CN110592044B - 蛋白激酶Fused编码基因及其在防治小菜蛾中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种昆虫蛋白激酶，其编码基因Fused，所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；本发明还公开了Fused基因特异片段，用于dsRNA的合成，该dsRNA注入Bt Cry1Ac杀虫蛋白敏感和抗性小菜蛾3龄初幼虫体腔后，小菜蛾生长发育迟缓，并最终导致小菜蛾在幼虫期和蛹期的死亡。本发明为小菜蛾Bt抗性治理提供了新的靶标，因此具有良好的应用前景。

Description

蛋白激酶Fused编码基因及其在防治小菜蛾中的应用

技术领域

本发明属于病虫害防治和生物技术领域，具体涉及小菜蛾蛋白激酶Fused基因及其在小菜蛾防治和Bt抗性治理中的应用。

背景技术

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt）可以产生多种杀虫晶体蛋白，从而特异性杀死多种田间重大害虫。基于Bt杀虫蛋白研发的Bt制剂是目前世界上用量最大的微生物杀虫剂，而且编码Bt杀虫蛋白的多个基因也已经被转入到多种重要的经济作物中（简称Bt作物），Bt制剂和Bt作物在防治田间害虫方面发挥了重要作用。然而，Bt制剂大量及不合理的使用以及Bt作物的大面积推广应用不可避免的导致害虫快速进化产生了抗药性，导致田间害虫防治失败。在这种背景下，昆虫Bt抗性分子机制的揭示以及新型害虫防治技术的研发迫在眉睫。

目前，致力于研发物种特异性生物杀虫剂和新一代转基因作物的RNAi的害虫防治技术被认为是未来田间害虫防治的希望所在。而且，Bt+RNAi的新一代转基因作物能有效的延缓田间害虫的抗性问题，必将在未来田间害虫防治中发挥关键作用。然而，基于Bt+RNAi的新型害虫防治技术的关键在于害虫高效安全致死靶标基因的筛选。小菜蛾是十字花科作物重要害虫，全世界每年由小菜蛾危害所造成的直接和间接经济损失已高达40-50亿美元，而我国小菜蛾危害每年引起的经济损失已高达到7.7亿美元，防控难度极大。而且，小菜蛾是第一个也是目前唯一的一个在田间对Bt制剂产生高抗性的害虫。因此，开展小菜蛾Bt+RNAi高效安全致死靶标基因筛选研究意义重大。

蛋白激酶是催化蛋白质磷酸化的酶，通过催化磷酸转移至底物蛋白质特定氨基酸残基上来调控底物蛋白定位以及活性。蛋白激酶是调节细胞功能的关键因子，构成了功能最多样的基因家族之一，依据其被磷酸化的氨基酸残基种类可分为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶等。生物体细胞内信号途径的关键基因功能和进化相对比较保守，然而，在基因序列上也会存在物种特异性。而且，我们前期研究发现小菜蛾丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶MAPK信号途径参与了小菜蛾Bt抗性分子机制。因此，可以寻找功能重要、进化保守且序列存在物种特异性的信号途径关键基因作为小菜蛾RNAi高效安全致死靶标基因。

Fused基因即编码一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该基因主要参与生物体刺猬信号途径(Hedgehog signaling pathway)并在生长发育过程中发挥了关键作用，缺失该基因对昆虫具有致死作用。而且，在不同物种中该基因中间序列不保守。更关键的是，在我们前期小菜蛾Bt Cry1Ac杀虫蛋白敏感和抗性的转录组和RNA-Seq研究发现，Fused基因可能在Bt抗性小菜蛾中过表达从而参与小菜蛾Bt抗性。因此，小菜蛾Fused基因可以作为一种潜在的特异性强的新一代Bt+RNAi害虫防治技术的安全高效靶标基因，从而非常值得开展详细的研究。

