KR20130132956A - 신생물의 치료를 위한 자식증 유도자 및 억제제 조합 요법 - Google Patents

신생물의 치료를 위한 자식증 유도자 및 억제제 조합 요법 Download PDF

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Abstract

본원에 개시된 소재는 제제 및 키나제 억제제이고, 또한 자식증의 유도자인 제제를 자식증의 억제제인 제제와 조합한 신생물의 치료 방법에 관한 것이다.
<대표도>
도 1a

Description

신생물의 치료를 위한 자식증 유도자 및 억제제 조합 요법{AUTOPHAGY INDUCER AND INHIBITOR COMBINATION THERAPY FOR THE TREATMENT OF NEOPLASMS}
발명의 분야
본원에 개시된 RNAi 구축물 및 조합 요법은 신생물(neoplasm)의 치료에 관한 것이다.
발명의 배경
클래스 I 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K)/Akt 경로의 이상 활성화는 다양한 암에서 널리 시사되었다. 이는 다양한 상류 성장 인자 및 그들의 수용체의 비정상적 활성의 결과로서 뿐만 아니라, 또한 PI3K 및 Akt 이소형의 직접 변경을 통한 것이며, 더 빈번하게는, PI3K의 활성을 무효화하는 인지질 포스파타제인 종양 억제인자 포스파타제 및 텐신 상동체 (PTEN)의 불활성화를 통한 것이다. 3개의 Akt 이소형은 매력적인 암 치료적 표적을 나타낸다 (문헌 [Samuels, Y., and K. Ericson, (2006), Oncogenic PI3K and its role in cancer. Curr Opin Oncol. 18:77-82]; [Stambolic, V., and J.R. Woodgett, (2006), Functional distinctions of protein kinase B/Akt isoforms defined by their influence on cell migration. Trends Cell Biol.]) 3개의 Akt 유전자의 마우스에서의 유전적 제거는 분명하며, 정상 생리학에서의 각각 이소형의 중복되는 기능 둘 다를 밝혔다 (문헌 [Chen, W.S., P.Z. Xu, K. Gottlob, M.L. Chen, K. Sokol, T. Shiyanova, I. Roninson, W. Weng, R. Suzuki, K. Tobe, T. Kadowaki, and N. Hay, (2001)], [Growth retardation and increased apoptosis in mice with homozygous disruption of the Akt1 gene. Genes Dev. 15:2203-8]; [Cho, H., J. Mu, J.K. Kim, J.L. Thorvaldsen, Q. Chu, E.B. Crenshaw, 3rd, K.H. Kaestner, M.S. Bartolomei, G.I. Shulman, and M.J. Birnbaum, (2001), Insulin resistance and a diabetes mellitus-like syndrome in mice lacking the protein kinase Akt2 (PKB beta). Science. 292:1728-31]; [Cho, H., J.L. Thorvaldsen, Q. Chu, F. Feng, and M.J. Birnbaum, (2001), Akt1/PKBalpha is required for normal growth but dispensable for maintenance of glucose homeostasis in mice. J Biol Chem. 276:38349-52. Epub 2001 Aug 31]; [Easton, R.M., H. Cho, K. Roovers, D.W. Shineman, M. Mizrahi, M.S. Forman, V.M. Lee, M. Szabolcs, R. de Jong, T. Oltersdorf, T. Ludwig, A. Efstratiadis, and M.J. Birnbaum, (2005), Role for Akt3/protein kinase Bgamma in attainment of normal brain size. Mol Cell Biol. 25:1869-78]; [Peng, X.D., P.Z. Xu, M.L. Chen, A. Hahn-Windgassen, J. Skeen, J. Jacobs, D. Sundararajan, W.S. Chen, S.E. Crawford, K.G. Coleman, and N. Hay, (2003), Dwarfism, impaired skin development, skeletal muscle atrophy, delayed bone development, and impeded adipogenesis in mice lacking Akt1 and Akt2. Genes Dev. 17:1352-65]; [Tschopp, O., Z.Z. Yang, D. Brodbeck, B.A. Dummler, M. Hemmings-Mieszczak, T. Watanabe, T. Michaelis, J. Frahm, and B.A. Hemmings, (2005), Essential role of protein kinase B gamma (PKB gamma/Akt3) in postnatal brain development but not in glucose homeostasis. Development. 132:2943-54. Epub 2005 Jun 1]; [Yang, Z.Z., O. Tschopp, N. Di-Poi, E. Bruder, A. Baudry, B. Dummler, W. Wahli, and B.A. Hemmings, (2005), Dosage-dependent effects of Akt1/protein kinase Balpha (PKBalpha) and Akt3/PKBgamma on thymus, skin, and cardiovascular and nervous system development in mice. Mol Cell Biol. 25:10407-18]) 및 종양 개시 (문헌 [Chen, M.L., P.Z. Xu, X.D. Peng, W.S. Chen, G. Guzman, X. Yang, A. Di Cristofano, P.P. Pandolfi, and N. Hay, (2006), The deficiency of Akt1 is sufficient to suppress tumor development in Pten+/- mice. Genes Dev. 20:1569-74]; [Ju, X., S. Katiyar, C. Wang, M. Liu, X. Jiao, S. Li, J. Zhou, J. Turner, M.P. Lisanti, R.G. Russell, S.C. Mueller, J. Ojeifo, W.S. Chen, N. Hay, and R.G. Pestell, (2007), Akt1 governs breast cancer progression in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104:7438-43]; [Maroulakou, I.G., W. Oemler, S.P. Naber, and P.N. Tsichlis, (2007), Akt1 ablation inhibits, whereas Akt2 ablation accelerates, the development of mammary adenocarcinomas in mouse mammary tumor virus (MMTV)-ErbB2/neu and MMTV-polyoma middle T transgenic mice. Cancer Res. 67:167-77]; [Skeen, J.E., P.T. Bhaskar, C.C. Chen, W.S. Chen, X.D. Peng, V. Nogueira, A. Hahn-Windgassen, H. Kiyokawa, and N. Hay, (2006), Akt deficiency impairs normal cell proliferation and suppresses oncogenesis in a p53-independent and mTORC1-dependent manner. Cancer Cell. 10:269-80]). 그러나, 인간 종양 성장을 유지하기 위한 3개의 Akt 이소형의 상대적 기여는 여전히 포착하기 어렵다.
인간 암은 대개 2개 또는 3개 모두의 Akt 이소형을 공동-발현하며, 각각 이소형의 증폭 또는 과다활성화는 상이한 유형의 암에서 기록되었다 (문헌 [Altomare, D.A., and J.R. Testa, (2005), Perturbations of the AKT signaling pathway in human cancer. Oncogene. 24:7455-64]; [Stahl, J.M., A. Sharma, M. Cheung, M. Zimmerman, J.Q. Cheng, M.W. Bosenberg, M. Kester, L. Sandirasegarane, and G.P. Robertson, (2004), Deregulated Akt3 activity promotes development of malignant malignant. Cancer Res. 64:7002-10]). 계속해서 나오는 증거는 Akt 이소형은 외부 자극 및 연구된 조직에 따라 구별되어 조절될 수 있다는 것을 제시하며, 세포에서 및 조직-특이적 방식으로 세포 절차의 분명한 측면을 조절할 수 있다 (문헌 [Dufour, G., M.J. Demers, D. Gagne, A.B. Dydensborg, I.C. Teller, V. Bouchard, I. Degongre, J.F. Beaulieu, J.Q. Cheng, N. Fujita, T. Tsuruo, K. Vallee, and P.H. Vachon, (2004), Human intestinal epithelial cell survival and anoikis. Differentiation state-distinct regulation and roles of protein kinase B/Akt isoforms. J Biol Chem. 279:44113-22. Epub 2004 Aug 6]; [Irie, H.Y., R.V. Pearline, D. Grueneberg, M. Hsia, P. Ravichandran, N. Kothari, S. Natesan, and J.S. Brugge, (2005), Distinct roles of Akt1 and Akt2 in regulating cell migration and epithelial-mesenchymal transition. J Cell Biol. 171:1023-34]; [Kim, D., S. Kim, H. Koh, S.O. Yoon, A.S. Chung, K.S. Cho, and J. Chung, (2001), Akt/PKB promotes cell invasion invasion via increased motility and metalloproteinase production. FASEB J. 15:1953-62]; [Samuels, Y., L.A. Diaz, Jr., O. Schmidt-Kittler, J.M. Cummins, L. Delong, I. Cheong, C. Rago, D.L. Huso, C. Lengauer, K.W. Kinzler, B. Vogelstein, and V.E. Velculescu. 2005. Mutant PIK3CA promotes cell growth and invasion of human cancer cell. Cancer Cell. 7:561-73]; [Tanno, S., S. Tanno, Y. Mitsuuchi, D.A. Altomare, G.H. Xiao, and J.R. Testa, (2001), AKT activation up-regulates insulin-like growth factor I receptor expression and promotes invasiveness of human pancreatic cancer cell. Cancer Res. 61:589-93]; [Yoeli-Lerner, M., G.K. Yiu, I. Rabinovitz, P. Erhardt, S. Jauliac, and A. Toker, (2005), Akt blocks breast cancer cell motility and invasion through the transcription factor NFAT. Mol Cell. 20:539-50]).
Akt는 그의 항-세포자멸성 활성에 대해 잘 알려져 있으며, 생존 키나제로서의 그의 묘사를 야기한다 (문헌 [Amaravadi, R., and C.B. Thompson, (2005), The survival kinases Akt and Pim as potential pharmacological targets. J Clin Invest. 115:2618-24]). 그러나, PI3K/Akt 경로의 성분을 억제함은 종종 추가의 프로-세포자멸성 손상 없이 실질적인 세포자멸을 유도하지 않는다. 이는 Akt의 인산화를 효율적으로 억제한 이중 PI3K/mTOR 억제제는 세포자멸의 유도 없이 신경아교종 이종이식편의 증식을 차단하였다는 것을 나타낸 최근의 연구에서 예시된다 (문헌 [Fan, Q.W., Z.A. Knight, D.D. Goldenberg, W. Yu, K.E. Mostov, D. Stokoe, K.M. Shokat, and W.A. Weiss, (2006), A dual PI3 kinase/mTOR inhibitor reveals emergent efficacy in glioma. Cancer Cell. 9:341-9]).
최근의 연구에서, 알킬화제를 클로로퀸과 조합하여 투여하였다 (WO 2006/078774). 키나제 억제제의 클로로퀸과의 조합에 대한 결과는 제시되지 않았다.
발명의 간단한 요약
본원에 개시된 주제 물질은 키나제 억제제이며, 또한 자식증(autophagy)의 억제제인 제제를 자식증의 유도자인 제제와 조합한 신생물의 치료 방법 및 그러한 제제들에 관한 것이다.
