molecula o mas de acido ribonucleico (ARN) bicatenario o interferente pequeno transcrito a partir de la totalidad o una porcion de una secuencia codificante diana que es esencial para el mantenimiento y supervivencia de la plaga. Por tanto, la presente divulgacion se refiere a la inhibicion espedfica de secuencia de secuencias codificantes usando ARN bicatenario (ARNbc), incluyendo ARN pequeno interferente (ARNpi), como medio para el control de plagas.

Hasta ahora, no ha sido practico proporcionar moleculas de ARNbc en la dieta de la mayona de las especies de

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plagas debido a que las moleculas de ARN se degradan facilmente por las nucleasas en el ambiente y se creyo que eran inestables en ambientes levemente alcalinos o acidos, tales como aquellos encontrados en los tractos digestivos de la mayor parte de plagas de invertebrados. Por tanto, ha existido la necesidad de metodos mejorados para modular la expresion genica suprimiendo, retrasando o de otro modo reduciendo la expresion genica en una plaga particular con el fin de controlar una infestacion por una plaga o para introducir nuevos rasgos fenotipicos.

Los inventores en el presente documento han identificado medios para controlar la infestacion por una plaga proporcionando moleculas de ARNbc en la dieta de dicha plaga. La secuencia del ARNbc corresponde a una parte o la totalidad de un gen esencial de la plaga y produce la regulacion negativa de la plaga mediante interferencia de ARN (ARNi). Como resultado de la regulacion negativa del ARNm, el ARNbc previene la expresion de la protema diana de la plaga y da como resultado uno o mas de (pero sin limitacion) los siguientes atributos: reduccion en la alimentacion por la plaga, reduccion en la viabilidad de la plaga, muerte de la plaga, inhibicion o diferenciacion y desarrollo de la plaga, ausencia o capacidad reducida de la reproduccion sexual por la plaga, formacion de musculos, formacion de hormona juvenil, regulacion de hormona juvenil, regulacion y transporte de iones, mantenimiento del potencial de la membrana celular, biosmtesis de aminoacidos, degradacion de aminoacidos, formacion del esperma, smtesis de feromonas, percepcion de feromonas, formacion de antenas, formacion de alas, formacion de patas, desarrollo y diferenciacion, formacion de huevos, maduracion larvaria, formacion de enzimas digestivas, smtesis de hemolinfa, mantenimiento de la hemolinfa, neurotransmision, division celular, metabolismo energetico, respiracion, apoptosis y cualquier componente de la estructura citoesqueletica de una celula eucariota, tales como, por ejemplo, actinas y tubulinas. Uno cualquiera o cualquier combinacion de estos atributos puede dar como resultado una inhibicion eficaz de la infestacion por la plaga y en el caso de una plaga de plantas, la inhibicion de la infestacion de la planta.

Todos los terminos tecnicos empleados en esta memoria descriptiva se usan de manera comun en bioqmmica, biologfa molecular y agricultura; de este modo, se entienden por los expertos en el campo al que pertenece esta divulgacion. Estos terminos tecnicos pueden encontrarse, por ejemplo, en: MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3a ed., Vol. 1 (-3), ed. Sambrook y Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Ausubel et al., Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience, Nueva York, 1988 (con actualizaciones periodicas); SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY: A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 5a ed., Vol. 1 (-2), ed. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc., 2002; GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL, Vol. 1-2, ed. Green et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997.

La metodologfa implicada en las tecnicas de biologfa vegetal se describen en el presente documento y tambien se describen en detalle en tratados tales como METHODS IN PLANT MOLECULAS BIOLOGY: A LABORATORY COURSE MANUAL, ed. Maliga et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1995. Se describen varias tecnicas usando PCR, por ejemplo, en Innis et al., PcR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, San Diego, 1990 y en Dieffenbach y Dveksler, PCR PRIMER: A LABORATORY MANUAL, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2003. Los pares de cebadores de PCR pueden derivarse de secuencias conocidas mediante tecnicas conocidas, tales como el uso de programas informaticos previstos para ese fin, por ejemplo, Primer, version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA. Los metodos para la smtesis qmmica de acidos nucleicos se discuten, por ejemplo, en Beaucage y Caruthers, Tetra. Letts. 22: 1859-62 (1981) y Matteucci y Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103: 3185 (1981).

Las digestiones con enzimas de restriccion, fosforilaciones, ligamientos y transformaciones se efectuaron tal como se describe en Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press. Todos los reactivos y materiales usados para el crecimiento y mantenimiento de celulas bacterianas se obtuvieron a traves de Aldrich Chemicals (Milwaukee, Wis.), DIFCO Laboratories (Detroit, Mich.), Invitrogen (Gaithersburg, Md.), o Sigma Chemical Company (St. Louis, Mo.) a menos que se especifique lo contrario.

Transformacion de Agrobacterium o bacteriana: como se conoce bien en la tecnica, las Agrobacteria que se usan para transformar celulas vegetales son derivados desarmados y virulentos de, generalmente, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes, que contienen un vector. El vector contiene tfpicamente un polinucleotido deseado que se localiza entre los lfmites de un ADN-T. Sin embargo, puede usarse cualquier bacteria capaz de transformar una celula vegetal, tales como, Rhizobium trifolii, Rhizobium leguminosarum, Phyllobacterium myrsinacearum, SinoRhizobium meliloti y MesoRhizobium loti.

Angiosperma: plantas vasculares que tienen semillas encerradas en un ovario. Las angiospermas son plantas de semilla que producen flores que portan frutos. Las angiospermas se dividen en plantas dicotiledoneas y monocotiledoneas.

La actividad biologica se refiere al comportamiento biologico y los efectos de una protema o peptido y sus manifestaciones en una plaga. Por ejemplo, un ARNi puede evitar la traduccion de un ARNm particular, inhibiendo de este modo la actividad biologica de la protema codificada por el ARNm u otra actividad biologica de la plaga.

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En la presente descripcion, una molecula de ARNi puede inhibir una actividad biologica en una plaga, dando como resultado uno o mas de (pero sin limitacion) los siguientes atributos: reduccion en la alimentacion por la plaga, reduccion en la viabilidad de la plaga, muerte de la plaga, inhibicion o diferenciacion y desarrollo de la plaga, ausencia o capacidad reducida de la reproduccion sexual por la plaga, formacion de musculos, formacion de hormona juvenil, regulacion de hormona juvenil, regulacion y transporte de iones, mantenimiento del potencial de la membrana celular, biosmtesis de aminoacidos, degradacion de aminoacidos, formacion del esperma, smtesis de feromonas, percepcion de feromonas, formacion de antenas, formacion de alas, formacion de patas, desarrollo y diferenciacion, formacion de huevos, maduracion larvaria, formacion de enzimas digestivas, smtesis de hemolinfa, mantenimiento de la hemolinfa, neurotransmision, division celular, metabolismo energetico, respiracion, apoptosis y cualquier componente de la estructura citoesqueletica de una celula eucariota, tales como, por ejemplo, actinas y tubulinas.

Un producto basico abarca cualquier producto producido o de otro modo derivado a partir de una planta, incluyendo, pero sin limitacion, comida, alimento, fibra, papel, comida, protema, almidon, harina, ensilaje, cafe, te y aceite.

ADN complementary (ADNc) se refiere a un ADN monocatenario sintetizado a partir de un molde de ARNm maduro. Aunque hay varios metodos, el ADNc se sintetiza mas frecuentemente a partir de ARNm maduro (completamente cortado y empalmado) usando la enzima transcriptasa inversa. Esta enzima actua sobre una sola hebra de ARNm, generando su ADN complementario basandose en el emparejamiento de pares de bases de ARN (A, U, G, C) a sus complementos de ADN (T, A, C, G). Dos hebras de acido nucleico son sustancialmente complementarias cuando se emparejan al menos un 85 % de sus bases.

Polinucleotido deseado: un polinucleotido deseado es un elemento genetico, tal como un promotor, potenciador, o terminador, o un gen o un polinucleotido que se va a transcribir y/o traducir en una celula transformada que comprende el polinucleotido deseado en su genoma. Si el polinucleotido deseado comprende una secuencia que codifica un producto proteico, la region codificante puede unirse operativamente a elementos reguladores, tales como a un promotor y a un terminador, que producen la expresion de un transcrito de ARN mensajero asociado y/o un producto proteico codificado por el polinucleotido deseado. Por lo tanto, un "polinucleotido deseado" puede comprender un gen que esta unido operativamente en la orientacion 5' a 3' a un promotor, un gen que codifica una protema y un terminador. Como alternativa, el polinucleotido deseado puede comprender un gen o un fragmento del mismo, en una orientacion "sentido" y/o "antisentido", cuya transcripcion produce acidos nucleicos que pueden afectar a la expresion de un gen endogeno en la celula vegetal. Un polinucleotido deseado tambien puede producir tras la transcripcion un producto de ARN bicatenario tras lo que se inicia la interferencia de ARN de un gen al que se asocia el polinucleotido deseado. Un polinucleotido deseado puede posicionarse en un vector, de tal forma que las secuencias del lfmite izquierdo y derecho flanquean o se encuentran a cada lado del polinucleotido deseado. La presente divulgacion preve la integracion estable de uno o mas polinucleotidos deseados en el genoma de al menos una celula hospedadora. Un polinucleotido deseado puede estar mutado o ser una variante de su secuencia de tipo silvestre. Se entiende que la totalidad o parte del polinucleotido deseado puede integrarse en el genoma de un hospedador. Tambien se entiende que la expresion "polinucleotido deseado" abarca uno o mas de dichos polinucleotidos. Por lo tanto, un vector puede comprender uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o mas polinucleotidos deseados.

Una planta dicotiledonea (dicot) es una planta de flor cuyos embriones tienen dos mitades de semilla o cotiledones, venas foliares ramificadas y partes de flor en multiplos de cuatro o cinco. Los ejemplos de dicotiledoneas incluyen, pero sin limitacion, Eucalyptus, Populus, Liquidamber, Acacia, teka, caoba, algodon, tabaco, Arabidopsis, tomate, patata, remolacha azucarera, brecol, mandioca, batata, pimiento, poinsetia, judfa, alfalfa, soja, zanahoria, fresa, lechuga, roble, arce, nogal, rosa, menta, calabaza, margarita, geranio, aguacate y cactus.

Exogeno, en referencia a un acido nucleico, significa que ese acido nucleico se deriva de organismos no hospedadores. El ADN o ARN exogeno representa acidos nucleicos que son de origen natural en la composicion genetica de hongos, bacterias, virus, mairnferos, peces o aves, pero que no son de origen natural en el hospedador que se va a transformar. Por lo tanto, un acido nucleico exogeno es uno que codifica, por ejemplo, un polipeptido que no se produce de manera natural por el hospedador transformado. Un acido nucleico exogeno no tiene por que codificar un producto proteico.

Un hongo o celulas fungicas, tal como se usa en el presente documento se refiere a cualquier celula presente en o derivada de un organismo que pertenece al reino Fungi. Los metodos son aplicables a todos los hongos y celulas fungicas que son susceptibles de silenciamiento genico mediante interferencia de ARN y que son capaces de internalizar ARN bicatenario a partir de su ambiente inmediato.

En una realizacion, el hongo puede ser un moho, o mas particularmente un hongo filamentoso. En otras realizaciones, el hongo puede ser una levadura.

En una realizacion, el hongo puede ser un hongo ascomiceto, es decir, un hongo que pertenece al Phylum Ascomycota.

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En realizaciones y metodos preferidos pero no limitantes la celula fungica se selecciona del grupo que consiste en:

una celula fungica de, o una celula derivada de un hongo patogeno para plantas, tales como, pero sin limitacion, Acremoniella spp., Allomyces spp., Alternaria spp. (por ejemplo Alternaria brassicola o Alternaria solani), Amorphothec spp., Ascochyta spp. (por ejemplo, Ascochyta pisi), Aspergillius spp., Aureobasidium spp., Blastocladiella spp., Botrytis spp. (por ejemplo, Botrytis cinerea o Botryotinia fuckeliana), Candida spp., Cladosporium spp., Cercospora spp. (por ejemplo Cercospora kikuchii o Cercospora zaea-maydis), Chaetomium spp., Cladosporium spp. (por ejemplo Cladosporium fulvum), Colletotrichum spp. (por ejemplo Colletotrichum lindemuthianum), Coccidioides spp., Conidiobolus spp., Coprinopsis spp., Corynascus spp., Cryphonectria spp., Cryptococcus spp., Cunninghamella spp., Curvularia spp., Debarymyces spp., Diplodia spp. (por ejemplo Diplodia maydis), Emericella ssp., Encephalitozoon spp., Eremothecium spp., Erysiphe spp. (por ejemplo Erysiphe graminis f. sp. graminis, Erysiphe graminis f.sp. hordei o Erysiphe pisi), Erwinia armylovora, Fusarium spp. (por ejemplo Fusarium nivale, Fusarium sporotrichioides, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Fusarium germinearum, Fusarium culmorum, Fusarium solani, Fusarium moniliforme o Fusarium roseum), Gaeumanomyces spp. (por ejemplo Gaeumanomyces graminis f.sp. tritici), Geomyces spp., Gibberella spp. (por ejemplo Gibberella zeae), Gloeophyllum spp., Glomus spp., Helminthosporium spp. (por ejemplo Helminthosporium turcicum, Helminthosporium carbonum, Helminthosporium mavdis o Helminthosporium sigmoideum), Hypocrea spp., Kluyveromyces spp., Lentinula spp., Leptosphaeria salvinii, Leucosporidium spp., Macrophomina spp. (por ejemplo Macrophomina phaseolina), Magnaportha spp. (por ejemplo Magnaporthe oryzae), Metharhizium spp., Mucor spp., Mycosphaerella spp., Neurospora spp., Nectria spp. (por ejemplo Nectria heamatococca), Ophiostoma spp., Paracocidioides spp, Peronospora spp. (por ejemplo Peronospora manshurica o Peronospora tabacina), Phoma spp. (por ejemplo Phoma betae), Phaeopsheria spp., Phanerochaete spp., Phakopsora spp. (por ejemplo Phakopsora pachyrhizi), Phymatotrichum spp. (por ejemplo Phymatotrichum omnivorum), Phytophthora spp. (por ejemplo Phytophthora cinnamomi, Phytophthora cactorum, Phytophthora phaseoli, Phytophthora parasitica, Phytophthora citrophthora, Phytophthora megasperma f.sp. soiae o Phytophthora infestans), Plasmopara spp. (por ejemplo Plasmopara viticola), Pneumocystis spp., Podosphaera spp. (por ejemplo Podosphaera leucotricha), Puccinia spp. (por ejemplo Puccinia sorghi, Puccinia striiformis, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia asparagi, Puccinia recondita o Puccinia arachidis), Pythium spp. (por ejemplo Pythium aphanidermatum), Pyronema spp., Pyrenophora spp. (por ejemplo Pyrenophora tritici-repentens o Pyrenophora teres), Pyricularia spp. (por ejemplo Pyricularia oryzae), Pythium spp. (por ejemplo Pythium ultimum), Rhincosporium secalis, Rhizoctonia spp. (por ejemplo Rhizoctonia solani, Rhizoctonia oryzae o Rhizoctonia cerealis), Rhizopus spp. (por ejemplo Rhizopus chinensid), Saccharomyces spp., Scerotium spp. (por ejemplo Scerotium rolfsii), Sclerotinia spp. (por ejemplo Sclerotinia sclerotiorum), Septoria spp. (por ejemplo Septoria lycopersici, Septoria glycines, Septoria nodorum o Septoria tritici), Spizellomyces spp., Thermomyces spp., Thielaviopsis spp. (por ejemplo Thielaviopsis basicola), Tilletia spp., Trametes spp., Trichoderma spp. (por ejemplo Trichoderma virde), Trichophyton spp., Uncinula spp. (por ejemplo Uncinula necator), Ustilago maydis (por ejemplo tizon del mafz), Venturia spp. (por ejemplo Venturia inaequalis o Venturia pirina) Yarrwia spp. o Verticillium spp. (por ejemplo Verticillium dahliae o Verticillium albo-atrum).

Gen se refiere a una secuencia polinucleotidica que comprende secuencias de control y codificantes necesarias para la produccion de un polipeptido o precursor. El polipeptido puede estar codificado por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier porcion de la secuencia codificante. Un gen puede constituir una secuencia codificante no interrumpida o puede incluir uno o mas intrones, unidos por las uniones de corte y empalme adecuadas. Ademas, un gen puede contener una o mas modificaciones bien en las regiones codificantes o no traducidas que podnan afectar a la actividad biologica o a la estructura qmmica del producto de expresion, a la velocidad de expresion o al modo de control de la expresion. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitacion, mutaciones, inserciones, eliminaciones y sustituciones de uno o mas nucleotidos. En este sentido, dichos genes modificados pueden citarse como "variantes" del gen "nativo".

Un elemento genetico es cualquier secuencia nucleotidica discreta, tal como, pero sin limitacion, un promotor, gen, terminador, intron, potenciador, espaciador, region 5' no traducida, region 3' no traducida, o sitio de reconocimiento de recombinasa.

Una modificacion genetica se refiere a la introduccion estable de ADN en el genoma de determinados organismos aplicando metodos de biologfa molecular y celular.

La "supresion genica" o "regulacion negativa de la expresion genica" o "inhibicion de la expresion genica" se usan de manera intercambiable y se refieren a una reduccion medible u observable en la expresion genica o una supresion completa detectable de la expresion genica, al nivel de producto proteico y/o producto de ARNm del gen diana. La regulacion negativa o inhibicion de la expresion genica es "espedfica" cuando la regulacion negativa o la inhibicion del gen diana sucede sin efectos evidentes en otros genes de la plaga.

Dependiendo de la naturaleza del gen diana, la regulacion negativa o la inhibicion de la expresion genica en las celulas de una plaga puede confirmarse mediante analisis fenotfpico de la celula o de la plaga completa o midiendo el ARNm o la expresion proteica usando tecnicas moleculares, tales como hibridacion de solucion de ARN, proteccion de nucleasas, hibridacion de Northern, retrotranscripcion, control de la expresion genica con una micromatriz, union de anticuerpos, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), transferencia Western, radioinmunoensayo (RIA), otros inmunoensayos o analisis de celulas activadas por fluorescencia (FACS).

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Gimnosperma, tal como se usan en el presente documento, se refiere a una planta de semilla que porta semillas sin ovarios. Los ejemplos de gimnospermas incluyen comferas, dcadas, ginkgos y efedras.

Homologia, tal como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias. Es posible que las secuencias de protemas o nucleotidos sean homologas si muestran un nivel "significativo" de similitud de secuencia o mas preferentemente de identidad de secuencia. Las secuencias realmente homologas estan relacionadas por la divergencia a partir de un gen antecesor comun. Los homologos de secuencia pueden ser de dos tipos: (i) en los casos donde existen homologos en diferentes especies se conocen como ortologos. Por ejemplo, los genes de a- globina en ser humano y raton son ortologos; (ii) los paralogos son genes homologos en una sola especie. Por ejemplo, los genes de a- y p-globina en raton son paralogos.

Una celula hospedadora se refiere a un microorganismo, a una celula procariota, a una celula eucariota, o a una lmea celular cultivada como una entidad unicelular que puede usarse, o se ha usado como receptor para un vector recombinante u otra transferencia de polinucleotidos, e incluye la descendencia de la celula original que se ha transfectado. La descendencia de una celula individual puede no ser necesariamente completamente identica en su morfologfa en su genomica o en el complemento de ADN total que el progenitor original debido a mutaciones naturales, accidentales o deliberadas.

Insecto tal como se usa en el presente documento puede ser cualquier insecto, lo que significa cualquier organismo que pertenece al reino de los Animales, mas espedficamente al phylum Arthropoda y a la clase Insecta o a la clase arachnida. Los metodos son aplicables a todos los insectos que son susceptibles de silenciamiento genico mediante interferencia de ARN y que son capaces de internalizar ARN bicatenario a partir de su ambiente inmediato.

En una realizacion, el insecto puede pertenecer a los siguientes ordenes: Acari, Araneae, Anoplura, Coleoptera, Collembola, Dermaptera, Dictyoptera, Diplura, Diptera, Embioptera, Ephemeroptera, Grylloblatodea, Hemiptera, Homoptera, Hymenoptera, Isoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Mecoptera, Neuroptera, Odonata, Orthoptera, Phasmida, Plecoptera, Protura, Psocoptera, Siphonaptera, Siphunculata, Thysanura, Strepsiptera, Thysanoptera, Trichoptera y Zoraptera.

En realizaciones y metodos preferidos pero no limitantes, el insecto se selecciona entre el grupo que consiste en:

un insecto que es una plaga para plantas, tal como, pero sin limitacion Nilaparvata spp. (por ejemplo, N. lugens (saltamontes marron)); Laodelphax spp. (por ejemplo, L. striatellus (saltamontes marron pequeno)); Nephotettix spp. (por ejemplo, N. virescens o N. cincticeps (saltahojas verde), o N.nigropictus (saltahojas del arroz)); Sogatella spp. (por ejemplo, S. furcifera (saltamontes de dorso blanco)); Blissus spp. (por ejemplo, B. leucopterus leucopterus (chinche)); Scotinophora spp. (por ejemplo, S. vermidulate (insecto negro del arroz)); Acrosternum spp. (por ejemplo,

A. hilare (chinche verde)); Parnara spp. (por ejemplo, P. guttata (saltador del arroz)); Chilo spp. (por ejemplo, C. suppressalis (barrenador rayado del tallo del arroz), C. auricilius (barrenador del tallo de flecos dorados), o C. polychrysus (barrenador del tallo de cabeza negra)); Chilotraea spp. (por ejemplo, C. polychrysa (barrenador del tallo del arroz)); Sesamia spp. (por ejemplo, S. inferens (barrenador rosa del arroz)); Tryporyza spp. (por ejemplo, T. innotata (barrenador blanco del arroz), o T. incertulas (barrenador amarillo del arroz)); Cnaphalocrocis spp. (por ejemplo, C. medinalis (enrollador de la hoja del arroz)); Agromyza spp. (por ejemplo, A. oryzae (mosca minadora), o A. parvicornis (mosca minadora de la hoja del mafz)); Diatraea spp. (por ejemplo, D. saccharalis (barrenador de la cana del azucar), o D. grandiosella (barrenador del mafz del suroeste)); Narnaga spp. (por ejemplo, N. aenescens (oruga verde del arroz)); Xanthodes spp. (por ejemplo, X. transversa (oruga verde)); Spodoptera spp. (por ejemplo, S. frugiperda (gusano cogollero), S. exigua (oruga de la remolacha), S. littoralis (oruga podadora) o S. praefica (oruga podadora de rayas amarillas occidental)); Mythimna spp. (por ejemplo, Mythmna (Pseudaletia) seperata (oruga negra)); Helicoverpa spp. (por ejemplo, H. zea (gusano del mafz)); Colaspis spp. (por ejemplo, C. brunnea (colaspis de la uva)); Lissorhoptrus spp. (por ejemplo, L. oryzophilus (picudo acuatico del arroz)); Echinocnemus spp. (por ejemplo, E. squamos (picudo de la planta del arroz)); Diclodispa spp. (por ejemplo, D. armigera (hispa del arroz)); Oulema spp. (por ejemplo, O. oryzae (escarabajo de la hoja); Sitophilus spp. (por ejemplo, S. oryzae (picudo del arroz)); Pachydiplosis spp. (por ejemplo, P. oryzae (mosquito enano del arroz)); Hydrellia spp. (por ejemplo, H. griseola (minador pequeno del arroz), o H. sasakii (gusano del tallo del arroz)); Chlorops spp. (por ejemplo, C. oryzae (gusano del arroz)); Ostrinia spp. (por ejemplo, O. nubilalis (barrenador europeo del mafz)); Agrotis spp. (por ejemplo, A.ipsilon (gusano cortador negro)); Elasmopalpus spp. (por ejemplo, E. lignosellus (barrenador menor del tallo del maiz)); Melanotus spp. (gusano alambre); Cyclocephala spp. (por ejemplo, C. borealis (escarabajo rubio del norte), o C. immaculata (escarabajo rubio del sur)); Popillia spp. (por ejemplo, P. japonica (escarabajo japones)); Chaetocnema spp. (por ejemplo, C. pulicaria (escarabajo pulga del mafz)); Sphenophorus spp. (por ejemplo, S. maidis (picudo del mafz)); Rhopalosiphum spp. (por ejemplo, R. maidis (pulgon de la hoja del mafz)); Anuraphis spp. (por ejemplo, A. maidiradicis (pulgon de la rafz del mafz)); Melanoplus spp. (por ejemplo, M. femurrubrum (saltamontes de patas rojas) M. differentialis (saltamontes diferencial) o M. sanguinipes (saltamontes migratorio)); Hylemya spp. (por ejemplo, H. platura (mosca de la semilla del mafz)); Anaphothrips spp. (por ejemplo, A. obscrurus (trips de la hierba)); Solenopsis spp. (por ejemplo, S. milesta (hormiga ladrona)); o spp. (por ejemplo, T. urticae (arana de dos manchas), T. cinnabarinus (acaro carmm); Helicoverpa spp. (por ejemplo, H. zea (gusano del algodon), o H. armigera (gusano de america)); Pectinophora spp. (por ejemplo, P. gossypiella (gusano rosa)); Earias spp. (por ejemplo, E. vittella (gusano manchado)); Heliothis spp. (por ejemplo, H. virescens (gusano cogollero del tabaco)); Anthonomus spp. (por ejemplo, A. grandis (grillo de la capsula del algodonero)); Pseudatomoscelis spp.

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(por ejemplo, P. seriatus (pulga saltona del algodon)); Trialeurodes spp. (por ejemplo, T. abutiloneus (mosca blanca de alas bandeadas) T. vaporariorum (mosca blanca de invernadero)); Bemisia spp. (por ejemplo, B. argentifolii (mosca blanca de la hoja del tabaco)); Aphis spp. (por ejemplo, A. gossypii (pulgon del algodon), A. mellifera); Lygus spp. (por ejemplo, L. lineolaris (chinche manchadora) o L. hesperus (chinche manchadora occidental)); Euschistus spp. (por ejemplo, E. conspersus (chinche conspersa)); Chlorochroa spp. (por ejemplo, C. sayi (chinche de Say)); Nezara spp. (por ejemplo, N. viridula (chinche verde del sur)); Thrips spp. (por ejemplo, T. tabaci (trips de la cebolla)); Frankliniella spp. (por ejemplo, F. fusca (trips del tabaco), o F. occidentalis (trips occidental de la flor)); Leptinotarsa spp. (por ejemplo, L. decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado), L. juncta (falso escarabajo de la patata), o L. texana (falso escarabajo de la patata de Texas)); Lema spp. (por ejemplo, L. trilineata (escarabajo de la patata de tres lmeas)); Epitrix spp. (por ejemplo, E. cucumeris (escarabajo pulga de la patata), E. hirtipennis (escarabajo pulga), o E. tuberis (escarabajo pulga de tuberculos)); Epicauta spp. (por ejemplo, E. vittata (escarabajo ampolla de rayas)); Empoasca spp. (por ejemplo, E. fabae (saltahojas de la patata)); Myzus spp. (por ejemplo, M. persicae (pulgon verde del melocoton)); Paratrioza spp. (por ejemplo, P. cockerelli (psflido)); Conoderus spp. (por ejemplo, C. falli (gusano de alambre de la patata del sur), o C. vespertinus (gusano de alambre del tabaco)); Phthorimaea spp. (por ejemplo, P. operculella (polilla de la patata)); Macrosiphum spp. (por ejemplo, M. euphorbiae (pulgon de la patata)); Thyanta spp. (por ejemplo, T. pallidovirens (chinche de hombros rojos)); Phthorimaea spp. (por ejemplo, P. operculella (polilla de la patata)); Helicoverpa spp. (por ejemplo, H. zea (gusano del fruto del tomate); Keiferia spp. (por ejemplo, K. lycopersicella (gusano alfiler del tomate)); Limonius spp. (gusanos de alambre); Manduca spp. (por ejemplo, M. sexta (gusano del tabaco), o M. quinquemaculata (gusano del tomate)); Liriomyza spp. (por ejemplo, L. sativae, L. trifolli o L. huidobrensis (minador de hojas)); Drosophilla spp. (por ejemplo, D. melanogaster, D. yakuba, D. pseudoobscura o D. simulans); Carabus spp. (por ejemplo, C. granulatus); Chironomus spp. (por ejemplo, C. tentanus); Ctenocephalides spp. (por ejemplo, C.felis (pulga del gato)); Diaprepes spp. (por ejemplo, D. abbreviatus (picudo de la rafz)); Ips spp. (por ejemplo, I. pini (horadador del pino)); Tribolium spp. (por ejemplo, T. castaneum (escarabajo de suelo rojo)); Glossina spp. (por ejemplo G. morsitans (mosca tsetse)); Anopheles spp. (por ejemplo, A. gambiae (mosquito de la malaria)); Helicoverpa spp. (por ejemplo, H. armigera (gusano africano)); Acyrthosiphon spp. (por ejemplo, A. pisum (pulgon del guisante)); Apis spp. (por ejemplo, A. melifera (abeja melffera)); Homalodisca spp. (por ejemplo, H. coagulate (chicharrita de alas cristalinas)); Aedes spp. (por ejemplo, Ae. aegypti (mosquito de la fiebre amarilla)); Bombyx spp. (por ejemplo, B. mori (gusano de la seda),

B. mandarina); Locusta spp. (por ejemplo, L. migratoria (langosta migratoria)); Boophilus spp. (por ejemplo, B. microplus (pulga del ganado)); Acanthoscurria spp. (por ejemplo, A. gomesiana (tarantula chocolate de pelo rojo)); Diploptera spp. (por ejemplo, D. punctata (cucaracha escarabajo del padfico)); Heliconius spp. (por ejemplo, H. erato (mariposa roja de la flor de la pasion) o H. melpomene (mariposa de postman)); Curculio spp. (por ejemplo, C. glandium (picudo de la bellota)); Plutella spp. (por ejemplo, P. xylostella (polilla de la col)); Amblyomma spp. (por ejemplo, A. variegatum (pulga del ganado)); Anteraea spp. (por ejemplo, A. yamamai (polilla de la seda)); Belgica spp. (por ejemplo, B. antartica), Bemisa spp. (por ejemplo, B. tabaci), Bicyclus spp., Biphillus spp., Callosobruchus spp., Choristoneura spp., Cicindela spp., Culex spp., Culicoides spp., Diaphorina spp., Diaprepes spp., Euclidia spp., Glossina spp., Gryllus spp., Hydropsyche spp., Julodis spp., Lonomia spp., Lutzomyia spp., Lysiphebus spp, Meladema spp, Mycetophagus spp., Nasonia spp., Oncometopia spp., Papilio spp., Pediculus spp., Plodia spp., Rhynchosciara spp., Sphaerius spp., Toxoptera spp., Trichoplusa spp. y Armigeres spp. (por ejemplo, A. subalbatus).

Un "agente para el control de plagas" o un "agente de supresion genica" se refiere a una molecula particular de ARN que comprende un primer segmento de ARN y un segundo segmento de ARN, en el que la complementariedad entre el primer y el segundo segmento de ARN da como resultado la capacidad de los dos segmentos para que hibriden in vivo e in vitro para formar una molecula bicatenaria. Generalmente, puede ser preferible incluir un tercer segmento de ARN que enlace y estabilice a la primera y segunda secuencia de tal forma que puede formarse un tallo unido junto a un extremo de cada uno del primer y el segundo segmento por el tercer segmento para formar un bucle, de tal forma que la estructura completa forma una estructura de tallo y bucle, o las estructuras que hibridan de una manera mas estrechas pueden formar una estructura de tallo-bucle anudada. Como alternativa, podna formarse una horquilla simetrica sin un tercer segmento en el que no se ha disenado un bucle, pero que por razones estericas una horquilla podna formar su propio bucle cuando el tallo es lo suficientemente largo como para estabilizarse por sf mismo. El primer y el segundo segmento de ARN se encontrara generalmente entre la longitud de la molecula de ARN y sera una repeticion sustancialmente invertida del otro y se unen juntos mediante el tercer segmento de ARN. El primer y el segundo segmento corresponde invariablemente y no respectivamente a una secuencia sentido y una antisentido respecto del ARN transcrito a partir del gen diana en la plaga de insecto diana que se suprime por la ingestion de la molecula de ARNbc.

El agente de control de plagas puede ser una molecula de acido nucleico sustancialmente purificada (o aislada) y mas espedficamente moleculas de acido nucleico o fragmentos de moleculas de acido nucleico de las mismas de un ADN genomico (ADNg) o una biblioteca de ADNc. Como alternativa, los fragmentos pueden comprender oligonucleotidos mas pequenos que tengan de aproximadamente 15 a aproximadamente 250 restos de nucleotidos y mas preferentemente, de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 restos de nucleotidos.

Introduccion, tal como se usan en el presente documento, se refiere a la insercion de una secuencia de acido nucleico en una celula, mediante metodos que incluyen infeccion, transfeccion, transformacion o transduccion.

Una planta monocotiledonea (monocot) es una planta de flor que tiene embriones con un cotiledon u hoja de

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semilla, venas foliares paralelas y partes de flor en multiplos de tres. Los ejemplos de monocotiledoneas incluyen, pero sin limitacion, cesped, ir^z, arroz, avena, trigo, cebada, sorgo, orqmdea, iris, lirio, cebolla y palmera.

Los nematodos, o lombrices, son uno de los phylums de animales mas comunes, con mas de 20.000 especies diferentes descritas (mas de 15.000 son parasfticas. Son ubicuos en ambientes de agua dulce, marinos y terrestres, donde generalmente superan en numero a otros animales en cuando al recuento de individuos y de especies y se encuentran en localizaciones tan diversas como la Antartida y fosas oceanicas. Ademas, hay muchas formas parasfticas, incluyendo patogenos en la mayona de plantas y animales.

Los metodos son aplicables a todos los nematodos que son susceptibles de silenciamiento genico mediante interferencia de ARN y que son capaces de internalizar ARN bicatenario a partir de su ambiente inmediato.

En una realizacion, el nematodo puede pertenecer a la familia de los Heteroderidae, que abarca los generos Heterodera y Globodera.

En realizaciones y metodos preferidos pero no limitantes el nematodo se selecciona del grupo que comprende, pero sin limitacion: Meloidogyne spp. (por ejemplo, M. incognita, M. javanica, M. graminicola, M. arenaria, M. chitwoodi, M. hapla o M. paranaensis); Heterodera spp. (por ejemplo, H. oryzae, H. glycines, H. zeae o H. schachtii); Globodera spp. (por ejemplo, G. pallida o G. rostochiensis); Rotylenchulus spp. (por ejemplo, R. reniformis); Pratylenchus spp. (por ejemplo, P. coffeae, P. Zeae o P. goodeyi); Radopholus spp. (por ejemplo, R. similis); Hirschmaniella spp. (por ejemplo, H. oryzae); Ancylostoma spp. (por ejemplo, A. caninum, A. ceylanicum, A. duodenale o A. tubaeforme); Anisakid; Aphelenchoides spp. (por ejemplo, A. Besseyi); Ascarids; Ascaris spp., (por ejemplo, A. suum o A. lumbridoides); Belonolaimus spp.; Brugia spp. (por ejemplo, B. malayi o B. pahangi); Bursaphelenchus spp.; Caenorhabditis spp. (por ejemplo, C. elegans, C. briggsae o C. remanei); Clostridium spp. (por ejemplo, C. acetobutylicum); Cooperia spp. (por ejemplo, C. oncophora); Criconemoides spp.; Cyathostomum spp. (por ejemplo,

C. catinatum, C. coronatum o C. pateratum); Cylicocyclus spp. (por ejemplo, C. insigne, C. nassatus o C. radiatus); Cylicostephanus spp. (por ejemplo, C. goldi o C. longibursatus); Diphyllobothrium; Dirofilaria spp. (por ejemplo, D. immitis); Ditylenchus spp. (por ejemplo, D. dipsaci, D. destructor o D. Angustus); Enterobius spp. (por ejemplo, E. vermicularis); Haemonchus spp. (por ejemplo, H. contortus); Helicotylenchus spp.; Hoplolaimus spp.; Litomosoides spp. (por ejemplo, L. sigmodontis); Longidorus spp. (por ejemplo, L. macrosoma); Necator spp. (por ejemplo, N. americanus); Nippostrongylus spp. (por ejemplo, N. brasiliensis) ; Onchocerca spp. (por ejemplo, O. volvulus); Ostertagia spp. (por ejemplo, O. ostertagi); Parastrongyloides spp. (por ejemplo, P. trichosuri); Paratrichodorus spp. (por ejemplo, P. minor o P. teres); Parelaphostrongylus spp. (por ejemplo, P. tenuis); Radophulus spp.; Scutellonerna. spp.; Strongyloides spp. (por ejemplo, S. Ratti o S. stercoralis); Teladorsagia spp. (por ejemplo, T. circumcincta); Toxascaris spp. (por ejemplo, T. leonina); Toxocara spp. (por ejemplo, T. canis o T. cati); Trichinella spp. (por ejemplo, T. britovi, T. spiralis o T. spirae); Trichodorus spp. (por ejemplo, T. similis); richuris spp. (por ejemplo, T. muris, T. vulpis o T. trichiura); Tylenchulus spp.; Tylenchorhynchus spp.; Uncinaria spp. (por ejemplo, U. stenocephala); Wuchereria spp. (por ejemplo, W. bancrofti); Xiphinema spp. (por ejemplo, X. Index o X. americanum).

Los nematodos parasfticos de plantas causan grandes perdidas de cosechas. Los generos mas comunes son: Aphelenchoides (nematodos foliares), Meloidogyne (nematodos del tallo radicular), Heterodera, Globodera (nematodos dsticos) tales como el nematodo de la rafz de la patata, Nacobbus, Pratylenchus (nematodos lesionadores), Ditylenchus, Xiphinema, Longidorus, Trichodorus. Otros nematodos atacan a la corteza y a los arboles de bosques. El representante mas importante de este grupo es Bursaphelenchus xylophilus, el nematodo de la madera del pino, presente en Asia y America y recientemente descubierto en Europa.

Una celula normal se refiere a una celula de un fenotipo no transformado o que muestra una morfologfa de una celula no transformada del tipo de tejido que se esta examinando.

Unido operativamente significa combinar dos o mas moleculas de tal modo que en combinacion funcionan adecuadamente en una celula de planta. Por ejemplo, un promotor se une operativamente a un gen estructural cuando el promotor controla la transcripcion del gen estructural.

Los ortologos son genes que estan relacionados por descendencia vertical de un ancestro comun y codifican protemas con la misma funcion en especies diferentes. Debido a su separacion despues de un suceso de especiacion, los ortologos pueden divergir, pero normalmente tienen similitudes a niveles de secuencia y de estructura. Dos genes que se derivan de un ancestro comun y codifican protemas con funcion similar se citan como ortologos. La identificacion de ortologos es crftica para hacer predicciones fiables de la funcion genica en genomas recien secuenciados.

Plaga o plaga diana incluye, pero sin limitacion, insectos, aracnidos, crustaceos, hongos, bacterias, virus, nematodos, platelmintos, lombrices, oxiuros, anquilosomas, tenias, tripanosomas, esquistosomas, moscardones, pulgas, garrapatas, acaros y piojos que son parasfticos en el ambiente humano y perjudican a las plantas. Una plaga puede ingerir o entrar en contacto con una o mas celulas, tejidos, o productos producidos por una planta transformada con un agente de supresion genica bicatenario.

Un pesticida se refiere a cualquier sustancia o mezcla de sustancias pensadas para prevenir, destruir, repeler o

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mitigar cualquier plaga. Un pesticida puede ser una sustancia qmmica o un agente biologico, tal como una planta transgenica, usada contra plagas incluyendo insectos, patogenos de plantas, malas hierbas, nematodos y microbios que compiten con los humanos por la comida, destruyen la propiedad, esparcen enfermedades o son una molestia.

El fenotipo es un rasgo o caractenstica distintiva de una planta, que puede alterarse integrando uno o mas "polinucleotidos deseados" y/o marcadores de seleccion/exploracion en el genoma de al menos una celula de planta de una planta transformada. Los "polinucleotidos deseados" y/o marcadores pueden conferir un cambio en el fenotipo de una planta transformada, modificando una cualquiera de una serie de caractensticas o propiedades geneticas, moleculares, bioqmmicas, fisiologicas, morfologicas o agronomicas de la celula vegetal o planta transformada en su conjunto. Por lo tanto, la expresion de uno o mas polinucleotidos deseados integrados de manera estable en el genoma de una planta puede producir un fenotipo seleccionado del grupo que consiste en, pero sin limitacion, tolerancia aumentada a enfermedades, tolerancia aumentada a insectos, tolerancia aumentada a la seqrna, tolerancia mejorada al fno y a las heladas, vigor mejorado, color mejorado, salud y caractensticas nutricionales mejoradas, almacenamiento mejorado, rendimiento mejorado, tolerancia aumentada a la sal, tolerancia aumentada a metales pesados, tolerancia aumentada al estres por agua, dulzor aumentado, vigor mejorado, sabor mejorado, textura mejorada, contenido en fosfato disminuido, germinacion mejorada, captacion mejorada de micronutrientes, composicion de almidon mejorada y mayor longevidad de las flores.

