CN105274122B - 小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用，提供了：分离的多核苷酸，其序列如SEQ ID NO:1、2所示；一种载体，它含有SEQ ID NO:1或2所示的多核苷酸；一种重组载体，含有如SEQ ID NO:7所示的序列；一种小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体及制备方法，是以pEarleyGate 303为骨架载体，在重组位点处置换插入顺序连接的EcoR I、AsiS I、P35S启动子、Not I、SEQ ID NO:1的序列、Sbf I、ACTIN的第四个内含子、BbvC I、SEQ ID NO:1的反向互补序列、Asc I、T35S终止子、EcoR I。

Description

小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种RNAi表达载体及其构建方法和应用，尤其涉及一种小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用。

背景技术

小菜蛾(Plutella xylostella)又名小青虫、两头尖，是白菜、油菜、花椰菜、甘蓝、萝卜等十字花科蔬菜的重要害虫，也是一种在世界上分布广泛的害虫。初龄幼虫仅取食叶肉，留下表皮，在菜叶上形成一个个透明的斑；3～4龄幼虫可将菜叶食成孔洞和缺刻，严重时全叶被吃成网状。由于其发生世代多，繁殖能力强，寄主范围广，抗药性水平高，小菜蛾逐渐取代菜青虫而成为蔬菜第1号害虫，给防治工作带来极大困难。小菜蛾是白菜、油菜、花椰菜和甘蓝等蔬菜的重要害虫之一，目前主要依赖化学农药进行防治。化学农药(甲氨基阿维菌素、氟虫腈、溴虫腈、吡虫啉等)的大量使用，一方面使小菜蛾产生了抗药性，用药量越来越大、抗药性越来越强，形成恶性循环；另一方面蔬菜农药残留直接威胁着人们的生命健康。据统计，我国有200多个癌症村；我国是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死约15万人；同时，胃癌和肠癌在我国也是高发癌症。研究发现，以上癌症的发生主要是由于化学农药残留造成的。

通过基因干涉来防治小菜蛾具有绿色、环保、可持续、经济有效等特点。有利于保护人们生命健康，由于RNAi具有高度的特异性，对非靶标基因或同源性不高的基因没有效果，具有极高的种间特异性。小菜蛾基因干涉防治成败的关键是需要找到有效的靶标基因。关键靶标基因必须具备如下几个特征：1、靶标基因在小菜蛾各个生理小种中高度保守，通过一个基因干涉片段可以对各种不同小菜蛾的生理小种都能起到干涉作用，即水平抗性强；2、靶标基因是小菜蛾生长发育的必须基因，一旦受到干涉，小菜蛾便可立即死亡；3、靶标基因对RNA干涉高度敏感：在小菜蛾体内表达丰度低，低剂量的小RNA即可达到彻底干涉的目的(垂直抗性)。

TOR(Target of Rapamycin)是一种进化中保守的丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，在酵母、动物、植物中通过整合营养和能量信号来促进细胞的增殖和生长。TOR信号通路在动物胚胎形成、分生组织激活，植物根和叶的生长、开花、衰老和生命周期的控制中都扮演着关键作用。近几年研究发现，TOR还具有调节核糖体的生物合成、促进翻译、新陈代谢调节和抑制自噬的功能。在模式动物线虫、果蝇和小鼠中，TOR基因的缺失能够导致动物胚胎致死，说明TOR基因是动物体内的必须基因，在动物的生长发育进程中扮演着核心作用。我们的研究表明，TOR基因是防治小菜蛾的关键靶标基因，TOR蛋白的第一代和第二代抑制剂可以显著抑制小菜蛾幼虫的生长发育。构建TOR基因的RNAi载体来干扰小菜蛾的TOR基因在小菜蛾中还没有被研究过。

发明内容

本发明的目的是提供小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体及其构建方法和应用。

在本发明的第一方面，提供一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。提供另一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有SEQ ID NO:1或2所示的多核苷酸。

在本发明的另一方面，提供一种重组载体，含有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，所述重组载体是以pCR8/GW/TOPO载体为骨架载体，在多克隆酶切位点处插入顺序连接的EcoR I酶切位点、AsiS I酶切位点、P35S启动子、NotI酶切位点、SEQ ID NO:1所示的序列、SbfI酶切位点、ACTIN的第四个内含子、BbvC I酶切位点、SEQ ID NO:1所示序列的反向互补序列、Asc I酶切位点、T35S终止子、EcoR I酶切位点。