도면의 설명
도 1은 Akt 이소형의 유발가능 (넉다운(knockdown)) KD 및 이종이식편 종양 성장에 대한 그들의 효과를 나타낸다. (a) 유발가능 shRNA 구축물을 발현하는 안정한 PC3 클론에서의 Akt 이소형 및 다양한 하류 단백질의 면역블롯 분석. 각각 클론을 10% FBS하에 7일 동안 성장된 1 μg/ml Dox를 갖는 각각의 shRNA(들)을 발현하도록 유도하였다. 이중 화살촉은 총 및 포스포-Akt 항체에 의해 검출된 3개의 Akt 이소형의 이동성에서의 약간의 차이, 및 IRS1의 이동성 변위를 나타낸다. 도 1b는 이종이식편 종양 성장에 대한 Akt KD의 효과를 나타낸다. 비히클 대조군 (-Dox, 검은색 원) 또는 Dox (+Dox, 흰색 원)로 처리된 다양한 shRNA를 함유하는 PC3 이종이식편 종양의 성장을 나타내는 대표적인 실험 (표 3의 세부사항을 참조함). 오차 막대는 SEM을 나타낸다. *, P < 0.05; **, P < 0.005.
도 2는 Akt KD가 실질적인 세포자멸 없이 세포 주기 지연 및 상승된 자식증을 야기하였다는 것을 나타낸다. (a) 나타낸 바와 같이 5, 15, 또는 21일 동안의 Dox 또는 비히클 대조군으로 처리된 PC3-shAkt123 종양의 조직학적 분석. 종양 조직을 Ki-67에 대해 특이적인 항체를 사용한 IHC에 의해 또는 TUNEL 검정에 의해 분석하였다. 각각 샘플에 대한 신호 강도의 병리학자의 점수는 괄호 내에 나타낸다. 막대, 100 μm. (b 및 c) 10% FBS하에 성장된 세포와 비교한 혈청 기아 (ss)하의 세포 주기 진행에 대한 삼중-Akt KD의 효과. EGFP 또는 모든 3개의 Akt 이소형을 표적화하는 shRNA를 함유하는 세포를 2일 동안 Dox가 있거나 또는 없이 10% FBS를 함유하는, 그리고 0% (b) 또는 0.5% (c) FBS로 변화된 배지에서 예비처리하였다. 세포 주기 프로파일을 혈청 회수 후의 나타낸 시점에서 분석하였다. 오차 막대는 SEM (n=3)을 나타낸다. 각각 Dox로 처리된 세포 주기 기(phase) 대 Dox로 처리되지 않은 세포 주기 기에서의 변화의 퍼센트를 또한 나타낸다.
도 3은 Akt KD에 의해 PC3 및 U87MG 세포에서 유도된 자식증을 나타낸다. (a) Dox-유도된 Akt 123 KD의 부재 (a 및 f) 또는 존재 (b-e 및 g)하에 5일 동안 성장된 PC3 (ad) 및 U87MG (e-g) 세포의 EM 영상. 화살표, 분해적 자가용해소체. 이중 화살표, 초기 AV. 화살촉, 이중막(phagophore) 단리 막. M, AV에서의 미토콘드리아. 별표, 글리코겐 입자 군집. 막대: (a, b, f, 및 g) 0.5 μm: (c 및 d) 200 nm; (e) 1 μm. (b) 4.5 μm2 (n ≥ 64)의 단위 세포질 부위 당 AV의 수의 정량화 및 Dox-유도된 shAkt 123 발현의 존재 및 부재하의 PC3 및 U87MG 세포의 무작위로 샘플링된 세포질 부위 (n = 5 >200 μm2의 부위)에서의 AV에 의해 차지된 세포질 부위의 퍼센트. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. (e) Dox-유도된 Akt 침묵화는 PC3 및 U87MG 종양의 퇴행을 야기하였다. (c) (a) Dox 처리 15일 후 대조군 EGFP shRNA를 발현하는 PC3 종양. 종양 세포는 큰 핵 및 핵소체, 일부 지질 액적 (별표)을 함유하며, 세포 이음부에 의해 연결되었다 (화살촉). (b-d) Dox 처리 15일 (b 및 c) 또는 10일 (d) 후 shAkt 123을 발현하는 PC3 종양. (b) 이들 종양에서의 세포 및 핵은 종종 줄어든 것으로 나타난다. 화살표, AV. E, 호산구. (c) 퇴행하는 종양 세포에서의 확장된 RER 시스터네 중 2개의 AV (화살표)를 발견하였다. (d) 인간 LAMP1의 면역금 표지로의 극박의 냉각부분. 표지는 용해소체 (화살표) 및 AV (상부 삽도) 상에 발생한다. 종양 세포의 일부는 또한 미세자식증을 연상시키는 모양의 인간 LAMP1-양성 치밀 소체를 함유한다 (하부 삽도; 문헌 [de Waal, E.J., H. Vreeling-Sindelarova, J.P. Schellens, J.M. Houtkooper, and J. James, (1986), Quantitative changes in the lysosomal vacuolar system of rat hepatocytes during short-term starvation. A morphometric analysis with special reference to macro- and microautophagy. Cell Tissue Res. 243:641-8]). 종양 세포는 작은 세포질 섬(island)(화살촉)을 함유하는 넓힌 핵막 및 ER 시스턴 (별표)을 갖는다. (e) 비히클 처리 5일 후의 U87MG 종양. (f-h) Dox 처리 5일 후의 U87MG-shAkt 123 종양. 화살표, AV. (h) 일부 종양 샘플에서, 글리코겐 군집 (별표) 및 글리코겐-함유 AV를 갖는 세포가 발생한다. 막대: (a-c) 2 μm: (e 및 f) 1 μm: (g) 0.5 μm: (d 및 h) 200 nm.
도 4는 Akt KD와 조합된 라이소좀자극제로 가속화된 세포 사멸을 나타낸다. (a) CQ 처리는 Dox-처리된 PC3-shAkt 123 세포에서의 GFP-LC3 점의 축적을 야기하였다. GFP-LC3을 안정하게 발현하는 PC3-shAkt 123 세포를 1 μg/ml Dox로 또는 1 μg/ml Dox 없이 6일 동안 예비처리하고, 10 μM CQ로 또는 10 μM CQ 없이 처리하였다. GFP 형광을 CQ 처리 1일 후 영상화하였다. 화살촉은 대표적인 GFP 점 또는 무리를 나타낸다. 막대, 10 μm. (b) Dox 또는 CQ로 처리되거나 또는 처리되지 않은 PC3-shAkt 123 세포에서의 LC3 프로세싱, PARP 절단, 및 총 Akt에 대한 shAkt123 및 10 μM CQ의 효과. LC3-11 대 LC3-1 및 절단된 (Cl) 대 전장 (FL) PARP의 비율을 CQ 처리 1일차 및 2일차에 만들어진 세포 용해물의 면역블롯으로부터 정량화하였다. 2일차 샘플의 면역블롯을 나타낸다. 분자량을 킬로달톤으로 괄호로 각각 단백질 옆에 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다. (c) PC3 세포에서의 CQ 촉진된 세포 사멸은 shAkt123을 발현하도록 유도된 반면, 3-MA 예비처리는 이 효과를 지연시켰다. PC3-shAkt123 세포를 1 μg/ml Dox와 3일 동안 예비인큐베이션시켜 shRNA 발현을 유도하였고, 그 후 세포를 Dox가 있거나 또는 없이 10 μM CQ 또는 2.5 nM Ba를 함유하는 신선한 배지 내에 시딩하였다. 예비처리 중 및 그 후 둘 다에서 Dox와 함께 1 mM 3-MA를 첨가하였다. 세포 생존율을 2, 3, 및 4일차에서 0.5% (e) 또는 0% (d) FBS하에 결정하였다 (0% FBS하에 Ba 단독으로 처리된 세포를 2일 및 3일 동안만 관찰하였음). 아넥신 V-양성 PI-음성 집단의 퍼센트를 0.5% FBS하에 2, 3, 및 4일차에서 결정하였다. 카스파제-3/7 활성을 2일차 및 3일차에서 0% FBS하에 결정하고, 동일한 수의 세포로 정규화된 상대적 형광 단위로서 발현시켰다 (RFU, 천단위). 오차 막대는 3개의 독립적인 실험의 SD를 나타낸다.
도 5는 III-5와 조합된 CQ 가속화된 세포 사멸을 나타낸다. (a) PC3 세포를 DMSO 또는 0.5 μM III-5로 10 μM CQ의 존재 또는 부재하에 0.5% FBS하에 처리하였다. 세포 생존율을 PI 배제에 의해 2일차, 3일차, 및 5일차에서 결정하였다. 아넥신 V 염색을 2일차 및 3일차에서 분석하고, PI+ 또는 PI-집단으로 나누었다. (b) 10 μM CQ 또는 3 mM 3-MA의 존재 또는 부재하에 0.5 (III-5-0.5) 또는 20 μM (III-5-20) III-5로 처리된 PC3 세포에서의 세포 생존율의 시간 경과. PC3 세포를 III-5로 24시간 동안 1% FBS하에 예비처리하고, 0.5% FBS를 함유하는 배지 내에 CQ의 존재 또는 부재하에 나누었다. 3-MA를 III-5 바로 전에, CQ 첨가 24시간 전에 첨가하였다. 세포 생존율을 PI 배제에 의해 CQ 첨가 후 나타낸 시점에서 결정하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다 (n = 3). LC3-11 대 LC3-1 비율을 면역블롯의 정량화로부터 결정하였다. (c) CQ는 III-5로 처리된 PC3 세포에서의 MDC+ 공포(vacuole)의 크기 및 수를 극적으로 증가시킨 반면, 3-MA는 이 효과를 억제하였다. 세포를 0.5% FBS를 함유하는 배지에서 배양하고, DMSO, 0.5 μM III-5, 10 μM CQ, 및 5 mM 3-MA로, 단독으로 또는 나타낸 바와 같이 조합으로 처리하였다. 48시간에서의 MDC 염색을 나타낸다. 막대, 10 μm.
도 6은 II-4와 조합된 CQ 가속화된 세포 사멸을 나타낸다. (a) PC3 세포를 DMSO 또는 4 μM II-4로 0.5% FBS하에 10 μM CQ의 존재 또는 부재하에 처리하였다. 세포 생존율을 PI 배제에 의해 10일의 기간에 걸쳐 결정하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 3개의 독립적인 실험 중 하나로부터의 대표적인 데이터를 나타낸다. (b) a에 나타낸 실험으로부터의 나타낸 시점에서 수집된 세포 용해물의 면역블롯 분석. 화살촉은 LC3-1 및 -II, CathD 43, 및 CathD 28에 대한 위치를 나타낸다. 나타낸 마커의 정량화는 c에 나타낸다. CathD 43은 카텝신 D 전구체의 43-50-kD 형태이다. CathD 28은 28-kD 카텝신 D 중쇄이다.