发明内容

利用本发明人实验室前期完成的Bt Cry1Ac杀虫蛋白敏感和抗性小菜蛾中肠转录组和RNA-Seq数据，发现一个潜在的可能与小菜蛾Bt Cry1Ac杀虫蛋白抗性相关的上调表达Fused基因。为了验证该基因是否参与小菜蛾Bt Cry1Ac杀虫蛋白抗性，首先克隆了Fused基因的全长序列，利用qPCR技术检测后发现，该基因的表达量在Bt Cry1Ac杀虫蛋白在抗性小菜蛾中肠中显著高于敏感小菜蛾，而且随后的RNAi功能实验利用特异性dsRNA沉默该基因的表达量能导致小菜蛾对Bt Cry1Ac杀虫蛋白的敏感性降低，因此，实验结果证实Fused基因参与小菜蛾Bt Cry1Ac杀虫蛋白抗性分子机制。

有趣的是，在开展Fused基因的RNAi功能实验时，偶然发现沉默该基因的表达量可以导致小菜蛾大量死亡，产生致死表型，在进一步大量实验优化RNAi实验体系后，发现注射和饲喂一定剂量的特异性dsRNA显著性沉默该基因的表达量后能让Bt Cry1Ac敏感小菜蛾幼虫产生接近100%的死亡率，偶尔存活下来的幼虫也在化蛹期和羽化期死亡。而且，因该基因过量表达与小菜蛾Bt抗性有关，采用注射和饲喂法开展RNAi沉默该基因表达量后都能使Bt Cry1Ac抗性小菜蛾产生同样高效的致死表型。因此，该基因及其特异性dsRNA可以作为小菜蛾RNAi害虫防治和Bt抗性治理的良好安全高效致死靶标。

进一步地研究发现，虽然该基因的功能在不同昆虫中保守，但是其编码蛋白的序列差异较大，仅N端激酶结构域和C端结构域保守；而在鳞翅目昆虫中，除这两个结构域外，还有一段序列相似度高，因此可以在该区域设计特异性的dsRNA进行鳞翅目害虫防治而不影响其他非靶标昆虫。

因此，以害虫关键生理功能基因Fused作为基于RNA干扰的害虫防治和Bt抗性治理的分子靶标，通过转基因技术抑制靶标害虫该基因表达的害虫防治新策略具有明显的商业价值和应用前景。

基于上述内容本发明得以完成。首先，本发明的目的是提供一种昆虫蛋白激酶基因Fused的序列及其dsRNA在防治小菜蛾和治理小菜蛾Bt抗性中的应用，相对于传统的化学防治技术，该技术具有高效专一、安全低毒的优点。

本发明提供一种昆虫蛋白激酶基因Fused，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该序列是在小菜蛾基因组序列和转录组基因片段的基础上，通过进一步克隆得到的全长cDNA序列。该cDNA序列编码区域2565 bp，编码含有854个氨基酸的蛋白，该蛋白序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明还提供一种昆虫蛋白激酶基因Fused的基因片段，其核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，是根据SEQ ID NO.1的氨基酸序列SEQ ID NO.2分析得到鳞翅目昆虫保守区段，设计出含有23-bp的T7启动子的特异性正向引物SEQ ID NO.4和反向引物SEQ ID NO.5进行PCR扩增，然后将得到的PCR产物纯化后进一步使用T7 Ribomax Express RNAi System(Promega, Madison, WI, USA)试剂盒并按照其说明书经体外反转录合成的。

本发明还提供一种dsRNA（由SEQ ID NO.3合成）在致死Bt Cry1Ac敏感和抗性小菜蛾中的应用：显微注射该dsRNA到小菜蛾3龄初幼虫体腔中，结果显示，该dsRNA可以特异性地沉默小菜蛾蛋白激酶基因Fused的mRNA表达，并导致小菜蛾在幼虫期和随后的蛹期死亡。由此可见，该dsRNA可以同时用于小菜蛾的防治和Bt抗性治理。