Tejido vegetal: una "planta" es cualquiera de los diversos organismos fotosinteticos, eucariotas y multicelulares del reino Plantae que de manera caractenstica producen embriones, contienen cloroplastos y tienen paredes celulares de celulosa. Una parte de una planta, es dear, un "tejido de planta" puede tratarse de acuerdo con los metodos de la presente divulgacion para producir una planta transgenica. Pueden transformarse muchos tejidos de plantas e incluyen, pero sin limitacion, embriones somaticos, polen, hojas, tallos, callos, estolones, microtuberculos y brotes. Por lo tanto, la presente divulgacion preve la transformacion de plantas angiospermas y gimnospermas tales como acacia, alfalfa, manzana, albaricoque, alcachofa, fresno, esparrago, aguacate, banana, cebada, judfa, remolacha, abedul, haya, mora, arandano, brecol, coles de Bruselas, repollo, colza, cantalupo, zanahoria, mandioca, coliflor, cedro, un cereal, apio, castana, cereza, col china, cftricos, clementinas, trebol, cafe, mafz, algodon, caupf, pepino, cipres, berenjena, olmo, endivia, eucalipto, hinojo, higos, abeto, geranio, uva, pomelo, cacahuete, cereza de suelo, cicuta, nogal americano, con rizada, kiwi, colinabo, alerce, lechuga, puerro, limon, lima, algarroba, pino, culantrillo, mafz, mango, arce, melon, mijo, champinon, mostaza, nuez, roble, avena, okra, cebolla naranja, una planta, flor o arbol ornamental, papaya, palma, perejil, chirrna, guisante, melocoton, cacahuete, pera, turba, pimiento, caqui, guandul, pino, pina, platano, ciruela, granada, patata, calabaza, achicoria, rabano, colza, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, sauce, soja, espinaca, pfcea, calabaza, fresa, remolacha azucarera, cana de azucar, girasol, batata, mafz dulce, mandarina, te, tabaco, tomate, arboles, tritical, cespedes, nabo, una vid, nogal, berro, sandfa, trigo, batata, tejo y calabacm.

De acuerdo con la presente divulgacion, un "tejido de planta" tambien abarca celulas vegetales. Las celulas vegetales incluyen cultivos en suspension, callos, embriones, regiones meristematicas, tejido calloso, hojas, rafces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen, semillas y microesporas. Los tejidos de plantas pueden estar en varios estados de madurez y pueden crecerse en cultivo lfquido o solido, o en suelo o medio adecuado en macetas, invernaderos o campos. Un tejido de planta tambien se refiere a cualquier clon de dicha planta, semilla, descendencia, propagulo ya se genere sexual o asexualmente y los descendientes de cualquiera de estos, tales como esquejes o semillas.

Transformacion de plantas y cultivo celular: se refiere generalmente al proceso mediante el cual las celulas vegetales se modifican geneticamente y se transfieren a un medio de cultivo de plantas adecuado para su mantenimiento, crecimiento posterior y/o desarrollo posterior. Dichos metodos se conocen bien por los expertos en la materia.

Progenie: una "progenie", tal como la progenie de una planta transgenica, es una que nace de, se engendra por, o se deriva de una planta o de la planta transgenica. Por lo tanto, una planta de "progenie", es dear, una planta de generacion "F1" es la descendencia o un descendiente de la planta transgenica producida mediante los metodos de la invencion. Una progenie de una planta transgenica puede contener en al menos uno, algunos, o todos sus genomas celulares el polinucleotido deseado que se integro en una celula de la planta transgenica parental mediante los metodos descritos en el presente documento. Por lo tanto, el polinucleotido deseado se "transmite" o "hereda" por la planta de progenie. El polinucleotido deseado que se hereda de este modo en la planta de progenie puede residir en una construccion de ADN-T, que tambien se hereda por la planta de progenie a partir de su progenitor. El termino "progenie", tal como se usa en el presente documento, puede considerarse tambien como los vastagos o descendientes de un grupo de plantas.

Promotor: promotor pretende significar un acido nucleico, preferentemente ADN que se une a ARN polimerasa y/o a otros elementos reguladores de la transcripcion. Como con cualquier promotor, los promotores facilitaran o controlaran la transcripcion del ADN o ARN para generar una molecula de ARNm a partir de una molecula de acido nucleico que esta unida operativamente al promotor. Tal como se ha afirmado anteriormente, el ARN generado puede codificar una protema o polipeptido o puede codificar un ARN de interferencia, o una molecula antisentido.

un promotor de planta es un promotor capaz de iniciar la transcripcion en celulas vegetales independientemente de

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si su origen es una celula vegetal o no. Los promotores de plantas ejemplares incluyen, pero sin limitacion, aquellos que se obtienen de plantas, virus de plantas y bacterias, tales como Agrobacterium o Rhizobium que comprenden genes expresados en celulas vegetales. Los ejemplos de promotores bajo el control de desarrollo incluyen promotores que inician la transcripcion preferencialmente en determinados tejidos, tales como e xilema, hojas, rames, o semillas. Dichos promotores se citan como promotores preferidos de tejido. Los promotores que inician la transcripcion solo en determinados tejidos se citan como promotores espedficos de tejido. Un promotor espedfico de tipo celular dirige principalmente la expresion en determinados tipos celulares en uno o mas organos, por ejemplo, celulas vasculares en las rafces u hojas, por ejemplo, un promotor espedfico de rafz. Un promotor inducible o represible es un promotor que esta bajo control ambiental. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar a la transcripcion mediante promotores inducibles incluyen condiciones anaerobias o la presencia de luz. Los promotores espedficos de tejido, preferidos de tejido, espedficos de tipo celular e inducibles forman parte de los promotores no constitutivos. Un promotor constitutivo es un promotor que esta activo en la mayona de condiciones ambientales y en la mayona de las partes de plantas.

Un polinucleotido es una secuencia nucleotfdica que comprende una secuencia genica codificante o un fragmento de la misma, un promotor, un intron, una region potenciadora, un sitio de poliadenilacion, un sitio de inicio de la traduccion, regiones 5' o 3' no traducidas, un gen indicador, un marcador de seleccion o similares. El polinucleotido puede comprender ADN o ARN monocatenario o bicatenario. El polinucleotido puede comprender bases modificadas o una estructura modificada. El polinucleotido puede ser genomico, un transcrito de ARN (tal como ARNm) o una secuencia nucleotfdica procesada (tal como un ADNc). El polinucleotido puede comprender una secuencia en orientacion sentido o antisentido.

Un polinucleotido aislado es una secuencia polinucleotfdica que no esta en su estado nativo, por ejemplo, el polinucleotido esta compuesto de una secuencia nucleotfdica no encontrada en la naturaleza o el polinucleotido esta separado de secuencias nucleotfdicas con las que esta tfpicamente en proximidad o esta proximo a secuencias nucleotfdicas con las que tfpicamente no esta en proximidad.

Una secuencia nucleotidica recombinante se refiere a una molecula de acido nucleico que contiene una modificacion disenada por ingeniena genetica mediante manipulacion por mutagenesis, enzimas de restriccion y similares.

Interferencia de ARN (ARNi) se refiere a la supresion espedfica de secuencia o espedfica de gen de la expresion genica (smtesis de protemas) que esta mediada por ARN pequeno interferente (ARNpi).

Semilla: una "semilla" puede considerarse un ovulo de planta maduro que contiene un embrion y una parte propagadora de una planta, tal como un tuberculo o espora. Una semilla puede incubarse antes de la transformacion mediada por microorganismos, en la oscuridad, por ejemplo, para facilitar la germinacion. La semilla tambien puede esterilizarse antes de la incubacion, tal como mediante un breve tratamiento con lejfa. La plantula resultante puede exponerse posteriormente a una bacteria deseada para su transformacion.

Marcador de seleccion/exploracion: un gen que, en caso de expresarse en plantas o tejidos de plantas, hace posible distinguirlos de otras plantas o tejidos de plantas que no expresan ese gen. Los procedimientos de exploracion pueden requerir ensayos para la expresion de protemas codificadas por el gen marcador de exploracion. Los ejemplos de marcadores de seleccion incluyen el gen de neomicina fosfotransferasa (NPTII) que codifica la resistencia a kanamicina y geneticina, el gen higromicina fosfotransferasa (HPT o APHIV) que codifica la resistencia a higromicina, u otros genes similares conocidos en la tecnica.

Identidad de secuencia: tal como se usa en el presente documento, la "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de acido nucleico incluye referencia a los restos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean para maxima correspondencia a lo largo de una region espedfica. En los casos donde las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitucion. Se dice que las secuencias que difieren en dichas sustituciones conservativas tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para hacer este ajuste se conocen bien por los expertos en la tecnica.

Tal como se usa en el presente documento, el porcentaje de identidad de secuencia significa el valor determinado al comparar dos secuencias alineadas de manera optima a lo largo de una ventana de comparacion, en el que la porcion de la secuencia de polinucleotido en la ventana de comparacion puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparacion con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para un alineamiento optimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el numero de posiciones en las que aparece la base de acido nucleico identica en ambas secuencias para producir el numero de posiciones coincidentes, dividiendo el numero de posiciones coincidentes entre el numero total de posiciones en la ventana de comparacion y multiplicando el resultado por 100 para dar el porcentaje de identidad de secuencia.

La "identidad de secuencia" tiene un significado reconocido en la tecnica y puede calcularse usando tecnicas publicadas. Vease COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, ed. (Oxford University Press, 1988), BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, ed. (Academic Press, 1993), COMPUTER

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ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PARTE I, Griffin y Griffin, eds., (Humana Press, 1994), SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, Von Heinje ed., Academic Press (1987), SEQUENCE ANALYSIS PRIMER, Gribskov y Devereux, eds. (Macmillan Stockton Press, 1991) y Carillo y Lipton, SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (1988). Los metodos empleados comunmente para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin limitacion, aquellos divulgados en GUIDE To HUGE COMPUTERS, Bishop, ed., (Academic Press, 1994) y Carillo y Lipton, anteriormente citado. Los metodos para determinar la identidad y similitud estan codificados en programas informaticos. Los metodos de programas informaticos preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin limitacion, al paquete informatico GCG (Devereux et al., Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTN, FASTA (Atschul et al, J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)) y FASTDB (Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6: 237 (1990)).

Los ARN de horquilla corta (ARNhc) son ARN monocatenarios que tienen un alto grado de estructura secundaria, de tal forma que una porcion de la hebra de ARN forma un bucle de horquilla.

ARN pequeno interferente (ARNpi) se refiere a moleculas de ARN bicatenario de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 nucleotidos de longitud que se nombran por su capacidad para interferir de manera espedfica con la expresion genica de protemas.

Una secuencia diana se refiere a una secuencia nucleotfdica en una plaga que se selecciona para su supresion o inhibicion mediante tecnologfa de ARN bicatenario. Una secuencia diana codifica una caractenstica o actividad biologica esencial en una plaga.

Terminadores transcripcionales: Las construcciones de expresion de ADN tienen tfpicamente una region de terminacion transcripcional en el extremo opuesto de la region reguladora del inicio de la transcripcion. La region de terminacion puede seleccionarse para estabilidad del ARNm para potenciar la expresion y/o para la adicion de colas de poliadenilacion anadidas al producto de transcripcion genica. La traduccion de un nuevo polipeptido sufre terminacion cuando cualquiera de los tres codones de terminacion de cadena entran en el sitio A en el ribosoma. Los codones de terminacion de la traduccion son UAA, UAG y UGA.

ADN transferente (ADN-T): un ADN-T bacteriano es un elemento genetico que se conoce como un elemento capaz de integrar una secuencia nucleotfdica contenida en sus lfmites en otro genoma. A este respecto, un ADN-T esta flanqueado, tfpicamente, por dos secuencias "Kmite". Un polinucleotido deseado de la presente invencion y un marcador de seleccion pueden posicionarse entre la secuencia similar al lfmite izquierdo y la secuencia similar al lfmite derecho de un aDN-T. El polinucleotido deseado y el marcador de seleccion contenido en el ADN-T pueden estar unidos operativamente a una diversidad de acidos nucleicos diferentes, espedficos de plantas (es decir, nativos), o exogenos, como elementos reguladores de promotor y terminador que facilitan su expresion, es decir, la transcripcion y/o traduccion de la secuencia de ADN codificada por el polinucleotido o marcador de seleccion deseado.

Transformacion de celulas vegetales: Un proceso mediante el cual se inserta de manera estable un acido nucleico en el genoma de una celula vegetal. La transformacion puede suceder en condiciones naturales o artificiales usando diversos metodos bien conocidos en la tecnica. La transformacion puede basarse en cualquier metodo conocido para la insercion de secuencias de acido nucleico en una celula hospedadora procariota o eucariota, incluyendo protocolos de transformacion mediados por Agrobacterium, tales como la "transformacion refinada" o la "cultivo preciso", infeccion viral, bigotes, electroporacion, microinyeccion, tratamiento con polietilenglicol, choque termico, lipofeccion y bombardeo con micropartfculas.

Planta transgenica: una planta transgenica es una que comprende al menos un genoma celular en el que se ha integrado de manera estable un acido nucleico exogeno. Una planta transgenica es una planta que solo comprende una celula modificada geneticamente y genoma celular, o es una planta que contiene algunas celulas modificadas geneticamente, o es una planta en la que todas las celulas estan modificadas geneticamente. Una planta transgenica puede ser una que comprende la expresion del polinucleotido deseado, es decir, el acido nucleico exogeno, en solo determinadas partes de la planta. Por lo tanto, una planta transgenica puede solo contener celulas modificadas geneticamente en determinadas partes de su estructura.

Variante: una "variante", tal como se usa en el presente documento, pretende indicar una secuencia nucleotidica que se desvfa de la secuencia nucleotidica estandar o dada de un gen particular. Los terminos "isoforma", "isotipo" y "analogo" tambien se refieren a formas "variantes" de una secuencia nucleotidica. Una secuencia nucleotidica que se altera mediante la adicion, eliminacion o sustitucion de uno o mas nucleotidos puede considerarse una secuencia "variante". Una "variante" tambien puede referirse a un "gen reordenado", tal como aquellos descritos en las patentes asignadas a Maxygen.

Se entiende que la presente divulgacion no esta limitada a la metodologfa particular, protocolos, vectores y reactivos, etc., descritos en el presente documento, ya que estos pueden variar. Tambien debe entenderse que la terminologfa usada en el presente documento solo se usa con el fin de describir realizaciones particulares y no pretende limitar el alcance de la presente divulgacion. Cabe destacar que tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas del singular "un", "una" y "el" o "la" incluyen referencia en plural a

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menos que el contexto dicte claramente lo contrario. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a "un gen" es una referencia a uno o mas genes e incluye equivalentes de los mismos conocidos para los expertos en la materia.

I. Plagas diana

La presente divulgacion proporciona metodolog^as y construcciones para controlar las infestaciones por plagas de insectos administrando a una plaga una secuencia codificante diana que suprime o inhibe de manera post- transcripcional una funcion biologica requerida en la plaga. Tal como se usa en el presente documento, el termino "plaga" se refiere a insectos, aracnidos, crustaceos, hongos, bacterias, virus, nematodos, platelmintos, lombrices, oxiuros, anquilosomas, tenias, tripanosomas, esquistosomas, moscardones, pulgas, garrapatas, acaros y piojos y similares que son parasfticos en seres humanos, animales y plantas. Una plaga puede ingerir o entrar en contacto con una o mas celulas, tejidos, o productos producidos por una planta transformada con un agente de supresion genica bicatenario.

Un rasgo de "resistencia a plagas" es una caractenstica de una planta transgenica hospedadora que hace que la planta sea resistente al ataque de una plaga que tipicamente es capaz de infligir dano o perdida a la planta. Dicha resistencia a plagas puede surgir de una mutacion natural o mas tipicamente de la incorporacion de ADN recombinante que confiere resistencia a plagas. Para conferir resistencia a insectos a una planta transgenica, un ADN recombinante puede, por ejemplo, transcribirse en una molecula de ARN que forma una molecula de ARNbc en los tejidos o fluidos de la planta recombinante. La molecula de ARNbc esta compuesta en parte de un segmento de ARN que es identico a un segmento correspondiente de ARN codificado a partir de una secuencia de ADN en un insecto de la plaga que prefiere alimentarse de la planta recombinante. La expresion del gen en el insecto de plaga diana se suprime por el ARNbc y la supresion de la expresion del gen en el insecto de plaga diana da como resultado que la planta sea resistente al insecto.

Las plagas adecuadas incluyen cualquier herbfvoro que cause dano a una planta o a una porcion de la misma. La divulgacion contempla plagas de insectos, nematodos y hongos en particular.

Las plagas de insectos son de particular interes e incluyen, pero sin limitacion:

del orden Lepidoptera, por ejemplo, Aden's spp., Adoxophyes spp., Aegeria spp., Agrotis spp., Alabama argillaceae, Amylois spp., Anticarsia gemmatalis, Archips spp, Argyrotaenia spp., Autographa spp., Busseola fusca, Cadra cautella, Carposina nipponensis, Chilo spp., Choristoneura spp., Clysia ambiguella, Cnaphalocrocis spp., Cnephasia spp., Cochylis spp., Coleophora spp., Crocidolomia binotalis, Cryptophlebia leucotreta, Cydia spp., Diatraea spp., Diparopsis castanea, Earias spp., Ephestia spp., Eucosma spp., Eupoecilia ambiguella, Euproctis spp., Euxoa spp., Grapholita spp., Hedya nubiferana, Heliothis spp., Hellula undalis, Hyphantria cunea, Keiferia lycopersicella, Leucoptera scitella, Lithocollethis spp., Lobesia botrana, Lymantria spp., Lyonetia spp., Malacosoma spp., Mamestra brassicae, Manduca sexta, Operophtera spp., Ostrinia Nubilalis, Pammene spp., Pandemis spp., Panolis flammea, Pectinophora gossypiella, Phthorimaea operculella, Pieris rapae, Pieris spp., Plutella xylostella, Prays spp., Scirpophaga spp., Sesamia spp., Sparganothis spp., Spodoptera spp., Synanthedon spp., Thaumetopoea spp., Tortrix spp., Trichoplusia ni y Yponomeuta spp.; del orden Coleoptera, por ejemplo, Agriotes spp., Anthonomus spp., Atomaria linearis, Chaetocnema tibialis, Cosmopolites spp., Curculio spp., Dermestes spp., Epilachna spp., Eremnus spp., Leptinotarsa decemlineata, Lissorhoptrus spp., Melolontha spp., Orycaephilus spp., Otiorhynchus spp., Phlyctinus spp., Popillia spp., Psylliodes spp., Rhizopertha spp., Scarabeidae, Sitophilus spp., Sitotroga spp., Tenebrio spp., Tribolium spp. y Trogoderma spp.; del orden Orthoptera, por ejemplo, Blatta spp., Blattella spp., Gryllotalpa spp., Leucophaea maderae, Locusta spp., Periplaneta ssp. y Schistocerca spp.; del orden Isoptera, por ejemplo, Reticulitemes ssp; del orden Psocoptera, por ejemplo, Liposcelis spp.; del orden Anoplura, por ejemplo, Haematopinus spp., Linognathus spp., Pediculus spp., Pemphigus spp. y Phylloxera spp.; del orden Mallophaga, por ejemplo, Damalinea spp. y Trichodectes spp.; del orden Thysanoptera, por ejemplo, Franklinella spp., Hercinothrips spp., Taeniothrips spp., Thrips palmi, Thrips tabaci y Scirtothrips aurantii; del orden Heteroptera, por ejemplo, Cimex spp., Distantiella theobroma, Dysdercus spp., Euchistus spp., Eurygaster spp., Leptocorisa spp., Nezara spp., Piesma spp., Rhodnius spp., Sahlbergella singulars, Scotinophara spp., Triatoma spp., familia Miridae spp. tales como Lygus hesperus y Lygus lineoloris, familia Lygaeidae spp. tales como Blissus leucopterus y familia Pentatomidae spp.; del orden Homoptera, por ejemplo, Aleurothrixus floccosus, Aleyrodes brassicae, Aonidiella spp., Aphididae, Aphis spp., Aspidiotus spp., Bemisia tabaci, Ceroplaster spp., Chrysomphalus aonidium, Chrysomphalus dictyospermi, Coccus hesperidum, Empoasca spp., Eriosoma larigerum, Erythroneura spp., Gascardia spp., Laodelphax spp., Lacanium corni, Lepidosaphes spp., Macrosiphus spp., Myzus spp., Nehotettix spp., Nilaparvata spp., Paratoria spp., Pemphigus spp., Planococcus spp., Pseudaulacaspis spp., Pseudococcus spp., Psylla ssp., Pulvinaria aethiopica, Quadraspidiotus spp., Rhopalosiphum spp., Saissetia spp.., Scaphoideus spp., Schizaphis spp., Sitobion spp., Trialeurodes vaporariorum, Trioza erytreae y Unaspis citri; del orden Hymenoptera, por ejemplo, Acromyrmex, Atta spp., Cephus spp., Diprion spp., Diprionidae, Gilpinia polytoma, Hoplocampa spp., Lasius spp., Monomorium pharaonis, Neodiprion spp, Solenopsis spp. y Vespa ssp.; del orden Diptera, por ejemplo, Aedes spp., Antherigona soccata, Bibio hortulanus, Calliphora erythrocephala, Ceratitis spp., Chrysomyia spp., Culex spp., Cuterebra spp., Dacus spp., Drosophila melanogaster, Fannia spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Hypoderma spp., Hyppobosca spp., Liriomysa spp., Lucilia spp., Melanagromyza spp., Musca ssp., Oestrus spp., Orseolia spp., Oscinella frit, Pegomyia hyoscyami, Phorbia spp., Rhagoletis pomonella, Sciara spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp. y Tipula spp., del orden Siphonaptera, por ejemplo, Ceratophyllus spp. yXenopsylla cheopis y del orden

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Thysanura, por ejemplo, Lepisma saccharina.

Las plagas de nematodos de interes particular incluyen, por ejemplo, A. caninum, A. ceylancium, H. contortus, O. ostertagi, C. elegans, C. briggsae, P. pacificus, S. stercoralis, S. ratti, P. trichosuri, M. arenaria, M. chitwoodi, M. hapla, M. incognita, M. javanica, M. paraensis, G. rostochiensis, G. pallida, H. glycines, H. schattii, P. penetrans, P. vulnus, R. similis, Z. punctata, A. suum, T. canis, B. malayi, D. immitis, O. volvulus, T. vulpis, T. spiralis, X. index. A. duodenale, A. lumbricoides, asf como especies de los siguientes generos: Aphelenchoides, Nacobbus, Ditylenchus, Longidorus, Trichodorus y Bursaphelenchus.

Las plagas fungicas de interes particular incluyen, pero sin limitacion Acremoniella spp., Alternaria spp. (por ejemplo Alternaria brassicola o Alternaria solani), Ascochyta spp. (por ejemplo, Ascochyta pisi), Botrytis spp. (por ejemplo, Botrytis cinerea o Botryotinia fuckeliana), Cladosporium spp., Cercospora spp. (por ejemplo, Cercospora kikuchii o Cercospora zaea-maydis), Cladosporium spp. (por ejemplo Cladosporium fulvum), Colletotrichum spp. (por ejemplo Colletotrichum lindemuthianum), Curvularia spp., Diplodia spp. (por ejemplo, Diplodia maydis), Erysiphe spp. (por ejemplo Erysiphe graminis f. sp. graminis, Erysiphe graminis f.sp. hordei o Erysiphe pisi), Erwinia armylovora, Fusarium spp. (por ejemplo Fusarium nivale, Fusarium sporotrichioides, Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Fusarium germinearum, Fusarium culmorum, Fusarium solani, Fusarium moniliforme o Fusarium roseum), Gaeumanomyces spp. (por ejemplo Gaeumanomyces graminis f.sp. tritici), Gibberella spp. (por ejemplo Gibberella zeae), Helminthosporium spp. (por ejemplo Helminthosporium turcicum, Helminthosporium carbonum, Helminthosporiurn mavdis o Helminthosporium sigmoideum), Leptosphaeria salvinii, Macrophomina spp. (por ejemplo Macrophomina phaseolina), Magnaportha spp. (por ejemplo Magnaporthe oryzae), Mycosphaerella spp., Nectria spp. (por ejemplo, Nectria heamatococca), Peronospora spp. (por ejemplo Peronospora manshurica o Peronospora tabacina), Phoma spp. (por ejemplo Phoma betae), Phakopsora spp. (por ejemplo Phakopsora pachyrhizi), Phymatotrichum spp. (por ejemplo Phymatotrichum omnivorum), Phytophthora spp. (por ejemplo Phytophthora cinnamomi, Phytophthora cactorum, Phytophthora phaseoli, Phytophthora parasitica, Phytophthora citrophthora, Phytophthora megasperma f.sp. soiae o Phytophthora infestans), Plasmopara spp. (por ejemplo Plasmopara viticola), Podosphaera spp. (por ejemplo Podosphaera leucotricha), Puccinia spp. (por ejemplo Puccinia sorghi, Puccinia striiformis, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia asparagi, Puccinia recondita o Puccinia arachidis), Pythium spp. (por ejemplo Pythium aphanidermatum), Pyrenophora spp. (por ejemplo Pyrenophora tritici-repentens o Pyrenophora teres), Pyricularia spp. (por ejemplo Pyricularia oryzae), Pythium spp. (por ejemplo Pythium ultimum), Rhincosporium secalis, Rhizoctonia spp. (por ejemplo Rhizoctonia solani, Rhizoctonia oryzae o Rhizoctonia cerealis), Rhizopus spp. (por ejemplo Rhizopus chinensid), Scerotium spp. (por ejemplo Scerotium rolfsii), Sclerotinia spp. (por ejemplo Sclerotinia sclerotiorum), Septoria spp. (por ejemplo Septoria lycopersici, Septoria glycines, Septoria nodorum o Septoria tritici), Thielaviopsis spp. (por ejemplo Thielaviopsis basicola), Tilletia spp., Trichoderma spp. (por ejemplo Trichoderma virde), Uncinula spp. (por ejemplo Uncinula necator), Ustilago maydis (por ejemplo tizon del mafz), Venturia spp. (por ejemplo, Venturia inaequalis o Venturia pirina) o Verticillium spp. (por ejemplo, Verticillium dahliae o Verticillium albo-atrum);

II. Identificacion de secuencias diana

La presente divulgacion proporciona un metodo para identificar y obtener un acido nucleico que comprende una secuencia nucleotidica para producir un ARNbc o un ARNpi. Por ejemplo, dicho metodo comprende: (a) sondar un ADNc o una biblioteca de ADN genomico con una sonda de hibridacion que comprende la totalidad o una porcion de una secuencia nucleotidica o un homologo de la misma a partir de un insecto usado como diana; (b) identificar un clon de ADN que hibrida con la sonda de hibridacion; (c) aislar el clon de ADN identificado en la etapa (b); y (d) secuenciar el ADNc o el fragmento de ADN genomico que comprende el clon aislado en la etapa (c) en el que la molecula de acido nucleico secuenciada transcribe la totalidad o una porcion sustancial de la secuencia del nucleotido de ARN o un homologo del mismo.

Adicionalmente, la presente divulgacion contempla un metodo para obtener un fragmento de acido nucleico que comprende una secuencia nucleotidica para producir una porcion sustancial de un ARNbc o un ARNpi que comprende: (a) sintetizar el primer y el segundo cebador oligonucleotfdico correspondiente a una porcion de una de las secuencias nucleotfdicas de una plaga usada como diana; y (b) amplificar un molde de ADNc o de ADN genomico en un vector de clonacion usando el primer y el segundo cebador oligonucleotidico de la etapa (a) en el que la molecula de acido nucleico amplificada transcribe una porcion sustancial de un ARNbc o ARNpi.

En la puesta en practica de la presente divulgacion, un gen diana puede derivarse de cualquier plaga que cause dano a plantas de cultivo y las consiguientes perdidas de rendimiento. Pueden emplearse varios criterios para la seleccion de los genes diana preferidos. El gen es uno cuyo producto proteico tiene una rapida velocidad de renovacion, de tal forma que la inhibicion del ARNbc dara como resultado una rapida disminucion de los niveles de protema. En determinadas realizaciones, es ventajoso seleccionar un gen para el que una pequena perdida en el nivel de expresion da como resultado efectos perjudiciales para la plaga receptora. Si se desea usar como diana una amplia variedad de especies de insectos, por ejemplo, se selecciona un gen que este elevadamente conservado entre estas especies. Por el contrario, con el fin de conferir especificidad, en determinadas realizaciones, se selecciona un gen que contiene regiones que estan poco conservadas entre especies individuales de insectos, o entre insectos y otros organismos. En determinadas realizaciones, puede ser deseable seleccionar un gen que no tiene homologos conocidos en otros organismos.

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Tal como se usa en el presente documento, la expresion "derivado de" se refiere a una secuencia nucleotidica espedfica que puede obtenerse a partir de una fuente o especie particular espedfica, aunque no necesariamente directamente de esa fuente o especie espedfica.

En una realizacion, se selecciona un gen que se expresa en el intestino del insecto. Los genes diana expresados en el intestino evitan la necesidad de que el ARNbc se extienda por el insecto. Los genes diana pueden incluir, por ejemplo, aquellos que comparten homologfas sustanciales con las secuencias nucleotfdicas de genes conocidos que se expresan en el intestino que codifican componentes proteicos de la V-ATPasa de protones de membrana plasmatica (Dow et al., 1997, Dow, 1999), por ejemplo, la subunidad B o E de V-ATPasa. Este complejo de protemas es la unica fuente de energfa del transporte de iones epitelial y es responsable de la alcalinizacion del lumen del intestino medio. La V-ATPasa tambien se expresa en el tubulo de Malpighi, un sobrecrecimiento de intestino posterior del insecto que funciona en equilibrio fluido y en la detoxificacion de compuestos exogenos de un modo analogo a un organo de rinon de un mairnfero.

En otra realizacion, se selecciona un gen que esta esencialmente implicado en el crecimiento, desarrollo y reproduccion de un insecto. Los genes ejemplares incluyen, pero sin limitacion, las subunidades estructurales de protemas ribosomales y un gen de coatomero beta, el gen CHD3. Las protemas ribosomales, tales como S4 (RpS4) y S9 (RpS9) son constituyentes estructurales del ribosoma implicados en la biosmtesis de protemas y que son componentes de la subunidad pequena ribosomica citosolica, las protemas ribosomicas, tales como L9 y Ll9 son constituyentes estructurales del ribosoma implicados en la biosmtesis de protemas que se localiza en el ribosoma. El gen de coatomero beta en C. elegans codifica una protema que es una subunidad de un complejo multimerico que forma un revestimiento de vesmula de membrana. Se han descubierto secuencias similares en diversos organismos, tales como Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster y Saccharomyces cerevisiae. Se encuentran secuencias relacionadas en diversos organismos, tales como Leptinotarsa decemlineata, Phaedon cochleariae, Epilachna varivetis, Anthonomus grandis, Tribolium castaneum, Myzus persicae, Nilaparvata lugens, Chilo suppressalis, Plutella xylostella y Acheta domesticus. Otras dianas genicas pueden incluir, por ejemplo, aquellas que juegan papeles importantes en la viabilidad, crecimiento, desarrollo, reproduccion e infectividad. Estos genes diana incluyen, por ejemplo, genes constitutivos, factores de transcripcion y genes espedficos de insecto o mutaciones knockout letales en Caenorhabditis o Drosophila. Los genes diana tambien pueden ser aquellos que son de otros organismos, por ejemplo, de un nematodo (por ejemplo, Meloidogyne spp. o Heterodera spp.), otros insectos o aracnidos (por ejemplo, Leptinotarsa spp., Phaedon spp., Epilachna spp., Anthonomus spp., Tribolium spp., Myzus spp., Nilaparvata spp., Chilo spp., Plutella spp., o Acheta spp. Ademas, la secuencia nucleotfdica para su uso como secuencia diana tambien puede derivarse de genes virales, bacterianos, fungicos, o de insecto cuyas funciones se han establecido a traves de la bibliograffa y cuyas secuencias de nucleotidos comparten una similitud sustancial con los genes diana en el genoma de un insecto.

Para muchos de los insectos que son dianas potenciales para su control, puede haber informacion limitada referente a las secuencias de la mayona de genes o del fenotipo resultante de la mutacion de genes particulares. Por tanto, pueden seleccionarse genes basandose en la informacion disponible referente a genes correspondientes en un organismo modelo, tal como Caenorhabditis o Drosophila, o en otras especies de insectos. Tambien pueden seleccionarse genes basandose en la informacion de secuencias disponible para otras especies, tales como especies de nematodos o fungicas, en las que se han caracterizado los genes. En algunos casos sera posible obtener la secuencia de un gen correspondiente a partir de un insecto diana efectuando busquedas en bases de datos, tales como GenBank, usando bien el nombre del gen o la secuencia del gen. Una vez que se ha obtenido la secuencia, puede usarse la PCR para amplificar un segmento seleccionado de manera adecuada del gen en el insecto.

Para obtener un segmento de ADN a partir del gen correspondiente en una especie de insecto, por ejemplo, pueden disenarse cebadores de PCR basandose en la secuencia tal como se encuentra en C. elegans o Drosophila, o un insecto a partir del cual ya se ha clonado el gen. Los cebadores se disenan para amplificar un segmento de ADN de longitud suficiente. Las condiciones de amplificacion se seleccionan de tal forma que sucedera la amplificacion incluso si los cebadores no coinciden exactamente con la secuencia diana. Como alternativa, el gen, o una porcion del mismo, puede clonarse a partir de una biblioteca de ADN genomico o de ADNc preparada a partir de la especie de plaga de insecto, usando un gen de insecto conocido como sonda. Se conocen tecnicas para llevar a cabo la PCR y la clonacion a partir de bibliotecas. En los ejemplos se proporcionan detalles adicionales del proceso mediante el cual los segmentos de ADN procedentes de especies de plagas de insecto diana pueden aislarse basandose en la secuencia de genes clonados anteriormente a partir de una especie de insecto. Un experto en la materia sera consciente de que puede usarse una diversidad de tecnicas para aislar segmentos genicos de especies de plagas de insectos que correspondan a genes previamente aislados de otras especies.

IN. Metodos para inhibir o suprimir un gen diana

La presente divulgacion proporciona metodos para inhibir la expresion genica de uno o multiples genes diana en una plaga diana usando metodos de ARNbc. La divulgacion es particularmente util para la modulacion de la expresion genica de eucariotas, en particular, la modulacion de la expresion de genes presentes en plagas que muestran un nivel de pH del sistema digestivo que es de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 9,5, mas preferentemente de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 8,0 y aun mas preferentemente de aproximadamente 6,5 a

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aproximadamente 7,5. Para plagas de plantas con un sistema digestivo que muestra niveles de pH fuera de estos intervalos, pueden desearse el uso de metodos de administracion que no requieran la ingestion de moleculas de ARNbc.

Los metodos abarcan proporcionar simultanea o secuencialmente dos o mas construcciones de ARN bicatenario o de ARN al mismo insecto, para lograr la regulacion negativa o la inhibicion de multiples genes diana o para lograr una inhibicion mas potente de un solo gen diana.

Como alternativa, se usan multiples dianas proporcionando un ARN bicatenario que se dirige a multiples secuencias diana y una sola diana se inhibe de manera mas eficaz por la presencia de mas de una copia del fragmento de ARN bicatenario correspondiente al gen diana. Por lo tanto, en una realizacion, la construccion de ARN bicatenario comprende multiples regiones de ARNbc, comprendiendo al menos una hebra de cada region de ARNbc una secuencia nucleotidica que es complementaria a al menos parte de una secuencia nucleotidica diana de un gen diana de insecto. Las regiones de ARNbc en la construccion de ARN pueden ser complementarias al mismo o a diferentes genes diana y/o las regiones de ARNbc pueden ser complementarias a dianas de la misma o diferentes especies de insectos. El uso de dichas construcciones de ARNbc en una celula vegetal hospedadora, por lo tanto, confiere una resistencia mas potente a una sola o a multiples especies de insectos en la planta. En una realizacion, la region de ARN bicatenario comprende multiples copias de la secuencia nucleotidica que es complementaria al gen diana. Como alternativa, el ARNbc se dirige a mas de una secuencia diana del mismo gen diana. La divulgacion por lo tanto abarca construcciones de ARN bicatenario aislado que comprenden al menos dos copias de dicha secuencia de nucleotidos complementarias a al menos parte de una secuencia nucleotidica de una diana de insecto. Puede desarrollarse ARNbc que se dirige a mas de una de las dianas anteriormente mencionadas, o una combinacion de diferentes ARNbc contra dianas diferentes anteriormente mencionadas. Los nucleotidos de ARNbc y construcciones de ARNbc adecuadas se describen en el documento WO2006/046148.

Los terminos "dirigir", "se dirige" y "direccion" son expresiones alternativas para indicar que al menos una de las hebras del ARNbc es complementaria a y como tal puede unirse a, el gen o secuencia nucleotidica diana.

El efecto modulador del ARNbc es aplicable a una diversidad de genes expresados en las plagas, incluyendo, por ejemplo, genes endogenos responsables del metabolismo celular o de la transformacion celular, incluyendo genes constitutivos, factores de transcripcion y otros genes que codifican polipeptidos implicados en el metabolismo celular.

Tal como se usa en el presente documento, la expresion "inhibicion de la expresion genica" o "inhibir la expresion de una diana genica en la celula de una plaga" se refiere a la ausencia (o disminucion observable) en el nivel de producto de protema y/o ARNm del gen diana. La especificidad se refiere a la capacidad para inhibir el gen diana sin efectos manifiestos sobre otros genes de la celula y sin efectos sobre cualquier gen en la celula que este produciendo la molecula de ARNbc. La inhibicion de la expresion genica del gen diana en la plaga de insecto puede dar como resultado nuevos rasgos fenotfpicos en la plaga de insecto.

"Supresion genica" se refiere a cualquiera de los metodos bien conocidos para reducir los niveles de transcripcion genica a ARNm y/o la posterior traduccion del ARNm. La supresion genica tambien pretende indicar la reduccion de la expresion de protemas a partir de un gen o una secuencia codificante, incluyendo la supresion genica postranscripcional y la supresion transcripcional. La supresion genica postranscripcional esta mediada por la homologfa entre la totalidad o una parte de un ARNm transcrito a partir de un gen o secuencia genica usada como diana para su supresion y el ARN bicatenario correspondiente usado para la supresion y se refiere a la reduccion sustancial y medible de la cantidad de ARNm disponible en la celula para unirse a los ribosomas. El ARN transcrito puede estar en orientacion con sentido para efectuar lo que se denomina co-supresion, en la orientacion antisentido para efectuar lo que se denomina supresion antisentido, o en ambas orientaciones, produciendo un ARNbc lo que se denomina interferencia de ARN (ARNi).

La supresion transcripcional esta mediada por la presencia en la celula de un agente de supresion genica de ARNbc que muestra una identidad de secuencia sustancial con una secuencia de ADN promotora o con el complemento de la misma para efectuar lo que se denomina una trans supresion de promotor. La supresion genica puede ser eficaz contra un gen de planta nativo asociado a un rasgo, por ejemplo, para proporcionar plantas con niveles reducidos de una protema codificada por el gen nativo o con niveles potenciados o reducidos de un metabolito afectado. La supresion genica tambien puede ser eficaz contra genes diana en plagas de plantas que pueden ingerir o estar en contacto con material vegetal que contiene agentes de supresion genica, espedficamente disenados para inhibir o suprimir la expresion de una o mas secuencias homologas o complementarias en la celula de la plaga. La supresion genica postraduccional mediante ARN orientado en la direccion antisentido o con sentido para regular la expresion genica en celulas vegetales se divulga en las Patentes de Estados Unidos N° 5.107.065, 5.759.829, 5.283.184 y 5.231.020. El uso de ARNbc para suprimir genes en plantas se divulga en los documentos WO 99/53050, WO 99/49029, en las publicaciones de solicitud de patente de los Estados Unidos N° 2003/0175965 y 2003/0061626, en la Solicitud de Patente de Estados Unidos N° 2004/0029283 y en las Patentes de Estados Unidos N° 6.506.559 y 6.326.193.

Un metodo beneficioso para la supresion genica postranscripcional en plantas emplea ARN transcrito tanto en orientacion con sentido como con orientacion antisentido que esta estabilizado, por ejemplo, como una estructura en

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horquilla y de tallo y bucle. Una construccion de ADN preferida para efectuar la supresion genica postranscripcional es una en la que un primer segmento codifica un ARN que muestra una orientacion antisentido que muestra una identidad sustancial con un segmento de un gen usado como diana para supresion, que esta unido a un segundo segmento en orientacion con sentido que codifica un ARN que muestra una complementariedad sustancial con el primer segmento. Dicha construccion forma una estructura de tallo y bucle mediante la hibridacion del primer segmento con el segundo segmento y se forma una estructura de tallo y bucle a partir de las secuencias nucleotfdicas que unen a los dos segmentos (veanse los documentos WO94/01550, WO98/05770, US 2002/0048814 y US 2003/0018993).