도 7은 AVO의 축적이 원형질 파열에 앞섰으며, 이는 Akt 억제제("Akti") 및 CQ 처리로의 세포자멸성 및 제핵성 세포의 모습과 연관되었다는 것을 나타내며, 이 예에서는 상기 Akt 억제제는 화합물 II-4이었다. (a) DMSO, 10 μM II-4, 10 μM CQ, 또는 이들 모두로 5% FBS하에 처리된 PC3 세포를 저속-촬영 현미경검사를 사용하여 3일 동안 지켜보았다. 나타낸 시점에서의 세포의 대표적인 영상을 나타낸다. 흰색 화살촉은 제제 모두로 처리된 세포에서 원형질 파열 전의 2개의 인접한 세포 사이의 융합을 나타낸다. 막대, 10 μm. (b) 나타낸 제제로 처리된 PC3 세포를 AO로 염색하고, 다스펙트럼 영상화 흐름 세포측정에 의해 분석하였다. (좌측) 각각 처리로의 3개의 대표적인 세포의 명시야 (BF), 핵 (그린), 공포 (레드), 및 그린/레드 복합 영상을 나타낸다. 막대, 10 μm. (중간) AO 그린 강도 대 AO 그린 밝은 세부 부위를 그래프로 그림은 3개의 분명한 집단을 밝혔다: R2 제핵성 세포, R3 세포자멸성 세포, 및 R4 살아있는 세포. (우측) R4에 대한 AO 레드 강도를 가장 밝은 AO 레드 강도를 갖는 사건을 포함하기 위해 작성된 임의의 게이트 (R5)를 갖는 히스토그램 상에 그래프로 그렸다. R2, R3, 및 R4 히스토그램을 Akti (II-4) + CQ 그래프에서만 덮어씌웠다. (c) 각각 집단에 대한 통계는 B에 나타낸다. *, 총 단일 세포의 퍼센트; **, R4 살아있는 세포의 평균 형광 강도; ***, R4 살아있는 세포의 퍼센트.
도 8은 Akt 억제가 미토콘드리아 초과산화물 및 세포 ROS 생성을 유도하며 이는 CQ에 의해 증가된는 것을 나타낸다. (a) 0.5% FBS 중에 배양된 PC3 세포를 DMSO, 3 μM II-4, 10 μM CQ, 또는 이들 모두로 처리하고, 미토삭스 레드 염료로 염색하고, 형광 현미경검사에 의해 검사하였다. 24시간에서의 영상을 나타낸다. 막대, 10 μm. (b) a에서와 같이 처리된 PC3 세포를 이미지-아이티(Image-iT) LIVE 그린 ROS 검출 키트로 염색하고, 24시간에서 형광 현미경검사에 의해 검사하였다. 세포의 밝은 시야 (BF) 영상을 또한 나타낸다. 막대, 10 μm. (c) 미토삭스 레드 및 ROS 그린 형광 강도를 24시간에서 흐름 세포측정에 의해 정량화하였다. 세포를 a 및 b에서와 같이 처리하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다 (n = 3).
도 9는 CQ가 시험관내에서 Akti-처리된 무(null)-PTEN 세포에서 세포 사멸을 선택적으로 가속화시켰으며, 생체내에서 Akt KD의 항종양 효능을 증대시킨 것을 나타낸다. (a) PTEN-/- (-/-) MEF는 동종 PTEN+/+ (+/+) 대응체보다 II-4 및 CQ로의 조합된 처리에 대해 더 민감성이었다. MEF를 각각 5 μM의 II-4 및 CQ로 1% FBS하에 처리하고, 세포 생존율을 PI 배제에 의해 0일차, 2일차, 및 3일차에서 결정하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다 (n = 3). (b) 28일의 기간에 걸쳐 비히클 (Veh), Dox 단독, CQ 단독, 또는 Dox 및 CQ 둘 다로 매일 처리된 PC3 이종이식편 종양의 평균 종양 부피. 비히클 및 비히클 + CQ 군을 종료 전에 종양 크기로부터의 체중 손실 때문에 18일 이하 동안 지켜보았다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다 (n = 각각 코호트에서의 10 종양). (c) 28일차에서의 Dox 단독 및 Dox + CQ 군에서의 종양 부피의 산포도 (P = 0.05). 수평 막대는 평균 종양 부피를 나타낸다. 완전히 완화된 종양의 수 (CR, 파선)를 각각 군에 대해 나타낸다. (d) 종양 부피 변화의 퍼센트로서 그래프로 그린 개별 종양 성장과 a에 나타낸 Dox 단독 및 Dox + CQ 코호트에 대한 0일차와의 비교. 파선은 출발 종양 부피로부터의 -100% 변화, 즉 완전한 종양 퇴행을 나타낸다. 28일차에서의 출발 종양 부피보다 더 작은 (≪0% 변화) 또는 더 큰 (>0% 변화) 종양의 수를 나타낸다.
도 10은 조합된 Aktl23 KD 및 CQ 처리로의 PC3 종양에서의 증가된 AV 축적 및 세포자멸을 나타낸다. (a) (a) CQ만으로 5일 동안 처리된 PC3-shAkt123 종양의 EM 영상. 화살표, 치밀 AV 및 용해소체; N, 핵소체. (b) Dox 단독. 화살표, a에서보다 덜 치밀한 모습을 갖는 AV. (c 및 d) Dox 및 CQ 둘 다. (c) 많은 치밀한 AV 및 확대된 AV (화살표)는 종양 세포에 축적된다. 세포자멸성 세포 (Ap)는 대식세포 (M)에 의해 부분적으로 둘러싸인다. T, 종양 세포. (d) AV-로딩된 (화살표) 종양 세포 사이에서의 세포자멸성 핵 (Ap). 삽도, 각 종양에서의 AV (a-c) 및 비정상적 미토콘드리아 (*)의 확대된 영상. 막대: (a-c) 2 μm: (d) 1 μm. (b) 무작위로 샘플링된 세포질 부위에서의 AV에 의해 차지된 세포질 부위의 퍼센트의 정량화 (n = 6 >80 μm2의 부위). (c) 무작위로 샘플링된 종양 세포 핵 사이에서의 세포자멸성 핵의 퍼센트 (n = 100개의 종양 세포 핵의 3-4 세트). (b 및 c) 오차 막대는 SEM을 나타낸다; *, P < 0.0005 다른 3개의 군과 비교함.
도 11은 shRNA에 의한 Akt 넉다운이 자식증 유전자 발현을 유도한다는 것을 나타낸다. PC3 세포를 72시간 동안 독시사이클린에 의해 shRNA를 나타낸 Akt 이소형으로 발현하도록 유도하였고, RNA를 Dox 처리되거나 (Dox+) 또는 처리되지 않은 대조군 (Dox-) 세포 둘 다로부터 추출하였다. 마이크로어레이 분석을 아피메트릭스(아피메트릭스) 칩을 사용하여 수행하였다. Dox+ 및 Dox- 샘플로부터의 각각 자식증 유전자의 발현 수준의 비율을 나타낸다. 데이터는 3개의 독립적인 실험으로부터의 평균 값이다.
도 12는 자식증 유전자 발현을 유도하는 Akt 억제제를 나타낸다. PC3 세포를 DMSO 비히클 대조군 또는 1-(1-(4-(5-히드록시-6-메틸-3-페닐피라진-2-일)벤질)피페리딘-4-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2(3H)-온 (II-1), 1-(1-(4-(6-히드록시-5-이소부틸-3-페닐피라진-2-일)벤질)피페리딘-4-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2(3H)-온 (II-2), 1-(1-(4-(7-페닐-1H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-6-일)벤질)피페리딘-4-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2(3H)-온 (II-4), (S)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온 (III-4), 및 (S)-1-(3-(N-(4-(3-페닐이속사졸-5-일)티아졸-2-일)티오펜-2-카르복스아미도)프로필)피페리딘-2-카르복스아미도 (IV-1)를 포함하는 다양한 Akt 억제제로 1 또는 5 □M에서 6시간 또는 24시간 동안 처리하였다. RNA를 세포로부터 추출하였다. 마이크로어레이 분석을 아피메트릭스 칩을 사용하여 수행하였다. 각각 자식증 유전자의 발현 수준을 DMSO 대조군에 대해 정규화시켰다. 데이터는 3개의 독립적인 실험으로부터의 평균 값이다.
도 13은 다양한 mTOR, PI3K 및 Akt 억제제가 단독으로 흐름 세포측정기에서의 측방 산란 (SSC)에 의해 측정된 바와 같이 증가된 자가탐식 공포 축적을 유도한다는 것을 나타낸다. 억제제는 3-페닐-2-(4-((4-(5-(피리딘-2-일)-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-일)메틸)페닐)-1,6-나프티리딘-5(6H)-온 (II-3), 벤질 2-(4-(3-에틸우레이도)페닐)-4-(1,4-옥사제핀-4-일)-5H-피롤로[3,4-d]피리미딘-6(7H)-카르복실레이트 (III-1); 1-에틸-3-(4-(4-모르폴리노-7-(피리미딘-2-일)-5,6,7,8-테트라히드로피리도[3,4-d]피리미딘-2-일)페닐)우레아 (III-2), (R)-1-(4-((2-(2-아미노피리미딘-5-일)-7-메틸-4-모르폴리노티에노[3,2-d]피리미딘-6-일)메틸)피페라진-1-일)-2-히드록시프로판-1-온 (III-3), 4-(2-(1H-인다졸-4-일)-6-((4-(메틸술포닐)피페라진-1-일)메틸)티에노[3,2-d]피리미딘-4-일)모르폴린 (III-6), (S)-N-(4-(벤조[d][1,3]디옥솔-5-일)티아졸-2-일)-N-(3-(2-포르밀피페리딘-1-일)프로필)티오펜-2-카르복스아미도 (IV-2) 및 라파마이신을 포함한다.
도 14는 CQ (10 μM)가 다양한 mTOR, PI3K, 및 Akt 억제제와 조합된 경우 자가탐식 공포의 수 및 크기를 증가시킨다는 것을 나타낸다.
도 15는 다양한 mTOR, PI3K 및 Akt 억제제가 단독으로 아크리딘 오렌지 염색 후 레드 대 그린 형광 비율에 의해 측정된 바와 같이 증가된 자가탐식 공포 축적을 유도한다는 것을 나타낸다.
도 16은 CQ가 자가탐식 공포의 축적을 다양한 mTOR, PI3K 및 Akt 억제제와 조합된 경우 아크리딘 오렌지 염색 후 레드 대 그린 형광 비율에 의해 측정된 바와 같이 증가시킨다는 것을 나타낸다.
도 17은 Akt 억제제 III-4 및 PI3K 억제제 III-6이 둘 다 CQ와 상승작용하여 세포 사멸을 가속시킨다는 것을 나타낸다.
도 18은 암 세포주에서의 Akt 이소형의 상대적 수준 및 U87MG 세포 및 이종이식편 종양에서의 Akt 이소형의 유발가능 넉다운을 나타낸다. (a) 종양 세포주에서의 각각 Akt 이소형의 상대적 발현 수준. 각각 세포주로부터의 총 세포 용해물에서의 Akt 단백질을 웨스턴 블롯 분석에 의해 이소형-특이적 항체를 사용하여 분석하고, 기준으로서 동일한 겔 상에 로딩된 각각 이소형의 재조합 단백질을 사용하여 정량화하였다. 데이터는 2개의 독립적인 실험의 대표적인 데이터이다. (b) 유발가능 shRNA 구축물을 발현하는 U87MG 세포에서의 Akt KD의 웨스턴 블롯 확인. 각각의 Akt 이소형을 표적화하는 나타낸 구축물을 함유하는 U87MG 세포의 안정한 풀(pool)을 3일 동안 1 mg/ml Dox로 shRNA를 발현하도록 유도하였다. 총 세포 용해물을 나타낸 항체를 사용하여 분석하였다. GAPDH 수준을 로딩 대조군으로서 결정하였다. 분자량은 각각 단백질 옆에 괄호에 kDa로 나타낸다. (c-f) 나타낸 shRNA를 함유하는 U87 MG 이종이식편 종양을 비히클 대조군 또는 Dox로 처리하였다. 각각 코호트는 10개의 마우스로 이루어졌다. (g) Dox는 야생형 PC3 세포의 성장에 대해 효과가 없다. (h) 제2 shAkt1 구축물에 의해 유도된 PC3 종양 성장 지연. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. *P < 0.05; **p < 0.005.