本发明通过注射发现害虫关键生理功能基因Fused的特异性dsRNA可以致死Bt敏感和抗性的小菜蛾，从而证明Fused的特异性dsRNA可以作为基于RNA干扰的小菜蛾防治和小菜蛾Bt抗性治理的分子靶标。可以通过转基因技术转入该害虫关键生理功能基因Fused的特异性dsRNA来抑制小菜蛾中该基因的表达并致死小菜蛾，从而达到田间小菜蛾治理的目的。因此，基于害虫关键生理功能基因Fused的转基因RNA干扰技术是一种小菜蛾防治新策略，它具有良好的商业价值和应用前景。总结来说，本发明具有以下有益效果如下：

本发明首次发现并证实了特异性干扰害虫靶标基因Fused，对高等动物和人类安全；其杀虫具有专一性，对非靶标生物安全，环境友好，无污染。因此，本发明相对于传统的害虫防治方法具有明显的技术优势。

附图说明

图1：为小菜蛾蛋白激酶Fused功能结构域分布示意图。黑色长方形表示该基因的跨物种保守的激酶结构域(kinase domain)，浅灰色长方形表示本研究中设计的Fused基因特异性dsRNA区域，该区域仅在鳞翅目昆虫中保守。

图2：(A)小菜蛾DBM1Ac-S和NIL-R的4龄幼虫中肠Fused基因序列突变检测，序列比对分析发现仅存在同义突变，纵坐标表示同义突变位点的数量；(B)小菜蛾Bt Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S和小菜蛾Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的4龄幼虫中肠的Fused基因mRNA的表达量检测，用RPL32基因作为内参基因，不同字母表示显著性差异(P > 0.05; Holm-Sidak’s test; n = 3)。

图3：(A)小菜蛾Bt Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S的3龄初幼虫显微注射SEQ ID NO.3合成的dsRNA后，在0–120 h内每隔24 h检测一次Fused基因的mRNA表达量情况，用RPL32基因作为内参基因；(B)注射dsRNA后0–120 h内每隔24 h统计一次小菜蛾幼虫的死亡率情况。注射Buffer和dsEGFP的为两个实验对照组。

图4：(A)小菜蛾Bt Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的3龄初幼虫显微注射SEQID NO.3合成的dsRNA后，在48 h检测一次Fused基因的mRNA表达量情况，RPL32基因作为内参基因，不同字母表示显著性差异(P < 0.05; Holm-Sidak’s test; n = 3)；(B)注射dsRNA后120 h统计的小菜蛾幼虫死亡率情况，注射Buffer和dsEGFP的作为两个实验对照组。

图5：(A) 小菜蛾Bt Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S和Bt Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的3龄初幼虫饲喂SEQ ID NO.3合成的dsRNA后，在48 h检测一次Fused基因的mRNA表达量情况，RPL32基因作为内参基因，不同字母表示显著性差异(P < 0.05; Holm-Sidak’stest; n = 3)；(B)饲喂dsRNA后120 h统计的小菜蛾幼虫死亡率情况，注射Buffer和dsEGFP的作为两个实验对照组。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步描述与说明，但本发明的保护范围并不仅限于此。

实验前材料样品准备：

(1) 小菜蛾Bt杀虫蛋白敏感种群(DBM1Ac-S)：该小菜蛾种群在中国农业科学院蔬菜花卉研究所昆虫组昆虫饲养室内采用甘蓝萝卜法进行继代饲养，期间从未接触任何有毒杀虫剂，对Bt制剂及其产生的Cry类杀虫蛋白敏感。

(2) 小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群(NIL-R)：该种群是在原始敏感种群DBM1Ac-S和原始抗性种群DBM1Ac-R经过多达7次的多组单对杂交、回交及汰选后建立的与DBM1Ac-S敏感种群遗传背景高度相似的近等基因系Cry1Ac高抗种群，目前其Cry1Ac的抗性倍数相对于敏感种群DBM1Ac-S已高达4000多倍。该种群建成后在本实验室内用Bt杀虫蛋白Cry1Ac进行持续抗性汰选，连续饲养至今。

以上所用的2个种群包括小菜蛾Bt杀虫蛋白敏感种群(DBM1Ac-S)和小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群(NIL-R)本实验室均有饲养和保存，可向公众发放用于实验研究。