De acuerdo con una realizacion de la presente divulgacion, se proporciona una secuencia nucleotidica para la que la expresion in vitro da como resultado la transcripcion de una secuencia de ARNbc que es sustancialmente homologa a una molecula de ARN de un gen diana en una plaga que comprende una secuencia de ARN codificada por una secuencia nucleotfdica del genoma de la plaga. Por lo tanto, despues de que la plaga ingiera, o de otro modo capte la secuencia de ARNbc incorporada en una dieta o rociada sobre una superficie vegetal, se efectua una regulacion negativa de la secuencia nucleotidica diana correspondiente al gen diana en las celulas de una plaga diana.

La inhibicion de un gen diana usando la tecnologfa de ARNbc es espedfica de secuencia en tanto que las secuencias nucleotidicas correspondientes a la region duplex del ARN son dianas para inhibicion genetica. Se prefiere ARN que contiene secuencias nucleotidicas identicas a una porcion del gen diana. Se ha descubierto que las secuencias de ARN con inserciones, eliminaciones y mutaciones puntuales en relacion a la secuencia diana tambien son efectivas para la inhibicion. Se prefiere que el ARNbc inhibidor y la porcion del gen diana compartan al menos aproximadamente un 85 % de identidad de secuencia, o aproximadamente un 90 % de identidad de secuencia, o aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia, o aproximadamente un 99 % de identidad de secuencia, o incluso aproximadamente un 100 % de identidad de secuencia. Como alternativa, la region duplex del ARN puede definirse funcionalmente como una secuencia nucleotidica que es capaz de hibridar con una porcion del transcrito del gen diana. Una secuencia menor de la de longitud completa que muestra una homologfa mayor compensa a una secuencia menos homologa mas larga. La longitud de las secuencias nucleotfdicas identicas puede ser de al menos aproximadamente 25 50, 100, 200, 300, 400, 500 o al menos aproximadamente 1000 bases. Normalmente, debe usarse una secuencia de mas de 20-100 nucleotidos, aunque se preferina una secuencia de mas de aproximadamente 200-300 nucleotidos y se preferina especialmente una secuencia de mas de aproximadamente 500-1000 nucleotidos dependiendo del tamano del gen diana. Esto tiene la ventaja de ser capaz de tolerar variaciones de secuencia que podnan esperarse debido a mutacion genetica, polimorfismo de cepa o divergencia evolutiva. La molecula de acido nucleico introducida puede no necesitar ser absolutamente homologa, puede no necesitar ser de longitud completa en relacion bien al producto primario de transcripcion o al ARNm totalmente procesado del gen diana. Por tanto, los expertos en la materia tienen que darse cuenta de que, tal como se divulgan en el presente documento, no es necesaria una identidad de secuencia del 100 % entre el ARN y el gen diana para poner en practica los metodos divulgados en el presente documento.

IV. Metodos para preparar ARNbc

Las moleculas de ARNbc pueden sintetizarse in vivo o in vitro. El ARNbc puede formarse mediante una sola hebra de ARN autocomplementaria o a partir de dos hebras de ARN complementarias. La ARN polimerasa endogena de la celula puede mediar la transcripcion in vivo, o puede usarse ARN polimerasa clonada para la transcripcion in vivo o in vitro. La inhibicion puede estar dirigida mediante transcripcion espedfica en un organo, tejido, o tipo celular; la estimulacion de una condicion ambiental (por ejemplo, infeccion, estres, temperatura, inductores qmmicos); y/o disenar la transcripcion a un estadio del desarrollo o edad. Las hebras de ARN pueden estar o no poliadeniladas; las hebras de ARN pueden ser o no capaces de traducirse en un polipeptidos por el aparato transcripcional de una celula.

Un ARN, ARNbc, ARNpi, o ARNmi puede producirse qmmica o enzimaticamente por un experto en la materia mediante reacciones manuales o automatizadas o in vivo en otro organismo. El aRn tambien puede producirse mediante smtesis organica parcial o total; puede introducirse cualquier ribonucleotido modificado mediante smtesis enzimatica u organica in vitro. El ARN puede sintetizarse por una ARN polimerasa celular o por una ARN polimerasa de bacteriofago (por ejemplo, T3, T7, SP6). El uso y la produccion de una construccion de expresion se conocen en la materia (vease, por ejemplo, el documento WO 97/32016; Las Patentes de Estados Unidos N° 5.593.874, 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214 y 5.804.693). Si se sintetiza qmmicamente o mediante smtesis enzimatica in vitro, el ARN puede purificarse antes de la introduccion en la celula. Por ejemplo, el ARN puede purificarse a partir de una mezcla mediante extraccion con un disolvente o una resina, precipitacion, electroforesis, cromatograffa, o una de sus combinaciones. Como alternativa, el ARN puede usarse sin o con una purificacion minima para evitar perdidas debido al procesamiento de la muestra. EL ARN puede secarse para su almacenamiento o disolverse en una solucion acuosa. La solucion puede contener tampones o sales para promover la hibridacion y/o estabilizacion de las hebras duplex.

V. Secuencias polinucleotidicas

De acuerdo con la divulgacion se proporcionan secuencias nucleotidicas, cuya expresion da como resultado una secuencia de ARN que es sustancialmente homologa a una molecula de ARN de un gen diana en una plaga que

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comprende una secuencia de ARN codificada por una secuencia nucleotidica en el genoma de la plaga. Por lo tanto, tras la ingestion de la secuencia de ARNbc puede obtenerse la regulacion negativa de la secuencia nucleotfdica del gen diana en las celulas de la plaga dando como resultado un efecto perjudicial sobre el mantenimiento, viabilidad, proliferacion, reproduccion e infestacion de la plaga.

Cada "secuencia nucleotfdica" expuesta en el presente documento se presenta como una secuencia de desoxirribonucleotidos (abreviados como A, G, C y T). Sin embargo, se entiende por "secuencia nucleotidica" de una molecula de acido nucleico o polinucleotido, para una molecula o polinucleotido de ADN, una secuencia de desoxirribonucleotidos y para una molecula o polinucleotido de ARN, la secuencia correspondiente de ribonucleotidos (A, G, C y U) donde cada desoxinucleotido de timina (T) en la secuencia de desoxinucleotido especificada se reemplaza por el ribonucleotido uracilo (U).

Tal como se usa en el presente documento, un "acido nucleico" se refiere a un polfmero de bases de desoxirribonucleotido o ribonucleotido monocatenario o bicatenario lefdo del extremo 5' al extremo 3'. Un acido nucleico puede contener opcionalmente bases nucleotfdicas de origen no natural o alteradas que permiten la lectura correcta por una polimerasa y que no reducen la expresion de un polipeptido codificado por ese acido nucleico. Una "secuencia nucleotidica" o "secuencia de acidos nucleicos" se refiere a las hebras tanto con sentido como antisentido de un acido nucleico bien como hebras individuales o en el duplex.

El termino "acido ribonucleico" (ARN) es inclusivo de ARNi (ARN inhibidor), ARNbc (ARN bicatenario), ARNpi (ARN pequeno interferente), ARNm (ARN mensajero), ARNmi (micro ARN), ARNt (ARN transferente, ya este cargado o descargado con un aminoacido acilado correspondiente) y ARNc (ARN complementario) y el termino "acido desoxirribonucleico" (ADN) es inclusivo de ADNc y ADN genomico y de tnbridos de ADN-ARN.

Las expresiones "segmento de acido nucleico", "segmento de secuencia de nucleotidos", o mas generalmente "segmento" se entendera por los expertos en la materia como una expresion funcional que incluye tanto secuencias genomicas, secuencias de ARN ribosomico, secuencias de ARN transferente, secuencias de ARN mensajero, secuencias de operon y secuencias nucleotfdicas disenadas mas pequenas que expresan o pueden adaptarse para expresar protemas, polipeptidos o peptidos.

Por consiguiente, la presente divulgacion se refiere a una molecula de acido nucleico aislada que comprende un polinucleotido que tiene una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en cualquiera de las secuencias polinucleotfdicas de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061. La divulgacion tambien proporciona fragmentos de las secuencias polinucleotfdicas de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061. La divulgacion proporciona ademas acidos nucleicos complementarios, o fragmentos de los mismos, para cualquiera de las secuencias polinucleotfdicas de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061, asf como un acido nucleico que comprende al menos 15 bases contiguas que hibrida con cualquiera de las secuencias polinucleotfdicas de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061.

La presente divulgacion tambien proporciona secuencias ortologas y complementos y fragmentos de las mismas, de las secuencias polinucleotfdicas de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061. Por consiguiente, la divulgacion abarca secuencias diana que son ortologos de insecto de un gen que comprende una secuencia nucleotfdica tal como se representa en cualquiera de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061. A modo de ejemplo, los ortologos de insecto pueden comprender una secuencia nucleotfdica tal como se representa en cualquiera de las SEC ID N°: 122-123, 1010 y 1437, o un fragmento de las mismas de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 o 27 nucleotidos. En la Tabla 4 se proporciona una lista no limitante de genes ortologos de insectos o aracnidos o secuencias que comprenden al menos un fragmento de 15, preferentemente de al menos 17 pb de una de las secuencias de la divulgacion.

La divulgacion tambien abarca secuencias diana que son ortologos de nematodo de un gen que comprende una secuencia nucleotfdica tal como se representa en cualquiera de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061. A modo de ejemplo, los ortologos de nematodo pueden comprender una secuencia nucleotfdica tal como se representa en cualquiera de las SEC ID No: 1023-1025, o un fragmento de las mismas de al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 nucleotidos. De acuerdo con otro aspecto, la divulgacion abarca por lo tanto cualquiera de los metodos descritos en el presente documento para controlar el crecimiento de nematodos en un organismo, o para prevenir la infestacion por nematodos de un organismo susceptible a la infeccion por nematodos, que comprende poner en contacto celulas de nematodo con un ARN bicatenario, en el que dicho ARN bicatenario comprende hebras complementarias hibridadas, una de las cuales tiene una secuencia nucleotfdica que es complementaria a al menos parte de la secuencia nucleotfdica de un gen diana que comprende un fragmento de al menos 21 nucleotidos de cualquiera de las secuencias tal como se representan en las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061, en el que el ARN bicatenario se capta por el nematodo y por lo tanto controla el crecimiento o evita la infestacion. La divulgacion tambien se refiere a plantas transgenicas resistentes a nematodos que comprenden un fragmento de al menos 21 nucleotidos de cualquiera de las secuencias tal como se representan en las SEC ID N°:

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De acuerdo con otra realizacion, la divulgacion abarca secuencias diana que son ortologos fungicos de un gen que comprende una secuencia nucleotidica tal como se representa en cualquiera de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061. A modo de ejemplo, los ortologos fungicos pueden comprender una secuencia nucleotidica tal como se representa en cualquiera de las SEC ID N°: 157, 158 y 1040, o un fragmento de al menos 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 o 27 nucleotidos de la misma. De acuerdo con otro aspecto, la divulgacion abarca por lo tanto cualquiera de los metodos descritos en el presente documento para controlar el crecimiento fungico en una celula o en un organismo, o para prevenir la infestacion fungica de una celula o un organismo susceptible a la infeccion fungica, que comprende poner en contacto celulas fungicas con una ARN bicatenario, en el que dicho ARN bicatenario comprende hebras complementarias hibridadas, una de las cuales tiene una secuencia nucleotidica que es complementaria a al menos parte de la secuencia nucleotidica de un gen diana que comprende un fragmento de al menos 21 nucleotidos de cualquiera de las secuencias tal como se representan en las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061, en el que el ARN bicatenario se capta por el hongo y por lo tanto controla el crecimiento o evita la infestacion. La invencion tambien se refiere a plantas transgenicas resistentes a hongos que comprenden un fragmento de al menos 21 de cualquiera de las secuencias representadas en las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061. En la Tabla 6 se proporciona una lista no limitante de genes ortologos fungicos o secuencias que comprenden al menos un fragmento de 15, preferentemente de al menos 17 pb de una de las secuencias de la divulgacion.

En una realizacion adicional, una molecula de ARNbc de la divulgacion comprende cualquiera de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061, aunque las secuencias expuestas en las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061 no son limitantes. Una molecula de ARNbc puede comprender cualquier gen diana contiguo procedente de una especie de plaga (por ejemplo, de aproximadamente 25 o mas, o de aproximadamente 21, 22, 23, 24, o 25 o mas nucleotidos contiguos).

Por molecula(s) de acido nucleico "aislada(s)" se entiende una molecula de acido nucleico, ADN o ARN, que se ha extrafdo de su ambiente natural. Por ejemplo, las moleculas de ADN recombinante contenidas en una construccion de ADN se consideran aisladas para los fines de la presente divulgacion. Los ejemplos adicionales de moleculas de ADN aisladas incluyen moleculas de ADN recombinante mantenidas en celulas hospedadoras heterologas o moleculas de ADN purificadas (parcial o sustancialmente) en solucion. Las moleculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vitro de las moleculas de ADN de la presente divulgacion. Las moleculas de acido nucleico aisladas incluyen ademas dichas moleculas producidas sinteticamente.

Las moleculas de acido nucleico pueden estar en forma de ARN, tal como ARNm, o en forma de ADN, incluyendo, por ejemplo, ADNc y ADN genomico obtenido mediante clonacion o producido sinteticamente. EL ADN o ARN puede ser bicatenario o monocatenario. El ADN monocatenario puede ser la hebra codificante, tambien conocido como la hebra con sentido, o puede ser la hebra no codificante, tambien citado como la hebra antisentido.

VI. Analisis de secuencias

A menos que se indique lo contrario, todas las secuencias nucleotfdicas determinadas secuenciando una molecula de ADN se determinaron usando un secuenciador de ADN automatizado (tal como el Modelo 373 de Applied Biosystems, Inc.). Por tanto, tal como se conoce en la materia para cualquier secuencia de ADN determinada mediante esta estrategia automatizada, cualquier secuencia nucleotidica determinada en el presente documento puede contener algunos errores. Las secuencias nucleotidicas determinadas mediante automatizacion son tipicamente al menos aproximadamente un 95 % identicas, mas tfpicamente al menos aproximadamente un 96 % hasta al menos aproximadamente un 99,9 % identicas a la secuencia nucleotfdica real de la molecula de ADN secuenciada. La secuencia real puede determinarse de manera mas precisa mediante otras estrategias, incluyendo metodos de secuenciacion manual de ADN bien conocidos en la tecnica. Como tambien se sabe en la tecnica, una sola insercion o delecion en una secuencia de nucleotidos determinada, comparada con la secuencia real, provocara un desplazamiento del marco en la traduccion de la secuencia nucleotfdica, de tal forma que la secuencia de aminoacidos predicha codificada por una secuencia nucleotfdica determinada puede ser completamente diferente de la secuencia de aminoacidos realmente codificada por la molecula de ADN secuenciada, comenzando en el punto de dicha insercion o delecion.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona una molecula de acido nucleico aislado que comprende un polinucleotido que hibrida en condiciones rigurosas de hibridacion con una porcion del polinucleotido en una molecula de acido nucleico descrita anteriormente. Por un polinucleotido que hibrida con una "porcion" de un polinucleotido se entiende un polinucleotido (bien de ADN o de ARN) que hibrida con al menos aproximadamente 15 nucleotidos y mas preferentemente con al menos aproximadamente 20 nucleotidos y aun mas preferentemente con al menos aproximadamente 30 nucleotidos, e incluso mas preferentemente con mas de 30 nucleotidos del polinucleotido de referencia. Estos fragmentos que hibridan con los fragmentos de referencia son utiles como sondas y cebadores

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diagnosticos. Dos secuencias hibridan cuando forman un complejo bicatenario en una solucion de hibridacion de SSC 6X, SDS al 0,5%, solucion de Denhardt 5X y 100 |jg de aDn portador no espedfico. Vease Ausubel et al., seccion 2.9, suplemento 27 (1994). Las secuencias pueden hibridar a "rigurosidad moderada", que se define como una temperature de 60 °C en una solucion de hibridacion de SSC 6X, SDS al 0,5 %, solucion de Denhardt 5X y 100 jg de ADN portador no espedfico. Para la hibridacion de "alta rigurosidad", la temperature se aumenta a 68 °C. Despues de la reaccion de hibridacion a rigurosidad moderada, se lavan los nucleotidos en una solucion de SSC 2X mas SDS al 0,05 % cinco veces a temperature ambiente, con lavados posteriores con SSC 0,1X mas SDS al 0,1 % a 60 °C durante 1 h. Para alta rigurosidad, la temperatura de lavado se aumenta a 68 °C. Los nucleotidos hibridados son aquellos que se detectan usando 1 ng de una sonda radiomarcada que tiene una radiactividad espedfica de 10.000 cpm/ng, donde los nucleotidos hibridados son claramente visibles despues de exposicion a pelfcuia de rayos X a -70 °C durante no mas de 72 horas.

La presente solicitud se dirige a dichas moleculas de acido nucleico que son al menos un 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identicas a una secuencia de acido nucleico descrita en cualquiera de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061. Sin embargo, se prefieren moleculas de acido nucleico que son al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % identicas a la secuencia de acido nucleico expuesta en cualquiera de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061. Las diferencias entre dos secuencias de acido nucleico pueden suceder en las posiciones 5' o 3' terminales de la secuencia nucleotfdica de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas bien individualmente entre los nucleotidos en la secuencia de referencia o en uno o mas grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Como aspecto particular, si cualquier molecula de acido nucleico particular es al menos un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % identica a una secuencia nucleotfdica de referencia se refiere a una comparacion efectuada entre dos moleculas usando algoritmos bien conocidos en la tecnica y puede determinarse convencionalmente usando programas informaticos disponibles publicamente, tales como el algoritmo BLASTN. Vease Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997).

En una realizacion, un acido nucleico comprende una hebra antisentido que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleotidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30), en el que la hebra antisentido es complementaria a una secuencia de ARN o una porcion de la misma que codifica una protema que controla el ciclo celular o la recombinacion de homologos y en el que dicho ANpi comprende ademas una hebra sentido que tiene de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleotidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30) y en el que dicha hebra con sentido y dicha hebra antisentido son secuencias nucleotfdicas distintas donde al menos aproximadamente 15 nucleotidos en cada hebra son complementarios con la otra hebra.

En una realizacion, la presente divulgacion proporciona moleculas de acido nucleico bicatenarias que median dicho silenciamiento genico de interferencia de ARN. En otra realizacion, las moleculas de ANpi consisten en moleculas de acido nucleico duplex que contienen de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 pares de bases entre oligonucleotidos que comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleotidos (por ejemplo, aproximadamente 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, o 30). En otra realizacion mas, las moleculas de ANpi comprenden moleculas de acido nucleico duplex con extremos salientes de aproximadamente 1 a aproximadamente 32 nucleotidos (por ejemplo, aproximadamente 1, 2, o 3), por ejemplo, duplex de aproximadamente 21 nucleotidos con aproximadamente 19 pares de bases y salientes 3'-terminales de mononucleotido, dinucleotido o trinucleotido. En otra realizacion mas, las moleculas de ANpi comprenden moleculas de acido nucleico duplex con extremos romos, donde ambos extremos son romos, o como alternativa, donde uno de los extremos es romo.

Una molecula de ANpi puede comprender nucleotidos modificados a la vez que se mantiene la capacidad para mediar la ARNi. Los nucleotidos modificados pueden usarse para mejorar caractensticas in vitro o in vivo tales como la estabilidad, actividad, y/o biodisponibilidad. Por ejemplo, una molecula de ANpi puede comprender nucleotidos modificados como un porcentaje del numero total de nucleotidos presentes en la molecula de ANpi. Como tal, una molecula de ANpi puede comprender generalmente de aproximadamente un 5 % a aproximadamente un 100 % de nucleotidos modificados (por ejemplo, aproximadamente un 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 100 % de nucleotidos modificados). El porcentaje real de nucleotidos modificados presentes en una molecula de ANpi dada dependera del numero total de nucleotidos presentes en el ANpi. Si la molecula de ANpi es monocatenaria, el porcentaje de modificacion puede basarse en el numero total de nucleotidos presentes en las moleculas de ANpi monocatenarias. Del mismo modo, si la molecula de ANpi es bicatenaria, el porcentaje de modificacion puede basarse en el numero total de nucleotidos presentes en la hebra con sentido, en la hebra antisentido, o en las hebras tanto con sentido como antisentido.

VII. Construcciones de acido nucleico

Un vector de acido nucleico recombinante puede, por ejemplo, ser un plasmido lineal o circular cerrado. El sistema de vector puede ser un solo vector o plasmido o dos o mas vectores o plasmidos que juntos contienen el acido nucleico total que se va a introducir en el genoma del hospedador bacteriano. Ademas, un vector bacteriano puede

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ser un vector de expresion. Las moleculas de acido nucleico tal como se exponen en las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061, o fragmentos de las mismas pueden, por ejemplo, insertarse sustancialmente en un vector bajo el control de un promotor adecuado que funciona en uno o mas hospedadores microbianos para dirigir la expresion de una secuencia codificante enlazada u otra secuencia de ADN. Hay muchos vectores disponibles para este fin y la seleccion del vector adecuado dependera principalmente del tamano del acido nucleico que se va a insertar en el vector y de la celula hospedadora particular que se va a transformar con el vector. Cada vector contiene diversos componentes dependiendo de su funcion (amplificacion de ADN o expresion de ADN) y de la celula hospedadora particular con la que sea compatible. Los componentes de vector para transformacion bacteriana incluyen generalmente, pero sin limitacion, uno o mas de los siguientes: una secuencia de senal, un origen de replicacion, uno o mas genes de marcador de seleccion y un promotor inducible que permite la expresion de ADN exogeno.

Promotores

"Unido operativamente", tal como se usa en referencia a una secuencia reguladora y a una secuencia nucleotidica estructural, significa que la secuencia reguladora provoca la expresion regulada de la secuencia nucleotfdica estructural enlazada. Las "secuencias reguladoras" o los "elementos de control" se refieren a secuencias nucleotfdicas situadas cadena arriba (secuencias no codificantes 5'), en, o cadena abajo (secuencias 3' no traducidas) de una secuencia nucleotfdica estructural y que influencia la sincroma y el nivel o cantidad de transcripcion, procesamiento de ARN o estabilidad, o la traduccion de la secuencia nucleotfdica estructural asociada. Las secuencias reguladoras pueden incluir promotores, secuencias lfder de traduccion, intrones, potenciadores, estructuras de tallo-bucle, secuencias de union represoras y secuencias de reconocimiento de poliadenilacion y similares.

Un vector de expresion para producir un ARNm tambien puede contener un promotor inducible que se reconoce por el organismo bacteriano hospedador y esta unido operativamente al acido nucleico que codifica, por ejemplo, la molecula de acido nucleico que codifica el ARNm de D. v. virgifera o un fragmento de interes del mismo. Los promotores inducibles adecuados para su uso con hospedadores bacterianos incluyen el promotor de p-lactamasa, promotores PL y PR de fago A de E. coli y promotor de galactosa de E. coli, promotor de arabinosa, promotor de fosfatasa alcalina, promotor de triptofano (trp) y el promotor del operon de lactosa y variaciones de los mismos y promotores tnbridos, tales como el promotor tac. Sin embargo, son adecuados otros promotores bacterianos inducibles conocidos.

La divulgacion contempla promotores que funcionan en diferentes especies de plantas. Los promotores utiles para la expresion de polipeptidos en plantas incluyen aquellos que son inducibles, virales, sinteticos, o constitutivos, tal como se describe en Odell et al., (1985), y/o promotores que se regulan temporalmente, que se regulan espacialmente y que se regulan de manera espacio-temporal. Los promotores preferidos incluyen los promotores potenciados de CaMV35S y el promotor de FMV35S. Para un control optimo de las especies que se alimentan de rafces, puede ser preferible lograra los niveles mas altos de expresion de estos genes en las rafces de las plantas. Se han identificado y se conocen en la tecnica una serie de promotores potenciados en rafz (Lu et al., 2000; Patentes de Estados Unidos N° 5.837.848 y 6.489.542).

En una realizacion, el vector de transformacion en plantas comprende una molecula de ADN purificada y aislada que comprende un promotor unido operativamente a una o mas secuencias nucleotidicas. La secuencia nucleotfdica se selecciona entre el grupo que consiste en las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040 y 1061. La secuencia nucleotidica incluye un segmento que codifica la totalidad o una parte de un ARN presente en un transcrito de ARN de una plaga diana y puede comprender repeticiones invertidas de la totalidad o parte de un ARN diana de la plaga. La molecula de ADN que comprende el vector de expresion tambien puede contener una secuencia de intron funcional posicionada bien cadena arriba de la secuencia codificante o incluso dentro de la secuencia codificante y tambien puede contener una secuencia lfder cinco prima (5') no traducida (es decir, una UTR o 5'-UTR) posicionada entre el promotor y el punto de inicio de la traduccion.

Genes de marcador de seleccion

Un vector o construccion de ADN recombinante comprendera tfpicamente un marcador de seleccion que confiera un fenotipo de seleccion en celulas vegetales. Los marcadores de seleccion tambien pueden usarse para seleccionar plantas o celulas vegetales que contienen los acidos nucleicos exogenos que codifican polipeptidos o protemas. El marcador puede codificar resistencia a un biocida, resistencia a antibioticos (por ejemplo, kanamicina, bleomicina G418, higromicina, etc.), o resistencia a herbicidas (por ejemplo, glifosato, etc.). Los ejemplos de marcadores de seleccion incluyen, pero sin limitacion, un gen neo que codifica resistencia a kanamicina y puede seleccionarse para usar kanamicina, G418, etc., un gen bar que codifica resistencia a bialafos; un gen de EPSP sintasa mutante que codifica resistencia a glifosato; un gen de nitrilasa que confiere resistencia a bromoxinilo; un gen de acetolactato sintasa (ALS) mutante que confiere resistencia a imidazolinona o a sulfonilurea; y un gen DHFR de resistencia a metotrexato. Los ejemplos de dichos marcadores de seleccion se ilustran en las Patentes de Estados Unidos 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 y 6.118.047.

Un vector o construccion recombinante puede incluir tambien un marcador de exploracion. Los marcadores de

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exploracion pueden usarse para controlar la expresion. Los ejemplos de marcadores de exploracion incluyen un gen de p-glucuronidasa o de uidA (GUS) que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogenicos (Jefferson, 1987; Jefferson et al., 1987); un gen de locus R, que codifica un producto que regula la produccion de pigmentos de antocianina (color rojo) en tejidos vegetales (Dellaporta et al., 1988); un gen de p- lactamasa (Sutcliffe et al., 1978), un gen que codifica una enzima para la que se conocen diversos sustratos cromogenicos (por ejemplo, PADAC, una cefalosporina cromogenica); un gen de luciferasa (Ow et al., 1986) un gen de xylE (Zukowsky et al., 1983) que codifica una catecol dioxigenasa que puede convertir catecoles cromogenicos; un gen de a-amilasa (Ikatu et al., 1990); un gen de tirosinasa (Katz et al., 1983) que codifica una enzima capaz de oxidar tirosina a DOPA y dopaquinona que a su vez se condensa en melanina; una a-galactosidasa, que cataliza a un sustrato cromogenico de a-galactosa.

Los vectores para transformacion en plantas preferidos incluyen aquellos derivados de un plasmido Ti de Agrobacterium tumefaciens (por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937, 5.501.967 y el documento EP 0 122 791). Tambien son utiles y se conocen plasmidos de Agrobacterium rhizogenes (o "Ri"). Otros vectores para transformacion en plantas preferidos incluyen aquellos divulgados, por ejemplo, por Herrera-Estrella (1983); Bevan (1983), Klee (1985) y en el documento EP 0 120 516.

En general, se prefiere introducir un ADN recombinante funcional en una localizacion no espedfica en el genoma de una planta. En casos especiales, puede ser util insertar una construccion de ADN recombinante mediante integracion de sitio espedfico. Existen varios sistemas de recombinacion de sitio espedfico que se sabe que funcionan en plantas, incluyendo cre-lox tal como se divulga en la Patente de Estados Unidos N° 4.959.317 y fLP- FRT tal como se divulga en la Patente de Estados Unidos N° 5.527.695.

Puede prepararse un vector de transformacion usando metodos disponibles en la tecnica. El vector de transformacion comprende una o mas secuencias de nucleotidos que es/son capaces de transcribirse a una molecula de ARN y que es/son sustancialmente homologos y/o complementarios a una o mas secuencias de nucleotidos codificadas por el genoma del insecto, de tal forma que tras la captacion del ARN existe regulacion negativa de la expresion de al menos una de las secuencias de nucleotidos respectivas del genoma del insecto.

Un vector de transformacion en plantas puede contener secuencias de mas de un gen, permitiendo de este modo la produccion de mas de un ARNbc para inhibir la expresion de dos o mas genes en celulas de una plaga diana. Un experto en la materia apreciara facilmente que pueden combinarse segmentos de ADN cuya secuencia corresponda a aquella presente en diferentes genes en un solo segmento de ADN compuesto para la expresion en una planta transgenica. Como alternativa, puede modificarse un plasmido que ya contiene al menos un segmento de ADN mediante la insercion secuencial de segmentos de ADN adicionales entre las secuencias del potenciador, del promotor y del terminador. En el agente de control de insectos disenado para la inhibicion de multiples genes, los genes que se van a inhibir pueden obtenerse de la misma especie de insecto para potenciar la eficacia del agente de control de insectos. En determinadas realizaciones, los genes pueden derivarse de diferentes insectos para ampliar el rango de insectos contra los que el agente es eficaz. Cuando se usan como diana multiples genes para la supresion o una combinacion de expresion y supresion, puede fabricarse un elemento de ADN policistronico tal como se ilustra y divulga en Fillatti, Publicacion de la Solicitud N° US 2004-0029283.

El vector de transformacion puede citarse como una construccion de ADNbc y tambien puede definirse como una molecula recombinante, como un agente de control de insectos, como una molecula genetica o como una construccion genetica quimerica. Una construccion genetica quimerica puede comprender, por ejemplo, secuencias nucleotfdicas que codifican uno o mas transcritos antisentido, uno o mas transcritos con sentido, uno o mas de cada uno de los anteriormente mencionados, en el que la totalidad o parte de un transcrito de estos es homologo con la totalidad o parte de una molecula de ARN que comprende una secuencia de ARN codificada por una secuencia nucleotfdica en el genoma de un insecto.

VIII. Plantas para ingenieria genetica

Una "planta" es cualquiera de los diversos organismos fotosinteticos, eucariotas y multicelulares del reino Plantae que de manera caractenstica producen embriones, contienen cloroplastos y tienen paredes celulares de celulosa. Una parte de una planta, es decir, un "tejido de planta" puede tratarse de acuerdo con los metodos de la presente invencion para producir una planta transgenica. Pueden transformarse muchos tejidos de plantas de acuerdo con la invencion e incluyen, pero sin limitacion, embriones somaticos, polen, hojas, tallos, callos, estolones, microtuberculos y brotes.

Por lo tanto, la presente divulgacion preve la transformacion de plantas angiospermas y gimnospermas tales como acacia, alfalfa, manzana, albaricoque, alcachofa, fresno, esparrago, aguacate, banana, cebada, judfa, remolacha, abedul, haya, mora, arandano, brecol, coles de Bruselas, repollo, colza, cantalupo, zanahoria, mandioca, coliflor, cedro, un cereal, apio, castana, cereza, col china, dtricos, clementinas, trebol, cafe, mafz, algodon, caupf, pepino, cipres, berenjena, olmo, endivia, eucalipto, hinojo, higos, abeto, geranio, uva, pomelo, cacahuete, cereza de suelo, cicuta, nogal americano, con rizada, kiwi, colinabo, alerce, lechuga, puerro, limon, lima, algarroba, pino, culantrillo, mafz, mango, arce, melon, mijo, champinon, mostaza, nuez, roble, avena, okra, cebolla naranja, una planta, flor o arbol ornamental, papaya, palma, perejil, chirma, guisante, melocoton, cacahuete, pera, turba, pimiento, caqui,

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guandul, pino, pina, platano, ciruela, granada, patata, calabaza, achicoria, rabano, colza, frambuesa, arroz, centeno, sorgo, sauce, soja, espinaca, pfcea, calabaza, fresa, remolacha azucarera, cana de azucar, girasol, batata, mafz dulce, mandarina, te, tabaco, tomate, arboles, tritical, cespedes, nabo, una vid, nogal, berro, sand^a, trigo, batata, tejo y calabacm.

Un "tejido de planta" tambien abarca celulas vegetales. Las celulas vegetales incluyen cultivos en suspension, callos, embriones, regiones meristematicas, tejido calloso, hojas, rafces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen, semillas y microesporas. Los tejidos de plantas pueden estar en varios estados de madurez y pueden crecerse en cultivo lfquido o solido, o en suelo o medio adecuado en macetas, invernaderos o campos. Un tejido de planta tambien se refiere a cualquier clon de dicha planta, semilla, descendencia, propagulo ya se genere sexual o asexualmente y los descendientes de cualquiera de estos, tales como esquejes o semillas.

La "progenie", tal como la progenie de una planta transgenica, es una que nace de, se engendra por, o se deriva de una planta o de la planta transgenica. Por lo tanto, una planta de "progenie", es decir, una planta de generacion "F1" es la descendencia o un descendiente de la planta transgenica producida. Una progenie de una planta transgenica puede contener en al menos uno, algunos, o todos sus genomas celulares el polinucleotido deseado que se integro en una celula de la planta transgenica parental mediante los metodos descritos en el presente documento. Por lo tanto, el polinucleotido deseado se "transmite" o "hereda" por la planta de progenie. El polinucleotido deseado que se hereda de este modo en la planta de progenie puede residir en una construccion de ADN-T, que tambien se hereda por la planta de progenie a partir de su progenitor. El termino "progenie", tal como se usa en el presente documento, puede considerarse tambien como los vastagos o descendientes de un grupo de plantas.

Una "semilla" puede considerarse un ovulo de planta maduro que contiene un embrion y una parte propagadora de una planta, tal como un tuberculo o espora. Una semilla puede incubarse antes de la transformacion mediada por Agrobacterium, en la oscuridad, por ejemplo, para facilitar la germinacion. La semilla tambien puede esterilizarse antes de la incubacion, tal como mediante un breve tratamiento con lejfa. La plantula resultante puede exponerse entonces a una cepa deseada de Agrobacterium u otra bacteria adecuada para la transformacion.

La presente divulgacion se extiende a metodos tal como se describen en el presente documento, en los que el insecto es Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado) y la planta es patata, berenjena, tomate, pimiento, tabaco, cereza de suelo o arroz, mafz o algodon.

La presente divulgacion se extiende a metodos tal como se describen en el presente documento, en los que el insecto es Phaedon chochleariae (escarabajo de hoja de la mostaza) y la planta es mostaza, repollo chino, hojas de nabo, col rizada o col china.

La presente divulgacion se extiende a metodos tal como se describen en el presente documento, en los que el insecto es Epilachna varivetis (escarabajo del frijol mexicano) y la planta es frijol, habas, alubias, judfas verdes, habas de Lima, frijol mungo, ejotes, frijoles de ojo negro, frijol de terciopelo, soja, caupf, guandul, trebol o alfalfa.

La presente divulgacion se extiende a metodos tal como se describen en el presente documento, en los que el insecto es Anthonomus grandis (grillo de la capsula del algodonero) y la planta es algodon.

La presente divulgacion se extiende a metodos tal como se describen en el presente documento, en los que el insecto es Tribolium castaneum (escarabajo rojo de la harina) y la planta esta en forma de productos de grano almacenados, tales como harina, cereales, comida, galletas saladas, judfa, especias, pastas, mezcla para pasteles, pienso seco para animales, flores secas, chocolate, nuez, semillas, e incluso en espedmenes de museo disecados.

La presente divulgacion se extiende a metodos tal como se describen en el presente documento, en los que el insecto es Myzus persicae (pulgon verde del melocoton) y la planta es un arbol, tal como Prunus, particularmente melocotonero, albaricoque o ciruela; un cultivo de vegetales de las familias Solanaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae y Cucurbitaceae, incluyendo, pero sin limitacion, alcachofa, esparrago, judfa, remolacha, brecol, coles de Bruselas, repollo, zanahoria, coliflor, cantalupo, apio, mafz, pepino, hinojo, con rizada, colinabo, nabo, berenjena, lechuga, mostaza, okra, perejil, chirivfa, guisante, pimiento, patata, rabano, espinaca, calabaza, tomate, nabo, berro y sandfa; y cultivos de campo, tales como, pero sin limitacion, tabaco, remolacha azucarera y girasol; un cultivo de flor o de otra planta ornamental.

La presente divulgacion se extiende a metodos tal como se describen en el presente documento, en los que el insecto es Nilaparvata lugens y la planta es una especie de arroz.

La presente divulgacion se extiende a metodos tal como se describen en el presente documento, en los que el insecto es Chilo suppressalis (barrenador rayado del tallo del arroz) y la planta es una planta de arroz, cebada, sorgo, mafz, trigo o cesped.

La presente divulgacion se extiende a metodos tal como se describen en el presente documento, en los que el insecto es Plutella xylostella (palomilla de dorso diamante) y la planta es una especie de Brassica tal como, pero sin limitacion, repollo, col china, coles de Bruselas, con rizada, colza, brecol, coliflor, nabo, mostaza o rabano.

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La presente divulgacion se extiende a metodos tal como se describen en el presente documento, en los que el insecto es Acheta domesticus (grillo domestico) y la planta es cualquier planta tal como se describe en el presente documento o cualquier materia organica.

IX. Metodos para ingenieria genetica

La presente divulgacion contempla la introduccion de una secuencia nucleotidica en una planta para lograr niveles de expresion inhibidores de una plaga de una o mas moleculas de ARNbc. Los polinucleotidos y polipeptidos pueden introducirse en una celula vegetal hospedadora mediante procedimientos convencionales conocidos en la tecnica para introducir secuencias recombinantes en una celula hospedadora diana. Dichos procedimientos incluyen, pero sin limitacion, protocolos de transfeccion, infeccion, transformacion captacion natural, fosfato de calcio, electroporacion, microinyeccion, bioUstica y transformacion mediada por microorganismos. Vease, por ejemplo, Miki et al., 1993, "Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants", En: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick y Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, paginas 67-88. Los metodos seleccionados vanan en funcion de la planta hospedadora.

La transferencia genica mediada por microorganismos se refiere al uso de un microorganismo para introducir un gen exogeno en una planta hospedadora. Aunque se ha usado ampliamente Agrobacterium (Horsch et al., Science 227:1229-31, 1985) para transferir genes a una planta, no es la unica bacteria capaz de transformar plantas. Por ejemplo, se ha demostrado que varias especies de bacterias fuera del genero Agrobacterium pueden modificarse para mediar la transferencia genica a diversas plantas. Se hicieron competentes bacterias de dos familias y tres generos, Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizobium meliloti y Mesorhizobium loti, para transferencia genica mediante adquisicion tanto del plasmido Ti desarmado como de un vector binario. Broothaerts, W. et al. Nature Feb 10, 433 (7026):629-633 (2005). La transformacion estable de tres especies de plantas, tabaco, arroz y Arabidopsis, se logro con estas especies no de Agrobacterium usando discos foliares, callo derivado de escutelo o inmersion floral. Id. Por lo tanto, diversas bacterias asociadas a plantas, cuando portan un plasmido Ti desarmado y un vector binario (o presumiblemente un plasmido co-integrado o Ti completo), son facilmente capaces de transferir ADN-T a plantas.

Una planta transgenica es una que comprende al menos un genoma celular en el que se ha integrado de manera estable un acido nucleico exogeno. Una planta transgenica es una planta que solo comprende una celula modificada geneticamente y genoma celular, o es una planta que contiene algunas celulas modificadas geneticamente, o es una planta en la que todas las celulas estan modificadas geneticamente. Una planta transgenica puede ser una que comprende la expresion del polinucleotido deseado, es decir, el acido nucleico exogeno, en solo determinadas partes de la planta. Por lo tanto, una planta transgenica puede solo contener celulas modificadas geneticamente en determinadas partes de su estructura.

Los metodos para la creacion de plantas transgenicas y la expresion de acidos nucleicos heterologos en plantas en particular se conocen y pueden usarse con los acidos nucleicos proporcionados en el presente documento para preparar plantas transgenicas que muestran susceptibilidad reducida a ser alimento de un organismo de plaga diana. Pueden prepararse vectores de transformacion en plantas, por ejemplo, insertando el ARNbc que produce acidos nucleicos divulgados en el presente documento en vectores de transformacion en plantas e introduciendo estos en plantas. Un sistema de vector conocido se ha derivado modificando el sistema de transferencia genica natural de Agrobacterium tumefaciens. El sistema natural comprende plasmidos Ti (inductores de tumor) grandes que contienen un segmento grande, conocido como ADN-T, que se transfiere a las plantas transformadas. Otro segmento del plasmido Ti, la region vir, es responsable de la transferencia de ADN-T. La region de ADN-T esta limitada por repeticiones terminales. En los vectores binarios modificados, se han eliminado los genes inductores de tumores y las funciones de la region vir se usan para transferir ADN exogeno limitado por las secuencias que bordean al ADN-T. La region T tambien puede contener un marcador de seleccion para la recuperacion eficaz de plantas y celulas transgenicas y un sitio de clonacion multiple para insertar secuencias para la transferencia, tal como un acido nucleico que codifica ARNbc.

