CN103403161A - 用于治疗新生物的自噬诱导剂和抑制剂组合疗法 - Google Patents

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Abstract

本文所公开的主题涉及药剂和用是激酶抑制剂且还是自噬诱导剂的药剂与是自噬抑制剂的药剂组合治疗新生物的方法。

Description

用于治疗新生物的自噬诱导剂和抑制剂组合疗法
技术领域
本文所公开的RNAi构建物和组合疗法涉及新生物的治疗。
背景技术
I类磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt途径的异常活化已广泛牵涉到多种癌症。这不仅是各种上游生长因子及其受体的反常活性的结果，还经过PI3K和Akt亚型的直接变更，且更经常的是，肿瘤抑制基因磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)(一种使PI3K活性无效的磷脂磷酸酶)的失活。三种Akt亚型代表引人注目的癌症治疗靶点(Samuels，Y.，and K.Ericson，(2006)，OncogenicPI3K and its role in cancer.Curr Opin Oncol.18:77-82;Stambolic，V.，andJ.R.Woodgett，(2006)，Functional distinctions of protein kinase B/Akt isoformsdefined by their influence on cell migration.TrendsCellBiol.)。在小鼠中3种Akt基因的基因缺损揭示了各亚型在正常生理学(Chen，W.S.，P.Z.Xu，K.Gottlob，M.L.Chen，K.Sokol，T.Shiyanova，I.Roninson，W.Weng，R.Suzuki，K.Tobe，T.Kadowaki，and N.Hay，(2001)，Growth retardation and increasedapoptosis in mice with homozygous disruption of the Akt1 gene.Genes Dev.15:2203-8;Cho，H.，J.Mu，J.K.Kim，J.L.Thorvaldsen，Q.Chu，E.B.Crenshaw，3rd，K.H.Kaestner，M.S.Bartolomei，G.I.Shulman，andM.J.Birnbaum，(2001)，Insulin resistance and a diabetes mellitus-like syndrome in mice lacking theprotein kinase Akt2(PKB beta).Science.292:1728-31;Cho，H.，J.L.Thorvaldsen，Q.Chu，F.Feng，and M.J.Birnbaum，(2001)，Akt1/PKBalpha isrequired for normal growth but dispensable for maintenance of glucosehomeostasis in mice.J Biol Chem.276:38349-52.Epub2001Aug31;Easton，R.M.，H.Cho，K.Roovers，D.W.Shineman，M.Mizrahi，M.S.Forman，V.M.Lee，M.Szabolcs，R.de Jong，T.Oltersdorf，T.Ludwig，A.Efstratiadis，and M.J.Birnbaum，(2005)，Role for Akt3/protein kinase Bgamma in attainment of normalbrain size.Mol Cell Biol.25:1869-78;Peng，X.D.，P.Z.Xu，M.L.Chen，A.Hahn-Windgassen，J.Skeen，J.Jacobs，D.Sundararajan，W.S.Chen，S.E.Crawford，K.G.Coleman，andN.Hay，(2003)，Dwarfism，impaired skindevelopment，skeletal muscle atrophy，delayed bone development，and impededadipogenesis in mice lacking Akt1 and Akt2.Genes Dev.17:1352-65;Tschopp，O.，Z.Z.Yang，D.Brodbeck，B.A.Dummler，M.Hemmings-Mieszczak，T.Watanabe，T.Michaelis，J.Frahm，andB.A.Hemmings，(2005)，Essential role ofprotein kinase B gamma(PKBgamma/Akt3)in postnatal brain development butnot in glucose homeostasis.Development.132:2943-54.Epub2005Jun1;Yang，Z.Z.，O.Tschopp，N.Di-Poi，E.Bruder，A.Baudry，B.Dummler，W.Wahli，andB.A.Hemmings，(2005)，Dosage-dependent effects of Akt1/protein kinaseBalpha(PKBalpha)andAkt3/PKBgamma on thymus，skin，and cardiovascularand nervous system development in mice.Mol Cell Biol.25:10407-18)和肿瘤起始(Chen，M.L.，P.Z.Xu，X.D.Peng，W.S.Chen，G.Guzman，X.Yang，A.DiCristofano，P.P.Pandolfi，andN.Hay，(2006)，The deficiency of Akt1 is sufficientto suppress tumor development in Pten+/-mice.Genes Dev.20:1569-74;Ju，X.，S.Katiyar，C.Wang，M.Liu，X.Jiao，S.Li，J.Zhou，J.Turner，M.P.Lisanti，R.G.Russell，S.C.Mueller，J.Ojeifo，W.S.Chen，N.Hay，andR.G.Pestell，(2007)，Akt1 governs breast cancer progression in vivo.Proc Natl Acad Sci USA.104:7438-43;Maroulakou，I.G.，W.Oemler，S.P.Naber，andP.N.Tsichlis，(2007)，Akt1 ablation inhibits，whereas Akt2 ablation accelerates，the development ofmammary adenocarcinomas in mouse mammary tumor virus(MMTV)-ErbB2/neu and MMTV-polyoma middle T transgenic mice.CancerRes.67:167-77;Skeen，J.E.，P.T.Bhaskar，C.C.Chen，W.S.Chen，X.D.Peng，V.Nogueira，A.Hahn-Windgassen，H.Kiyokawa，andN.Hay，(2006)，Aktdeficiency impairs normal cell proliferation and suppresses oncogenesis in ap53-independent and mTORC1-dependent manner.Cancer Cell.10:269-80)中的独特和重叠的功能。然而，三种Akt亚型在维持人类肿瘤生长中的相对贡献仍是难以捉摸的。
人类癌症通常共表达两种或全部三种Akt亚型，且各个亚型的扩增或超活化在不同类型癌症中有文献证明(Altomare，D.A.，andJ.R.Testa，(2005)，Perturbations of the AKT signaling pathway in human cancer.Oncogene.24:7455-64;Stahl，J.M.，A.Sharma，M.Cheung，M.Zimmerman，J.Q.Cheng，M.W.Bosenberg，M.Kester，L.Sandirasegarane，andG.P.Robertson，(2004)，Deregulated Akt3 activity promotes development of malignant melanoma.CancerRes.64:7002-10)。越来越多的证据表明，Akt亚型取决于外部刺激和所研究的组织可以被差别调节，并可以以细胞和组织特异性的方式调节细胞生理过程的不同方面(Dufour，G.，M.J.Demers，D.Gagne，A.B.Dydensborg，I.C.Teller，V.Bouchard，I.Degongre，J.F.Beaulieu，J.Q.Cheng，N.Fujita，T.Tsuruo，K.Vallee，and P.H.Vachon，(2004)，Human intestinal epithelial cellsurvival and anoikis.Differentiation state-distinct regulation and roles of proteinkinase B/Akt isoforms.J Biol Chem.279:44113-22.Epub2004Aug6;Irie，H.Y.，R.V.Pearline，D.Grueneberg，M.Hsia，P.Ravichandran，N.Kothari，S.Natesan，and J.S.Brugge，(2005)，Distinct roles of Akt1and Akt2in regulating cellmigration and epithelial-mesenchymal transition.J Cell Biol.171:1023-34;Kim，D.，S.Kim，H.Koh，S.O.Yoon，A.S.Chung，K.S.Cho，andJ.Chung，(2001)，Akt/PKB promotes cancer cell invasion via increased motility andmetalloproteinase production.FASEBJ.15:1953-62;Samuels，Y.，L.A.Diaz，Jr.，O.Schmidt-Kittler，J.M.Cummins，L.Delong，I.Cheong，C.Rago，D.L.Huso，C.Lengauer，K.W.Kinzler，B.Vogelstein，andV.E.Velculescu.2005.MutantPIK3CA promotes cell growth and invasion of human cancer cells.Cancer Cell.7:561-73;Tanno，S.，S.Tanno，Y.Mitsuuchi，D.A.Altomare，G.H.Xiao，and J.R.Testa，(2001)，AKTactivation up-regulates insulin-like growth factor I receptorexpression and promotes invasiveness of human pancreatic cancer cells.CancerRes.61:589-93;Yoeli-Lerner，M.，G.K.Yiu，I.Rabinovitz，P.Erhardt，S.Jauliac，and A.Toker，(2005)，Aktblocks breast cancer cell motility and invasion throughthe transcription factor NFAT.Mol Cell.20:539-50)。
Akt因其抗凋亡活性而众所周知，所述抗凋亡活性导致其作为生存激酶的描述(Amaravadi，R.，andC.B.Thompson，(2005)，The survival kinases Aktand Pim as potential pharmacological targets.J Clin Invest.115:2618-24)。然而，在没有另外的促凋亡损伤的情况下，抑制PI3K/Akt途径的组分经常不能诱导实质上的凋亡。这在最近的研究中有例证，其中有效抑制Akt磷酸化的双重PI3K/mTOR抑制剂阻断了神经胶质瘤异种移植物的增殖，而没有诱导凋亡(Fan，Q.W.，Z.A.Knight，D.D.Goldenberg，W.Yu，K.E.Mostov，D.Stokoe，K.M.Shokat，andW.A.Weiss，(2006)，A dual PI3kinase/mTOR inhibitor revealsemergent efficacy in glioma.Cancer Cell.9:341-9)。
在最近的研究中，与氯喹组合地给予烷化剂(WO2006/078774)。未见激酶抑制剂与氯喹组合的结果。
发明内容
本文所公开的主题涉及药剂和治疗新生物(neoplasms)的方法，所述方法用是激酶抑制剂且还是自噬诱导剂的药剂与是自噬抑制剂的药剂组合来治疗。
附图说明
图1显示Akt亚型的可诱导(敲低(knockdown))KD及其对异种移植物肿瘤生长的作用。(A)在表达可诱导的shRNA构建物的稳定PC3克隆中，Akt亚型和各种下游蛋白质的免疫印迹分析。用1μg/ml Dox在10%FBS下生长7天，诱导各个克隆表达各自的shRNA。双箭头表示通过全部和磷酸-Akt抗体检测的3种Akt亚型的迁移率的微小差异，和IRS1的迁移率变动。图1B显示AktKD对异种移植物肿瘤生长的作用。代表性实验显示用媒介物对照(-Dox，实心圆)或Dox(+Dox，空心圆)处理的含有各种shRNA的PC3异种移植物肿瘤的生长(详见表3)。误差棒代表SEM。*，P＜0.05;**，P＜0.005。
图2示出Akt KD导致细胞周期延迟和升高的自噬，而无实质上的凋亡。(A)如所指出的用Dox或媒介物对照处理5、15或21天的PC3-shAkt123肿瘤的组织学分析。通过IHC使用对Ki-67具有特异性的抗体或通过TUNEL分析方法来分析肿瘤组织。病理学家对各个样品的信号强度的评分在括号中标明。棒(Bars)，100μm。(B和C)与在10%FBS下生长的细胞相比，在血清饥饿(ss)下三重-Akt KD对细胞周期进展的影响。将含有靶向EGFP或所有三种Akt亚型的shRNA的细胞在含有10%FBS的培养基中用或不用Dox预处理2天，并改变至0%FBS(B)或0.5%FBS(C)。在撤去血清后，在指定的时间点分析细胞周期特征。误差棒代表SEM(n=3)。还显示了用Dox处理相对于不用Dox处理在各个细胞周期中的变化百分数。
图3示出在PC3和U87MG细胞中通过Akt KD诱导的自噬。(A)在缺少(a和f)或存在(b-e和g)Dox诱导的Akt123KD的情况下生长5天的PC3(ad)和U87MG(e-g)细胞的EM影像。箭号，降解的自体溶酶体。双箭号，起始AV。箭头，自噬体隔离膜(phagophore isolation membrane)。M，AV中的线粒体。星号，糖原粒子簇(glycogen particle clusters)。棒：(a，b，f和g)0.5μm:(c和d)200nm;(e)1μm。(B)在具有和不具有Dox诱导的shAkt123表达的PC3和U87MG细胞的随机取样的胞质面积(n=5，＞200μm2面积)中，每4.5μm2(n≥64)的单位胞质面积AV的数量和由AV占据的胞质面积百分数的定量。误差棒代表SEM。(e)Dox诱导的Akt沉默导致在PC3和U87MG肿瘤中的退化。(C)(a)在15天的Dox处理后表达对照EGFPshRNA的PC3肿瘤。所述肿瘤细胞含有大的细胞核及核仁、一些脂滴(星号)，并通过细胞接合(celljunctions)(箭头)来连接。(b-d)在15天(b和c)或10天(d)的Dox处理后表达shAkt123的PC3肿瘤。(b)在这些肿瘤中的细胞和细胞核常显得皱缩。箭号，AV。E，嗜酸性粒细胞。(c)在退化肿瘤细胞中的膨胀的RER潴泡(cisternae)之中发现的两个AV(箭号)。(d)具有人类LAMPl的免疫金标记的超薄冷冻切片。标记出现在溶酶体(箭号)和AV(顶部插图(top inset))上。一些肿瘤细胞还含有人类LAMPl-阳性的致密体，所述致密体具有让人想起微自噬的形状(底部插图(bottom inset);de Waal，E.J.，H.Vreeling-Sindelarova，J.P.Schellens，J.M.Houtkooper，and J.James，(1986)，Quantitative changes inthe lysosomal vacuolar system of rat hepatocytes during short-term starvation.Amorphometric analysis with special reference to macro-and microautophagy.Cell Tissue Res.243:641-8)。所述肿瘤细胞具有加宽的核被膜和ER池(cistern)(星号)，所述ER池含有小的胞质岛(箭头)。(e)媒介物处理5天后的U87MG肿瘤。(f-h)Dox处理5天后的U87MG-shAkt123肿瘤。箭号，AV。(h)在一些肿瘤样品中，出现具有糖原簇(星号)和含糖原AV的细胞。棒:(a-c)2μm:(e和f)1μm:(g)0.5μm:(d和h)200nm。
图4描述与AktKD组合的抗溶酶体药剂(lysosomotropic agent)加速的细胞死亡。(A)CQ处理引起在Dox-处理的PC3-shAkt123细胞中GFP-LC3点的积聚。将稳定表达GFP-LC3的PC3-shAkt123细胞用或不用1μg/ml Dox预处理6天并用或不用10μMCQ处理。CQ处理的1天后将GFP荧光成像。箭头指向代表性GFP点或丛。棒，10μm.(B)shAkt123和10μM CQ对用或不用Dox或CQ处理的PC3-shAkt123细胞中的LC3加工、PARP分裂和总Akt的影响。LC3-II对LC3-I的比和分裂的(Cl)对全长(FL)PARP的比是从CQ处理的第1天和第2天进行的细胞裂解液免疫印迹来定量的。显示了第2天样品的免疫印迹。附加说明地，邻近各个蛋白以千道尔顿为单位标明分子量。数据是三个独立实验的代表。(C)在诱导以表达shAkt123的PC3细胞中CQ促进细胞死亡，而3-MA预处理延迟该作用。在细胞接种到具有或没有Dox的含10μM CQ或2.5nM Ba的新鲜培养基之前，用1μg/ml Dox对PC3-shAkt123细胞预孵育3天以诱导shRNA表达。在预处理期间和预处理之后，都与Dox一起加入1mM3-MA。在0.5%(e)或0%(D)FBS(在0%FBS下，仅用Ba处理2天和3天的细胞)下，在第2天、第3天和第4天测定细胞生存力(viability)。在0.5%FBS下，在第2天、第3天和第4天测定膜联蛋白V-阳性的PI-阴性的种群的百分数。在0%FBS下，在第2天和第3天测定半胱天冬酶-3/7活性并表示为标准化至相同细胞数量的相对荧光单位(RFU，以千为单位)。误差棒代表三个独立实验的SD。
图5描述与III-5组合的CQ加速的细胞死亡。(A)在0.5%FBS下，在存在或缺少10μM CQ条件下，用DMSO或0.5μM III-5处理PC3细胞。在第2天、第3天和第5天通过PI排除测定细胞生存力。在第2天和第3天分析膜联蛋白V染色并将其分解成PI+或PI-种群。(B)在具有或没有10μMCQ或3mM3-MA的情况下，在用0.5(III-5-0.5)或20μM(III-5-20)III-5处理的PC3细胞中细胞生存力的时间过程。在存在或缺少CQ的情况下，将在1%FBS下用III-5预处理24小时的PC3细胞分离至含有0.5%FBS的培养基中。在CQ加入前24小时，加入3-MA，然后立即加入III-5。在CQ加入后的指定时间点，通过PI排除测定细胞生存力。误差棒代表SEM(n=3)。由免疫印迹的定量来测定LC3-II对LC3-I的比。(C)CQ显著增加了用III-5处理的PC3细胞中MDC+空泡的大小和数量，而3-MA遏制该作用。细胞在含有0.5%FBS的培养基中培养并用DMSO、0.5μM III-5、10μM CQ和5mM3-MA如所标明地单独或组合处理。显示了在48小时的MDC染色。棒，10μm.
图6描述与II-4组合的CQ加速的细胞死亡。(A)0.5%FBS下在存在或缺少10μM CQ情况下用DMSO或4μM II-4处理PC3细胞。在10天的过程中通过PI排除测定细胞生存力。误差棒代表SEM。显示了来自三个独立实验之一的代表性数据。(B)在从A中所示实验标明时间点收集的细胞裂解液的免疫印迹分析。箭头表示LC3-I和-II、CathD43和CathD28的位置。所标明标记物的定量示于C中。CathD43，组织蛋白酶D前体的43-50-kD形式。CathD28，28-kD组织蛋白酶D重链。
图7描述AVO的积聚在血浆膜破裂之前并与用Akt抑制剂(“Akti”)(在该实施例中，化合物II-4)和CQ处理的凋亡和除核细胞的出现有关。(A)使用时差显微镜跟踪用DMSO、10μM II-4、10μM CQ或者二者在5%FBS下处理的PC3细胞3天。显示了在标明时间点所述细胞的代表性影像。白色箭头表示用两种药剂处理的细胞中血浆膜破裂前两个相邻细胞间的融合。棒，10μm.(B)将以标明的药剂的处理的PC3细胞用AO染色并通过多谱段成像流式细胞仪来分析。显示了(左侧)亮视野(BF)、胞核(绿色)、空泡(红色)和进行各个处理的三种代表性细胞的绿色/红色复合影像。棒，10μm。(中间)AO绿强度对AO绿色明亮细节面积作图揭示了三种不同的种群：R2除核细胞、R3凋亡的细胞和R4活细胞。(右侧)R4的AO红强度在具有任意关口(arbitrarygate)(R5)的直方图上作图，该直方图用来包括具有最亮AO红强度的事件。R2、R3和R4直方图只在Akti(II-4)+CQ绘图中被叠加。(C)B中所示各个种群的统计。*，全体单个细胞的百分数；**，R4活细胞的平均荧光强度；***，R4活细胞的百分数。
图8描述Akt抑制诱导线粒体过氧化物和细胞ROS产生，其被CQ增强。(A)将在0.5%FBS中培养的PC3细胞用DMSO、3μM II-4、10μM CQ或两者处理，用MitoSOX红色染料染色并通过荧光显微镜来检查。显示了在24小时的影像。棒，10μm。(B)将如A中所处理的PC3细胞用Image-iTLIVEgreenROSDetection试剂盒染色并在24小时通过荧光显微镜来检查。还显示了细胞的亮视野(BF)影像。棒，10μm。(C)在24h通过流式细胞仪的MitoSOX红色和ROS绿色荧光强度的定量。细胞如A和B中那样处理。误差棒代表SEM(n=3)。
图9描述CQ在体外Akti-处理的无PTEN细胞中选择性加速细胞死亡并在体内增强Akt KD的抗肿瘤效力。(A)PTEN-/-(-/-)MEF比等基因的PTEN+/+(+/+)相似物对用II-4和CQ的组合处理方法更敏感。1%FBS下将MEF用各5μM的II-4和CQ处理，并在第0天、第2天和第3天通过PI排除测定细胞生存力。误差棒代表SEM(n=3)。(B)在28天期间内每天用媒介物(Veh)、仅Dox、仅CQ或Dox和CQ两者处理的PC3异种移植物肿瘤的平均肿瘤体积。由于来自肿瘤负荷的体重减轻，所述媒介物和媒介物+CQ组在结束前至多跟踪18天。误差棒代表SEM(n=各队列中10个肿瘤)。(C)在第28天仅Dox和Dox+CQ组中肿瘤体积的散点图(P=0.05)。水平线表示平均肿瘤体积。对各个组标明了完全缓解肿瘤的数量(CR，虚线)。(D)与A中所示仅Dox和Dox+CQ队列第0天相比，绘制成肿瘤体积变化的百分数的个体肿瘤生长。虚线表示从起始肿瘤体积的-100%变化，即，完全肿瘤消退。标明了在第28天具有比起始肿瘤体积小(《0%变化)或大(＞0%变化)的肿瘤的数量。
图10描述用组合的Aktl23KD和CQ处理方法在PC3肿瘤中增强的AV积聚和凋亡。(A)(a)仅用CQ处理5天的PC3-shAkt123肿瘤的EM影像。箭号，致密的AV和溶酶体；N，核仁。(b)仅Dox。箭号，AV具有比a中较不致密的外观。(c和d)Dox和CQ两者。(c)数目众多的致密的和扩大的AV(箭号)积聚在肿瘤细胞中。凋亡的细胞(Ap)部分地被巨噬细胞(M)所包围。T，肿瘤细胞。(d)AV-负载的(箭号)肿瘤细胞之中的凋亡的胞核(Ap)。插图，各个肿瘤中AV(a-c)和反常线粒体(*)的扩大影像。棒:(a-c)2μm:(d)1μm。(B)随机取样的胞质面积(n=6，＞80μm2面积)中由AV所占据的胞质面积百分数的定量。(C)随机取样的肿瘤细胞核(n=3-4，100个肿瘤细胞核的组)之中凋亡胞核的百分数。(B和C)误差棒代表SEM；与其它三个组相比*，P＜0.0005。
图11描述通过shRNA的Akt敲低诱导自噬基因表达。通过多西环素将PC3细胞诱导72小时以向标明的Akt亚型表达shRNA，从Dox处理的(Dox+)或未处理的对照(Dox-)细胞都提取RNA。使用Affymetrix芯片进行微点阵分析。显示了来自Dox+和Dox-样品的各自噬基因表达水平的比。数据是来自3个独立实验的平均值。
图12描述诱导自噬基因表达的Akt抑制剂。将PC3细胞用DMSO媒介物对照或各种Akt抑制剂以1或5M处理6或24小时，所述抑制剂包括1-(1-(4-(5-羟基-6-甲基-3-苯基吡嗪-2-基)苄基)哌啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮(II-1)、1-(1-(4-(6-羟基-5-异丁基-3-苯基吡嗪-2-基)苄基)哌啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮(II-2)、1-(1-(4-(7-苯基-1H-咪唑并[4，5-g]喹喔啉-6-基)苄基)哌啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮(II-4)、(S)-2-(4-氯苯基)-1-(4-((5R，7R)-7-羟基-5-甲基-6，7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-(异丙基氨基)丙烷-1-酮(III-4)和(S)-1-(3-(N-(4-(3-苯基异噁唑-5-基)噻唑-2-基)噻吩-2-酰氨基)丙基)哌啶-2-酰胺(IV-1)。从所述细胞中提取RNA。使用Affymetrix芯片进行微点阵分析。将各自噬基因的表达水平标准化至所述DMSO对照。数据是来自3个独立实验的平均值。
图13描述各种mTOR、PI3K和Akt抑制剂单独诱导如流式细胞仪中通过侧向散射(SSC)测量的增加的自噬空泡积聚。抑制剂包括3-苯基-2-(4-((4-(5-(吡啶-2-基)-1H-1，2，4-三唑-3-基)哌啶-1-基)甲基)苯基)-1，6-二氮杂萘-5(6H)-酮(II-3)、2-(4-(3-乙基脲基)苯基)-4-(1，4-氧杂氮杂环庚烷-4-基)-5H-吡咯并[3，4-d]嘧啶-6(7H)-羧酸苄酯(III-1)；1-乙基-3-(4-(4-吗啉代-7-(嘧啶-2-基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，4-d]嘧啶-2-基)苯基)脲(III-2)、(R)-1-(4-((2-(2-氨基嘧啶-5-基)-7-甲基-4-吗啉代噻吩并[3，2-d]嘧啶-6-基)甲基)哌嗪-1-基)-2-羟基丙烷-1-酮(III-3)、4-(2-(1H-吲哚-4-基)-6-((4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-基)吗啉(III-6)、(S)-N-(4-(苯并[d][1，3]间二氧杂环戊烯-5-基)噻唑-2-基)-N-(3-(2-甲酰基哌啶-1-基)丙基)噻吩-2-酰胺(IV-2)和雷帕霉素。
图14描述当与各种mTOR、PI3K和Akt抑制剂组合时，CQ(10μM)增加自噬空泡的数量和大小。
图15描述各种mTOR、PI3K和Akt抑制剂单独诱导如吖啶橙染色后通过红色对绿色荧光比测量的增加的自噬空泡积聚。
图16描述当与各种mTOR、PI3K和Akt抑制剂组合时，CQ增加如吖啶橙染色后通过红色对绿色荧光比测量的自噬空泡的积聚。
图17描述Akt抑制剂III-4和PI3K抑制剂III-6两者均与CQ协同起作用，以加速细胞死亡。
图18描述癌细胞系中Akt亚型的相对水平和U87MG细胞和异种移植物肿瘤中Akt亚型可诱导的敲低。(A)肿瘤细胞系中各Akt亚型的相对表达水平。将来自各细胞系全体细胞裂解液中的Akt蛋白质通过用亚型特异性抗体的蛋白质印记分析来分析，并用装载到相同凝胶上的各亚型的重组蛋白质作为标准物来定量。数据是两个独立实验的代表。(B)表达可诱导shRNA构建物的U87MG细胞中Akt KD的蛋白质印记验证。将U87MG细胞的稳定库(Stable pools)用1mg/mlDox诱导3天以表达shRNA，所述细胞含有标明的靶向各自Akt亚型的构建物。用标明的抗体分析全体细胞裂解液。测定GAPDH水平作为加载对照(loading control)。附加说明地，邻近各蛋白质以kDa为单位标明分子量。(C-F)将含有标明的shRNA的U87MG异种移植物肿瘤用媒介物对照或Dox处理。各队列由十只小鼠组成。(G)Dox对野生型PC3细胞的生长没有影响。(H)由第二shAkt1构建物诱导的PC3肿瘤生长迟缓。误差棒代表SEM。*P＜0.05；**p＜0.005。
图19描述shGFP和Akt亚型KD对细胞周期进展、凋亡和自噬的影响。(A)用或不用Dox处理方法(1μg/ml96小时)的含标明的shRNA的PC3稳定克隆的稳态细胞周期特征。误差棒代表2个独立实验的标准偏差。(B)与不用Dox处理方法的相同克隆相比，表示为用Dox处理方法的各期当中变化百分数的(A)中的细胞周期特征。数据是至少2个具有供各条件分析的至少0.5x106个细胞的独立实验的代表。(C)有或没有Dox-诱导的shGFP表达的AV数量中未显示明显差异的PC3和U87MG细胞每4.5μm2(n=130)单位胞质面积AV数量的EM定量。误差棒代表SEM。(D)与未处理的对照相比，Dox-诱导的shAktl23表达5天后，PC3和U87MG细胞中增加的点状LC3免疫荧光染色。棒，10μm。(E)在标明的处理下，具有GFP-LC3小点的PC3-shAktl23细胞的百分数。将稳定表达GFP-LC3的PC3-shAktl23细胞如图4中那样预处理，并测定具有＞5个点状GFP可视小点的细胞的百分数。注意，虽然CQ治疗方法单独在细胞中引起核周的GFP-LC3丛，但是这些在形态学上不同于Dox处理的细胞中广布的胞质GFP-LC3小点。误差棒代表来自各具有至少15个细胞的2个随机视野的标准偏差。(F)CQ处理方法引起Dox-处理的表达shAktl23的PC3细胞中MDC-标记的空泡的积聚。用MDC标记前，存在或缺少1μg/ml Dox情况下，用或不用10μM CQ，将PC3-shAkt123细胞孵育5天。比例棒：10μm。(G)用1μg/ml Dox、10μM CQ或两者处理的吖啶橙染色的PC3-shAktl23细胞的流式细胞仪分析。FL1-H表示胞核绿色荧光的强度。FL3-H表示AVO红色荧光的强度。在直方图上标明具有高FL3-H/FL1-H比细胞的百分数，所述细胞具有高AVO水平的特性(Paglinetal.，2001)。所示数据是三个独立实验的代表。
图20.LAMP2、Atg7、蛋白酶抑制剂、组织蛋白酶DsiRNA和胃蛋白酶抑制剂A与PI-103或Akti-1/2组合对PC3细胞生存力的影响。(A)与非靶向的对照寡核苷酸(siCtrl)相比，由siRNA寡核苷酸a-d及其库显示LAMP2的KD的免疫印迹。(B)LAMP2siRNA寡核苷酸对PC3细胞生存力的影响。0.5%FBS下将PC3细胞用80nM siRNA转染，转染2天后加入PI-103(0.5μM)或DMSO并在PI-103加入4天后分析细胞生存力(PI排除)。(C)用Atg7siRNA库(Santa Cruz)或非靶向的对照寡核苷酸转染的PC3细胞的Atg7免疫印迹。(D)不同处理方法下Atg7siRNA寡核苷酸对PC3细胞生存力的影响。0.5%FBS下将PC3细胞用20nM siRNA转染，转染2天后加入具有或没有CQ(10μM)的Akti-1I2(5μM)或DMSO并在化合物加入2天和3天后分析细胞生存力(PI排除)。*，两种条件间P＜0.05。(E)用与DMSO、10μMCQ、3μMAkti-1/2或Akti-1/2和CQ两者一起加入的标明浓度的zVAD.fmk处理的PC3细胞。在第3天通过PI排除测定细胞生存力。*，两种条件间P＜0.05；**，两种条件间P＜0.001。(F)用与DMSO、10μMCQ、3μM Akti-1/2或Akti-1/2和CQ两者一起加入的标明浓度的zFA.fmk处理的PC3细胞。在第3天通过PI排除测定细胞生存力。*，两种条件间P＜0.05；**，两种条件间P＜0.001。(F)用与DMSO、10μM CQ、3μM Akti-1/2或Akti-1/2和CQ两者一起加入的标明浓度的zFA.fmk处理的PC3细胞。在第3天通过PI排除测定细胞生存力。*，与单独的Akti-1/2或者单独的zFA.fmk处理的细胞相比，P＜0.05。(G-H)DMSO、10μM CQ、3μM Akti-1/2或Akti-1/2和CQ两者加入前用标明浓度的CA-074-Me(G)或ALLN(H)预处理2小时的PC3细胞。在第3天通过PI排除测定细胞生存力。*，与单独的Akti-1/2或者单独的蛋白酶抑制剂处理的细胞相比，P＜0.05。(I)不同处理方法下组织蛋白酶DsiRNA寡核苷酸对PC3细胞生存力的影响。0.5%FBS下将PC3细胞用10nM组织蛋白酶D siRNA库(Santa Cruz)或非靶向对照转染，转染2天后加入具有或没有CQ(10μM)的Akti-1/2(5μM)或DMSO并在化合物加入2天后分析细胞生存力(PI排除)。通过右上角所示免疫印迹分析确认组织蛋白酶D敲低。(J)不同处理方法下胃蛋白酶抑制剂A对PC3细胞生存力的影响。用DMSO、5μM Akti-1/2、10μM CQ或二者在0.5%FBS下用或不用200μM胃蛋白酶抑制剂A处理PC3细胞。化合物加入2天后分析细胞生存力(PI排除)。*，两种条件间P＜0.05。(B，D-J)误差棒代表SEM(n=3)。附加说明地，邻近用于A、C和I中的免疫印迹的各个蛋白以千道尔顿为单位标明分子量。