上述两个小菜蛾种群均在室内进行隔离饲养，将蛹放入成虫饲养笼中(R=10 cm，L=40 cm)，笼四周以80目的纱网包围，成虫羽化后，笼内挂浸过10%蜂蜜糖水的脱脂棉球一个，为成虫补充营养，让其在甘蓝苗或萝卜苗上产卵，卵孵化后再用靠接法转入新鲜的甘蓝苗上饲养。饲养温度是25±1 °C，相对湿度为60–70%，光周期为光照：黑暗=16 h：8 h。

实施例1：小菜蛾蛋白激酶Fused的克隆及Bt Cry1Ac抗敏差异比较

1. 小菜蛾Fused基因的全长cDNA序列克隆

基于小菜蛾基因组(DBM-DB: http://iae.fafu.edu.cn/DBM/)中Fused基因(基因登录号：Px012410)的序列信息，采用Primer Premier 5.0软件设计基因全长cDNA序列特异性引物（正向引物：5′-CAGGTTGGTCGTACAGAT-3′；反向引物：5′-ATGATTAGGGTGAGTTGG-3′；生工生物工程(上海)股份有限公司合成）。然后，提取敏感小菜蛾DBM1Ac-S种群4龄幼虫总RNA样品，反转录为cDNA模板，利用PCR技术进行全长cDNA序列克隆。经PCR扩增后，将得到PCR产物纯化并亚克隆转化到大肠杆菌中送测序。结果分析后，拼接得到敏感小菜蛾DBM1Ac-S种群Fused基因的全长cDNA序列，如SEQ ID NO.1所示。

2. 小菜蛾Fused基因在Bt Cry1Ac抗敏种群中差异比较

(1) 小菜蛾Fused基因序列在Bt Cry1Ac抗敏种群中差异比较

提取小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S和小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的4龄幼虫中肠总RNA样品，反转录合成cDNA后，利用Fused基因全长引物进行PCR克隆，连接转化后送测序，将测序得到的抗敏Fused基因全长序列进行序列差异比对分析。比对结果发现，Bt Cry1Ac抗敏种群间Fused基因仅存在同义突变位点（图2A），所以它们不可能参与抗性。因此，小菜蛾Fused基因序列变异与小菜蛾Bt Cry1Ac抗性无关。

(2) 小菜蛾Fused基因表达量在Bt Cry1Ac抗敏种群中差异比较

提取小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S和小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的4龄幼虫中肠总RNA，反转录合成cDNA后，以RPL32为内参基因，使用实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR, 简称qPCR)技术检测目的基因Fused的相对表达量（图2B）。结果显示，相对于小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S，BtCry1Ac抗性种群NIL-R中Fused基因的表达量显著上调，这表明小菜蛾Fused基因表达量可能与小菜蛾Bt Cry1Ac抗性有关。

实施例2：小菜蛾Fused基因的dsRNA准备

(1) 小菜蛾Fused基因的dsRNA引物的设计

基于已克隆得到的小菜蛾Fused基因全长序列SEQ ID NO.1，使用Primer Premier5.0软件，根据SEQ ID NO.1序列编码的氨基酸序列SEQ ID NO.2分析得到的鳞翅目昆虫保守区段（图1）设计出含有23-bp的T7启动子的特异性正向引物SEQ ID NO.4和反向引物SEQID NO.5。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

(2) 小菜蛾Fused基因的dsRNA的合成和注射前准备

利用上述引物SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5，通过PCR扩增得到单一PCR产物，经进一步纯化后再使用T7 Ribomax Express RNAi System (Promega, Madison, WI, USA)试剂盒并按照其说明书经体外反转录合成小菜蛾Fused基因的特异性dsRNA，使用注射缓冲液injection buffer [10 mM Tris– HCl (pH 7.0); 1 mM EDTA]溶解得到的dsRNA，该dsRNA样品通过1%琼脂糖凝胶电泳检验其纯度并进一步使用NanoDrop 2000c光度计测定其终浓度。在显微注射和饲喂前，将该dsRNA与25 °C温浴处理20 min的Metafectene PRO转染试剂按照1:1的体积比充分混匀。