Una planta transgenica formada usando metodos de transformacion mediados por Agrobacterium u otro microorganismo contiene tipicamente una secuencia nucleotidica recombinante insertada en un cromosoma y se cita como un suceso transgenico. Dichas plantas transgenicas pueden citarse como heterocigoticas para la secuencia exogena insertada. Una planta transgenica homocigotica con respecto a un transgen puede obtenerse mediante autofecundacion de una planta transgenica segregante para producir una semilla de F1. Un cuarto de la simiente de F1 producida sera homocigotica respecto al transgen. La germinacion de semillas de F1 da como resultado plantas que pueden ensayarse para heterocigocidad u homocigocidad, Usando tfpicamente un ensayo SNP o un ensayo de amplificacion termica que permita la distincion entre heterocigotos y homocigotos (es decir, un ensayo de cigocidad).

Por consiguiente, la presente divulgacion tambien proporciona plantas o celulas vegetales, que comprenden los polinucleotidos o polipeptidos de la presente divulgacion. En una realizacion, las plantas son angiospermas o gimnospermas. Mas alla del significado ordinario de planta, el termino "plantas" tambien pretende significar la fruta, semillas, flor, estrobilo etc. de la planta. La planta puede ser un transfectante directo, lo que significa que el vector se introdujo directamente en la planta, tal como mediante Agrobacterium, o la planta puede ser la progenie de una planta transfectada. La progenie tambien puede obtenerse mediante reproduccion asexual de una planta transfectada. La planta de segunda generacion o una posterior puede o no producirse mediante reproduccion

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sexual, es decir, fertilizacion. Ademas, la planta puede ser un gametofito (fase haploide) o un esporofito (fase diploide).

X. Cria/cruzamientos convencionales

Ademas de la transformacion directa de una planta con una construccion de acido nucleico recombinante, las plantas transgenicas pueden prepararse cruzando una primera planta que tiene una construccion de acido nucleico recombinante con una segunda planta que carece de la construccion. Por ejemplo, el acido nucleico recombinante para la supresion genica puede introducirse en una primera lmea de plantas que es susceptible a transformacion para producir una planta transgenica que puede cruzarse con una segunda lmea de planta para la introgresion del acido nucleico recombinante para la supresion genica en la segunda lmea de plantas.

Puede ser ventajoso expresar una construccion de acido nucleico en una planta macho esteril, por ejemplo, como medio para reducir la preocupacion acerca del flujo transgenico a plantas vecinas.

La presente divulgacion puede, en la practica, combinarse con otros rasgos de control de insectos en una planta para lograr rasgos deseados para el control mejorado de la infestacion por insectos. La combinacion de rasgos de control de insectos que emplean modos de accion distintos puede proporcionar plantas transgenicas protegidas contra insectos con mayor durabilidad frente a plantas que portan un solo rasgo de control de insectos debido a la probabilidad reducida de que se desarrolle resistencia en el campo.

La combinacion de determinadas construcciones de ARNbc con uno o mas genes de protemas de control de plagas puede dar como resultado sinergias que potencien el fenotipo de control de plagas de una planta transgenica. Los bioensayos de plagas que emplean dieta artificial o tejido de planta completo pueden usarse para definir respuestas a dosis para mortalidad larvaria, por ejemplo, o inhibicion del crecimiento usando tanto ARNbc como protemas de control de plagas. Un experto en la materia puede ensayar mezclas de moleculas de ARNbc y protemas de control de plagas en un bioensayo para identificar combinaciones de agentes activos que son sinergicos y deseables para su desarrollo en plantas protegidas contra plagas (Tabashnik, 1992). Se ha comunicado sinergia para eliminar plagas entre diferentes protemas de control de insectos (para una revision, vease Schnepf et al., 1998). Se anticipa que las sinergias existiran entre determinados ARNbc y entre determinados ARNbc y determinadas protemas de control de insectos.

XI. Cuantificacion de la inhibicion de expresion de gen diana

La inhibicion de la expresion de un gen diana puede cuantificarse midiendo bien el ARN diana endogeno o la protema producida mediante la traduccion del aRn diana y las consecuencias de la inhibicion pueden confirmarse mediante el examen de las propiedades evidentes de la celula u organismo. Las tecnicas para cuantificar ARN y protemas son conocidas para un experto habitual en la materia. Existen multiples marcadores de seleccion que confieren resistencia a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectionicina, rifampicina y tetraciclina y similares.

En determinadas realizaciones, la expresion genica se inhibe en al menos un 10 %, preferentemente en al menos un 33 %, mas preferentemente en al menos un 50 % y aun mas preferentemente en al menos un 80 %. La expresion genica puede inhibirse en al menos un 80 %, mas preferentemente en al menos un 90 %, mas preferentemente en al menos un 95 %, o en al menos un 99 % en las celulas de la plaga de tal forma que tiene lugar una inhibicion significativa. Una inhibicion significativa pretende hacer referencia a una inhibicion suficiente que da como resultado un fenotipo detectable (por ejemplo, cese del crecimiento larvario, paralisis o mortalidad, etc.) o una disminucion detectable en el ARN y/o protema correspondiente al gen diana que se esta inhibiendo. Aunque en determinadas realizaciones la inhibicion sucede en sustancialmente todas las celulas del insecto, en otras realizaciones preferidas la inhibicion ocurre solo en un subconjunto de celulas que expresan el gen. Por ejemplo, si el gen que se va a inhibir juega un papel esencial en las celulas del tracto alimentario del insecto, la inhibicion del gen en estas celulas es suficiente para ejercer un efecto perjudicial en el insecto.

XII. Productos

Se proporcionan productos basicos que contienen una o mas de las secuencias de la presente divulgacion y se producen a partir de una planta recombinante o semilla que contiene una o mas de las secuencias nucleotfdicas divulgadas. Un producto basico que contiene una o mas de las secuencias pretende incluir, pero sin limitacion, comidas, aceites, granos triturados o enteros o semillas de una planta, cualquier producto alimentario comprendido en una comida, aceite, o grano triturado o entero de una planta o semilla recombinante, o cualquier ensilaje, fibra, papel, u otro producto derivado de una planta que contiene una o mas de las secuencias de la presente divulgacion. La deteccion de una secuencia en un producto basico proporciona, de hecho, pruebas de que el producto comprende una planta transgenica, o a una porcion de la misma, que expresa una secuencia divulgada para controlar la infestacion por plagas usando metodos de supresion genica mediados por ARNbc.

A continuacion se proporcionan ejemplos espedficos para identificar secuencias diana que comprenden al menos una o mas moleculas de ARN bicatenario ilustradas en el presente documento pensadas para suprimir una caractenstica o funcion esencial en la plaga, asf como para introducir las secuencias dianas en plangas. Estos

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pretenden ser ilustrativos y no limitaciones de la presente invencion.

Ejemplo 1: Genes diana silenciadores de C. elegans en C. elegans en exploracion de alto rendimiento

La genoteca completa de C. elegans se preparo en el vector pGN9A (WO 01/22121) entre dos promotores y terminadores de T7 identicos, conduciendo su expresion en la direccion sentido y antisentido despues de la expresion de la T7 polimerasa, que se indujo mediante IPTG.

Esta biblioteca se transformo en la cepa bacteriana AB301-105 (DE3) en formato de placas de 96 pocillos. Para la exploracion del genoma completo, estas celulas bacterianas se alimentaron con la cepa nuc-1 (e1392) de C. elegans deficiente en nucleasa.

El suministro de ARNbc producido en la cepa bacteriana AB301-105 (DE3), en gusanos nuc-1 (e1392) de C. elegans, se realizo en un formato de placa de 96 pocillos de la siguiente manera: se transfirieron huevos de nuc-1 a una placa distinta y se dejaron incubar simultaneamente a 20 °C durante una sincronizacion de la generacion L1. Las placas de 96 pocillos se llenaron con 100 pL de medio de crecimiento lfquido que comprendfa IPTG y con 10 pL de cultivo celular bacteriano de DO600 1 AB301-105 (DE3) de la biblioteca de ARNbc de C. elegans portadora cada una de un vector con un fragmento genomico de C. elegans para la expresion del ARNbc. A cada pocillo, se anadieron 4 de los gusanos sincronizados de L1 y se incubaron a 25 °C durante al menos 4 a 5 dfas. Estos experimentos se realizaron por cuadruplicado. En la exploracion se usaron 6 controles:

- pGN29 = control negativo, tipo silvestre

- pGZ1 = unc-22 = fenotipo con contracciones nerviosas

- pGZ18 = quitina sintasa = letal embrionario

- pGZ25 = pos-1 = letal embrionario

- pGZ59 = bli-4D = letal agudo

- ACC = acetil co-enzima A carboxilasa = letal agudo

Despues de 5 dfas, el fenotipo de los gusanos nuc-1 (e1392) de C. elegans alimentados con las bacterias productoras del ARNbc se compararon con el fenotipo de gusanos alimentados con el vector vado (pGN29) y los otros controles. Los gusanos que se habfan alimentado con ARNbc se exploraron con respecto a la letalidad (aguda o larvaria) para la generacion parental (Po), letalidad (embrionaria) para primera generacion filial (F1), o para el retraso de crecimiento de Po de la siguiente manera: (i) Letalidad aguda de Po: Las L1 no se han desarrollado y se han muerto, este fenotipo nunca da progenie y los pocillos parecen vados; (ii) Letalidad (larvaria) de Po: Po murieron en un estadio posterior a L1, este fenotipo tampoco da progenie. Se encuentran larvas muertas o gusanos adultos muertos en los pocillos; (iii) Letalidad para F1: Las L1 se han desarrollado hasta el estadio adulto y estan aun vivas. Este fenotipo no tiene progenie. Esto puede deberse a esterilidad, letalidad embrionaria (huevos muertos en la parte inferior del pocillo), detencion embrionaria o detencion larvaria (eventualmente termina siendo letal); (iv) Crecimiento detenido y retraso/retardo del crecimiento: Comparacion con un pocillo con desarrollo normal y N° normal de progenie.

Para las secuencias diana que se presentan en la Tabla 1A, se llego a la conclusion de que el silenciamiento del gen diana de C. elegans mediado por el ARNbc en nematodos, tales como C. elegans, tema un efecto fatal sobre el crecimiento y la viabilidad de los gusanos.

Despues del experimento anterior de silenciamiento con ARNbc, se llevo a cabo un experimento de fenotipado mas detallado en C. elegans en un formato de alto rendimiento en placas de 24 pocillos. La biblioteca de ARNbc producida en la cepa bacteriana AB301-105 (DE3), tal como se describe anteriormente, se suministro a gusanos C. elegans nuc-1 (el392) en placas de 24 pocillos de la siguiente manera: se transfirieron huevos de nuc-1 a una placa distinta y se dejaron incubar simultaneamente a 20 °C durante una sincronizacion de la generacion L1. Posteriormente 100 de los gusanos L1 sincronizados se sumergieron en 500 pL de una mezcla de medio de alimentacion completo S, que comprendfa colesterol 5 pg/ml, PEG 4 pL/ml e IPTG 1 mM y 500 pL de cultivo celular bacteriano de DO600 1 AB301-105 (DE3) de la biblioteca de ARNbc de C. elegans portadora cada una de un vector con un fragmento genomico de C. elegans para la expresion del ARNbc. Se roto a los gusanos de L1 sumergidos durante 2 horas a 25 °C.

Despues de la centrifugacion y retirada de 950 pL del sobrenadante, 5 pL del sedimento restante y resuspendido (que comprendfa aproximadamente de 10 a 15 gusanos) se transfirieron a la mitad de cada pocillo de una placa de 24 pocillos, cargada con una capa de caldo LB agar. La placa inoculada se incubo a 25 °C durante 2 dfas. En la fase adulta, se individualizo 1 gusano adulto y se incubo a 25 °C durante 2 dfas para inspeccionar su progenie. Los gusanos adultos se inspeccionaron in situ en la placa de 24 pocillos original. Estos experimentos se realizaron por cuadruplicado.

Esta exploracion fenotfpica detallada se repitio con un segundo lote de gusanos, siendo la unica diferencia que los gusanos del segundo lote se incubaron a 20 °C durante 3 dfas.

El fenotipo de los gusanos alimentados con ARNbc de C. elegans se comparo con el fenotipo de gusanos C. elegans nuc-1 (e1392) alimentados con el vector vado.

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Basandose en este experimented se llego a la conclusion de que el silenciamiento de los genes diana de C. elegans como se representa en la Tabla 1A tema un efecto fatal sobre el crecimiento y viabilidad de los gusanos y que este gen diana es esencial para la viabilidad de los nematodos. Por lo tanto, estos genes son buenos genes diana para controlar (eliminar o evitar el crecimiento) a los nematodos mediante el silenciamiento genico mediado por ARNbc. Por consiguiente, la presente divulgacion abarca el uso de ortologos en nematodos del gen diana anterior de C. elegans, para controlar la infestacion por nematodos, tales como infestaciones por nematodos en plantas.

Ejemplo 2: Identificacion de ortologos de D. melanogaster

Tal como se describe en el Ejemplo 1 anterior, se identificaron numerosas secuencias letales de C. elegans y pueden usarse para identificar ortologos en otras especies y generos. Por ejemplo, las secuencias letales de C. elegans pueden usarse para identificar secuencias ortologas de D. melanogaster. Es decir, puede hacerse una busqueda con cada secuencia de C. elegans contra una base de datos publica, tal como GenBank, para secuencias ortologas en D. melanogaster. Se seleccionaron los ortologos potenciales de D. melanogaster que compartfan un alto grado de homologfa de secuencia (valor E preferentemente menor que o igual a 1E-30) y las secuencias son los mejores aciertos redprocos de blast, esto ultimo significa que las secuencias de organismos diferentes (por ejemplo,

C. elegans y D. melanogaster) son los mejores aciertos blast entre sf. Por ejemplo, la secuencia C de C. elegans se comparo frente a secuencias en D. melanogaster usando BLAST. Si la secuencia C tiene la secuencia D de D. melanogaster como la mejor coincidencia y cuando D se compara con todas las secuencias de C. elegans, a su vez tambien con la secuencia C, entonces D y C son mejores coincidencias redprocas. Este criterio se usa a menudo para definir la ortologfa, que significa secuencias similares de especies diferentes, que tienen funcion similar. Los identificadores de secuencia de D. melanogaster se representan en la Tabla 1A.

Ejemplo 3: Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado)

A. Clonacion de secuencias genicas parciales de Leptinotarsa decemlineata

Se aislo ARN intacto de alta calidad de 4 fases larvarias diferentes de Leptinotarsa decemlineata (escarabajo de la patata de Colorado; Fuente: Jeroen van Schaik, Entocare CV Biologische Gewasbescherming, Postbus 162, 6700 AD Wageningen, Pafses Bajos) usando reactivo TRIzol® (N° de Cat 15596-026/15596-018, Invitrogen™, Rockville, Maryland, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genomico presente en la preparacion de ARN se retiro mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante (N° de Cat. 1700, Promega®). El ADNc se genero usando un kit comercialmente disponible (Transcriptasa inversa SuperScript® III, N° de Cat. 18080044, Invitrogen™, Rockville, Maryland, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para aislar secuencias de ADNc que comprendfan una porcion de los genes LD001, LD002, LD003, LD006, LD007, LD010, LD011, LD014, LD015, LD016 y LD018, se realizo una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® (N° de Cat. N8080240, Applied Biosystems®) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificacion de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-LD, que muestra genes diana de Leptinotarsa decemlineata que incluyen las secuencias cebadoras y las secuencias de ADNc obtenidas. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, purificado (Kit de extraccion de gel QIAquick®, N° de Cat. 28706, Qiagen®), se clonaron en el vector pCR8/GW/TOPO® (N° de Cat. K2500 20, Invitrogen™) y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-LD y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoacidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-LD, en la que el inicio de la fase de lectura se indica entre parentesis.

B. Produccion de ARNbc de los genes de Leptinotarsa decemlineata

Se sintetizo ARNbc en cantidades de miligramo usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express (N° de Cat. P1700, Promega®). En primer lugar se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en direccion 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una orientacion diferente con respecto al promotor de T7.

Para cada uno de los genes diana, se genero el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso espedficos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-LD. Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se genero usando cebadores directos e inversos de T7 espedficos en una reaccion PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-LD. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificacion PCR (kit de purificacion PCR Qiaquick®, N° de Cat. 28106, Qiagen®) y precipitacion con NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se

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hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8- LD. La Tabla 8-LD presenta secuencias para la preparacion de fragmentos de ARN de secuencias diana de Leptinotarsa decemlineata y secuencias de concatemero, incluyendo secuencias cebadoras.

C. Clonacion de genes de Leptinotarsa decemlineata en el vector vegetal pK7GWIWG2D(II)

Dado que el mecanismo de interferencia de ARN actua a traves de fragmentos de ARNbc, las secuencias nucleotfdicas diana de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientacion antisentido y sentido, separados por el intron - CmR - intron, en el que CmR es el marcador de resistencia a cloranfenicol, para formar una construccion de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron usando la reaccion de recombinacion LR entre un clon de entrada que contema attL (vease el Ejemplo 1) y un vector de destino que contema attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIWG2D(II) se obtuvo a traves de VIB/Plant Systems Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reaccion de recombinacion de LR se

TM TM

llevo a cabo usando la mezcla enzimatica LR Clonase II (N° de Cat. 11791-020, Invitrogen ) siguiendo las instrucciones del fabricante.. Estos experimentos de clonacion produjeron una construccion en horquilla de cada uno de los genes LD002, LD006, LD007, LD010, LD011, LD014 y LD016, que teman bien la orientacion promotor - sentido - intron - CmR - intron - antisentido, o la orientacion promotor- antisentido - intron - CmR - intron - sentido y en el que el promotor es el promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S es adecuado para la transformacion en A. tumefaciens.

Para LD002, se realizo una doble digestion con enzimas de restriccion BsoBI y PvuI en LD002 clonado en pCR8/GW/TOPO® (vease el Ejemplo 3A). Para LD006, se realizo una digestion con la enzima de restriccion BsoBI en LD006 clonado en pCR8/GW/TOPO® (vease el Ejemplo 3A). Para LD007, se realizo una digestion con la enzima de restriccion BsoBI en LD007 clonado en pCR8/GW/TOPO® (vease el Ejemplo 3A). Para LD007, se realizo una digestion con la enzima de restriccion BsoBI en LD007 clonado en pCR8/Gw/TOPO® (vease el Ejemplo 3A). Para LD010, se realizo una doble digestion con enzimas de restriccion PvuI y PvuII en LD010 clonado en pCR8/GW/TOPO® (vease el Ejemplo 3A). Para LD014, se realizo una digestion con la enzima de restriccion BsoBI en LD014 clonado en pCR8/GW/TOPO® (vease el Ejemplo 1). Para LD016, se realizo una digestion con la enzima de restriccion BsoBI en LD016 clonado en pCR8/GW/TOPO® (vease el Ejemplo 3A). La banda que contema el gen de interes flanqueado por los sitios de attL se purifico usando el kit de extraccion en gel Qiaquick®. Se anadio una cantidad de 150 ng de fragmento purificado y 150 ng de pK7GWIWG2D(II) junto con la enzima LR clonasa II y se incubo durante al menos 1h a 25 °C. Despues del tratamiento con la solucion de proteinasa K (10 min a 37°C), la mezcla de recombinacion completa se transformo en las celulas qmmicamente competentes Top 10. Se seleccionaron los clones positivos mediante analisis por digestion de restriccion. La secuencia completa de la construccion en horquilla para:

- LD002 (antisentido - intron - CmR - intron - sentido) se expone en la SEC ID N°:: 240;

- LD006 (sentido - intron - CmR - intron - antisentido) se expone en la SEC ID N°:: 241;

- LD007 (sentido - intron - CmR - intron - antisentido) se expone en la SEC ID N°:: 242;

- LD010 (sentido - intron - CmR - intron - antisentido) se expone en la SEC ID N°:: 243;

- LD011 (antisentido - intron - CmR - intron - sentido) se expone en la SEC ID N°:: 244;

- LD014 (sentido - intron - CmR - intron - antisentido) se expone en la SEC ID N°:: 245;

- LD016 (antisentido - intron - CmR - intron - sentido) se expone en la SEC ID N°:: 246;

La Tabla 9-LD proporciona secuencias completas para cada construccion en horquilla.

D. Exploracion de dianas de ARNbc usando dieta artificial para la actividad contra Leptinotarsa decemlineata

Se preparo dieta artificial para el escarabajo de la patata de Colorado de la siguiente manera (adaptada de Gelman et al., 2001, J. Ins. Sc., vol. 1, N° 7, 1-10): se esterilizaron en autoclave el agua y el agar, y los demas ingredientes (mostrados en la Tabla 2 mas adelante) se anadieron cuando la temperatura descendio a 55 °C. A esta temperatura, los ingredientes se mezclaron bien antes de dividir la dieta en alfcuotas en placas de 24 pocillos (Nunc™) con una cantidad de 1 ml de diete por pocillo. Se dejo solidificar la dieta artificial por enfriamiento a temperatura ambiente. La dieta se almaceno a 4 °C durante hasta tres semanas.

Tabla 2: Ingredientes para la dieta artificial

Ingredientes: Volumen para 1 l

agua: 768 ml

agar: 14 g

copos de avena laminados: 40 g

levadura de Torula: 60 g

hidrolizado de lactalbumina: 30 g

casema: 10 g

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fructosa: 20 g

mezcla salina de Wesson: 4 g

polvo de fruto de tomate: 12,5 g

hoja de patata en polvo: 25 g

b-sitosterol: 1 g

acido sorbico: 0,8 g

Metil parabeno: 0,8 g

mezcla de vitaminas de Vanderzant: 12 g

sulfato de neomicina: 0,2 g

aureomicina: 0,130 g

rifampicina: 0,130 g

cloranfenicol: 0,130 g

nistatina: 0,050 g

aceite de soja: 2 ml

aceite de germen de trigo: 2 ml

Se aplicaron cincuenta |jl de una solucion de ARNbc a una concentracion de 1 mg/ml por v^a topica sobre la dieta artificial solida en los pocillos de la placa multipocillo. La dieta se seco en una cabina de flujo laminar. Por tratamiento, se ensayaron veinticuatro larvas de escarabajo de la patata de Colorado (2° estadio), con dos insectos por pocillo. Las placas se conservaron en la camara de cna de insectos a una temperatura de 25 ± 2 °C, humedad relativa del 60 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. Se evaluo a los escarabajos como vivos o muertos cada 1,2 o 3 dfas. Despues de siete dfas, para las dianas LD006, LD007, LD010, LD011 y LD014, la dieta se reemplazo por dieta nueva con ARNbc aplicado por via topica a la misma concentracion (1 mg/ml); para las dianas LD001, LD002, LD003, LD015 y LD016, la dieta se reemplazo solo por dieta reciente. Los ARNbc diana se compararon con solo con dieta o dieta con ARNbc aplicado por via topica correspondiente a un fragmento de la secuencia codificante de la GFP (protema fluorescente verde) (SEC ID N°: 235).

La alimentacion con dieta artificial que contema los ARNbc desnudos a larvas de L. decemlineata dio como resultado aumentos significativos en la mortalidad de las larvas como se indica en dos bioensayos separados (Figuras 1LD- 2LD).

Todos los ARNbc ensayados dieron como resultado finalmente una mortalidad del 100 % despues de 7 a 14 dfas. La dieta con o sin ARNbc de GFP mantuvo a los insectos a lo largo del bioensayo con poca o sin mortalidad.

Tfpicamente, en todos los ensayos observados, las larvas de EPC de segundo estadio se alimentaron normalmente con dieta con o sin ARNbc durante 2 dfas y cambiaron al tercer estadio larvario. En este nuevo estadio larvario, se observo que los EPC redudan significativamente o del todo su alimentacion, con un aumento en la mortalidad como resultado.

E. Bioensayo de dianas de ARNbc usando discos foliares de patata para actividad contra Leptinotarsa decemlineata

Se empleo un metodo de bioensayo alternativo usando material foliar de patata en lugar de dieta artificial como fuente de alimentacion para los EPC. Se cortaron discos de aproximadamente 1,1 cm de diametro (o 0,95 cm2) de hojas de plantas de patata de 2 a 3 de vida usando un horadador de corteza de tamano adecuado. Los discos foliares tratados se prepararon aplicando 20 jl de una solucion de 10 ng/jl de ARNbc de LD002 diana o ARNbc de gfp de control en la superficie foliar adaxial. Se dejo que los discos foliares se secasen y se colocaron individualmente en 24 pocillos de una multiplaca de 24 pocillos (Nunc™). Se coloco en cada pocillo un solo EPC de segundo estadio larvario, que despues se cubrio con papel de tejido y una tapa de plastico multipocillo. La placa que contema los insectos y los discos foliares se mantuvo en una camara de insectos a 28 °C con un fotoperiodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad. Se dejo que los insectos se alimentasen de los discos foliares durante 2 dfas, tras los cuales se transfirieron los insectos a una nueva placa que contema discos foliares tratados recientes. A continuacion, los insectos se transfirieron a una placa que contema discos foliares no tratados cada dfa hasta el dfa 7. Se registraron las puntuaciones de mortalidad y peso de los insectos.

La alimentacion con discos foliares de patata con ARNbc desnudo intacto aplicado sobre la superficie de LD002 diana a larvas de L. decemlineata dio como resultado un aumento significativo en la mortalidad larvaria (es decir, en el dfa 7 todos los insectos estaban muertos; mortalidad del 100 %) mientras que el ARNbc de gfp de control no tuvo ningun efecto sobre la supervivencia del EPC. El ARNbc de LD002 diana afecto gravemente al crecimiento de las larvas despues de 2 a 3 dfas mientras que las larvas alimentadas con ARNbc de gfp a la misma concentracion se desarrollaron como normales (Figura 3-LD).

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F. Exploracion de versiones mas cortas de los ARNbc usando dieta artificial con respecto a la actividad contra Leptinotarsa decemlineata

Este ejemplo ilustra el descubrimiento de que fragmented de ARNbc mas cortos (60 o 100 pb) por sf mismos o como construcciones de concatemero son suficientes para causar toxicidad para el escarabajo de la patata de Colorado.

Para este ejemplo se selecciono LD014, una diana que se sabe que induce letalidad en el escarabajo de la patata de Colorado. Este gen codifica una subunidad E de V-ATPasa (SEC ID N°:: 15).

Un fragmento de 100 pares de bases, LD014_F1, en la posicion 195-294 en la SEC ID N:: 15 (SEC ID N°: 159) y un fragmento de 60 pares de bases, LD014_F2, en la posicion 235-294 en la SEC ID N:: 15 (SEC ID N°: 160) se seleccionaron adicionalmente. Vease tambien la Tabla 7-LD.

Se disenaron dos concatemeros de 300 pares de bases, LD014_C1 y LD014_C2, (SEC ID N°:: 161 y SEC ID N°:: 162). LD014_C1 contema 3 repeticiones del fragmento de 100 pares de bases descrito anteriormente (SEC ID N°::

159) y LD014_C2 contema 5 repeticiones del fragmento de 60 pares de bases descrito anteriormente (SEC ID N°::

160) . Vease tambien la Tabla 7-LD.

Los fragmentos LD014_F1 y LD014_F2 se sintetizaron como cebadores en sentido y antisentido. Estos cebadores se hibridaron para crear las moleculas de ADN bicatenario antes de la clonacion. Se incluyeron los sitios de restriccion XbaI y XmaI en los extremos 5' y 3' de los cebadores, respectivamente, para facilitar la clonacion.

Los concatemeros se produjeron como genes sinteticos de 300 pares de bases. Se incluyeron los sitios de restriccion XbaI y XmaI en los extremos 5' y 3' de los fragmentos de ADN sinteticos, respectivamente, para facilitar la clonacion.

Las 4 moleculas de ADN, es decir, las 2 unidades sencillas (LD014_F1 y LD014_F2) y los 2 concatemeros (LD014_C1 y LD014_C2), se sometieron a digestion con XbaI y XmaI y se subclonaron en pBluescriptII SK+ linealizado con digestiones de XbaI y XmaI, dando como resultado plasmidos recombinantes p1, p2, p3 y p4, respectivamente.

Produccion de ARN bicatenario: se sintetizo ARNbc usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express. En primer lugar se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en direccion 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una orientacion diferente con respecto al promotor de T7. Para LD014_F1, se genero el molde de T7 en sentido usando el cebador directo espedfico de T7 oGBM159 y el cebador inverso espedfico oGBM164 (representados en el presente documento como SEC ID N°:: 204 y SEC ID N°: 205, respectivamente) en una reaccion PCR con las siguientes condiciones: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72°C. El molde de T7 antisentido se genero usando el cebador directo espedfico oGBM163 y el cebador inverso espedfico de T7 oGBM160 (representado en el presente documento como SEC ID N°: 206 y SEC ID N°:: 207, respectivamente) en una reaccion PCR con las mismas condiciones descritas anteriormente. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificacion PCR (kit de purificacion PCR Qiaquick®) y precipitacion de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante se representa en el presente documento por SEC ID N°: 203.

Para LD014_F2, se genero el molde de T7 en sentido usando el cebador directo espedfico de T7 oGBM161 y el cebador inverso espedfico oGBM166 (representados en el presente documento como las SEC ID N°:: 209 y SEC ID N°:: 210, respectivamente) en una reaccion PCR con las siguientes condiciones: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72°C. El molde de T7 antisentido se genero usando el cebador directo espedfico oGBM165 y el cebador inverso espedfico de T7 oGBM162 (representado en el presente documento como SEC ID N°: 211 y SEC ID N°:: 212, respectivamente) en una reaccion PCR con las mismas condiciones descritas anteriormente. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificacion PCR (kit de purificacion PCR Qiaquick®) y precipitacion de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante se representa en el presente documento por SEC ID N°: 208.

Tambien para los concatemeros, se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en direccion 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una orientacion diferente con respecto al promotor de T7. Los plasmidos recombinantes p3 y p4 que conteman LD014_C1 y LD014_C2 se linealizaron con XbaI o XmaI, los dos fragmentos lineales para cada construccion se purificaron y se usaron como molde para el ensayo de transcripcion in vitro, usando los promotores de T7 que flanqueaban a los sitios de clonacion. Se preparo aRn bicatenario mediante transcripcion in vitro usando Sistema de ARNi T7 RiboMAX™ Express. Las hebras sentido de los ARNbc resultantes para LD014_C1 y LD014_C2 se representan en el presente documento por SEQ ID NO:: 213 y SEC ID N°:: 214, respectivamente.

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Secuencias mas cortas de LD014 diana y concatemeros fueron capaces de inducir letalidad en Leptinotarsa decemlineata, tal como se muestra en la Figura 4-LD.

G. Exploracion de los ARNbc a diferentes concentraciones usando dieta artificial para actividad contra Leptinotarsa decemlineata

Cincuenta pl de una solucion de ARNbc a concentraciones en serie de factor 10 de 1 pg/pl (para LD027 diana a partir de 0,1 pg/pl) hasta 0,01 ng/pl se aplicaron por via topica en la dieta artificial solida en los pocillos de una placa de 24 pocillos (Nunc™). La dieta se seco en una cabina de flujo laminar. Por tratamiento, se ensayaron veinticuatro larvas de escarabajo de la patata de Colorado (2° estadio), con dos insectos por pocillo. Las placas se conservaron en la camara de cna de insectos a una temperatura de 25 ± 2 °C, humedad relativa del 60 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. Se evaluo a los escarabajos como vivos o muertos a intervalos regulares hasta el dfa 14. Despues de siete dfas, la dieta se reemplazo por dieta nueva con ARNbc aplicado por via topica a las mismas concentraciones. Los ARNbc diana se compararon con dieta sola.

La alimentacion con dieta artificial que contema los ARNbc desnudos intactos de diferentes dianas a larvas de L. decemlineata dio como resultado mortalidades larvarias elevadas a concentraciones tan bajas como entre 0,1 y 10 ng de ARNbc/pl tal como se muestra en la Figura 5-LD.

H. Clonacion de un fragmento genico de EPC en un vector adecuado para la produccion bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos

Aunque puede usarse cualquier promotor bacteriano eficaz, se clono un fragmento de ADN correspondiente a una diana genica de EPC en un vector para la expresion de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano (vease el documento WO 00/01846).

Las secuencias de los cebadores espedficos usados para la amplificacion de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8. El molde usado es el vector pCR8/GW/TOPO® que contiene cualquiera de las secuencias diana. Los cebadores se usan en una reaccion PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizo en gel de agarosa, se purifico (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clono en su extremo romo en vector pGNA49A linealizado con Srf I (referencia al documento WO00188121A1) y se secuencio. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la secuencia respectiva tal como se proporciona en la Tabla 8. El vector recombinante que porta esta secuencia se denomina pGBNJ003.

Las secuencias de los cebadores espedficos usados para la amplificacion del fragmento genico LD010 se proporcionan en la Tabla 8 (cebador directo SEC ID N°:: 191 y cebador inverso SEC ID N°:: 190). El molde usado era el vector pCR8/GW/TOPO® que contema la secuencia LD010 (SEC ID N°:: 11). Los cebadores se usaron en una reaccion PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizo en gel de agarosa, se purifico (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clono en su extremo romo en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuencio. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la SEC ID N°:: 188 tal como se proporciona en la Tabla 8. El vector recombinante que porta esta secuencia se denomino pGBNJ003.

I. Expresion y produccion de una diana de ARN bicatenario en dos cepas de Escherichia coli: (1) AB301- 105(DE3), y, (2) BL21(DE3)

Se siguieron los procedimientos descritos a continuacion para expresar niveles adecuados de ARN bicatenario activo en insectos de LD010 diana en bacterias. Se uso una cepa deficiente en RNasaIII, AB301-105(DE3), en comparacion con bacterias que conteman RNasaIII de tipo silvestre, BL21(DE3).

Transformacion de AB301-105(DE3) y BL21(DE3)

Se anadieron trescientos ng del plasmido y se mezclaron suavemente en una alfcuota de 50 pl de la cepa de E. coli qmmicamente competente enfriada en hielo AB301-105(DE3) o BL21(DE3). Las celulas se incubaron sobre hielo durante 20 minutos antes de someterlas a un tratamiento de choque termico de 37 °C durante 5 minutos, despues de los cuales se pusieron de nuevo sobre hielo durante 5 minutos adicionales. Se anadieron cuatrocientos cincuenta pl de medio SOC a temperatura ambiente a las celulas y la suspension se incubo en un agitador (250 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Se transfirieron cien pl de la suspension de celulas bacterianas a un matraz conico de 500 ml que contema 150 ml de caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) lfquido suplementado con 100 pg/ml de antibiotico de carbenicilina. El cultivo se incubo en un agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37 °C durante toda la noche (16 a 18 horas).

Induccion qumica de la expresion de ARN bicatenario en AB301-105(DE3) y BL21(DE3)

La expresion de ARN bicatenario del vector recombinante pGBNJ003, en la cepa bacteriana AB301-105(DE3) o BL21(DE3) fue posible ya que estaban presentes todos los componentes geneticos para expresion controlada. En presencia del inductor qmmico isopropiltiogalactosido, o IPTG, la polimerasa T7 dirigira la transcripcion de la

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secuencia diana en direcciones tanto antisentido como sentido ya que estas estan flanqueadas por promotores de T7 orientados de manera opuesta.

La densidad optica a 600 nm del cultivo bacteriano de una noche se midio usando un espectrofotometro adecuado y se ajusto a un valor de 1 mediante la adicion de caldo LB reciente. Se transfirieron cincuenta ml de este cultivo a un tubo Falcon™ de 50 ml y el cultivo se centrifugo despues a 3000 g a 15 °C durante 10 minutos. Se retiro el sobrenadante y el sedimento bacteriano se resuspendio en 50 ml de medio completo S reciente (medio SNC mas 5 |jg/ml de colesterol) suplementado con 100 jg/ml de carbenicilina e IPTG 1 mM. Las bacterias se indujeron durante 2 a 4 horas a temperatura ambiente.

Tratamiento con calor de bacterias

Las bacterias se destruyeron mediante tratamiento con calor para minimizar el riesgo de contaminacion de la dieta artificial en las placas de ensayo. Sin embargo, el tratamiento con calor de las bacterias que expresaban ARN bicatenario no es un requisito previo para inducir la toxicidad hacia los insectos debido a la interferencia de ARN. El cultivo bacteriano inducido se centrifugo a 3000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos, se desecho el sobrenadante y el sedimento se sometio a 80 °C durante 20 minutos en un bano con agua. Despues del tratamiento con calor, el sedimento bacteriano se resuspendio en 1,5 ml de agua MilliQ y la suspension se transfirio a un tubo de microcentnfuga. Se prepararon y usaron diversos tubos en los bioensayos para cada renovacion. Los tubos se conservaron a -20 °C hasta su uso posterior.

J. Ensayos de laboratorio para probar Escherichia coli que expresan el ARNbc diana de LD010 contra Leptinotarsa decemlineata

Se emplearon dos metodos de bioensayo para ensayar el ARN bicatenario producido en Escherichia coli contra larvas del escarabajo de la patata de colorado: (1) bioensayo basado en dieta artificial, y, (2) bioensayo basado en plantas.

Bioensayos basado en dieta artificial

Se preparo una dieta artificial para el escarabajo de la patata de Colorado como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 4. Se dispenso medio mililitro de dieta en cada uno de los pocillos de una placa de ensayo multipocillo de 48 pocillos (Nunc ). Para cada tratamiento, se aplicaron cincuenta jl de una suspension de bacterias tratadas con calor de DO 1 (que es equivalente a 5 x 107 celulas bacterianas) que expresaban ARNbc por via topica en la dieta solida en los pocillos y se dejaron secar las placas en una cabina de flujo laminar. Por tratamiento, se ensayaron cuarenta y ocho larvas de escarabajo de la patata del colorado de 2° estadio, una por cada pocillo que contema dieta y bacterias. Cada fila de una placa (es decir, 8 pocillos) se considero como un replicado. Las placas se mantuvieron en la camara de cna de insectos a una temperatura de 25 ± 2 °C, humedad relativa del 60 ± 5 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. Despues de cada 4 dfas, se transfirieron los escarabajos a dieta reciente que contema bacterias aplicadas por via topica. Los escarabajos se evaluaron como vivos o muertos cada dfa o tres dfas despues de la infestacion. Para los supervivientes, se registro el crecimiento y desarrollo en terminos de peso larvario en el dfa 7 despues de la infestacion.

Para la cepa de E. coli AB301-105(DE3) deficiente en RNasaIII, se ensayaron las bacterias que conteman el plasmido pGBNJ003 y aquellas que conteman el vector vacfo pGN29 (referencia al documento WO 00/188121A1) en bioensayos para toxicidad en EPC. Las bacterias que portaban el plasmido pGBNJ003 mostraron un claro aumento en la mortalidad de insectos a lo largo del tiempo, mientras que se observo muy poca o ninguna mortalidad para pGN29 y control de solo dieta (Figuras 6a-LD y 7a-LD). El crecimiento y desarrollo de supervivientes larvarios del escarabajo de la patata de Colorado, 7 dfas despues de la alimentacion con una dieta artificial que contema bacterias que expresaban ARNbc de LD010 diana, estaba gravemente impedido (Tabla 10-LD, Figura 8a-LD).

Para la cepa de E. coli BL21(DE3), se ensayaron bacterias que conteman plasmido pGBNJ003 y aquellas que conteman el vector vacfo pGN29 contra las larvas del escarabajo de la patata de Colorado. Se observaron efectos perjudiciales similares en las larvas alimentadas con dieta suplementada con bacterias BL21(DE3) al igual que para la cepa deficiente en RNasaIII, AB301-105(DE3) (Figuras 6b-LD y 7b-LD). Sin embargo, el numero de supervivientes para los cinco clones fue mayor para BL21(DE3) que para AB301-105(DE3); en el dfa 12, los valores promedio de mortalidad fueron aproximadamente un 25 % menores para esta cepa en comparacion con la cepa deficiente en RNasaIII. Asimismo, los pesos promedio de los supervivientes alimentados con dieta que contema BL21(DE3) que expresaba ARNbc correspondiente a LD010 diana se vieron gravemente reducidos (Tabla 10-LD, Figura 8b-LD).

El retraso en el crecimiento y desarrollo de las larvas de EPC alimentadas con una dieta que contema cualquiera de las dos cepas bacterianas que alojaban el plasmido pGBNJ003 estaba directamente correlacionado con la inhibicion de la alimentacion dado que no se observaban excrementos en los pocillos de placas recientes del dfa 4 en adelante cuando se compararon con bacterias que portaban el vector vacfo pGN29 o las de la placa de solo dieta. Esta observacion fue similar a aquella en la que se alimento a los EPC con ARN bicatenario transcrito in vitro aplicado por via topica a la dieta artificial (vease el Ejemplo 3D); en este caso, el cese de la alimentacion se produjo desde el dfa 2 en adelante en los tratados con dieta.

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Bioensayos basados en plantas

Se rocio a plantas de patata enteras con suspensiones de bacterias qmmicamente inducidas que expresaban ARNbc antes alimentar a larvas de EPC con las plantas. Las plantas de patata de la variedad "lmea 5" se desarrollaron a partir de tuberculos hasta el estadio de 8-12 hojas desplegadas en una camara de cultivo de plantas con las siguientes condiciones: 25 ± 2 °C, humedad relativa del 60 %, fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plastico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente colocado en el suelo en una maceta y se recorto la base y se cubrio con una fina malla de nailon para permitir el aireamiento, reducir la condensacion en su interior e impedir que se escapen las larvas. Se colocaron quince larvas de escarabajo de la patata de Colorado en el estadio larvario L1 en cada planta tratada en la jaula. Las plantas se trataron con una suspension de E. coli AB301-105(DE3) que portaban los plasmidos pGBNJ003 (clon 1; Figura 7a-LD) o el plasmido pGN29 (clon 1; vease la Figura 7a-LD). Se aplicaron diferentes cantidades de bacterias a las plantas: 66, 22 y 7 unidades, donde una unidad se define como 109 celulas bacterianas en 1 ml de una suspension bacteriana a un valor de densidad optica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se rocio un volumen total de 1,6 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se uso una planta por tratamiento en ese ensayo. Se conto el numero de supervivientes y se registro el peso de cada superviviente.