图21.与Akti-1/2组合的CQ促进的线粒体膜去极化和细胞ROS积聚。(A)CQ增强的Akti-1/2-诱导的线粒体去极化。将0.5%FBS中培养的PC3细胞用DMSO、3μM Akti-1/2、10μM CQ或两者处理，并在各个时间点用MitoPT染料(Immunochemistry Technologies，LLC)染色。显示了在48小时的影像。健康线粒体显示JC-1聚集物(MitoPT-R)的点状红色染色，而具有去极化线粒体的细胞显示JC-1单体(MitoPT-G)的弥散绿色染色。还显示了红色和绿色通道间合并的影像(MitoPT-M)。比例棒：20μm。(B)显示来自(A)中所描述处理方法的红色点状染色和弥散绿色染色的细胞的百分数。来自各处理方法荧光影像的两个随机视野的＞86个细胞被计数。误差棒代表两个视野间的标准偏差。(C)3-MA诱导的由CQ、Akti和Akti+CQ产生的ROS信号。将在0.5%FBS中培养的PC3细胞用3-MA预处理过夜，然后用DMSO、5μM Akti-1/2、10μM CQ或两者处理48小时，并用Image-iT LIVEGreen ROS Detection试剂盒染色。用激光扫描图像仪Isocyte(BlueshiftBiotechnologies)收集来自所有细胞的总的荧光强度。用488nm激光和510-540nm带通滤波器收集绿色荧光强度并将其标准化至用405nm激光和430-480nm带通滤波器通过Hoechst染色测定的细胞数量。误差棒，两个独立实验的标准偏差。(D)Nikon TE300倒置显微镜下所得的绿色ROS信号和亮视野(BF)的代表性图像。单独的Akti-1/2首先诱导ROS水平中的均匀性增加，但截止48小时所述荧光变得明显减弱并局限于核周的和胞质的类似自体溶酶体的空泡。虽然单独的CQ对ROS水平具有很小的影响，但是与Akti-1/2组合引起空泡荧光的延长的增加，以及增加的具有持续的均匀荧光的细胞种群，许多细胞显示48小时内凋亡的形态学征象。箭头指向展现空泡荧光的代表性细胞。星号表示具有均匀绿色荧光并且还展示凋亡形态学的代表性细胞。比例棒：20μm。
图22.NAC拯救的由Akti+CQ诱导的细胞死亡。(A)NAC减弱由各种处理方法诱导的MitoSOX红色信号。将PC3细胞用5mM NAC预处理1天，然后洗掉(NACpr)，并用标明的药剂处理，或者用5mM NAC预处理1小时，并在NAC(NAC)连续存在下用标明的药剂孵育。Akti-1/2加入24小时后，通过流式细胞仪测定MitoSOX信号。使用5μM Akti-1/2和10μM CQ。连续NAC处理方法对于该时间点MitoSOX红色信号减弱是必需的。(B)Akti-1/2加入4天后，通过流式细胞仪测定如(A)中那样处理的细胞的生存力(PI排除)。NAC预处理在Akti+CQ组中显示低的、轻微降低的细胞死亡，并且在连续NAC处理下看到明显的拯救。(A和B)误差棒代表SEM(n=3)。(C)将稳定表达GFP-LC3的PC3细胞如(A)中那样处理并在Akti-1/2加入48小时后通过免疫印迹来分析。β-肌动蛋白和GAPDH用作加载对照。右侧显示了标准化至GAPDH的p62和分裂的GFP水平的定量，和LC3-II对LC3-I比。Akti引起p62水平的减弱，增加LC3-I周转(内源性和GFP-LC3-I两者)以及伴随的LC3-II和分裂GFP积聚。CQ在具有和没有Akti的情况下均增加p62的水平，与其在自体溶酶体中阻断p62降解一致。由于其在自体溶酶体中阻断p62降解，CQ还诱导LC3-II和分裂GFP积聚。NAC处理方法抵消所有这些在具有或没有CQ的情况下由Akti诱导的作用，但不影响Akti抑制pAkt或pS6的能力。NACpr显示一些但比连续NAC处理方法弱的作用。(D)在Akti-1/2加入2小时后、11小时后和23小时后，在存在或缺少5mM NAC(Akt-1/2前1小时加入)情况下，用DMSO、3μM Akti-1/2处理的稳定表达GFP-LC3的PC3细胞的时差荧光影像。箭头指向具有可见的GFP-LC3小点的代表性细胞。比例棒：50μm。
图23描述用来制作特异性靶向Akt亚型的shRNA的pHUSH运载体系统。所述pHUSH运载体系统包含shRNA表达穿梭质粒(pShuttle-H1)和病毒运载体骨架(pHUSH-GW;GW=Gateway)，所述病毒运载体骨架含有TetR-IRES-Puro盒，使得能够进行Tet-调节的shRNA表达。所述Akt shRNA运载体通过以下步骤来构建：(1)设计并克隆shRNA序列至pShuttle-H1中，(2)通过Gateway(Invitrogen)重组反应，将H1-shRNA盒转移至pHUSH-GW中和(3)将完成的H1-pHUSH质粒包装成逆转录病毒。对于各shRNA，针对Akt基因的编码序列，用适当的算法设计了19bp siRNA序列。将所述shRNA序列转化成shRNA发夹结构序列，然后合成相应的双链DNA寡核苷酸并克隆成所示pShuttle-H1。通过瞬时转染至细胞和经蛋白质印记检查的各Akt亚型的敲低程度来验证pShuttle-H1运载体中各shRNA的有效性。然后将确证的H1-shRNA盒转移至pHUSH-GW运载体并包装成逆转录病毒(表1概述了所用的确证序列)。通过用单个或组合的含有shRNA的病毒的逆转录病毒感染来产生稳定表达各shRNA的细胞。对于单个Akt亚型敲低，将细胞用一个逆转录病毒运载体感染，所述运载体编码单个靶向各Akt亚型的shRNA构建物(对Akt1的构建物252和253，对Akt2的254和255，及对Akt3的259和260)并用5mg/ml嘌呤霉素选择稳定的克隆。对于双重Akt1和Akt2敲低，使用同时靶向Akt1和2两者的单个shRNA(构建物256和257)。双重Akt2和3(构建物255和261)，或三重Akt1、2和3(构建物257和261)敲低是通过以下方法来实现的：用各编码一个单个shRNA的含有不同抗生素选择标记物(嘌呤霉素和潮霉素)的两种逆转录运载体共感染细胞，并用5mg/ml嘌呤霉素和300mg/ml潮霉素选择选择稳定的克隆。对于双重Akt1和3敲低，使用单个靶向Akt1和3两者的shRNA(构建物258)，或者使用用两个shRNA运载体(构建物253和261)的共感染(表2)。表2中所示所有shRNA已在培养的细胞中被确证。异种移植物模型中确证的shRNA的效能和肿瘤抑制效果概述于表3。
图24描述通过氯喹与Akt抑制的组合诱导的细胞死亡的机制的模型。单独的Akt抑制(通过shRNA、特异性Akt抑制剂或I类PI3K抑制剂)经过多重机制可活化自噬，其包括降低的Akt下游的mTORC1活性(CorradettiMN，GuanKL.Upstream of the mammalian target of rapamicin:do all roadspass through mTOR?Oncogene(2006);25:6347-60)、增加的FoxO蛋白活性(Zhao J，Brault JJ，Schild A，Goldberg AL.Coordinate activation of autophagyand the proteasome pathway by foxO transcription factor，Autophagy(2008);4:378-80)，和降低的葡萄糖和能量代谢。发明人还观察到在具有Akt敲低或抑制的细胞中的反常线粒体的积聚和ER应激的征象(未发表的数据)，两者都可以诱导自噬(Yorimitsu T，Klionsky DJ.Endoplasmic reticulum stress:anew pathway to induce autophagy.Autophagy(2007);3:160-2)。反常线粒体可以产生ROS信号，其导致升高的损伤的线粒体的自噬除去和氧化应激的衰减(attenuation)。3-甲基腺嘌呤(3-MA)和抑制III类PI3K的其它非选择性pan-PI3K抑制剂如渥曼青霉素或LY294002阻断自噬的诱导作用。由CQ(或其它溶酶体酶活性抑制剂)引起的受损的自体溶酶体降解可以导致有害的ROS产生剂的积聚，所述ROS产生剂进一步放大ROS损伤。多重下游事件可以导致凋亡样和非凋亡的细胞死亡。不清楚是否在一些细胞中由单独的Akt抑制诱导的自噬应答可最终直接导致细胞死亡，还是需要另外的刺激(insults)。
图25A-E描述用Akt抑制剂、CQ及其组合处理的PC3细胞中的AV积聚。(照片A-C)：0.5%FBS下生长的PC3细胞用(A)DMSO对照、(B)10μMCQ和(C)5μM Akti-1/2处理1天。CQ和Akti-1/2两者都单独诱导AV的积聚(箭号)。(照片D-E)：Akti-1，2和CQ的组合处理方法导致较大AV的积聚和凋亡胞核的外观。(D)处理1天后，许多细胞含有非常大的AV(箭号)、扩张的ER潴泡(箭头)，并看起来很大程度地空泡化(小箭号)。(E)处理2天后，凋亡在大部分细胞(星号)中变得显而易见。比例棒，2μm。
图26A-B描述在多个细胞系中对单独CQ、单独AKTi III-4及其组合的测量的ED50。图26A描述CQ和AKTi的配比工作表。图26B通过以下方法描述CI(组合指数)：使用在用10%血清处理的第4天经CellTiter-Glo分析方法获得的数据的条线图。X-轴表示所述细胞系而Y-轴表示以μM为单位的浓度。AKTi与CQ的组合明显地降低AKTi和CQ两者的ED50。
图27A-B描述PC3(PTEN-、p53-和Al)细胞系的数据。图27A描述当AKTi III-4和CQ以各种比组合时，在ED50、ED75和ED90的CI值。所述数据显示，III-4:CQ的组合比分别为5:1至1:800，当具有最低的ED50、ED75和ED90值时，其为约1:1.5至约1:200，可选择地，为约1:3至约1:50，可选择地，为约1:12至约1:50，具体为约1:25。27B描述单独AKTi III-4、单独CQ和以1:25比(约所述EC50比)配制的AKTi与CQ组合的生长抑制曲线。x-轴表示以μM为单位的III-4浓度而y-轴表示对照的百分数。所述数据表明，所述组合在比单独III-4或者比单独CQ低的III-4浓度抑制细胞系的生长。
图28A-B描述MDA-361.1(PI2-K mut(E545K)、Her2+、HR+和腔(Luminal))细胞系的数据。图28A描述当AKTi III-4和CQ以各种比组合时，在ED50、ED75和ED90的CI值。所述数据显示，III-4:CQ的组合比分别为5:1至1:800，当具有最低的ED50、ED75和ED90值时，其为约1:1.5至约1:200，可选择地，为约1:3至约1:25，具体为约1:12.5。图28B描述单独AKTi III-4、单独CQ和以1:12.5的比(约所述EC50比)配制的AKTi与CQ组合的生长抑制曲线。x-轴表示以μM为单位的III-4浓度而y-轴表示对照的百分数。所述数据表明，所述组合在比单独III-4或者比单独CQ低的III-4浓度抑制细胞系的生长。
图29A-B描述MDA-MB-231(Kras、Braf、p53mut、Triple-和Basal)细胞系的数据。图29A描述当AKTi III-4和CQ以各种比组合时，在ED50、ED75和ED90的CI值。所述数据显示，III-4:CQ的组合比分别为5:1至1:800，当具有最低的ED50、ED75和ED90值时，其为约2.5:1至约1:1:3，具体为约1.25:1。图29B描述单独AKTiIII-4、单独CQ和以1.25:1比(约所述EC50比)配制的AKTi与CQ组合的生长抑制曲线。x-轴表示以μM为单位的III-4浓度而y-轴表示对照的百分数。所述数据表明，所述组合在比单独III-4或者比单独CQ低的III-4浓度抑制细胞系的生长。
图30A-B描述U87MG(PTEN-、PI3K mut(I391M))细胞系的数据。图30A描述当AKTi III-4和CQ以各种比组合时，在ED50、ED75和ED90的CI值。所述数据显示，III-4:CQ的组合比分别为5:1至1:800，当具有最低的ED50、ED75和ED90值时，其分别为约2.5:1至约1:25，可选择地，为约1.25:1至约1:3，具体为约1:1.5。图30B描述单独AKTi III-4、单独CQ和以1:1.5比(约具有最小CI的EC50比)配制的AKTi与CQ组合的生长抑制曲线。x-轴表示以μM为单位的III-4浓度而y-轴表示对照的百分数。所述数据表明，所述组合在比单独III-4或者比单独CQ低的III-4浓度抑制细胞系的生长。
图31A-C描述Panc-1(Akt2amp、Kras mut、p53mut)细胞系的数据。图31A描述当AKTi III-4和CQ以各种比组合时，在ED50、ED75和ED90的CI值。所述数据显示，III-4:CQ的组合比分别为5:1至1:800，当具有最低的ED50、ED75和ED90值时，其分别为约2.5:1至约1:1.3，具体为约1.25:1。图31B描述单独AKTi III-4、单独CQ和以1.28:1比(约具有最小CI的EC50比)配制的AKTi与CQ组合的生长抑制曲线。x-轴表示以μM为单位的III-4浓度而y-轴表示对照的百分数。所述数据表明，所述组合在比单独III-4或者比单独CQ低的III-4浓度抑制细胞系的生长。图31C描述单独AKTiIII-4、单独CQ和以1:1.56比(约具有最小CI的EC50比)配制的AKTi与CQ组合的生长抑制曲线。x-轴表示以μM为单位的III-4浓度而y-轴表示对照的百分数。所述数据表明，所述组合在比单独III-4或者比单独CQ低的III-4浓度抑制细胞系的生长。
图32A-B和34A-B描述当在所给化合物处理24小时后，各化合物与CQ组合时，表示自噬诱导作用和凋亡诱导作用之间的相关性的数据，所述数据分别在537MEL黑色素瘤细胞系和SKBR3乳腺癌细胞系中由吖啶橙染色测量。对照是DMSO。试验化合物是1-(1-(4-(7-苯基-1H-咪唑并[4，5-g]喹喔啉-6-基)苄基)哌啶-4-基)-1H-苯并[d]咪唑-2(3H)-酮(II-4)、3-苯基-2-(4-((4-(5-(吡啶-2-基)-1H-1，2，4-三唑-3-基)哌啶-1-基)甲基)苯基)-1，6-二氮杂萘-5(6H)-酮(II-3)、(S)-2-(4-氯苯基)-1-(4-((5R，7R)-7-羟基-5-甲基-6，7-二氢-5H-环戊并[d]嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-3-(异丙基氨基)丙烷-1-酮(III-4)、4-(2-(1H-吲唑-4-基)-6-((4-(甲磺酰基)哌嗪-1-基)甲基)噻吩并[3，2-d]嘧啶-4-基)吗啉(III-6)、(R)-N-(2，3-二羟基丙氧基)-3，4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯基氨基)苯甲酰胺(VII)、(S)-1-乙基-3-(4-(4-(3-甲基吗啉代)-7-(嘧啶-2-基)-5，6，7，8-四氢吡啶并[3，4-d]嘧啶-2-基)苯基)脲(III-2a)和雷帕霉素。
图33A-G和35A-G分别表示在537MEL黑色素瘤和SKBR3乳腺癌细胞中凋亡诱导作用的剂量响应曲线，所述细胞用标明的化合物单独处理或与10μM CQ一起处理，通过Annezin V(AnnV)和碘化丙啶(PI)染色测量。
在上述图中，当所述化合物与CQ组合时，在自噬诱导作用和凋亡诱导作用之间显示正相关。在所述化合物不能诱导自噬(VII)的情况下，当与CQ组合时未显示协同性凋亡诱导作用。
具体实施方式
定义
术语“新生物”包括“癌”和“癌性的”，其指或描述典型地以未调节的细胞生长为特征的哺乳动物中的生理学病症。“肿瘤”包含一种或多种癌性细胞。癌的实例包括，但不限于，癌瘤(carcinoma)、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这些癌更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)；肺癌，其包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌("NSCLC")、肺腺癌和肺鳞状细胞癌；腹膜癌；肝细胞癌；胃部癌症或胃癌(gastric orstomach cancer)，其包括胃肠癌；胰腺癌；胶质母细胞瘤；宫颈癌；卵巢癌；肝癌(liver cancer)；膀胱癌；肝细胞瘤(hepatoma)；乳腺癌；结肠癌；直肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌或子宫癌；唾液腺癌；肾癌或肾脏癌(kidney or renalcancer)；前列腺癌；外阴癌；甲状腺癌；肝癌(hepatic carcinoma)；肛门癌；阴茎癌以及头颈癌。在一个实施方案中，所述新生物不是糖酵解依赖性癌症。在另一个实施方案中，所述新生物是前列腺癌、乳腺癌、神经胶质瘤或胰腺癌。在另一个实施方案中，所述新生物是前列腺癌、乳腺癌或卵巢癌。在另一个实施方案中，所述新生物包含PTEN或PI3K突变。在另一个实施方案中，所述新生物是对Akt激酶途径的抑制剂耐药的。
如本文所用的术语“烷基”指饱和的直链或支链的一至十二个碳原子的单价烃基，其中所述烷基任选地可以独立地被一个或多个下面所描述的取代基所取代。烷基的实例包括，但不限于，甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr、正丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、异丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu、正丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、异丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu、仲丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、叔丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2，3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3，3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3、1-庚基、1-辛基等。
术语“烯基”指具有至少一个不饱和位点(即，碳-碳，sp2双键)的直链或支链的二至十二个碳原子的单价烃基，其中所述烯基任选地可以独立地被一个或多个本文所描述的取代基所取代，并包括具有“顺式”和“反式”取向的基(radicals)，或者，具有“E”和“Z”取向的基。实例包括，但不限于，乙烯基(ethylenyl)或乙烯基(vinyl)(-CH＝CH2)、烯丙基(-CH2CH＝CH2)等。
术语“炔基”指具有至少一个不饱和位点(即，碳-碳，sp三键)的直链或支链的二至十二个碳原子的单价烃基，其中所述炔基任选地可以独立地被一个或多个本文所描述的取代基所取代。实例包括，但不限于，乙炔基(-C≡CH)、丙炔基(炔丙基、-CH2C≡CH)等。
术语“碳环(carbocycle)”、“碳环基”、“碳环(carbocyclic ring)”和“环烷基”指作为单环具有3-12个碳原子或作为二环具有7-12个碳原子的单价非芳族的，饱和的或部分不饱和的环。具有7-12个原子的二环碳环，例如，可以排成二环[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]体系，而具有9-10个环原子的二环碳环可以排成二环[5，6]或[6，6]体系，或排成桥连体系如二环[2.2.1]庚烷、二环[2.2.2]辛烷和二环[3.2.2]壬烷。单环碳环的实例包括，但不限于，环丙基、环丁基、环戊基、1-环戊-1-烯基、1-环戊-2-烯基、1-环戊-3-烯基、环己基、1-环己-1-烯基、1-环己-2-烯基、1-环己-3-烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、环壬基、环癸基、环十一烷基、环十二烷基等。
“芳基”或“芳族的”意思是通过从母体芳族环体系单个碳原子上除去一个氢原子衍生的6-20个碳原子的单价芳香烃基。一些芳基在示例性结构中表示成"Ar"。芳基包括二环基，所述二环基包含稠合至饱和的、部分不饱和的环，或芳族碳环或杂环的芳香环。典型的芳基包括，但不限于，从苯(苯基)、取代的苯、萘、蒽、联苯、茚基、茚满基、1，2-二氢萘、1，2，3，4-四氢萘基等衍生的基团。芳基任选地独立地被一个或多个本文所描述的取代基所取代。
术语“杂环(heterocycle)”、“杂环基”和“杂环(heterocyclicring)”在本文中可交换使用并指3-20个环原子的饱和的，部分不饱和的(即，环内具有一个或多个双键和/或三键)或芳族的碳环基，其中至少一个环原子是选自氮、氧和硫的杂原子，剩余环原子是C，其中一个或多个环原子任选地独立地被一个或多个下面所描述的取代基所取代。杂环可以是具有3-7个环成员(2-6个碳原子和1-4个选自N、O、P和S的杂原子)的单环或具有7-10个环成员(4-9个碳原子和1-6个选自N、O、P和S的杂原子)的二环，例如，二环[4，5]、[5，5]、[5，6]或[6，6]体系。杂环在Paquette，Leo A.;"Principles of ModernHeterocyclic Chemistry"(W.A.Benjamin，New York，1968)中有描述，具体是在Chapters1，3，4，6，7，and9;"The Chemistry of Heterocyclic Compounds，Aseries of Monographs"(John Wiley&Sons，New York，1950topresent)，具体来说是在Volumes13，14，16，19，and28;and J.Am.Chem.Soc.(1960)82:5566。术语“杂环”包括杂环烷氧基。“杂环基”还包括其中杂环基稠合至饱和的，部分不饱和的环，或芳香碳环或杂环上的基。杂环的实例包括，但不限于，吡咯烷基、四氢呋喃基、二氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、二氢吡喃基、四氢噻喃基、哌啶子基、吗啉代、硫吗啉代、噻噁烷基、哌嗪基、高哌嗪基、氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基、硫杂环丁烷基、高哌啶基、氧杂环庚烷基、硫杂环庚烷基、氧氮杂
Figure BDA0000371184410000191
基、二氮杂
Figure BDA0000371184410000192
基、硫氮杂基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、吲哚啉基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、二噁烷基、1，3-二氧戊环基、吡唑啉基、二噻烷基、二硫戊环基、二氢吡喃基、二氢噻吩基、二氢呋喃基、吡唑烷基、咪唑啉基、咪唑烷基、3-氮杂二环[3.1.0]己烷基、3-氮杂二环[4.1.0]庚烷基、氮杂二环[2.2.2]己烷基、3H-吲哚基、喹嗪基和N-吡啶基脲。螺部分(Spiromoieties)也包括在本定义的范围之内。其中2个环碳原子被氧代(=O)部分所取代的杂环的实例是嘧啶酮基(pyrimidinonyl)和1，1-二氧代-硫吗啉基。本文所述杂环基团任选地独立地被一个或多个本文所描述的取代基所取代。
术语“杂芳基”或“杂芳族的”指5-元、6-元或7-元环的单价芳基，并包括5-20个原子的稠合环体系(其中至少一个是芳族的)，其含有一个或多个独立地选自氮、氧和硫的杂原子。杂芳基的实例是吡啶基(其包括，例如2-羟基吡啶基)、咪唑基、咪唑并吡啶基、嘧啶基(其包括，例如，4-羟基嘧啶基)、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、喹啉基、异喹啉基、吲哚基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、噌啉基、吲唑基、吲嗪基、酞嗪基、哒嗪基、三嗪基、异吲哚基、蝶啶基、嘌呤基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、噻二唑基、呋咱基、苯并呋咱基、苯并噻吩基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、二氮杂萘基和呋喃并吡啶基。杂芳基任选地独立地被一个或多个本文所描述的取代基所取代。
在可能的情况下，所述杂环或杂芳基可以是碳连(碳-连接的)、氮连(氮-连接的)或氧连(氧-连接的)。例如且不限于，碳结合的杂环或杂芳基结合在吡啶的2、3、4、5或6位，哒嗪的3、4、5或6位置，嘧啶的2、4、5或6位，吡嗪的2、3、5或6位，呋喃、四氢呋喃、噻喃、噻吩、吡咯或四氢吡咯的2、3、4或5位，噁唑、咪唑或噻唑的2、4或5位，异噁唑、吡唑或异噻唑的3、4或5位，氮丙啶的2或3位，氮杂环丁烷的2、3或4位置，喹啉的2、3、4、5、6、7或8位或异喹啉的1、3、4、5、6、7或8位。
术语“治疗或处理(treat)”和“治疗方法或处理方法(treatment)”都指治疗学的处理方法和预防疾病的或预防性措施，其预防或减慢(减少)不期望的生理学变化或障碍，如癌的生长、发展或扩散。在一个实施方案中，术语“处理”和“处理方法”指治疗学的处理方法，其减慢(减少)不期望的生理学变化或障碍，如癌的生长、发展或扩散。对本发明来说，有益的或期望的临床效果包括，但不限于，症状的缓解、疾病程度的减轻、疾病的稳定(即，不恶化)状态、疾病进展的延迟或放缓、疾病状态的改善或缓和，及减轻(不论部分的或完全的)，不论可检测到的或不可检测到的。“处理方法”还可以表示与如果不接受治疗预期的生存相比延长的生存。需要治疗的那些患者包括已具有病症或障碍的那些患者以及有患病症或障碍倾向的那些患者或其中要预防病症或障碍的那些患者。
如本文所用，“糖酵解依赖性癌症”意思是指癌症，其特征在于除可以通过自噬获得的能量外，癌细胞的基本上所有的能量需求依赖葡萄糖代谢。糖酵解依赖性癌症的癌细胞可以容许某种水平的非糖酵解代谢，但是这种水平不能防止癌细胞在缺少葡萄糖能量来源下通过凋亡或自噬经历细胞死亡。有多种方法确定癌症是否依赖于糖酵解。可以切除肿瘤样品并在体外通过若干熟知的分析方法的任意一种检查以确定所述细胞是否依赖于糖酵解。这些方法可以确定所述细胞是否利用需氧或厌氧的糖酵解。FDG-PET扫描技术用高水平的葡萄糖摄取作为检测的标记物。摄取可检测到的葡萄糖衍生物18-氟-2-脱氧葡萄糖的癌细胞可位于患者解剖学的计算机影像上。通过FDG-PET扫描技术可以检测的那些癌症具有依赖于糖酵解的高度可能性。
短语“治疗有效量”意思是本发明化合物的量，其(i)治疗具体疾病、病症或障碍，(ii)减弱、改善或消除所述具体疾病、病症或障碍的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文所描述的具体疾病、病症或障碍的一种或多种症状的发作。在癌症情况下，所述药物的治疗有效量可以减小癌细胞的数量；减小肿瘤大小；抑制(即，慢至某种程度和/或停止)癌细胞浸润至外周器官；抑制(即，慢至某种程度和/或停止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上缓解(relieve)与所述癌症相关的一种或多种症状。在所述药物可防止生长和/或杀死现有癌细胞的情况下，其可以是细胞生长抑制的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，功效可被测量，例如，通过评估至疾病进展的时间(TTP)和/或确定响应率(RR)。
术语“哺乳动物”包括，但不限于，人类、小鼠。大鼠、豚鼠、猴子、狗、猫、马、牛、猪和羊及家禽。
如本文所用的短语“可药用的盐”，指本发明化合物可药用的有机盐或无机盐。示例性的盐包括，但不限于，硫酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、蔗糖盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐(methanesulfonate)“甲磺酸盐(mesylate)”、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即，1，1'-亚甲基-二-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。可药用的盐可包含另一种分子如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其它抗衡离子。所述抗衡离子可以是稳定母体化合物上的电荷的任何有机或无机部分。此外，可药用的盐可以在其结构中具有多于一个带电的原子。在可药用盐包含多个带电原子的情况下，可药用盐可具有多个抗衡离子。因此，可药用的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
如果本发明的化合物是碱，期望的可药用的盐可以通过本领域中可得的任何适宜方法来制备，例如用无机酸对游离碱的处理，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、磷酸等，或用有机酸对游离碱的处理，所述有机酸如醋酸；马来酸；琥珀酸；扁桃酸；富马酸；丙二酸；丙酮酸；草酸；乙醇酸；水杨酸；吡喃糖酸(pyranosidyl acid)，如葡萄糖醛酸或半乳糖醛酸；α羟基酸，如柠檬酸或酒石酸；氨基酸，如天冬氨酸或谷氨酸；芳香酸，如苯甲酸或肉桂酸；磺酸，如对甲苯磺酸或乙磺酸等。例如，由P.Stahlet al，Camille G.(eds.)Handbook of Pharmaceutical Salts.Properties，Selectionand Use.(2002)Zurich:Wiley-VCH;S.Berge et al，Journal of PharmaceuticalSciences(1977)66(1)1 19;P.Gould，International J.of Pharmaceutics(1986)33 201 217;Anderson et al，The Practice of Medicinal Chemistry(1996)，Academic Press，New York;Remington’s Pharmaceutical Sciences，18th ed.，(1995)Mack Publishing Co.，Easton PA;and in The Orange Book(Food&DrugAdministration，Washington，D.C.on their website)讨论了通常认为适于从碱性药用化合物生成药学上有用的或可接受的盐的酸。将这些公开在本文引入作为参考。
如果本发明的化合物是酸，期望的可药用的盐可以通过任何适宜的方法来制备，例如，用无机碱或有机碱对游离酸的处理，所述碱如胺(伯胺、仲胺或叔胺)、碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物等。适宜盐的用作说明的实例包括，但不限于，从以下物质衍生的有机盐：氨基酸，如甘氨酸和精氨酸；氨；伯胺、仲胺和叔胺；及环状胺，如哌啶、吗啉和哌嗪；和从以下物质衍生的无机盐：钠、钙、钾、镁、锰、铁、铜、锌、铝和锂。
短语“可药用的”表明所述物质或组合物化学上和/或毒物学上与构成制剂的其它成分和/或以其治疗的所述哺乳动物是相容的。
短语“基本上对应的”意思是序列具有从已知或目标序列的无关紧要的变异。在一个实施例中，序列与已知或目标序列具有约80%同源性。在另一个实施例中，序列具有85%同源性。在另一个实施例中，序列具有90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或以上同源性。确定百分比同源性的方法在本领域内是已知的。
“溶剂化物”指一个或多个溶剂分子和本发明化合物的物理缔合物或络合物。本发明的化合物可以以非溶剂化以及溶剂化形式存在。形成溶剂化物的溶剂的实例包括，但不限于，水、异丙醇、乙醇、甲醇、DMSO、乙酸乙酯、醋酸和乙醇胺。术语“水合物”指其中所述溶剂分子是水的络合物。该物理缔合物涉及多种程度的离子键合和共价键合，其包括氢键键合。在一些实例中所述溶剂化物将能够分离，例如当一个或多个溶剂分子被掺到结晶固体的晶格里时。溶剂化物的制备通常是已知的，例如，M.Caira et al，J.Pharmaceutical Sci.，93(3)，601 611(2004)。E.C.van Tonder et al，AAPSPharmSciTech.，5(1)，article12(2004);和A.L.Bingham et al，Chem.Commun.，603604(2001)描述了溶剂化物、半溶剂化物、水合物等的类似制备。典型的、非限定的方法涉及在高于环境温度将发明化合物溶于期望量的期望溶剂(有机溶剂或水或其混合物)中，并以足够形成晶体的速率冷却所述溶液，然后通过标准方法分离所述晶体。分析技术，如I.R.光谱，显示作为溶剂化物(或水合物)的晶体中溶剂(或水)的存在。