实施例3：注射小菜蛾Fused基因dsRNA导致小菜蛾幼虫和蛹期的致死表型

1. 小菜蛾Fused基因dsRNA显微注射

将小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S和小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的3龄初小菜蛾幼虫饥饿处理6 h并冰冻麻醉30 min后，将50 ng准备好的dsRNA溶液用Nanoliter 2000显微注射仪从幼虫腹部节间膜处注入体腔，每个处理组共注射90头，3次生物学重复（每个重复30头）。注射相同体积浓度的Buffer和dsEGFP（均混有处理组相同体积的Metafectene PRO转染试剂）至两个对照组体内，然后将注射后的小菜蛾置于正常的饲养条件中饲养。

2. 小菜蛾Fused基因沉默效果检测

对于小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S的3龄初幼虫，选择dsRNA注射后0–120 h内每隔24 h进行基因沉默效果检测，提取各虫体样品的总RNA并反转录成cDNA。使用RT-PCR技术检测目的基因Fused表达量情况，以RPL32作为内参基因校正样本cDNA的差异，结果显示在Fused基因dsRNA注入48 h后出现最大的沉默效果，而且该沉默效果在其后可以维持至少48 h（图3A）。

对于小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的3龄初幼虫，选择dsRNA注射后48 h进行基因沉默效果检测，提取各虫体样品的总RNA并反转录成cDNA，每组设置3个生物学重复。以RPL32为内参基因，使用qPCR技术检测目的基因Fused的相对表达量，以计算目的基因Fused的沉默效果。实验结果显示，小菜蛾幼虫在注入Fused基因的dsRNA 48 h后，其Fused基因的表达量显著下降(> 70%)，这说明Fused基因的沉默效果非常显著（图4A）。

3. 小菜蛾在注入Fused基因的dsRNA后幼虫死亡率的观察

小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S的3龄初幼虫在注入Fused基因的dsRNA后0–120 h内，小菜蛾的死亡率逐渐上升，在注射后120 h时，死亡率已高达95%（图3B）。而小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的3龄初幼虫在注入Fused基因的dsRNA后120 h时，小菜蛾幼虫的死亡率也同样高达92%（图4B）。这些实验结果表明，Fused基因的dsRNA能同时致死Bt Cry1Ac敏感和抗性的小菜蛾幼虫。

4. 注入小菜蛾Fused基因dsRNA后小菜蛾蛹期生物学观察

对于小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S和小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的3龄初幼虫在注入Fused基因的dsRNA 120 h后存活的少量4龄幼虫，让其自然发育并观察其后续的生物学特性（表1）。结果显示，两种群存活小菜蛾幼虫化蛹率和蛹重均显著性下降，更重要的是，其羽化率均为0，即这些在Fused基因的dsRNA注射后存活的少量小菜蛾幼虫也都在蛹期死亡，这表明Fused基因dsRNA的3龄初注射不仅能致死大部分Bt Cry1Ac敏感和抗性的小菜蛾幼虫，同时也能导致后续存活的Bt Cry1Ac敏感和抗性的小菜蛾在蛹期全部死亡（表1），因此，Fused基因可以作为基于RNA干扰的小菜蛾防治和Bt抗性治理的靶标基因。

表1. 小菜蛾DBM1Ac-S和NIL-R的3龄初幼虫显微注射dsRNA后对存活4龄幼虫随后生物学参数的影响

注：表中不同的字母表示同一种群相同生物学参数具有显著性差异 ( Holm-Sidak’s test; P < 0.05; n = 3)。

实施例4：饲喂小菜蛾Fused基因dsRNA导致小菜蛾幼虫和蛹期的致死表型

1.小菜蛾Fused基因dsRNA口服饲喂

将小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S和小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的3龄初小菜蛾幼虫饥饿处理24 h，使用微量移液器饲喂含50 ngdsRNA的口服液。每个处理组共饲喂90头，3次生物学重复（每个重复30头）。饲喂相同体积浓度的Buffer和dsEGFP（均混有处理组相同体积的Metafectene PRO转染试剂）至两个对照组体内，然后将处理后的小菜蛾置于正常的饲养条件中饲养。