El rociado de las plantas con una suspension de la cepa bacteriana de E. coli AB301-105(DE3) que expresaba ARNbc diana de pGBNJ003 dio lugar a un drastico aumento en la mortalidad de los insectos en comparacion con el control de pGN29. El recuento de mortalidad se mantuvo cuando la cantidad de suspension celular bacteriana se diluyo 9 veces (Figura 9-LD). Los pesos promedio de los supervivientes larvarios en el dfa 11 en las plantas rociadas con bacterias que portaban el vector pGBNJ003 eran aproximadamente 10 veces menores que los de aquellos de pGN29 (Figura 10-LD). El dano por la alimentacion de las larvas de EPC en la planta de la patata rociada con bacterias que conteman el plasmido pGBNJ003 estaba muy reducido en comparacion con el dano ocasionado a una planta de patata pulverizada con bacterias que conteman el vector vacfo pGN29 (Figura 11-LD).

Estos experimentos demostraron que el ARN bicatenario correspondiente a una secuencia diana de gen de insecto producida en sistemas de expresion de tipo silvestre o deficientes en RNasaIII es toxico para el insecto en cuanto a aumentos sustanciales en la mortalidad de los insectos y en el retraso en el crecimiento/desarrollo para los supervivientes larvarios. Tambien esta claro a partir de estos experimentos que se proporciona un ejemplo para proteger eficazmente a plantas/cultivos del dano por insectos mediante el uso de una pulverizacion de una formulacion que consiste en bacterias que expresan ARN bicatenario correspondiente a un gen diana de insecto.

K. Ensayo de diversas densidades de cultivo en suspension de Escherichia coli que expresan ARNbc de diana de LD010 contra Leptinotarsa decemlineata

La preparacion y tratamiento de cultivos bacterianos se describen en el Ejemplo 3J. Se aplicaron diluciones en serie de factor tres de cultivos (comenzando a partir de 0,25 unidades equivalentes) de la cepa de Escherichia coli deficiente en RNasaIII AB301-105(DE3) que expresaba ARN bicatenario de LD010 diana al follaje de la planta de la patata de la variedad "Bintje" en el estadio de 8-12 hojas desplegadas. Se colocaron diez larvas de L1 de L. decemlineata sobre las plantas tratadas con una planta por tratamiento. La puntuacion de la mortalidad de insectos y el impedimento del crecimiento se realizo en el dfa 7 (es decir, 7 dfas despues de la infestacion).

Tal como se muestra en la Figura 14-LD, se registro una alta mortalidad larvaria de EPC (del 90 al 100 %) despues de 1 semana cuando se alimento a los insectos con plantas de patata tratadas con una aplicacion topica mediante una fina pulverizacion de cultivos inactivados por calor de E. coli que portaban plasmido pGBNJ003 (para la expresion de ARNbc de diana 10) a densidades de 0,25, 0,08 y 0,025 unidades bacterianas. A 0,008 unidades, aproximadamente un tercio de los insectos estaban muertos, sin embargo, los insectos supervivientes eran significativamente mas pequenos que aquellos en los grupos de control (E. coli que portaba el vector vacfo pGN29 y solo agua). El dano por la alimentacion de las larvas de EPC en la planta de la patata rociada con bacterias que conteman el plasmido pGBNJ003 a concentraciones de 0,025 o 0,008 unidades estaba muy reducido en comparacion con el dano ocasionado a una planta de patata pulverizada con bacterias que conteman el vector vacfo pGN29 (Figura 15-LD).

L. Los adultos son extremadamente susceptibles al ARNbc ingerido por via oral correspondiente a genes diana.

El ejemplo proporcionado a continuacion destaca el descubrimiento de que los insectos adultos (y no solo insectos en el estadio larvario) son extremadamente susceptibles al ARNbc ingerido por via oral correspondiente a genes diana.

Se seleccionaron cuatro genes para este experimento: dianas 2, 10, 14 y 16 (SEC ID N°: 168, 188, 198 y 220, respectivamente). Se uso como control ARNbc de un fragmento de GFP (SEC ID N°: 235). Se cogieron al azar adultos jovenes (de 2 a 3 dfas de vida) del cultivo de cna en laboratorio sin sesgo hacia el genero del insecto. Se seleccionaron diez adultos por tratamiento. Los adultos se mantuvieron previamente en ayuno durante al menos 6 horas antes del comienzo del tratamiento. En el primer dfa del tratamiento, se dio de comer a cada adulto cuatro discos foliares de patata (1,5 cm2 de diametro) que se habfan tratado previamente con una aplicacion topica de 25 pl

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de ARNbc diana a 0,1 pg/pl (sintetizado tal como se describe en el Ejemplo 3A; aplicacion topica tal como se describe en el Ejemplo 3E) por disco. Se confino a cada adulto en una placa de Petri pequena (3 cm de diametro) para asegurarse de que todos los insectos hadan ingerido cantidades iguales de alimento y por lo tanto recidan las mismas dosis de ARNbc. Al dfa siguiente se alimento de nuevo a cada adulto con cuatro discos foliares tratados tal como se ha descrito anteriormente. En el tercer dfa, se recogieron los diez adultos por tratamiento y se colocaron juntos en una jaula que consistfa en una caja de plastico (dimensiones 30 cm x 20 cm x 15 cm) con una fina malla de nailon incorporada en la tapa para proporcionar buena ventilacion. Dentro de la caja, se coloco en la base cierta cantidad de papel de filtro humedecido. Se coloco cierta cantidad de follaje de patata (no tratado) sobre el papel para mantener a los adultos durante el experimento. A partir del dfa 5, se llevaron a cabo evaluaciones regulares para contar el numero de insectos muertos, vivos (que se movfan) y moribundos. Para evaluar si los insectos estaban moribundos, se coloco a los adultos sobre sus dorsos para comprobar si eran capaces de volver a colocarse en varios minutos; se considero que un insecto estaba moribundo solo si no era capaz darse la vuelta.

En este experimento se demostraron efectos toxicos espedficos evidentes del ARN bicatenario correspondiente a diferentes dianas en adultos del escarabajo de la patata de Colorado, Leptinotarsa decemlineata, (Figure 12-LD). El ARN bicatenario correspondiente a un fragmento de gfp no mostro toxicidad hacia adultos de EpC en el dfa de la valoracion final (dfa 19). Este experimento demostro claramente que la supervivencia de adultos de EPC se redujo gravemente solo tras unos dfas de exposicion a ARNbc cuando se administro por via oral. Por ejemplo, para la diana 10, en el dfa 5, 5 de 10 adultos estaban moribundos (enfermos y se movfan lentamente); en el dfa 6, 4 de cada 10 adultos estaban muertos con tres de los supervivientes moribundos; en el dfa 9, todos los adultos observados estaban muertos.

Como consecuencia de este experimento, la aplicacion de los ARN bicatenarios diana contra plagas de insectos pueden ampliarse para incluir las dos fases vitales de una plaga de insecto (es decir, larvas y adultos) que pueden ocasionar un amplio dano a los cultivos, como es el caso del escarabajo de la patata de Colorado.

Ejemplo 4: Phaedon cochleariae (escarabajo de la hoja de mostaza)

A. Clonacion de una secuencia parcial de los genes de Phaedon cochleariae (escarabajo de la hoja de mostaza) PC001, PC003, PC005, PC010, PC014, PC016 y PC027 mediante PCR de familia

Se aislo ARN intacto de alta calidad a partir del estadio larvario de Phaedon cochleariae (escarabajo de la hoja de mostaza; Fuente: Dr. Caroline Muller, Julius-von-Sachs-Institute for Biosciences, Chemical Ecology Group, University of Wuerzburg, Julius-von-Sachs-Platz 3, D-97082 Wuerzburg, Alemania) usando reactivo TRIzol® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genomico presente en la preparacion de ARN se retiro mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante. Se genero ADNc usando un kit comercialmente disponible (transcriptasa inversa SuperScript® Ill) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para aislar secuencias de ADNc que comprendfan una porcion de los genes PC001, PC003, PC005, PC010, PC014, PC016 y PC027, se realizo una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificacion de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-PC. La Tabla 2-PC muestra genes diana de Phaedon cochleariae que incluyen secuencias cebadoras y secuencias de ADNc obtenidas. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purifico (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR4/TOPO® (N° de Cat. K4530- 20, Invitrogen™) y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-PC y se citan como las secuencias parciales.

Las secuencias de aminoacidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-PC, La Tabla 3-PC proporciona secuencias de aminoacidos de clones de ADNc y el inicio de la fase de lectura se indica entre parentesis.

B. Produccion de ARNbc de los genes de Phaedon cochleariae

Se sintetizo ARNbc en cantidades de miligramo usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express. En primer lugar se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en direccion 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una orientacion diferente con respecto al promotor de T7.

Para cada uno de los genes diana, se genero el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso espedficos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-PC. La Tabla 8-PC proporciona detalles para preparar fragmentos de ARN de secuencias diana de Phaedon cochleariae, incluyendo secuencias cebadoras.

Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes: 1 minuto a 95 °C, seguido de 20 ciclos de 30

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segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 50 °C y 1 minuto a 72 °C seguido de 10 minutes a 72 °C. El molde de T7 antisentido se genero usando cebadores directos e inversos de T7 espedficos en una reaccion PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-PC. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificacion PCR (kit de purificacion PCR Qiaquick®) y precipitacion de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8PC.

C. Recombinacion de los genes de Phaedon cochleariae (escarabajo de la hoja de mostaza) en el vector vegetal pK7GWIWG2D(II)

Dado que el mecanismo de interferencia de ARN actua a traves de fragmentos de ARNbc, las secuencias

nucleotfdicas diana de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientacion

antisentido y sentido, separados por el intron - CmR - intron, en el que CmR es el marcador de resistencia a cloranfenicol, para formar una construccion de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron usando la reaccion de recombinacion LR entre un clon de entrada que contema attL (vease el Ejemplo 4A) y un vector de destino que contema attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIWG2D(II) se obtuvo a traves de VIB/Plant Systems Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reaccion de recombinacion de LR se llevo a cabo usando la mezcla enzimatica LR Clonase™ II siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos

experimentos de clonacion produjeron una construccion en horquilla de cada uno de los genes PC001, PC010,

PC014, PC016 y PC027, que teman la orientacion promotor - sentido - intron - CmR - intron - antisentido y en el que el promotor es el promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S es adecuado para la transformacion en A. tumefaciens.

Se realizaron digestiones con enzimas de restriccion en los plasmidos de pCR8/GW/TOPO® que conteman las diferentes dianas (vease el Ejemplo 4B): para PC001, una doble digestion con BsoBI y Pvul; para PC010, una doble digestion con Pvul y PvuII; para PC014, una triple digestion con II, Pvul y Xhol; para PC016, una sola digestion con ApaLI; para PC027, una doble digestion con AvaI y DrdI. La banda que contema el gen de interes flanqueado por los sitios de attL se purifico usando el kit de extraccion en gel Qiaquick®. Se anadio una cantidad de 150 ng de fragmento purificado y 150 ng de pK7GWIWG2D(II) junto con la enzima LR clonasa II y se incubo durante al menos 1h a 25 °C. Despues del tratamiento con la solucion de proteinasa K (10 min a 37°C), la mezcla de recombinacion completa se transformo en las celulas qrnmicamente competentes Top 10. Se seleccionaron los clones positivos mediante analisis por digestion de restriccion. La secuencia completa de la construccion en horquilla para:

- PC001 (sentido - intron - CmR - intron - antisentido) se representa en la SEC ID N°: 508;

- PC010 (sentido - intron - CmR - intron - antisentido) se representa en la SEC ID N°: 509;

- PC014 (sentido - intron - CmR - intron - antisentido) se representa en la SEC ID N°: 510;

- PC016 (sentido - intron - CmR - intron - antisentido) se representa en la SEC ID N°: 511;

- PC027 (sentido - intron - CmR - intron - antisentido) se representa en la SEC ID N°: 512;

La Tabla 9-PC proporciona secuencias para cada construccion en horquilla.

D. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc, usando discos foliares de colza oleaginosa con respecto a actividad contra larvas de Phaedon cochleariae

El ejemplo proporcionado a continuacion es una ejemplificacion del hallazgo de que las larvas del escarabajo de la hoja de la mostaza (EHM) son susceptibles a ARNbc ingerido por via oral correspondiente a los propios genes diana.

Para ensayar las diferentes muestras de ARN bicatenario contra larvas de EHM, se empleo un ensayo disco foliar usando material foliar de colza oleaginosa (Brassica napus variedad SW Oban; Fuente: Nick Balaam, Sw Seed Ltd., 49 North Road, Abington, Cambridge, CB1 6AS, Reino Unido) como fuente de alimentacion. Los cultivos de insecto se mantuvieron en la misma variedad de colza oleaginosa en la camara de insectos a 25 ± 2 °C y una humedad relativa del 60 ± 5 % con un fotoperiodo de 16h de luz/8h de oscuridad. Se cortaron discos de aproximadamente 1,1 cm de diametro (o 0,95 cm2) de hojas de plantas de colza de 4 a 6 semanas de edad usando un taladro de corteza de tamano adecuado. Se diluyeron muestras de ARN bicatenario a 0,1 pg/pl en agua Milli-Q que contema Triton™ X- 100 al 0,05 %. Se prepararon discos foliares tratados aplicando 25 pl de la solucion diluida de ARNbc diana de PC001, PC003, PC005, PC010, PC014, PC016, PC027 y ARNbc de gfp de control o Triton™ X-100 0,05 % sobre la superficie foliar adaxial. Se dejaron secar los discos foliares y se colocaron individualmente en cada uno de los 24 pocillos de una multiplaca de 24 pocillos que conteman 1 ml de agar al 2 % gelificado que ayuda a evitar que el disco foliar se seque. Se colocaron dos larvas de EHM neonatas en cada pocillo de la placa, que despues se cubrio con una tapa de plastico multipocillo. La placa (un tratamiento que contema 48 insectos) se dividio en 4 replicados de 12 insectos por replicado (cada fila). La placa que contema los insectos y los discos foliares se mantuvo en una camara de insectos a 25 ± 2 °C y una humedad relativa del 60 ± 5 % con un fotoperiodo de 16h de luz/8h de oscuridad. Se alimento a los insectos con discos foliares durante 2 dfas, tras los cuales se transfirieron a una nueva

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placa que contema discos foliares recientemente tratados. A continuacion, 4 d^as despues del inicio del bioensayo, los insectos de cada replicado se recogieron y se transfirieron a una placa de Petri que contema hojas de colza oleaginosa nuevas no tratadas. Se registraron la mortalidad larvaria y el peso promedio en los d^as 2, 4, 7, 9 y 11.

Las larvas de P. cochleariae alimentadas con hojas de colza oleaginosa tratadas con ARNbc diana desnudo intacto dieron como resultado aumentos significativos en las mortalidades larvarias para todas las dianas ensayadas, tal como se indica en la Figura 1(a). El ARN bicatenario ensayado para PC010 diana ocasiono una mortalidad larvaria del 100 % en el dfa 9 y para PC027 en el dfa 11. Para todas las otras dianas, se alcanzaron valores de mortalidad significativamente altos en el dfa 11 en comparacion con el ARNbc de gfp de control, Triton™ X-100 al 0,05 % solamente hoja no tratada: (valor promedio en porcentaje ± intervalo de confianza con alfa 0,05) PC001 (94,4 ± 8,2); PC003 (86,1 ± 4,1); PC005 (83,3 ± 7,8); PC014 (63,9 ± 20,6); PC016 (75,0 ± 16,8); ARNbc de gfp (11,1 ± 8,2); Triton™ X-100 al 0,05 % (19,4 ± 10,5); hoja solamente (8,3 ± 10,5).

Los supervivientes larvarios se evaluaron basandose en su peso promedio. Para todas las dianas ensayadas, las larvas del escarabajo de la hoja de mostaza tuvieron pesos promedio significativamente reducidos despues del dfa 4 del bioensayo; los insectos alimentados con ARNbc de gfp o Triton™ X-100 al 0,05 % solamente, se desarrollaron normalmente, al igual que para larvas solamente con hojas (Figura 1(b)-PC).

E. Ensayos de laboratorio para explorar ARNbc a diferentes concentraciones usando discos foliares de colza oleaginosa con respecto a la actividad contra larvas de Phaedon cochleariae

Se aplicaron veinticinco pl de una solucion de ARNbc PC010 o PC027 diana a concentraciones diez veces en serie desde 0,1 pg/pl hasta 0,1 ng/pl por via topica sobre el disco foliar de colza oleaginosa, tal como se ha descrito en el Ejemplo 4D anterior. Como control negativo, se administro solamente Triton™ X-100 al 0,05 % al disco foliar. Por tratamiento, se ensayaron veinticuatro larvas neonatas de escarabajo de la hoja de mostaza, con dos insectos por pocillo. Las placas se conservaron en la camara de cna de insectos a una temperatura de 25 ± 2 °C, humedad relativa del 60 ± 5 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. En el dfa 2, las larvas se transfirieron a una nueva placa que contema discos foliares nuevos tratados con ARNbc. En el dfa 4 para PC010 diana y en el dfa 5 para PC027 diana, los insectos de cada replicado se transfirieron a una placa de Petri que contema material foliar no tratado abundante. Los escarabajos se evaluaron como vivos o muertos en los dfas 2, 4, 7, 8, 9 y 11 para PC010 diana y 2, 5, 8, 9 y 12 para PC027 diana.

La alimentacion con discos foliares de colza oleaginosa que conteman ARNbc desnudos intactos de las dos dianas diferentes, PC010 y PC027, a larvas de P. cochleariae dio como resultado altas mortalidades a concentraciones tan bajas como 1 ng de ARNbc/pl de solucion, tal como se muestra en las Figuras 2 (a) y (b). Los valores de mortalidad promedio en porcentaje ± intervalo de confianza con alfa 0,05 para diferentes concentraciones de ARNbc para PC010 diana en el dfa 11, 0 pg/pl: 8,3 ± 9,4; 0,1 pg/pl: 100; 0,01 pg/pl: 79,2 ± 20,6; 0,001 pg/pl: 58,3 ± 9,4; 0,0001 pg/pl: 12,5 ± 15,6; y para PC027 diana en el dfa 12, 0 pg/pl: 8,3 ± 9,4; 0,1 pg/pl: 95,8 ± 8,2; 0,01 pg/pl: 95,8 ± 8,2; 0,001 pg/pl: 83,3 ± 13,3; 0,0001 pg/pl: 12,5 ± 8,2.

F. Clonacion de un fragmento genico de EHM en un vector adecuado para la produccion bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos

A continuacion hay un ejemplo de clonacion de un fragmento de ADN correspondiente a una diana genica de EHM en un vector para la expresion de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano, aunque puede usarse cualquier vector que comprende un promotor de T7 o cualquier otro promotor para la transcripcion eficaz en bacterias (referencia al documento WO0001846).

Las secuencias de los cebadores espedficos usados para la amplificacion del fragmento genico diana PC010 se proporcionan en la Tabla 8-PC. El molde usado era el vector pCR8/GW/TOPO® que contema la secuencia de PC010 (SEC ID N°: 253). Los cebadores se usaron en una reaccion PCR touchdown con las siguientes condiciones: 1 minuto a 95 °C, seguido de 20 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C con reduccion de la temperatura de -0,5 °C por ciclo y 1 minuto a 72 °C, seguido de 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 50 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizo en gel de agarosa, se purifico (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clono con extremos romos en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuencio. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la SEC ID N°: 488 tal como se proporciona en la Tabla 8-PC. El vector recombinante que porta esta secuencia se denomino pGCDJ001.

G. Expresion y produccion de una diana de ARN bicatenario en dos cepas de Escherichia coli AB301- 105(DE3)

Se siguieron los procedimientos descritos a continuacion para expresar niveles adecuados de ARN bicatenario activo en insectos de diana de insectos en bacterias. En este experimento, se usa una cepa deficiente en RNasaIII, AB301-105(DE3).

Transformacion de AB301-105(DE3)

Se anadieron trescientos ng del plasmido y se mezclaron suavemente en una alfcuota de 50 pl de la cepa de E. coli

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qmmicamente competente enfriada en hielo AB301-105(DE3). Las celulas se incubaron sobre hielo durante 20 minutes antes de someterlas a un tratamiento de choque termico de 37 °C durante 5 minutes, despues de los cuales se pusieron de nuevo sobre hielo durante 5 minutes adicionales. Se anadieron cuatrocientos cincuenta jl de medio SOC a temperature ambiente a las celulas y la suspension se incubo en un agitador (250 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Se transfirieron cien jl de la suspension de celulas bacterianas a un matraz conico de 500 ml que conterna 150 ml de caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) lfquido suplementado con 100 jg/ml de antibiotico de carbenicilina. El cultivo se incubo en un agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37 °C durante toda la noche (16 a 18 horas).

Induccion qumica de la expresion de ARN bicatenario en AB301-105(DE3)

La expresion de ARN bicatenario del vector recombinante pGCDJ001, en la cepa bacteriana AB301-105(DE3) fue posible ya que estaban presentes todos los componentes geneticos para expresion controlada. En presencia del inductor qmmico isopropiltiogalactosido, o IPTG, la polimerasa T7 dirigira la transcripcion de la secuencia diana en direcciones tanto antisentido como sentido ya que estas estan flanqueadas por promotores de T7 orientados de manera opuesta.

La densidad optica a 600 nm del cultivo bacteriano de una noche se midio usando un espectrofotometro adecuado y se ajusto a un valor de 1 mediante la adicion de caldo LB reciente. Se transfirieron cincuenta ml de este cultivo a un tubo Falcon™ de 50 ml y el cultivo se centrifugo despues a 3000 g a 15 °C durante 10 minutos. Se retiro el sobrenadante y el sedimento bacteriano se resuspendio en 50 ml de medio completo S reciente (medio SNC mas 5 jg/ml de colesterol) suplementado con 100 jg/ml de carbenicilina e IPTG 1 mM. Las bacterias se indujeron durante 2 a 4 horas a temperatura ambiente.

Tratamiento con calor de bacterias

Las bacterias se destruyeron mediante tratamiento con calor para minimizar el riesgo de contaminacion de la dieta artificial en las placas de ensayo. Sin embargo, el tratamiento con calor de las bacterias que expresaban ARN bicatenario no es un requisito previo para inducir la toxicidad hacia los insectos debido a la interferencia de ARN. El cultivo bacteriano inducido se centrifugo a 3000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos, se desecho el sobrenadante y el sedimento se sometio a 80 °C durante 20 minutos en un bano con agua. Despues del tratamiento con calor, el sedimento bacteriano se resuspendio en un volumen total de 50 ml de solucion de Triton™ X-100 al 0,05 %. El tubo se almaceno a 4 °C hasta su uso posterior.

H. Pruebas de laboratorio para ensayar Escherichia coli que expresan dianas de ARNbc contra Phaedon cochleariae

Bioensayos de disco foliar

Se empleo el metodo de bioensayo de disco foliar para ensayar ARN bicatenario de PC010 diana producido en Escherichia coli (a partir de plasmido pGCDJ001) contra larvas del escarabajo de la hoja de mostaza. Se prepararon discos foliares a partir de follaje de colza oleaginosa, tal como se describe en el Ejemplo 4. En cada disco se pipetearon veinte jl de una suspension bacteriana, con una medicion de densidad optica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. El disco foliar se coloco en un pocillo de una placa multipocillo de 24 pocillos que conterna 1 ml de agar gelificado. En cada disco foliar se anadieron dos larvas neonatas. Para cada tratamiento, se prepararon 3 replicados de 16 larvas neonatas por cada replicado. Las placas se mantuvieron en la camara de cna de insectos a una temperatura de 25 ± 2 °C y una humedad relativa del 60 ± 5 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. En el dfa 3 (es decir, 3 dfas despues del comienzo del bioensayo), las larvas se transfirieron a una nueva placa que conterna discos foliares nuevos tratados (misma dosificacion). El material foliar se renovo cada dos dfas a partir del dfa 5 en adelante. El bioensayo se puntuo en mortalidad y peso promedio. Los controles negativos fueron discos foliares tratados con bacterias que portaban el plasmido pGN29 (vector vacte) y solamente hoja.

Se ha mostrado un claro aumento de la mortalidad de larvas de P. cochleariae con el tiempo despues de alimentar a los insectos con hojas de colza oleaginosa tratadas con una suspension de cepa de E. coli deficiente en RNasaIII ABC301-105(DE3) que contienen el plasmido pGCDJ001, mientras que se observo muy poca o ninguna mortalidad de insectos en el caso de bacterias con el plasmido pGN29 o control solamente con hojas (Figura 3-PC).

Bioensayos basados en plantas

Se rocfan plantas completas con suspensiones de bacterias inducidas qmmicamente que expresan ARNbc antes de alimentar a los EHM con las plantas. Las plantas se cultivan en una camara de crecimiento vegetal. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plastico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente colocado en el suelo en una maceta y se recorto la base y se cubrio con una fina malla de nailon para permitir el aireamiento, reducir la condensacion en su interior e impedir que se escapen los insectos. Se colocan EHM en cada planta tratada en la jaula. Las plantas se tratan con una suspension de E. coli AB301-105(DE3) que portan el plasmido pGCDJ001 o el plasmido pGN29. Se aplican diferentes cantidades de bacterias a las plantas: por ejemplo 66, 22 y 7 unidades, donde una unidad se define como 109 celulas bacterianas en 1 ml de una suspension bacteriana a un valor de densidad optica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se rocfa un volumen total de entre 1 y 10 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usa una planta por tratamiento en este

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ensayo. Se cuenta el numero de supervivientes y se registra el peso de cada superviviente.

El rociado de las plantas con una suspension de la cepa bacteriana de E. coli AB301-105(DE3) que expresa ARNbc diana de pGCDjOoi da lugar a un drastico aumento en la mortalidad de los insectos en comparacion con el control de pGN29. Estos experimentos demuestran que el ARN bicatenario correspondiente a una secuencia diana de gen de insecto producida en sistemas de expresion bacteriana de tipo silvestre o deficientes en RNasaIII es toxico para el insecto en cuanto a aumentos sustanciales en la mortalidad de los insectos y en el retraso en el crecimiento/desarrollo para los supervivientes larvarios. Tambien esta claro a partir de estos experimentos que se proporciona un ejemplo para proteger eficazmente a plantas/cultivos del dano por insectos mediante el uso de una pulverizacion de una formulacion que consiste en bacterias que expresan ARN bicatenario correspondiente a un gen diana de insecto.

Ejemplo 5: Epilachna varivetis (Escarabajo del frijol mexicano)

A. Clonacion de secuencias genicas parciales de Epilachna varivetis

Se aislo ARN intacto de alta calidad de 4 fases larvarias diferentes de Epilachna varivetis (escarabajo del frijol mexicano; Fuente: Thomas Dorsey, Supervising Entomologist, New Jersey Department of Agriculture, Division of Plant. Industry, Bureau of Biological Pest Control, Phillip Alampi Beneficial Insect Laboratory, PO Box 330, Trenton, Nueva Jersey 08625-0330, EE.UU.) usando reactivo TRIzoI® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genomico presente en la preparacion de ARN se retiro mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante (N° de Cat. 1700, Promega). El ADNc se genero usando un kit comercialmente disponible (Transcriptasa inversa Superscript® Ill) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para aislar secuencias de ADNc que comprendfan una porcion de los genes EV005, EV009, EV010, EV015 y EV016, se realizo una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificacion de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-EV, que muestra genes diana de Epilachna varivetis que incluyen las secuencias cebadoras y las secuencias de ADNc obtenidas. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: para EV005 y EV009, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 50°C y 1 minuto 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C; para EV014, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 53 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 7 minutos a 72 °C; para EV010 y EV016, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 40 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR4/TOPO® y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-EV y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoacidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-EV, en la que el inicio de la fase de lectura se indica entre parentesis.

B. Produccion de ARNbc de los genes de Epilachna varivetis

Para cada uno de los genes diana, se genero el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso espedficos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-EV.

Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes: 1 minuto a 95 °C, seguido de 20 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 50 °C y 1 minuto a 72 °C seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se genero usando cebadores directos e inversos de T7 espedficos en una reaccion PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-EV. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificacion PCR (kit de purificacion PCR Qiaquick®) y precipitacion de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8- EV.

C. Recombinacion de los genes de Epilachna varivetis en el vector vegetal pK7GWIWG2D(M)

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nucleotfdicas diana de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientacion antisentido y sentido, separados por el intron - CmR - intron, en el que CmR es el marcador de resistencia a cloranfenicol, para formar una construccion de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron usando la reaccion de recombinacion LR entre un clon de entrada que contema attL (vease el Ejemplo 1) y un vector de destino que contema attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIWG2D(II) se obtuvo a traves de VIB/Plant Systems Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reaccion de recombinacion de LR se llevo a cabo usando la mezcla enzimatica LR Clonase™ II siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos experimentos de clonacion dieron como resultado una construccion en horquilla para cada uno de los genes diana, que teman la orientacion promotor - sentido - intron - CmR - intron - antisentido y en el que el promotor es el promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S es adecuado para la transformacion en A. tumefaciens.

Se realizaron digestiones con enzimas de restriccion en los plasmidos de pCR8/GW/TOPO® que conteman las diferentes dianas (vease el Ejemplo B). La banda que contema el gen de interes flanqueado por los sitios de attL se purifico usando el kit de extraccion en gel Qiaquick®. Se anadio una cantidad de 150 ng de fragmento purificado y 150 ng de pK7GWIWG2D(II) junto con la enzima LR clonasa II y se incubo durante al menos 1h a 25 °C. Despues del tratamiento con la solucion de proteinasa K (10 min a 37°C), la mezcla de recombinacion completa se transformo en las celulas qmmicamente competentes Top 10. Se seleccionaron los clones positivos mediante analisis por digestion de restriccion.

D. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc usando discos foliares de judia con respecto a actividad contra larvas de Epilachna varivetis

El ejemplo proporcionado a continuacion es una ejemplificacion del hallazgo de que las larvas del escarabajo del frijol mexicano (EFM) son susceptibles a ARNbc ingerido por via oral correspondiente a los propios genes diana.

Para ensayar las diferentes muestras de ARN bicatenario contra larvas de EFM, se empleo un ensayo de disco foliar usando material foliar de judfa verde (Phaseolus vulgaris variedad Montano; Fuente: Aveve NV, Belgica) como fuente de alimentacion. La misma variedad de judfas se uso para mantener cultivos de insectos en la camara de insectos 25 ± 2 °C y una humedad relativa del 60 ± 5 % con un fotoperiodo de 16 h de luz/8 h de oscuridad. Se cortaron discos de aproximadamente 1,1 cm de diametro (o 0,95 cm2) de hojas de plantas de judfa de 1 a 2 semanas de edad usando un taladro de corteza de tamano adecuado. Se diluyeron muestras de ARN bicatenario a

1 |jg/|jl en agua Milli-Q que contema Triton™ X-100 al 0,05 %. Se prepararon discos foliares tratados aplicando 25 jl de la solucion diluida de ARNbc diana de EV005, EV010, EV015, EV016 y ARNbc de gfp de control o Triton™ X-100 0,05 % sobre la superficie foliar adaxial. Se dejaron secar los discos foliares y se colocaron individualmente en cada uno de los 24 pocillos de una multiplaca de 24 pocillos que conteman 1 ml de agar al 2 % gelificado que ayuda a evitar que el disco foliar se seque. Se coloco una unica larva de EFM neonata en cada pocillo de una placa, que despues se cubrio con una tapa de plastico multipocillo. La placa se dividio en 3 replicados de 8 insectos por replicado (fila). La placa que contema los insectos y los discos foliares se mantuvo en una camara de insectos a 25 ±

2 °C y una humedad relativa del 60 ± 5 % con un fotoperiodo de 16h de luz/8h de oscuridad. Los insectos se alimentaron de los discos foliares durante 2 dfas, despues de lo cual los insectos se transfirieron a una nueva placa que contema discos foliares recien tratados. A continuacion, 4 dfas despues del inicio del bioensayo, los insectos se transfirieron a una placa de Petri que contema hojas de judfa frescas no tratadas cada dfa hasta el dfa 10. La mortalidad de los insectos se registro el dfa 2 y despues cada dos dfas.

La alimentacion con hojas de judfa verde que conteman ARNbc diana desnudos intactos aplicados en superficie a larvas de E. varivestis dio como resultado aumentos significativos de las mortalidades larvarias, tal como se indica en la Figura 1. Los ARN bicatenarios ensayados de las dianas EV010, EV015 y EV016 condujeron a un 100 % de mortalidad despues de 8 dfas, mientras que el ARNbc de EV005 diana tardo 10 dfas en matar a todas las larvas. La mayona de los insectos alimentados con discos foliares tratados que conteman ARNbc de gfp de control o solamente el tensioactivo Triton™ X-100 se mantuvieron durante todo el bioensayo (Figura 1-EV).

E. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc usando discos foliares de judia con respecto a actividad contra adultos de Epilachna varivestis

El ejemplo proporcionado a continuacion es una ejemplificacion del hallazgo de que los adultos del escarabajo del frijol mexicano son susceptibles a ARNbc ingerido por via oral correspondiente a los propios genes diana.

En una preparacion de bioensayo similar a la de las larvas del escarabajo del frijol mexicano, se ensayaron EFM adultos frente a ARN bicatenario aplicado por via topica a discos foliares de judfa. El ARNbc de ensayo de cada diana EV010, EV015 y EV016 se diluyo en Triton™ X-100 al 0,05 % hasta una concentracion final de 0,1 jg/jl. Se trataron discos foliares de judfa mediante aplicacion topica de 30 jl de la solucion de ensayo a cada disco. Se dejo que los discos se secaran completamente antes de colocar cada uno en un corte de agar al 2 % gelificado en cada pocillo de una placa multipocillo de 24 pocillos. Se recogieron adultos de tres dfas de edad de las jaulas de cultivo y no se les alimento durante 7-8 horas antes de colocar un adulto en cada pocillo de la placa de bioensayo (por lo tanto, 24 adultos por tratamiento). Las placas se mantuvieron en la camara de cna de insectos (en las mismas condiciones que para las larvas de EFM durante 24 horas) despues de lo cual los adultos se transfirieron a una

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nueva placa que contema discos foliares tratados con ARNbc nuevos. Despues de 24 horas adicionales, los adultos de cada tratamiento se recogieron y se colocaron en una caja de plastico con dimensiones de 30 cm x 15 cm x 10 cm que conteman dos plantas de judfa en macetas y no tratadas de 3 semanas de edad. Se evaluo la mortalidad de los insectos desde el dfa 4 hasta el d^a 11.

Los tres ARNbc diana (EV010, EV015 y EV016) ingeridos por adultos Epilachna varivestis dieron como resultado aumentos significativos de la mortalidad del dfa 4 (4 despues del comienzo del bioensayo), como se muestra en la Figura 2(a)-EV. A partir del d^a 5, se observaron cambios drasticos en los patrones de alimentacion entre insectos a los que se alimento inicialmente con discos foliares de judfa tratados con ARNbc diana y los que se alimentaron con discos que conteman ARNbc de gfp de control o tensioactivo Triton™ X-100. Fueron claramente visibles reducciones en el dano foliar por adultos EFM en plantas de judfa no tratadas para las tres dianas en comparacion con controles de ARNbc de gfp y de solamente tensioactivo, aunque a distintos niveles; los insectos alimentados con diana 15 provocaron el menor dano al follaje de la judfa (Figura 2(b)-EV).

F. Clonacion de un fragmento genico de EFM en un vector adecuado para la produccion bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos

Las secuencias de los cebadores espedficos usados para la amplificacion de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-EV. El molde usado es el vector pCR8/GW/TOPO® que contiene cualquiera de las secuencias diana. Los cebadores se usan en una reaccion PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizo en gel de agarosa, se purifico (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clono con extremos romos en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuencio. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la secuencia respectiva tal como se proporciona en la Tabla 8-EV.

G. Expresion y produccion de una diana de ARN bicatenario en dos cepas de Escherichia coli: (1) AB301- 105(DE3), y, (2) BL21(DE3)

Se siguieron los procedimientos descritos a continuacion para expresar niveles adecuados de ARN bicatenario activo en insectos de diana de insectos en bacterias. Se uso una cepa deficiente en RNasaIII, AB301-105(DE3), en comparacion con bacterias que conteman RNasaIII de tipo silvestre, BL21(DE3).

Transformacion de AB301-105(DE3) y BL21(DE3)

La expresion de ARN bicatenario a partir del vector recombinante en la cepa bacteriana AB301-105(DE3) o BL21(DE3) fue posible ya que estaban presentes todos los componentes geneticos para expresion controlada. En presencia del inductor qmmico isopropiltiogalactosido, o IPTG, la polimerasa T7 dirigira la transcripcion de la secuencia diana en direcciones tanto antisentido como sentido ya que estas estan flanqueadas por promotores de T7 orientados de manera opuesta.

La densidad optica a 600 nm del cultivo bacteriano de una noche se midio usando un espectrofotometro adecuado y se ajusto a un valor de 1 mediante la adicion de caldo LB reciente. Se transfirieron cincuenta ml de este cultivo a un tubo Falcon™ de 50 ml y el cultivo se centrifugo despues a 3000 g a 15 °C durante 10 minutos. Se retiro el sobrenadante y el sedimento bacteriano se resuspendio en 50 ml de medio completo S reciente (medio SNC mas 5 pg/ml de colesterol) suplementado con 100 pg/ml de carbenicilina e IPTG 1 mM. Las bacterias se indujeron durante 2 a 4 horas a temperatura ambiente.

Tratamiento con calor de bacterias

Las bacterias se destruyeron mediante tratamiento con calor para minimizar el riesgo de contaminacion de la dieta artificial en las placas de ensayo. Sin embargo, el tratamiento con calor de las bacterias que expresaban ARN

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bicatenario no es un requisito previo para inducir la toxicidad hacia los insectos debido a la interferencia de ARN. El cultivo bacteriano inducido se centrifugo a 3000 g a temperatura ambiente durante 10 minutes, se desecho el sobrenadante y el sedimento se sometio a 80 °C durante 20 minutos en un bano con agua. Despues del tratamiento con calor, el sedimento bacteriano se resuspendio en 1,5 ml de agua MilliQ y la suspension se transfirio a un tubo de microcentnfuga. Se prepararon y usaron diversos tubos en los bioensayos para cada renovacion. Los tubos se conservaron a -20 °C hasta su uso posterior.

H. Pruebas de laboratorio para ensayar Escherichia coli que expresan dianas de ARNbc contra Epilachna varivetis

Bioensayos basados en plantas

Se rocfan plantas completas con suspensiones de bacterias inducidas qmmicamente que expresan ARNbc antes de alimentar a los EFM con las plantas. Se cultivan en una camara de cultivo de plantas. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plastico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente colocado en el suelo en una maceta y se recorto la base y se cubrio con una fina malla de nailon para permitir el aireamiento, reducir la condensacion en su interior e impedir que se escapen los insectos. Se colocan EFM en cada planta tratada en la jaula. Las plantas se tratan con una suspension de E. coli AB301-105(DE3) que portan el vector recombinante o el plasmido pGN29. Se aplican diferentes cantidades de bacterias a las plantas: por ejemplo 66, 22 y 7 unidades, donde una unidad se define como 109 celulas bacterianas en 1 ml de una suspension bacteriana a un valor de densidad optica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se rocfa un volumen total de entre 1 y 10 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usa una planta por tratamiento en este ensayo. Se cuenta el numero de supervivientes y se registra el peso de cada superviviente.

El rociado de las plantas con una suspension de la cepa bacteriana de E. coli AB301-105(DE3) que expresa ARNbc diana de vector recombinante da lugar a un drastico aumento en la mortalidad de los insectos en comparacion con el control de pGN29. Estos experimentos demuestran que el ARN bicatenario correspondiente a una secuencia diana de gen de insecto producida en sistemas de expresion bacteriana de tipo silvestre o deficientes en RNasaIII es toxico para el insecto en cuanto a aumentos sustanciales en la mortalidad de los insectos y en el retraso en el crecimiento/desarrollo para los supervivientes larvarios. Tambien esta claro a partir de estos experimentos que se proporciona un ejemplo para proteger eficazmente a plantas/cultivos del dano por insectos mediante el uso de una pulverizacion de una formulacion que consiste en bacterias que expresan ARN bicatenario correspondiente a un gen diana de insecto.