如本文所用的术语“协同性”指比两种或更多种单个药剂累加作用更有效的治疗学组合。诱导自噬的激酶的抑制剂与一种或多种自噬抑制剂之间协同性相互作用的确定可以基于从本文所描述的分析方法中获得的效果。当活性成分是以下时，可达到协同性作用：(1)以组合的单位剂量制剂共配制并同时给药或递送；(2)作为单独制剂交替或平行递送；(3)通过一些其它用药方案。当以交替疗法递送时，当先后给予或递送所述化合物时可达到协同性作用，例如，通过单独注射器中的不同注射液。通常，在交替疗法期间，有效剂量的各个活性成分是先后给药的，即，连续地，而在组合疗法中，有效剂量的两种或更多种活性成分是一起给药的。本文所提供的组合已被评价过，且所述数据可以用定量协同作用、相加作用和拮抗作用的标准程序来分析。用于计算协同作用的程序的实例是由Chou andTalalay，in"New Avenues in Developmental Cancer Chemotherapy，"AcademicPress，1987，Chapter2所描述的程序。
如本文所用，“自噬抑制剂”意思是指组合物，所述组合物与在其缺少下经历自噬的细胞中的自噬水平相比，降低在其存在下经历自噬的细胞中的自噬水平。自噬是大量溶媒降解和胞质物质和细胞器的再循环的分解代谢过程，其特征在于胞质中自噬空泡的出现，其导致溶酶体区室中胞质细胞器和其它构成物的自体消化。虽然当允许到达其限度时自噬可以容许临界细胞杀死，自噬可以为应激条件下的细胞提供暂时的生存机制，但在具体环境下还可以使细胞易受若干形式的细胞死亡损伤。取决于所用的条件和药剂，抑制自噬可以或者促进或者抑制细胞死亡(Amaravadi，R.K.，D.Yu，J.J.Lum，T.Bui，M.A.Christophorou，G.I.Evan，A.Thomas-Tikhonenko，andC.B.Thompson，(2007)，Autophagy inhibition enhances therapy-inducedapoptosis in a Myc-induced model of lymphoma.J Clin Invest.117:326-336;Kroemer，G.，and M.Jaattela.2005.Lysosomes and autophagy in cell deathcontrol.Nat Rev Cancer.5:886-97;Levine，B.，andJ.Yuan，(2005)，Autophagyin cell death:an innocent convict.J Clin Invest.115:2679-2688;Lockshin，R.A.，and Z.Zakeri，(2004)，Apoptosis，autophagy，and more.Int J Biochem Cell Biol.36:2405-19)。自噬是具有不同阶段的分解代谢过程。这些阶段包括诱导期、隔离期(sequestration)、融合期和降解期。自噬抑制剂可抑制所述阶段中的一个或多个。在一个实施方案中，自噬抑制剂抑制更后的自噬阶段。在一个实施例中，自噬抑制剂抑制自噬的隔离期、融合期和降解期。在一个实施例中，自噬抑制剂抑制自噬的融合期和降解期。在一个实施例中，自噬抑制剂抑制自噬的降解期。有用的自噬抑制剂包括siRNA；反义RNA；抑制LAMP2、LAMP1或自噬(Atg)基因(例如，Atg1、Atg4、Atg8、Atg5、Atg7或Atg12)表达或功能的药剂；3-甲基腺嘌呤；抗溶酶体药剂(其也可为抗寄生物药)，如氯喹、羟氯喹(hydroxychloroquine)或苏拉明(suramin)，空泡质子-ATP酶抑制剂，如巴弗洛霉素A1(Bafilomycin A1)，作用于循环系统的药剂，如胺碘酮(Amiodarone)或哌克昔林(Perhexilene)，细胞毒素药剂，如长春碱(Vinblastine)，影响脂质代谢的药剂，抗生素，如莫能星(monensin)或激素，如胰高血糖素或雌二醇，抗溶酶体药剂，如氯化铵、cAMP或甲胺，ATP酶抑制剂，蛋白酶抑制剂，溶酶体蛋白酶抑制剂如组织蛋白酶抑制剂和组织蛋白酶敲低(cathepsin knockdown)，以及LAMP敲低，例如LAMP1和LAMP2。在另一个实施方案中，溶酶体活性调节剂可以与诱导自噬的激酶的抑制剂组合以提供对于新生物的组合疗法。溶酶体是含有消化酶(酸性水解酶)的细胞器。这些酶包括消化脂质的脂酶、消化碳水化合物(例如，糖)的糖酶、消化蛋白质的蛋白酶、消化核酸和磷酸单酯的核酸酶。在一个实施例中，所述调节剂用于抑制溶酶体活性。在一个实施方案中，所述组合提供协同性作用。
激酶抑制剂
有数以百计的激酶，但并非所有激酶抑制剂都诱导自噬。例如，bRaf和MEK激酶的抑制剂不能诱导自噬。在一个实施例中，MEK抑制剂(R)-N-(2，3-二羟基丙氧基)-3，4-二氟-2-(2-氟-4-碘苯基氨基)苯甲酰胺(VII)不能诱导自噬增加。在另一个实施例中，当与化合物VII组合时，CQ不能在癌(例如，黑色素瘤和乳腺癌)细胞中诱导凋亡。本文所描述的是确定激酶抑制是否还能诱导自噬的分析方法。诱导自噬的激酶的抑制剂包括Akt(例如Akt-1、Akt-2和Akt-3)、PI3K、mTOR、PDK1和p70S6K的抑制剂。所述Akt激酶抑制剂可以是pan-Akt抑制剂、变构Akt抑制剂或者Akt-1、Akt-2或Akt-3的选择性抑制剂。
在一个实施方案中，所述Akt激酶抑制剂是式I化合物和其互变异构体、拆分的对映异构体、拆分的非对映异构体、溶剂化物及盐，所述式I化合物为：
Figure BDA0000371184410000251
对映异构体对映异构体其中，
R1是H、Me、Et和CF3；
R2是H或Me；R5是H或Me；
A是：
其中G是任选地被一个至四个R9基团所取代的苯基或任选地被卤素所取代的5-6元杂芳基；
R6和R7独立地是H；OCH3；(C3-C6环烷基)-(CH2)；(C3-C6环烷基)-(CH2CH2)；V-(CH2)0-1，其中V是5-6元杂芳基；W-(CH2)1-2，其中W是任选地被F、Cl、Br、I、OMe、CF3或Me所取代的苯基；C3-C6-环烷基，其任选地被C1-C3烷基或O(C1-C3烷基)所取代；羟基-(C3-C6-环烷基)；氟代-(C3-C6-环烷基)；CH(CH3)CH(OH)苯基；任选地被F、OH、C1-C3烷基、环丙基甲基或C(=O)(C1-C3烷基)所取代的4-6元杂环基；或任选地被一个或多个基团所取代的C1-C6-烷基，所述基团独立地选自OH、氧代、O(C1-C6-烷基)、CN、F、NH2、NH(C1-C6-烷基)、N(C1-C6-烷基)2、环丙基、苯基、咪唑基、哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、四氢呋喃基、氧杂环丁烷基或四氢吡喃基，或者R6和R7与它们所连接的氮一起形成任选地被一个或多个基团所取代的4-7元杂环，所述基团独立地选自OH、卤素、氧代、CF3、CH2CF3、CH2CH2OH、O(C1-C3烷基)、C(=O)CH3、NH2、NHMe、N(Me)2、S(O)2CH3、环丙基甲基和C1-C3烷基；
Ra和Rb是H，或者Ra是H，且Rb和R6与它们所连接的原子一起形成具有一个或两个环氮原子的5-6元杂环；
Rc和Rd是H或Me，或者Rc和Rd与它们所连接的原子一起形成环丙基环；
R8是H、Me、F或OH，或者R8和R6与它们所连接的原子一起形成具有一个或两个环氮原子的5-6元杂环；
各个R9独立地是卤素、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、O-(C1-C6-烷基)、CF3、OCF3、S(C1-C6-烷基)、CN、OCH2-苯基、CH2O-苯基、NH2、NH-(C1-C6-烷基)、N-(C1-C6-烷基)2、哌啶基、吡咯烷基、CH2F、CHF2、OCH2F、OCHF2、OH、SO2(C1-C6-烷基)、C(O)NH2、C(O)NH(C1-C6-烷基)，和C(O)N(C1-C6-烷基)2;
R10是H或Me；和
m、n和p独立地是0或1。
另一个实施方案包括式I的Akt抑制剂，其中R1是甲基；R2、R5和R10是H；G是任选地被1-3个R9所取代的苯基；R9是卤素、C1-C3烷基、NC、CF3、OCF3、OCH3或OCH2苯基；Rc和Rd是H或甲基；m、n和p是0或1；且R8是H或甲基。
另一个实施方案包括式I的Akt抑制剂，其包括化合物：
Figure BDA0000371184410000281
式I化合物的制备
式I化合物可以按照2007年7月5日提交的题为“Hydroxylated andMethoxylated Pyrimidyl Cyclopentanes as AKT Protein Kinase Inhibitors”的美国专利申请11/773,949中所描述的方法来制备，本文将其引入作为参考用于所有目的。
式I化合物可以单个制备或作为化合物库制备，所述化合物库包含至少2个化合物，例如5至1,000个化合物，或10至100个化合物。式I化合物库可以通过组合的‘裂分-混合’合成法('split and mix'approach)或通过多重平行合成使用溶液相或者固相化学来制备。
为作说明，方案1-4表示制备式I化合物以及关键中间体的通用方法。本领域的技术人员应当理解，可以使用其它合成路线。虽然具体的起始原料和试剂在方案中有描述并在下面讨论，但是其它起始原料和试剂可易于被取代以提供多种衍生物和/或反应条件。此外，可根据本公开使用本领域技术人员已知的常规化学进一步修饰通过下面所描述方法制备的多种化合物。
Figure BDA0000371184410000291
方案1
方案1表示制备式I化合物10的方法，其中R1是H，R2是OH且R5是H。碱(如KOH)存在下，在适当溶剂(如乙醇)中，嘧啶2的生成可通过酮酯1与硫脲的反应来实现。在标准还原条件下(例如，Raney Ni和NH4OH)将化合物2的巯基还原，提供化合物3，然后可将羟基嘧啶3在标准条件(例如，在DIEA/DCE中的POCl3)下氯化，提供化合物4。然后将化合物4在标准条件(例如，在适当溶剂如CHCl3中的MCPBA)下氧化，给出嘧啶-氧化物5。用乙酸酐处理嘧啶-氧化物，给出重排产物6。化合物7通过以下方法得到：在标准SNAr反应条件下化合物6与适当取代的哌啶反应，提供化合物7。将化合物7水解以提供化合物8，然后将化合物8脱保护，得到中间体9。在偶合试剂(如HBTU)存在下，用适当氨基酸酰化哌嗪基环戊并[d]嘧啶9，如有必要接下来脱保护，给出式I化合物10。
Figure BDA0000371184410000301
方案2
方案2表示制备式I化合物22、25和27的方法，其中R1、R2和R5是甲基。按照方案2，(+)-长叶薄荷酮11与溴的溴化给出二溴化物12。用碱(如乙醇钠)对二溴化物12的处理提供蒲勒烯酸酯(pulegenate)13。蒲勒烯酸酯13的臭氧解给出酮酯14。在碱(如KOH)存在下，在乙醇中用硫脲处理酮酯14，接下来在标准条件(例如氨中的Raney Ni催化剂)下还原巯基，提供羟基嘧啶16。在标准条件(例如，POCl3)下氯化羟基嘧啶16，提供4-氯嘧啶17。用氧化剂(如MCPBA或过氧化氢)氧化4-氯嘧啶17，提供N-氧化物18。用乙酸酐的N-氧化物18的重排得中间体19。按照方案1中所描述的操作步骤，化合物19与期望的哌嗪反应，提供其中R5是H的化合物20，和其中R5是Me的化合物23。使用具有手性固定相的HPLC手性分离化合物20和23，，然后用碱(如氢氧化锂)处理水解，分别提供化合物21和24。脱保护后，化合物21和24随后分别与适当的氨基酸反应，提供化合物22和25。
可替换地，在碱(如NaH或KOH)存在下，可将化合物24的7-羟基用烷基化试剂(如烷基卤化物)烷基化，提供化合物26，其中R2是Me。脱保护后，化合物26随后与适当的氨基酸反应，提供化合物27。
Figure BDA0000371184410000311
方案3
方案3表示制备化合物73和74的可替换方法。按照方案3，使用氨合成子的14的氨基化给出63。在50℃-250℃和/或在高压下，在甲酰胺存在下，使用例如甲酸铵实施嘧啶生成，给出二环单元64。使用例如POCl3或SOCl2活化64，给出活化的嘧啶65。在0℃-150℃使用适宜保护的/取代的哌啶取代该离去基团，给出哌啶66。在-20℃-50℃使用例如间氯过氧苯甲酸(“MCPBA”或“m-CPBA”)或
Figure BDA0000371184410000312
氧化，给出N-氧化物67。用酰化试剂(例如乙酸酐)处理，接下来加热(40℃-200℃)引起重排，给出68。在0℃-50℃用例如LiOH或NaOH水解，给出醇69。在适当温度用例如Swern条件、MnO4或吡啶-SO3络合物氧化，给出酮70。在氢、CBS催化剂或硼氢化物还原剂存在下，在手性配体存在下，使用例如催化性手性催化剂进行不对称还原，在醇71或72处产生(R)立体化学或者产生(S)立体化学。可替换地，可使用非手性还原剂(例如H2，Pd/C)，从而使环戊烷单元上的甲基提供面式选择性和基本上非对映立体选择性。如果还原给出较低的非对映立体选择性，可以通过(例如)色谱、结晶化或衍生化来分离非对映异构体。最终，Boc-基团的脱保护(例如，在0℃-50℃使用酸)，使用适当官能化的氨基酸的酰化和该氨基酸的胺的最终官能化(例如任何保护基的除去、烷基化、还原氨化或酰化，引入新的取代基)产生最终化合物73和74。
Figure BDA0000371184410000321
方案4
向化合物(1)引入手性助剂(例如Evans噁唑烷酮等等)可以通过标准酰化操作步骤来实现，给出共轭物(2)。例如，用活化剂(例如COCl2)对酸的处理或在-20℃-100℃在胺类碱存在下混合酸酐生成(例如2，2-二甲基丙酰氯)，接下来用适当的手性助剂(X)处理，给出化合物(2)。立体化学和手性助剂的选择可以决定新产生的手性中心的立体化学和非对映立体选择性。将化合物(2)用低温(例如-20℃至-100℃)的路易斯酸(例如TiCl4)和胺类碱(例如Hunig’s碱)处理，接下来在低温使用适当取代的亚胺离子前体(3)处理，产生化合物(4)。预计温度、路易斯酸和手性助剂都可影响加成加合物的非对映立体选择性。最后，温和条件(例如在-10℃-30℃的LiOH/H2O)下的皂化产生期望的酸(5)。
在另一个实施方案中，所述激酶抑制剂是下式的Akt抑制剂、其立体异构体、互变异构体或可药用的盐，
Figure BDA0000371184410000331
其中：
G是任选地被一个至三个Ra基团所取代的苯基或任选地被卤素所取代的5-6元杂芳基；
R1和R1a独立地选自H、Me、CF3、CHF2或CH2F；
R2是H、F或-OH；
R2a是H；
R3是H；
R4是H或任选地被F、-OH或-O(C1-C3烷基)所取代的C1-C4烷基；
R5和R5a独立地选自H和C1-C4烷基，或者R5和R5a与它们所连接的原子一起形成5-6元环烷基或5-6元杂环，其中所述杂环具有氧杂原子；
各个Ra独立地是卤素、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、-O-(C1-C6-烷基)、CF3、-OCF3、S(C1-C6-烷基)、CN、-OCH2-苯基、NH2、-NO2、-NH-(C1-C6-烷基)、-N-(C1-C6-烷基)2、哌啶基、吡咯烷基、CH2F、CHF2、-OCH2F、-OCHF2、-OH、-SO2(C1-C6-烷基)、C(O)NH2、C(O)NH(C1-C6-烷基)和C(O)N(C1-C6-烷基)2；和
J是1或2。
另一个实施方案包括Akt抑制剂化合物，其包括：
Figure BDA0000371184410000332
Figure BDA0000371184410000341
在一个实施方案中，所述激酶抑制剂是式II的Akt抑制剂化合物：
Figure BDA0000371184410000342
其中，R1和R2独立地是氢、C1-C5烷基、羟基、C1-5烷氧基或胺；p是选自1至6的整数；A是5-14个碳的环状的、二环的或三环的芳族或杂芳族的环，所述环可任选地被卤素、OH、氨基、二烷基氨基、单烷基氨基、C1-C6-烷基或苯基所取代，前述取代基任选地被卤素、OH、C1-C3烷基或环丙基甲基所取代；且在一个实施方案中A具有下列结构的一种：
Figure BDA0000371184410000343
其中D和E独立地是-CH或N；
其中R3和R4各自独立地是氢、卤素、OH、氨基、二烷基氨基、单烷基氨基，或C1-C6-烷基，前述取代基任选地被卤素、OH、C1-C3烷基或者环丙基甲基取代；
R5是任选地被卤素、OH、氨基、二烷基氨基、单烷基氨基或C1-C6-烷基所取代的5或6元芳族环或杂芳族环，前述取代基任选地被卤素、OH、C1-C3烷基或环丙基甲基所取代；在一个实施方案中R5是苯基；
B是具有下式的芳族的、杂芳族的、环状的或杂环状的环：
Figure BDA0000371184410000351
其中，Q、T、X和Y各自独立地选自-CH、-CH2、C=O、N或O；
Z是-CH、-CH2、C=O、N、O或-C=C–；
R6和R7独立地选自氢、卤素、羰基和5或6元的芳族或杂芳族的环，所述环任选地被卤素、OH、氨基、二烷基氨基、单烷基氨基或C1-C6-烷基所取代，前述取代基任选地被卤素、OH、C1-C3烷基或环丙基甲基所取代；在一个实施方案中R6或R7是吡啶基，或者R6和R7一起形成5-6元芳族的、杂芳族的、环状的或杂环状的环，所述环任选地被卤素、OH、氨基、二烷基氨基、单烷基氨基或C1-C6-烷基所取代，前述取代基任选地被卤素、OH、C1-C3烷基或环丙基甲基所取代；在一个实施方案中，B具有下列结构的一种：
Figure BDA0000371184410000352
其中X、Y、Q、R6和R7如上面所描述，且X’、Q’和T’是-CH或N。
在另一个实施方案中，AKT抑制剂包括具有下式的化合物或其可药用的盐或立体异构体：
Figure BDA0000371184410000353
其中：a是0或1；b是0或1；m是0、1或2；n是0、1或2；p是0、1或2；r是0或1；s是0或1；
Q选自：--NR7R8、
R1独立地选自(C=O)aObC1-C6烷基、(C=O)aOb芳基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、(C=O)aOb杂环基、(C=O)aObC3-C6环烷基、CO2H、卤素、CN、OH、ObC1-C6全氟烷基、Oa(C=O)bNR7R8、NRc(C=O)NR7R8、S(O)mRa、S(O)2NR7R8、NRcS(O)mRa、氧代、CHO、NO2、NRc(C=O)ObRa、O(C=O)ObC1-C6烷基、O(C=O)ObC3-C6环烷基、O(C=O)Ob芳基和O(C=O)Ob-杂环基，其中所述烷基、芳基、烯基、炔基、杂环基和环烷基任选地被一个或多个选自Rz的取代基所取代；
R2独立地选自C1-C6烷基、芳基、杂环基、CO2H、卤素、CN、OH和S(O)2NR7R8，其中所述烷基、芳基和杂环基任选地被一个、两个或三个选自Rz的取代基所取代；
R7和R8独立地选自H、(C=O)ObC1-C10烷基、(C=O)ObC3-C8环烷基、(C=O)Ob芳基、(C=O)Ob杂环基、C1-C10烷基、芳基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、杂环基、C3-C8环烷基、SO2Ra和(C=O)NRb 2，其中所述烷基、环烷基、芳基、杂环基、烯基和炔基任选地被一个或多个选自Rz的取代基所取代；或者
R7和R8可以与它们所连接的氮一起形成单环或二环的杂环，所述杂环各个环具有5-7元且除氮之外任选地含有一个或两个另外的选自N、O和S的杂原子，所述单环或二环杂环任选地被一个或多个选自Rz的取代基所取代；
Rz选自：(C=O)rOs(C1-C10)烷基、Or(C1-C3)全氟烷基、(C0-C6)亚烷基-S(O)mRa、氧代、OH、卤素、CN、(C=O)rOs(C2-C10)烯基、(C=O)rOs(C2-C10)炔基、(C=O)rOs(C3-C6)环烷基、(C=O)rOs(C0-C6)亚烷基-芳基、(C=O)rOs(C0-C6)亚烷基-杂环基、(C=O)rOs(C0-C6)亚烷基-N(Rb)2、C(O)Ra、(C0-C6)亚烷基-CO2Ra、C(O)H、(C0-C6)亚烷基-CO2H、C(O)N(Rb)2、S(O)mRa和S(O)2N(Rb)2、NRc(C=O)ObRa、O(C=O)ObC1-C10烷基、O(C=O)ObC3-C8环烷基、O(C=O)Ob芳基和O(C=O)Ob-杂环基，其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和杂环基任选地被至多三个取代基所取代，所述取代基选自Rb、OH、(C1-C6)烷氧基、卤素、CO2H、CN、O(C=O)C1-C6烷基、氧代和N(Rb)2；
Ra是(C1-C6)烷基、(C3-C6)环烷基、芳基或杂环基；和
Rb是H、(C1-C6)烷基、芳基、杂环基、(C3-C6)环烷基、(C=O)OC1-C6烷基、(C=O)C1-C6烷基或S(O)2Ra；
Rc选自：H、C1-C6烷基、芳基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、杂环基、C3-C8环烷基和C1-C6全氟烷基，其中所述烷基、环烷基、芳基、杂环基、烯基和炔基任选地被一个或多个选自Rz的取代基所取代。
在另一个实施方案中，AKT抑制剂包括下式化合物或其可药用的盐或立体异构体：
其中a是0或1；b是0或1；m是0、1或2；n是0、1、2或3；p是0、1或2；r是0或1；s是0或1；u、v、w和x独立地选自：CH和N，条件是仅u、v、w和x中的一个可以是N；
Q选自：--NR5R6、
Figure BDA0000371184410000372
R1独立选自(C=O)aObC1-C6烷基、(C=O)aOb芳基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、(C=O)aOb杂环基、(C=O)aObC3-C6环烷基、CO2H、卤素、CN、OH、ObC1-C6全氟烷基、Oa(C=O)bNR7R8、NRc(C=O)NR7R8、S(O)mRa、S(O)2NR7R8、NRcS(O)mRa、氧代、CHO、NO2、NRc(C=O)ObRa、O(C=O)ObC1-C6烷基、O(C=O)ObC3-C6环烷基、O(C=O)Ob芳基和O(C=O)Ob-杂环，其中所述烷基、芳基、烯基、炔基、杂环基和环烷基任选地被一个或多个选自Rz的取代基所取代；
R2独立地选自C1-C6烷基、芳基、杂环基、CO2H、卤素、CN、OH和S(O)2NR7R8，其中所述烷基、芳基和杂环基任选地被一个、两个或三个选自Rz的取代基所取代；
R7和R8独立地选自H、(C=O)ObC1-C10烷基、(C=O)ObC3-C8环烷基、(C=O)Ob芳基、(C=O)Ob杂环基、C1-C10烷基、芳基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、杂环基、C3-C8环烷基、SO2Ra和(C=O)NRb 2，其中所述烷基、环烷基、芳基、杂环基、烯基和炔基任选地被一个或多个选自Rz的取代基所取代，或者
R7和R8可以与它们所连接的氮一起形成单环或二环的杂环，所述杂环各个环具有5-7元且除氮之外任选地含有一个或两个另外的选自N、O和S的杂原子，所述单环或二环杂环任选地被一个或多个选自Rz的取代基所取代；
Rz选自：(C=O)rOs(C1-C10)烷基、Or(C1-C3)全氟烷基、(C0-C6)亚烷基-S(O)mRa、氧代、OH、卤素、CN、(C=O)rOs(C2-C10)烯基、(C=O)rOs(C2-C10)炔基、(C=O)rOs(C3-C6)环烷基、(C=O)rOs(C0-C6)亚烷基-芳基、(C=O)rOs(C0-C6)亚烷基-杂环基、(C=O)rOs(C0-C6)亚烷基-N(Rb)2、C(O)Ra、(C0-C6)亚烷基-CO2Ra、C(O)H、(C0-C6)亚烷基-CO2H、C(O)N(Rb)2、S(O)mRa和S(O)2N(Rb)2NRc(C=O)ObRa、O(C=O)ObC1-C10烷基、O(C=O)ObC3-C8环烷基、O(C=O)Ob芳基和O(C=O)Ob-杂环，其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和杂环基任选地被至多三个取代基所取代，所述取代基选自Rb、OH、(C1-C6)烷氧基、卤素、CO2H、CN、O(C=O)C1-C6烷基、氧代和N(Rb)2；
Ra是(C1-C6)烷基、(C3-C6)环烷基、芳基或杂环基；和
Rb是H、(C1-C6)烷基、芳基、杂环基、(C3-C6)环烷基、(C=O)OC1-C6烷基、(C=O)C1-C6烷基或S(O)2Ra；
Rc选自：H、C1-C6烷基、芳基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、杂环基、C3-C8环烷基和C1-C6全氟烷基，其中所述烷基、环烷基、芳基、杂环基、烯基和炔基任选地被一个或多个选自Rz的取代基所取代。
在另一个实施方案中，AKT抑制剂包括下式化合物或其可药用的盐或立体异构体：
Figure BDA0000371184410000381
其中a是0或1；b是0或1；m是0、1或2；n是0、1、2或3；p是0、1或2；r是0或1；s是0或1；u、v和x独立地选自CH和N；W是键、CH或N；
Q选自：--NR5R6、
Figure BDA0000371184410000391
R1独立地选自(C=O)aObC1-C6烷基、(C=O)aOb芳基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、(C=O)aOb杂环基、(C=O)aObC3-C6环烷基、CO2H、卤素、CN、OH、ObC1-C6全氟烷基、Oa(C=O)bNR7R8、NRc(C=O)NR7R8、S(O)mRa、S(O)2NR7R8、NRcS(O)mRa、氧代、CHO、NO2、NRc(C=O)ObRa、O(C=O)ObC1-C6烷基、O(C=O)ObC3-C6环烷基、O(C=O)Ob芳基和O(C=O)Ob-杂环，其中所述烷基、芳基、烯基、炔基、杂环基和环烷基任选地被一个或多个选自Rz的取代基所取代；
R2独立地选自C1-C6烷基、芳基、杂环基、CO2H、卤素、CN、OH和S(O)2NR7R8，其中所述烷基、芳基和杂环基任选地被一个、两个或三个选自Rz的取代基所取代；
R7和R8独立地选自H、(C=O)ObC1-C10烷基、(C=O)ObC3-C8环烷基、(C=O)Ob芳基、(C=O)Ob杂环基、C1-C10烷基、芳基、C2-C10烯基、C2-C10炔基、杂环基、C3-C8环烷基、SO2Ra和(C=O)NRb 2，其中所述烷基、环烷基、芳基、杂环基、烯基和炔基任选地被一个或多个选自Rz的取代基所取代，或者
R7和R8可以与它们所连接的氮一起形成单环或二环的杂环，所述杂环各个环具有5-7元且除氮之外任选地含有一个或两个另外的选自N、O和S的杂原子，所述单环或二环杂环任选地被一个或多个选自Rz的取代基所取代；
Rz选自：(C=O)rOs(C1-C10)烷基、Or(C1-C3)全氟烷基、(C0-C6)亚烷基-S(O)mRa、氧代、OH、卤素、CN、(C=O)rOs(C2-C10)烯基、(C=O)rOs(C2-C10)炔基、(C=O)rOs(C3-C6)环烷基、(C=O)rOs(C0-C6)亚烷基-芳基、(C=O)rOs(C0-C6)亚烷基-杂环基、(C=O)rOs(C0-C6)亚烷基-N(Rb)2、C(O)Ra、(C0-C6)亚烷基-CO2Ra、C(O)H、(C0-C6)亚烷基-CO2H、C(O)N(Rb)2、S(O)mRa和S(O)2N(Rb)2NRc(C=O)ObRa、O(C=O)ObC1-C10烷基、O(C=O)ObC3-C8环烷基、O(C=O)Ob芳基和O(C=O)Ob-杂环，其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基和杂环基任选地被至多三个取代基所取代，所述取代基选自Rb、OH、(C1-C6)烷氧基、卤素、CO2H、CN、O(C=O)C1-C6烷基、氧代和N(Rb)2；
Ra是(C1-C6)烷基、(C3-C6)环烷基、芳基或杂环基；和
Rb是H、(C1-C6)烷基、芳基、杂环基、(C3-C6)环烷基、(C=O)OC1-C6烷基、(C=O)C1-C6烷基或S(O)2Ra；
Rc选自：H、C1-C6烷基、芳基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、杂环基、C3-C8环烷基和C1-C6全氟烷基，其中所述烷基、环烷基、芳基、杂环基、烯基和炔基任选地被一个或多个选自Rz的取代基所取代。
示例性AKT抑制剂包括：
Figure BDA0000371184410000401
Figure BDA0000371184410000403
和II-2
Figure BDA0000371184410000404
在一个实施方案中，所述激酶抑制剂是Akt-1选择性抑制剂，且是式IV化合物：
Figure BDA0000371184410000411
其中A、B、D和E独立地是S、-CH、O或N，其中取决于A、B、D和E，式IV中所表示的环可以是芳族的、杂芳族的、环状的或杂环的；
p是1至6的整数；
R15和R16独立地选自氢、卤素、OH、氨基、二烷基氨基、单烷基氨基和C1-C6-烷基；
Q是5-6元芳族环或杂芳族环；在一个实施方案中Q是下列结构：
Figure BDA0000371184410000412
其中，G和G’独立地是N、S或-C=C-；
R’和R”与它们所结合的N一起形成5、6或7元杂环，所述杂环任选地被卤素、OH、氨基、二烷基氨基、单烷基氨基、C1-C6-烷基取代，且作为实例，具有下列结构，其取决于G’可以是杂芳族的或杂环的，其可以另外含有上面所列的取代基，所述结构为：
其中G’如上面所描述，
J是未取代的或取代的酰胺；
R17是5-14元的芳族或杂芳族环系，所述环系可任选地被取代；在一个实施方案中，R17具有下列结构的一种：
Figure BDA0000371184410000414
其中，X和Y独立地是N、O、S或-CH；
R18、R19和R20独立地选自卤素、OH、氨基、二烷基氨基、单烷基氨基、C1-C6-烷基或苯基，所述基团任选地被卤素、OH、C1-C3烷基或环丙基甲基所取代；或者R18和R19一起形成芳族环、杂芳族环、环或杂环。
式IV化合物包括：
Figure BDA0000371184410000421
和IV-1
Figure BDA0000371184410000422
另一个实施方案包括AKT抑制剂如哌立福辛(perifosine)，其具有式：
Figure BDA0000371184410000423
另一个实施方案包括AKT抑制剂如寡核苷酸，其包括具有以下序列的反义寡核苷酸：5'ccagcccccaccagtccact3'、5'cgccaaggagatcatgcagc3'、5'gctgcatgatctccttggcg3'、5'agatagctggtgacagacag3'、5'cgtggagagatcatctgagg3'、5'tcgaaaaggtcaagtgctac3'、5'tggtgcagcggcagcggcag3'和5'ggcgcgagcgcgggcctagc3'。
在一个实施方案中，所述激酶抑制剂是式III化合物。在一个实施例中，式III化合物包括PI3-k抑制剂。在另一个实施例中，式III化合物包括mTOR抑制剂。式III化合物具有以下结构：
Figure BDA0000371184410000424
其中A、B、D和E独立地是-CH或N；
R8和R9一起形成5元或6元的芳族的、杂芳族的、环状的或杂环状的环，所述环可任选地被取代。例如，R8和R9可与它们所连接的式III中的碳一起形成9-10元二环环系。二环环系的实施方案包括下列结构，其中
Figure BDA0000371184410000425
表示式III环中的键：
Figure BDA0000371184410000431
其中R11和R12独立地选自氢、卤素、OH、氨基、二烷基氨基、单烷基氨基、C1-C6-烷基、-C(=O)O-(CRyRz)n-W或苯基，所述基团任选地被卤素、OH、C1-C3烷基或环丙基甲基所取代，其中W是C5-12芳基或杂芳基，Ry和Rz独立地是氢、卤素、-OH或C1-6烷基；或者R11和R12一起形成5-14元的芳族或杂芳族的环。例如，R11和R12可与它们所连接的碳和上面式III中的环一起形成12-14元三环环系，且在一个实施方案中具有下列结构：
Figure BDA0000371184410000432
R’和R”与它们所结合的N一起形成具有下列结构中的一种的5、6或7元杂环，所述杂环任选地被卤素、OH、氨基、二烷基氨基、单烷基氨基、C1-C6-烷基所取代，其也可含有上面所列的取代基，所述结构为：
Figure BDA0000371184410000433
其中，G和G’独立地是C、O或N；
R10是芳族环或杂芳族环，其具有以下结构：
Figure BDA0000371184410000434
其中，X、Y、Z和Z’独立地是-CH或N；
R13是氢、卤素、OH、氨基、二烷基氨基、单烷基氨基、C1-C6-烷基或-N-(C=O)-N-R14，其中R14是C1-C6-烷基。R10的一个实例是：
Figure BDA0000371184410000441
其中，J是-N-(C=O)-N-，且R14是C1-C6-烷基。
式III化合物的实例包括PI3-k抑制剂：
Figure BDA0000371184410000442
另一个实施方案包括具有下式的mTOR抑制剂、其立体异构体、互变异构体或可药用的盐：
Figure BDA0000371184410000443
其中：
A是选自以下基团的环：吗啉4-基、3，4-二氢-2H-吡喃-4-基、3，6-二氢-2H-吡喃-4-基、四氢-2H-吡喃-4-基、1，4-氧杂氮杂环庚烷-4-基、哌啶-1-基，并任选地被1-2个取代基所取代，所述取代基选自-C(O)ORa、-C(O)NRaRb、-NRaRb、-ORa、-SRa、-S(O)2Rc、-S(O)Rc、-Rc、卤素、-NO2、-CN和-N3，其中Ra和Rb各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基和C3-6环烷基，或者Ra和Rb与各自连接的氮原子一起形成3元至6元环，且Rc选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C3-6环烷基；