2.小菜蛾Fused基因沉默效果检测

选择饲喂dsRNA后48 h的小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S和Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R进行基因沉默效果检测，提取各虫体样品的总RNA并反转录成cDNA。使用RT-PCR技术检测目的基因Fused表达量情况，以RPL32作为内参基因校正样本cDNA的差异，结果显示DBM1Ac-S和NIL-R种群中Fused基因的表达量均显著下降(>70%)，这说明饲喂dsRNA后Fused基因的沉默效果非常显著（图5A）。

3.小菜蛾在饲喂Fused基因的dsRNA后幼虫死亡率的观察

小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S和小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R幼虫饲喂dsRNA后120 h时，死亡率均高达90%（图5B）。这些实验结果表明，饲喂Fused基因的dsRNA也能同时致死Bt Cry1Ac敏感和抗性的小菜蛾幼虫。

4.饲喂Fused基因dsRNA后小菜蛾蛹期生物学观察

对于小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac敏感种群DBM1Ac-S和小菜蛾Bt杀虫蛋白Cry1Ac抗性近等基因系种群NIL-R的3龄初幼虫在饲喂Fused基因的dsRNA 120 h后存活的少量4龄幼虫，让其自然发育并观察其后续的生物学特性（表2）。结果显示，与注射dsRNA后现象相同，两种群存活小菜蛾幼虫化蛹率和蛹重均显著性下降，更重要的是，其羽化率均为0，即这些在口服Fused基因的dsRNA后存活的少量小菜蛾幼虫也都在蛹期死亡，这表明Fused基因dsRNA的3龄初饲喂同样不仅能致死大部分Bt Cry1Ac敏感和抗性的小菜蛾幼虫，同时也能导致后续存活的Bt Cry1Ac敏感和抗性的小菜蛾在蛹期全部死亡（表2），因此，Fused基因可以作为基于RNA干扰的小菜蛾防治和Bt抗性治理的靶标基因。

表2. 小菜蛾DBM1Ac-S和NIL-R的3龄初幼虫饲喂dsRNA后对存活4龄幼虫随后生物学参数的影响

注：表中不同的字母表示同一种群相同生物学参数具有显著性差异 ( Holm-Sidak’s test; P < 0.05; n = 3)。

<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所

<120> 蛋白激酶Fused编码基因及其在防治小菜蛾中的应用

<160> 5

<210> 1

<211> 2565

<212> DNA

<213> 小菜蛾

<220>

<221> 起始密码子

<222> (1)..(3)

<220>

<221> 终止密码子

<222> (2563)..(2565)