Ejemplo 6: Anthonomus grandis (grillo de la capsula del algodonero)

A. Clonacion de secuencias parciales de Anthonomus grandis

Se aislo ARN intacto, de alta calidad de las 3 fases de Anthonomus grandis (grillo de la capsula del algodonero; Fuente: Dr. Gary Benzon, Benzon Research Inc., 7 Kuhn Drive, Carlisle, Pennsylvania 17013, EE.UU.) usando reactivo TRIzol® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genomico presente en la preparacion de ARN se retiro mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante. Se genero ADNc usando un kit comercialmente disponible (transcriptasa inversa SuperScript® Ill) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para aislar secuencias de ADNc que comprendfan una porcion de los genes AG001, AG005, AG010, AG014 y AG016, se realizo una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificacion de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-AG. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: para AG001, AG005 y AG016, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 50°C y 1 minuto y 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C; para AG010, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 2 minutos y 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C; para AG014, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 7 minutos a 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR8/GW/TOPO® y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-AG y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoacidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-AG,

B. Produccion de ARNbc de los genes de Anthonomus grandis (grillo de la capsula del algodonero)

Para cada uno de los genes diana, se genero el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso

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espedficos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-AG. Se realizo una PCR touchdown de la siguiente manera: 1 minuto a 95 °C, seguido de 20 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C con reduccion de la temperature de 0,5 °C por ciclo y 1 minuto a 72 °C, seguido de 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 50 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se genero usando cebadores directos e inversos de T7 espedficos en una reaccion PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-AG. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificacion PCR (kit de purificacion PCR Qiaquick®) y precipitacion de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-AG.

C. Recombinacion de los genes de Anthonomus grandis en el vector vegetal pK7GWIWG2D(II)

Dado que el mecanismo de interferencia de ARN actua a traves de fragmentos de ARNbc, las secuencias nucleotfdicas diana de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientacion antisentido y sentido, separados por el intron - CmR - intron, en el que CmR es el marcador de resistencia a cloranfenicol, para formar una construccion de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron usando la reaccion de recombinacion LR entre un clon de entrada que conterna attL (vease el Ejemplo 1) y un vector de destino que conterna attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIWG2D(II) se obtuvo a traves de VIB/Plant Systems Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reaccion de recombinacion de LR se llevo a cabo usando la mezcla enzimatica LR Clonase™ II siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos experimentos de clonacion dieron como resultado una construccion en horquilla para cada uno de los genes diana, que ternan la orientacion promotor - sentido - intron - CmR - intron - antisentido y en la que el promotor es el promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S es adecuado para la transformacion en A. tumefaciens.

Se realizaron digestiones con enzimas de restriccion en los plasmidos de pCR8/GW/TOPO® que conternan las diferentes dianas (vease el Ejemplo 2). La banda que conterna el gen de interes flanqueado por los sitios de attL se purifico usando el kit de extraccion en gel Qiaquick®. Se anadio una cantidad de 150 ng de fragmento purificado y 150 ng de pK7GWIWG2D(II) junto con la enzima LR clonasa II y se incubo durante al menos 1h a 25 °C. Despues del tratamiento con la solucion de proteinasa K (10 min a 37°C), la mezcla de recombinacion completa se transformo en las celulas qmmicamente competentes Top 10. Se seleccionaron los clones positivos mediante analisis por digestion de restriccion.

D. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc, usando dieta artificial con respecto a actividad contra las larvas del grillo de la capsula del algodonero, Anthonomus grandis. Se mantiene un cultivo de grillos de la capsula del algodonero, Anthonomus grandis, con dieta artificial. Para los bioensayos, se recogen huevos de grillo de la capsula del algodonero y se preparan tal como se ha descrito anteriormente y se colocan en una placa de Petri sobre papel de filtro humedo. Los huevos se incuban en oscuridad a 25 ± 2 °C y una humedad relativa del 65 ± 5 % durante tres dfas para obtener larvas de primera fase. Estas larvas se usan en superposicion de superficie de la dieta y bioensayos de incorporacion para ensayar ARNbc correspondiente a genes diana de GCA AG001, AG005, AG010, AG014 y AG016.

Para el bioensayo de superposicion de superficie de la dieta, se aplican por via topica 25 pl muestras de ARN bicatenario a una concentracion de 1 pg/pl a 500 pl dieta establecida en cada pocillo. Para el bioensayo de incorporacion en la dieta, se mezclan 50 pl de ARNbc (1 pg/pl) con 500 pl dieta establecida (a una temperatura aproximada de 45 °C). En ambos bioensayos, las placas se dejan secar en una cabina de flujo laminar horizontal. Se transfieren larvas de grillos de la capsula del algodonero L1 a la dieta con un insecto por pocillo. Se ensayan cuarenta y ocho insectos en total para cada uno de los tratamientos.

Se realizan evaluaciones a intervalos diarios hasta el dfa 7 (7 dfas despues del inicio del bioensayo). En cada evaluacion los insectos se evaluan como vivos o muertos y se examinan en busca de anomalfas. Durante la prueba las condiciones de ensayo son 25 ± 2 °C y una humedad relativa del 65 ± 5 %, con un fotoperiodo de 14:10 horas de luz:oscuridad.

E. Clonacion de un fragmento genico de GCA en un vector adecuado para la produccion bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos

A continuacion hay un ejemplo de clonacion de un fragmento de ADN correspondiente a una diana genica de GCA en un vector para la expresion de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano, aunque puede usarse cualquier vector que comprende un promotor de T7 o cualquier otro promotor para la transcripcion eficaz en bacterias (referencia al documento WO0001846).

Las secuencias de los cebadores espedficos usados para la amplificacion de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-AG. El molde usado es el vector pCR8/GW/TOPO® que contiene cualquiera de las secuencias diana. Los

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F. Expresion y produccion de una diana de ARN bicatenario en dos cepas de Escherichia coli: (1) AB301- 105(DE3), y, (2) BL21(DE3)

Transformacion de AB301-105(DE3) y BL21(DE3)

Tratamiento con calor de bacterias

G. Pruebas de laboratorio para ensayar Escherichia coli que expresan dianas de ARNbc contra Anthonomus grandis

Bioensayos basados en plantas

Se rocfan plantas completas con suspensiones de bacterias inducidas qmmicamente que expresan ARNbc antes de alimentar a los GCA con las plantas. Se cultivan en una camara de cultivo de plantas. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plastico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente colocado en el suelo en una maceta y se recorto la base y se cubrio con una fina malla de nailon para permitir el aireamiento, reducir la condensacion en su interior e impedir que se escapen los insectos. Se colocan GCA en cada planta tratada en la jaula. Las plantas se tratan con una suspension de E. coli AB301-105(DE3) que portan el vector recombinante o el plasmido pGN29. Se aplican diferentes cantidades de bacterias a las plantas: por ejemplo 66, 22 y 7 unidades, donde una unidad se define como 109 celulas bacterianas en 1 ml de una suspension bacteriana a un valor de densidad optica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se roda un volumen total de entre 1 y 10 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usa una planta por tratamiento en este ensayo. Se cuenta el numero de supervivientes y se registra el peso de cada superviviente.

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El rociado de las plantas con una suspension de la cepa bacteriana de E. coli AB301-105(DE3) que expresa ARNbc diana de vector recombinante da lugar a un drastico aumento en la mortalidad de los insectos en comparacion con el control de pGN29. Estos experimented demuestran que el ARN bicatenario correspondiente a una secuencia diana de gen de insecto producida en sistemas de expresion bacteriana de tipo silvestre o deficientes en RNasaIII es toxico para el insecto en cuanto a aumentos sustanciales en la mortalidad de los insectos y en el retraso en el crecimiento/desarrollo para los supervivientes larvarios. Tambien esta claro a partir de estos experimented que se proporciona un ejemplo para proteger eficazmente a plantas/cultivos del dano por insectos mediante el uso de una pulverizacion de una formulacion que consiste en bacterias que expresan ARN bicatenario correspondiente a un gen diana de insecto.

Ejemplo 7: Tribolium castaneum (escarabajo rojo de la harina)

A. Clonacion de secuencias parciales de Tribolium castaneum

Se aislo ARN intacto de alta calidad de todos los estadios diferentes de Tribolium castaneum (escarabajo rojo de la harina; Fuente: Dr. Lara Senior, Insect Investigations Ltd., Capital Business Park, Wentloog, Cardiff, CF3 2PX, Gales, Reino Unido) usando reactivo TRIzol® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genomico presente en la preparacion de ARN se retiro mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante. Se genero ADNc usando un kit comercialmente disponible (transcriptasa inversa Superscript® Ill) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para aislar secuencias de ADNc que comprendfan una porcion de los genes TC001, TC002, TC010, TC014 y TC015, se realizo una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificacion de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-TC. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 50°C y 1 minuto y 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C (TC001, TC014, TC015); 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 2 minutos y 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C (TC010); 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 53 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 7 minutos a 72 °C (TC002). Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR8/GW/TOPO® y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-TC y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoacidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-TC.

B. Produccion de ARNbc de los genes de Tribolium castaneum

Para cada uno de los genes diana, se genero el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso espedficos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-TC. Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes: 1 minuto a 95 °C, seguido de 20 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C (-0,5 °C/ciclo) y 1 minuto a 72 °C, seguido de 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 50 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se genero usando cebadores directos e inversos de T7 espedficos en una reaccion PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-TC. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificacion PCR (kit de purificacion PCR Qiaquick®) y precipitacion de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-TC.

C. Recombinacion de los genes de Tribolium castaneum en el vector vegetal pK7GWIWG2D(M)

Dado que el mecanismo de interferencia de ARN actua a traves de fragmentos de ARNbc, las secuencias nucleotfdicas diana de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientacion antisentido y sentido, separados por el intron - CmR - intron, en el que CmR es el marcador de resistencia a cloranfenicol, para formar una construccion de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron usando la reaccion de recombinacion LR entre un clon de entrada que contema attL (vease el Ejemplo 1) y un vector de destino que contema attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIWG2D(II) se obtuvo a traves de VIB/Plant Systems Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reaccion de recombinacion de LR se llevo a cabo usando la mezcla enzimatica LR Clonase™ II siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos

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experimented de clonacion dieron como resultado una construccion en horquilla para cada uno de los genes diana, que teman la orientacion promotor - sentido - intron - CmR - intron - antisentido y en el que el promotor es el promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S es adecuado para la transformacion en A. tumefaciens.

Se realizaron digestiones con enzimas de restriccion en los plasmidos de pCR8/GW/TOPO® que conteman las diferentes dianas (vease el Ejemplo 2). La banda que contema el gen de interes flanqueado por los sitios de attL se purifico usando el kit de extraccion en gel Qiaquick®. Se anadio una cantidad de 150 ng de fragmento purificado y 150 ng de pK7GWIWG2D(II) junto con la enzima LR clonasa II y se incubo durante al menos 1h a 25 °C. Despues del tratamiento con la solucion de proteinasa K (10 min a 37°C), la mezcla de recombinacion completa se transformo en las celulas qmmicamente competentes Top 10. Se seleccionaron los clones positivos mediante analisis por digestion de restriccion.

D. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc, usando dieta artificial para actividad contra larvas de Tribolium castaneum

El ejemplo proporcionado a continuacion es una ejemplificacion del hallazgo de que las larvas del escarabajo rojo de la harina (ERH) son susceptibles a ARNbc ingerido por via oral correspondiente a los propios genes diana.

Se mantuvieron escarabajos rojos de la harina, Tribolium castaneum, en Insect Investigations Ltd. (origen: Imperial College of Science, Technology and Medicine, Silwood Park, Berkshire, Reino Unido). Los insectos se cultivaron de acuerdo con SOP/251/01 de la compafna. En resumen, los escarabajos se alojaron en jarras o tanques de plastico. Estos tienen una parte superior abierta para permitir la ventilacion. Se ajusto una pieza de malla sobre la parte superior y se fija con una banda elastica para evitar la fuga. Se coloco medio de cna de larvas (harina) en el recipiente en el que pueden criarse los escarabajos. Las colonias de escarabajos producidas almacenadas se mantuvieron en una habitacion a temperatura controlada a 25 ± 3 °C con un ciclo de luz:oscuridad de 16:8 horas.

Se incorporo ARN bicatenario de TC014 diana (con la secuencia correspondiente a SEC ID N°: 799) a una mezcla de harina y leche en polvo (harina integral: leche en polvo a una relacion de 4:1) y se dejo secar durante toda la noche. Cada replicado se preparo por separado: Se anadieron 100 pl de una solucion de ARNbc 10 pg/pl (1 mg de ARNbc) a una mezcla de 0,1 g harina/leche. Se molio la mezcla seca en un polvo fino. Los insectos se mantuvieron dentro de placas de Petri (diametro de 55 mm), revestido con una doble capa de papel de filtro. La dieta tratada se coloco entre las dos capas de papel de filtro. Se colocaron diez larvas de primera fase de ambos sexos en cada placa (replicado). Se realizaron cuatro replicados para cada tratamiento. El control fue agua Milli-Q. Se realizaron evaluaciones (numero de supervivientes) de manera regular. Durante la prueba, las condiciones de ensayo fueron de 25 - 33 °C y una humedad relativa del 20 - 25 %, con un fotoperiodo de 12:12 horas de luz:oscuridad.

La supervivencia de larvas de T. castaneum a lo largo del tiempo con dieta artificial tratada con ARNbc TC014 diana se redujo significativamente en comparacion con el control solamente con dieta, tal como se muestra en la Figura 1.

E. Clonacion de un fragmento genico de ERH en un vector adecuado para la produccion bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos

A continuacion hay un ejemplo de clonacion de un fragmento de ADN correspondiente a una diana genica de ERH en un vector para la expresion de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano, aunque puede usarse cualquier vector que comprende un promotor de T7 o cualquier otro promotor para la transcripcion eficaz en bacterias (referencia al documento WO0001846).

Las secuencias de los cebadores espedficos usados para la amplificacion de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-TC. El molde usado es el vector pCR8/GW/TOPO® que contiene cualquiera de las secuencias diana. Los cebadores se usan en una reaccion PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizo en gel de agarosa, se purifico (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clono con extremos romos en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuencio. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la secuencia respectiva tal como se proporciona en la Tabla 8-TC.

Transformacion de AB301-105(DE3) y BL21(DE3)

Se anadieron trescientos ng del plasmido y se mezclaron suavemente en una alteuota de 50 pl de la cepa de E. coli qmmicamente competente enfriada en hielo AB301-105(DE3) o BL21(DE3). Las celulas se incubaron sobre hielo durante 20 minutos antes de someterlas a un tratamiento de choque termico de 37 °C durante 5 minutos, despues

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de los cuales se pusieron de nuevo sobre hielo durante 5 minutos adicionales. Se anadieron cuatrocientos cincuenta pl de medio SOC a temperatura ambiente a las celulas y la suspension se incubo en un agitador (250 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Se transfirieron cien pl de la suspension de celulas bacterianas a un matraz conico de 500 ml que contema 150 ml de caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) lfquido suplementado con 100 pg/ml de antibiotico de carbenicilina. El cultivo se incubo en un agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37 °C durante toda la noche (16 a 18 horas).

Tratamiento con calor de bacterias

G. Pruebas de laboratorio para ensayar Escherichia coli que expresan dianas de ARNbc contra Tribolium castaneum

Bioensayos basados en plantas

Se rocfan plantas completas con suspensiones de bacterias inducidas qmmicamente que expresan ARNbc antes de alimentar a los ERH con las plantas. Se cultivan en una camara de cultivo de plantas. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plastico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente colocado en el suelo en una maceta y se recorto la base y se cubrio con una fina malla de nailon para permitir el aireamiento, reducir la condensacion en su interior e impedir que se escapen los insectos. Se colocan ERH en cada planta tratada en la jaula. Las plantas se tratan con una suspension de E. coli AB301-105(DE3) que portan el vector recombinante o el plasmido pGN29. Se aplican diferentes cantidades de bacterias a las plantas: por ejemplo 66, 22 y 7 unidades, donde una unidad se define como 109 celulas bacterianas en 1 ml de una suspension bacteriana a un valor de densidad optica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se rocfa un volumen total de entre 1 y 10 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usa una planta por tratamiento en este ensayo. Se cuenta el numero de supervivientes y se registra el peso de cada superviviente.

Ejemplo 8: Myzus persicae (pulgon verde del melocoton)

A. Clonacion de secuencias parciales de Myzus persicae

Se aislo ARN intacto, de alta calidad de ninfas de Myzus persicae (pulgon verde del melocoton; Fuente: Dr. Rachel Down, Insect & Pathogen Interactions, Central Science Laboratory, Sand Hutton, York, YO41 1LZ, Reino Unido) usando reactivo TRIzoi® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genomico presente en la preparacion de ARN se retiro mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante. Se genero ADNc usando

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un kit comercialmente disponible (transcriptasa inversa Superscript® III) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para aislar secuencias de ADNc que comprendfan una porcion de los genes MP001, MP002, MP010, MP016 y MP027, se realizo una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificacion de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-MP. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: para MP001, MP002 y MP016, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 50°C y 1 minuto 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C; para MP027, se uso un programa de touchdown: 10 minutos a 95 °C, seguido de 10 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 40 segundos a 60 °C con reduccion de la temperatura de 1 °C por ciclo y 1 minuto 10 segundos a 72 °C, seguido de 30 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 40 segundos a 50 °C y 1 minuto 10 segundos a 72 °C, seguido de 7 minutos a 72 °C; para MP010, 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 3 minutos a 72 °C, seguido de 7 minutos a 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR8/GW/TOPO® y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-MP y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoacidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-MP,

B. Produccion de ARNbc de genes de Myzus persicae

Para cada uno de los genes diana, se genero el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso espedficos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-MP. Se realizo una PCR touchdown de la siguiente manera: 1 minuto a 95 °C, seguido de 20 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C (para MP001, MP002, MP016, MP027 y gfp) o 30 segundos a 50 °C (para MP010) con una reduccion de la temperatura de 0,5 °C por ciclo y 1 minuto a 72 °C, seguido de 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 45 °C y 1 minuto a 72 °C seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se genero usando cebadores directos e inversos de T7 espedficos en una reaccion PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8- MP. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificacion PCR (kit de purificacion PCR Qiaquick®) y precipitacion de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-MP.

C. Recombinacion de los genes de Myzus persicae en el vector vegetal pK7GWIWG2D(II)

Dado que el mecanismo de interferencia de ARN actua a traves de fragmentos de ARNbc, las secuencias nucleotfdicas diana de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientacion antisentido y sentido, separados por el intron - CmR - intron, en el que CmR es el marcador de resistencia a cloranfenicol, para formar una construccion de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron usando la reaccion de recombinacion LR entre un clon de entrada que contema attL (vease el Ejemplo A) y un vector de destino que contema attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIWG2D(II) se obtuvo a traves de VIB/Plant Systems Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reaccion de recombinacion de LR se llevo a cabo usando la mezcla enzimatica LR Clonase™ II siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos experimentos de clonacion produjeron una construccion en horquilla de cada uno de los genes MP001, MP002, MP010, MP016 y MP026, que tema la orientacion promotor - sentido - intron - CmR - intron - antisentido y en el que el promotor es el promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S es adecuado para la transformacion en A. tumefaciens.

Se realizo una digestion con la enzima de restriccion Alw44I para todas las dianas clonadas en pCR8/GW/TOPO® (vease el Ejemplo B). La banda que contema el gen de interes flanqueado por los sitios de attL se purifico usando el kit de extraccion en gel Qiaquick®. Se anadio una cantidad de 150 ng de fragmento purificado y 150 ng de pK7GWIWG2D(II) junto con la enzima LR clonasa II y se incubo durante al menos 1h a 25 °C. Despues del tratamiento con la solucion de proteinasa K (10 min a 37°C), la mezcla de recombinacion completa se transformo en las celulas qmmicamente competentes Top 10. Se seleccionaron los clones positivos mediante analisis por digestion de restriccion. La secuencia completa de la construccion en horquilla para:

- MP001 (sentido - intron - CmR - intron - antisentido) se representa en la SEC ID N°: 1066;

- MP002 (sentido - intron - CmR - intron - antisentido) se representa en la SEC ID N°: 1067;

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- MP010 (sentido - intron - CmR - intron - antisentido) se representa en la SEC ID N°: 1068;

- MP016 (sentido - intron - CmR - intron - antisentido) se representa en la SEC ID N°: 1069;

- MP027 (sentido - intron - CmR - intron - antisentido) se representa en la SEC ID N°: 1070.

La Tabla 9-MP proporciona secuencias completas para cada construccion en horquilla.

D. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc usando dieta artificial Kquida con respecto a actividad contra Myzus persicae

Se preparo dieta artificial lfquida para el pulgon verde del melocoton, Myzus persicae, basandose en la dieta adecuada para pulgones del guisante (Acyrthosiphon pisum), tal como se describe por Febvay et al. (1988) [Influence of the amino acid balance on the improvement of an artificial diet for a biotype of Acyrthosiphon pisum (Homoptera: Aphididae). Can. J. Zool. 66: 2449-2453], pero con algunas modificaciones. El componente de aminoacidos de la dieta se preparo de la siguiente manera: en mg/100 ml, alanina 178,71, beta-alanina 6,22, arginina 244,9, asparagina 298,55, acido aspartico 88,25, cistema 29,59, acido glutamico 149,36, glutamina 445,61, glicina 166,56, histidina 136,02, isoleucina 164,75, leucina 231,56, clorhidrato de lisina 351,09, metionina 72,35, ornitina (HCl) 9,41, fenilalanina 293, prolina 129,33, serina 124,28, treonina 127,16, triptofano 42,75, tirosina 38,63, L-valina 190,85. Los aminoacidos se disolvieron en 30 ml de H2O Milli-Q excepto para tirosina que se disolvio primero en unas pocas gotas de HCl 1 M antes de anadirla a la mezcla de aminoacidos. El componente de mezcla de vitaminas de la dieta se preparo como una reserva concentrada 5x de la siguiente manera: en mg/l, acido aminobenzoico 100, acido ascorbico 1000, biotina 1, pantotenato de calcio 50, cloruro de colina 500, acido folico 10, mioinositol 420, acido nicotmico 100, clorhidrato de piridoxina 25, riboflavina 5, clorhidrato de tiamina 25. La riboflavina se disolvio en 1 ml de H2O a 50 °C y despues se anadio a la reserva de mezcla de vitaminas. La mezcla de vitaminas se separo en alfcuotas en 20 ml por alfcuota y se almaceno a -20 °C. Se anadio una alfcuota de mezcla de vitaminas a la solucion de aminoacidos. Se anadio sacarosa y MgSO4.7H2O con las siguientes cantidades a la mezcla: 20 g y 242 mg, respectivamente. Se preparo una solucion de reserva de metales traza de la siguiente manera: en mg/100 ml, CuSO4.5H2O 4,7, FeCl3.6H2O 44,5, MnCl2.4H2O 6,5, NaCl 25,4, ZnCh 8,3. Se anadieron diez ml de la solucion de metales traza y 250 mg de KH2PO4 a la dieta y se anadio agua Milli-Q a un volumen final de dieta lfquida de 100 ml. El pH de la dieta se ajusto a 7 con una solucion de KOH 1 M. La dieta se esterilizo por filtracion a traves de un disco de filtro de 0,22 pm (Millipore).

Se criaron pulgones verdes del melocoton (Myzus persicae; Fuente: Dr. Rachel Down, Insect & Pathogen Interactions, Central Science Laboratory, Sand Hutton, York, YO41 1LZ, Reino Unido) sobre colza oleaginosa de 4 a 6 semanas de edad (Brassica napus variedad SW Oban; Fuente: Nick Balaam, Sw Seed Ltd., 49 North Road, Abington, Cambridge, CB1 6AS, Reino Unido) en jaulas con marco de aluminio que conteman una malla de 70 pm en una camara de ambiente controlado con las siguientes condiciones: 23 ±2 °C y humedad relativa del 60 ± 5 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas.

Un dfa antes del inicio del bioensayo, se recogieron adultos de las jaulas de cna y se colocaron en hojas de colza nuevas separadas en una placa de Petri y se dejaron durante toda la noche en la camara de insectos. Al dfa siguiente se seleccionaron ninfas de primera fase y se transfirieron a camaras de alimentacion. Una camara de alimentacion comprendfa 10 ninfas de primera fase colocadas en una paca de Petri pequena (con un diametro de 3 cm) cubierta con una unica capa de parafilm M muy estirado sobre el que se anadieron 50 pl de la dieta. La camara se sello con una segunda capa de parafilm y se incubo en las mismas condiciones que los cultivos de adultos. La dieta con ARNbc se renovo cada dos dfas y se evaluo la supervivencia de los insectos en el dfa 8, es decir, al 8° dfa despues del comienzo del bioensayo. Por tratamiento, se prepararon simultaneamente 5 camaras de alimentacion de bioensayos (replicados). Se incorporaron soluciones de ARNbc de ensayo y de control (gfp) en la dieta hasta una concentracion final de 2 pg/pl. Las camaras de alimentacion se mantuvieron a 23 ± 2 °C y una humedad relativa del 60 ± 5 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. Se determino un ensayo de Mann-Whitney mediante GraphPad Prism version 4 para establecer si las medianas difenan significativamente entre la diana 27 (MP027) y ARNbc de gfp.

En el bioensayo, la alimentacion con dieta artificial lfquida suplementada con ARNbc desnudo intacto de la diana 27 (SEC ID N°: 1061) a ninfas de Myzus persicae usando una camara de alimentacion, dio como resultado un aumento significativo de la mortalidad, tal como se muestra en la Figura 1. El porcentaje medio de supervivientes para la diana 27, ARNbc de gfp y tratamiento solamente con dieta fue de 2, 34 y 82, respectivamente. La comparacion de la diana 027 con grupos de ARNbc usando el ensayo de Mann-Whitney dio como resultado un valor de P de una cola de 0,004 que indica que la mediana de la diana 027 es significativamente diferente (P < 0,05) de la mediana mayor esperada de ARNbc de gfp. Los pulgones verdes del melocoton con la dieta lfquida con ARNbc de diana 27 incorporado fueron notablemente mas pequenos que aquellos que se alimentaron con dieta solamente o con ARNbc de gfp de control (datos no presentados).

E. Clonacion de un fragmento genico de PVM en un vector adecuado para la produccion bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos

A continuacion hay un ejemplo de clonacion de un fragmento de ADN correspondiente a una diana genica de PVM en un vector para la expresion de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano, aunque puede usarse cualquier

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vector que comprende un promotor de T7 o cualquier otro promotor para la transcripcion eficaz en bacterias (referencia al documento WO0001846).

Las secuencias de los cebadores espedficos usados para la amplificacion de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-MP. El molde usado es el vector pCR8/GW/TOPO® que contiene cualquiera de las secuencias diana. Los cebadores se usan en una reaccion PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizo en gel de agarosa, se purifico (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clono en su extremo romo en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuencio. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la secuencia respectiva tal como se proporciona en la Tabla 8-MP.

Transformacion de AB301-105(DE3) y BL21(DE3)

Tratamiento con calor de bacterias

G. Pruebas de laboratorio para ensayar Escherichia coli que expresan dianas de ARNbc contra Myzus persicae

Bioensayos basados en plantas

Se rodan plantas completas con suspensiones de bacterias inducidas qmmicamente que expresan ARNbc antes de alimentar a los PVM con las plantas. Se cultivan en una camara de cultivo de plantas. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plastico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente colocado en el suelo en una maceta y se recorto la base y se cubrio con una fina malla de nailon para permitir el aireamiento, reducir la condensacion en su interior e impedir que se escapen los insectos. Se colocan PVM en cada planta tratada en la jaula. Las plantas se tratan con una suspension de E. coli AB301-105(DE3) que portan el vector recombinante o el plasmido pGN29. Se aplican diferentes cantidades de bacterias a las plantas: por ejemplo 66, 22 y

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7 unidades, donde una unidad se define como 109 celulas bacterianas en 1 ml de una suspension bacteriana a un valor de densidad optica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se roda un volumen total de entre 1 y 10 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usa una planta por tratamiento en este ensayo. Se cuenta el numero de supervivientes y se registra el peso de cada superviviente.

Ejemplo 9: Nilaparvata lugens (saltamontes marron)

A. Clonacion de secuencias parciales de Nilaparvata lugens

A partir de ARN total de alta calidad de Nilaparvata lugens (fuente: Dr. J. A. Gatehouse, Dept. Biological Sciences, Durham University, Reino Unido) se genero ADNc usando un kit comercialmente disponible (Transcriptasa inversa Superscript® III) siguiendo el protocolo del fabricante.

Para aislar secuencias de ADNc que comprendfan una porcion de los genes de Nilaparvata lugens NL001, NL002, NL003, NL004, NL005, NL006, NL007, NL008, NL009, NL010, NL011, NL012, NL013, NL014, NL015, NL016, NL018, NL019 NL021, NL022 y NL027, se realizo una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo el protocolo del fabricante.

Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificacion de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-NL. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: para NL001, 5 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL002: 3 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL003: 3 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 61 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL004: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 51 °C y 1 minuto a 72 °C; para NL005: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL006: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 3 minuto 30 segundos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL007: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 15 segundos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL008: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 53 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL009: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL010: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 2 minuto 30 segundos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL011: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C; para NL012: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C; para NL013: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 10 segundos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL014: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 53 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL015: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 40 segundos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL016: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 40 segundos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL018: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 35 segundos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL019: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL021: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 45 segundos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL022: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 45 segundos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; y para NL027: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 1 minuto 45 segundos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR8/GW/TOPO® y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-NL y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoacidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-NL,

B. Clonacion de una secuencia parcial del gen NL023 de Nilaparvata lugens mediante secuencia de EST

A partir de ARN total de alta calidad de Nilaparvata lugens (fuente: Dr. J. A. Gatehouse, Dept. Biological Sciences,

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Durham University, Reino Unido) se genero ADNc usando un kit comercialmente disponible (Transcriptasa inversa Superscript® III) siguiendo el protocolo del fabricante.

Se amplifico una secuencia parcial de ADNc, NL023, a partir de ADNc de Nilaparvata lugens que correspondfa a una secuencia de EST de Nilaparvata lugens en la base de datos publica Genbank con el numero de referencia CAH65679.2. Para aislar secuencias de ADNc que comprendfan una porcion del gen NL023, se realizo una serie de reacciones PCR con cebadores espedficos basados en EST usando PerfectShot™ ExTaq (N° de Cat. RR005A, Takara Bio Inc.) siguiendo el protocolo del fabricante.

Para NL023, se usaron los cebadores espedficos oGBKW002 y oGBKW003 (representados en el presente documento como SEC ID N°: 1157 y SEC ID N°: 1158, respectivamente) en dos reacciones PCR independientes con las siguientes condiciones: 3 minutos a 95 °C, seguido de 30 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 56 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR4-TOPO® y se secuenciaron. La secuencia consenso resultante de la secuencia de ambos productos de PCR se representa en el presente documento por SEC ID N°: 1111 y se cita como secuencia parcial del gen NL023. La secuencia parcial de aminoacidos correspondiente se representa en el presente documento como SEC ID N°: 1112.

C. Produccion de ARNbc de genes de Nilaparvata lugens

Para cada uno de los genes diana, se genero el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso espedficos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 4. Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes: para NL001: 4 minutos a 94 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 60 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL002: 4 minutos a 94 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 60 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL003: 4 minutos a 94 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 94 °C, 30 segundos a 66 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL004: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 54 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL005: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 57 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL006: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 54 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL007: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 51 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL008: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 54 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL009: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 54 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL010: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 54 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL011: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 53 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL012: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 53 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL013: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL014: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 51 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL015: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL016: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 57 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL018: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL019: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 54 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL021: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL022: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 53 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; para NL023: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 52 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C; y para NL027: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 52 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se genero usando cebadores directos e inversos de T7 espedficos en una reaccion PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 4-NL. Los productos pCr resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificacion PCR (kit de purificacion PCR Qiaquick®). Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante, pero con la siguiente modificacion: El sedimento de ARN se lava dos veces en etanol al 70 %. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-NL.

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El ADN molde usado para las reacciones PCR con cebadores de T7 en el control de protema verde fluorescente (gfp) fue el plasmido pPD96.12 (the Fire Lab,
http://genome-www.stanford.edu/group/fire/), que contiene la secuencia codificante de gfp de tipo silvestre intercalada por 3 intrones sinteticos. Se sintetizo ARN bicatenario usando el kit comercialmente disponible Sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express. En primer lugar se generaron por separado dos moldes promotores de ARN polimerasa T7 en direccion 5' individuales en dos reacciones PCR individuales, conteniendo cada una la secuencia diana en una orientacion diferente con respecto al promotor de T7. Para gfp, se genero el molde de T7 sentido usando el cebador directo espedfico de T7 oGAU183 y el cebador inverso espedfico oGAU182 (representados en el presente documento como SEC ID N°: 236 y SEC ID N°: 237, respectivamente) en una reaccion PCR con las siguientes condiciones: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se genero usando el cebador directo espedfico oGAU181 y el cebador inverso espedfico de T7 oGAU184 (representados en el presente documento como SEC ID N°: 238 y SEC ID N°: 239, respectivamente) en una reaccion PCR con las mismas condiciones descritas anteriormente. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron (kit de purificacion PCR QIAquick®). Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron mediante precipitacion con acetato de sodio e isopropanol, siguiendo el protocolo del fabricante, pero con la siguiente modificacion: El sedimento de ARN se lava dos veces en etanol al 70 %. Las hebras sentido del ARNbc resultantes se representa en el presente documento por SEC ID N°: 235.

D. Pruebas de laboratorio para explorar dianas de ARNbc usando dieta artificial Kquida con respecto a actividad contra Nilaparvata lugens

Se preparo dieta artificial lfquida (MMD-1) para el saltamontes marron del arroz, Nilaparvata lugens, tal como se describe por Koyama (1988) [Artificial rearing and nutritional physiology of the planthoppers and leafhoppers (Homoptera: Delphacidae and Deltocephalidae) on a holidic diet. JARQ 22: 20-27], pero con una modificacion en la concentracion final del componente de la dieta, sacarosa: se uso un 14,4 % (peso frente a volumen). Se prepararon componentes de la dieta como concentrados separados: reserva mineral 10x (almacenada a 4 °C), reserva de aminoacidos 2x (almacenada a -20 °C) y reserva de vitaminas x 10 (almacenada a -20 °C). Los componentes de reserva se mezclaron inmediatamente antes del inicio de un bioensayo a concentracion de 4/3x para permitir la dilucion con la solucion de ARNbc de ensayo (concentracion 4x), el pH se ajusto a 6,5 y se esterilizo por filtracion en alfcuotas de aproximadamente 500 pl.

Se criaron saltamontes marrones del arroz (Nilaparvata lugens) en plantas de arroz de dos a tres meses de edad (Oryza sativa cv Taichung Native 1) en una camara de ambiente controlado: 27 ± 2 °C, humedad relativa del 80 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. Una camara de alimentacion comprendfa 10 ninfas de primera o segunda fase colocadas en una placa de Petri pequena (con un diametro de 3 cm) cubierta con una unica capa de parafilm M muy estirado a la que se anadieron 50 pl de la dieta. La camara se sello con una segunda capa de parafilm y se incubo en las mismas condiciones que los cultivos de adultos pero sin exposicion directa a la luz. La dieta con ARNbc se renovo cada dos dfas y se evaluo la supervivencia de los insectos diariamente. Por tratamiento, se prepararon simultaneamente 5 camaras de alimentacion de bioensayos (replicados). Se incorporaron soluciones de ARNbc de ensayo y de control (gfp) en la dieta hasta una concentracion final de 2 mg/ml. Las camaras de alimentacion se mantuvieron a 27 ± 2 °C, humedad relativa del 80 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. Se analizaron los datos de supervivencia de insectos usando el modelo de curva de supervivencia de Kaplan- Meier y se compararon las supervivencias entre grupos usando el ensayo de rangos logantmicos (Prism version 4.0).

La alimentacion con dieta artificial lfquida suplementada con ARNbc desnudos intactos a Nilaparvata lugens in vitro usando una camara de alimentacion dio como resultado aumentos significativos de las mortalidades de las ninfas tal como se muestra en cuatro bioensayos separados (Figuras 1(a)-(d)-NL; Tablas 1a-d-NL). Estos resultados demuestran que los ARNbc correspondientes a diferentes genes esenciales de SM mostraron toxicidad significativa hacia el saltamontes marron del arroz.

El efecto del ARNbc de gfp en la supervivencia de SM en estos bioensayos no es significativamente diferente a la supervivencia solamente con dieta.

Las Tablas 10a-d-NL muestran un resumen de la supervivencia de Nilaparvata lugens con dieta artificial suplementada con 2 mg/ml (concentracion final) de las siguientes dianas: en la Tabla 10(a)-NL: NL002, NL003, NL005, NL010; en la Tabla 10(b)-NL NL009, NL016; en la Tabla 10(c)-NL NL014, NL018; y en la Tabla 10(d)-NL NL013, NL015, NL021. En la columna de analisis de supervivencia, el efecto del ARNi se indica de la siguiente manera: + = supervivencia significativamente reducida en comparacion con el control de ARNbc de gfp (alfa < 0,05); - = sin diferencias significativas en la supervivencia en comparacion con el control de ARNbc de gfp. Se compararon las curvas de supervivencia (entre dieta solamente y la dieta complementada con ARNbc de ensayo, ARNbc de gfp y ARNbc de ensayo y dieta solamente y ARNbc de gfp) usando el ensayo de rangos logantmicos.

E. Pruebas de laboratorio para explorar ARNbc a diferentes concentraciones usando dieta artificial con respecto a actividad contra Nilaparvata lugens

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Se aplicaron cincuenta |jl de dieta artificial Kquida suplementada con diferentes concentraciones de ARNbc de NL002 diana, concretamente 1, 0,2, 0,08 y 0,04 mg/ml (concentracion final), a las camaras de alimentacion de saltamontes marron. La dieta con ARNbc se renovo cada dos d^as y se evaluo la supervivencia de los insectos diariamente. Por tratamiento, se prepararon simultaneamente 5 camaras de alimentacion de bioensayos (replicados). Las camaras de alimentacion se mantuvieron a 27 ± 2 °C, humedad relativa del 80 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas. Se analizaron los datos de supervivencia de insectos usando el modelo de curva de supervivencia de Kaplan-Meier y se compararon las supervivencias entre grupos usando el ensayo de rangos logantmicos (Prism version 4.0).

La alimentacion con dieta artificial lfquida suplementada con ARNbc desnudos intactos NL002 diana a diferentes concentraciones dio como resultado mortalidades de SM significativamente mayores a concentraciones finales tan bajas como 0,04 mg de ARNbc por ml de dieta en comparacion con la supervivencia solamente con dieta, tal como se muestra en la Figura 2-NL y en la Tabla 9-NL. La Tabla 9-NL resume la supervivencia de Nilaparvata lugens en un ensayo de alimentacion con dieta artificial suplementado con 1, 0,2, 0,08 y 0,04 mg/ml (concentracion final) de NL002 diana. En la columna de analisis de supervivencia se indica el efecto del ARNi de la siguiente manera: + = reduce significativamente la supervivencia en comparacion con control solamente con dieta (alfa < 0,05); - = sin diferencias significativas en la supervivencia en comparacion con el control solamente con dieta. Las curvas de supervivencia se compararon usando el ensayo de rangos logantmicos.

F. Clonacion de un fragmento genico de SM en un vector adecuado para la produccion bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos

A continuacion hay un ejemplo de clonacion de un fragmento de ADN correspondiente a una diana genica de SM en un vector para la expresion de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano, aunque puede usarse cualquier vector que comprende un promotor de T7 o cualquier otro promotor para la transcripcion eficaz en bacterias (referencia al documento WO0001846).

Las secuencias de los cebadores espedficos usados para la amplificacion de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8. El molde usado es el vector pCR8/GW/TOPO® que contiene cualquiera de las secuencias diana. Los cebadores se usan en una reaccion PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizo en gel de agarosa, se purifico (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clono con extremos romos en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuencio. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la secuencia respectiva tal como se proporciona en la Tabla 8-NL.

Transformacion de AB301-105(DE3) y BL21(DE3)

Se anadieron trescientos ng del plasmido y se mezclaron suavemente en una alfcuota de 50 jl de la cepa de E. coli qmmicamente competente enfriada en hielo AB301-105(DE3) o BL21(DE3). Las celulas se incubaron sobre hielo durante 20 minutos antes de someterlas a un tratamiento de choque termico de 37 °C durante 5 minutos, despues de los cuales se pusieron de nuevo sobre hielo durante 5 minutos adicionales. Se anadieron cuatrocientos cincuenta jl de medio SOC a temperatura ambiente a las celulas y la suspension se incubo en un agitador (250 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Se transfirieron cien jl de la suspension de celulas bacterianas a un matraz conico de 500 ml que contema 150 ml de caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) lfquido suplementado con 100 jg/ml de antibiotico de carbenicilina. El cultivo se incubo en un agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37 °C durante toda la noche (16 a 18 horas).

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Tratamiento con calor de bacterias

H. Pruebas de laboratorio para ensayar Escherichia coli que expresan dianas de ARNbc contra Nilaparvata lugens

Bioensayos basados en plantas

Se rocfan plantas completas con suspensiones de bacterias inducidas qmmicamente que expresan ARNbc antes de alimentar a los SM con las plantas. Se cultivan en una camara de cultivo de plantas. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plastico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente colocado en el suelo en una maceta y se recorto la base y se cubrio con una fina malla de nailon para permitir el aireamiento, reducir la condensacion en su interior e impedir que se escapen los insectos. Se colocan SM en cada planta tratada en la jaula. Las plantas se tratan con una suspension de E. coli AB301-105(DE3) que portan el vector recombinante o el plasmido pGN29. Se aplican diferentes cantidades de bacterias a las plantas: por ejemplo 66, 22 y 7 unidades, donde una unidad se define como 109 celulas bacterianas en 1 ml de una suspension bacteriana a un valor de densidad optica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se rocfa un volumen total de entre 1 y 10 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usa una planta por tratamiento en este ensayo. Se cuenta el numero de supervivientes y se registra el peso de cada superviviente.