R1和R2与它们所连接的原子组合形成任选取代的吡咯烷、哌啶或高哌啶环，其中所述吡咯烷、哌啶或高哌啶环的氮原子被以下基团所取代：
Figure BDA0000371184410000444
其中E是氢、C6-10芳基、C5-10杂芳基、C3-10环烷基、C3-10杂环烷基、C1-6烷基或C1-6杂烷基；且其中E任选地被1至5个取代基所取代，所述取代基选自卤素、C1-6烷基、-NRdRe、-SRd、-ORd、-C(O)ORd、-C(O)NRdRe、-C(O)Rd、-NRdC(O)Re、-OC(O)Rf、-NRdC(O)NRdRe、-OC(O)NRdRe、-C(=NORd)NRdRe、-NRdC(=N-CN)NRdRe、-NRdS(O)2NRdRe、-S(O)2Rd、-S(O)2NRdRe、-Rf、-NO2、-N3、=O、-CN、-(CH2)1-4-NRdRe、-(CH2)1-4-SRd、-(CH2)1-4-ORd、-(CH2)1-4-C(O)ORd、-(CH2)1-4-C(O)NRdRe、-(CH2)1-4-C(O)Rd、-(CH2)1-4-NRdC(O)Re、-(CH2)1-4-OC(O)Rf、-(CH2)1-4-NRdC(O)NRdRe、-(CH2)1-4-OC(O)NRdRe、-(CH2)1-4-C(=NORd)NRdRe、-(CH2)1-4-NRdC(=N-CN)NRdRe、-(CH2)1-4-NRdS(O)2NRdRe、-(CH2)1-4-S(O)2Rd、-(CH2)1-4-S(O)2NRdRe、-(CH2)1-4-NO2、-(CH2)1-4-N3或-(CH2)1-4-CN；其中Rd和Re各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基，或者Rd和Re，当与同一氮原子相连时，组合形成3-元至6-元环；Rf选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；
F选自C1-6亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基和C1-6亚杂烷基；其中F独立地被0-3个取代基所取代，所述取代基选自卤素、-NRgRh、-SRg、-ORg、-C(O)ORg、-C(O)NRgRh、-NRgC(O)Ri、-OC(O)Ri、-NRgC(O)NRgRh、-OC(O)NRgRh、NRgS(O)2NRgRh、-S(O)2Rg、-S(O)2NRgRh、-Ri、-NO2、N3、=O、-CN、-(CH2)1-4-NRgRh、-(CH2)1-4-SRg、-(CH2)1-4-ORg、-(CH2)1-4-C(O)ORg、-(CH2)1-4-C(O)NRgRh、-(CH2)1-4-C(O)Rg、-(CH2)1-4-NRgC(O)Rh、-(CH2)1-4-OC(O)Ri、-(CH2)1-4-NRgC(O)NRgRh、-(CH2)1-4-OC(O)NRgRh、-(CH2)1-4-NRgS(O)2NRgRh、-(CH2)1-4-S(O)2Rg、-(CH2)1-4-S(O)2NRgRh、-(CH2)1-4-NO2、-(CH2)1-4-N3和-(CH2)1-4-CN；其中Rg和Rh各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基，且任选地，Rg和Rh，当与同一氮原子相连时，组合形成3-元至6-元环；Ri选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；
G选自-C(O)-、-OC(O)-、-NHC(O)-、-NHC(=NOH)-、-S(O)2-和-NHS(O)2-；
m和p各自独立地是选自0至1的整数，其中如果m和p两者均是整数0，那么E不是C1-6烷基或C1-6杂烷基；
其中通过组合R1和R2形成的吡咯烷、哌啶或高哌啶环另外被0至5个取代基所取代，所述取代基选自卤素、-NRjRk、-SRj、-ORj、-C(O)ORj、-C(O)NRjRk、-NHC(O)Rj、-OC(O)Rj、-Rm、-CN和=O，其中Rj和Rk各自独立选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-5环烷基和C3-5杂环烷基，且Rj和Rk，当与同一氮原子相连时，任选地组合形成3-元至6-元环；且Rm选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-5环烷基和C3-5杂环烷基；
B选自亚苯基、亚吡啶基、亚嘧啶基、亚哒嗪基和亚吡嗪基并被0至4个取代基所取代，所述取代基选自卤素、-CN、-N3、-NO2、-C(O)ORn、-C(O)NRnRo、-NRnC(O)Ro、-NRnC(O)NRnRo、-ORn、-NRnRo和Rp；其中Rn和Ro独立地选自氢和C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C1-4杂烷基、C3-7环烷基和C3-7杂环烷基，或者当与同一氮原子相连时，Rn和Ro任选地组合形成3-元至6-元环；Rp是C1-4烷基、C1-4卤代烷基、C3-7环烷基和C3-7杂环烷基，其中位于B的相邻原子上的不包括D基团的任意两个取代基任选地组合形成5-元至6-元碳环、杂环、芳基环或杂芳基环；和
D选自-NR3C(O)NR4R5、-NR4R5、-C(O)NR4R5、-OC(O)OR4、-OC(O)NR4R5、-NR3C(=N-CN)NR4R5、-NR3C(=N-OR4)NR4R5、-NR3C(=N-NR4)NR4R5、-NR3C(O)R4、-NR3C(O)OR4、-NR3S(O)2NR4R5和-NR3S(O)2R4，其中R3选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基和C2-6烯基；R4和R5各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、C3-10杂环烷基、C6-10芳基和C5-10杂芳基，且R4和R5，当与同一氮原子相连时，任选地组合形成5-元至7-元杂环或杂芳基环；且其中R3、R4和R5另外被0-3个取代基所取代，所述取代基独立地选自卤素、-NO2、-CN、-NRqRr、-ORq、-SRq、-C(O)ORq、-C(O)NRqRr、-NRqC(O)Rr、-NRqC(O)ORs、-(CH2)1-4-NRqRr、-(CH2)1-4-ORq、-(CH2)1-4-SRq、-(CH2)1-4-C(O)ORq、-(CH2)1-4-C(O)NRqRr、-(CH2)1-4-NRqC(O)Rr、-(CH2)1-4-NRqC(O)ORr、-(CH2)1-4-CN、-(CH2)1-4-NO2、-S(O)Rr、-S(O)2Rr、=O和-Rs；其中Rq和Rr选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6杂烷基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、C6-10芳基、C5-10杂芳基；且Rs在每次出现时独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、C6-10芳基和C5-10杂芳基；且其中所述D基团和位于所述B环相邻原子上的取代基任选地组合形成5-元至6-元杂环或杂芳基环。
在一些实施方案中：
A是选自以下基团的环：吗啉-4-基、3，4-二氢-2H-吡喃-4-基、3，6-二氢-2H-吡喃-4-基、四氢-2H-吡喃-4-基、1，4-氧杂氮杂环庚烷-4-基、哌啶-1-基，所述环任选地被C1-C6烷基所取代；
B选自亚苯基和亚嘧啶基;
D是-NR3C(O)NR4R5、-NR4R5、-C(O)NR4R5、-OC(O)OR4、-OC(O)NR4R5、-NR3C(=N-CN)NR4R5、-NR3C(=N-OR4)NR4R5、-NR3C(=N-NR4)NR4R5、-NR3C(O)R4、-NR3C(O)OR4、-NR3S(O)2NR4R5或-NR3S(O)2R4，其中R3是氢或C1-6烷基；R4和R5各自独立地是氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基或C3-10环烷基，或者R4和R5组合形成5-元或6-元杂环；
R1和R2与它们所连接的原子组合形成取代的吡咯烷、哌啶或高哌啶环，其中所述环的氮原子被以下基团所取代：
Figure BDA0000371184410000471
其中E是氢、C6芳基、C5-6杂芳基、C1-6烷基或C5-6杂环烷基；且其中E任选地被1个至5个取代基所取代，所述取代基选自卤素、C1-6烷基、-NRdRe、-SRd、-ORd、-C(O)ORd、-C(O)NRdRe、-C(O)Rd、-NRdC(O)Re、-OC(O)Rf、-NRdC(O)NRdRe、-OC(O)NRdRe、-C(=NORd)NRdRe、-NRdC(=N-CN)NRdRe、-NRdS(O)2NRdRe、-S(O)2Rd、-S(O)2NRdRe、-Rf、-NO2、-N3、=O、-CN、-(CH2)1-4-NRdRe、-(CH2)1-4-SRd、-(CH2)1-4-ORd、-(CH2)1-4-C(O)ORd、-(CH2)1-4-C(O)NRdRe、-(CH2)1-4-C(O)Rd、-(CH2)1-4-NRdC(O)Re、-(CH2)1-4-OC(O)Rf、-(CH2)1-4-NRdC(O)NRdRe、-(CH2)1-4-OC(O)NRdRe、-(CH2)1-4-C(=NORd)NRdRe、-(CH2)1-4-NRdC(=N-CN)NRdRe、-(CH2)1-4-NRdS(O)2NRdRe、-(CH2)1-4-S(O)2Rd、-(CH2)1-4-S(O)2NRdRe、-(CH2)1-4-NO2、-(CH2)1-4-N3或-(CH2)1-4-CN；其中Rd和Re各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基，或者Rd和Re，当与同一氮原子相连时，组合形成3-元至6-元环；Rf选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；
F是C1-6亚烷基；
G是-C(O)-、-OC(O)-、-NHC(O)-、-NHC(=NOH)-、-S(O)2-或-NHS(O)2-；和
m和p独立地是0或1。
另一个实施方案包括mTOR抑制剂化合物，所述mTOR抑制剂化合物包括：
其立体异构体、互变异构体及可药用的盐，其中A是5-元至8-元杂环，所述杂环具有1-3个独立地选自N、O和S的杂原子作为环顶点并具有0至2个双键；其中所述A环另外被0至5个RA取代基所取代，所述取代基选自C(O)ORa、-C(O)NRaRb、-NRaRb、-OC(O)Rc、-ORa、-SRa、-S(O)2Rc、-S(O)Rc、-Rc、-(CH2)1-4-NRaRb、-(CH2)1-4-NRaC(O)Rc、-(CH2)1-4-ORa、-(CH2)1-4-SRa、-(CH2)1-4-S(O)2Rc、-(CH2)1-4-S(O)Rc、卤素、-NO2、-CN和-N3，其中Ra和Rb各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基、苯基和-(CH2)1-4(苯基)，且任选地Ra和Rb，与其各自所连接的氮原子一起，组合形成3-元至7-元杂环，其包含1-2个选自N、O和S的杂原子；Rc选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6环烷基、苯基和-(CH2)1-4(苯基)；相连到5-元至8-元杂环中同一原子的任意两个取代基任选地组合形成3-元至5-元碳环或3-元至5-元杂环；R1和R2与它们所连接的原子组合形成5-元至8-元单环或桥二环杂环，所述环包含-O-作为一个环顶点；其中通过组合R1和R2形成的5-元至8-元单环或桥二环杂环还任选地包含一个另外的选自N、O和S的杂原子，并被0至5个RR取代基所取代，所述取代基选自卤素、-NRjRk、-SRj、-ORj、-C(O)ORj、-C(O)NRjRk、-NHC(O)Rj、-OC(O)Rj、-Rm、-CN、=O、=S、=N-CN、-(CH2)1-4-CN、-(CH2)1-4-ORj、-(CH2)1-4-NRjRk、-C1-4亚烷基-ORj、-C1-4亚烷基-Rm、-C2-4亚烯基-Rm、-C2-4亚炔基-Rm、-C1-4亚烷基-C1-9杂芳基、C2-4亚烯基-C1-9杂芳基、C2-4亚炔基-C1-9杂芳基、C1-4亚烷基-C6-10芳基、C2-4亚炔基-C6-10芳基和C2-4亚炔基-C6-10芳基，其中Rj和Rk各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C2-6杂环烷基、苯基、吡啶基和-(CH2)1-4-(Ph)，且Rj和Rk，当相连到同一氮原子时，任选地组合形成3-元至6-元杂环，所述杂环包含1-2个选自N、O和S的杂原子；且Rm选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C2-6杂环烷基和-(CH2)1-4-(Ph)，且其中RR取代基的C3-7环烷基、C2-6杂环烷基、C1-9杂芳基或C6-10芳基部分被0-3个取代基所取代，所述取代基选自F、Cl、Br、I、-NH(C1-4烷基)、-N(二C1-4烷基)、O(C1-4烷基)、C1-6烷基、C1-6杂烷基、-C(O)O(C1-4烷基)、-C(O)NH(C1-4烷基)、-C(O)N(二C1-4烷基)、-NO2、-CN；其中当R1和R2组合形成单环的5-元至8-元杂环时，那么相连到所述5-元至8-元杂环中同一原子或相邻碳原子上的任意两个RR取代基任选地组合形成3-元至7-元环烷基环或3-元至7-元杂环烷基环，所述环包含1-2个作为环顶点的选自N、O和S的杂原子；B选自亚苯基和5-元至6-元亚杂芳基，且被0至4个RB取代基所取代，所述取代基选自卤素、-CN、-N3、-NO2、-C(O)ORn、-C(O)NRnRo、-NRnC(O)Ro、-NRnC(O)NRnRo、-ORn、-NRnRo、-(CH2)1-4-C(O)ORn、-(CH2)1-4-C(O)NRnRo、-(CH2)1-4-ORn、-(CH2)1-4-NRnRo、-(CH2)1-4-SRp和Rp；其中Rn和Ro独立地选自氢和C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C2-6杂环烷基、苯基和-(CH2)1-4-(苯基)或者当相连到同一氮原子时，Rn和Ro任选地组合形成3-元至6-元杂环，所述杂环包含1-2个选自N、O和S的杂原子；Rp是C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C2-6杂环烷基、苯基和-(CH2)1-4-(苯基)，其中位于B的相邻原子上的不包括D基团的任意两个取代基任选地组合形成5-元至6-元碳环、杂环、芳基环或杂芳基环；D选自-NR3C(O)NR4R5、-NR4R5、-C(O)NR4R5、-OC(O)OR4、-OC(O)NR4R5、-NR3C(=N-CN)NR4R5、-NR3C(=N-OR4)NR4R5、-NR3C(=N-NR4)NR4R5、-NR3C(O)R4、-NR3C(O)OR4、-NR3S(O)2NR4R5、-NR3S(O)2R4、-NR3C(=S)NR4R5和-S(O)2R4R5，其中R3选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基和C2-6烯基；R4和R5各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6烷基氨基-C(=O)-、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、C2-9杂环烷基、C6-10芳基和C1-9杂芳基，且R4和R5，当相连到同一氮原子时，任选地组合形成5-元至7-元杂环或5-元至6-元杂芳基环，所述环包含1-3个选自N、O和S的杂原子；且其中R3、R4和R5另外任选地被0-3个RD取代基所取代，所述取代基独立地选自卤素、-NO2、-CN、-NRqRr、-ORq、-SRq、-C(O)ORq、-C(O)NRqRr、-NRqC(O)Rr、-NRqC(O)ORs、-(CH2)1-4-NRqRr、-(CH2)1-4-ORq、-(CH2)1-4-SRq、-(CH2)1-4-C(O)ORq、-(CH2)1-4-C(O)NRqRr、-(CH2)1-4-NRqC(O)Rr、-(CH2)1-4-NRqC(O)ORr、-(CH2)1-4-CN、-(CH2)1-4-NO2、-S(O)Rr、-S(O)2Rr、-(CH2)1-4Rs、=O和-Rs；其中Rq和Rr选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6杂烷基、C3-7环烷基、C2-6杂环烷基、C6-10芳基、C1-9杂芳基；且Rs在每次出现时独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C3-7环烷基、C2-6杂环烷基、C6-10芳基和C1-9杂芳基；且其中位于B环相邻原子上的D基团和取代基任选地组合形成5-元至6-元杂环的或杂芳基的环，所述环任选地被1-2个RD取代基所取代。
另一个实施方案包括mTOR抑制剂化合物，所述mTOR抑制剂化合物包括：
Figure BDA0000371184410000501
其立体异构体、互变异构体及可药用的盐，其中R1选自6-元至10-元芳基、5-元至9-元杂芳基、3-元至12-元杂环烷基、3-元至12-元环烷基，其中R1被0至5个RR1取代基所取代，所述取代基选自卤素、F、Cl、Br、I、-NRaRb、-SRa、-ORa、-C(O)ORa、-C(O)NRaRb、-C(O)Ra、-NRaC(O)Rb、-OC(O)Rc、-NRaC(O)NRaRb、-OC(O)NRaRb、-NRaS(O)2NRaRb、-S(O)2Ra、-S(O)2NRaRb、-Rc、-NO2、-N3、=O、-CN、Rc1、-X1-NRaRb、-X1-SRa、-X1-ORa、-X1-C(O)ORa、-X1-C(O)NRaRb、-X1-C(O)Ra、-X1-NRaC(O)Rb、-X1-OC(O)Ra、-X1-NRaC(O)NRaRb、-X1-OC(O)NRaRb、-X1-NRaS(O)2NRaRb、-X1-S(O)2Ra、-X1-S(O)2NRaRb、-X1-NO2、-X1-N3、-X1-CN和X1-Rc1；其中Ra和Rb各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C2-7杂环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基，Ra和Rb，当相连到同一氮原子时，任选地组合形成3-元至6-元杂环，所述环包含1-2个选自N、O和S的杂原子；Rc选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C2-7杂环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；X1选自C1-4亚烷基、C2-4亚烯基和C2-4亚炔基；且Rc1选自苯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-咪唑基、2-吲哚基、1-萘基、2-萘基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡咯基、2-呋喃基和3-呋喃基，且其中Rc1被0-3个取代基所取代，所述取代基选自F、Cl、Br、I、-NRaRb、-SRa、-ORa、-S(O)2Ra、-S(O)2NRaRb、-NO2、-N3、=O、-CN、吡啶基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和C1-6杂烷基；R2选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6杂烷基、6-元至10-元芳基、5-元至10-元杂芳基、3-元至12-元杂环烷基、3-元至12-元环烷基、-L-C6-10芳基、-L-C1-9杂芳基、-L-C3-12环烷基和-L-C2-12杂环烷基，其中L选自C1-6亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基和C1-6亚杂烷基，且其中R2被0至5个RR2取代基所取代，所述取代基选自卤素、F、Cl、Br、I、-NRdRe、-SRd、-ORd、-C(O)ORd、-C(O)NRdRe、-C(O)Rd、-NRdC(O)Re、-OC(O)Rf、-NRdC(O)NRdRe、-OC(O)NRdRe、-NRdS(O)2NRdRe、-S(O)2Rd、-S(O)2NRdRe、-Rf、-NO2、-N3、=O、-CN、-X2-NRdRe、-X2-SRd、-X2-ORd、-X2-C(O)ORd、-X2-C(O)NRdRe、-X2-C(O)Rd、-X2-NRdC(O)Re、-X2-OC(O)Rd、-X2-NRdC(O)NRdRe、-X2-OC(O)NRdRe、-X2-NRdS(O)2NRdRe、-X2-S(O)2Rd、-X2-S(O)2NRdRe、-X2-NO2、-X2-N3和-X2-CN；其中Rd和Re各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C2-7杂环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基，Rd和Re，当相连到同一氮原子时，任选地组合形成3-元至6-元杂环，所述环包含1-2个选自N、O和S的杂原子；Rf选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C2-7杂环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；且X2选自C1-4亚烷基、C2-4亚烯基和C2-4亚炔基；R3是5-元至12-元单环或桥杂环烷基环，其中所述R3基团被0-3个RR3取代基所取代，所述取代基选自-C(O)ORg、-C(O)NRgRh、-NRgRh、-ORg、-SRg、-S(O)2Ri、-S(O)Ri、-Ri、卤素、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN和-N3，其中Rg和Rh各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C2-6烯基和C3-6环烷基，其中Rg和Rh，与各自所连接的氮原子一起，任选地组合形成3-元至6-元杂环，所述环包含1-2个选自N、O和S的杂原子，且Ri选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C3-6环烷基；且如果R3是单环杂环烷基环，那么相连到R3同一原子的任意两个RR3基团任选地组合形成3-元至7-元碳环或3-元至7-元杂环，所述环包含1-2个作为环顶点的选自N、O和S的原子；A1、A2、A3和A4各自独立地选自N、C(RA)或C(H)，其中A1、A2、A3和A4中的至少三个各自独立地是C(H)或C(RA)，其中RA在每次出现时独立地选自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基，或者相连到相邻原子的任意两个RA基团任选地组合形成包含1-2个作为环顶点的选自N、O和S的杂原子的C2-6杂环、C3-7环烷基环、包含1至4个作为环顶点的选自N、O和S的杂原子的C1-5杂芳基环或苯基环；且D选自-NR4C(O)NR5R6、-NR5R6、-C(O)NR5R6、-OC(O)OR5、-OC(O)NR5R6、-NR4C(=N-CN)NR5R6、-NR4C(=N-OR5)NR5R6、-NR4C(=N-NR5)NR5R6、-NR4C(O)R5、-NR4C(O)OR5、-NR4S(O)2NR5R6和-NR4S(O)2R5，其中R4选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基和C2-6烯基；R5和R6各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、C2-10杂环烷基、C6-10芳基和C1-9杂芳基，且R5和R6，当相连到同一氮原子时，任选地组合形成5-元至7-元杂环或5-元至9-元杂芳基环，所述环包含1-3个作为环顶点的选自N、O和S的杂原子且被0-3个RD取代基所取代；且其中R4、R5和R6另外被0-3个RD取代基所取代，其中RD独立地选自卤素、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-NRjRk、-ORj、-SRj、-C(O)ORj、-C(O)NRjRk、-NRjC(O)Rk、-NRjC(O)ORm、-X3-NRjRk、-X3-ORj、-X3-SRj、-X3-C(O)ORj、-X3-C(O)NRjRk、-X3-NRjC(O)Rk、-X3-NRjC(O)ORk、-X3-CN、-X3-NO2、-S(O)Rm、-S(O)2Rm、=O和-Rm；其中Rj和Rk选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6杂烷基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、C6-10芳基、C1-9杂芳基；且Rm在每次出现时独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、C6-10芳基和C1-9杂芳基；X3选自C1-4亚烷基、C2-4亚烯基和C2-4亚炔基；且其中D和RA取代基任选地组合形成任选取代的5-元至6-元杂环或杂芳基环，所述环被0-4个RD取代基所取代，所述RA取代基相连到与D所连接的原子相邻的原子。
另一个实施方案包括mTOR抑制剂化合物，所述mTOR抑制剂化合物包括：
Figure BDA0000371184410000521
其立体异构体、互变异构体及可药用的盐，其中Y1和Y2各自独立地是N或C(R1)，但Y1和Y2不都是N或不都是C(R1)，其中R1选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6杂烷基、6-元至10-元芳基、5-元至9-元杂芳基、3-元至12-元杂环烷基、3-元至12-元环烷基，其中R1被0-5个RR1取代基所取代，所述取代基选自卤素、F、Cl、Br、I、-NRaRb、-SRa、-ORa、-C(O)ORa、-C(O)NRaRb、-C(O)Ra、-NRaC(O)Rb、-OC(O)Rc、-NRaC(O)NRaRb、-OC(O)NRaRb、-NRaS(O)2NRaRb、-S(O)2Ra、-S(O)2NRaRb、-Rc、-NO2、-N3、=O、-CN、Rc1、-X1-NRaRb、-X1-SRa、-X1-ORa、-X1-C(O)ORa、-X1-C(O)NRaRb、-X1-C(O)Ra、-X1-NRaC(O)Rb、-X1-OC(O)Ra、-X1-NRaC(O)NRaRb、-X1-OC(O)NRaRb、-X1-NRaS(O)2NRaRb、-X1-S(O)2Ra、-X1-S(O)2NRaRb、-X1-NO2、-X1-N3、-X1-CN和X1-Rc1；其中Ra和Rb各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C2-7杂环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基，Ra和Rb，当相连到同一氮原子时，任选地组合形成3-元至6-元杂环，所述环包含1-2个选自N、O和S的杂原子；Rc选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C2-7杂环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；X1选自C1-4亚烷基、C2-4亚烯基和C2-4亚炔基；且Rc1选自苯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-咪唑基、2-吲哚基、1-萘基、2-萘基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡咯基、2-呋喃基和3-呋喃基，且其中Rc1被0-3个取代基所取代，所述取代基选自F、Cl、Br、I、-NRaRb、-SRa、-ORa、-S(O)2Ra、-S(O)2NRaRb、-NO2、-N3、=O、-CN、吡啶基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基和C1-6杂烷基；R2选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6杂烷基、-L-C6-10芳基、-L-C1-9杂芳基、-L-C3-12环烷基和-L-C2-12杂环烷基，其中L选自C1-6亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基和C1-6亚杂烷基，且其中R2被0-5个RR2取代基所取代，所述取代基选自卤素、F、Cl、Br、I、-NRdRe、-SRd、-ORd、-C(O)ORd、-C(O)NRdRe、-C(O)Rd、-NRdC(O)Re、-OC(O)Rf、-NRdC(O)NRdRe、-OC(O)NRdRe、-NRdS(O)2NRdRe、-S(O)2Rd、-S(O)2NRdRe、-Rf、-NO2、-N3、=O、-CN、-X2-NRdRe、-X2-SRd、-X2-ORd、-X2-C(O)ORd、-X2-C(O)NRdRe、-X2-C(O)Rd、-X2-NRdC(O)Re、-X2-OC(O)Rd、-X2-NRdC(O)NRdRe、-X2-OC(O)NRdRe、-X2-NRdS(O)2NRdRe、-X2-S(O)2Rd、-X2-S(O)2NRdRe、-X2-NO2、-X2-N3和-X2-CN；其中Rd和Re各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C2-7杂环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基，Rd和Re，当相连到同一氮原子时，任选地组合形成3-元至6-元杂环，所述环包含1-2个选自N、O和S的原子；Rf选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C2-7杂环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；且X2选自C1-4亚烷基、C2-4亚烯基和C2-4亚炔基；R3是5-元至12-元单环或桥杂环烷基环，其中所述R3基团被0-3个RR3取代基所取代，所述取代基选自-C(O)ORg、-C(O)NRgRh、-NRgRh、-ORg、-SRg、-S(O)2Ri、-S(O)Ri、-Ri、卤素、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN和-N3，其中Rg和Rh各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C1-6杂烷基、C2-6烯基和C3-6环烷基，其中Rg和Rh，与各自所连接的氮原子一起，任选地组合形成3-元至6-元环，所述环包含1-2个N、O和S的杂原子，且Ri选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C3-6环烷基；且当R3是单环杂环烷基环时，那么相连到R3同一原子的任意两个RR3基团任选地组合形成3-元至7-元碳环或3-元至7-元杂环，所述环包含1-2个作为环顶点的选自N、O和S的杂原子；A1、A2、A3和A4各自独立地选自N、C(RA)或C(H)，其中A1、A2、A3和A4的至少三个各自独立地是C(H)或C(RA)，其中RA在每次出现时独立地选自F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基，或者相连到相邻原子的任意两个RA基团任选地组合形成包含1-2个作为环顶点的选自N、O和S的杂原子的C2-6杂环、C3-7环烷基环、包含1-4个作为环顶点的选自N、O和S的杂原子的C1-5杂芳基环或苯基环；且D选自-NR4C(O)NR5R6、-NR5R6、-C(O)NR5R6、-OC(O)OR5、-OC(O)NR5R6、-NR4C(=N-CN)NR5R6、-NR4C(=N-OR5)NR5R6、-NR4C(=N-NR5)NR5R6、-NR4C(O)R5、-NR4C(O)OR5、-NR4S(O)2NR5R6和-NR4S(O)2R5，其中R4选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基和C2-6烯基；R5和R6各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、C2-10杂环烷基、C6-10芳基和C1-9杂芳基，且R5和R6，当相连到同一氮原子时，任选地组合形成5-元至7-元杂环或5-元至9-元杂芳基环，所述环包含1-3个作为环顶点的选自N、O和S的杂原子且被0-3个RD取代基所取代；且其中R4、R5和R6另外被0-3个RD取代基所取代，其中RD独立地选自卤素、F、Cl、Br、I、-NO2、-CN、-NRjRk、-ORj、-SRj、-C(O)ORj、-C(O)NRjRk、-NRjC(O)Rk、-NRjC(O)ORm、-X3-NRjRk、-X3-ORj、-X3-SRj、-X3-C(O)ORj、-X3-C(O)NRjRk、-X3-NRjC(O)Rk、-X3-NRjC(O)ORk、-X3-CN、-X3-NO2、-S(O)Rm、-S(O)2Rm、=O和-Rm；其中Rj和Rk选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6杂烷基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、C6-10芳基、C1-9杂芳基；且Rm在每次出现时独立地选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、C6-10芳基和C1-9杂芳基；X3选自C1-4亚烷基、C2-4亚烯基和C2-4亚炔基；且其中D和RA取代基任选地组合形成任选取代的5-元至6-元杂环或杂芳基环，所述环被0-4个RD取代基所取代，所述RA取代基相连到与D所连接的原子相邻的原子。