<400> 1

ATGGATAATTACGTTGTTATATCTTTTGTCGGGGAAGGATCTTTTGGACGAGTCTTCAAAGCAAAACACAAGGAAAGCGATGCCGTTGTGGCTTTAAAAGTTATTAGAAAGAAAGGACGATCGACAAAGGACCTGAAGAACCTAAGACAAGAATGTGATATTCAAAGAGAACTGAACCACCCCAATATCATACGCATGATAGATAGCTTTGACACTGAATCAGAGCTGGTAGTTGTGACTGAGTATGCAGAGAAAGAATTGCACAGTATCCTTGCTAAAGAGGGATGTCTTAATGAAGAACAAGTTAAAAAGATCACTTGGGACCTTGTTTCAGCTCTTTATTACCTGCATTCTCACAGAGTATTACATAGAGATCTAAAGCCTCAGAATGTGTTATTAGATAGTACTGGAAGGGCTAAGCTGTGTGACTTTGGTCTCGCCAGAATAATGACAAATGCAACGCACATTCTCACCTCCATCAAAGGCACACCTTTATACATGGCCCCAGAACTTATTGATGAAAAGCCTTATGATCATCAAGCAGATCTTTGGTCACTTGGGTGCATTGTGTATGAGTTGATGGCCGGTCAGCCTCCATTCTGTACCATGTCCATCTGGCAGCTCGTCCGCATGATCCGACACAAGCCGGTGCAATGGCCCAGCTTCATCAGTGCTGAGGCCCGCTCCTTCTTACAGGGATTACTACACAAGGACCCAGCAAAGCGAATGTGTTGGCCGGAAATATTGGAGCATTCATTTGTTTCTGGACACATCCTGATATTGCCCGAAGATGTCCAGAGTGAGTCACCGTTCACGAAGCCACTGACACACAGCCAGCAGGAGCTTAAACAGTTGCAGAGAGACAAAGTTTGCAGTAATAATGCAAGACTGAAGCACGAGGGAGAAACTCTGAAAGCAGCCGACAGGAGGGCCCACGACTTGCGCCAGATCACCAAGCCCGCGGTGGCAGAGTGCGTGCCCATGTCTGATGACGACAGCGTGCGAGCGACAAGCGCCTTCAGCGTCCGAGACAGCCTCAAGACAGACGACGAAGACAACCCTCAGCCAATCACAGCCGCCAACGCTAAACTACTACGACACGAGTATAACGTCATGAATAATACGAACCTAGTTGTGTGCCACCAAGAAAACAACATGGCGCAGTTGGCTGCAGCAAATAAAAAGACAAATGAACAAGCTGTTAACAAAATGGATAGAATAGTTGAGGAGAAACATAATGTTGAGAAACCTGTTGTTGAAGATGCTAAGACTGCTGATAGTGATGGAAAGAAAGAAGTGACAGATTCAAATAAACAGAAAAGCAAAGGCAATGATACTGCATCACAGAGCTTAGAGAATCCCAAGAGTTCAACTAAATCTGGCAGTGATGTTAGTTCCGGATTGAGCAAAAGTGTCCCCCCATCGTACAAACAAAAGATACTCCAGTTCTCAAGAGATAAACTGAGATTTGGCAGCGGAGGGAACAGATTAACTAGAAGCATAAAGAGATCCTTCCATTTTAGTAGAAGCTGGGACAAAAATAAATCTGAAAATCAGAGGCGTACTAGTGAACCTGCCATTGAAATACCGAGCTTAGTAGATGGCGATAAGGATACAGTTTCTAAAGAAGACCAAGATGAAGATACGGAGAAATGCGAAGTAATTGAAGAGATTTTTGATGATAAAGATGTTGCTAACAATGACATTGTACAGCAGAAAGAAGAAGATGATGTCAAGGAGCCTTCAGCAATTGAGTTGGAAGAGTGGGAAGCATTCCTGAACTCCAATATCAGCGAAGTTATGGACGGCGACGTGGAATCTCTCACACAGTTGAATATGGTGACGATGGTGACGGGCGTGGTGACGGGCGCGGCGCGCGGCGCGGGCGGCGGGCGCGTGTGCGGCGGCGTGGCGGCGCTGCTGGCGCTGCCGCCGGCCACGCCCGCGCTGCCGCGGCACACGCTGCTCAATATACAGGACGTGTACTTGGAGGCAAAAGTTGTGTATCACTTTGTATCAGCCATAAACTCACTCATGAAGCAAGGCTCAGCTACTGATGATGAATATGCTGAGGACAGACTATCTGGCGTGGCTCGCATGCTGGAGGTGGTGTCGTGGCTGGGCGTGCGCTCGTGCCGTGCCGCGCGCCAGTTCGCCGCCGCCGTGGACGCGCGCCGCGCGCACGCCGTGTTCAACCGGCTGCTGCAGCTCTATCAGAAATCGCCGCGCATAGCGTTGAACGTGGTCGGAGTGCTGGTCACAGTTCTACAGGACCTGCCGGAGCATGCAGACGTCGTGGAAAAGATACTCTTTGACGACAAACAGTTCAACTTCCTCCGCCTCCTCGACAACACCACAGACGCGCTCAGGATGCGAGTCTGTATCCTCATTAGTCTACTCTGTACGTTCTCATGCACCGCTCTATCTGTCGCCATGGAGTCCAAGTGGAGTAAGAAGGACAGCGATAGTTTGGAAGCGCTGCATACTCACTGCAATGTTACATTGAACAGGGCGGCCAGACTCGCTTCGAAGGAACTCAGTAATATGCCTTTTTATGTCAGCTAA