도 19는 세포 주기 진행, 세포자멸 및 자식증에 대한 shGFP 및 Akt 이소형 KD의 효과를 나타낸다. (a) Dox 처리(96시간 동안 1 μg/ml)를 하거나 또는 하지않은 나타낸 shRNA를 함유하는 PC3 안정한 클론의 항정-상태(steady-state) 세포 주기 프로파일. 오차 막대는 2개의 독립적인 실험의 표준 편차를 나타낸다. (b) Dox 처리하지 않은 동일한 클론에 비교하여 Dox 처리한 각각 기에서의 변화의 퍼센트로서 표현된 (a)에서의 세포 주기 프로파일. 데이터는 각각 조건에 대해 분석된 0.5 x 106개 이상의 세포를 갖는 2개 이상의 독립적인 실험의 대표적인 데이터이다. (c) Dox-유도된 shGFP 발현이 있거나 또는 없는 AV 수에서의 유의한 차이를 나타내지 않는 PC3 및 U87MG 세포의 4.5 μm2 (n = 130)의 단위 세포질 부위 당 AV의 수의 EM 정량화. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. (d) 처리되지 않은 대조군과 비교한 Dox-유도된 shAktl23 발현 5일 후의 PC3 및 U87MG 세포에서의 증가된 점 LC3 면역형광 염색. 막대, 10 μn. (e) 나타낸 처리하에서 GFP-LC3 점을 갖는 PC3-shAktl23 세포의 퍼센트. GFP-LC3을 안정하게 발현하는 PC3-shAktl23 세포를 도 4에서와 같이 예비처리하고, >5 점(punctate) GFP 가시적 점(dot)을 갖는 세포의 퍼센트를 결정하였다. 비록 CQ 처리 단독으로 세포에서의 핵주위 GFP-LC3 무리를 야기하였지만, 이들은 Dox 처리된 세포에서의 광범위한 세포질 GFP-LC3 점과 형태학적으로 상이하다는 것을 주목한다. 오차 막대는 각각 15개 이상의 세포의 2개의 무작위 영역으로부터의 표준 편차를 나타낸다. (f) CQ 처리는 shAktl23을 발현하는 Dox-처리된 PC3 세포에서의 MDC-표지된 공포의 축적을 야기한다. PC3-shAkt123 세포를 1 μg/ml Dox의 존재 또는 부재하에, 10 μM CQ의 존재 또는 부재하에, 5일 동안 인큐베이션하고, 그 후 MDC로 표지하였다. 축척 막대: 10 μm. (g) 1 μg/ml Dox, 10 μM CQ 또는 이들 둘 다로 처리된 아크리딘 오렌지-염색된 PC3-shAktl23 세포의 흐름 세포측정 분석. FL1-H는 핵의 그린 형광의 강도를 나타낸다. FL3-H는 AVO의 레드 형광의 강도를 나타낸다. 높은 FL3-H/FLl-H 비율을 갖는 세포의 퍼센트, 높은 수준의 AVO를 갖는 세포 (문헌 [Paglin et al., 2001])의 특징을 히스토그램 상에 나타낸다. 나타낸 데이터는 3개의 독립적인 실험에 대해 대표적인 데이터이다.
도 20. PC3 세포 생존율에 대한 PI-103 또는 Akti-1/2와 조합된 LAMP2, Atg7, 프로테아제 억제제, 카텝신 D siRNA 및 펩스타틴 A의 효과. (a) 비-표적화 대조군 올리고 (siCtrl)와 비교한 siRNA 올리고 a-d 및 그들의 풀에 의한 LAMP2의 KD를 나타내는 면역블롯. (b) PC3 세포 생존율에 대한 LAMP2 siRNA 올리고의 효과. PC3 세포를 80 nM의 siRNA로 0.5% FBS하에 형질감염시키고, PI-103 (0.5 μM) 또는 DMSO를 형질감염-2일 후 첨가하고, 세포 생존율 (PI 배제)을 PI-103 첨가 4일 후 분석하였다. (c) Atg7 siRNA 풀 (Santa Cruz) 또는 비-표적화 대조군 올리고로 형질감염된 PC3 세포의 Atg7 면역블롯. (d) 상이한 처리하의 PC3 세포 생존율에 대한 Atg7 siRNA 올리고의 효과. PC3 세포를 0.5% FBS하에 20 nM의 siRNA로 형질감염시키고, Akti-1I2 (5 μM) 또는 DMSO를 CQ (10 μM)의 존재 또는 부재하에 형질감염-후 2일에서 첨가하고, 세포 생존율 (PI 배제)을 화합물 첨가 2일 및 3일 후 분석하였다. *, 2개의 조건 사이에서의 P < 0.05. (e) DMSO, 10 μM CQ, 3 μM Akti-1/2, 또는 Akti-1/2 및 CQ 둘 다와 함께 첨가된 zVAD.fmk의 나타낸 농도로 처리된 PC3 세포. 세포 생존율을 3일차에서 PI 배제에 의해 결정하였다. *, P< 0.05; **, P< 0.001 (2개의 조건 사이에서). (f) DMSO, 10 μM CQ, 3 μM Akti-1/2, 또는 Akti-1/2 및 CQ 둘 다와 함께 첨가된 zFA.fmk의 나타낸 농도로 처리된 PC3 세포. 세포 생존율을 3일차에서 PI 배제에 의해 결정하였다. *, P< 0.05; **, P< 0.001 (2개의 조건 사이에서). (f) DMSO, 10 μM CQ, 3 μM Akti-1/2, 또는 Akti-1/2 및 CQ 둘 다와 함께 첨가된 zFA.fmk의 나타낸 농도로 처리된 PC3 세포. 세포 생존율을 3일차에서 PI 배제에 의해 결정하였다. *, P< 0.05 (Akti-1/2 단독 또는 zFA.fmk 단독으로 처리된 세포와 비교함). DMSO, 10 μM CQ, 3 μM Akti-1/2, 또는 Akti-1/2 및 CQ 둘 다의 첨가 전에 2시간 동안 (g-h) CA-074-Me (g) 또는 ALLN (h)의 나타낸 농도로 예비-처리된 PC3 세포. 세포 생존율을 3일차에서 PI 배제에 의해 결정하였다. *, P < 0.05 (Akti-1/2 단독 또는 프로테아제 억제제 단독으로 처리된 세포와 비교함). (i) 상이한 치료하의 PC3 세포 생존율에 대한 카텝신 D siRNA 올리고의 효과. PC3 세포를 10 nM의 카텝신 D siRNA 풀 (Santa Cruz) 또는 0.5% FBS하의 비-표적화하는 대조군으로 형질감염시키고, CQ (10 μM)의 존재 또는 부재하에 Akti-1/2 (5 μM) 또는 DMSO를 형질감염-후 2일에서 첨가하고, 세포 생존율 (PI 배제)을 화합물 첨가 2일 후 분석하였다. 카텝신 D 넉다운을 우측 상부 모서리에 나타낸 면역블롯 분석에 의해 확인하였다. (j) 상이한 치료하에 PC3 세포 생존율에 대한 펩스타틴 A의 효과. PC3 세포를 200 μM 펩스타틴 A의 존재 또는 부재하의 DMSO, 5 μM Akti-1/2, 10 μM CQ 또는 이들 둘 다로 0.5% FBS하에 처리하였다. 세포 생존율 (PI 배제)을 화합물 첨가 2일 후 분석하였다. 2개의 조건 사이에서의 *, P < 0.05. (b, d-j) 오차 막대는 SEM을 나타낸다 (n = 3). 분자량은 A, C & I에서의 면역블롯에 대한 각각 단백질 옆에 괄호로 kDa로 나타낸다.
도 21. CQ는 Akti-1/2와 조합으로 미토콘드리아 막 탈분극 및 세포 ROS 축적을 촉진시켰다. (a) CQ 증대된 Akt-1/2-유도된 미토콘드리아 탈분극. 0.5% FBS 중에 배양된 PC3 세포를 DMSO, 3 μM Akti-1/2, 10 μM CQ, 또는 이들 둘 다로 처리하고, 다양한 시점에서 미토피티(MitoPT) 염료 (Immunochemistry Technologies, LLC)로 염색하였다. 48시간에서의 영상을 나타낸다. 건강한 미토콘드리아는 JC-1응집체 (미토피티-R)의 점 레드 염색을 나타낸 반면, 탈분극 미토콘드리아를 갖는 세포는 JC-1 단량체 (미토피티 -G)의 확산 그린 염색을 나타낸다. 레드 및 그린 채널 사이의 병합된 영상을 또한 나타낸다 (미토피티 -M). 축척 막대: 20 μm. (b) (a)에 기재된 처리로부터 레드 점 염색 및 확산 그린 염색을 나타내는 세포의 퍼센트. 각각 처리의 형광 영상의 2개의 무작위 장으로부터의 >86 세포를 계수하였다. 오차 막대는 2개의 장 사이의 표준 편차를 나타낸다. (c) 3-MA는 CQ, Akti 및 Akti + CQ에 의해 생성된 ROS 신호를 감소시켰다. 0.5% FBS 중에 배양된 PC3 세포를 3-MA로 밤새 예비-처리하고, 이어서 DMSO, 5 μM Akti-1/2, 10 μM CQ, 또는 이들 둘다로 48시간 동안 처리하고, 이미지(Image)-iT 라이브(LIVE) 그린 ROS 검출 키트로 염색하였다. 모든 세포로부터의 총 형광 강도를 레이져 스캔 영상화기인 이소사이트(Isocyte) (Blueshift Biotechnologies)를 사용하여 수집하였다. 그린 형광 강도를 488 nm 레이져 및 510-540 nm 밴드 통과 여과기로 수집하고, 405 nm 레이져 및 430-480 nm 밴드 통과 여과기를 사용하여 호츠스트(Hoechst) 염색에 의해 결정된 세포 수에 정규화하였다. 오차 막대, 2개의 독립적인 실험 사이에서의 표준 편차. (d) 니콘(Nikon) TE300 도립 현미경하에 관찰된 그린 ROS 신호 및 밝은 시야 (BF)의 대표적인 영상. Akti-1/2 단독은 초기에 ROS 수준의 균일적 증가를 유도하였지만, 48시간이 지난 후 형광은 유의하게 감소되었고, 자가용해소체와 유사한 핵주위 및 세포질 공포에 국소화되었다. 비록 CQ 단독은 ROS 수준에 대해 적은 효과를 가졌지만, Akti-1/2와의 조합은 공포 형광의 지속적 증가, 및 지속적 균일 형광을 갖는 세포의 증가된 집단을 야기하였으며, 이들의 다수는 48시간 내에 세포자멸의 형태학적 징후를 나타냈다. 화살촉은 공포 형광을 나타내는 대표적인 세포를 가리킨다. 별표는 균일 그린 형광을 가지며, 또한 세포자멸성 형태학을 나타내는 대표적인 세포를 나타낸다. 축척 막대: 20 μm.