另一个实施方案包括mTOR抑制剂化合物，所述mTOR抑制剂化合物包括：
Figure BDA0000371184410000551
Figure BDA0000371184410000561
另一个实施方案包括所述mTOR抑制剂，雷帕霉素：
Figure BDA0000371184410000562
另一个实施方案包括下式的PI3-k抑制剂化合物或其可药用的盐：
Figure BDA0000371184410000571
其中：
R1和R2独立地选自氢、卤素、C1-6烷基、-NRdRe、-SRd、-ORd、-C(O)ORd、-C(O)NRdRe、-C(O)Rd、-NRdC(O)Re、-OC(O)Rf、-NRdC(O)NRdRe、-OC(O)NRdRe、-C(=NORd)NRdRe、-NRdC(=N-CN)NRdRe、-NRdS(O)2NRdRe、-S(O)2Rd、-S(O)2NRdRe、-Rf、-NO2、-N3、=O、-CN、-(CH2)1-4-NRdRe、-(CH2)1-4-SRd、-(CH2)1-4-ORd、-(CH2)1-4-C(O)ORd、-(CH2)1-4-C(O)NRdRe、-(CH2)1-4-C(O)Rd、-(CH2)1-4-NRdC(O)Re、-(CH2)1-4-OC(O)Rf、-(CH2)1-4-NRdC(O)NRdRe、-(CH2)1-4-OC(O)NRdRe、-(CH2)1-4-C(=NORd)NRdRe、-(CH2)1-4-NRdC(=N-CN)NRdRe、-(CH2)1-4-NRdS(O)2NRdRe、-(CH2)1-4-S(O)2Rd、-(CH2)1-4-S(O)2NRdRe、-(CH2)1-4-NO2、-(CH2)1-4-N3或-(CH2)1-4-CN；其中Rd和Re各自独立地选自氢、C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基，或者Rd和Re，当相连到同一氮原子时，任选地组合形成3-元至6-元环；Rf选自C1-6烷基、C1-6卤代烷基、C3-7环烷基、C3-7杂环烷基、苯基和-(CH2)1-4-苯基；或者
R1和R2与它们所连接的原子一起形成稠合的5-元或6-元杂环基环或杂芳基环，所述环任选地被氧代、卤素、C1-C3烷基或CF3所取代。
PI3-k抑制剂的实例包括下列：
在一个实施方案中，所述激酶抑制剂是式V和VI的PI3K激酶抑制剂：
Figure BDA0000371184410000581
或其立体异构体、几何异构体、互变异构体或可药用的盐，其中：
R1选自H、F、Cl、Br、I、CN、-(CR14R15)mNR10R11、-C(R14R15)nNR12C(=Y)R10、-(CR14R15)nNR12S(O)2R10、-(CR14R15)mOR10、-(CR14R15)nS(O)2R10、-(CR14R15)nS(O)2NR10R11、-C(OR10)R11R14、-C(=Y)R10、-C(=Y)OR10、-C(=Y)NR10R11、-C(=Y)NR12OR10、-C(=O)NR12S(O)2R10、-C(=O)NR12(CR14R15)mNR10R11、-NO2、-NR12C(=Y)R11、-NR12C(=Y)OR11、-NR12C(=Y)NR10R11、-NR12S(O)2R10、-NR12SO2NR10R11、-SR10、-S(O)2R10、-S(O)2NR10R11、-SC(=Y)R10、-SC(=Y)OR10、C1-C12烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C3-C12碳环基、C2-C20杂环基、C6-C20芳基和C1-C20杂芳基；
R2选自H、F、Cl、Br、I、CN、CF3、-NO2、-C(=Y)R10、-C(=Y)OR10、-C(=Y)NR10R11、-(CR14R15)mNR10R11、-(CR14R15)nOR10、-(CR14R15)t-NR12C(=O)(CR14R15)NR10R11、-NR12C(=Y)R10、-NR12C(=Y)OR10、-NR12C(=Y)NR10R11、-NR12SO2R10、OR10、-OC(=Y)R10、-OC(=Y)OR10、-OC(=Y)NR10R11、-OS(O)2(OR10)、-OP(=Y)(OR10)(OR11)、-OP(OR10)(OR11)、SR10、-S(O)R10、-S(O)2R10、-S(O)2NR10R11、-S(O)(OR10)、-S(O)2(OR10)、-SC(=Y)R10、-SC(=Y)OR10、-SC(=Y)NR10R11、C1-C12烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C3-C12碳环基、C2-C20杂环基、C6-C20芳基和C1-C20杂芳基；
R3是碳连接的单环杂芳基、碳连接的稠合二环C3-C20杂环基或碳连接的稠合二环C1-C20杂芳基，其中所述单环杂芳基、稠合二环C3-C20杂环基和稠合二环C1-C20杂芳基任选地被一个或多个基团所取代，所述基团选自F、Cl、Br、I、-CN、-NR10R11、-OR10、-C(O)R10、-NR10C(O)R11、-N(C(O)R11)2、-NR10C(O)NR10R11、-NR12S(O)2R10、-C(=O)OR10、-C(=O)NR10R11、C1-C12烷基和(C1-C12烷基)-OR10；
R10、R11和R12独立地是H、C1-C12烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C3-C12碳环基、C2-C20杂环基、C6-C20芳基或C1-C20杂芳基，
或者R10和R11与它们所连接的氮原子一起形成C2-C20杂环，所述环任选地被一个或多个基团所取代，所述基团独立地选自氧代、(CH2)mOR12、NR12R12、CF3、F、Cl、Br、I、SO2R12、C(=O)R12、NR12C(=Y)R12、NR12S(O)2R12、C(=Y)NR12R12、C1-C12烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C3-C12碳环基、C2-C20杂环基、C6-C20芳基和C1-C20杂芳基；
R14和R15独立地选自H、C1-C12烷基或-(CH2)n-芳基，
或者R14和R15与它们所连接的原子一起形成饱和的或部分不饱和的C3-C12碳环；其中所述烷基、烯基、炔基、碳环基、杂环基、芳基和杂芳基任选地被一个或多个基团所取代，所述基团独立地选自F、Cl、Br、I、CN、CF3、-NO2、氧代、R10、-C(=Y)R10、-C(=Y)OR10、-C(=Y)NR10R11、-(CR14R15)nNR10R11、-(CR14R15)nOR10、-NR10R11、-NR12C(=Y)R10、-NR12C(=Y)OR11、-NR12C(=Y)NR10R11、-(CR14R15)mNR12SO2R10、=NR12、OR10、-OC(=Y)R10、-OC(=Y)OR10、-OC(=Y)NR10R11、-OS(O)2(OR10)、-OP(=Y)(OR10)(OR11)、-OP(OR10)(OR11)、-SR10、-S(O)R10、-S(O)2R10、-S(O)2NR10R11、-S(O)(OR10)、-S(O)2(OR10)、-SC(=Y)R10、-SC(=Y)OR10、-SC(=Y)NR10R11、C1-C12烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C3-C12碳环基、C2-C20杂环基、C6-C20芳基和C1-C20杂芳基；
Y是O、S或NR12；
m是0、1、2、3、4、5或6；和
n是1、2、3、4、5或6。
实例PI3-k抑制剂包括下列：
Figure BDA0000371184410000591
和III-3
Figure BDA0000371184410000601
式V和VI化合物的制备
式V和VI化合物可以通过包括与化学领域中那些熟知的方法类似的方法来合成，并且所述方法包括WO2006/046031中所述的方法，将其全部内容并入本文作为参考用于所有目的。起始原料通常是从商业来源可得的，如Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)，或易于用本领域技术人员熟知的方法制备，例如，通过Louis F.Fieser and Mary Fieser，Reagents for OrganicSynthesis，v.1-19，Wiley，N.Y.(1967-1999ed.)，或者Beilsteins Handbuch derorganischen Chemie，4，Aufl.ed.Springer-Verlag，Berlin，包括增补本(也可得自Beilstein在线数据库)中通常所描述的方法来制备。
式V和VI化合物可以用制备其它噻吩、呋喃、嘧啶的操作步骤(US6608053;US6492383;US6232320;US6187777;US3763156;US3661908;US3475429;US5075305;US2003/220365;GB1393161;WO93/13664)和制备其它杂环的操作步骤来制备，所述其它杂环的制备在以下文献中有描述：Comprehensive Heterocyclic Chemistry，Editors Katritzky and Rees，PergamonPress，1984。
式V和VI化合物通过常规方法可以转化成可药用的盐，且盐可以转化成游离的化合物。可药用的盐的实例包括与无机酸的盐和与有机酸的盐，所述无机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、硝酸和磷酸；所述有机酸如甲磺酸、苯磺酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、乙磺酸、天冬氨酸和谷氨酸。所述盐可以是甲磺酸盐、盐酸盐、磷酸盐、苯磺酸盐或硫酸盐。盐可以是一盐或二盐。例如，所述甲磺酸盐可以是一甲磺酸盐或二甲磺酸盐。
式V和VI化合物及盐还可以作为水合物或溶剂化物存在。
制备式V和VI化合物中，中间体官能团(例如，伯胺或仲胺)的保护可能是必要的。这种保护的需要将取决于远端官能团的性质和制备方法的条件而改变。适宜的氨基保护基包括乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧羰基(BOC)、苄氧羰基(CBz)和9-芴亚甲氧羰基(Fmoc)。本领域的技术人员能容易地决定这种保护的需要。对于保护基的通常描述及其用途，见T.W.Greene，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley&Sons，New York，1991。
为作说明，方案5-11表示制备本发明化合物以及关键中间体的通用方法。对于单个反应步骤的更详细描述，见下面实施例部分。本领域的技术人员应当理解，其它反应路线可以用来合成发明的化合物。虽然具体的起始原料和试剂在方案中有描述并在下面讨论，但是易于用其它起始原料和试剂取代以提供多种衍生物和/或反应条件。此外，可根据本公开使用本领域技术人员已知的常规化学进一步修饰通过下面所描述方法制备的多种化合物。
Figure BDA0000371184410000611
方案5
方案5表示从2-羧酸酯，3-氨基噻吩和2-氨基，3-羧酸酯噻吩试剂(分别为51和52)制备噻吩并嘧啶中间体55和56的通用方法，其中Hal是Cl、Br或I；且R1、R2和R10如对式V和VI化合物或对其前体或前药所定义。
Figure BDA0000371184410000621
方案6
方案6表示在有机溶剂中碱性条件下用吗啉从二卤代噻吩并嘧啶中间体57和58选择性取代4-卤素，分别制备2-卤代，4-吗啉代噻吩并嘧啶化合物59和60的通用方法，其中Hal是Cl、Br或I；且R1和R2如对式V和VI化合物或对其前体或前药所定义。
Figure BDA0000371184410000622
方案7
方案7表示衍生其中R1是H的2-卤代，4-吗啉代，6-氢噻吩并嘧啶化合物61和62的6-位的通用方法。用锂化试剂处理61或62，除去6位质子，接下来加入酰化试剂R10C(O)Z，其中Z是离去基，如卤化物、NHS酯、羧酸酯或二烷基氨基，得到2-卤代，4-吗啉代，6-酰基噻吩并嘧啶化合物63和64，其中Hal是Cl、Br或I；且R2和R10如对式V和VI化合物或对其前体或前药所定义。制备6-甲酰基化合物(R10=H)的R10C(O)Z的实例是N，N’-二甲基甲酰胺(DMF)。
Figure BDA0000371184410000631
方案8
方案8表示用单环杂芳基、稠合二环杂环基或稠合二环杂芳基硼酸(R15=H)或硼酸酯(R15=烷基)试剂67Suzuki-型偶联2-卤代嘧啶中间体(65和66)，制备式V和VI的2-取代(Hy)，4-吗啉代噻吩并嘧啶化合物(68和69)的通用方法，其中Hal是Cl、Br或I；且R1和R2如对式V和VI化合物或对其前体或前药所定义。对于Suzuki反应的综述，见：Miyaura et al.(1995)Chem.Rev.95:2457-2483;Suzuki，A.(1999)J.Organomet.Chem.576:147-168;Suzuki，A.in Metal-Catalyzed Cross-Coupling Reactions，Diederich，F.，Stang，P.J.，Eds.，VCH，Weinheim，DE(1998)，pp49-97。所述钯催化剂可以是典型地用于Suzuki-型交叉偶联的任何钯催化剂，如PdCl2(PPh3)2、Pd(PPh3)4、Pd(OAc)2、PdCl2(dppf)-DCM、Pd2(dba)3/Pt-Bu)3(Owensetal(2003)Bioorganic&Med.Chem.Letters13:4143-4145;Molander et al(2002)Organic Letters4(11):1867-1870;US6448433)。
Figure BDA0000371184410000641
方案9
方案9表示炔71合成的通用方法，所述炔71可以用来制备化合物72和73的炔基化衍生物。在适当碱(Cs2CO3等)存在下，炔丙基胺71可以通过炔丙基溴70与式R10R11NH(其中R10和R11独立地选自H、烷基、芳基和杂芳基，或者R10和R11与它们所连接的氮一起形成杂环)胺的反应来制备。对于炔基胺类和相关合成的综述见Booker-Milburn，K.I.，ComprehensiveOrganic Functional Group Transformations(1995)，2:1039-1074;and Viehe，H.G.，(1967)Angew.Chem.，Int.Ed.Eng.，6(9):767-778。炔71随后可以与中间体72(X2=溴代或碘代)或73(经Sonogashira偶联)反应，分别提供化合物74和75，其中R2和R3如对式V和VI化合物或对其前体或前药所定义。
Figure BDA0000371184410000651
方案10
方案10表示炔77合成的通用方法，所述炔77可以用来制备化合物72和73的炔基化衍生物。偕二烷基炔丙基胺77可以用Zaragoza et al(2004)J.Med.Chem.，47:2833所描述的方法来制备。按照方案6，在CuCl和适当碱(例如TEA等)存在下，偕二烷基氯化物76(R14和R15独立地是甲基、乙基或其它烷基)可以与式R10R11NH(其中R10和R11独立地选自H、烷基、芳基和杂芳基，或者R10和R11与它们所连接的氮一起形成杂环)胺反应，提供所述炔77。炔77可以与中间体72或73(经Sonogashira偶联)反应，分别提供化合物78和79，其中R2和R3如对式V和VI化合物或对其前体或前药所定义。
Figure BDA0000371184410000661
方案11
方案11表示炔81合成的通用方案，所述炔81可以用来制备化合物72和73的炔基化衍生物。丁-3-炔-1-胺81(其中R14和R15独立地是H、烷基、芳基、杂芳基，或者R14和R15与它们所连接的碳原子一起形成碳环或杂环)可以用Olomucki M.et al(1960)Ann.Chim.5:845所描述的规程从炔80(LG=甲苯磺酸酯或其它离去基团)与式R10R11NH(其中R10和R11独立地选自H、烷基、芳基和杂芳基，或者R10和R11与它们所连接的氮一起形成杂环)胺的反应来制备。按照为方案5和6所提供的描述，炔81随后可以与中间体72或73反应(经Sonogashira偶合)，分别提供化合物82和83，其中R2和R3如对式V和VI化合物或对其前体或前药所定义。
式I-VI的噻吩并嘧啶化合物的可药用的盐可以用常规技术来制备。所述方法典型地包括在适宜的溶剂中用适宜的酸处理如上面所描述的式I的噻吩并嘧啶。
在如上面所描述的本发明的方法中，氨基化步骤和Pd介导的交叉偶联步骤均在常规条件下发生。所述钯催化剂可以是典型地用于Suzuki-型交叉偶联的任何钯催化剂，如PdCl2(PPh3)2。所述还原剂典型地是硼氢化物，如NaBH(OAc)3、NaBH4或NaCNBH4。
治疗新生物的方法
一个实施方案包括治疗哺乳动物中新生物的方法，其包含：以对治疗所述新生物有效的量给予(i)激酶抑制剂，其中所述抑制剂诱导自噬；和(ii)自噬抑制剂的组合。所述激酶抑制剂和所述自噬抑制剂可以在相同时间或在不同时间一起给药或分开给药。在一个实施方案中，诱导自噬的激酶的抑制剂和所述自噬抑制剂以协同性有效量存在。
在另一个实施方案中，治疗哺乳动物中新生物的方法除了包含以对治疗所述新生物有效的量给予(i)激酶抑制剂，其中所述抑制剂诱导自噬；和(ii)自噬抑制剂的组合之外，还包含给予蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂是本领域熟知的。在一个实施方案中，所述蛋白酶抑制剂抑制溶酶体半胱氨酸蛋白酶活性或天冬氨酸蛋白酶，如胃蛋白酶抑制剂A。激酶抑制剂、自噬抑制剂和蛋白酶抑制剂可以单独给药，或在相同时间或在不同时间以任意组合一起或分开给药。
还提供了阻断或减少复发肿瘤生长或复发癌细胞生长的方法。在本发明的某些实施方案中，受试者正在进行癌症治疗。本文所描述的组合疗法的给药阻断或减少复发肿瘤生长或复发癌细胞生长。
另一个实施方案提供了癌细胞中诱导凋亡的方法，其包含以对诱导所述凋亡有效的量对所述细胞给予(i)激酶抑制剂，其中所述抑制剂诱导自噬；和(ii)自噬抑制剂。在一个实例中，有效量的激酶抑制剂和/或自噬抑制剂产生协同性的凋亡诱导作用。在另一个实例中，有效量的所述激酶和/或所述自噬抑制剂具有比单独的激酶抑制剂或自噬抑制剂的ED50、ED75或ED90低的ED50、ED75或ED90。在一个实例中，所述激酶抑制剂和自噬抑制剂以约2:1至约1:50的比给予，可替换地以约1.25:1至约1:12的比给予，可替换地以约1:1至约1:5的比给予。在一个实例中，III-4是与CQ以约1:25、1:12.5、1:1.5或1.3:1的比组合配制的.
当任何变量在任何成分或在式I、II、III、IV、V或VI中出现多于一次时，其对各次出现的定义独立于其在每次其它出现的定义。取代基和/或变量的组合也是允许的，只要这样的组合导致容许的化合价。
本文所描述的治疗新生物的方法可包括与自噬抑制剂组合给予诱导自噬的激酶的抑制剂，其中所述抑制剂是RNA干扰(RNAi)构建物。图23显示，这样的RNAi构建物可以包含RNA、DNA或转录至RNA的DNA。优选地，本方法中RNAi构建物与自噬抑制剂组合的使用导致对新生物的协同性杀死或抑制作用。
RNA构建物
在另一个实施方案中，本文所公开的主题涉及本文所描述的RNAi构建物。RNAi构建物是有用的Akt抑制剂。
如本文所用，RNAi构建物包括shRNA、siRNA、DNA指导的shRNA和siRNA以及DNA本身、本文所描述的DNA寡核苷酸和运载体。在某些实施方案中，siRNA或shRNA是从包含核酸序列的RNAi构建物转录的，所述核酸序列基本上与一个或多个Akt基因的靶标序列对应。优选地，序列选自SEQ ID No:39-48及其组合。当引入到细胞时，这些RNAi构建物能够减少一种或多种Akt蛋白的表达。减少蛋白的表达意味着细胞中表达低于如果没有引入所述RNAi构建物的表达。检测表达水平的方法是本文所述的或是本领域中已知的。所述RNAi构建物可以减少AKT亚型的表达，所述亚型包括Akt1、Akt2、Akt3及其组合。
所述RNAi构建物可以包含一种或多种基本上与选自SEQ ID No:1-18的序列对应的DNA序列。可以合成DNA序列并将其克隆至本文所描述穿梭载体(shuttle)中。在另一个实施方案中，能够减少一种或多种Akt蛋白表达的RNAi构建物包含基本上与选自SEQ ID No:19-38及其组合的序列对应的RNA序列。在另一个实施方案中，所述RNAi构建物可以含有有义RNA链和基本上互补的反义RNA链，其中所述反义链包含一个或多个基本上与选自SEQ ID No:20、22、24、26、28、30、32、34、36和38的序列对应的序列，其中所述有义链和反义链被退火为RNA双链体。所述双链体可以包含有义链，所述有义链包含一个或多个基本上与选自SEQ ID No:19、21、23、25、27、29、31、33、35和37的序列对应的序列。所述有义链和反义链可退火，从而以序列对组合的形式形成所述双链体，所述序列对组合包括下列：SEQ ID No:19:20、21:22、23:24、25:26、27:28、29:30、31:32、33:34、35:36和37:38及包含多于一个序列对的组合。所述RNAi构建物可以含有共价连接有义链和反义链的发夹结构。
在另一个实施方案中，本文描述了能够减少一种或多种Akt蛋白表达的RNAi构建物。这种RNAi构建物的非限制性实例包括这样的构建物，即，其包含基本上与SEQ ID No:32对应的核苷酸序列，并另外包含基本上与选自SEQ ID No:22、26和36的序列对应的序列。另一个非限制性实例包含基本上与SEQ ID No:31对应的核苷酸序列，并另外包含基本上与选自SEQID No:21、25和35的序列对应的序列。降低标靶Akt亚型表达的其它组合可以容易地从本公开中获得。
另一个实施方案涉及能够减少Akt基因表达的RNAi构建物，其中所述构建物是Dicer的底物。再一个实施方案涉及本文所描述的分离的核苷酸或核酸序列。如本文所描述的RNAi构建物可以用任何已知的方法来制备(McIntyre，GJ，and Fanning GC，BMC Biotechnology(2006)，6:1)。
药物制剂
本发明的药物组合物或制剂包括式I-VI化合物和本文所描述的其它化合物、自噬抑制剂和一种或多种可药用的载体、助流剂、稀释剂或赋形剂的组合。
式I-VI化合物，和本文所描述的其它化合物及本发明的自噬抑制剂可以以非溶剂化形式以及与可药用的溶剂如水、乙醇等的溶剂化形式存在，并意在本发明既包含溶剂化又包含非溶剂化形式。
式I-VI化合物，和本文所描述的其它化合物及本发明的自噬抑制剂还可以以不同的互变异构形式存在，且所有这些形式都包含在本发明的范围之内。术语“互变异构体”或“互变异构形式”指经低能垒可互变的不同能量的结构异构体。例如，质子互变异构体(也称作质子转移互变异构体)包括经质子迁移的互变，如酮-烯醇和亚胺-烯胺异构化。化合价互变异构体包括通过一些成键电子的结构重组的互变。
药物组合物既包括散装组合物，又包括个体剂量单位，其包含多于一种(例如，两种)药学活性剂以及任何无药学活性的赋形剂、稀释剂、载体或助流剂，所述药学活性剂包括式I-VI化合物和选自本文所描述另外的药剂列表的自噬抑制剂。所述散装组合物和各个体计量单位可以含有固定量的上述药学活性剂。所述散装组合物是尚未形成个体剂量单位的物质。用作说明的剂量单位是口服剂量单位如片剂、丸剂、胶囊剂等。类似地，本文所描述的通过给予本发明药物组合物治疗患者的方法还意在包括给药散装组合物和个体剂量单位。
药物组合物还包含与本文所述那些等同的同位素标记的本发明化合物，不同的是，一个或多个原子被具有与自然中通常发现的原子量或原子序数不同的原子量或原子序数的原子所替换。如所详细说明的任何具体原子或元素的所有同位素及其用途被考虑在本发明化合物的范围内。可以掺入本发明化合物的示例性同位素包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯和碘的同位素，如2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、32P、33P、35S、18F、36Cl、123I和125I。本发明某些同位素标记的化合物(例如，用3H和14C标记的那些)在化合物和/或底物组织分布分析方法中是有用的。氚化的(3H)和碳-14(14C)同位素因其易于制备和可检测性是有用的。此外，用较重同位素如氘(2H)的取代可以提供由较大代谢稳定性产生的某些治疗学优点(例如，增加体内半衰期或减少剂量需要量)并因此在某些情况下可以是优选的。正电子发射同位素如15O、13N、11C和18F可用于正电子发射断层扫描(PET)研究以检查底物受体占据。本发明的同位素标记的化合物通常可以通过以下方法制备：遵循与本文下面的方案和/或实施例中所公开的那些操作步骤类似的操作步骤，用同位素标记的试剂替换非同位素标记的试剂。
将式I-VI化合物和本文所描述的其它化合物及自噬抑制剂依照标准药学操作规范(standard pharmaceutical practice)配制，用于治疗性处理(包括预防性处理)哺乳动物(包括人类)中的过增殖障碍的治疗组合。本发明提供了药物组合物，其包含与一种或多种可药用的载体、助流剂、稀释剂或赋形剂结合的式I-VI化合物。
适宜的载体、稀释剂和赋形剂是本领域的技术人员熟知的并包括物质如碳水化合物、蜡、水可溶解的和/或可溶胀的聚合物、亲水或疏水的物质、明胶、油、溶剂、水等。所用的具体载体、稀释剂或赋形剂取决于本发明化合物将适用的方式和目标。溶剂通常基于本领域技术人员认为对给予哺乳动物安全的溶剂(GRAS)来选择。通常，安全溶剂是无毒含水溶剂如水和在水中可溶或可混溶的其它无毒溶剂。适宜的含水溶剂包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(例如，PEG400、PEG300)等等及其混合物。所述制剂还可以包括一种或多种缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、湿润剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、增甜剂、芳香剂、矫味剂和其它已知的添加剂以提供药物(即，本发明的化合物或其药物组合物)的优美外观或有助于药品(即，药剂)的制造。
所述制剂可以用常规溶解和混合操作步骤来制备。例如，在一种或多种上面所描述的赋形剂存在下，将散装药物物质(即，本发明的化合物或所述化合物的稳定形式(例如，与环糊精衍生物或其它已知络合剂的络合物))溶于适宜的溶剂中。将本发明的化合物典型地配制成药物剂型以提供容易可控的药物剂量并使患者能够顺应开具的用药方案。
供施用的所述药物组合物(或制剂)可以取决于给予药物所用的方法以多种方式来包装。通常，用于分配的物品包括已在其中放置适当形式药物制剂的容器。适宜的容器是本领域的技术人员所熟知的并包括物质如瓶(塑料的或玻璃的)、小药囊(sachets)、安瓿、塑料袋、金属圆筒(cylinders)等。所述容器还可以包括防干扰装置(tamper-proofassemblage)以防止欠慎重地获取包装的内容物。除此之外，所述容器已在其上放置了描述容器内容物的标签。所述标签还可以包括适当的警告。
本发明化合物的药物制剂可以针对各种给药路线和类型来制备。例如，可将具有期望纯度的式I-VI化合物或本文所描述的另一种化合物任选地以低压冻干的制剂、磨细的粉末或水溶液的形式与可药用的稀释剂、载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington's Pharmaceutical Sciences(1995)18th edition，Mack Publ.Co.，Easton，PA)。制剂可以通过以下方法来进行：在适当的pH，在环境温度，并以期望的纯度与生理学可接受的载体(即，在所用剂量和浓度下对受者无毒的载体)混合。所述制剂的pH主要取决于化合物的具体用途和浓度，但可以在约3至约8。
所述药物制剂优选地是无菌的。具体来说，要用于体内给药的制剂必须是无菌的。这种灭菌易于通过经无菌滤膜的过滤来实现。
所述药物制剂通常可以作为固体组合物、低压冻干制剂或作为水溶液来储存。
本发明的药物制剂将以与良好医学操作规范一致的方式(即，量、浓度、程序表、过程、媒介物和给药途径)来配制和给药。该背景中需考虑的因素包括正在治疗的具体障碍、正在治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床病症、障碍的原因、药剂递送部位、给药方法、给药程序安排和医学从业者已知的其它因素。要给予的化合物的“治疗上有效量”会受这种考虑约束，并且是预防、改善或治疗凝血因子介导的障碍必需的最小量。这种量优选地在对主体有毒或致使主体对出血明显地更加敏感的量以下。
作为通常建议，口服或肠胃外给药的式I-VI化合物或本文所描述的另一种化合物的每剂量的起始药学有效量为约0.01-100mg/kg，即，约0.1-20mg/kg患者体重/天，典型的所用化合物起始范围是0.3-15mg/kg/天。
可接受的稀释剂、载体、赋形剂和稳定剂在所用剂量和浓度对受者是无毒的，并包括缓冲剂如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，其包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；氯化苯甲烃铵、氯化苯乙胺；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，其包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐的抗衡离子如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。所述活性药物成分还可以在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米粒和纳米囊)或在粗乳剂中，例如，通过凝聚技术或通过界面聚合作用，被裹在所制备的微囊中，例如，分别被裹在羟甲基纤维素或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸酯)微囊中。这些技术公开于Remington'sPharmaceutical Sciences 18th edition，(1995)Mack Publ.Co.，Easton，PA.中。
可以制备式I-VI化合物和本文所描述的其它化合物的持续释放制剂。持续释放制剂的适宜的实例包括含式I化合物的固体疏水聚合物的半透型基质，所述基质是成形物品的形式，例如，薄膜或微囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙基酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(US3773919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-甘醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-甘醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射的微球)和聚-D(-)3-羟基丁酸。
所述药物制剂包括适于本文所详述的给药途径的那些制剂。所述制剂可以方便地以单位剂量形式呈现并可以通过任何药学领域熟知的方法来制备。技术和制剂通常在Remington's Pharmaceutical Sciences18thEd.(1995)Mack Publishing Co.，Easton，PA中可以找到。这些方法包括使活性成分与组成一种或多种附属成分的载体结合的步骤。通常所述制剂通过以下方法制备：均匀并紧密地使活性成分与液体载体或细分的固体载体结合或与两者都结合，然后如果必要使产品成型。
适于口服给药的式I-VI化合物和本文所描述的其它化合物及自噬抑制剂的制剂可以制成离散单位如丸剂、硬或软的例如明胶胶囊、扁胶囊(cachets)、糖锭(troches)、锭剂(lozenges)、含水或含油的混悬剂、可分散的粉末或颗粒、乳剂、糖浆剂或酏剂，其各含有预设量的式I-VI化合物或本文所描述的其它化合物和自噬抑制剂。这些制剂可以按照用于药物组合物制造的本领域已知的任何方法来制备并且这些制剂可以含有一种或多种包括增甜剂、矫味剂、着色剂和防腐剂的试剂，以便提供适口的制剂。压制片剂可以通过以下方法来制备：在适宜机器中将任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、表面活性剂或分散剂混合的自由流动形式(如粉末或颗粒)的活性成分压缩。模塑片剂可以通过以下方法制备：在适宜机器中模塑以惰性液体稀释剂润湿的粉末状活性成分的混合物。所述片剂可以任选地进行包衣或刻线并任选地进行配制，以便提供活性成分从其中缓慢释放或控制释放。