<210> 2

<211> 854

<212> 氨基酸

<400> 2

MDNYVVISFVGEGSFGRVFKAKHKESDAVVALKVIRKKGRSTKDLKNLRQECDIQRELNHPNIIRMIDSFDTESELVVVTEYAEKELHSILAKEGCLNEEQVKKITWDLVSALYYLHSHRVLHRDLKPQNVLLDSTGRAKLCDFGLARIMTNATHILTSIKGTPLYMAPELIDEKPYDHQADLWSLGCIVYELMAGQPPFCTMSIWQLVRMIRHKPVQWPSFISAEARSFLQGLLHKDPAKRMCWPEILEHSFVSGHILILPEDVQSESPFTKPLTHSQQELKQLQRDKVCSNNARLKHEGETLKAADRRAHDLRQITKPAVAECVPMSDDDSVRATSAFSVRDSLKTDDEDNPQPITAANAKLLRHEYNVMNNTNLVVCHQENNMAQLAAANKKTNEQAVNKMDRIVEEKHNVEKPVVEDAKTADSDGKKEVTDSNKQKSKGNDTASQSLENPKSSTKSGSDVSSGLSKSVPPSYKQKILQFSRDKLRFGSGGNRLTRSIKRSFHFSRSWDKNKSENQRRTSEPAIEIPSLVDGDKDTVSKEDQDEDTEKCEVIEEIFDDKDVANNDIVQQKEEDDVKEPSAIELEEWEAFLNSNISEVMDGDVESLTQLNMVTMVTGVVTGAARGAGGGRVCGGVAALLALPPATPALPRHTLLNIQDVYLEAKVVYHFVSAINSLMKQGSATDDEYAEDRLSGVARMLEVVSWLGVRSCRAARQFAAAVDARRAHAVFNRLLQLYQKSPRIALNVVGVLVTVLQDLPEHADVVEKILFDDKQFNFLRLLDNTTDALRMRVCILISLLCTFSCTALSVAMESKWSKKDSDSLEALHTHCNVTLNRAARLASKELSNMPFYVS

<210> 3

<211> 260

<212> DNA

<220>

<221> 上游T7启动子

<222> (1)..(23)

<220>

<221> 下游T7启动子

<222> (238)..(260)

<400> 3

TAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCAATGATACTGCATCACAGAGCTTAGAGAATCCCAAGAGTTCAACTAAATCTGGCAGTGATGTTAGTTCCGGATTGAGCAAAAGTGTCCCCCCATCGTACAAACAAAAGATACTCCAGTTCTCAAGAGATAAACTGAGATTTGGCAGCGGAGGGAACAGATTAACTAGAAGCATAAAGAGATCCTTCCATTTTAGTAGAAGCTGGGACAAATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<220>

<221> T7启动子

<222> (1)..(23)

<400> 4

TAATACGACTCACTATAGGGAGAAGGCAATGATACTGCATC

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<220>

<221> T7启动子

<222> (1)..(23)

<400> 5

TAATACGACTCACTATAGGGAGATTTGTCCCAGCTTCTACT

Claims (7)

1.一种昆虫蛋白激酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述昆虫蛋白激酶的编码基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.一种dsRNA，其特征在于：其是与权利要求2所述的基因中的鳞翅目昆虫保守区段具有互补性，所述保守区的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.如权利要求4所述的dsRNA，其特征在于：它是由含有23-bp的T7启动子的特异性正向引物SEQ ID NO.4和反向引物 SEQ ID NO.5扩增得到的PCR产物纯化后经体外反转录制备得到。

6.根据权利要求4或5所述的dsRNA在防治小菜蛾和/或治理小菜蛾对苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）抗性中的应用。

7.一种防治小菜蛾和/或治理小菜蛾对苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）抗性的方法，其特征在于：将权利要求2或3所述昆虫蛋白激酶的编码基因作为抑制靶标，通过dsRNA干扰抑制其表达。

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