在本发明的另一方面，提供一种小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体，所述RNAi表达载体是以植物表达载体pEarleyGate 303为骨架载体，在重组位点处置换插入顺序连接的EcoR I酶切位点、AsiS I酶切位点、P35S启动子、Not I酶切位点、SEQ ID NO:1所示的序列、SbfI酶切位点、ACTIN的第四个内含子、BbvC I酶切位点、SEQ ID NO:1所示序列的反向互补序列、Asc I酶切位点、T35S终止子、EcoR I酶切位点。

在本发明的另一方面，提供一种含有前述小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体的微生物转化体。

在本发明的另一方面，提供一种前述的小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体的制备方法，包括如下步骤：

(1)合成如SEQ ID NO:1和2所示的序列，SEQ ID NO:1所示的序列命名为TOR-RNAi，SEQ ID NO:2所示的序列命名为35S-IN4，对pCR8/GW/TOPO载体和35S-IN4序列进行酶切连接，获得含有35S-IN4的载体，命名为p35S-IN4；

(2)将步骤(1)合成的TOR-RNAi序列和载体p35S-IN4进行酶切连接得到载体p35S-TORIN4；

(3)将载体p35S-TORIN4和TOR-RNAi序列进行酶切连接得到载体p35S-TORRI，p35S-TORRI中含有如Seq ID No：7序列所示的序列；

(4)将p35S-TORRI中插入的Seq ID No：7序列重组到植物表达载体pEarleyGate303上，得到小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体。

在本发明的另一方面，提供一种SEQ ID NO:1所示的多核苷酸的用途，用于作为制备特异性干扰小菜蛾基因表达或抑制亚小菜蛾生长的干扰分子的抑制或沉默靶标。

在本发明的另一方面，提供一种SEQ ID NO:1所示的多核苷酸或SEQ ID NO:2所示的多核苷酸或含有SEQ ID NO:1或2所示的多核苷酸的载体或含有序列如SEQ ID NO:7所示的重组载体或前述小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体在培育抗小菜蛾的转基因植物中的应用。

本发明的有益效果是：构建了一种针对小菜蛾TOR基因的RNAi载体，实验证明将该载体转入到模式植物拟南芥中后，转基因拟南芥植株对小菜蛾的抗性明显增加，证明本发明构建的小菜蛾TOR基因的RNAi载体十分有效。本发明对培育抗虫植物具有重要意义，有很好的应用前景，对降低农药使用、延缓害虫抗性的产生、对维持生态系统的平衡和可持续发展也具有重大的应用价值。

附图说明

图1为载体p35S-IN4的结构示意图。

图2为载体p35S-TORRI构建过程示意图。

图3为载体p35S-TORRI酶切后电泳条带图；其中条带1、2为p35S-TORRI载体用AsiSI和Asc I酶切后的产物，条带3、4为p35S-TORRI载体用BbvC I和Asc I酶切后的产物。

图4为载体pE35S-TORRI构建过程示意图。

图5为转基因拟南芥基因组DNA的PCR检测结果；其中：M为Trans2k plus DNAmarker，P为正对照p35S-TORRI质粒，WT为负对照野生型Co1-0，1～19为转基因拟南芥。

图6为饲喂拟南芥转基因植株的小菜蛾的食叶量数据图。

图7为饲喂拟南芥转基因植株后小菜蛾结茧前幼虫的平均质量数据图。

图8为饲喂拟南芥转基因植株后结茧前小菜蛾幼虫的存活率数据图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

主要试剂及生产者：

酶EcoR I、AsiS I、BbvC I、Asc I、Not I、Sbf I均为(NEB公司，美国)，pCR8/GW/TOPO载体(Invitrogen公司，美国)，胶回收试剂盒(Takara公司，日本)，T4DNA连接酶(Takara公司，日本)，DH5α感受态细胞(Takara公司，日本)，质粒提取试剂盒(Takara公司，日本),农杆菌LBA4404菌株、pEarleyGATE303载体(重庆大学生命科学学院植物分子育种实验室提供)，DNA提取试剂盒(天根公司，中国)，去磷酸化试剂盒(Takara公司，日本)，Taq DNA Polymerase(全式金公司，中国)，Gateway LR Clonase enzymemix(Invitrogen公司，美国)，质粒DNA提取试剂盒(Takara公司，日本)。本发明实施例中的各序列合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1小菜蛾TOR基因RNAi载体的构建

一、小菜蛾TOR基因RNAi片段的获取及合成

通过小菜蛾基因组数据库(http://iae.fafu.edu.cn/DBM/)，找出小菜蛾TOR基因的全长CDS序列：TOR1：7140bp；TOR2：6882bp。用小菜蛾TOR的CDS在NCBI中进行同源比对，找出三段最保守的序列，融合三条序列。在融合的序列的5’端加上Asc I-Not I酶切位点，在3’端加上SbfI-BbvC I酶切位点，将该序列命名为TOR-RNAi(658bp)，序列如序列表Seq IDNo：1所示，合成该序列。