本发明药物制剂的片剂赋形剂可以包括：充填剂(或稀释剂)，以增加组成片剂的粉末状药物的容量体积；崩解剂，当其被摄入时以促进所述片剂破碎成小碎片，理想地是个体药物粒子，并促进药物的快速溶出和吸收；粘合剂，以确保能以期望的机械强度形成颗粒剂和片剂，并在其已经被压缩后保持片剂在一起，以防止其在包装、运输和日常装卸期间破碎成其组分粉末；助流剂，以改善生产期间组成片剂的粉末的流动性；润滑剂，以确保制造期间压片粉末不粘附到用来压片的设备上。它们改善经过压床的粉末混合物的流动并使当完成的片剂从设备中排出时的摩擦力和破损降到最低；抗粘附剂，其具有与助流剂的那些功能类似的功能，在制造期间减少组成片剂的粉末与用来冲压出片剂形状的机器之间的粘附；矫味剂，其掺合到片剂中以给予其更愉快的味道或掩蔽不愉快的味道；和着色剂，以有助于识别和患者顺应性。
含有与适于片剂制造的无毒的可药用的赋形剂混合的活性成分的片剂是可以接受的。这些赋形剂可以是，例如，惰性稀释剂，如碳酸钙或碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；成粒和崩解剂，如玉米淀粉或藻酸；粘合剂，如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂，如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。片剂可以不包衣的或者可以是由已知技术包衣(包括微囊化)的，以延迟胃肠道中的崩解和吸收并由此提供历时较长时间的持续作用。例如，可以使用单独的或与蜡一起使用的时间延迟材料如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
对于眼睛或其它外部组织(例如，口和皮肤)的治疗，所述制剂优选地用作局部软膏或乳膏，其含有一定量的一种或多种活性成分，例如，0.075-20%w/w的活性成分。当以软膏配制时，所述活性成分可以与石蜡族或者与水可混溶的软膏基质一起使用。可替换地，可将所述活性成分与水包油乳膏基质一起配制在乳膏中。
如果需要，乳膏基质的水相可以包括多元醇，即，具有两个或更多个羟基的醇，如丙二醇、1，3-丁二醇、甘露醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇(包括PEG400)及其混合物。理想地，所述局部制剂可以包含增强所述活性成分经皮肤或其它起作用区域的吸收或渗透的化合物。这些皮肤渗透增强剂的实例包括二甲基亚砜和相关的类似物。
本发明乳剂的油相可以由已知的成分以已知的方式来组成，其包括至少一种乳化剂与脂肪或油的混合物，或与脂肪和油两者的化合物。优选地，亲水乳化剂与作为稳定剂的亲脂乳化剂一起包括在内。合起来，具有或没有一种或多种稳定剂的一种或多种乳化剂组成乳化蜡，并且所述蜡与所述油和脂肪一起构成形成乳膏制剂油性分散相的乳化软膏基质。适于在本发明制剂中使用的乳化剂和乳化稳定剂包括
Figure BDA0000371184410000741
60、80、十六醇十八醇混合物(cetostearyl alcohol)、苄醇、十四烷醇、单硬脂酸甘油酯和十二烷基硫酸钠。
本发明药物制剂的含水混悬液含有与适于制造含水混悬液的赋形剂混合的活性材料。这些赋形剂包括悬浮剂，如羧甲基纤维素钠、交联羧甲纤维素、聚维酮、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；和分散剂或润湿剂，如自然存在的磷脂(例如，卵磷脂)、亚烷基氧化物与脂肪酸的缩合产物(例如，聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如，十七亚乙基氧基十六醇(heptadecaethyleneoxycetanol))、环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇酐衍生的偏酯的缩合产物(例如，脱水山梨醇聚氧乙烯醚单油酸酯)。所述含水混悬液还可以含有一种或多种防腐剂如对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯，一种或多种着色剂，一种或多种矫味剂和一种或多种增甜剂如蔗糖和糖精。
药物组合物可以是无菌可注射制剂的形式，如无菌可注射的含水或油质混悬液。该混悬液可以按照已知的技术使用已在上面提到的那些适宜的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。所述无菌可注射制剂可以是无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的溶液或混悬液，如1，3-丁二醇中的溶液或由低压冻干粉末制备的溶液。在可接受的媒介物和溶剂之中可以使用的是水、林格溶液和等渗的氯化钠溶液。除此之外，无菌固定油(sterile fixed oils)照例可以用作溶剂或混悬介质。为了该目的，可以使用任何温和的固定油，其包括合成的甘油单酯或甘油二酯。除此之外，脂肪酸如油酸同样可以用在可注射制剂的制备中。
可以与载体材料组合以生产单个剂型的活性成分的量会取决于所治疗的主体和具体的给药模式而改变。例如，意在对人口服给药的定时释放制剂可以含有大约1-1000mg与适当且便利量的载体材料配合的活性材料，所述载体材料可以占总体组合物的约5至约95%(重量:重量)。可以制备所述药物组合物来为给药提供可容易测量的量。例如，意在静脉输注的水溶液可以每毫升溶液含有约3-500μg所述活性成分，以便适宜容量的输注能以约30mL/小时的速率进行。
适于肠胃外给药的制剂包括含水的和非水的无菌注射液，其可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使所述制剂与预期受者血液等渗的溶质；及含水的和非水的无菌混悬液，其可以包括悬浮剂和增稠剂。
适于对眼睛局部给药的制剂还包括滴眼剂，其中所述活性成分溶于或混悬于适宜的载体中，尤其用于所述活性成分的含水溶剂。所述活性成分优选地存在于如下这样的制剂中：约0.5-20%w/w浓度，例如约0.5-10%w/w，例如约1.5%w/w。
适于在口中局部给药的制剂包括锭剂，其包含矫味剂中的活性成分，所述矫味剂通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶；软锭剂，其包含惰性基质中的活性成分，所述惰性基质如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶；和漱口剂，其包含适宜液体载体中的所述活性成分。
直肠给药的制剂可以作为使用适宜基质的栓剂存在，所述基质包含例如可可脂或水杨酸酯。
适于肺内或鼻腔给药的制剂具有例如0.1-500微米(包括0.1-500微米粒径，增量微米如0.5微米、1微米、30微米、35微米等等)粒径，所述制剂通过经鼻通道的快速吸入或通过经口的吸入来给药以便到达肺泡囊。适宜的制剂包括所述活性成分的含水溶液或含油溶液。适于气溶胶或干粉给药的制剂可以按照常规方法来制备且可以在如下面所描述的障碍的治疗和预防中与其它治疗剂如此前所用的化合物一起递送。
适于阴道给药的制剂可以作为阴道栓剂、棉球(tampons)/乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾剂，除所述活性成分之外其应含有本领域已知的应是适当的这些载体。
还预期的是，可以通过基因疗法将本发明的药剂(例如，DNA、RNAi、shRNA、siRNA、激酶抑制剂、化学治疗剂或抗癌剂)引入到受试者。基因疗法指通过对受试者给予核酸来进行的疗法。在基因疗法应用中，将基因引入细胞以便实现治疗上有效的基因产物的体内合成，例如对于缺陷基因的替换。基因疗法”既包括常规的基因疗法，其中持续效果是通过单个治疗方法来实现的，又包括基因治疗剂的给予，其牵涉一次或重复给予治疗上有效的DNA或mRNA。反义RNA和DNA可以用作体内阻断某些基因表达的治疗剂。已经显示，可将短的反义寡核苷酸输入细胞，其中它们作为抑制剂起作用，尽管它们具有由其被细胞膜限制性摄取所引起的低细胞内浓度(Zamecnik et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:4143-4146(1986))。所述寡核苷酸可被修饰以曾强其摄取，例如通过用不带电的基团取代其带负电的磷酸二酯基团。对于基因疗法的方法的一般性综述，见，例如，Goldspiel etal.Clinical Pharmacy12:488-505(1993);Wu and Wu Biotherapy3:87-95(1991);Tolstoshev Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32:573-596(1993);MulliganScience260:926-932(1993);Morgan and Anderson Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993);and May TIBTECH11:155-215(1993)。可以使用的在重组DNA技术领域中通常已知的方法在Ausubel et al.eds.(1993)CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，NY;andKriegler(1990)Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY.中有描述。
在一个实施方案中，将用于形成本发明RNA构建物的RNAi构建物或DNA递送至进行治疗的一个或多个细胞，并可以将其与自噬抑制剂一起递送。有两种主要的手段使所述DNA/RNA(任选地包含在运载体中)进入患者的细胞；体内和离体。对于体内递送，通常在需要DNA/RNA的部位，将DNA/RNA直接注射到患者中。对于离体治疗，取出患者的细胞，将DNA/RNA引入这些分离的细胞中，并将修饰的细胞直接给予患者，或者，例如，将修饰的细胞包裹在植入到患者中的多孔膜中(见，例如，美国专利4,892,538和5,283,187)。对于将核酸引入活细胞有多种可用的技术。所述技术取决于是在体外将寡核苷酸转移至培养的细胞，还是在体内转移到预期宿主的细胞中而改变。在体外适于寡核苷酸至哺乳动物细胞转移的技术包括脂质体的使用、电穿孔法、显微注射法、细胞融合、二乙氨乙基葡聚糖法(DEAE-dextran)、磷酸钙沉淀法等等。基因离体递送的常用运载体是逆转录病毒运载体。
体内核酸转移技术的实例包括用病毒运载体(如腺病毒、单纯疱疹病毒I或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(对脂质介导的基因转移有用的脂质是例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)的转染。对于当前已知的基因标记和基因疗法规程的综述见Anderson et al.，Science256:808-813(1992)。还见WO93/25673和其中所引用的文献。基因疗法中使用病毒运载体的实例可在Clowes et al.J.Clin.Invest.93:644-651(1994);Kiem et al.Blood83:1467-1473(1994);Salmons and Gunzberg Human Gene Therapy4:129-141(1993);Grossman and Wilson Curr.Opin.in Genetics and Devel.3:110-114(1993);Bout et al.Human Gene Therapy5:3-10(1994);Rosenfeld et al.Science252:431-434(1991);Rosenfeld et al.Cell68:143-155(1992);Mastrangeli et al.J.Clin.Invest.91:225-234(1993);andWalsh et al.Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204:289-300(1993)中找到。
在一些情况下，期望用靶向靶标细胞的药剂提供核酸源，如特异性针对细胞表面膜蛋白或靶标细胞的抗体，靶标细胞上受体的配体等等。在使用脂质体的情况下，结合到与内吞相关的细胞表面膜蛋白的蛋白可以用于靶向和/或促进摄取，例如衣壳蛋白或其对具体细胞类型向性的片段，对周期中经历细胞内摄作用的蛋白的抗体，靶向细胞内定位并增强细胞内半衰期的蛋白。描述了受体介导的内吞的技术，例如，由Wu et al.，J.Biol.Chem.262，4429-4432(1987);和Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87，3410-3414(1990)描述了受体介导的内吞的技术。对于基因标记和基因疗法规程的综述见Anderson et al.，Science256，808-813(1992)。
所述制剂可以包装在单位剂量或多个剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并可以储存在冻干(低压冻干)条件下，使用之前仅需加入无菌液体载体，例如水，立即供注射用。临时的注射液和混悬液是从先前所描述的这类无菌粉末、颗粒和片剂制备的。优选的单位剂量制剂是如本文上面所详述含每日剂量或单位每日亚剂量活性成分的那些制剂，或其适当部分的活性成分的那些制剂。
本发明还提供了兽用组合物，其因此包含与兽用载体一起使用的至少一种如上面所定义的活性成分。兽用载体是用于给予所述组合物的物质并可以是固体、液体或气态物质，所述物质以其它方式是兽医学领域惰性的或可接受的并且是与所述活性成分相容的。这些兽用组合物可以肠胃外给药、口服给药或以任何其它期望的途径给药。
组合疗法
所述组合疗法可以作为同时或先后用药方案来给药。当先后给药时，所述组合可以在两次或更多次给药中给药。所述组合给药包括使用分开的制剂或单个药物制剂的共给药，和以任一次序的连续给药，其中优选地有两种(或所有)活性剂同时发挥其生物学活性的时间段。
对于任意上面共给药的药剂，适宜的剂量是目前所用的那些剂量并因为新近识别的药剂和其它自噬抑制剂或治疗方法的组合作用(协同作用)可以被降低。
在抗癌疗法的具体实施方案中，将式I-VI化合物或本文所描述的其它化合物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、溶剂化物、代谢产物或可药用的盐与自噬抑制剂组合，并且还与手术疗法和放射疗法组合。选择一种或多种式I-VI化合物或本文所描述的其它化合物及一种或多种自噬抑制剂的量，和给药的相对时机，以便实现期望的组合治疗效果。在一个实施方案中，所述治疗效果是协同作用。
本发明的化合物可以通过任何适于所治疗病症的途径来给药。适宜的途径包括口服、肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、动脉内、吸入、皮内、鞘内、硬膜外和输注技术)、经皮、直肠、经鼻、局部(包括口腔和舌下)、阴道、腹膜内、肺内和鼻内。局部给药还可以牵涉经皮给药的使用，如透皮贴剂或离子电渗疗法装置。药物制剂在Remington's PharmaceuticalSciences，18thEd.，(1995)Mack Publishing Co.，Easton，PA.Other examples ofdrug formulations can be found in Liberman，H.A.and Lachman，L.，Eds.，Pharmaceutical Dosage Forms，Marcel Decker，Vol3，2ndEd.，New York，NY中有论述。对于局部免疫抑制治疗方法，可以通过内部损伤给药给予所述化合物，其包括灌注或者移植前使所述移植物与所述抑制剂接触。应当理解，优选的途径可以随例如受者的病症而改变。在所述化合物口服给药的情况下，可将其与可药用的载体、助流剂或赋形剂一起配制为丸剂、胶囊、片剂等等。在所述化合物肠胃外给药的情况下，如下面所详述的，可将其与可药用的肠胃外媒介物或稀释剂一起并以单位剂量可注射的形式配制。
治疗人类患者的剂量可为约10至约1000mg式I-VI化合物。典型的剂量可以是约100mg至约300mg所述化合物。可以一天一次(QID)、每天两次(BID)或更频繁地给予剂量，其取决于药代动力学(PK)和药理动力学(PD)性质，所述性质包括具体化合物的吸收、分部、代谢和排泄。除此之外，毒性因素可以影响剂量和给药方案。当口服给药时，丸剂、胶囊或片剂可以每天吞服或较不频繁地吞服，持续指定的时间。所述用药方案可重复多个治疗循环。
制品
还提供了诱导自噬的激酶的抑制剂和自噬抑制剂的组合的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒包括诱导自噬的激酶的抑制剂和自噬抑制剂、可药用的载体、媒介物或稀释剂及容器。还可包括使用说明书。
在本发明的另一个实施方案中，提供了制品，或“试剂盒”，其含有对上面所描述的疾病和障碍的治疗有用的式I-VI化合物。在一个实施方案中，所述试剂盒包含容器，其包含式I化合物或其立体异构体、几何异构体、互变异构体、溶剂化物、代谢产物或可药用的盐。所述试剂盒还可以包含标签或药品说明书(package insert)，在容器上或附随于容器。术语“药品说明书”用来指习惯上包括在治疗品商品化包装内的说明书，其含有涉及这些治疗品使用的有关适应症、用法、用量、给药方法、禁忌症和/或警告的信息。适宜的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器、泡罩包装等等。所述容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成。所述容器可以容纳对治疗所述病症有效的式I-VI化合物或其制剂，并可以具有无菌存取口(sterile accessport)(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射针头刺破的塞子的静脉内注射液袋或小瓶)。所述组合物中至少一种活性剂是式I-VI化合物或本文所描述的化合物。所述标签或药品说明书标明，所述组合物是用于治疗选择的病症，如癌症。在一个实施方案中，所述标签或药品说明书标明，包含式I-VI化合物或本文所描述的化合物的组合物可以用来治疗由异常细胞生长造成的障碍。所述标签或药品说明书还可以标明，所述组合物可以用来治疗其它障碍。可替换地，或另外地，制品还可以包含第二容器，其包含可药用的缓冲剂，如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。其还可以包括从商业或使用者观点期望的其它材料，其包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、注射针头和注射器。
所述试剂盒还可以包含对式I-VI化合物或本文所描述的化合物给药的指导，并且，如果存在，还可以包含对第二药物制剂给药的指导。例如，如果所述试剂盒包含第一组合物和第二药物制剂，所述第一组合物包含式I-VI化合物或本文所描述的化合物，所述试剂盒还可以包含向有需要的患者同时、先后或分开给予第一和第二药物制剂的指导。
在另一个实施方案中，所述试剂盒适于递送固体口服形式的式I-VI化合物或本文所描述的化合物，如片剂或胶囊。这种试剂盒优选地包括若干单位剂量。这些试剂盒可以包括具有以其预期使用顺序取向的剂量的卡片。这种试剂盒的实例是“泡罩包装”。泡罩包装是包装工业中所熟知的并广泛用于包装药物单位剂型。如果需要，可以提供记忆辅助器(memory aid)，例如以数字、字母或其它标记的形式或用日历插页，其在治疗程序表中指明可以给药的日期。
按照一个实施方案，试剂盒可以包含(a)包含式I-VI化合物或本文所描述的化合物的第一容器，和任选的(b)包含第二药物制剂的第二容器，其中所述第二药物制剂包含具有抗过增殖活性的第二化合物。可替换地，或另外地，所述试剂盒还可以包含第三容器，其包含可药用的缓冲剂，如抑菌的注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格溶液和葡萄糖溶液。其还可以包括从商业或使用者观点期望的其它材料，其包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、注射针头和注射器。
在所述试剂盒包含式I-VI化合物或本文所描述的化合物和第二治疗剂(即，自噬抑制剂)组合物的情况下，所述试剂盒可以包含用于含有分开的组合物的容器如分开的瓶或分开的箔包装；然而，所述分开的组合物还可以含在单个、未分开的容器内。典型地，所述试剂盒包含对所述分开的组分给药的指导。当所述分开的组分优选地以不同剂型(例如，口服和肠胃外)给药时，以不同剂量间隔给药时，或当开处方的医师希望所述组合物的个体组分的滴定时，所述试剂盒形式是格外有利的。
诱导自噬的激酶的抑制剂
本文所提供的数据显示，Akt抑制和其它某些激酶的抑制不总是诱导明确的凋亡响应。自噬是对全-Akt敲低或抑制、Akt-亚型选择性敲低或抑制或Akt、PI3K、mTOR、PDK1或p70S6K途径的小分子抑制剂的可容易检测的响应。激酶抑制诱导的自噬可以使肿瘤细胞对靶抗溶酶体降解途径的药剂敏感。实际上，当在临床前模型中与诱导自噬并促进完全肿瘤缓解的激酶抑制剂组合时，阻断溶酶体降解功能的药剂能够促使细胞死亡。抑制、放慢或阻断自噬响应可能是增加诱导自噬的激酶的抑制剂的治疗功效的有前途的策略，所述诱导自噬的激酶的抑制剂例如Akt、PI3K、mTOR、PDK-1和p70S6K抑制剂。
自噬是例如比癌细胞系中的凋亡对Akt抑制更敏感的响应。为数众多报道已经证明多种癌症中磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt途径的脱调节，其不仅导致不受控制的生长和增殖，还导致对各种细胞死亡刺激的抵抗(ManningBD，Cantley LC.AKT/PKB signaling:navigating downstream.Cell2007;129:1261-74;Samuels Y，Ericson K.Oncogenic PI3K and its role in cancer.CurrOpin Oncol2006;18:77-82)。因此，靶向例如Akt、处在该途径中央结点的丝氨酸/苏氨酸激酶或对其抑制诱导自噬的其它激酶既可以抑制恶性细胞的生长又可以抑制恶性细胞的生存。
虽然认为Akt在保护细胞使其在各种促凋亡刺激后免于程序性细胞死亡中起重要作用(Manning BD，et al.;Downward J.Mechanisms andconsequences of activation of protein kinase B/Akt.Curr Opin Cell Biol 1998;10:262-7)，但仍测定是否凋亡是对单独抑制Akt活性的主要响应。特异性地敲低三种Akt亚型的每一种的RNA干扰技术以及特异性抑制剂导致明显比例的所检查的癌细胞系不能容易地经受凋亡，甚至当所有三种Akt亚型都被极大地减少时(Koseoglu S，Lu Z，Kumar C，Kirschmeier P，Zou J.AKT1，AKT2 and AKT3-dependent cell survival is cell line-specific and knockdown ofall three isoforms selectively induces apoptosis in 20 human tumor cell lines.Cancer Biol Ther2007;6:755-62)。这与以下报道是一致的：在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中只有总Akt活性中的小部分为凋亡抑制所需要。(Liu X，Shi Y，Birnbaum MJ，Ye K，De Jong R，Oltersdorf T，Giranda VL，Luo Y.Quantitativeanalysis of anti-apoptotic function of Akt in Akt1 and Akt2 double knock-outmouse embryonic fibroblast cells under normal and stressed conditions.J BiolChem2006;281:31380-8)。在Akt抑制后癌细胞对凋亡诱导的敏感度可能取决于其遗传背景和环境状况(environmental conditions)两者。例如，虽然较高水平的活化Akt可暗示肿瘤细胞对该途径的相对依赖并可以是对Akt抑制的凋亡响应的稍好的预测物，但还是在具有Akt活化的细胞中观察到对凋亡的抵抗，其包括磷酸酶和张力蛋白同系物(PTEN)，一种负向调节PI3K/Akt活性的肿瘤抑制基因丢失的那些细胞(Koseoglu S，et al)。可以想象，作为经过严格选择压力的进化结果，在晚期癌细胞中能通过多重机制遏制凋亡。
相反，虽然无PTEN细胞系PC3和U87MG两者都在对所有三种Akt亚型(shAkt123)可诱导的shRNA敲低的响应中凋亡是抵抗的，但是数据显示两种细胞系中明显升高的自噬作用。在各种细胞系中自噬看来似乎是对由特异性shRNA敲低或者由途径的选择性抑制剂引起的减少的活性更敏感的响应，无论在这些细胞中是否诱导自噬(Degtyarev and Lin，this work andunpublished data)。
阻断自噬降解与Akt抑制组合加速细胞死亡。自噬已经被认为既是细胞死亡的机制又是细胞保护过程，取决于具体情况和细胞环境(circumstances and cellular contexts)。(Scarlatti F，Granata R，Meijer AJ，Codogno P.Does autophagy have a license to kill mammalian cells?2008)。然而，表达shAkt123的PC3细胞可以生存延长的时间期而没有生存力明显损失，甚至在减少的血清条件下。当随着异种移植物肿瘤生长，虽然shAkt123的持续表达最初能有效地抑制肿瘤生长，但是多数肿瘤未能完全地缓解并最后胜过所述抑制剂作用且在2-3周内复发。这些暗示，由单独抑制Akt诱导的自噬不能在这些条件下有效消除癌细胞。
因为自噬是对Akt敲低或小分子抑制剂更敏感的响应，阻断有效的自噬与Akt抑制组合能加速细胞死亡。所述抗溶酶体药剂氯喹(CQ)在细胞中明显加速细胞死亡，所述细胞表达shAkt123或者用如下相对特异性的小分子途径抑制剂处理：PI-103(PI3K/mTOR抑制剂，其对I类比对III类PI3K的效力大1，000倍)(Knight ZA，Gonzalez B，Feldman ME，Zunder ER，Goldenberg DD，Williams O，Loewith R，Stokoe D，Balla A，Toth B，Balla T，Weiss WA，Williams RL，Shokat KM.A pharmacological map of the PI3-Kfamily defines a role for p110alpha in insulin signaling.Cell2006;125:733-47)和Akti-1/2(选择性双重Akt1、2抑制剂)(Barnett SF，Defeo-Jones D，Fu S，Hancock PJ，Haskell KM，Jones RE，Kahana JA，Kral AM，Leander K，Lee LL，Malinowski J，McAvoy EM，Nahas DD，Robinson RG，Huber HE.Identificationand characterization of pleckstrin-homology-domain-dependent andisoenzyme-specific Akt inhibitors.Biochem J2005;385:399-408)，所述两者都诱导明显的自噬。用损害溶酶体酸化作用的空泡质子泵(V-H+-ATP酶)抑制剂巴弗洛霉素A1获得类似的效果(Yamamoto A，Tagawa Y，Yoshimori T，Moriyama Y，Masaki R，Tashiro Y.Bafilomycin A1 prevents maturation ofautophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes andlysosomes in rat hepatoma cell line，H-4-II-E cells.Cell Struct Funct1998;23:33-42)。也已经在扩展的癌细胞系实验对象中观察到CQ和Akt抑制剂的协同性生长抑制。
扩大的自体溶酶体样空泡的积聚在用CQ和Akt途径抑制剂处理的细胞中细胞死亡的起始之前。虽然Akt抑制和CQ单独都能诱导自噬空泡(AV)的积聚(图25A-C)，但是进一步分析显示，单独的Akt抑制导致增加的组织蛋白酶D的产生和成熟及溶酶体活性，而CQ阻断组织蛋白酶D的成熟，其在具有Akt抑制的细胞中导致非常大的和可能的降解缺陷的空泡的积聚。这与半胱天冬酶3的活化和凋亡胞核的引人注目的增加一致(图25D，E)。在用Akt抑制剂单独处理的细胞中具有线粒体去极化和活性氧物质(ROS)产生的增加。在48小时内单独用Akt抑制剂减弱胞质ROS产生，但CQ共处理引起胞质和空泡中延长的ROS积聚。由于增加的溶酶体膜通透性(LMP)和随后胞质ROS清除剂硫氧还蛋白的降解造成的组织蛋白酶D的胞质易位先前被建议为CQ与另一种自噬诱导剂组合导致的ROS积聚和细胞死亡诱导的机制(Carew JS，Nawrocki ST，Kahue CN，Zhang H，Yang C，Chung L，Houghton JA，Huang P，Giles FJ，Cleveland JL.Targeting a utophagy augmentsthe anticancer activity of the histone deacetylase inhibitor SAHA to overcomeBcr-Abl-mediated drug resistance.Blood2007;110:313-22)。虽然LMP仍然可以是对细胞死亡有贡献的可能的下游事件，但是在研究者的系统中细胞死亡起始之前没有观察到硫氧还蛋白降解的明显增加(Degtyarev and Lin，unpublished data)。相反，组织蛋白酶D敲低或溶酶体蛋白酶活性的抑制不能保护细胞使其免受CQ/Akti-1/2-诱导的细胞死亡，而是在促进细胞死亡中当与Akti-1/2组合时具有与CQ类似的效果。这与CQ和Akti-1/2对组织蛋白酶D成熟的相反效果一致，并暗示，保留(升高的)溶酶体降解活性对由Akt抑制诱导的升高的自噬活性存在下的细胞生存是至关重要的。综合考虑，这些发现支持由Akt抑制引起的有限线粒体去极化导致促进自噬的ROS信号增加的模型(Scherz-Shouval R，Shvets E，Fass E，Shorer H，Gil L，Elazar Z.Reactive oxygen species are essential for autophagy and specifically regulate theactivity of Atg4.Embo J2007;26:1749-60)，其依次移除损伤的线粒体并缓解氧化应激。由CQ引起的自体溶酶体消化作用的损伤导致有害氧化产物的聚集，所述氧化产物还能放大ROS损害(Moore MN，Viarengo A，Donkin P，Hawkins AJ.Autophagic and lysosomal reactions to stress in the hepatopancreasof blue mussels.Aquat Toxicol2007;84:80-91)。多个下游事件，其包括半胱天冬酶活化和可能的LMP，可能既导致凋亡样细胞死亡又导致非凋亡细胞死亡(图24)。不受理论束缚，图24描述了Akt抑制与自噬抑制剂(氯喹)组合导致的细胞死亡机制的模型。
pan-Akt抑制剂的剂量可能会受其副作用的限制，最特别的是由于胰岛素信号的抑制造成的代谢作用(Amaravadi et al，2005)。发明人的数据暗示，
至少在癌症模型如无PTENPC3异种移植物肿瘤中，单独用持续的pan-Akt敲低是不可能实现肿瘤细胞的完全消除的。然而，与CQ的组合治疗方法明显增加异种移植物模型中完全肿瘤缓解的发生，尽管单独的CQ没有明显效果。这暗示，经过Akt抑制的自噬诱导可以使肿瘤对该相对无毒的临床上批准用于其它适应症的药物敏感。
不适当的自噬抑制能够导致其肿瘤遏制功能的丧失或可以引起可替换的生存途径的增量调节(Levine B.Cell biology:autophagy and cancer.Nature2007;446:745-7;Wang Y，Singh R，Massey AC，Kane SS，Kaushik S，Grant T，Xiang Y，Cuervo AM，Czaja MJ.Loss of macroautophagy promotes or preventsfibroblast apoptosis depending on the death stimulus.J Biol Chem2008;283:4766-77)。本文数据暗示，缺陷自体溶酶体的积聚是为CQ的效果所必需的。阻断降解同时允许自噬隔离出现的一个潜在优点是，这可以导致缺陷自体溶酶体中毒性更强的ROS发生器的形成，如脂褐素(Terman A，Gustafsson B，Brunk UT.The lysosomal-mitochondrial axis theory ofpostmitotic aging and cell death.Chem Biol Interact 2006;163:29-37;MooreMN，Viarengo A，Donkin P，Hawkins AJ.Autophagic and lysosomal reactions tostress in the hepatopancreas of blue mussels.Aquat Toxicol2007;84:80-91)，因此其导致更迅速的细胞死亡诱导作用。除此之外，在它们已参与到自噬响应后，细胞不可能找到容易的逃避(escape)。