도 22. NAC는 Akti + CQ에 의해 유도된 세포 사멸을 구조하였다. (a) NAC는 다양한 처리에 의해 유도된 미토삭스(MitoSOX) 레드 신호를 감소시켰다. PC3 세포를 1일 동안 5 mM NAC로 예비처리하고, 이어서 세척하고 (NACpr), 나타낸 제제로 처리하거나, 또는 1시간 동안 5 mM NAC로 예비처리하고, NAC (NAC)의 연속적 존재하에 나타낸 제제로 인큐베이션하였다. 미토삭스 신호를 흐름 세포측정에 의한 Akti-1/2 첨가 24시간 후 결정하였다. 5 μM Akti-1/2 및 10 μM CQ를 사용하였다. 연속적 NAC 처리가 이 시점에서의 미토삭스 레드 신호 감소를 위해 요구된다. (b) (a)에서 처리된 바와 같은 세포의 생존율 (PI 배제)을 Akti-1/2 첨가 4일 후 흐름 세포측정에 의해 결정하였다. NAC 예비처리는 Akti + CQ 군에서의 세포 사멸의 작은, 무의미한 감소를 나타냈으며, 연속적 NAC 처리로의 유의한 구조를 나타낸다. (a 및 b) 오차 막대는 SEM을 나타낸다 (n = 3). (c) GFP-LC3을 안정하게 발현하는 PC3 세포를 (a)에서와 같이 처리하고, 면역블롯에 의해 Akti-1/2 첨가 후 48시간에서 분석하였다. β-액틴 및 GAPDH를 로딩 대조군으로서 사용하였다. p62의 정량화 및 GAPDH로 정규화된 절단된 GFP 수준, 및 LC3-II 대 LC3-I 비율을 우측에 나타낸다. Akti는 p62 수준의 감소, 증가된 LC3-I 회전 (내인성 및 GFP-LC3-I 둘 다) 및 수반되는 LC3-II 및 절단된 GFP 축적을 야기하였다. CQ는 Akti의 존재 및 부재하에 둘 다 p62의 수준을 증가시켰으며, 이는 자가용해소체에서의 p62 분해의 그의 차단과 일관된다. CQ는 또한 LC3-II, 및 자가용해소체에서의 그들의 분해의 그의 차단으로 인한 절단된 GFP 축적을 유도하였다. NAC 처리는 CQ의 존재 또는 부재하의 Akti에 의해 유도된 모든 이들 효과를 중화하였지만, pAkt 또는 pS6을 억제하는 Akti의 능력에 영향을 주지 않았다. NACpr은 연속적 NAC 처리보다 일부, 그러나 더 약한 효과를 나타냈다. (d) 5 mM NAC(Akt-1/2 1시간 전에 첨가됨)의 존재 또는 부재하에 Akti-1/2 첨가 후 2, 11 및 23시간에서의 DMSO, 3 μM Akti-1/2로 처리된 GFP-LC3을 안정하게 발현하는 PC3 세포의 저속 촬영 형광 영상. 화살촉은 가시적 GFP-LC3 점을 갖는 대표적인 세포를 가리킨다. 축척 막대: 50 μm.
도 23은 Akt 이소형을 특이적으로 표적화하는 shRNA를 제작하기 위해 사용된 pHUSH 벡터 시스템을 나타낸다. pHUSH 벡터 시스템은 Tet-조절된 shRNA 발현을 가능하게 하는 TetR-IRES-Puro 카세트를 함유하는 shRNA 발현 셔틀 플라스미드 (pShuttle-H1) 및 바이러스 벡터 주쇄 (pHUSH-GW; GW=게이트웨이(Gateway))를 포함한다. Akt shRNA 벡터를 (1) pShuttle-H1 내에 shRNA 서열을 설계하고, 클로닝하는 단계 (2) H1-shRNA 카세트를 게이트웨이 (Invitrogen) 재조합 반응에 의해 pHUSH-GW 내에 전달하는 단계 및 (3) 완성된 H1-pHUSH 플라스미드를 레트로바이러스로서 패키징하는 단계에 의해 구축하였다. 각각 shRNA에 대해, 19bp siRNA 서열을 Akt 유전자(들)의 코딩 서열에 대한 적절한 알고리즘을 사용하여 설계하였다. shRNA 서열을 shRNA 헤어핀 서열로 변환하고, 이어서 상응하는 이중-가닥 DNA 올리고를 합성하고, 나타낸 바와 같이 pShuttle-H1 내에 클론닝하였다. pShuttle-H1 벡터 내의 각각 shRNA의 효과를 세포 내로의 일과성 형질감염에 의해 확인하고, 각각 Akt 이소형의 넉다운의 정도를 웨스턴 블롯에 의해 검사하였다. 입증된 H1-shRNA 카세트를 이어서 pHUSH-GW 벡터 내에 전달하고, 레트로바이러스로서 패키징하였다 (표 1은 사용된 입증된 서열을 요약함). 각각 shRNA를 안정하게 발현하는 세포를 shRNA-함유 바이러스의 단일 또는 조합으로의 레트로바이러스 감염에 의해 생성하였다. 단일 Akt 이소형 넉다운에 대해, 세포를 각각 Akt 이소형 (Akt1에 대해 구축물 252 & 253, Akt2에 대해 254 & 255, 및 Akt3에 대해 259 & 260)을 단일로 표적화하는 shRNA 구축물을 코딩하는 하나의 레트로바이러스 벡터로 감염시키고, 안정한 클론을 5 mg/ml 푸로마이신을 사용하여 선택하였다. 이중 Akt1 및 Akt2 넉다운에 대해, Akt1 및 2 둘 다를 동시에 표적화하는 단일 shRNA (구축물 256 & 257)를 사용하였다. 이중 Akt2 및 3 (구축물 255 및 261), 또는 삼중 Akt1, 2 및 3 (구축물 257 및 261) 넉다운을 세포를 각각 하나의 단일 shRNA를 코딩하는 상이한 항생제 선택 마커 (푸로마이신 및 히그로마이신)를 함유하는 2개의 레트로바이러스 벡터로 동시-감염함으로써 달성하였고, 안정한 클론을 5 mg/ml 푸로마이신 및 300 mg/ml 히그로마이신을 사용하여 선택하였다. 이중 Akt1 및 3 넉다운에 대해, Akt1 및 3 (구축물 258) 둘 다를 표적화하는 단일 shRNA, 또는 2개의 shRNA 벡터 (구축물 253 및 261)로의 동시-감염 중 하나를 사용하였다 (표 2). 표 2에 나타낸 모든 shRNA는 배양된 세포에서 입증되었다. 이종이식편 모델에서 입증된 shRNA의 효능 및 종양 억제적 효과는 표 3에 요약되어 있다.
도 24는 Akt 억제로의 클로로퀸의 조합에 의한 세포 사멸의 기전의 모델을 나타낸다. Akt 억제 단독 (shRNA, 특이적 Akt 억제제 또는 클래스 I PI3K 억제제에 의함)은 Akt의 하류에서의 감소된 mTORC1 활성 (문헌 [Corradetti MN, Guan KL. Upstream of the mammalian target of rapamycin: do all roads pass through mTOR? Oncogene (2006); 25:6347-60]), F옥소 단백질의 증가된 활성 (문헌 [Zhao J, Brault JJ, Schild A, Goldberg AL. Coordinate activation of autophagy and the proteasome pathway by foxO transcription factor, Autophagy (2008); 4:378-80]), 및 감소된 글루코스 및 에너지 대사를 포함하는 다중 기전을 통해 자식증을 활성화시킬 수 있다. 본 발명자들은 또한 둘 다 자식증을 유도할 수 있는 Akt 넉다운 또는 억제를 갖는 세포에서의 ER 스트레스의 비정상적 미토콘드리아 및 징후의 축적 (발행되지 않은 데이터)을 관찰하였다. (문헌 [Yorimitsu T, Klionsky DJ. Endoplasmic reticulum stress: a new pathway to induce autophagy. Autophagy (2007); 3:160-2]). 비정상적 미토콘드리아는 ROS 신호를 생성하여, 손상된 미토콘드리아의 상승된 자가탐식 제거 및 산화성 스트레스의 감소를 야기할 수 있다. 3-메틸아데닌 (3-MA) 및 클래스 III PI3K를 억제하는 다른 비-선택적 팬-PI3K 억제제, 예를 들면 보르트만닌 또는 LY294002는 자식증의 유도를 차단한다. CQ (또는 용해소체 효소 활성의 다른 억제제)에 의해 야기된 손상된 자가용해소체적 분해는 ROS 손상을 추가로 증폭시키는 유해한 ROS 생성자의 응집을 야기할 수 있다. 다중 하류 사건은 세포자멸-유사 및 비-세포자멸성 세포 사멸 둘 다를 야기할 수 있다. Akt 억제 단독에 의해 유도된 자가탐식 반응이 결국 일부 세포에서 직접 세포 사멸을 야기할 수 있는지, 또는 추가의 손상을 요구하는지 명확하지 않다.
도 25a-e는 Akt 억제제, CQ 및 이들의 조합으로 처리된 PC3 세포에서의 AV 축적을 나타낸다. (패널 a-c): 0.5% FBS하에 성장시킨 PC3 세포를 (a) DMSO 대조군, (b) 10 μM CQ, 및 (c) 5 μM Akti-1/2로 1일 동안 처리하였다. CQ 및 Akti-1/2 단독 둘 다는 AV의 축적을 유도하였다 (화살표). (패널 d-e): Akti-1,2 및 CQ의 조합된 처리는 더 큰 AV 및 모습 세포자멸성 핵의 축적을 야기하였다. (d) 1일의 처리 후, 많은 세포는 매우 큰 AV (화살표), 팽창된 ER 시스턴 (화살촉)을 함유하였으며, 크게 공포성인 것으로 나타났다 (작은 화살표). (e) 2일의 처리 후, 세포자멸은 큰 비율의 세포에서 분명해졌다 (별표). 축척 막대, 2 μm.
도 26a-b는 다중 세포주에서의 CQ 단독, AKTi III-4 단독, 및 그들의 조합에 대해 측정된 ED50을 나타낸다. 도 26a는 CQ 및 AKTi에 대한 화합물 비율 작업 표를 나타낸다. 도 26b는 10%혈청으로의 처리 4일차에서의 쎌타이터-글로(CellTiter-Glo) 검정에 의해 수득된 데이터에 대한 막대 그래프의 사용에 의한 CI (조합 색인)를 나타낸다. X-축은 세포주를 나타내고, Y-축은 농도를 μM으로 나타낸다. AKTi의 CQ와의 조합은 AKTi 및 CQ 둘 다에 대한 ED50을 유의하게 낮춘다.