Ejemplo 10: Chilos suppressalis (barrenador rayado del tallo del arroz),

A. Clonacion de la secuencia parcial de los genes de Chilo suppressalis mediante PCR familiar

Se aislo ARN intacto, de alta calidad de los 4 estadios larvarios diferentes de Chilo suppressalis (barrenador rayado del tallo del arroz) usando reactivo TRIzol® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genomico presente en la preparacion de ARN se retiro mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante. Se genero ADNc usando un kit comercialmente disponible (transcriptasa inversa SuperScript® III) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para aislar secuencias de ADNc que comprendfan una porcion de los genes CS001, CS002, CS003, CS006, CS007, CS009, CS011, CS013, CS014, CS015, CS016 y CS018, se realizo una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificacion de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-CS. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR4/TOPO® y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-CS y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoacidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-CS.

B. Produccion de ARNbc de los genes de Chilo suppressalis

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Para cada uno de los genes diana, se genera el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso espedficos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-CS. Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes: 4 minutos a 95 °C, seguido de 35 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se genera usando cebadores directos e inversos de T7 espedficos en una reaccion PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-CS. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificacion PCR (kit de purificacion PCR Qiaquick®) y precipitacion de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-CS.

C. Recombinacion de los genes de Chilo suppressalis en el vector vegetal pK7GWIWG2D(II)

Dado que el mecanismo de interferencia de ARN actua a traves de fragmentos de ARNbc, las secuencias nucleotfdicas diana de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientacion antisentido y sentido, separados por el intron - CmR - intron, en el que CmR es el marcador de resistencia a cloranfenicol, para formar una construccion de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron usando la reaccion de recombinacion LR entre un clon de entrada que conterna attL (vease el Ejemplo 1) y un vector de destino que conterna attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIWG2D(II) se obtuvo a traves de VIB/Plant Systems Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reaccion de recombinacion de LR se llevo a cabo usando la mezcla enzimatica LR Clonase™ II siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos experimentos de clonacion dieron como resultado una construccion en horquilla para cada uno de los genes diana, que ternan la orientacion promotor - sentido - intron - CmR - intron - antisentido y en el que el promotor es el promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S es adecuado para la transformacion en A. tumefaciens.

Se realizaron digestiones con enzimas de restriccion en los plasmidos de pCR8/GW/TOPO® que conternan las diferentes dianas (vease el Ejemplo B). La banda que conterna el gen de interes flanqueado por los sitios de attL se purifico usando el kit de extraccion en gel Qiaquick®. Se anadio una cantidad de 150 ng de fragmento purificado y 150 ng de pK7GWIWG2D(II) junto con la enzima LR clonasa II y se incubo durante al menos 1h a 25 °C. Despues del tratamiento con la solucion de proteinasa K (10 min a 37°C), la mezcla de recombinacion completa se transformo en las celulas qmmicamente competentes Top 10. Se seleccionaron los clones positivos mediante analisis por digestion de restriccion.

D. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc, usando dieta artificial para actividad contra larvas de Chilo suppressalis

Se mantuvieron barrenadores rayados del tallo del arroz, Chilo suppressalis, (origen: Syngenta, Stein, Suiza) con una dieta artificial modificada basada en la descrita por Kamano y Sato, 1985 (en: Handbook of Insect Rearing. volumenes I y II. P Singh y RF Moore, eds., Elsevier Science Publishers, Amsterdam y Nueva York, 1985, pags. 448). En resumen, se preparo un litro de dieta de la siguiente manera: se anadieron 20 g de agar a 980 ml de agua Milli-Q y se esterilizo por autoclave; la solucion de agar se enfrio a aproximadamente 55 °C y los demas ingredientes se anadieron y se mezclaron exhaustivamente: 40 g de harina de mafz (Polenta), 20 g de celulosa, 30 g de sacarosa, 30 g de caserna, 20 g de germen de trigo (tostado), 8 g mezcla de sales de Wesson, 12 g de mezcla de vitaminas de Vanderzant, 1,8 g de acido sorbico, 1,6 g de nipagina (metilparabeno), 0,3 g de aureomicina, 0,4 g de colesterol y 0,6 g de L-cisterna. La dieta se enfrio a aproximadamente 45 °C y se vertio en bandejas o vasos de alimentacion. La dieta se dejo reposar en una cabina de flujo laminar horizontal. Se retiraron secciones de hojas de arroz con huevos ovipositados de una jaula que alojaba polillas adultas y se clavaron en la dieta solida en el vaso o bandeja de cna. Se dejo que los huevos eclosionaran y las larvas disponibles estaban disponibles para bioensayos y el mantenimiento de los cultivos de insectos. Durante las pruebas y la cna, las condiciones fueron de 28 ± 2 °C y una humedad relativa del 80 ± 5 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas.

Se uso la misma dieta artificial para los bioensayos pero en este caso la dieta se vertio a partes iguales en 24 placas multipocillo, conteniendo cada pocillo 1 ml de dieta. Una vez que se establece la dieta, las formulaciones de ensayo se aplican a la superficie de la dieta (2 cm2), a la tasa de 50 pl de ARNbc de diana a 1 pg/pl. Las soluciones de ARNbc se dejan secar y se colocan dos larvas de polillas de primera fase en cada pocillo. Despues de 7 dfas, las larvas se transfieren a dieta tratada reciente en placas multipocillo. En el dfa 14 (es decir, 14 dfas despues del inicio del bioensayo) se registra el numero de insectos vivos y muertos y se examinan en busca de anomalfas. Se ensayan veinticuatro larvas en total por tratamiento.

Se realiza un bioensayo alternativo en el que se alimentan larvas neonatas del barrenador rayado del tallo del arroz con hojas de arroz tratadas. Se sumergen secciones pequenas de hojas de arroz Indica de la variedad Taichung native 1 en solucion de Triton™ X-100 al 0,05 % que contiene 1 pg/pl de ARNbc diana, se deja secar y cada seccion se coloca en un pocillo de una de 24 multipocillos que contienen agar gelificado al 2 %. Se transfieren dos neonatos de la bandeja de cna a cada seccion de hoja tratada con ARNbc (24 larvas por tratamiento). Despues de 4 y 8 dfas,

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las larvas se transfieren a secciones de hojas de arroz tratadas recientes. El numero de larvas vivas y muertas se evalua los d^as 4, 8 y 12; tambien se registra cualquier anomalfa.

E. Clonacion de un fragmento genico de BRA en un vector adecuado para la produccion bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos

A continuacion hay un ejemplo de clonacion de un fragmento de ADN correspondiente a una diana genica de BRA en un vector para la expresion de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano, aunque puede usarse cualquier vector que comprende un promotor de T7 o cualquier otro promotor para la transcripcion eficaz en bacterias (referencia al documento WO0001846).

Las secuencias de los cebadores espedficos usados para la amplificacion de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8. El molde usado es el vector pCR8/GW/TOPO® que contiene cualquiera de las secuencias diana. Los cebadores se usan en una reaccion PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizo en gel de agarosa, se purifico (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clono con extremos romos en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuencio. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la secuencia respectiva tal como se proporciona en la Tabla 8-CS.

Transformacion de AB301-105(DE3) y BL21(DE3)

Tratamiento con calor de bacterias

G. Pruebas de laboratorio para ensayar Escherichia coli que expresan dianas de ARNbc contra Chilo suppressalis

Bioensayos basados en plantas

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Se rodan plantas completas con suspensiones de bacterias inducidas qmmicamente que expresan ARNbc antes de alimentar a los BRA con las plantas. Se cultivan en una camara de cultivo de plantas. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plastico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente colocado en el suelo en una maceta y se recorto la base y se cubrio con una fina malla de nailon para permitir el aireamiento, reducir la condensacion en su interior e impedir que se escapen los insectos. Se colocan BRA en cada planta tratada en la jaula. Las plantas se tratan con una suspension de E. coli AB301-105(DE3) que portan el vector recombinante o el plasmido pGN29. Se aplican diferentes cantidades de bacterias a las plantas: por ejemplo 66, 22 y 7 unidades, donde una unidad se define como 109 celulas bacterianas en 1 ml de una suspension bacteriana a un valor de densidad optica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se roda un volumen total de entre 1 y 10 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usa una planta por tratamiento en este ensayo. Se cuenta el numero de supervivientes y se registra el peso de cada superviviente.

Ejemplo 11: Plutella xylostella (palomilla de dorso diamante)

A. Clonacion de una secuencia parcial de la Plutella xylostella

Se aislo ARN intacto, de alta calidad de todos los estadios larvarios diferentes de Plutella xylostella (palomilla de dorso diamante; Fuente: Dr. Lara Senior, Insect Investigations Ltd., Capital Business Park, Wentloog, Cardiff, CF3 2PX, Gales, Reino Unido) usando reactivo TRIzol® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genomico presente en la preparacion de ARN se retiro mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante. Se genero ADNc usando un kit comercialmente disponible (transcriptasa inversa SuperScript® Ill) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para aislar secuencias de ADNc que comprendfan una porcion de los genes PX001, PX009, PX010, PX015, PX016, se realizo una serie de reacciones pCr con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificacion de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-PX. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 50°C y 1 minuto y 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C (para PX001, PX009, PX015, PX016); 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 54 °C y 2 minuto y 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C (para PX010). Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR8/GW/TOPO® y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-PX y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoacidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-PX.

B. Produccion de ARNbc de los genes de Plutella xylostella

Para cada uno de los genes diana, se genero el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso espedficos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-PX. Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes: 1 minuto a 95 °C, seguido de 20 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C (-0,5 °C/ciclo) y 1 minuto a 72 °C, seguido de 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 50 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se genero usando cebadores directos e inversos de T7 espedficos en una reaccion PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-PX. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificacion PCR (kit de purificacion PCR Qiaquick®) y precipitacion de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante

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para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-PX.

C. Recombinacion de los genes de Plutella xylostella en el vector vegetal pK7GWIWG2D(II)

Dado que el mecanismo de interferencia de ARN actua a traves de fragmentos de ARNbc, las secuencias nucleotfdicas diana de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientacion antisentido y sentido, separados por el intron - CmR - intron, en el que CmR es el marcador de resistencia a cloranfenicol, para formar una construccion de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron usando la reaccion de recombinacion LR entre un clon de entrada que contema attL (vease el Ejemplo 1) y un vector de destino que contema attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIWG2D(II) se obtuvo a traves de VIB/Plant Systems Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reaccion de recombinacion de LR se llevo a cabo usando la mezcla enzimatica LR Clonase™ II siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos experimentos de clonacion dieron como resultado una construccion en horquilla para cada uno de los genes diana, que teman la orientacion promotor - sentido - intron - CmR - intron - antisentido y en el que el promotor es el promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S es adecuado para la transformacion en A. tumefaciens.

D. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc, usando dieta artificial para actividad contra larvas de Plutella xylostella

Se mantuvieron palomillas de dorso diamante , Plutella xylostella, en Insect Investigations Ltd. (origen: Newcastle University, Newcastle-upon-Tyne, Reino Unido). Los insectos se criaron en hojas de repollo. Se seleccionaron larvas de ambos sexos, de primera fase (de aproximadamente 1 dfa de edad) para su uso en el ensayo. Los insectos se mantuvieron en tubos Eppendorf (1,5 ml de capacidad). Se coloco dieta de palomilla de dorso diamante comercialmente disponible (Bio-Serv, NJ, EE.UU), preparada siguiendo las instrucciones del fabricante sobre la tapa de cada tubo (capacidad de 0,25 ml, diametro de 8 mm). Mientras aun era lfquida, la dieta se nivelo para retirar el exceso y producir una superficie homogenea.

Una vez que la dieta se ha establecido, se aplican las formulaciones de ensayo a la superficie de la dieta, a una tasa de 25 |jl de formulacion no diluida (1 jg/jl de ARNbc de dianas) por replicado. Se deja que las formulaciones de ensayo se sequen y se coloca una larva de polilla de primera fase en cada tubo. La larva se coloca sobre la superficie de la dieta en la tapa y se cierra cuidadosamente el tubo. Los tubos se almacenan boca abajo, sobre las tapas, de tal forma que la larva permanece sobre la superficie de la dieta. Dos veces por semana las larvas se transfieren a nuevos tubos Eppendorf con dieta reciente. Se proporciona a los insectos dieta tratada durante las primeras dos semanas del ensayo y a continuacion dieta no tratada.

Se realizan evaluaciones dos veces por semanas durante un total de 38 dfas momento en el cual todas las larvas estan muertas. En cada evaluacion los insectos se evaluan como vivos o muertos y se evaluan en busca de anomalfas. Se realizan cuarenta replicados de larvas individuales para cada uno de los tratamientos. Durante la prueba las condiciones de ensayo son 23 a 26 °C y una humedad relativa del 50 al 65 %, con un fotoperiodo de luz:oscuridad de 16:8 horas.

E. Clonacion de un fragmento genico de PDD en un vector adecuado para la produccion bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos

A continuacion hay un ejemplo de clonacion de un fragmento de ADN correspondiente a una diana genica de PDD en un vector para la expresion de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano, aunque puede usarse cualquier vector que comprende un promotor de T7 o cualquier otro promotor para la transcripcion eficaz en bacterias (referencia al documento WO0001846).

Las secuencias de los cebadores espedficos usados para la amplificacion de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-PX. El molde usado es el vector pCR8/GW/TOPO® que contiene cualquiera de las secuencias diana. Los cebadores se usan en una reaccion PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizo en gel de agarosa, se purifico (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clono con extremos romos en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuencio. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la secuencia respectiva tal como se proporciona en la Tabla 8-PX.

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Transformacion de AB301-105(DE3) y BL21(DE3)

Se anadieron trescientos ng del plasmido y se mezclaron suavemente en una alfcuota de 50 |jl de la cepa de E. coli qmmicamente competente enfriada en hielo AB301-105(DE3) o BL21(DE3). Las celulas se incubaron sobre hielo durante 20 minutos antes de someterlas a un tratamiento de choque termico de 37 °C durante 5 minutos, despues de los cuales se pusieron de nuevo sobre hielo durante 5 minutos adicionales. Se anadieron cuatrocientos cincuenta jl de medio SOC a temperatura ambiente a las celulas y la suspension se incubo en un agitador (250 rpm) a 37 °C durante 1 hora. Se transfirieron cien jl de la suspension de celulas bacterianas a un matraz conico de 500 ml que contema 150 ml de caldo de cultivo Luria-Bertani (LB) lfquido suplementado con 100 jg/ml de antibiotico de carbenicilina. El cultivo se incubo en un agitador Innova 4430 (250 rpm) a 37 °C durante toda la noche (16 a 18 horas).

Tratamiento con calor de bacterias

G. Pruebas de laboratorio para ensayar Escherichia coli que expresan dianas de ARNbc contra Plutella xylostella

Bioensayos basados en plantas

Se rocfan plantas completas con suspensiones de bacterias inducidas qmmicamente que expresan ARNbc antes de alimentar a los PDD con las plantas. Se cultivan en una camara de cultivo de plantas. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plastico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente colocado en el suelo en una maceta y se recorto la base y se cubrio con una fina malla de nailon para permitir el aireamiento, reducir la condensacion en su interior e impedir que se escapen los insectos. Se colocan PDD en cada planta tratada en la jaula. Las plantas se tratan con una suspension de E. coli AB301-105(DE3) que portan el vector recombinante o el plasmido pGN29. Se aplican diferentes cantidades de bacterias a las plantas: por ejemplo 66, 22 y 7 unidades, donde una unidad se define como 109 celulas bacterianas en 1 ml de una suspension bacteriana a un valor de densidad optica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se rocfa un volumen total de entre 1 y 10 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usa una planta por tratamiento en este ensayo. Se cuenta el numero de supervivientes y se registra el peso de cada superviviente.

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A. Clonacion de secuencias parciales de Acheta domesticus

Se aislo ARN intacto de alta calidad de todos los estadios diferentes de Acheta domesticus (grillo domestico; Fuente: Dr. Lara Senior, Insect Investigations Ltd., Capital Business Park, Wentloog, Cardiff, CF3 2PX, Gales, Reino Unido) usando reactivo TRIzol® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genomico presente en la preparacion de ARN se retiro mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante. Se genero ADNc usando un kit comercialmente disponible (transcriptasa inversa Superscript® Ill) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para aislar secuencias de ADNc que comprendfan una porcion de los genes AD001, AD002, AD009, AD015 y AD016, se realizo una serie de reacciones PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las instrucciones del fabricante.

Las secuencias de los cebadores degradados usados para la amplificacion de cada uno de los genes se proporcionan en la Tabla 2-AD. Estos cebadores se usaron en respectivas reacciones PCR con las siguientes condiciones: 10 minutos a 95 °C, seguido de 40 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 1 minuto a 50°C y 1 minuto y 30 segundos a 72°C, seguido de 7 minutos a 72 °C. Los fragmentos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa, se purificaron (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clonaron en el vector pCR8/GW/TOPO® y se secuenciaron. Las secuencias de los productos PCR resultantes se representan mediante las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 2-AD y se citan como las secuencias parciales. Las secuencias de aminoacidos parciales correspondientes se representan por las SEC ID N° respectivas tal como se proporcionan en la Tabla 3-AD,

B. Produccion de ARNbc de los genes de Acheta domesticus

Para cada uno de los genes diana, se genero el molde de T7 en sentido usando cebadores directo e inverso espedficos de T7. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8-AD. Las condiciones de las reacciones PCR fueron las siguientes: 1 minuto a 95 °C, seguido de 20 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 60 °C (-0,5 °C/ciclo) y 1 minuto a 72 °C, seguido de 15 ciclos de 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 50 °C y 1 minuto a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El molde de T7 antisentido se genero usando cebadores directos e inversos de T7 espedficos en una reaccion PCR con las mismas condiciones que las descritas anteriormente. Las secuencias de los respectivos cebadores para amplificar el molde anti-sentido para cada uno de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8- AD. Los productos PCR resultantes se analizaron en gel de agarosa y se purificaron mediante el kit de purificacion PCR (kit de purificacion PCR Qiaquick®) y precipitacion de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclaron para transcribirse y las hebras de ARN resultantes se hibridaron, se trataron con DNasa y RNasa y se purificaron con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante. La hebra sentido del ARNbc resultante para cada uno de los genes diana se proporciona en la Tabla 8-AD.

C. Recombinacion de los genes de Acheta domesticus en el vector vegetal pK7GWIWG2D(M)

D. Pruebas de laboratorio para ensayar dianas de ARNbc, usando dieta artificial para actividad contra larvas

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Se mantuvieron grillos domesticos, Acheta domesticus, en Insect Investigations Ltd. (origen: Blades Biological Ltd., Kent, Reino Unido). Los insectos se criaron con microgranulos de salvado y hojas de repollo. Se seleccionaron ninfas de ambos sexos del mismo tamano y no mas de 5 dfas de edad para su uso en la prueba. Se mezclo ARN bicatenario con una dieta de roedor en granulos basada en trigo (dieta convencional de rata y raton, B & K Universal Ltd., Grimston, Aldbrough, Hull, Reino Unido). La dieta, BK001P, contiene los siguientes ingredientes en orden descendente en peso: trigo, soja, harina forrajera de trigo, cebada, aglutinante de granulos, vitamina 5 de roedor, mezcla de grasas, fosfato dicalcico, carbamatos fungicidas. La dieta granulada para roedores se tritura finamente y se trata con calor en un horno de microondas antes de mezclar, para inactivar cualquier componente enzimatico. Toda la dieta de roedor se toma del mismo lote para asegurar la uniformidad. La dieta triturada y el ARNbc se mezclan exhaustivamente y se moldean en granulos pequenos del mismo peso, que se dejan secar durante toda la noche a temperatura ambiente.

Se aplicaron muestras de ARN bicatenario de dianas y control de gfp a concentraciones de 10 pg/pl a una relacion de 1 g de dieta molida mas 1 ml de solucion de ARNbc, dando como resultado de este modo una tasa de aplicacion de 10 mg de ARNbc por gramo de granulos. Los granulos se reemplazan cada semana. Se proporciona a los insectos granulos tratados durante las primeras tres semanas de la prueba. A continuacion se proporcionan granulos no tratados. Los insectos se mantienen dentro de recipientes de plastico con tapa (9 cm de diametro, 4,5 cm de profundidad), diez por recipiente. Cada arena contiene un granulo cebo tratado y una fuente de agua (bola de algodon humeda), cada uno colocado en un bote de bajo peso separado. El agua se repone a voluntad durante todo el experimento.

Se realizan evaluaciones a intervalos de dos veces por semana, sin haber mas de cuatro dfas entre las evaluaciones, hasta que todos los insectos habfan muerto o mudado al estadio adulto (84 dfas). En cada evaluacion los insectos se evaluan como vivos o muertos y se examinan en busca de anomalfas. Desde el dfa 46 en adelante, una vez que ha comenzado la muda a adulto, todos los insectos (vivos y muertos) se evaluan como ninfa o adulto. Los insectos supervivientes se pesan en el dfa 55 de la prueba. Se realizan cuatro replicados para cada uno de los tratamientos. Durante la prueba las condiciones de ensayo son 25 a 33 °C y una humedad relativa del 20 al 25 %, con un fotoperiodo de 12:12 horas de luz:oscuridad.

E. Clonacion de un fragmento genico de GD en un vector adecuado para la produccion bacteriana de ARN bicatenario activo en insectos

A continuacion hay un ejemplo de clonacion de un fragmento de ADN correspondiente a una diana genica de GD en un vector para la expresion de ARN bicatenario en un hospedador bacteriano, aunque puede usarse cualquier vector que comprende un promotor de T7 o cualquier otro promotor para la transcripcion eficaz en bacterias (referencia al documento WO0001846).

Las secuencias de los cebadores espedficos usados para la amplificacion de los genes diana se proporcionan en la Tabla 8. El molde usado es el vector pCR8/GW/TOPO® que contiene cualquiera de las secuencias diana. Los cebadores se usan en una reaccion PCR con las siguientes condiciones: 5 minutos a 98 °C, seguido de 30 ciclos de 10 segundos a 98 °C, 30 segundos a 55 °C y 2 minutos a 72 °C, seguido de 10 minutos a 72 °C. El fragmento PCR resultante se analizo en gel de agarosa, se purifico (Kit de extraccion de gel QIAquick®), se clono con extremos romos en vector pGNA49A linealizado con Srf I y se secuencio. La secuencia del producto PCR resultante corresponde a la secuencia respectiva tal como se proporciona en la Tabla 8-AD.

Transformacion de AB301-105(DE3) y BL21(DE3)

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Tratamiento con calor de bacterias

G. Pruebas de laboratorio para ensayar Escherichia coli que expresan dianas de ARNbc contra Acheta domesticus

Bioensayos basados en plantas

Se rocfan plantas completas con suspensiones de bacterias inducidas qmmicamente que expresan ARNbc antes de alimentar a los GD con las plantas. Se cultivan en una camara de cultivo de plantas. Las plantas se cubrieron colocando una botella de plastico de 500 ml boca abajo sobre la planta con el cuello de la botella firmemente colocado en el suelo en una maceta y se recorto la base y se cubrio con una fina malla de nailon para permitir el aireamiento, reducir la condensacion en su interior e impedir que se escapen los insectos. Se colocan gD en cada planta tratada en la jaula. Las plantas se tratan con una suspension de E. coli AB301-105(DE3) que portan el vector recombinante o el plasmido pGN29. Se aplican diferentes cantidades de bacterias a las plantas: por ejemplo 66, 22 y 7 unidades, donde una unidad se define como 109 celulas bacterianas en 1 ml de una suspension bacteriana a un valor de densidad optica de 1 a una longitud de onda de 600 nm. En cada caso, se rocfa un volumen total de entre 1 y 10 ml sobre la planta con la ayuda de un vaporizador. Se usa una planta por tratamiento en este ensayo. Se cuenta el numero de supervivientes y se registra el peso de cada superviviente.

Ejemplo 13: Pyricularia grisea (tizon del arroz)

A. Clonacion de secuencias parciales de P. grisea

Se afsla ARN intacto, de alta calidad de diferentes estadios de crecimiento de P. grisea usando reactivo TRIzol® siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN genomico presente en la preparacion de ARN se retira mediante tratamiento con DNasa siguiendo las instrucciones del fabricante. Se genera ADNc usando un kit comercialmente disponible (transcriptasa inversa SuperScript® III) siguiendo las instrucciones del fabricante.

Para aislar secuencias de ADNc que comprenden una porcion del gen diana, se realiza PCR con cebadores degradados usando Amplitaq Gold® siguiendo las instrucciones del fabricante. Los productos de PCR resultantes se fraccionan y secuencian.

B. Produccion de ARNbc de genes de P. grisea

Se sintetiza ARNbc en cantidades de miligramo usando un kit comercialmente disponible, tal como sistema de ARNi T7 Ribomax™ Express, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los productos PCR resultantes se analizan en gel

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de agarosa y se purifican mediante el kit de purificacion PCR (por ejemplo, kit de purificacion PCR Qiaquick®) y precipitacion de NaClO4. Los moldes directo e inverso de T7 generados se mezclan y las hebras de ARN resultantes se hibridan, despues se tratan con DNasa y RNasa y se purifican con acetato de sodio, siguiendo las instrucciones del fabricante.

C. Recombinacion de diana de P. grisea en el vector vegetal pK7GWIWG2D(II)

Dado que el mecanismo de interferencia de ARN actua a traves de fragmentos de ARNbc, las secuencias nucleotfdicas de los genes diana, como los seleccionados anteriormente, se clonaron en orientacion antisentido y sentido, separados por el intron - CmR - intron, en el que CmR es el marcador de resistencia a cloranfenicol, para formar una construccion de ARNbc en horquilla. Estas construcciones en horquilla se generaron usando la reaccion de recombinacion LR entre un clon de entrada que contema attL (vease el Ejemplo A) y un vector de destino que contema attR (= pK7GWIWG2D(II)). El vector vegetal pK7GWIwG2D(II) se obtuvo a traves de VIB/Plant Systems Biology con un Acuerdo de Transferencia de Material. La reaccion de recombinacion de LR se llevo a cabo usando la mezcla enzimatica LR Clonase™ II siguiendo las instrucciones del fabricante. Estos experimentos de clonacion dieron como resultado una construccion en horquilla para el gen diana, que teman la orientacion promotor - sentido - intron - CmR - intron - antisentido y en el que el promotor es el promotor de 35S operativo en plantas. El vector binario pK7GWIWG2D(II) con el promotor de 35S es adecuado para la transformacion en A. tumefaciens.

Se realizaron digestiones con enzimas de restriccion en los plasmidos de pCR8/GW/TOPO® que conteman la diana (vease el Ejemplo B). La banda que contema el gen de interes flanqueado por los sitios de attL se purifico usando el kit de extraccion en gel Qiaquick®. Se anadio una cantidad de 150 ng de fragmento purificado y 150 ng de pK7GWIWG2D(II) junto con la enzima LR clonasa II y se incubo durante al menos 1h a 25 °C. Despues del tratamiento con la solucion de proteinasa K (10 min a 37°C), la mezcla de recombinacion completa se transformo en las celulas qmmicamente competentes Top 10. Se seleccionaron los clones positivos mediante analisis por digestion de restriccion.

D. Expresion y produccion de una diana de ARN bicatenario en dos cepas de Escherichia coli: (1) AB301- 105(DE3), y, (2) BL21(DE3)

Se siguieron los procedimientos descritos a continuacion para expresar niveles adecuados de ARN bicatenario de diana fungica en bacterias. Se uso una cepa deficiente en RNasaIII, AB301-105(DE3), en comparacion con bacterias que conteman RNasaIII de tipo silvestre, BL21(DE3).

Transformacion de AB301-105(DE3) y BL21(DE3)

Tratamiento con calor de bacterias

Las bacterias se destruyeron mediante tratamiento con calor para minimizar el riesgo de contaminacion de la dieta artificial en las placas de ensayo. Sin embargo, el tratamiento con calor de las bacterias que expresaban ARN bicatenario no es un requisito previo para inducir la toxicidad hacia los insectos debido a la interferencia de ARN. El cultivo bacteriano inducido se centrifugo a 3000 g a temperatura ambiente durante 10 minutos, se desecho el sobrenadante y el sedimento se sometio a 80 °C durante 20 minutos en un bano con agua. Despues del tratamiento

con calor, el sedimento bacteriano se resuspendio en 1,5 ml de agua MilliQ y la suspension se transfirio a un tubo de microcentnfuga. Se prepararon y usaron diversos tubos en los bioensayos para cada renovacion. Los tubos se conservaron a -20 °C hasta su uso posterior.

Tabla 1 A

DI de C.elegans: ID de D. melanogaster Descripcion Exploracion de ARNi Devgen

B0250.1: CG1263 Protema de subunidad ribosomica grande L8. Aguda letal o letal

B0336.10: CG3661 Protema de subunidad ribosomica grande L23. Aguda letal o letal

B0336.2: CG8385 Factor de ribosilacion de ADP. Aguda letal o letal

B0464.1: CG3821 Aspartil(D) ARNt sintetasa putativa. Aguda letal o letal

C01G8.5: CG10701 Ortologo de la familia ERM de enlazantes citoesqueleticos. Aguda letal o letal

C01H6.5: CG33183 Receptor de hormonas nucleares que se requiere en todas las mudas larvarias Aguda letal o letal

C02C6.1: CG18102 Miembro de la clase genica relacionada con DYNamina Aguda letal o letal

C03D6.8: CG6764 Protema de subunidad ribosomica grande L24 (R1p24p). Aguda letal o letal

C04F12.4: CG6253 rpl-14 codifica una protema de subunidad ribosomica grande de L14. Aguda letal o letal

C04H5.6: CG10689 Producto con actividad ARN helicasa (EC:2.7.7.) implicado en el corte y empalme de ARNm nuclear, mediante espliceosoma que es un componente del complejo de espliceosoma. Embrionaria letal o esteril

C13B9.3: CG14813 Subunidad delta del complejo de coatomero (COPI). Aguda letal o letal

C17H12.14: CG1088 Miembro de la clase genica de ATPasa vacuolar H. Aguda letal o letal

C26E6.4: CG3180 ARN polimerasa II dirigida por ADN. Aguda letal o letal

F23F12.6: CG16916 Subunidad de ATPasa triple A del subcomplejo de base de partmula reguladora 19S del proteasoma 26S (RP) Aguda letal o letal

F57B9.10: CG10149 Miembro de la clase genica de tipo no ATPasa, partmula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal

K11D9.2: CG3725 Homologo de Ca[2+] ATPasa del retmulo sarcoendoplasmico. Embrionaria letal o esteril

T20G5.1: CG9012 Cadena pesada de clatrina Aguda letal o letal

T20H4.3: CG5394 Prolil-ARNt sintetasa (ProRS) citoplasmica predicha. Aguda letal o letal

T21E12.4: CG7507 Homologo de cadena pesada de dinema citoplasmatica. Aguda letal o letal

C05C10.3: CG1140 ortologo del gen humano 3-OXOACIDO COA TRANSFERASA Aguda letal o letal

C09D4.5: CG2746 Protema ribosomica L19, constituyente estructural de ribosoma implicado en la biosmtesis de protemas que se localiza en el ribosoma. Aguda letal o letal

C09E10.2: CG31140 Ortologo de diacilglicerol cinasa implicado en el movimiento, oviposicion y transmision sinaptica y se expresa en neuronas. Aguda letal o letal

C13B9.3: CG14813 Subunidad delta del coatomero (COPI). Aguda letal o letal

C14B9.7: CG12775 Protema de subunidad ribosomica grande L21 (RPL-21) implicada en la biosmtesis de protemas. Aguda letal o letal

C15H11.7: CG30382 Subunidad tipo 6 alfa de la partmula del nucleo de proteasa 20S del proteasoma 26S (CP). Aguda letal o letal

C17E4.9: CG9261 Protema implicada en el complejo de ATPasa que intercambia Na+/K+. Embrionaria letal o esteril

C17H12.14: CG1088 Subunidad E de V-ATPasa. Aguda letal o letal

C23G10.4: CG11888 Subunidad no ATPasa del subcomplejo de base de partmula reguladora 19S del proteasoma 26S (RPN-2). Aguda letal o letal

C26D10.2: CG7269 Producto con actividad helicasa implicado en el corte y empalme de ARNm nuclear, mediante espliceasoma que se localiza en el nucleo. Aguda letal o letal

C26E6.4: CG3180 Subunidad de 140 kD de ARN polimerasa II (RpII 140), actividad de ARN polimerasa dirigida por ADN (EC:2.7.7.6) implicada en la transcripcion del promotor Pol II que es un componente del complejo de nucleo de ARN polimerasa II dirigida por ADN. Aguda letal o letal

C26F1.4: CG15697 Producto con funcion en la biosmtesis de protemas y ubiquitina en la degradacion de protemas. Aguda letal o letal

C30C11.1: CG12220 Funcion desconocida. Aguda letal o letal

C30C11.2: CG10484 Miembro de la clase genica de tipo no ATPasa, partmula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal

C36A4.2: CG13977 Citocromo P450. Aguda letal o letal

C37C3.6: CG33103 Ortologo de trombospondina, papilina y lacunina. Aguda letal o letal

C37H5.8: CG8542 Miembro de la clase genica de protema de choque termico. Aguda letal o letal

C39F7.4: CG3320 Protema Rab-1 implicada en la adhesion celular. Aguda letal o letal

C41C4.8: CG2331 ATPasa del retmulo endoplasmatico transicional TER94, organizacion y biogenesis del Golgi. Retardo del crecimiento o detencion del crecimiento

C42D8.5: CG8827 Protema similar a ACE. Aguda letal o letal

C47E12.5: CG1782 Enzima activadora de ubiquitina, funcion en una reaccion dependiente de ATP que activa ubiquitina antes de su conjugacion a protemas que se degradaran posteriormente por el proteasoma 26S. Aguda letal o letal

C47E8.5: CG1242 Miembro de la clase genica de formacion de DAuer anomala. Aguda letal o letal

C49H3.11: CG5920 Protema de subunidad ribosomica pequena S2. Aguda letal o letal

C52E4.4: CG1341 Miembro de la clase genica de tipo ATPasa, partmula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal

C56C10.3: CG8055 Protema vehmulo potencialmente implicada en el transporte intracelular de protemas. Retardo del crecimiento o detencion del crecimiento

CD4.6: CG4904 Subunidad tipo 1 alfa de la partmula del nucleo de proteasa 20S del proteasoma 26S (CP). Aguda letal o letal

D1007.12: CG9282 Protema de subunidad ribosomica grande L24. Aguda letal o letal

D1054.2: CG5266 Miembro de la clase genica de subunidad alfa de proteasoma. Aguda letal o letal

D1081.8: CG6905 Protema transformante de MYB. Aguda letal o letal

F07D10.1: CG7726 Protema de subunidad ribosomica grande L11 (RPL-11.2) implicada en la biosmtesis de protemas. Aguda letal o letal

F11C3.3: CG17927 Cadena pesada de miosina muscular (MHC B). Aguda letal o letal

F13B10.2: CG4863 Protema L3 de subunidad ribosomica grande (rp1-3). Aguda letal o letal

F16A11.2: CG9987 Tipo de protema hipotetica de Methanococcus 0682. Aguda letal o letal

F20B6.2: CG17369 Subunidad B de V-ATPasa. Retardo del crecimiento o detencion del crecimiento

F23F12.6: CG16916 Subunidad de ATPasa triple A del subcomplejo de base de partmula reguladora 19S del proteasoma 26S (RP) (RPT-3). Aguda letal o letal

F25H5.4: CG2238 Factor de elongacion de la traduccion 2 (EF-2), una protema de union a GTP implicada en la smtesis de protemas. Retardo del crecimiento o detencion del crecimiento

F26D10.3: CG4264 Miembro de la clase genica de protema de choque termico. Aguda letal o letal

F28C6.7: CG6846 Protema de subunidad ribosomica grande L26 (RPL-26) implicada en la biosmtesis de protemas. Embrionaria letal o esteril

F28D1.7: CG8415 Protema de subunidad ribosomica pequena (S23) (RPS- 23) implicada en la biosmtesis de protemas. Aguda letal o letal

F29G9.5: CG5289 Miembro de la clase genica de tipo ATPasa, partmula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal

F32H2.5: CG3523 Protema mitocondrial. Aguda letal o letal

F37C12.11: CG2986 Protema de subunidad ribosomica pequena (S21) (RPS- 21) implicada en la biosmtesis de protemas. Aguda letal o letal

F37C12.4: CG7622 Protema de subunidad ribosomica grande L36 (RPL-36) implicada en la biosmtesis de protemas. Aguda letal o letal

F37C12.9: CG1527 Protema de subunidad ribosomica pequena (S14) (RPS- 14) implicada en la biosmtesis de protemas. Aguda letal o letal

F38E11.5: CG6699 Subunidad beta' (beta-prima) del complejo de coatomero (COPI). Aguda letal o letal

F39B2.6: CG10305 Protema de subunidad ribosomica pequena (S26) (RPS- 26) implicada en la biosmtesis de protemas. Aguda letal o letal

F39H11.5: CG12000 Miembro de la clase genica de subunidad beta de proteasoma. Aguda letal o letal

F40F8.10: CG3395 Protema ribosomica S9 (RpS9), constituyente estructural de ribosoma implicado en la biosmtesis de protemas que es un componente de la subunidad ribosomica pequena citosolica. Aguda letal o letal

F42C5.8: CG7808 Protema de subunidad ribosomica pequena (S8) (RPS-8) implicada en la biosmtesis de protemas. Aguda letal o letal

F49C12.8: CG5378 Miembro de la clase genica de tipo no ATPasa, partmula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal

F53A3.3: CG2033 Protema de subunidad ribosomica pequena S15a. Aguda letal o letal

F53G12.10: CG4897 Protema L7 de subunidad ribosomica grande (rpl-7). Aguda letal o letal

F54A3.3: CG8977 Funcion desconocida. Aguda letal o letal

F54E2.3: CG1915 Producto con actividad cinasa de cadena ligera de miosina sallimus (sls) (EC:2.7.1.117) implicado en la condensacion de cromosoma mitotico que se localiza en el nucleo.

F54E7.2: CG11271 Protema de subunidad ribosomica pequena (S12) (RPS- 12) implicada en la biosmtesis de protemas. Aguda letal o letal

F55A11.2: CG4214 Miembro de la clase genica de SYNtaxina. Aguda letal o letal

F55A3.3: CG1828 Factor de transcripcion. Aguda letal o letal

F55C10.1: CG11217 Ortologo de calcineurina B, la subunidad reguladora de la protema fosfatasa 2B. Aguda letal o letal

F56F3.5: CG2168 rps-1 codifica una protema de subunidad ribosomica pequena S3A. Aguda letal o letal

F58F12.1: CG2968 ATP sintasa. Aguda letal o letal

F59E10.3: CG3948 Subunidad zeta del complejo de coatomero (COPI). Aguda letal o letal

JC8.3: CG3195 Protema L12 de subunidad ribosomica grande (rpl-12). Aguda letal o letal

K01G5.4: CG1404 GTPasa monomerica pequena RAN potencial (adhesion celular). Aguda letal o letal

K04F10.4: CG18734 Subtilasa. Aguda letal o letal

K05C4.1: CG12323 Miembro de la clase genica de subunidad beta de proteasoma. Aguda letal o letal

K07D4.3: CG18174 Partmula reguladora del proteasoma potencial, subcomplejo de tapa, rpn11 Aguda letal o letal

K11D9.2: CG3725 Ca[2+] ATPasa del retmulo sarcoendoplasmico. Embrionaria letal o esteril; Aguda letal o letal

M03F4.2: CG4027 Una actina que se expresa en la pared corporal y musculos vulvares y la espermateca. Aguda letal o letal

R06A4.9: CG1109 Seis repeticiones de WD40. Aguda letal o letal

R10E11.1: CG15319 Cofactor transcripcional potencial. Aguda letal o letal

R12E2.3: CG3416 Protema con actividad endopeptidasa implicada en la proteolisis y peptidolisis. Aguda letal o letal

F10C1.2: CG10119 Miembro de la clase genica B de filamento intermedio. Embrionaria letal o esteril

F35G12.8: CG11397 Homologo de la subunidad SMC4 de condensina mitotica. Embrionaria letal o esteril

F53G12.1: CG5771 Homologo de GTPasa. Embrionaria letal o esteril

F54E7.3: CG5055 Protema que contiene dominio PDZ. Embrionaria letal o esteril

H28O16.1: CG3612 ATP sintasa. Retardo del crecimiento o detencion del crecimiento

K12C11.2: CG4494 Miembro de la clase genica homologa de SUMO (relacionada con ubiquitina). Embrionaria letal o esteril

R12E2.3: CG3416 Miembro de la clase genica de tipo no ATPasa, partmula reguladora del proteasoma. Aguda letal o letal

R13A5.8: CG6141 Protema ribosomica L9, constituyente estructural de ribosoma implicado en la biosmtesis de protemas que se localiza en el ribosoma. Aguda letal o letal

T01C3.6: CG4046 rps-16 codifica una protema de subunidad ribosomica pequena S16. Aguda letal o letal

T01H3.1: CG7007 Protema de tipo protema proteolipfdica PPA1. Aguda letal o letal

T05C12.7: CG5374 Chaperonina citosolica. Aguda letal o letal

T05H4.6: CG5605 Subunidad 1 del factor de liberacion de cadena peptfdica eucariota. Aguda letal o letal

T10H9.4: CG17248 N-sinaptobrevina; v-SNARE, transporte mediado por vesmulas, vesmula sinaptica.