二、小菜蛾TOR基因RNAi载体的构建

按照如下步骤操作：

(1)合成如序列表Seq ID No：2所示的序列，将该序列命名为35S-IN4，该序列包含EcoR I、AsiS I、Not I、SbfI、BbvC I和Asc I酶切位点(如下面序列所示，下划线字母依次表示该6个酶切位点)，该序列含有花椰菜病毒的启动子(P35S)、ACTIN的第四个内含子(Intron 4)和花椰菜病毒的终止子(T35S)序列。35S-IN4的序列为：

GAATTCGCGATCGCGTTTAAACTTGCTGCCAGCAGGTCCGATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATGGTCCGATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGGGATCTTTTTATTTTTAATTTTCTTTCAAATACTTCCAACTAGTGCGGCCGCAAAAAACCTGCAGGAGCAGGTAAAATTGGACTGTCATTTCTAAGTTTTTGCTTCTTGTGGTTGATTAAATGTAGACAACTCCTCTAATGGTTTACATTTTCTGTGTGTGTGTGTGTGTGTAATCAGATGTGCCTCAGCAAAAAAGGCGCGCCCGGCCATGCTAGAGTCCGCAAAAATCACCAGTCTCTCTCTACAAATCTATCTCTCTCTATTTTTCTCCAGAATAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAGGGAATTAGGGTTCTTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAATTTCTAATTCCTAAAACCAAAATCCAGTGACGAATTC

用EcoR I对pCR8/GW/TOPO载体和35S-IN4序列进行单酶切，酶切体系为50μL体系，如下所示：

37℃酶切3小时后，用胶回收试剂盒回收相应的片段。将回收的载体pCR8/GW/TOPO用去磷酸化试剂盒去磷酸化，防止自连。将酶切的35S-IN4片段和去磷酸化的载体pCR8/GW/TOPO进行连接，连接体系为5μL体系，如下所示：

置于冰水混合物上过夜连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，菌液PCR鉴定阳性克隆。用35S F(如序列表Seq ID No：3所示)和Intron4R(如序列表Seq ID No：4所示)引物鉴定阳性克隆，PCR扩增的反应体系为50μL体系，包括5μL 10×Taq Buffer、4μL2.5mM dNTPs、1μLTaq DNAPolymerase、1μL 10μM 35S F引物、1μL 10μMIntron4R引物、1μL的菌液作为模板，用ddH₂O补足至50μL。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸30s,40个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增得到250bp左右的片段即为阳性克隆。获得含有35S-IN4的载体，命名为p35S-IN4，其结构如图1所示。35S F:5’-ATGACGCACAATCCCACTATCCTTC-3’，Intron4R:5’-GTAAACCATTAGAGGAGTTGTC-3’。

(2)将前述合成的TOR-RNAi序列和载体p35S-IN4分别用内切酶Not I和SbfI进行酶切，酶切体系为50μL体系，如下所示：

37℃酶切3小时后，用胶回收试剂盒分别回收相应的片段。将回收的TOR-RNAi和载体p35S-IN4进行连接，连接体系为5μL体系，如下所示：

置于冰水混合物上过夜连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，用引物TOR-RNAi F(如序列表Seq ID No：5所示)和Intron4R鉴定菌液阳性克隆，TOR-RNAi F:5’-GCTGGAAGATGTAGGTGATGG-3’。

鉴定阳性克隆的步骤方法与本步骤前述鉴定阳性克隆的步骤方法一样，只是将相应的对象和引物置换即可。PCR扩增得到500bp左右的片段即为阳性克隆。得到p35S-IN4+TOR-RNAi的载体，命名为p35S-TORIN4。