도 27a-b는 PC3 (PTEN-, p53- 및 Al) 세포주에 대한 데이터를 나타낸다. 도 27a는 AKTi III-4 및 CQ가 다양한 비율로 조합된 경우 ED50, ED75 및 ED90에서의 CI 값을 나타낸다. 데이터는 각각 가장 낮은 ED50, ED75 및 ED90 값은 약 1:1.5 내지 약 1:200의 비율이며, 대안 비율은 약 1:3 내지 약 1:50의 범위이며, 추가의 대안 비율은 약 1:12 내지 약 1:50이며, 약 1:25의 특정 비율인 각각 5:1 내지 1:800의 범위의 III-4:CQ의 조합 비율을 나타낸다. 27b는 AKTi III-4 단독, CQ 단독, 및 1:25 비율 (약 EC50 비율)로 투여된 AKTi 및 CQ 조합의 성장 억제 곡선을 나타낸다. x-축은 III-4 농도를 μM로 나타내며, y-축은 대조군의 %를 나타낸다. 데이터는 III-4 단독 또는 CQ 단독 중 하나보다 III-4의 더 낮은 농도에서의 세포주에서의 조합 억제 성장을 나타낸다.
도 28a-b는 MDA-361.1 (PI2-K mut (E545K), Her2+, HR+ 및 Luminal) 세포주에 대한 데이터를 나타낸다. 도 28a는 AKTi III-4 및 CQ가 다양한 비율로 조합된 경우 ED50, ED75 및 ED90에서의 CI 값을 나타낸다. 데이터는 각각 가장 낮은 ED50, ED75 및 ED90 값은 약 1:1.5 내지 약 1:200의 비율이며, 대안 비율은 약 1:3 내지 약 1:25의 범위이며, 약 1:12.5의 특정 비율인 각각 5:1 내지 1:800의 범위에서의 III-4:CQ의 조합 비율을 나타낸다. 도 28b는 1:12.5 비율 (약 EC50 비율)로 투여된 AKTi III-4 단독, CQ 단독, 및 AKTi 및 CQ 조합의 성장 억제 곡선을 나타낸다. x-축은 III-4 농도를 μM로 나타내고, y-축은 대조군의 %를 나타낸다. 데이터는 III-4 단독 또는 CQ 단독 중 하나보다 III-4의 더 낮은 농도에서의 세포주에서의 조합 억제 성장을 나타낸다.
도 29a-b는 MDA-MB-231 (Kras, Braf, p53 mut, Triple- 및 Basal) 세포주에 대한 데이터를 나타낸다. 도 29a는 AKTi III-4 및 CQ가 다양한 비율로 조합된 경우 ED50, ED75 및 ED90에서의 CI 값을 나타낸다. 데이터는 각각 가장 낮은 ED50, ED75 및 ED90 값은 약 2.5:1 내지 약 1:1:3의 비율이며, 약 1.25:1의 특정 비율인 각각 5:1 내지 1:800의 범위의 III-4:CQ의 조합 비율을 나타낸다. 도 29b는 1.25:1 비율 (약 EC50 비율)로 투여된 AKTi III-4 단독, CQ 단독, 및 AKTi 및 CQ 조합의 성장 억제 곡선을 나타낸다. x-축은 III-4 농도를 μM로 나타내며, y-축은 대조군의 %를 나타낸다. 데이터는 III-4 단독 또는 CQ 단독 중 하나보다 III-4의 더 낮은 농도에서의 세포주에서의 조합 억제 성장을 나타낸다.
도 30a-b는 U87MG (PTEN-, PI3K mut (I391M)) 세포주에 대한 데이터를 나타낸다. 도 30a는 AKTi III-4 및 CQ가 다양한 비율로 조합된 경우 ED50, ED75 및 ED90에서의 CI 값을 나타낸다. 데이터는 각각 가장 낮은 ED50, ED75 및 ED90 값은 약 2.5:1 내지 약 1:25의 비율이며, 대안 비율은 약 1.25:1 내지 약 1:3의 범위이며, 약 1:1.5의 특정 비율인 각각 5:1 내지 1:800의 범위의 III-4:CQ의 조합 비율을 나타낸다. 도 30b는 AKTi III-4 단독, CQ 단독의 성장 억제 곡선, 및 1:1.5 비율 (최소 CI를 갖는 약 EC50 비율)로 투여된 AKTi 및 CQ 조합을 나타낸다. x-축은 III-4 농도를 μM로 나타내며, y-축은 대조군의 %를 나타낸다. 데이터는 III-4 단독 또는 CQ 단독 중 하나보다 III-4의 더 낮은 농도에서의 세포주에서의 조합 억제 성장을 나타낸다.
도 31a-c는 Panc-1 (Akt2 amp, Kras mut, p53 mut) 세포주에 대한 데이터를 나타낸다. 도 31a는 AKTi III-4 및 CQ가 다양한 비율로 조합된 경우 ED50, ED75 및 ED90에서의 CI 값을 나타낸다. 데이터는 각각 가장 낮은 ED50, ED75 및 ED90 값은 약 2.5:1 내지 약 1:1.3의 비율이며, 약 1.25:1의 특정 비율인 각각 5:1 내지 1:800의 범위의 III-4:CQ의 조합 비율을 나타낸다. 도 31b는 AKTi III-4 단독, CQ 단독, 및 1.28:1 비율 (약 최소 CI를 갖는 EC50 비율)로 투여된 AKTi 및 CQ 조합의 성장 억제 곡선을 나타낸다. x-축은 III-4 농도를 μM로 나타내며, y-축은 대조군의 %를 나타낸다. 데이터는 III-4 단독 또는 CQ 단독 중 하나보다 III-4의 더 낮은 농도에서의 세포주에서의 조합 억제 성장을 나타낸다. 도 31c는 1:1.56 비율 (약 최소 CI를 갖는 EC10 비율)로 투여된 AKTi III-4 단독, CQ 단독, 및 AKTi 및 CQ 조합의 성장 억제 곡선을 나타낸다. x-축은 III-4 농도를 μM로 나타내며, y-축은 대조군의 %를 나타낸다. 데이터는 III-4 단독 또는 CQ 단독 중 하나보다 III-4의 더 낮은 농도에서의 세포주에서의 조합 억제 성장을 나타낸다.
도 32a-b 및 34a-b는 각각 화합물이 각각 537MEL 흑색종 세포주 및 SKBR3 유방암 세포주에서 아크리딘 오렌지 염색에 의해 측정된 투여된 화합물의 처리 후 24시간에서 CQ와 조합된 경우 자식증 유도 및 세포자멸 유도 사이의 연관성을 나타내는 데이터를 나타낸다. 대조군은 DMSO이었다. 시험된 화합물은 1-(1-(4-(7-페닐-1H-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-6-일)벤질)피페리딘-4-일)-1H-벤조[d]이미다졸-2(3H)-온 (II-4), 3-페닐-2-(4-((4-(5-(피리딘-2-일)-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-일)메틸)페닐)-1,6-나프티리딘-5(6H)-온 (II-3), (들)-2-(4-클로로페닐)-1-(4-((5R,7R)-7-히드록시-5-메틸-6,7-디히드로-5H-시클로펜타[d]피리미딘-4-일)피페라진-1-일)-3-(이소프로필아미노)프로판-1-온 (III-4), 4-(2-(1H-인다졸-4-일)-6-((4-(메틸술포닐)피페라진-1-일)메틸)티에노[3,2-d]피리미딘-4-일)모르폴린 (III-6), (R)-N-(2,3-디히드록시프로폭시)-3,4-디플루오로-2-(2-플루오로-4-요오도페닐아미노)벤즈아미드 (VII), (S)-1-에틸-3-(4-(4-(3-메틸모르폴리노)-7-(피리미딘-2-일)-5,6,7,8-테트라히드로피리도[3,4-d]피리미딘-2-일)페닐)우레아 (III-2a) 및 라파마이신이었다.
도 33a-g 및 35a-g는 각각 나타낸 화합물 단독 또는 10 μM CQ로 처리된 아네진(Annezin) V (AnnV) 및 프로피듐 요오다이드 (PI) 염색에 의해 측정된 537MEL 흑색종 및 SKBR3 유방암 세포에서의 세포자멸 유도의 투여량 반응 곡선을 나타낸다.
상기 도에서, 화합물이 CQ와 조합된 경우 자식증 유도 및 세포자멸 유도 사이의 양성 연관성을 나타낸다. 자식증 (VII)을 유도하지 않는 화합물의 경우, CQ와 조합된 경우 상승작용적 세포자멸 유도는 나타나지 않았다.
본 발명의 상세한 설명
정의
용어 "신생물"은 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리적 상태를 지칭하거나 기재하는 "암" 및 "암성"을 포함한다. "종양"은 1개 이상의 암 세포를 포함한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병 또는 림프양 악성종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 암의 보다 특별한 예는 편평 세포암 (예를 들어, 상피 편평 세포암), 폐암, 예를 들어 소세포 폐암, 비-소세포 폐암 ("NSCLC"), 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종, 복막암, 간세포암, 위(gastric 또는 stomach)암, 예를 들어 위장암, 췌장암, 신경교종암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간암, 유방암, 결장암, 직장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장(kidney 또는 renal)암, 전립선암, 외음암, 갑상선암, 간 암종, 항문 암종, 음경 암종 및 또는 두경부암을 포함한다. 한 실시양태에서, 신생물은 해당작용 의존성 암 이외의 것이다. 또다른 실시양태에서, 신생물은 전립선암, 유방암, 신경교종암 또는 췌장암이다. 또다른 실시양태에서, 신생물은 전립선암, 유방암 또는 난소암이다. 또다른 실시양태에서, 신생물은 PTEN 또는 PI3K 돌연변이를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 신생물은 Akt 키나제 경로 억제제에 대해 내성이 있다.