T14F9.1: CG17332 Subunidad de ATPasa. Retardo del crecimiento o detencion del crecimiento

T20G5.1: CG9012 Cadena pesada de clatrina Aguda letal o letal

T21B10.7: CG7033 Protema 1 de complejo t. Embrionaria letal o esteril

W09B12.1: CG17907 Acetilcolinesterasa.

T27F2.1: CG8264 Miembro de la clase genica homologa SKIP (protema que interactua con Ski) de mairnfero. Aguda letal o letal

ZC434.5: CG5394 Glutamil-ARNt sintetasa mitocondrial predicha (GluRS). Aguda letal o letal

B0511.6: CG6375 Helicasa. Embrionaria letal o esteril

DY3.2: CG10119 Lamina nuclear; protema LMN-1. Retardo del crecimiento o detencion del crecimiento

R13G10.1: CG11397 Homologo de la subunidad SMC4 de condensina mitotica. Tipo silvestre

T26E3.7: CG3612 Protema mitocondrial predicha. Retardo del crecimiento o detencion del crecimiento

Y113G7A.3: CG1250 Activador de GTPasa, transporte de protemas de ER al Golgi, componente del la pila del Golgi. Aguda letal o letal

Y43B11AR.4: CG11276 Protema ribosomica S4 (RpS4), constituyente estructural de ribosoma implicado en la biosmtesis de protemas que es un componente de la subunidad ribosomica pequena citosolica. Aguda letal o letal

Y46G5A.4: CG5931 Gen Y46G5A.4. Aguda letal o letal

Y71F9AL.17: CG7961 Subunidad alfa del complejo de coatomero (COPI). Aguda letal o letal

Y76B12C.7: CG10110 Factor de escision genica y especificidad de poliadenilacion. Embrionaria letal o esteril

Y37D8A.10: CG1751 Funcion desconocida. Embrionaria letal o esteril

CG7765: C06G3.2 Miembro de la clase genica de protema de tipo kinesina.

CG10922: C44E4.4 Protema de union a ARN. Embrionaria letal o esteril

CG4145: F01G12.5 Colageno de tipo IV alfa-2. Embrionaria letal o esteril

CG13391: F28H1.3 Alanil-ARNt sintetasa (AlaRS) citoplasmatica no predicha. Retardo del crecimiento o detencion del crecimiento

CG7765: R05D3.7 Miembro de la clase genica descoordinada. Embrionaria letal o esteril

CG7398: R06A4.4 Miembro de la clase genica de la familia de importina beta. Embrionaria letal o esteril

CG7436: T17E9.2 Funcion desconocida. Embrionaria letal o esteril

CG2666: T25G3.2 Quitina sintasa potencial. Embrionaria letal o esteril

CG17603: W04A8.7 Factor asociado a protema de union a TATA, TAFIL (TAFII250). Embrionaria letal o esteril

Tablas 1-LD/PC/MP/NL

ID de diana: Identificador Dm SEC ID N° NA SEC ID N° AA Funcion (basada en Flybase)

LD027: CG6699 23 24 Protema coatomero beta, subunidad de un complejo multimerico que forma una cubierta de las vesmulas de la membrana

PC027: CG6699 259 260

MP027: CG6699 896 897

NL027: CG6699 1113 1114

Tabla 2-LD

ID de diana: Cebador directo 5' ^ 3' Cebador inverso 5' ^ 3' Secuencia de ADNc (hebra con sentido) 5' ^ 3'

LD001: SEC ID N°: 25 SEC ID N°: 26 SEC ID N°: 1

Tabla 3-LD______________

Secuencia de aminoacidos correspondiente de clon de ADNc

SEC ID N°: 2 (fase +1)

LD002: SEC ID N° 27 SEC ID N° 28 SEC ID N° 3

LD003: SEC ID N° 29 SEC ID N° 30 SEC ID N° 5

LD006: SEC ID N° 31 SEC ID N° 32 SEC ID N° 7

LD007: SEC ID N° 33 SEC ID N° 34 SEC ID N° 9

LD010: SEC ID N° 35 SEC ID N° 36 SEC ID N° 11

LD011: SEC ID N° 37 SEC ID N° 38 SEC ID N° 13

LD014: SEC ID N° 39 SEC ID N° 40 SEC ID N° 15

LD014 F1: SEC ID N° 159

LD014 F2: SEC ID N° 160

LD014 C1: SEC ID N° 161

LD014 C2: SEC ID N° 162

LD015: SEC ID N° 41 SEC ID N° 42 SEC ID N° 17

LD016: SEC ID N° 43 SEC ID N° 44 SEC ID N° 19

LD018: SEC ID N° 45 SEC ID N° 46 SEC ID N° 21

LD027: SEC ID N° 47 SEC ID N° 48 SEC ID N° 23

Tabla 2-PC

PC001: SEC ID N° 261 SEC ID N° 262 SEC ID N° 247

PC003: SEC ID N° 263 SEC ID N° 264 SEC ID N° 249

PC005: SEC ID N° 265 SEC ID N° 266 SEC ID N° 251

PC010: SEC ID N° 267 SEC ID N° 268 SEC ID N° 253

PC014: SEC ID N° 269 SEC ID N° 270 SEC ID N° 255

PC016: SEC ID N° 271 SEC ID N° 272 SEC ID N° 257

PC027: SEC ID N° 273 SEC ID N° 274 SEC ID N° 259

Secuencia de aminoacidos correspondiente de clon de ADNc

SEC ID N°: 4 (fase -3)

SEC ID N°: 6 (fase -2)

SEC ID N°: 8 (fase +1)

SEC ID N°: 10 (fase +1)

SEC ID N°: 12 (fase +1)

SEC ID N°: 14 (fase -1)

SEC ID N°: 16 (fase +3)

SEC ID N°: 18 (fase -1)

SEC ID N°: 20 (fase -2)

SEC ID N°: 22 (fase +2)

SEC ID N°: 24 (fase +1)

Tabla 3-PC

Secuencia de aminoacidos correspondiente de clon de ADNc

SEC ID N°: 248 (fase +1)

SEC ID N°: 250 (fase +2)

SEC ID N°: 252 (fase +3)

SEC ID N°: 254 (fase +3)

SEC ID N°: 256 (fase +3)

SEC ID N°: 258 (fase +2)

SEC ID N°: 260 (fase +1)

Tabla 2-EV Tabla 3-EV

Secuencia de aminoacidos correspondiente de clon de ADNc

SEC ID N°: 514 (fase +3)

SEC ID N°: 516 (fase +1)

SEC ID N°: 518 (fase +3)

SEC ID N°: 520 (fase +1)

EV005: SEC ID N°: 523 SEC ID N°: 524 SEC ID N°: 513

EV009: SEC ID N°: 525 SEC ID N°: 526 SEC ID N°: 515

EV010: SEC ID N°: 527 SEC ID N°: 528 SEC ID N°: 517

EV015: SEC ID N°: 529 SEC ID N°: 530 SEC ID N°: 519

5

EV016: SEC ID N°: 531 SEC ID N°: 532 SEC ID N°: 521

Secuencia de aminoacidos correspondiente de clon de ADNc__________________

SEC ID N°: 522 (fase +2)

Tabla 2-AG Tabla 3-AG

AG001: SEC ID N°: 611 SEC ID N°: 612 SEC ID N°: 601

AG005: SEC ID N°: 613 SEC ID N°: 614 SEC ID N°: 603

AG010: SEC ID N°: 615 SEC ID N°: 616 SEC ID N°: 605

AG014: SEC ID N°: 617 SEC ID N°: 618 SEC ID N°: 607

AG016: SEC ID N°: 619 SEC ID N°: 620 SEC ID N°: 609

Secuencia de aminoacidos correspondiente de clon de ADNc

SEC ID N°: 602 (fase +1)

SEC ID N°: 604 (fase +2)

SEC ID N°: 606 (fase +3)

SEC ID N°: 608 (fase +3)

SEC ID N°: 610 (fase +1)

5 Tabla 2-TC Tabla 3-TC

TC001: SEC ID N°: 803 SEC ID N°: 804 SEC ID N°: 793

TC002: SEC ID N°: 805 SEC ID N°: 806 SEC ID N°: 795

TC010: SEC ID N°: 807 SEC ID N°: 808 SEC ID N°: 797

TC014: SEC ID N°: 809 SEC ID N°: 810 SEC ID N°: 799

TC015: SEC ID N°: 811 SEC ID N°: 812 SEC ID N°: 801

Secuencia de aminoacidos correspondiente de clon de ADNc

SEC ID N°: 794 (fase +1)

SEC ID N°: 796 (fase +1)

SEC ID N°: 798 (fase +3)

SEC ID N°: 800 (fase +1)

SEC ID N°: 802 (fase +2)

Tabla 2-MP

MP001: SEC ID N°: 898 SEC ID N°: 899 SEC ID N°: 888

MP002: SEC ID N°: 900 SEC ID N°: 901 SEC ID N°: 890

MP010: SEC ID N°: 902 SEC ID N°: 903 SEC ID N°: 892

MP016: SEC ID N°: 904 SEC ID N°: 905 SEC ID N°: 894

MP027: SEC ID N°: 906 SEC ID N°: 907 SEC ID N°: 896

Tabla 2-NL Tabla 3-NL

NL001: SEC ID N° 1117 SEC ID N° 1118 SEC ID N° 1071

NL002: SEC ID N° 1119 SEC ID N° 1120 SEC ID N° 1073

NL003: SEC ID N° 1121 SEC ID N° 1122 SEC ID N° 1075

NL004: SEC ID N° 1123 SEC ID N° 1124 SEC ID N° 1077

NL005: SEC ID N° 1125 SEC ID N° 1126 SEC ID N° 1079

NL006: SEC ID N° 1127 SEC ID N° 1128 SEC ID N° 1081

NL007: SEC ID N° 1129 SEC ID N° 1130 SEC ID N° 1083

NL008: SEC ID N° 1131 SEC ID N° 1132 SEC ID N° 1085

NL009: SEC ID N° 1133 SEC ID N° 1134 SEC ID N° 1087

NL010: SEC ID N° 1135 SEC ID N° 1136 SEC ID N° (extremo a terminal) SEC ID N° (extremo C 1089 mino 1115 terminal)

NL011: SEC ID N° 1137 SEC ID N° 1138 SEC ID N° 1091

NL012: SEC ID N° 1139 SEC ID N° 1140 SEC ID N° 1093

NL013: SEC ID N° 1141 SEC ID N° 1142 SEC ID N° 1095

NL014: SEC ID N° 1143 SEC ID N° 1144 SEC ID N° 1097

NL015: SEC ID N° 1145 SEC ID N° 1146 SEC ID N° 1099

NL016: SEC ID N° 1147 SEC ID N° 1148 SEC ID N° 1101

Tabla 3-MP

Secuencia de aminoacidos correspondiente de clon de ADNc

SEC ID N°: 889 (fase +1)

SEC ID N°: 891 (fase +2)

SEC ID N°: 893 (fase +3)

SEC ID N°: 895 (fase +1)

SEC ID N°: 897 (fase +3)

Secuencia de aminoacidos correspondiente de clon de ADNc

SEC ID N°: 1072 (fase +2)

SEC ID N°: 1074 (fase +1)

SEC ID N°: 1076 (fase +2)

SEC ID N°: 1078 (fase +1)

SEC ID N°: 1080 (fase +1)

SEC ID N°: 1082 (fase +3)

SEC ID N°: 1084 (fase +2)

SEC ID N°: 1086 (fase +1)

SEC ID N°: 1088 (fase +1)

SEC ID N° amino term SEC ID N° carboxilo te: 1090 (extremo linal) (fase +2) 1116 (extremo 5rminal) (fase +3)

SEC ID N°: 1092 (fase +2)

SEC ID N°: 1094 (fase +2)

SEC ID N°: 1096 (fase +2)

SEC ID N°: 1098 (fase +2)

SEC ID N°: 1100 (fase +1)

SEC ID N°: 1102 (fase +2)

Secuencia de aminoacidos correspondiente de clon de ADNc

SEC ID N°: 1104 (fase +2)

SEC ID N°: 11,06 (fase +2)

SEC ID N°: 1108 (fase +2)

SEC ID N°: 1110 (fase +2)

SEC ID N°: 1112 (fase +2)

SEC ID N°: 1114 (fase +2)

NL018: SEC ID N°: 1149 SEC ID N° 1150 SEC ID N°: 1103

NL019: SEC ID N°: 1151 SEC ID N° 1152 SEC ID N°: 1105

NL021: SEC ID N°: 1153 SEC ID N° 1154 SEC ID N°: 1107

NL022: SEC ID N°: 1155 SEC ID N° 1156 SEC ID N°: 1109

NL023: SEC ID N°: 1157 SEC ID N° 1158 SEC ID N°: 1111

NL027: SEC ID N°: 1159 SEC ID N° 1160 SEC ID N°: 1113

Tabla 2-CS Tabla 3-CS

Secuencia de aminoacidos correspondiente de clon de ADNc

SEC ID N°: 1683 (fase +1)

SEC ID N°: 1685 (fase +1)

SEC ID N°: 1687 (fase +1)

SEC ID N°: 1689 (fase +1)

SEC ID N°: 1691 (fase +3)

SEC ID N°: 1693 (fase +1)

SEC ID N°: 1695 (fase +1)

SEC ID N°: 1697 (fase +2)

SEC ID N°: 1699 (fase +2)

SEC ID N°: 1701 (fase +1)

SEC ID N°: 1703 (fase -3)

SEC ID N°: 1705 (fase +2)

CS001: SEC ID N° 1706 SEC ID N° 1707 SEC ID N° 1682

CS002: SEC ID N° 1708 SEC ID N° 1709 SEC ID N° 1684

CS003: SEC ID N° 1710 SEC ID N° 1711 SEC ID N° 1686

CS006: SEC ID N° 1712 SEC ID N° 1713 SEC ID N° 1688

CS007: SEC ID N° 1714 SEC ID N° 1715 SEC ID N° 1690

CS009: SEC ID N° 1716 SEC ID N° 1717 SEC ID N° 1692

CS011: SEC ID N° 1718 SEC ID N° 1719 SEC ID N° 1694

CS013: SEC ID N° 1720 SEC ID N° 1721 SEC ID N° 1696

CS014: SEC ID N° 1722 SEC ID N° 1723 SEC ID N° 1698

CS015: SEC ID N° 1724 SEC ID N° 1725 SEC ID N° 1700

CS016: SEC ID N° 1726 SEC ID N° 1727 SEC ID N° 1702

CS018: SEC ID N° 1728 SEC ID N° 1729 SEC ID N° 1704

Tabla 2-PX Tabla 3-PX

Secuencia de aminoacidos correspondiente de clon de ADNc

SEC ID N°: 2101 (fase +1)

SEC ID N°: 2103 (fase +3)

SEC ID N°: 2105 (fase +3)

SEC ID N°: 2107 (fase +3)

SEC ID N°: 2109 (fase +2)

PX001: SEC ID N°: 2110 SEC ID N°: 2111 SEC ID N°: 2100

PX009: SEC ID N°: 2112 SEC ID N°: 2113 SEC ID N°: 2102

PX010: SEC ID N°: 2114 SEC ID N°: 2115 SEC ID N°: 2104

PX015: SEC ID N°: 2116 SEC ID N°: 2117 SEC ID N°: 2106

PX016: SEC ID N°: 2118 SEC ID N°: 2119 SEC ID N°: 2108

5

Tabla 2-AD Tabla 3-AD

AD001: SEC ID N° 2374 SEC ID N° 2375 SEC ID N° 2364

AD002: SEC ID N° 2376 SEC ID N° 2377 SEC ID N° 2366

AD009: SEC ID N° 2378 SEC ID N° 2379 SEC ID N° 2368

AD015: SEC ID N° 2380 SEC ID N° 2381 SEC ID N° 2370

AD016: SEC ID N° 2382 SEC ID N° 2383 SEC ID N° 2372

Secuencia de aminoacidos correspondiente de clon de ADNc

SEC ID N°: 2365 (fase +1)

SEC ID N°: 2367 (fase +2)

SEC ID N°: 2369 (fase +3)

SEC ID N°: 2371 (fase +2)

SEC ID N°: 2373 (fase +2)

Tabla 4- LD/MP/NL

ID de diana: SEC ID N° N° de Ejemplo Gi y especie

LD027: 121 66501387 (Apis mellifera)

LD027: 122 77326476 (Chironomus tentans)

LD027: 123 90129719 (Bicyclus anynana)

MP027: 1010 47522167 (Acyrthosiphon pisum)

NL027: 1437 49543279 (Rhipicephalus appendiculatus)

10 Tabla 5-MP

ID de diana: SEC ID N° N° de Ejemplo Gi y especie

MP027: 1023 27540724 (Meloidogyne hapla)

MP027: 1024 34026304 (Meloidogyne arenaria)

MP027: 1025 34028558 (Meloidogyne iavanica)

Tabla 6-LD/MP

ID de diana: SEC ID N° N° de Ejemplo Gi y especie

LD027: 157 90546087 (Gloeophyllum trabeum)

LD027: 158 50292600 (Candida glabrata CBS 138)

MP027: 1040 60673889 (Alternaria brassicicola)

Tabla 8-LD

ID de diana: Cebadores directos 5' ^ 3' Cebadores inversos 5' ^ 3' Secuencia de ADN de ARNbc (hebra con sentido) 5' ^ 3'

LD001: SEC ID N° 164 SEC ID N° 165 SEC ID N°: 163

: SEC ID N° 166 SEC ID N° 167

LD002: SEC ID N° 169 SEC ID N° 170 SEC ID N°: 168

: SEC ID N° 171 SEC ID N° 172

LD003: SEC ID N° 174 SEC ID N° 175 SEC ID N°: 173

: SEC ID N° 176 SEC ID N° 177

LD006: SEC ID N° 179 SEC ID N° 180 SEC ID N°: 178

: SEC ID N° 181 SEC ID N° 182

LD007: SEC ID N° 184 SEC ID N° 185 SEC ID N°: 183

: SEC ID N° 186 SEC ID N° 187

LD010: SEC ID N° 189 SEC ID N° 190 SEC ID N°: 188

: SEC ID N° 191 SEC ID N° 192

LD011: SEC ID N° 194 SEC ID N° 195 SEC ID N°: 193

: SEC ID N° 196 SEC ID N° 197

LD014: SEC ID N° 199 SEC ID N° 200 SEC ID N°: 198

: SEC ID N° 201 SEC ID N° 202

LD014 F1: SEC ID N° 204 SEC ID N° 205 SEC ID N°: 203

: SEC ID N° 206 SEC ID N° 207

LD014 F2: SEC ID N° 209 SEC ID N° 210 SEC ID N°: 208

: SEC ID N° 211 SEC ID N° : 212

LD014 C1: SEC ID N°: 213

LD014 C2: SEC ID N°: 214

LD015: SEC ID N° 216 SEC ID N° 217 SEC ID N°: 215

: SEC ID N° 218 SEC ID N° 219

LD016: SEC ID N° 221 SEC ID N° 222 SEC ID N°: 220

: SEC ID N° 223 SEC ID N° 224

LD018: SEC ID N° 226 SEC ID N° 227 SEC ID N°: 225

: SEC ID N° 228 SEC ID N° 229

LD027: SEC ID N° 231 SEC ID N° 232 SEC ID N°: 230

: SEC ID N° 233 SEC ID N° 234

gfp: SEC ID N° 236 SEC ID N° 237 SEC ID N°: 235

: SEC ID N° 238 SEC ID N° 239

5

Tabla 8-PC

PC001: SEC ID N°: 474 SEC ID N°: 476 SEC ID N°: 475 SEC ID N°: 477 SEC ID N°: 473

PC003: SEC ID N°: 479 SEC ID N°: 481 SEC ID N°: 480 SEC ID N°: 482 SEC ID N°: 478

PC005: SEC ID N° SEC ID N° 484 486 SEC ID N° SEC ID N° 485 487 SEC ID N°: 483

PC010: SEC ID N° SEC ID N° 489 491 SEC ID N° SEC ID N° 490 492 SEC ID N°: 488

PC014: SEC ID N° SEC ID N° 494 496 SEC ID N° SEC ID N° 495 497 SEC ID N°: 493

PC016: SEC ID N° SEC ID N° 499 501 SEC ID N° SEC ID N° 500 502 SEC ID N°: 498

PC027: SEC ID N° SEC ID N° 504 506 SEC ID N° SEC ID N° 505 507 SEC ID N°: 503

Tabla 8-EV

EV005: SEC ID N° SEC ID N° 577 579 SEC ID N° SEC ID N° 578 580 SEC ID N°: 576

EV009: SEC ID N° SEC ID N° 582 584 SEC ID N° SEC ID N° 583 585 SEC ID N°: 581

EV010: SEC ID N° SEC ID N° 587 589 SEC ID N° SEC ID N° 588 590 SEC ID N°: 586

EV015: SEC ID N° SEC ID N° 592 594 SEC ID N° SEC ID N° 593 595 SEC ID N°: 591

EV016: SEC ID N° SEC ID N° 597 599 SEC ID N° SEC ID N° 598 600 SEC ID N°: 596

5 Tabla 8-AG

AG001: SEC ID N° SEC ID N° 769 771 SEC ID N° SEC ID N° 770 772 SEC ID N°: 768

AG005: SEC ID N° SEC ID N° 774 776 SEC ID N° SEC ID N° 775 777 SEC ID N°: 773

AG010: SEC ID N° SEC ID N° 779 781 SEC ID N° SEC ID N° 780 782 SEC ID N°: 778

AG014: SEC ID N° SEC ID N° 784 786 SEC ID N° SEC ID N° 785 787 SEC ID N°: 783

AG016: SEC ID N° SEC ID N° 789 791 SEC ID N° SEC ID N° 790 792 SEC ID N°: 788

Tabla 8-TC

TC001: SEC ID N° SEC ID N° 864 866 SEC ID N° SEC ID N° 865 867 SEC ID N°: 863

TC002: SEC ID N° SEC ID N° 869 871 SEC ID N° SEC ID N° 870 872 SEC ID N°: 868

TC010: SEC ID N° SEC ID N° 874 876 SEC ID N° SEC ID N° 875 877 SEC ID N°: 873

TC014: SEC ID N° SEC ID N° 879 881 SEC ID N° SEC ID N° 880 882 SEC ID N°: 878

TC015: SEC ID N° SEC ID N° 884 886 SEC ID N° SEC ID N° 885 887 SEC ID N°: 883

MP001: SEC ID N° SEC ID N° 1042 1044 SEC ID N° SEC ID N° 1043 1045 SEC ID N°: 1041

MP002: SEC ID N° SEC ID N° 1047 1049 SEC ID N° SEC ID N° 1048 1050 SEC ID N°: 1046

MP010: SEC ID N° SEC ID N° 1052 1054 SEC ID N° SEC ID N° 1053 1055 SEC ID N°: 1051

MP016: SEC ID N° SEC ID N° 1057 1059 SEC ID N° SEC ID N° 1058 1060 SEC ID N°: 1056

MP027: SEC ID N° SEC ID N° 1062 1064 SEC ID N° SEC ID N° 1063 1065 SEC ID N°: 1061

Tabla 8-NL

ID de diana: Cebadores directos 5' ^ 3' Cebadores inversos 5' ^ 3' Secuencia de ADN de ARNbc 5' ^ 3'

NL001: SEC ID N° SEC ID N° 1573 1575 SEC ID N° SEC ID N° 1574 1576 SEC ID N°: 1572

NL002: SEC ID N° SEC ID N° 1578 1580 SEC ID N° SEC ID N° 1579 1581 SEC ID N°: 1577

NL003: SEC ID N° SEC ID N° 1583 1585 SEC ID N° SEC ID N° 1584 1586 SEC ID N°: 1582

NL004: SEC ID N° SEC ID N° 1588 1590 SEC ID N° SEC ID N° 1589 1591 SEC ID N°: 1587

NL005: SEC ID N° SEC ID N° 1593 1595 SEC ID N° SEC ID N° 1594 1596 SEC ID N°: 1592

NL006: SEC ID N° SEC ID N° 1598 1600 SEC ID N° SEC ID N° 1599 1601 SEC ID N°: 1597

NL007: SEC ID N° SEC ID N° 1603 1605 SEC ID N° SEC ID N° 1604 1606 SEC ID N°: 1602

NL008: SEC ID N° SEC ID N° 1608 1610 SEC ID N° SEC ID N° 1609 1611 SEC ID N°: 1607

NL009: SEC ID N° SEC ID N° 1613 1615 SEC ID N° SEC ID N° 1614 1616 SEC ID N°: 1612

NL010: SEC ID N° SEC ID N° 1618 1620 SEC ID N° SEC ID N° 1619 1621 SEC ID N°: 1617

NL011: SEC ID N° SEC ID N° 1623 1625 SEC ID N° SEC ID N° 1624 1626 SEC ID N°: 1622

NL012: SEC ID N° SEC ID N° 1628 1630 SEC ID N° SEC ID N° 1629 1631 SEC ID N°: 1627

NL013: SEC ID N° SEC ID N° 1633 1635 SEC ID N° SEC ID N° 1634 1636 SEC ID N°: 1632

NL014: SEC ID N° SEC ID N° 1638 1640 SEC ID N° SEC ID N° 1639 1641 SEC ID N°: 1637

NL015: SEC ID N° SEC ID N° 1643 1645 SEC ID N° SEC ID N° 1644 1646 SEC ID N°: 1642

NL016: SEC ID N° SEC ID N° 1648 1650 SEC ID N° SEC ID N° 1649 1651 SEC ID N°: 1647

NL018: SEC ID N° SEC ID N° 1653 1655 SEC ID N° SEC ID N° 1654 1656 SEC ID N°: 1652

NL019: SEC ID N° SEC ID N° 1658 1660 SEC ID N° SEC ID N° 1659 1661 SEC ID N°: 1657

NL021: SEC ID N° SEC ID N° 1663 1665 SEC ID N° SEC ID N° 1664 1666 SEC ID N°: 1662

NL022: SEC ID N° SEC ID N° 1668 1670 SEC ID N° SEC ID N° 1669 1671 SEC ID N°: 1667

NL023: SEC ID N° SEC ID N° 1673 1675 SEC ID N° SEC ID N° 1674 1676 SEC ID N°: 1672

NL027: SEC ID N° SEC ID N° 1678 1680 SEC ID N° SEC ID N° 1679 1681 SEC ID N°: 1677

5 Tabla 8-CS

CS001: SEC ID N° SEC ID N° 2041 2043 SEC ID N° SEC ID N° 2042 2044 SEC ID N°: 2040

CS002: SEC ID N° SEC ID N° 2046 2048 SEC ID N° SEC ID N° 2047 2049 SEC ID N°: 2045

CS003: SEC ID N° SEC ID N° 2051 2053 SEC ID N° SEC ID N° 2052 2054 SEC ID N°: 2050

CS006: SEC ID N° SEC ID N° 2056 2058 SEC ID N° SEC ID N° 2057 2059 SEC ID N°: 2055

CS007: SEC ID N° SEC ID N° 2061 2063 SEC ID N° SEC ID N° 2062 2064 SEC ID N°: 2060

CS009: SEC ID N° SEC ID N° 2066 2068 SEC ID N° SEC ID N° 2067 2069 SEC ID N°: 2065

CS011: SEC ID N° SEC ID N° 2071 2073 SEC ID N° SEC ID N° 2072 2074 SEC ID N°: 2070

CS013: SEC ID N° SEC ID N° 2076 2078 SEC ID N° SEC ID N° 2077 2079 SEC ID N°: 2075

CS014: SEC ID N° SEC ID N° 2081 2083 SEC ID N° SEC ID N° 2082 2084 SEC ID N°: 2080

CS015: SEC ID N° SEC ID N° 2086 2088 SEC ID N° SEC ID N° 2087 2089 SEC ID N°: 2085

CS016: SEC ID N° SEC ID N° 2091 2093 SEC ID N° SEC ID N° 2092 2094 SEC ID N°: 2090

CS018: SEC ID N° SEC ID N° 2096 2098 SEC ID N° SEC ID N° 2097 2099 SEC ID N°: 2095

Tabla 8-PX

PX001: SEC ID N° SEC ID N° 2340 2342 SEC ID N° SEC ID N° 2341 2343 SEC ID N°: 2339

PX009: SEC ID N° SEC ID N° 2345 2347 SEC ID N° SEC ID N° 2346 2348 SEC ID N°: 2344

PX010: SEC ID N° SEC ID N° 2350 2352 SEC ID N° SEC ID N° 2351 2353 SEC ID N°: 2349

PX015: SEC ID N° SEC ID N° 2355 2357 SEC ID N° SEC ID N° 2356 2358 SEC ID N°: 2354

PX016: SEC ID N° SEC ID N° 2360 2362 SEC ID N° SEC ID N° 2361 2363 SEC ID N°: 2359

Tabla 8-AD

AD001: SEC ID N° SEC ID N° 2462 2464 SEC ID N° SEC ID N° 2463 2465 SEC ID N°: 2461

AD002: SEC ID N° SEC ID N° 2467 2469 SEC ID N° SEC ID N° 2468 2470 SEC ID N°: 2466

AD009: SEC ID N° SEC ID N° 2472 2474 SEC ID N° SEC ID N° 2473 2475 SEC ID N°: 2471

AD015: SEC ID N° SEC ID N° 2477 2479 SEC ID N° SEC ID N° 2478 2480 SEC ID N°: 2476

AD016: SEC ID N° SEC ID N° 2482 2484 SEC ID N° SEC ID N° 2483 2485 SEC ID N°: 2481

Bioensayo: Cepa hospedadora bacteriana Tratamiento N° de supervivientes Peso total Peso promedio/larva

I: solamente dieta 8* 1,0245 0,1281

AB309-105: pGN29 8* 1,0124 0,1266

pGBNJ003 clon 1: 4 0,0273 0,0068

pGBNJ003 clon 2: 1 0,0091 0,0091

pGBNJ003 clon 3: 25 0,7113 0,0285

pGBNJ003 clon 4: 12 0,1379 0,0115

pGBNJ003 clon 5: 12 0,1808 0,0151

II: solamente dieta 8* 1,0435 0,1304

BL21 (DE3): pGN29 8* 1,1258 0,1407

pGBNJ003 clon 1: 33 0,5879 0,0178

pGBNJ003 clon 2: 42 0,8034 0,0191

pGBNJ003 clon 3: 33 0,3441 0,0104

pGBNJ003 clon 4: 21 0,1738 0,0083

pGBNJ003 clon 5: 33 0,3628 0,0120

Tablas 10(a)-NL

ARNi: Media de % de supervivencia (dfas despues del inicio) Analisis de • • 1 supervivencia

0: 1 2 3 4 5 6 7 8

gfp: 100 98 90 82 68 60 44 32 20 -

solamente dieta: 100 98 96 86 74 68 58 54 38 -

NL002: 100 98 90 76 68 34 6 0 0 +

NL003: 100 98 74 48 36 22 12 2 0 +

NL005: 100 100 74 56 40 20 16 6 4 +

NL010: 100 96 74 56 48 30 18 12 8 +

1 = Los datos se analizaron usando el analisis de curva de supervivencia de Kaplan-Meier 5 Tablas 10(a)-NL (continuacion)____________________________________________________

: Chi cuadrado valor de P Dif. Sig.2

dieta frente a:

NL002: 29,06 < 0,0001 Sf

NL003: 39,59 < 0,0001 Sf

NL005: 29,55 < 0,0001 Sf

NL010: 21,04 < 0,0001 Sf

ARNbc de gfp frente a:

NL002: 15,09 0,0001 Sf

NL003: 22,87 < 0,0001 Sf

NL005: 15,12 < 0,0001 Sf

NL010: 8,838 0,0029 Sf

dieta frente a ARNbc de gfp: 4,030 0,0447 (~0,05) No

2 alfa < 0,05 Tablas 10(b)-NL _______

0: 1 2 3 4 5 6 7 8

gfp: 100 96 84 82 76 70 54 50 44 -

solamente dieta: 100 96 88 82 76 70 54 50 44 -

NL009: 100 94 75 63 42 30 24 22 14 +

NL016: 100 94 84 78 54 44 36 18 14 +

1 = Los datos se analizaron usando el analisis de curva de supervivencia de Kaplan-Meier

: Chi cuadrado valor de P Dif. Sig.2

dieta frente a:

NL009: 11,98 0,0005 Si

NL016: 8,98 0,0027 Si

ARNbc de gfp frente a:

NL009: 13,69 0,0002 Si

NL016: 11,37 0,0007 Si

dieta frente a ARNbc de gfp:: 0,03317 0,8555 No

alfa < 0,05

Tablas 10(c)-NL

0: 1 2 3 4 5 6 7 8

gfp: 100 92 84 78 72 62 58 56 48 -

solamente dieta: 100 84 72 68 64 58 52 42 42 -

NL014: 100 86 68 60 46 32 24 18 14 +

NL018: 100 82 70 54 40 30 18 14 12 +

5 1 = Los datos se analizaron usando el analisis de curva de supervivencia de Kaplan-Meier

: Chi cuadrado valor de P Dif. Sig.2

dieta frente a:

NL014: 8,088 0,0045 Si

NL018: 10,47 0,0012 Si

ARNbc de gfp frente a:

NL014: 14,55 0,0001 Si

NL018: 17,64 < 0,0001 Si

dieta frente a ARNbc de gfp:: 0,6548 0,4184 No

alfa < 0,05

Tablas 10(d)-NL

ARNi: Media de % de supervivencia (dfas despues del inicio) Analisis de supervivenci a1

0: 1 2 3 4 5 6 7 8 9

gfp: 100 96 84 84 72 68 68 66 66 62 -

solamente dieta: 100 96 86 82 74 72 70 70 66 58 -

NL013: 100 94 82 68 50 40 30 28 20 20 +

NL015: 100 100 72 30 18 12 8 6 6 6 +

NL021: 100 100 84 58 50 44 40 34 34 22 +

10 1 = Los datos se analizaron usando el analisis de curva de supervivencia de Kaplan-Meier

Tablas 10(d)-NL (continuacion)_________________________________________________

: Chi cuadrado valor de P Dif. Sig.2

dieta frente a:

NL013: 15,73 < 0,0001 Si

NL015: 39,44 < 0,0001 Si

NL021: 12,75 0,0004 Si

ARNbc de gfp frente a:

NL013: 16,42 < 0,0001 Si

NL015: 39,15 < 0,0001 Si

NL021: 14,1 0,0002 Si

: Chi cuadrado valor de P Dif. Sig.2

dieta frente a ARNbc de gfp:: 0,1031 0,7481 No

alfa < 0,05

Tabla 11-NL

ARNi NL002: Media de % de su pervivencia (dfas despues del inicio) Analisis de supervivenci

0: 1 2 3 4 5 6 7

solamente dieta: 100 100 96 90 86 78 78 78 -

1 pg/pl: 100 84 80 44 26 8 6 6 +

0,2 pg/pl: 100 84 60 12 8 4 2 2 +

0,08 pg/pl: 100 84 62 18 14 6 6 6 +

0,04 pg/pl: 100 84 48 24 22 22 22 22 +

5

: Chi cuadrado valor de P Dif. Sig.2

dieta frente a:

NL002 1 pg/pl: 57,53 < 0,0001 Si

NL002 0,2 pg/pl: 74,54 < 0,0001 Si

NL002 0,08 pg/pl: 64 < 0,0001 Si

NL002 0,04 pg/pl: 39,49 < 0,0001 Si

alfa < 0,05

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1. Una celula de planta transformada con y que comprende un polinucleotido que codifica un ARN bicatenario, comprendiendo dicho ARN bicatenario hebras complementarias hibridadas, en el que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleotido seleccionado entre el grupo que consiste en:

(i) polirribonucleotidos complementarios a al menos 21 nucleotidos contiguos de un gen diana representado por cualquiera de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040y1061,

(ii) polirribonucleotidos complementarios a al menos 21 nucleotidos contiguos de un gen diana que codifica la secuencia de aminoacidos representado por cualquiera de las SEC ID N°: 1114, 24, 260 y 897, y

(iii) polirribonucleotidos que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con los polirribonucleotidos de (i)

o (ii).
2. Una planta transformada con y que comprende un polinucleotido que codifica un ARN bicatenario, comprendiendo dicho ARN bicatenario hebras complementarias hibridadas, en el que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleotido seleccionado entre el grupo que consiste en:

(i) polirribonucleotidos complementarios a al menos 21 nucleotidos contiguos de un gen diana representado por cualquiera de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040y1061,

(ii) polirribonucleotidos complementarios a al menos 21 nucleotidos contiguos de un gen diana que codifica la secuencia de aminoacidos representado por cualquiera de las SEC ID N°: 1114, 24, 260 y 897, y

(iii) polirribonucleotidos que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con los polirribonucleotidos de (i)

o (ii).
3. Una planta que comprende un ARN bicatenario, comprendiendo dicho ARN bicatenario hebras complementarias hibridadas, en el que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleotido seleccionado entre el grupo que consiste en:

(i) polirribonucleotidos complementarios a al menos 21 nucleotidos contiguos de un gen diana representado por cualquiera de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040y1061,

(ii) polirribonucleotidos complementarios a al menos 21 nucleotidos contiguos de un gen diana que codifica la secuencia de aminoacidos representado por cualquiera de las SEC ID N°: 1114, 24, 260 y 897, y

(iii) polirribonucleotidos que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con los polirribonucleotidos de (i) o (ii).
4. Una semilla de la planta de las reivindicaciones 2 o 3, en la que dicha semilla comprende dicho ARN bicatenario.
5. Un producto producido a partir de la planta de la reivindicacion 2 o 3, en el que dicho producto comprende dicho ARN bicatenario.
6. Un pesticida que comprende la planta de la reivindicacion 3.
7. Un metodo para controlar la infestacion por plaga de insectos, que comprende proporcionar a una plaga material vegetal que comprende un ARN bicatenario, comprendiendo dicho aRn bicatenario hebras complementarias hibridadas, en el que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleotido seleccionado entre el grupo que consiste en:

(i) polirribonucleotidos complementarios a al menos 21 nucleotidos contiguos de un gen diana representado por cualquiera de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040y1061,

(ii) polirribonucleotidos complementarios a al menos 21 nucleotidos contiguos de un gen diana que codifica la secuencia de aminoacidos representado por cualquiera de las SEC ID N°: 1114, 24, 260 y 897, y

(iii) polirribonucleotidos que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con los polirribonucleotidos de (i) o (ii)
8. Un metodo para controlar la infestacion por plaga de insectos, que comprende proporcionar un ARN bicatenario en la dieta de dicha plaga de insecto o rociar una superficie vegetal con un ARN bicatenario, comprendiendo dicho ARN bicatenario hebras complementarias hibridadas, en el que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleotido seleccionado entre el grupo que consiste en:

10

15

20

(i) polirribonucleotidos complementary a al menos 21 nucleotidos contiguos de un gen diana representado por cualquiera de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040y1061,

TRG406415

(ii) polirribonucleotidos complementarios a al menos 21 nucleotidos contiguos de un gen diana que codifica la secuencia de aminoacidos representado por cualquiera de las SEC ID N°: 1114, 24, 260 y 897, y

(iii) polirribonucleotidos que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con los polirribonucleotidos de (i)

o (ii)
9. Un metodo para mejorar el rendimiento de cultivo, que comprende:

a) introducir en la planta un polinucleotido que codifica un ARN bicatenario, comprendiendo dicho ARN bicatenario hebras complementarias hibridadas, en el que al menos una de dichas hebras comprende un polirribonucleotido seleccionado entre el grupo que consiste en:

(i) polirribonucleotidos complementarios a al menos 21 nucleotidos contiguos de un gen diana representado por cualquiera de las SEC ID N°: 1113, 1437, 1677, 23, 121 a 123, 157, 158, 230, 259, 503, 896, 1010, 1023 a 1025, 1040y1061,

(ii) polirribonucleotidos complementarios a al menos 21 nucleotidos contiguos de un gen diana que codifica la secuencia de aminoacidos representado por cualquiera de las SEC ID N°: 1114, 24, 260 y 897, y

(iii) polirribonucleotidos que tienen al menos un 85 % de identidad de secuencia con los polirribonucleotidos de (i)

o (ii); y

b) cultivar dicha planta para permitir la expresion de dicho ARN bicatenario, en el que dicha expresion inhibe la alimentacion por una plaga de insectos y la perdida de rendimiento debido a la infestacion por la plaga.
10. Uso de una celula de planta de acuerdo con la reivindicacion 1, una planta de acuerdo con la reivindicacion 2 o 3, o un producto de acuerdo con la reivindicacion 5, para tratar las infestaciones por insectos de plantas.