(3)用质粒提取试剂盒提取p35S-TORIN4质粒。再将合成的TOR-RNAi序列和p35S-TORIN4质粒用内切酶BbvC I和Asc I进行酶切连接，酶切连接体系和方法同本步骤前述酶切连接方法，只是相应的对象和内切酶不同。用引物Intron4F(如序列表Seq ID No：6所示)和TOR-RNAi F鉴定阳性克隆，PCR扩增得到500bp左右的片段即为阳性克隆，Intron4F：5’-TTTGCTTCTTGTGGTTGATTA-3’，鉴定阳性克隆的步骤方法与本步骤前述鉴定阳性克隆的步骤方法一样，只是将相应的对象和引物置换即可。获得p35S-TORIN4+TOR-RNAi的载体，命名为p35S-TORRI，其构建过程示意图如图2所示，即为以pCR8/GW/TOPO载体为骨架载体，在多克隆酶切位点处插入顺序连接的EcoR I酶切位点、AsiS I酶切位点、P35S启动子、Not I酶切位点、SEQ ID NO:1所示的序列、Sbf I酶切位点、ACTIN的第四个内含子、BbvC I酶切位点、SEQ ID NO:1所示的反向互补序列、Asc I酶切位点、T35S终止子、EcoR I酶切位点，在pCR8/GW/TOPO中插入的这些片段连接起来的序列如序列表Seq ID No：7所示，将该序列命名为35S-TORRI。p35S-TORRI载体中的TOR序列能够形成一个茎环结构，以达到干扰小菜蛾TOR基因的目的。将构建的载体p35S-TORRI进行酶切验证，一组酶切体系为用内切酶AsiS I、AscI，另一组酶切体系为用内切酶BbvC I、Asc I，酶切体系均为50μL体系，如下所示：

37℃酶切3小时后，用1％的琼脂糖跑胶，结果如图3所示。图中1、2为p35S-TORRI载体用AsiS I和Asc I酶切后的产物，大片段为3237bp，小片段为1976bp；图中3、4为p35S-TORRI载体用BbvC I和Asc I酶切后的产物，大片段为4555bp，小片段为658bp，同时得到这4个大小片段的p35S-TORRI载体即为构建成功的载体。酶切验证后将正确的p35S-TORRI载体送去测序，测序结果显示所得到的载体为正确的构建。

(4)再通过Gateway LR反应将p35S-TORRI中插入的Seq ID No：7序列重组到植物表达载体pEarleyGate 303上，LR反应体系为2.5μL体系，如下所示：

在PCR仪中25℃反应3小时，反应产物转化DH5α感受态细胞。用35S F和Intron4R引物鉴定阳性克隆,PCR扩增得到850bp左右的片段即为阳性克隆。得到pEarleyGate 303+35S-TORRI的载体，命名为pE35S-TORRI，其构建过程示意图如图4所示。鉴定阳性克隆的步骤方法与前述步骤(3)中鉴定阳性克隆的步骤方法一样，只是将相应的对象和引物置换,将循环程序中的72℃延伸时间改为50s即可。

实施例2转基因拟南芥植株的获得

按照如下步骤操作：

(1)将实施例1得到的pE35S-TORRI载体转化农杆菌LBA4404菌株，转化步骤为：1)在装有50μL农杆菌LBA4404菌株感受态细胞的离心管中加入pE35S-TORRI载体质粒DNA(用质粒DNA提取试剂盒提取得到，操作方法参考试剂盒说明书)5μL，轻轻混匀后冰浴30min；2)放入液氮中1min，然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3)取出离心管，置于冰上冰浴3min；4)在超净工作台中将离心管中冰浴后的液体加入500μL LB液体培养基，28℃、200rpm振荡培养4h；5)取出菌液在含有利福平和卡那霉素各50mg/L的LB固体培养基上涂板，待干后在28℃培养箱中倒置培养。2天左右菌落可见。

挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃、220rpm振荡培养过夜。用35S F(如序列表Seq ID No：6所示)和Intron4R引物鉴定阳性克隆,PCR扩增得到850bp左右的片段即为阳性克隆，35S F：5’-ATGACGCACAATCCCACTATCCTTC-3’。PCR扩增的反应体系为50μL体系，包括5μL 10×Taq Buffer、4μL 2.5mM dNTPs、1μLTaq DNAPolymerase、1μL 10μM 35S F引物、1μL 10μM Intron4R引物、1μL的菌液作为模板，用ddH₂O补足至50μL。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸50s,40个循环，最后72℃延伸10min。将阳性克隆的菌液接种到新鲜无菌的LB液体培养基(含利福平和卡那霉素各50mg/L)中,28℃200rpm震荡培养至OD600大约为0.8时,5000rpm离心10min,将菌体用MS浸染液(MS液体培养基+5％蔗糖)重悬，制得用于转化拟南芥的菌液。

(2)将步骤(1)制备得到的转化拟南芥的菌液通过花序浸染法浸染拟南芥Col-0野生型植株。在用花序浸染法转拟南芥之前，先用剪刀剪去已经长成的角果，把200mL的MS浸染液悬浮的菌液倒入大平皿内，然后把拟南芥的花序浸入进去浸染1min，浸染的过程要转动平皿，浸染后用滤纸擦干，浸染后的拟南芥植株用保湿袋保湿,暗光处放置16h。然后取出按照正常的生长条件培养，待种子成熟后收获种子。