본원에서 사용된 용어 "알킬"은 1 내지 12개의 탄소 원자의 포화 선형 또는 분지쇄 1가 탄화수소 라디칼을 지칭하며, 여기서 알킬 라디칼은 독립적으로 하기 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있다. 알킬 기의 예는 메틸 (Me, -CH3), 에틸 (Et, -CH2CH3), 1-프로필 (n-Pr, n-프로필, -CH2CH2CH3), 2-프로필 (i-Pr, i-프로필, -CH(CH3)2), 1-부틸 (n-Bu, n-부틸, -CH2CH2CH2CH3), 2-메틸-1-프로필 (i-Bu, i-부틸, -CH2CH(CH3)2), 2-부틸 (s-Bu, s-부틸, -CH(CH3)CH2CH3), 2-메틸-2-프로필 (t-Bu, t-부틸, -C(CH3)3), 1-펜틸 (n-펜틸, -CH2CH2CH2CH2CH3), 2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH2CH3), 3-펜틸 (-CH(CH2CH3)2), 2-메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH2CH3), 3-메틸-2-부틸 (-CH(CH3)CH(CH3)2), 3-메틸-1-부틸 (-CH2CH2CH(CH3)2), 2-메틸-1-부틸 (-CH2CH(CH3)CH2CH3), 1-헥실 (-CH2CH2CH2CH2CH2CH3), 2-헥실 (-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3), 3-헥실 (-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3)), 2-메틸-2-펜틸 (-C(CH3)2CH2CH2CH3), 3-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3), 4-메틸-2-펜틸 (-CH(CH3)CH2CH(CH3)2), 3-메틸-3-펜틸 (-C(CH3)(CH2CH3)2), 2-메틸-3-펜틸 (-CH(CH2CH3)CH(CH3)2), 2,3-디메틸-2-부틸 (-C(CH3)2CH(CH3)2), 3,3-디메틸-2-부틸 (-CH(CH3)C(CH3)3), 1-헵틸, 1-옥틸 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "알케닐"은 적어도 1개의 불포화 부위, 즉 탄소-탄소 sp2 이중 결합을 갖는 2 내지 12개의 탄소 원자의 선형 또는 분지쇄 1가 탄화수소 라디칼을 지칭하고, 여기서 알케닐 라디칼은 독립적으로 본원에 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있고, "시스" 및 "트랜스" 배향 또는 대안적으로는 "E" 및 "Z" 배향을 갖는 라디칼을 포함한다. 예로는 에틸레닐 또는 비닐 (-CH=CH2), 알릴 (-CH2CH=CH2) 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "알키닐"은 적어도 1개의 불포화 부위 즉, 탄소-탄소 sp 삼중 결합을 갖는 2 내지 12개의 탄소 원자의 선형 또는 분지형 1가 탄화수소 라디칼을 지칭하며, 여기서 알키닐 라디칼은 독립적으로 본원에 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환될 수 있다. 예로는 에티닐 (-C≡CH), 프로피닐 (프로파르길, -CH2C≡CH) 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "카르보사이클", "카르보시클릴", "카르보시클릭 고리" 및 "시클로알킬"은, 모노시클릭 고리로서 3 내지 12개의 탄소 원자 또는 비시클릭 고리로서 7 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 1가 비-방향족의 포화 또는 부분 불포화 고리를 지칭한다. 7 내지 12개의 원자를 갖는 비시클릭 카르보사이클은, 예를 들어 비시클로 [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로 배열될 수 있고, 9 또는 10개의 고리 원자를 갖는 비시클릭 카르보사이클은 비시클로 [5,6] 또는 [6,6] 시스템으로, 또는 비시클로[2.2.1]헵탄, 비시클로[2.2.2]옥탄 및 비시클로[3.2.2]노난과 같은 가교(bridged)된 시스템으로 배열될 수 있다. 모노시클릭 카르보사이클의 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 1-시클로펜트-1-에닐, 1-시클로펜트-2-에닐, 1-시클로펜트-3-에닐, 시클로헥실, 1-시클로헥스-1-에닐, 1-시클로헥스-2-에닐, 1-시클로헥스-3-에닐, 시클로헥사디에닐, 시클로헵틸, 시클로옥틸, 시클로노닐, 시클로데실, 시클로운데실, 시클로도데실 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"아릴" 또는 "방향족"은 모 방향족 고리계의 단일 탄소 원자로부터 1개의 수소 원자의 제거에 의해 유래되는, 6 내지 20개의 탄소 원자의 1가 방향족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 몇몇 아릴 기는 예시적인 구조에서 "Ar"로 표시된다. 아릴은 포화, 부분 불포화 고리, 또는 방향족 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리에 융합된 방향족 고리를 포함하는 비시클릭 라디칼을 포함한다. 전형적인 아릴 기는 벤젠 (페닐), 치환된 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 비페닐, 인데닐, 인다닐, 1,2-디히드로나프탈렌, 1,2,3,4-테트라히드로나프틸 등에서 유래된 라디칼을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 아릴 기는 독립적으로 본원에 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
용어 "헤테로사이클," "헤테로시클릴" 및 "헤테로시클릭 고리"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 3 내지 20개의 고리 원자를 갖는 포화 또는 부분 불포화 (즉, 고리 내에 1개 이상의 이중 결합 및/또는 삼중 결합을 가짐) 또는 방향족 카르보시클릭 라디칼을 지칭하며, 여기서 적어도 1개의 고리 원자는 질소, 산소 및 황으로부터 선택된 헤테로원자이고, 나머지 고리 원자는 C이고, 여기서 1개 이상의 고리 원자는 독립적으로 하기 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다. 헤테로사이클은 3 내지 7개의 고리원 (2 내지 6개의 탄소 원자, 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자)을 갖는 모노사이클일 수도 있고, 또는 7 내지 10개의 고리원 (4 내지 9개의 탄소 원자, 및 N, O, P 및 S로부터 선택된 1 내지 6개의 헤테로원자)을 갖는 비사이클, 예를 들어 비시클로 [4,5], [5,5], [5,6] 또는 [6,6] 시스템일 수도 있다. 헤테로사이클은 문헌 [Paquette, Leo A.; "Principles of Modern Heterocyclic Chemistry" (W.A. Benjamin, New York, 1968)] (특히, 제1장, 제3장, 제4장, 제6장, 제7장 및 제9장), ["The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A series of Monographs" (John Wiley & Sons, New York, 1950 to present)] (특히, 제13권, 제14권, 제16권, 제19권 및 제28권) 및 [J. Am. Chem. Soc. (1960) 82:5566])에 기재되어 있다. 용어 "헤테로사이클"은 헤테로시클로알콕시를 포함한다. "헤테로시클릴"은 또한 헤테로사이클 라디칼이 포화, 부분 불포화 고리 또는 방향족의 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리에 융합된 라디칼을 포함한다. 헤테로시클릭 고리의 예는 피롤리디닐, 테트라히드로푸라닐, 디히드로푸라닐, 테트라히드로티에닐, 테트라히드로피라닐, 디히드로피라닐, 테트라히드로티오피라닐, 피페리디노, 모르폴리노, 티오모르폴리노, 티옥사닐, 피페라지닐, 호모피페라지닐, 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 호모피페리디닐, 옥세파닐, 티에파닐, 옥사제피닐, 디아제피닐, 티아제피닐, 2-피롤리닐, 3-피롤리닐, 인돌리닐, 2H-피라닐, 4H-피라닐, 디옥사닐, 1,3-디옥솔라닐, 피라졸리닐, 디티아닐, 디티올라닐, 디히드로피라닐, 디히드로티에닐, 디히드로푸라닐, 피라졸리디닐이미다졸리닐, 이미다졸리디닐, 3-아자비시클로[3.1.0]헥사닐, 3-아자비시클로[4.1.0]헵타닐, 아자비시클로[2.2.2]헥사닐, 3H-인돌릴 퀴놀리지닐 및 N-피리딜 우레아를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 스피로 모이어티는 또한 본 정의의 범위 내에 포함된다. 2개의 고리 탄소 원자가 옥소 (=O) 모이어티로 치환된 헤테로시클릭 기의 예는 피리미디노닐 및 1,1-디옥소-티오모르폴리닐이다. 본원에서의 헤테로사이클 기는 독립적으로 본원에 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
용어 "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족"은 5원, 6원 또는 7원 고리의 1가 방향족 라디칼을 지칭하고, 질소, 산소 및 황으로부터 독립적으로 선택된 1개 이상의 헤테로원자를 함유하는 5 내지 20개 원자의 융합된 고리계 (이들 중 적어도 하나는 방향족임)을 포함한다. 헤테로아릴 기의 예는 피리디닐 (예를 들어, 2-히드록시피리디닐 포함), 이미다졸릴, 이미다조피리디닐, 피리미디닐 (예를 들어, 4-히드록시피리미디닐 포함), 피라졸릴, 트리아졸릴, 피라지닐, 테트라졸릴, 푸릴, 티에닐, 이속사졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 이소티아졸릴, 피롤릴, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 인돌릴, 벤즈이미다졸릴, 벤조푸라닐, 신놀리닐, 인다졸릴, 인돌리지닐, 프탈라지닐, 피리다지닐, 트리아지닐, 이소인돌릴, 프테리디닐, 푸리닐, 옥사디아졸릴, 트리아졸릴, 티아디아졸릴, 티아디아졸릴, 푸라자닐, 벤조푸라자닐, 벤조티오페닐, 벤조티아졸릴, 벤족사졸릴, 퀴나졸리닐, 퀴녹살리닐, 나프티리디닐 및 푸로피리디닐이다. 헤테로아릴 기는 독립적으로 본원에 기재된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
헤테로사이클 또는 헤테로아릴 기는 가능한 곳에서 탄소 부착 (탄소-연결)되거나, 질소 부착 (질소-연결)되거나 또는 산소 부착 (산소-연결)될 수 있다. 제한되지 않는 예로서, 탄소 결합된 헤테로사이클 또는 헤테로아릴은 피리딘의 위치 2, 3, 4, 5 또는 6, 피리다진의 위치 3, 4, 5 또는 6, 피리미딘의 위치 2, 4, 5 또는 6, 피라진의 위치 2, 3, 5 또는 6, 푸란, 테트라히드로푸란, 티오푸란, 티오펜, 피롤 또는 테트라히드로피롤의 위치 2, 3, 4 또는 5, 옥사졸, 이미다졸 또는 티아졸의 위치 2, 4 또는 5, 이속사졸, 피라졸 또는 이소티아졸의 위치 3, 4 또는 5, 아지리딘의 위치 2 또는 3, 아제티딘의 위치 2, 3 또는 4, 퀴놀린의 위치 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8, 또는 이소퀴놀린의 위치 1, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8에서 결합된다.
용어 "치료하다" 및 "치료"는 원하지 않은 생리적 변화 또는 장애, 예를 들어 암의 성장, 발병 또는 전개를 방지하거나 지연시키는 (줄이는) 치료적 치료 및 예방 또는 방지 수단 둘 다를 지칭한다. 한 실시양태에서, 용어 "치료하다" 및 "치료"는 원하지 않은 생리적 변화 또는 장애, 예를 들어 암의 성장, 발병 또는 전개를 지연시키는 (줄이는) 치료적 치료를 지칭한다. 본 발명의 목적상, 유익하거나 원하는 임상 결과는 검출가능하든 검출가능하지 않든 간에 증상의 완화, 질환 정도의 경감, 질환의 안정화된 (즉, 악화되지 않은) 상태, 질환 진행의 지연 또는 저속화, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 차도 (부분적 또는 전반적)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우에 예상되는 생존과 비교하여 생존을 연장시키는 것을 의미할 수도 있다. 치료를 필요로 하는 대상체는 이미 해당 병태 또는 장애가 있는 대상체뿐만 아니라 이러한 병태 또는 장애를 갖기 쉬운 대상체 또는 이러한 병태 또는 장애를 예방할 대상체를 포함한다.