所述PI3K/Akt途径对细胞生长和生存的多个方面是重要的，所述途径具有比人类癌症中其它途径更频繁地被基因畸变所靶向的多种组分，使得它成为有吸引力的癌症治疗靶标。在Akt抑制剂临床结果下面的关键性问题是三种需要的亚型之间选择性的程度及从抑制这些激酶预期的对肿瘤细胞生长和生存的作用。最近描述的对Akt1和Akt2具有空前的选择性的变构Akt抑制剂提供了有价值的工具以开始处理这些问题(Barnett，S.F.，M.T.Bilodeau，and C.W.Lindsley，(2005)，The Akt/PKB family of protein kinases:areview of small molecule inhibitors and progress towards target validation.CurrTop Med Chem.5:109-25)。然而，迄今小分子抑制剂限制在能实现的特异性程度内，并由于弱的药理学性质不能评估所报道的化合物的体内功效。除此之外，尚未报道Akt3选择性化合物。
RNA干扰是遏制基因表达的有力方法。使用Dox-可诱导的shRNA手段，发明人能个别地和在所有可能的组合中实现各Akt亚型的特异性KD，以评估体内肿瘤生长的维持中各亚型的需求。本文提供的数据暗示，在Pten-雄激素非依赖性前列腺癌模型PC3和胶质母细胞瘤模型U87MG两者中，Akt1是维持肿瘤生长最重要的亚型。这与最近的报道一致，在Akt1是主要表达亚型的组织中和在Akt1不是主要表达亚型的那些组织中两种情况下，Akt1缺乏都可以显著降低Pten+/-小鼠中肿瘤的发生(Chen et al.，2006)。然而，在小鼠基因研究中先于Pten+/-小鼠中肿瘤发展切除Akt1，而在当前研究中发明人允许肿瘤在诱导Akt1KD之前确立。因此，减少Akt1活性不仅预防肿瘤发展，而且抑制人类癌症模型中缺乏PTEN的确立肿瘤的生长。
Akt2和Akt3的另外KD导致更稳定和确切的肿瘤生长抑制。这暗示，在维持肿瘤生长中Akt2和Akt3活性可以部分补偿减少的Akt1活性。这与用组合的AktKD观察到的下游靶标更有效的抑制一致。综合考虑能够被同时发生的Akt2KD所抵消的与单独抑制Akt1有关的增加的侵袭力的最近报告，高选择性Akt1抑制可能不是期望的。本文所提供的数据暗示，所有三种亚型的部分KD在肿瘤生长抑制中更有效。看似合理的方案是抑制所有三种Akt亚型，但是具有不同程度活性的KD，因此为其正常的生理学功能保留关键性亚型活性水平，而同时实现对肿瘤生长和进展的最大抑制效果。
Akt的一个最突出功能是来介导细胞生存。已经报道，基本上活性Akt保护细胞使其在各种促凋亡刺激后免受程序性细胞死亡。然而凋亡是否是对Akt抑制的主要响应是不太明确的，尤其是在由于各种基因改变而经常遏制凋亡的癌细胞中。先前使用PI3K/Akt途径的小分子抑制剂的实验经常产生相矛盾的结果，所述结果被这些化合物不可避免的非特异性效果所模糊。本文所提供的数据表明，在正常细胞培养条件下，任意或所有三种Akt亚型的特异性KD可以导致细胞周期延迟而没有促进明显凋亡。这与最近的报道一致：在正常生长条件下，仅总体Akt活性的小部分是为凋亡抑制所必需的(Liu，X.，Y.Shi，M.J.Birnbaum，K.Ye，R.De Jong，T.Oltersdorf，V.L.Giranda，and Y.Luo，(2006)，Quantitative analysis of anti-apoptotic function ofAkt in Akt1 and Akt2 double knock-out mouse embryonic fibroblast cells undernormal and stressed conditions.J Biol Chem.281:31380-8)。相反，在具有AktKD的PC3和U87MG细胞中都观察到明显增加的自噬，其暗示自噬是对减少的Akt活性更敏感的响应。这通过使用相对特异性的途径抑制剂来进一步证明，所述抑制剂包括双重PI3K/mTOR抑制剂和双重Akt1，2抑制剂。
虽然Akt抑制诱导的自噬的分子机制仍有待进一步阐明，但是存在若干可能性。第一，抑制Akt可以导致mTOR的抑制，其是已知的自噬抑制剂。令人感兴趣的是，显示组成性活性形式的Akt通过雷帕霉素遏制自噬的诱导作用(Takeuchi，H.，Y.Kondo，K.Fujiwara，T.Kanzawa，H.Aoki，G.B.Mills，and S.Kondo，(2005)，Synergistic augmentation of rapamycin-inducedautophagy in malignant glioma cells by phosphatidylinositol 3-kinase/proteinkinase B inhibitors.Cancer Res.65:3336-46)，从而提高以下的可能性：Akt对自噬的效果可以不完全经过Akt下游的raptor-mTOR活性来介导，或者雷帕霉素的效果可以至少部分经过抑制Akt来介导，例如经过延长治疗后抑制mTORC2装配(Sarbassov，D.D.，S.M.Ali，S.Sengupta，J.H.Sheen，P.P.Hsu，A.F.Bagley，A.L.Markhard，andD.M.Sabatini，(2006)，Prolonged rapamycintreatment inhibits mTORC2 assembly and Akt/PKB.Mol Cell.22:159-68.Epub2006Apr6)。第二，可能的是，Akt的其它信号输出如葡萄糖摄取和代谢或细胞周期调节还可以独立于mTOR帮助自噬调节。值得注意的是，Akt抑制稳定p27kip1，最近显示其在生长因子去除下介导自噬(Liang，J.，S.H.Shao，Z.X.Xu，B.Hennessy，Z.Ding，M.Larrea，S.Kondo，D.J.Dumont，J.U.Gutterman，C.L.Walker，J.M.Slingerland，and G.B.Mills，(2007)，The energysensing LKB1-AMPK pathway regulates p27(kip1)phosphorylation mediatingthe decision to enter autophagy or apoptosis.Nat Cell Biol.9:218-24)。第三，本文所提供的数据表明，Akt抑制诱导线粒体膜去极化和增加的ROS产生。最近显示，饥饿刺激线粒体中ROS的生成，其充当活化自噬的信号(Scherz-Shouval，R.，E.Shvets，E.Fass，H.Shorer，L.Gil，andZ.Elazar，(2007)，Reactive oxygen species are essential for autophagy and specifically regulate theactivity of Atg4.Embo J.26:1749-60)。可以想象，Akt抑制可以经类似的机制诱导自噬，且升高的自噬本身使这些受损的线粒体再循环并防止ROS积聚至有害的水平。
虽然当允许到达其极限时过度的自噬可以导致细胞杀死，但是在发明人检查的无PTEN癌细胞系中，甚至在减少的血清条件下，单独抑制Akt似乎在细胞杀死中是非常无效的。在体内肿瘤生长条件下，自噬可能是Akt抑制限制肿瘤生长的潜在机制，但还可能提供从Akt抑制施加的代谢和氧化应激中的暂时缓解，其可以允许出现抗药性。实际上，单独用AktKD处理的大多数肿瘤变得有抗药性并在初始消退或停滞后复发。在早期抑制自噬可以防止暂时的保护作用，但还可以抵消自噬的可能的肿瘤抑制作用。在后期阻断自噬完成可避免该抵消作用。实际上，Akt抑制与抗溶酶体药剂的组合导致不能被清除的降解缺陷的自体溶酶体样空泡的过度积聚，其导致加速的细胞死亡。该组合不仅可以破坏ROS清除剂和自噬的自我更新功能，而且促进缺陷的自体溶酶体的破裂和溶酶体内容物向胞浆内的释放，其进一步增大氧化应激和线粒体损伤，导致最后的细胞死亡。最近，报道了作为对治疗的适应性生存响应来诱导的自噬抑制能在Myc-诱导的小鼠淋巴瘤模型中增强凋亡(Amaravadi et al.，2007)。如本文所报道，使用抗溶酶体药剂可以充分利用通过Akt/PI3K抑制诱导的自噬，促进无PTEN人类肿瘤异种移植物的缓解。既然预期该作用与通过给定治疗方法诱导的自噬程度呈正相关，抗溶酶体药剂与诱导广泛自噬的药剂(如Akt途径的抑制剂)的创造性组合可以深深地影响其抗癌功效。Degenhardt et al.提出，Akt过度表达所导致的自噬抑制能导致肿瘤中心的坏死而同时周围的肿瘤细胞可能报以加速的生长，所述加速的生长是坏死诱导的炎性响应和Akt刺激的增殖的组合作用的结果。然而，在Akt抑制的存在下，因为肿瘤细胞增殖被极大地减少，由CQ-诱导的晚自噬抑制引起的加速细胞死亡能够在肿瘤细胞有由于可能的炎性响应而重新长回的时间之前能完全消除肿瘤细胞。本文所提供的数据显示，缺乏PTEN的细胞比具有完整PTEN的细胞对该组合更敏感，其暗示可能实现合理的治疗窗。已发现CQ在若干疾病中的治疗功效并很好地被耐受(Gustafsson，L.L.，O.Walker，G.Alvan，B.Beermann，F.Estevez，L.Gleisner，B.Lindstrom，andF.Sjoqvist，(1983)，Disposition of chloroquine inman after single intravenous and oral doses.Br J Clin Pharmacol.15:471-9;Hagihara，N.，S.Walbridge，A.W.Olson，E.H.Oldfield，and R.J.Youle，(2000)，Vascular protection by chloroquine during brain tumor therapy with Tf-CRM107.Cancer Res.60:230-4)。在给出据报道诱导自噬的抗癌剂的延长名单的情况下，CQ和其它抗溶酶体药剂可在癌症治疗中找到有希望的新的治疗价值。
实施例
材料和方法
细胞培养和试剂：如先前所描述的，维持PTEN-/-和PTEN+/+MEF(Sun，H.，R.Lesche，D.M.Li，J.Liliental，H.Zhang，J.Gao，N.Gavrilova，B.Mueller，X.Liu，andH.Wu，(1999)，PTEN modulates cell cycle progression and cellsurvival by regulating phosphatidylinositol3，4，5，-trisphosphate and Akt/proteinkinase B signaling pathway.Proc Natl Acad Sci U S A.96:6199-204)。在含10%无四环素的胎牛血清的DMEM/Ham’s F-12(1:1)中在37℃和5%CO2维持PC3和U87MG细胞。II-4来自Calbiochem(Akt inhibitor VIII)(Barnett，S.F.，D.Defeo-Jones，S.Fu，P.J.Hancock，K.M.Haskell，R.E.Jones，J.A.Kahana，A.M.Kral，K.Leander，L.L.Lee，J.Malinowski，E.M.McAvoy，D.D.Nahas，R.G.Robinson，and H.E.Huber，(2005)，Identification and characterization ofpleckstrin-homology-domain-dependent and isoenzyme-specific Akt inhibitors.Biochem J.385:399-408)。为抑制自噬，将细胞用5-10μM氯喹、2.5nM巴弗洛霉素A1或1mM3-MA(都来自Sigma)处理并在标明的时间点分析。Image-iT LIVE Green Reactive Oxygen Species Detection试剂盒购自Molecular Probes。MitoPT Mitochondria Permeability Transition Detection试剂盒购自Immunochemistry Technologies，LLC。
可诱导的shRNA构建物和可诱导的shRNA克隆的产生：已在别处报道pHUSH四环素诱导的逆转录病毒基因转移运载体(Gray，D.，A.M.Jubb，D.Hogue，P.Dowd，N.Kljavin，S.Yi，W.Bai，G.Frantz，Z.Zhang，H.Koeppen，F.J.de Sauvage，and D.P.Davis，(2005)，Maternal embryonic leucine zipperkinase/murine protein serine-threonine kinase 38is a promising therapeutictarget for multiple cancers.Cancer Res.65:9751-61;Hoeflich，K.P.，D.C.Gray，M.T.Eby，J.Y.Tien，L.Wong，J.Bower，A.Gogineni，J.Zha，M.J.Cole，H.M.Stern，L.J.Murray，D.P.Davis，and S.Seshagiri，(2006)，Oncogenic BRAF isrequired for tumor growth and maintenance in melanoma models.Cancer Res.66:999-1006;US2007/0026002，herein incorporated by reference in itsentirety)。如先前所描述的，使用穿梭运载体将互补的双链shRNA寡核苷酸插入该运载体系统，然后进行Gateway重组反应(Invitrogen)(Grunwald，V.，L.DeGraffenried，D.Russel，W.E.Friedrichs，R.B.Ray，and M.Hidalgo，(2002)，Inhibitors of mTOR reverse doxorubicin resistance conferred by PTEN status inprostate cancer cells.Cancer Res.62:6141-5;See also Figure23herein)。本研究中所用的shRNA序列概述于表2中。所有构建物经序列测定验证。如所描述的进行逆转录病毒感染(Gray et al.，2005;Hoeflich et al.，2006)。对于单个Akt亚型敲低，将细胞用一种逆转录病毒运载体感染，所述运载体编码单一靶向各Akt亚型的shRNA构建物(对Akt1的构建物252和253，对Akt2的254和255及对Akt3的259和260)，并使用5μg/ml嘌呤霉素选择稳定的克隆。对于双重Akt1和Akt2KD，使用同时靶向Akt1和2两者的单个shRNA(构建物256和257)。通过用各编码单个shRNA的两种含不同抗生素选择标记物(嘌呤霉素和潮霉素)的逆转录病毒运载体共感染来实现双重Akt2和3(构建物255和261)或三重Akt1、2和3(构建物257和261)敲低，并使用5μg/ml嘌呤霉素和300μg/ml潮霉素选择稳定的克隆。对于双重Akt1和3KD，使用靶向Akt1和3两者的单个shRNA(构建物258)，或者使用用两种shRNA运载体的共感染(构建物253和261)。
蛋白质印迹分析、免疫荧光法、IHC和TUNEL分析方法：对于蛋白质印迹分析，使全体蛋白裂解液经受SDS-PAGE并将其转移至硝化纤维素中。所用抗体是：抗-Akt1、抗-Akt2、抗-Akt3、抗-全体-Akt、抗-p-Akt(Ser473)、抗-p-Akt(Thr308)、抗-p-S6(Ser235/236)、抗-PARP和抗-裂解的半胱天冬酶-3(Cell Signaling Technology)；抗-p-PRAS40(Invitrogen)；抗-p27Kip1(SantaCruzBiotechnology)；抗-LC3(Novus)；抗-LAMP2和抗-组织蛋白酶D(BDBiosciences)；和抗-GAPDH(Advanced Immunochemical Inc.)。使用IR Dye800-缀合的(Rockland)和Alexa-Fluoro680-缀合的(Molecular Probes)种类选择性二级抗体检测一级抗体。使用用Odyssey红外扫描仪(LICOR)并使用厂商软件进行检测和定量。对于免疫荧光染色，将细胞固定在3%多聚甲醛中，并先后使用PBS中的0.01%毛地黄皂苷和用cy3-缀合的抗-兔二级抗体(Jackson Immunoresearch)检测的兔多克隆抗-LC3(Abgent)一级抗体透化。对于IHC，收集福尔马林固定的、石蜡包埋的样品。使用抗-Ki-67(MIB-1，DakoCytomation)抗体与Dako ARK试剂盒(Dako Corporation)将5-μm厚的石蜡包埋的切片染色。将组织用苏木精复染、脱水并封固(mounted)。在所有情况下，按照每个厂商的说明书，用Dako Target Retrieval试剂盒进行抗原提取(antigen retrieval)。对于TUNEL分析方法，按照厂商说明书，使用原位细胞死亡检测试剂盒(POD;Roche Diagnostic)将福尔马林固定的、石蜡包埋的切片染色。
异种移植物研究：6至8周大的雌性无胸腺nu/nu裸鼠购自Charles RiverLaboratories并在Genentech的常规动物设施中饲养。在右胁腹对小鼠注射再混悬于200μl汉克平衡盐溶液(Invitrogen)的5～7.5x106个细胞。当肿瘤达到100～300mm3的平均体积时，将具有类似大小肿瘤的小鼠分成治疗队列。对于对照和KD队列，小鼠分别接受含5%蔗糖或5%蔗糖加1mg/mlDox的饮用水。使用琥珀色水瓶并每周更换3次。将CQ溶于0.9%生理盐水，过滤消毒并或者经腹膜内途径或者经皮下途径以45mg/kg给药。用测径器测量肿瘤并每周将小鼠称重两次。对肿瘤达到2000mm3或丧失超过20%体重的小鼠实施安乐死。8～10只小鼠用于各治疗组。使用JMP软件(SASInstitute，Inc.)分析统计学显著性。
电子显微镜检查：使细胞在塑料瓶中生长至单层并将其固定在半强度Karnovsky固定剂(2%多聚甲醛、2.5%戊二醛、0.025%CaCl2.2H2O和0.1M二甲胂酸钠缓冲液，pH7.4)中；将肿瘤切成小立方体(～1mm3)并通过在相同的固定剂或用于免疫电子显微镜检查的固定剂中的浸渍来固定。将细胞和组织用1%OsO4和1%K4Ru(II)(CN)6或1.5%K3Fe(CN)6后固定，在乙醇中脱水并包埋在Epon中。将超薄切片用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色。在4.5μm2的系统取样的胞质面积上计数AV的数目(对于每一条件，n≥64)。通过方形网格测量百分AV面积，所述网格覆盖≥5组系统取样的显微照片，各组覆盖≥80μm2胞质面积。从3-4组100个系统计数的肿瘤细胞核中凋亡胞核的数目计算出肿瘤组织中凋亡胞核的平均百分数。
免疫电子显微镜检查。小肿瘤块通过以下方法固定：在4℃在含2%多聚甲醛、0.2%戊二醛的pH7.4的0.1M磷酸盐缓冲液中浸渍5小时。用PBS冲洗后，将所述肿瘤块包埋在12%明胶中，用2.3M蔗糖低温防护并在液氮中冷冻。在-120℃切超薄冷冻切片，用1%甲基纤维素、1.2M蔗糖采集，解冻并收集在铜网上。用含0.02M甘氨酸的PBS洗涤后，将切片用兔抗-人类LAMP1抗体(gift of M.Fukuda，(Carlsson，S.R.，J.Roth，F.Piller，and M.Fukuda.1988.Isolation and characterization of human lysosomalmembrane glycoproteins，h-lamp-1and h-lamp-2.Major sialoglycoproteinscarrying polylactosaminoglycan.J Biol Chem.263:18911-9)或用大鼠单克隆抗-小鼠LAMP-1抗体ID4B(T.August，Developmental Studies Hybridoma Bank，Iowa City，IA)孵育，然后用二级兔抗-大鼠IgG抗体(Dako)孵育。其后将这些用与10nm胶体金颗粒缀合的蛋白A标记，并与1.8%甲基纤维素、0.6%乙酸双氧铀混合物相对比。
细胞生存力和细胞周期分析。用Vi-Cell Analyzer(Beckman Coulter)使用台盼蓝排除分析方法，或用含1μg/ml PI的PBS/1%BSA标记然后通过用荧光激活细胞分选仪(FACS)(Becton Dickinson)的流式细胞分析，测量细胞数量和生存力。将FITC-缀合的膜联蛋白V用于通过FACS分析的磷脂酰丝氨酸暴露的估定。使用半胱天冬酶-Glo3/7Assay试剂盒(Promega)分析半胱天冬酶活化。对于细胞周期分析，将细胞用已冷的70%乙醇的滴加固定，用PBS洗涤并再混悬于含50μg/ml PI和60单位RNAse A的染色溶液中。通过流式细胞仪使用FlowJo和ModFit软件(Becton Dickinson)分析DNA内容物。
多谱段成像流式细胞仪：将用各种试剂处理的细胞用吖啶橙染色并通过使用IDEAS图像分析程序的ImageStream系统(Amnis Corporation，Seattle，WA)来分析。首先将DNA AO绿色图像和空泡的AO红色图像补偿到单独通道中，然后定量凋亡/除核细胞(基于AO核形态学和强度)与形成空泡的细胞(AO Red+)的百分比。AO绿强度对AO绿色明亮细节区域作图显示三种不同的种群：R2除核细胞(低AO绿色标记，由于弥散胞质的掩蔽造成的更高区域)；R3凋亡细胞(中部至低的AO绿色，由于小的、明亮的冷凝核碎片的存在造成的非常低的AO绿色细节区域)；R4活细胞(完整明亮的胞核)。AO红强度在具有任意关口(R5)的第二直方图上作图，该直方图用来包括具有最亮的AO红强度的事件。
时差视频显微镜检查：在环境控制(37℃和5%CO2)下，将24孔板中培养的细胞在Olympus IX81倒置显微镜成像3天。化合物加入6小时后开始成像并以1小时间隔取像。
实施例1
可诱导的Akt亚型的shRNA KD以剂量和亚型依赖的方式抑制无PTEN人类肿瘤异种移植物的生长
为了确定三种Akt亚型在维持肿瘤生长中的相对贡献，发明人使用tet-可诱导的shRNA KD方法，所述tet-可诱导的shRNA KD方法使用最近描述的逆转录病毒运载体系统，一种用于H1或U6短发夹结构的tet-可诱导的质粒运载体(Gray et al.，2005;Hoeflich et al.，2006)。发明人选择无PTEN人类前列腺癌细胞系PC3和神经胶质瘤细胞系U87MG(Li，J.，C.Yen，D.Liaw，K.Podsypanina，S.Bose，S.I.Wang，J.Puc，C.Miliaresis，L.Rodgers，R.McCombie，S.H.Bigner，B.C.Giovanella，M.Ittmann，B.Tycko，H.Hibshoosh，M.H.Wigler，andR.Parsons，(1997)，PTEN，aputative protein tyrosinephosphatase gene mutated in human brain，breast，and prostate cancer.Science.275:1943-7)。两种细胞系都表达所有三种Akt亚型；在PC3细胞中，Akt1蛋白以大约Akt2的两倍水平表达，Akt3贡献＜全部Akt的10%，而在U87MG细胞中，所有三种Akt蛋白以相等水平表达(图18A)。产生PC3和U87MG细胞的稳定克隆，其包含可诱导的shRNA构建物，所述构建物靶向所有可能的单个或组合的Akt亚型(表2)。各个Akt靶向的shRNA(shAkt)在多西环素(Dox)诱导后引起相应AktmRNA和蛋白的～75-99%KD(图1A、图18B和表3)。在对所述KD的响应中，不同程度地观察到下游靶标PRAS40和S6的降低的稳定状态磷酸化、p27Kip1的增量调节和IRS1的反馈稳定作用，在具有所有三种Akt KD的细胞中观察到最强的作用(图1A)。
发明人接下来检查Akt KD对体内PC3细胞维持确立肿瘤生长的能力的影响。单独的Akt2(shAkt2)或Akt3(shAkt3)的Dox-诱导的KD不导致肿瘤生长的明显抑制(图1B和表3)。相反，两种不同的靶向Aktl(shAkt1)的shRNA构建物都显示明显的肿瘤生长抑制，各在三分之二独立的克隆内。在这些克隆中典型地观察到肿瘤生长迟缓或停滞(图1B、图18H和表3)。Aktl，2(shAkt12)或Aktl，3(shAkt13)同时发生的KD也抑制肿瘤生长，伴随着几乎所有肿瘤生长停滞并在若干Dox-处理的小鼠中观察到肿瘤消退。令人感兴趣的是，Akt2和Akt3(shAkt23)两者的KD也导致明显的肿瘤生长抑制，在Dox处理的2周期间内没有肿瘤体积加倍，其暗示单独的Akt1活性不足以维持最佳的肿瘤生长。最后，三重-Akt KD(shAktI23)最有效地抑制肿瘤生长，伴随着在处理的第一个2周期间内观察到的连续的肿瘤消退。在U87MG细胞中观察到类似结果，所述细胞表达类似水平的三种Akt亚型。在三种单个KD当中，只有shAkt1表现出明显的肿瘤停滞，并且三重-AktKD再次观察到肿瘤消退(图18，C-F)。因此，单独的Aktl的KD可以在PC3和U87MG异种移植物两者中都抑制肿瘤生长，且该Akt1依赖性不仅是总Akt剂量作用。然而，更确切的肿瘤生长抑制和消退出现在具有所有三种Akt亚型KD的肿瘤中。
表1用在AktshRNA运载体(pShuttle-H1和pHUSH-GW)中的DNA寡核苷酸序列
Figure BDA0000371184410000931
Figure BDA0000371184410000941
Figure BDA0000371184410000951
表2所用Akt shRNA构建物和有效靶标序列的概述
Figure BDA0000371184410000961
a用来确立shRNA稳定表达的抗生素选择。Pur，嘌呤霉素；Hyg，潮霉素。
b靶标中的有义序列(都以5’-3’方向)。
c含这些19个碱基对核心序列的siRNA双链体或shRNA发夹结构还应该对标明的基因(有义和反义序列两者都是以5’-3’方向)是有效的。
表3对于各种PC3-AktshRNA克隆，Akt敲低效能和对异种移植物肿瘤生长的影响的概述
Figure BDA0000371184410000981
Figure BDA0000371184410000991
a与未治疗的对照相比，Dox治疗72小时后通过实时定量RT-PCR(Taqman)测定的信息水平的百分比。数据表示至少3个独立实验的均值±SEM。
b各队列中所分析肿瘤的数目。
c截止第14天进展的肿瘤数目，由肿瘤体积＞治疗开始时初始大小的2倍所定义。
d截止第14天消退的肿瘤数目，由肿瘤体积＜治疗开始时初始大小的50%所定义。
e第14天或当实现显著性差异的第一天肿瘤生长抑制(TGI)的百分比，计算为%TGI=%[Vc(dx-d0)-Vt(dx-d0)]/Vc(dx-d0)*100，其中Vc(dx-d0)是分析日(dx)和治疗开始日(d0)之间对照队列的平均肿瘤体积(Vc)的差，且Vt(dx-d0)是分析日和治疗开始日之间治疗队列的平均肿瘤体积(Vt)的差。%TGI＞100表明肿瘤消退。
f达到显著性的日期，在对照和治疗组之间显著性差异实现之前治疗后所需天数。
*通过斯氏t检验(Student’st test)测定的与蔗糖媒介物治疗组相比P＜0.05。
实施例2
Akt KD诱导没有明显凋亡的细胞周期延迟
具有Akt KD的PC3肿瘤的分析显示与对照肿瘤相比增殖标记物Ki-67的轻微降低和TUNEL-阳性细胞的非明显增加(图2A)。在体外培养的PC3细胞中也观察到凋亡的缺少。10%FBS下，在表达各shAkt构建物的细胞中观察到G0/GI期的轻微增加和S期的降低。对于单独Akt1和两种或三种Akt亚型的任意组合，在表达shRNA的细胞中还观察到轻度增加的G2/M期细胞的积聚，其暗示这些细胞DNA复制和有丝分裂两者中的细胞周期延迟。然而，未观察到具有任意KD的明显亚-G1种群(图19，A和B)。另外的实验也未能在对PC3和U87MG细胞两者中Akt KD的响应中检测明显半胱天冬酶活化。为了在体内环境中部分地模仿亚适生长条件，发明人使培养物中血清的细胞受饿并查询所述细胞是否对Akt KD变得更加敏感。实际上，完全血清饥饿或减少血清至0.5%导致显著增加的G0/G1期细胞的积聚。然而，对于至少在0%FBS中2天和在0.5%FBS中5天，仍未观察到明显的亚-G1峰(图2，B和C)。
实施例3
AktKD促进PC3和U87MG细胞中的自噬
因为已显示Akt抑制自噬(Arico，S.，A.Petiot，C.Bauvy，P.F.Dubbelhuis，A.J.Meijer，P.Codogno，and E.Ogier-Denis，(2001)，The tumor suppressorPTEN positively regulates macroautophagy by inhibiting thephosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B pathway.J Biol Chem.276:35243-6.Epub2001Jul26;Degenhardt et al.，2006)，发明人查询内源性Akt的特异性KD能否促进自噬。实际上，EM分析显示在被诱导表达shAkt123的PC3和U87MG细胞两者中明显增加的AV的积聚(图3，A和B；和图19C)。AV和酸性囊泡细胞器(AVO)的积聚进一步由自体吞噬体标记物GFP-LC3的定位来确认，用抗-LC3抗体和荧光染料单丹酰戊二胺(monodansylcadaverine，MDC)及吖啶橙(AO;图4A，图19，D-G)染色。
发明人通过EM检查表达shAkt的异种移植物肿瘤。所述对照的靶向GFP的表达shRNA的PC3肿瘤由细胞-细胞接合所连接的健康样细胞组成(图3C，a)。相反，在表达shAkt123的肿瘤中的细胞在Dox处理10-15天后展现出退化的形态学征兆和细胞-细胞接触的丧失(图3C，b)。在退化的肿瘤细胞中发现对人类溶酶体相关的膜蛋白(LAMP)1阳性的晚AV(图3C，b-d)。而且，这些细胞经常含有彻底混乱的肿胀的线粒体和膨胀的RER，其暗示能量代谢、ER应激和自噬之间的联系。在退化的肿瘤细胞中很少观察到典型凋亡的染色质凝集和破碎特性；而一些含AV的细胞展现出轻微固缩，其是经历自噬退化细胞的特征(图3C，b和d)。
为了确定退化的形态学征兆前AV积聚是否出现在肿瘤细胞中，发明人检查具有5天或者3周AktKD的U87MG肿瘤。在表达shAkt123 5天的肿瘤中，大多数细胞表现出与媒介物治疗的对照类似的总体形态学，但百分比AV面积增加至大约两倍(从对照肿瘤中的0.78%至Dox治疗的肿瘤中的1.53%；P＜0.05；图3C，e-h)。Akt KD3周后，与治疗15天的PC3肿瘤类似，U87MG肿瘤在许多细胞中表现出退化的征兆(未发表的数据)。
实施例4
抗溶酶体药剂加速具有AktKD的PC3细胞中的细胞死亡