(3)用卡那霉素抗性的平皿筛选转基因种子，用DNA提取试剂盒提取抗性植株叶片的DNA做PCR检测(用35S F和Intron4R引物检测)，PCR扩增的反应体系为50μL体系，包括5μL10×Taq Buffer、4μL 2.5mM dNTPs、1μLTaq DNAPolymerase、1μL 10μM 35S F引物、1μL 10μM Intron4R引物、1μL的DNA作为模板，用ddH₂O补足至50μL。PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，40个循环；最后72℃延伸10min。图5为转基因拟南芥基因组DNA的PCR检测结果，扩增出850bp条带的植株即为转基因成功的植株。将转入小菜蛾TOR-RNAi片段的拟南芥命名为DBM-TORRI/WT。

实施例3转基因拟南芥的抗虫能力研究

1、小菜蛾的群体饲养

用于做抗虫实验的害虫为小菜蛾,在实验室进行繁殖培养,其培养条件为24℃,16h光照/8h黑暗。用胡萝卜苗的子叶或幼嫩的叶子饲养小菜蛾幼虫,7-8天后结茧,用毛笔将蛹轻轻地刷下来,移到玻璃缸中,用纱布将口封上,待蛹羽化(约2-3天)后,放入用10％的蔗糖溶液浸泡过的医用脱脂棉(供小菜蛾成虫食用蔗糖水)和胡萝卜苗叶子(用于收集虫卵),食用蔗糖水的小菜蛾将在2-3天内产卵,将带有虫卵的胡萝卜苗叶子收集起来,放到带有滤纸的干净的塑料培养皿中,待虫卵孵化后,用孵化的幼虫做拟南芥的抗虫性检测实验。

2、转TOR-RNAi片段拟南芥对小菜蛾抗性的分析

分别用转基因拟南芥DBM-TORRI/WT三个不同株系T3-2、T3-8、T3-18和野生型拟南芥WT(作为阴性对照)叶片饲养小菜蛾初孵幼虫,平均每个株系饲喂50头小菜蛾初孵幼虫，每天早晚各饲喂一次。统计小菜蛾的食叶量、结茧前小菜蛾幼虫的平均质量、结茧前小菜蛾幼虫的存活率，分别统计了饲喂叶片后第2天、第4天、第6天和第8天的数据。如图6、7所示，饲喂转基因植株T3-2、T3-18叶片的小菜蛾食叶量和平均重量显著低于对照组WT，饲喂转基因植株T3-8叶片的小菜蛾RNAi效果弱于转基因植株T3-2、T3-18。从小菜蛾的存活率来看，如图8所示，随着饲喂转基因叶片时间的增加，小菜蛾的存活率逐渐降低，到第8天时，饲喂转基因植株T3-2、T3-18叶片的小菜蛾存活率只有10％左右；而饲喂转基因植株T3-8叶片的小菜蛾存活率在40％左右。从图6、7、8可以看出，转基因植株T3-2、T3-18对小菜蛾具有显著的抗虫性。而转基因植株T3-8对小菜蛾的抗虫性要弱于转基因植株T3-2、T3-18。通过以上实验，说明我们构建的小菜蛾TOR基因RNAi载体在对小菜蛾的防治上有显著效果，在小菜蛾的基因干涉防治上应用前景广阔。

在后续研究中，将对具有显著抗虫效果的转基因拟南芥进行small RNA测序，找到对小菜蛾TOR基因干扰最显著的small RNA，将该small RNA合成对应的ds RNA，应用在小菜蛾防治中。

Claims (3)

1.一种小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体，其特征在于：所述RNAi表达载体是以植物表达载体pEarleyGate 303为骨架载体，在重组位点处插入Seq ID No：7序列所示的序列。

2.一种含有权利要求1所述RNAi表达载体的微生物转化体。

3.一种权利要求1所述的小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)合成如SEQ ID NO:1和2所示的序列，SEQ ID NO:1所示的序列命名为TOR-RNAi，SEQID NO:2所示的序列命名为35S-IN4，对pCR8/GW/TOPO载体和35S-IN4序列进行酶切连接，获得含有35S-IN4的载体，命名为p35S-IN4；

(2)将步骤(1)合成的TOR-RNAi序列和载体p35S-IN4进行酶切连接得到载体p35S-TORIN4；

(3)将载体p35S-TORIN4和TOR-RNAi序列进行酶切连接得到载体p35S-TORRI，p35S-TORRI中含有如Seq ID No：7序列所示的序列；

(4)将p35S-TORRI中插入的Seq ID No：7序列重组到植物表达载体pEarleyGate 303上，得到小菜蛾TOR基因的RNAi表达载体。