尽管有升高的自噬水平和轻微的细胞周期延迟，但是表达shAkt123的PC3细胞可在培养中在10%FBS下存活许多代，而没有可感知的细胞死亡增加。甚至在减少的血清(0.5%FBS)中，在延长的时期内仅有生存力的微小降低(未发表的数据)。虽然文献对早期自噬抑制对细胞生存的影响已有争论，但是文献一致显示在晚期阻断自噬在诱导自噬的条件下导致加速的细胞死亡(Kanzawa，T.，I.M.Germano，T.Komata，H.Ito，Y.Kondo，andS.Kondo，(2004)，Role of autophagy in temozolomide-induced cytotoxicity for malignantglioma cells.Cell Death Differ.11:448-57;Boya，P.，R.A.Gonzalez-Polo，N.Casares，J.L.Perfettini，P.Dessen，N.Larochette，D.Metivier，D.Meley，S.Souquere，T.Yoshimori，G.Pierron，P.Codogno，andG.Kroemer，(2005)，Inhibition of macroautophagy triggers apoptosis.Mol Cell Biol.25:1025-40;Gonzalez-Polo，R.A.，P.Boya，A.L.Pauleau，A.Jalil，N.Larochette，S.Souquere，E.L.Eskelinen，G.Pierron，P.Saftig，andG.Kroemer，(2005)，Theapoptosis/autophagy paradox:autophagic vacuolization before apoptotic death.JCell Sci.118:3091-102.Epub2005Jun28;Kroemer and Jaattela，2005;Yu，L.，F.Wan，S.Dutta，S.Welsh，Z.Liu，E.Freundt，E.H.Baehrecke，and M.Lenardo，(2006)，Autophagic programmed cell death by selective catalase degradation.Proc Natl Acad Sci U S A.103:4952-7)。因此，发明人研究阻断由Akt KD所引起的自噬的完成对细胞生存力的影响。在稳定表达GFP-LC3的PC3-shAktl23细胞中，Akt KD导致点状的GFP信号(图4A和图19E)，所述信号具有非脂质化前体形式的内源性LC3(LC3-I)的对应减少和脂质化自体吞噬体定位的LC3-II的轻度增加，其在自体溶酶体中迅速被翻转(图4B;Klionsky et al.，2008)。所述抗溶酶体药剂氯喹(CQ)，一种广泛用来抑制自体吞噬体向降解的自体溶酶体的成熟的弱碱性胺(Boya，P.，R.A.Gonzalez-Polo，N.Casares，J.L.Perfettini，P.Dessen，N.Larochette，D.Metivier，D.Meley，S.Souquere，T.Yoshimori，G.Pierron，P.Codogno，and G.Kroemer，(2005)，Inhibition of macroautophagy triggers apoptosis.Mol Cell Biol.25:1025-40;Kroemer and Jaattela，2005;Lum，J.J.，D.E.Bauer，M.Kong，M.H.Harris，C.Li，T.Lindsten，andC.B.Thompson，(2005)，Growth factor regulation of autophagyand cell survival in the absence of apoptosis.Cell.120:237-48)，引起核周区域小GFP-LC3簇的出现。在继续的LC3-I翻转存在下，CQ与AktKD的组合导致更强的GFP-LC3小点的积聚以及增大的LC3-II的积聚，其与自体溶酶体降解中的缺陷一致。还观察到类似的MDc+空泡积聚(图19F)。在0.5%FBS并且更尤其是0%FBS下用CQ处理的表达shAkt123的细胞中，这伴随着加速的细胞死亡(图4，C和D)。第二抗溶酶体药剂巴弗洛霉素A1(Ba)抑制空泡质子泵(VH+-ATP酶)并防止溶酶体区室的适当酸化作用(Yamamoto，A.，Y.Tagawa，T.Yoshimori，Y.Moriyama，R.Masaki，andY.Tashiro，(1998)，Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles byinhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cellline，H-4-II-E cells.Cell Struct Funct.23:33-42)，并且还与shAkt123组合促进细胞死亡。在用与Akt KD组合的CQ或者Ba处理的细胞中，观察到增加的膜联蛋白V-阳性种群和半胱天冬酶-3，7活性，其与这些细胞中多聚-ADP-核糖聚合酶(PARP)裂解的增加有关(图4B)。相反，用1mM3-MA(一种自体吞噬体生成的最早阶段的抑制剂)的预处理(起因于它的III类PI3K抑制)(Seglen，P.O.，andP.B.Gordon，(1982)，3-Methyladenine:specific inhibitor ofautophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes.Proc NatlAcad Sci U S A.79:1889-92;Petiot，A.，E.Ogier-Denis，E.F.Blommaart，A.J.Meijer，and P.Codogno，(2000)，Distinct classes of phosphatidylinositol3'-kinases are involved in signaling pathways that control macroautophagy inHT-29cells.J Biol Chem.275:992-8)遏制CQ或者Ba对shAkt表达细胞的促进细胞死亡的影响(图4，C和D)。这暗示，由抗溶酶体抑制剂引起的加速的细胞死亡依赖于反常AV的积聚。
实施例5
CQ与PI3K和Akt抑制剂组合加速细胞死亡
最近，报道抑制Akt活化的磷脂酰肌醇醚脂质类似物诱导具有辐射致敏作用的自噬(Fujiwara et al.，2007)。因为已知磷脂酰肌醇醚脂质类似物具有另外的细胞靶标(Gills et al.，2006;Memmott et al.，2008)，发明人查询PI3K-Akt的其它特异性抑制剂能否也诱导自噬并使细胞对晚期自噬抑制敏感。发明人首先使用双重PI3K/mTOR抑制剂，化合物III-5(PI-103)，其在纳摩尔浓度抑制I类PI3K和mTOR但对III类PI3K的效力弱＞1，000倍(Knight，Z.A.，B.Gonzalez，M.E.Feldman，E.R.Zunder，D.D.Goldenberg，O.Williams，R.Loewith，D.Stokoe，A.Balla，B.Toth，T.Balla，W.A.Weiss，R.L.Williams，and K.M.Shokat，(2006)，A pharmacological map of the PI3-K familydefines a role for p110alpha in insulin signaling.Cell.125:733-47)。与在抑制I类和III类PI3K两者上是等效的并抑制由后者活性所引起的自噬(Petiot et al.，2000;Knight et al.，2006)的广谱PI3K抑制剂渥曼青霉素或LY294002相比，III-5在诱导AV的积聚上是强有效的(图5，B和C)。与Akt KD类似，与CQ组合加速用III-5处理的细胞的死亡(图5A)。在明显细胞死亡的检测前观察到明显增加的LC3-II对LC3-I比和被MDC明亮染色的扩大空泡的出现(图5，B和C)。如用Akt KD所观察到的，用3-MA的预处理既减少LC3-II对-I比又减少MDC+空泡的积聚并放慢细胞死亡速率(图5，B和C)。相反，LAMP2的siRNA KD部分模仿了CQ的促进细胞死亡的作用，所述LAMP2是先前显示为自体吞噬体向自体溶酶体的成熟所必需的蛋白(图20，A和B);Gonzalez-Polo et al.，2005)。
用所报道的一种最具选择性的Akt抑制剂(双重Akt1，2抑制剂化合物II-4(Akti-1/2))也获得类似CQ的效果(Barnett et al.，2005)。单独用II-4处理有效地抑制Akt在Ser473和Thr308残基两者上的磷酸化并明显减少下游靶标S6的磷酸化，而不引起明显的细胞死亡(图6，A和B)。与CQ的共处理导致细胞生存力的迅速下降，并截止第10天观察到完全的细胞死亡。免疫印迹分析显示在II-4处理的24小时之内明显的LC3-II积聚，其因CQ共处理进一步增强(图6，B和C)。
为了遵循细胞死亡的动力学，发明人使用时差显微镜来使以CQ和II-4处理的活细胞成像(图7A)。单独的CQ处理引起细胞分化的轻微降低和核周区域暗颗粒的逐渐积聚。AO染色表明这些颗粒是其生成被3-MA所抑制的AVO(未发表的数据)。单独用II-4的处理导致接近完成的细胞分化抑制而无明显细胞死亡。这些细胞展现出具有最后充满胞质的AVO积聚的变平的形态学。用II-4和CQ两者处理的细胞显示出类似的AVO积聚，但在48小时之内观察到细胞皱缩和血浆膜破裂。在少数情况下，发现两个邻近的细胞形成膜接合，所述接合在血浆膜破裂前扩展成两个细胞间的完全融合(图7A，白色箭头)。
使用多谱段成像流式细胞仪观察到AVO积聚和细胞死亡之间的类似相关(图7，B和C)。单独用CQ或者II-4的处理诱导AVO积聚而无生存力的明显丧失，而两者的组合导致活细胞中AVO积聚的进一步增加和具有凝结的凋亡胞核的细胞的附随增加及作为坏死细胞特性的除核种群的出现。
实施例6
自噬抑制和降解缺陷的自体溶酶体积聚两者都有助于由CG与II-4组合诱导的加速的细胞死亡
为了研究自噬抑制本身与Akt抑制组合是否足以诱导加速的细胞死亡，发明人使用siRNA敲低Atg7，一种与自体吞噬体生成有关的基因(Ohsumi，Y.2001.Molecular dissection of autophagy:two ubiquitin-like systems.)。单独的Atg7的KD不能表现出对细胞死亡明显的影响，但当与Akti组合时截止到第3天诱导小的细胞生存力下降。然而，当与CQ和II-4两者组合时，Atg7KD导致在第2天细胞死亡的暂时延迟(图20，C和D)。与前面提到的3-MA的作用一起考虑，这些数据暗示自噬抑制和缺陷的AV积聚两者都有助于由CQ与Akt抑制组合诱导的加速的细胞死亡。
因为自噬是溶酶体区室的关键功能(Terman，A.，B.Gustafsson，and U.T.Brunk，(2006)，Thelysosomal-mitochondrial axis theory of postmitotic aging andcell death.Chem Biol Interact.163:29-37)，发明人通过免疫印迹检查溶酶体标记物LAMPI和组织蛋白酶D(主要的溶酶体天冬氨酸蛋白酶)(图6，B和C)。单独的化合物II-4诱导LAMP1水平的增加，其与升高的溶酶体活性一致。作为43-kD组织蛋白酶前体酶原(preprocathepsin)D来合成组织蛋白酶D，将所述组织蛋白酶前体酶原共翻译地裂解并糖基化，形成46-kD组织蛋白前体酶(procathepsin)D，其靶向溶酶体，得到中间体，所述中间体进一步裂解为成熟酶，所述成熟酶由15-kD轻链和28-kD重链组成。使用检测28-kD和前体形式组织蛋白酶D两者的抗体，在单独II-4处理后，首先检测到43-50kD的组织蛋白酶D早熟形式水平的增加，然后检测到成熟酶的28-kD重链的增加，其再一次表明增加的溶酶体活性。CQ靠消耗28-kD链而引起前体形式的积聚，其与组织蛋白酶D加工和成熟所必需的溶酶体半胱氨酸蛋白酶活性的抑制一致(Liaudet-Coopman，E.，M.Beaujouin，D.Derocq，M.Garcia，M.Glondu-Lassis，V.Laurent-Matha，C.Prebois，H.Rochefort，andF.Vignon，(2006)，组织蛋白酶D:newly discovered functions of a long-standing asparticprotease in cancer and apoptosis.Cancer Lett.237:167-79)。在用II-4和CQ两者处理的细胞中，前体形式的组织蛋白酶D积聚到甚至比单独任一个更高的水平，而成熟的28-kD链逐渐降低。化合物II-4处理还降低p62(活性在自体溶酶体中退化的另一种自噬活性标记物)的水平(Klionsky et al.，2008)，而CQ在具有和没有II-4处理的情况下都阻断p62降解(图22C)。总而言之，这些数据暗示Akt抑制引起增加的溶酶体酶的产生和成熟，而在最后的自体溶酶体区室中CQ共处理损害这些酶的成熟，其引起缺陷AVO的积聚。后者伴随有在2天之内增加的半胱天冬酶3向活性形式的裂解(图6B)及半胱天冬酶活性的对应增加和其底物PARP的裂解(未发表的数据)。pancaspase抑制剂zVAD.fmk在所有试验浓度都部分地拯救细胞死亡(图20E)。虽然zVAD.fmk还可以在更高的浓度抑制溶酶体半胱氨酸蛋白酶，但是已经报道后者介导半胱天冬酶非依赖性细胞死亡(Foghsgaard et al.，2001)。广谱半胱氨酸蛋白酶抑制剂zFA.fmk及N-乙酰基-Leu-Leu-Nle-CHO和更特异性的组织蛋白酶B抑制剂CA-074-Me都不能表现出由II-4和CQ诱导的细胞死亡的明显拯救。而所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂与Akti组合在10-50μM浓度增强细胞杀灭，虽然它们还单独在较高浓度表现出细胞毒性(图20，F-H)。这些结果暗示，由II-4和CQ诱导的细胞死亡至少部分是半胱天冬酶依赖性的，而溶酶体蛋白酶活性可能是在Akt抑制下细胞生存所必需的。
为了进一步查询损伤溶酶体的降解与Akt抑制组合能否加速细胞死亡，发明人使用siRNA敲低组织蛋白酶D。实际上，当与II-4组合时这明显增加了细胞死亡并当两者都与II-4组合时进一步增强了CQ的杀细胞作用(图20I)。类似地，天冬氨酸蛋白酶(包括组织蛋白酶D)的抑制剂——胃蛋白酶抑制剂A，与Akti-112一起也促进细胞死亡(图20J)。
实施例7
CQ加强Akti-诱导的线粒体过氧化物和细胞活性氧物质(ROS)积聚
越来越多的证据已经暗示在程序性细胞死亡的实行中溶酶体和线粒体之间的密切关系(Bursch，W.(2001)，The autophagosomal-lysosomalcompartment in programmed cell death.Cell Death Differ.8:569-81)。Theautophagosomal-lysosomal compartment in programmed cell death.Cell DeathDiffer.8:569-81;Terman，A.，T.Kurz，B.Gustafsson，and U.T.Brunk，(2006)，Lysosomal labilization.IUBMB Life.58:531-9)。因此，发明人研究Akt抑制和CQ对线粒体膜电位的影响。与在维持线粒体完整性中Akt的功能一致(Parcellier，A.，L.A.Tintignac，E.Zhuravleva，andB.A.Hemmings，(2007)，PKBand the mitochondria:AKTing on apoptosis.Cell Signal.0:0)，单独的Akti-112引起线粒体膜电位的降低，尽管大多数细胞中仍存在明显数量的极化线粒体。虽然单独的CQ不具有明显的作用，但是CQ和II-4的共处理在细胞生存力急剧下降之前引起线粒体电位的几乎完全丧失(图21，A和B)。
最近报道线粒体ROS与自噬诱导作用有关(Scherz-Shouval et al.，2007)。因为线粒体是过氧化物(O2 -)产生的主要胞内来源，发明人使用MitoSOX red分析O2 -产生，所述MitoSOXred是O2 -指示剂，其在氧化和后续与DNA结合后作为膜电位和荧光的函数积聚在线粒体中。单独的化合物II-4在6小时内增加MitoSOX荧光(图8，A和C;和未描述的)。大多数荧光展现出线粒体定位型式，其具有显示核荧光的细胞亚种群，与这些细胞中增加的线粒体通透性一致。虽然单独的CQ仅引起MitoSOX信号的轻微增加，但是与II-4组合导致荧光强度的明显增加，且大多数细胞展现出强的核染色型式。如使用通用ROS-敏感探针所测量，O2 -产生的增加随后是24小时内总体细胞ROS水平的增加(图8，B和C)。令人感兴趣的是，由II-4单独诱导的胞质ROS信号在48小时内衰减，而与CQ的共处理引起ROS水平延长的增加(图21D和未描述的)。这与以下见解一致：由Akt抑制引起的有限线粒体的去极化诱导暂时ROS信号，从而增加自噬，其大体上除去损坏的线粒体。由CQ引起的受损的细胞组分消化导致有害氧化产物(如蜡样质/脂褐素)的自体溶酶体聚集，其可以进一步放大ROS损害(Moore et aI.，2(06))，导致细胞死亡。3-MA预处理减少由II-4诱导的ROS水平(图21C)，其暗示III类PI3K依赖性类似于饥饿诱导的ROS产生(Scherz-Shouval et al.，2007)。在II-4和CQ存在下，使用通用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)的处理拯救了细胞生存力(图22，A和B)。除此之外，NAC减少Akti-诱导的LC3和GFP-LC3脂质化、p62降解和GFP-LC3点生成(图22，C和D)，其与ROS在自噬诱导中的必要作用一致(Scherz-Shouval et al.，2007)。
实施例8
CQ在体外Akti-处理的无PTEN细胞中选择性加速细胞死亡并在体内增强Akt KD的抗肿瘤功效
因为PC3细胞是无PTEN的，发明人使用等基因的PTEN+/+和PTEN-/-小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)探究PTEN状态能否影响细胞对单独的Akt抑制或与CQ组合的Akt抑制的敏感度。先前显示PTEN-/-MEF具有升高的Akt途径活性并比PTEN+t+MEF对mTOR抑制的抗增殖作用更加敏感(Sun et al.，1999)。如图9A所示，PTEN-/-MEF还比其PTEN+/+配对物对组合的CQ和II-4的杀细胞作用明显地更加敏感。这暗示PTEN-/-细胞对于Akt抑制后的生存可能更依赖于自噬降解，其提高了以下可能性：通过使用该策略选择性靶向恶性无PTEN肿瘤细胞，可以实现合理治疗指数。
为了查询在体内在Akt抑制后无PTEN肿瘤是否也依赖自噬降解，发明人研究CQ对表达shAkt123的PC3异种移植物肿瘤生存的影响。如图9B所示，单独CQ的腹膜内注射引起小的但是无关紧要的肿瘤生长速率减少。单独Akt KD导致明显的肿瘤生长抑制并伴有初始肿瘤停滞，但大多数肿瘤未能完全消退，并在2-3周内90%的肿瘤出现复发；未实现完全缓解。相反，研究自始至终，在40%用Dox和CQ处理的肿瘤中观察到完全消退并伴有另外20%的肿瘤维持停滞(图9，C和D)。以CQ的皮下瘤周注射获得类似的结果(未发表的数据)。在第5天采集的肿瘤样品的EM检查显示，在用单独的Dox或者CQ处理的肿瘤中AV面积轻微增加，而在用Dox和CQ两者处理的肿瘤中观察到引人注目的AV积聚，其显示＞50%消退。这些AV比在单独的Dox-或CQ-肿瘤中发现的那些更大并含有密集的未消化物质，但通常伴有单膜自体溶酶体出现并对人类LAMP1呈阳性染色，其与自体吞噬体-溶酶体融合后受损的降解一致。这与增加的展现出凋亡形态学的肿瘤胞核的数目以及具有缺乏免疫力的血浆膜完整性(compromised plasma membraneintegrity)和反常线粒体的含AV的细胞残骸一致(图10)。因此，CQ不仅在体外与Akt抑制组合加速细胞死亡而且在体内增加完全肿瘤缓解的发生率。
使用Dox-可诱导的shRNA手段，发明人既个别地又以所有可能的组合特异性地敲低各Akt亚型，以评价在肿瘤生长维持中它们的需要量。发明人的结果暗示，在无PTEN的PC3和U87MG细胞中，在维持肿瘤生长中Aktl是最重要的亚型，而Akt2和Akt3活性能部分补偿减少的Aktl活性。综合考虑Akt2抑制的潜在代谢副作用和能够为同时的Akt2抑制所抵消的与单独抑制Akt1相关的报道的侵袭力增加(Irie et al.，2005)，可能有必要同时抑制两种或所有三种Akt亚型以实现最大肿瘤抑制，但是以不同程度的失活来保存重要的亚型活性水平以减少副作用。
Akt一个最突出的功能是细胞生存。已经报道组成性活性Akt保护细胞使其在各种促凋亡刺激后免受程序性细胞死亡(Downward，1998)。然而，凋亡是否是对Akt抑制的主要响应是不太明确的，尤其是在由于各种基因改变经常遏制凋亡的癌细胞中。先前使用PI3K/Akt途径的小分子抑制剂的实验经常产生相矛盾的为非特异性作用所模糊的结果。发明人的数据表明，Akt的特异性KD可以引起细胞周期延迟而不促进明显的凋亡。这与最近的研究是一致的，仅总体Akt活性的小部分是为凋亡抑制所必需的(Liu et al.，2006)。相反，发明人发现自噬是对由特异性shRNA KD或者选择性途径抑制剂所引起的减少的Akt活性更敏感的响应。
若干机制可能有助于通过Akt抑制的自噬诱导作用。第一，抑制Akt可以导致mTORC1抑制。mTOR是已知的自噬抑制剂。令人感兴趣的是，组成性活性形式的Akt通过雷帕霉素遏制自噬的诱导作用(Takeuchi et al.，2005)，其提高了以下可能性：可以至少部分地通过经其对mTORC2的长期作用抑制Akt来介导雷帕霉素对自噬的作用(Sarbassov et al.，2006)。第二，Akt的其它信号输出，如FoxO蛋白(Zhao et al.，2008)或葡萄糖代谢，也可以有助于独立于mTOR的自噬调节。第三，发明人的数据表明Akt抑制诱导增加的线粒体过氧化物和可以活化自噬的细胞ROS信号。
当允许达到其限度时自噬活化可以导致最终的细胞死亡，或自噬活化可以通过最终的自噬细胞死亡或者转换到更迅速的死亡程序如凋亡，使细胞对另外诱导死亡的刺激物敏感。例如，Akt抑制可以通过加强的自噬响应增加辐射敏感度(Fujiwara et al.，2007)，而该蛋白酶介导的Atg5裂解可以将自噬转换成凋亡(Yousefi et al.，2006)。本文中发明人展示，在发明人研究的无PTEN癌细胞的细胞杀死中单独抑制Akt是无效的，但是可以通过阻断自体溶酶体降解来加速细胞死亡。虽然自噬可能是Akt抑制限制肿瘤生长的潜在机制，但是它还可以提供从Akt抑制所施加的代谢和氧化应激中的暂时缓解。在早期抑制自噬可以防止这种暂时保护作用，但是当允许经可选择的生存机制早期逃避时，也可抵消其肿瘤抑制效果。然而，在肿瘤细胞已经变得定型(committed)并依赖于自噬降解后，阻断溶酶体功能可避免这种抵消作用，同时通过有害氧化聚集物的积聚放大氧化损害和细胞毒作用(Seehafer and Pearce，2006)。实际上，发明人的数据暗示，在由Akt抑制诱导的升高的自噬活性存在下，相容的溶酶体降解能力对于细胞生存是重要的，这样使得用抗溶酶体药剂、组织蛋白酶DKD或溶酶体蛋白酶抑制剂抑制溶酶体功能与Akt抑制组合可促使细胞死亡。自噬、溶酶体变化和氧化应激已经与抗癌治疗方法延长的名单相联系，且抗溶酶体药剂已显示单独或与其它治疗剂组合的抗癌活性(Shoemaker and Dagher，1979;Ohta et al.，1998;Ostenfeld et al.，2005;Amaravadi et al.，2007;Carew，J.S.，S.T.Nawrocki，C.N.Kahue，H.Zhang，C.Yang，L.Chung，J.A.Houghton，P.Huang，F.J.Giles，and J.L.Cleveland，(2007)，Targetinga utophagy augments the anticancer activityof the histone deacetylase inhibitor SAHA to overcome Bcr-Abl-mediated drugresistance.Blood.110:313-22;Fujiwara et al.，2007;GrothPedersen et al.，2007)。本文中发明人第一次报道了由Akt/PI3K/mTOR抑制诱导的自噬还可以使用抗溶酶体药剂(如耐受良好的药物CQ)来充分利用，以促进无PTEN的人类肿瘤异种移植物的缓解。因为预期该作用与由给定治疗方法诱导的自噬程度呈正相关，这些药剂(如Akt途径抑制剂)与强力自噬诱导剂的创造性组合可以深深地影响其抗癌功效。
具体文献是美国临时申请61/103,198，将其全部内容并入本文作为参考。具体文献还有美国临时申请61/160,169，将其全部内容并入本文作为参考。现已充分描述本发明，本领域的普通技术人员应当理解，本发明可在条件、制剂和其它参数的宽广和相等范围内实施，而不影响本发明或其任何实施方案范围。本文将引用的所有专利、专利申请和出版物的全部内容并入作为参考。

Claims (61)

1.在哺乳动物中治疗新生物的方法，其包含，
以对治疗所述新生物有效的量给予(i)诱导自噬的激酶的抑制剂和(ii)自噬抑制剂的组合。
2.权利要求1的方法，其中所述诱导自噬的激酶的抑制剂和所述自噬抑制剂以协同有效量存在。
3.权利要求1的方法，其中所述自噬抑制剂是siRNA或反义RNA。
4.权利要求1的方法，其中所述自噬抑制剂抑制LAMP2、LAMP1或自噬(Atg)基因的表达或功能。
5.权利要求4的方法，其中所述Atg基因是Atg1、Atg4、Atg8、Atg5、Atg7或Atg12。
6.权利要求1的方法，其中所述自噬抑制剂是自噬的诱导期、隔离期、融合期或降解期的抑制剂。
7.权利要求6的方法，其中所述自噬抑制剂是自噬诱导期的抑制剂。
8.权利要求7的方法，其中所述自噬抑制剂是3-甲基腺嘌呤。
9.权利要求6的方法，其中所述自噬抑制剂是自噬的降解期或融合期的抑制剂。
10.权利要求9的方法，其中所述自噬降解期的抑制剂是抗溶酶体药剂。
11.权利要求10的方法，其中所述抗溶酶体药剂是抗寄生虫药物。
12.权利要求11的方法，其中所述抗寄生虫药物是氯喹、羟氯喹或苏拉明。
13.权利要求10的方法，其中所述抗溶酶体药剂是空泡质子-ATP酶抑制剂。
14.权利要求13的方法，其中所述空泡质子-ATP酶抑制剂是巴弗洛霉素A1。
15.权利要求10的方法，其中所述抗溶酶体药剂是作用于循环系统的药剂。
16.权利要求15的方法，其中所述药剂是胺碘酮或哌克昔林。
17.权利要求10的方法，其中所述抗溶酶体药剂是细胞毒素药剂。
18.权利要求17的方法，其中所述细胞毒素药剂是长春碱。
19.权利要求10的方法，其中所述抗溶酶体药剂是影响脂质代谢的药剂、抗生素或激素。
20.权利要求19的方法，其中所述激素是胰高血糖素或雌二醇。
21.权利要求20的方法，其中所述抗生素是莫能星。
22.权利要求10的方法，其中所述抗溶酶体药剂是氯化铵、cAMP或甲胺。
23.权利要求1的方法，其中所述诱导自噬的激酶的抑制剂选自Akt抑制剂、PI3K抑制剂、mTOR抑制剂、PDK1抑制剂和p70S6K抑制剂。
24.权利要求23的方法，其中所述诱导自噬的激酶的抑制剂是Akt激酶抑制剂或PI3K激酶抑制剂。
25.权利要求24的方法，其中所述诱导自噬的激酶的抑制剂是Akt激酶抑制剂。
26.权利要求24的方法，其中所述自噬抑制剂是自噬的降解期或融合期抑制剂。
27.权利要求26的方法，其中所述自噬的降解期或融合期抑制剂是抗溶酶体药剂。
28.权利要求25的方法，其中所述Akt激酶抑制剂是pan-Akt抑制剂。
29.权利要求25的方法，其中所述Akt激酶抑制剂是Akt-1选择性抑制剂、Akt-2选择性抑制剂或Akt-3选择性抑制剂。
30.权利要求25的方法，其中所述Akt激酶抑制剂是Akt-1的抑制剂和Akt-2的抑制剂。
31.权利要求25的方法，其中所述Akt激酶抑制剂是变构Akt抑制剂。
32.权利要求23的方法，其中所述Akt激酶抑制剂是式I化合物和其互变异构体、经拆分的对映异构体、经拆分的非对映异构体、溶剂化物及盐，所述式I化合物为：
对映异构体对映异构体其中：
R1是H、Me、Et和CF3；
R2是H或Me；
R5是H或Me；
A是：
Figure FDA0000371184400000031
G是任选地被一个至四个R9基团所取代的苯基或任选地被卤素所取代的5-6元杂芳基；
R6和R7独立地是H；OCH3；(C3-C6环烷基)-(CH2)；(C3-C6环烷基)-(CH2CH2)；V-(CH2)0-1，其中V是5-6元杂芳基；W-(CH2)1-2，其中W是任选地被F、Cl、Br、I、OMe、CF3或Me所取代的苯基；C3-C6-环烷基，所述C3-C6-环烷基任选地被C1-C3烷基或O(C1-C3烷基)取代；羟基-(C3-C6-环烷基)；氟代-(C3-C6-环烷基)；CH(CH3)CH(OH)苯基；任选地被F、OH、C1-C3烷基、环丙基甲基或C(=O)(C1-C3烷基)所取代的4-6元杂环基；或任选地被一个或多个基团所取代的C1-C6-烷基，所述基团独立地选自OH、氧代、O(C1-C6-烷基)、CN、F、NH2、NH(C1-C6-烷基)、N(C1-C6-烷基)2、环丙基、苯基、咪唑基、哌啶基、吡咯烷基、吗啉基、四氢呋喃基、氧杂环丁烷基或四氢吡喃基，
或者R6和R7与它们所连接的氮一起形成任选地被一个或多个基团所取代的4-7元杂环，所述基团独立地选自OH、卤素、氧代、CF3、CH2CF3、CH2CH2OH、O(C1-C3烷基)、C(=O)CH3、NH2、NHMe、N(Me)2、S(O)2CH3、环丙基甲基和C1-C3烷基；
Ra和Rb是H，
或者Ra是H，且Rb和R6与它们所连接的原子一起形成具有一个或两个环氮原子的5-6元杂环；
Rc和Rd是H或Me，
或者Rc和Rd与它们所连接的原子一起形成环丙基环；
R8是H、Me、F或OH，
或者R8和R6与它们所连接的原子一起形成具有一个或两个环氮原子的5-6元杂环；
各个R9独立地是卤素、C1-C6-烷基、C3-C6-环烷基、O-(C1-C6-烷基)、CF3、OCF3、S(C1-C6-烷基)、CN、OCH2-苯基、CH2O-苯基、NH2、NH-(C1-C6-烷基)、N-(C1-C6-烷基)2、哌啶基、吡咯烷基、CH2F、CHF2、OCH2F、OCHF2、OH、SO2(C1-C6-烷基)、C(O)NH2、C(O)NH(C1-C6-烷基)和C(O)N(C1-C6-烷基)2；
R10是H或Me；和
m、n和p独立地是0或1。
33.权利要求1的方法，其中所述新生物是肉瘤。
34.权利要求1的方法，其中所述新生物是癌瘤。
35.权利要求32的方法，其中所述新生物是鳞状细胞癌。
36.权利要求32的方法，其中所述新生物是腺瘤或腺癌。
37.权利要求1的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、睾丸癌、阴茎癌、生殖泌尿道癌、精原细胞瘤、食道癌、喉癌、胃部癌症、胃癌、胃肠道癌、皮肤癌、角化棘皮瘤、滤泡癌、黑色素瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、结肠癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳头状癌、膀胱癌、肝癌、胆道癌、肾癌、骨癌、髓样障碍、淋巴样障碍、毛细胞癌、口腔和咽(口部)癌、唇癌、舌癌、口癌、唾液腺癌、咽癌、小肠癌、结肠癌、直肠癌、肛门癌、肾脏癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、大肠癌、子宫内膜癌、子宫癌、脑癌、中枢神经系统癌、腹膜癌、肝细胞癌、头癌、颈癌、霍奇金病和白血病。
38.权利要求1的方法，其中所述Akt激酶抑制剂是式II化合物：
其中，
R1和R2独立地是氢、C1-5烷基、羟基、C1-5烷氧基或胺；
P是1-6的整数；
A是5-14个碳的环状、二环或三环的芳族或杂芳族的环，所述环可任选地被卤素、OH、氨基、二烷基氨基、单烷基氨基、C1-C6-烷基或苯基所取代，前述取代基任选地被卤素、OH、C1-C3烷基或环丙基甲基所取代，
B是具有下式的芳族的、杂芳族的、环状的或杂环状的环：
Figure FDA0000371184400000051
其中，Q、T、X和Y各自独立地选自-CH、CH2、N或O；
Z是-CH、CH2、N、O或-C=C-；
R6和R7独立地选自氢、卤素和羰基，或者R6和R7一起形成5-6元的芳族的、杂芳族的、环状的或杂环状的环，所述环可任选地被卤素、OH、氨基、二烷基氨基、单烷基氨基或C1-C6-烷基所取代，前述取代基任选地被卤素、OH、C1-C3烷基或环丙基甲基所取代。
39.权利要求1的方法，其中所述新生物不是糖酵解依赖性癌症。
40.权利要求1的方法，其中所述诱导自噬的激酶的抑制剂包含一种或多种降低一种或多种Akt蛋白表达的RNA干扰(RNAi)构建物。
41.权利要求40的方法，其中所述一种或多种Akt蛋白选自Akt1、Akt2、Akt3及其组合。
42.权利要求40的方法，其中所述RNAi构建物包含一种或多种基本上与Akt基因中的序列对应的DNA序列。
43.权利要求40的方法，其中所述RNAi构建物包含一种或多种基本上与选自SEQ ID No:1-18的序列对应的DNA序列。
44.权利要求40的方法，其中所述RNAi构建物包含有义RNA链和基本上互补的反义RNA链，其中所述反义链包含一种或多种基本上与选自SEQ ID No:20、22、24、26、28、30、32、34、36和38的序列对应的序列，其中所述有义链和反义链被退火为RNA双链体。
45.权利要求44的方法，其中所述有义链包含一种或多种基本上与选自SEQ ID No:19、21、23、25、27、29、31、33、35和37的序列对应的序列。
46.权利要求44的方法，其中所述一种或多种有义链和所述一种或多种反义链被退火为以下序列对：SEQ ID No:19:20、21:22、23:24、25:26、27:28、29:30、31:32、33:34、35:36和37:38及序列对的组合。
47.权利要求40的方法，其中所述RNAi构建物是siRNA或shRNA。
48.权利要求47的方法，其中所述siRNA或shRNA是从包含基本上与选自SEQ ID No:1-18的序列对应的核酸序列的RNAi构建物转录的。
49.减少一种或多种Akt蛋白表达的RNAi构建物。
50.权利要求49的RNAi构建物，其包含一种或多种基本上与一种或多种Akt基因中的序列对应的DNA序列。
51.权利要求50的RNAi构建物，其中所述一种或多种DNA序列选自SEQ ID No:39-48。
52.权利要求49的RNAi构建物，其包含一种或多种基本上与选自SEQID No:1-18的序列对应的DNA序列。
53.权利要求49的RNAi构建物，其中所述构建物是siRNA或shRNA。
54.权利要求53的RNAi构建物，其包含有义RNA链和基本上互补的反义RNA链，其中所述反义链包含一种或多种基本上与选自SEQ ID No:20、22、24、26、28、30、32、34、36和38的序列对应的序列，其中所述有义链和反义链被退火为RNA双链体。
55.权利要求54的RNAi构建物，其中所述有义链包含一种或多种基本上与选自SEQ ID No:19、21、23、25、27、29、31、33、35和37的序列对应的序列。
56.权利要求55的RNAi构建物，其中所述一种或多种有义链和所述一种或多种反义链被退火为以下序列对：SEQ ID No:19:20、21:22、23:24、25:26、27:28、29:30、31:32、33:34、35:36和37:38及序列对的组合。
57.权利要求56的RNAi构建物，其中所述有义链和所述反义链通过单链发夹结构共价连接。
58.权利要求49的RNAi构建物，其包含基本上与SEQ ID No:32对应的核苷酸序列和基本上与选自SEQ ID No:22、26和36的序列对应的序列。
59.权利要求49的RNAi构建物，其包含基本上与SEQ ID No:31对应的核苷酸序列和基本上与选自SEQ ID No:21、25和35的序列对应的序列。
60.能够降低一种或多种Akt蛋白的表达的RNAi构建物，其包含被转录成RNA序列的基本上与选自SEQ ID No:1-18的序列对应的DNA序列。
61.能够降低一种或多种Akt蛋白的表达的RNAi构建物，其包含基本上与选自SEQ ID No:19-38的序列及其组合对应的RNA序列。
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