본원에서 사용되는 "해당작용 의존성 암"은, 자식증에 의해 수득될 수 있는 에너지를 제외하여, 필요한 이들의 본질적인 모든 에너지를 글루코스 대사에 의존하는 암 세포를 특징으로 하는 암을 지칭하는 것으로 의도된다. 해당작용 의존성 암의 암 세포는 어느 정도 수준의 비-당분해 대사를 할 수 있으나, 이러한 수준은 글루코스 에너지원의 부재시 암 세포가 아폽토시스 또는 자식증에 의한 세포사를 경험하는 것을 예방하지 않는다. 암이 해당작용에 의존성인지 여부를 측정하는 많은 방법이 있다. 세포가 해당작용에 의존성인지를 측정하기 위해 종양 샘플은 널리 알려진 몇몇 검정 중 임의의 하나에 의해 시험관내에서 절개되거나 시험될 수 있다. 이러한 방법은 세포가 유산소 또는 무산소 해당작용을 이용하는지 여부를 측정할 수 있다. FDG-PET스캔 기술은 검출용 표지로서 고수준의 글루코스 흡수를 이용한다. 검출가능한 글루코스 유도체 18-플루오로-2-데옥시글루코스를 흡수하는 암 세포는 환자 신체의 컴퓨터 이미지 상에 위치할 수 있다. FDG-PET스캔 기술에 의해 검출될 수 있는 상기 암은 해당작용에 의존성일 가능성이 크다.
어구 "치료적 유효량"은 (i) 특정 질환, 상태 또는 장애를 치료하거나, (ii) 특정 질환, 상태 또는 장애의 하나 이상의 증상을 약화시키거나 호전시키거나 제거하거나, 또는 (iii) 본원에 기재된 특정 질환, 상태 또는 장애의 하나 이상의 증상의 발생을 예방하거나 지연시키는 본 발명의 화합물의 양을 의미한다. 암의 경우, 치료적 유효량의 약물은 암 세포의 수를 감소시키고/거나, 종양 크기를 감소시키고/거나, 말초 기관으로의 암 세포 침윤을 억제하고/거나 (즉, 어느 정도 지연시키고/거나 정지시킴), 종양 전이를 억제하고/거나 (즉, 어느 정도 지연시키고/거나 정지시킴), 종양 성장을 어느 정도 억제하고/거나, 암과 연관된 증상 중 하나 이상을 어느 정도 경감시킬 수 있다. 약물은, 존재하는 암 세포의 성장을 방지하고/거나 존재하는 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도까지 세포증식억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 요법의 경우, 효능은 예를 들어 질환 진행까지의 시간 (TTP)을 평가하고/하거나 반응률 (RR)을 결정하여 측정될 수 있다.
용어 "포유동물"은 인간, 마우스, 래트, 기니아 피그, 원숭이, 개, 고양이, 말, 소, 돼지 및 양, 및 가금류를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 어구 "제약상 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 제약상 허용되는 유기 또는 무기 염을 지칭한다. 예시적인 염은 술페이트, 시트레이트, 아세테이트, 옥살레이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 니트레이트, 비술페이트, 포스페이트, 산 포스페이트, 이소니코티네이트, 락테이트, 살리실레이트, 산 시트레이트, 타르트레이트, 올레에이트, 탄네이트, 판토테네이트, 비타르트레이트, 아스코르베이트, 숙시네이트, 말레에이트, 젠티시네이트, 푸마레이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 사카레이트, 포르메이트, 벤조에이트, 글루타메이트, 메탄술포네이트 "메실레이트", 에탄술포네이트, 벤젠술포네이트, p-톨루엔술포네이트 및 파모에이트 (즉, 1,1'-메틸렌-비스-(2-히드록시-3-나프토에이트)) 염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 제약상 허용되는 염은 또다른 분자, 예컨대 아세테이트 이온, 숙시네이트 이온 또는 다른 반대이온의 내포를 포함할 수 있다. 반대이온은 모 화합물의 전하를 안정화시키는 임의의 유기 또는 무기 잔기일 수 있다. 추가로, 제약상 허용되는 염은 그의 구조 내에 1개 초과의 하전된 원자를 가질 수 있다. 여러 개의 하전된 원자가 제약상 허용되는 염의 일부인 경우에는 다수 개의 반대이온을 가질 수 있다. 따라서, 제약상 허용되는 염은 하나 이상의 하전된 원자 및/또는 하나 이상의 반대이온을 가질 수 있다.
본 발명의 화합물이 염기인 경우, 원하는 제약상 허용되는 염은 당업계에서 이용가능한 임의의 적합한 방법, 예를 들어 유리 염기를 무기 산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 메탄술폰산, 인산 등으로 처리하거나 또는 유기 산, 예를 들어 아세트산, 말레산, 숙신산, 만델산, 푸마르산, 말론산, 피루브산, 옥살산, 글리콜산, 살리실산, 피라노시딜산, 예컨대 글루쿠론산 또는 갈락투론산, 알파 히드록시산, 예를 들어 시트르산 또는 타르타르산, 아미노산, 예를 들어 아스파르트산 또는 글루탐산, 방향족 산, 예컨대 벤조산 또는 신남산, 술폰산, 예를 들어 p-톨루엔술폰산 또는 에탄술폰산 등으로 처리하여 제조될 수 있다. 염기성 제약 화합물로부터 제약상 유용하거나 허용되는 염을 형성시키는 데에 적합한 것으로 일반적으로 간주되는 산은, 예를 들어 문헌 [P. Stahl et al., Camille G. (eds.) Handbook of Pharmaceutical Salts. Properties, Selection and Use. (2002) Zurich: Wiley-VCH]; [S. Berge et al., Journal of Pharmaceutical Sciences (1977) 66(1) 1 19]; [P. Gould, International J. of Pharmaceutics (1986) 33 201 217]; [Anderson et al., The Practice of Medicinal Chemistry (1996), Academic Press, New York]; [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., (1995) Mack Publishing Co., Easton PA]; 및 [The Orange Book] (푸드 & 드러그 어드미니스트레이션 (Food & Drug Administration, 미국 워싱턴 디.씨. 소재)의 웹사이트 상)에 논의되어 있다. 이들 개시내용은 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 화합물이 산인 경우, 원하는 제약상 허용되는 염은 임의의 적합한 방법, 예를 들어 유리 산을 무기 또는 유기 염기, 예를 들어 아민 (1급, 2급 또는 3급), 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리성 토금속 수산화물 등으로 처리하여 제조될 수 있다. 적합한 염의 설명적 예는 아미노산, 예컨대 글리신 및 아르기닌, 암모니아, 1급, 2급 및 3급 아민, 및 시클릭 아민, 예컨대 피페리딘, 모르폴린 및 피페라진으로부터 유래된 유기 염; 및 나트륨, 칼슘, 칼륨, 마그네슘, 망간, 철, 구리, 아연, 알루미늄 및 리튬으로부터 유래된 무기 염을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
어구 "제약상 허용되는"은, 해당 물질 또는 조성물이 제제에 포함된 다른 성분들 및/또는 이것으로 치료할 포유동물과 화학적 및/또는 독성학적으로 상용가능하다는 것을 나타낸다.
어구 "실질적으로 상응하는"은 공지된 또는 표적 서열로부터 중요하지 않은 변형을 갖는 서열을 의미한다. 한 예에서, 서열은 공지된 또는 표적 서열과 약 80％ 상동성을 갖는다. 또다른 예에서, 서열은 85％ 상동성을 갖는다. 또다른 예에서, 서열은 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 그 초과 ％ 상동성을 갖는다. ％ 상동성의 측정 방법이 당업계에 공지되어 있다.
"용매화물"은 1개 이상의 용매 분자와 본 발명의 화합물의 물리적 회합체 또는 복합체를 지칭한다. 본 발명의 화합물은 비용매화된 형태뿐만 아니라, 용매화된 형태로도 존재할 수 있다. 용매화물을 형성하는 용매의 예는 물, 이소프로판올, 에탄올, 메탄올, DMSO, 에틸 아세테이트, 아세트산 및 에탄올아민을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 용어 "수화물"은 용매 분자가 물인 복합체를 지칭한다. 이러한 물리적 회합체는 다양한 정도의 이온성 및 공유 결합, 예를 들어 수소 결합을 포함한다. 특정한 경우에, 용매화물은, 예를 들어 하나 이상의 용매 분자를 결정성 고체의 결정 격자에 혼입시킨 경우에 단리될 수 있을 것이다. 용매화물의 제조는 일반적으로, 예를 들어 문헌 [참고: M. Caira et al., J. Pharmaceutical Sci., 93(3), 601 611 (2004)]에 공지되어 있다. 용매화물, 반용매화물, 수화물 등의 유사한 제조 방법이 문헌 [E. C. van Tonder et al., AAPS PharmSciTech., 5(1), article 12 (2004)]; 및 [A. L. Bingham et al., Chem. Commun., 603 604 (2001)]에 기재되어 있다. 전형적인 비제한적 공정은 본 발명의 화합물을 주위 온도보다 고온에서 목적 량의 목적 용매(유기 또는 물 또는 그의 혼합물)에 용해시키고, 결정을 형성시키기에 충분한 속도로 상기 용액을 냉각시킨 다음 표준 방법에 의해 단리시키는 것을 포함한다. 예를 들어, I.R. 분광법과 같은 분석 기술은 용매 (또는 물)가 결정 내에 용매화물 (또는 수화물)로서 존재한다는 것을 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "상승작용적"은 둘 이상의 단일 제제의 부가 효과보다 더 효과적인 치료적 조합을 지칭한다. 자식증을 유도하는 키나제 억제제와 1개 이상의 자식증 억제제 사이의 상승작용적 상호작용의 측정은 본원에 기재된 검정으로부터 수득되는 결과에 기초할 수 있다. 상승작용적 효과는 (1) 활성 성분들이 동시 제제화되어 투여되거나 조합된 단위 투여 제제 중에서 동시에 전달되는 경우, (2) 활성 성분들이 별도의 제제로서 교대로 전달되거나 병행하여 전달되는 경우, 또는 (3) 활성 성분들이 일부 다른 요법에 의해 전달되는 경우에 달성될 수 있다. 교대 요법으로 전달한 경우에는, 화합물을, 예를 들어 별도의 주사기로 상이한 주사제에 의해 순차적으로 투여 또는 전달한 경우에 상승작용적 효과를 수득할 수 있다. 일반적으로, 교대 요법 동안에는 유효 투여량의 각각의 활성 성분이 순차적으로, 즉 연속적으로 투여되지만, 조합 요법에서는 유효 투여량의 2종 이상의 활성 성분이 함께 투여된다. 본 발명에서 제공된 조합물을 평가하였고, 그 데이터는 상승작용, 부가작용 및 길항작용을 정량화하기 위한 표준 프로그램을 이용하여 분석할 수 있었다. 상승작용을 계산하기 위해 사용되는 프로그램의 예는 문헌 [Chou and Talalay, in "New Avenues in Developmental Cancer Chemotherapy," Academic Press, 1987, Chapter 2]에 기재된 것이다.
본원에서 사용된 "자식증 억제제"는 그의 부재 하에 자식증에 걸린 세포의 자식증 수준과 비교하여, 그의 존재 하에 자식증에 걸린 세포의 자식증 수준을 감소시키는 조성물을 지칭하는 것으로 의도된다. 자식증은 세포질 물질 및 세포소기관의 벌크 라이소좀 분해 및 재순환시키는 이화 과정이고, 이는 세포질에서의 자식증 액포의 출현을 특징으로 하며, 라이소좀 구획에서의 세포질 세포소기관 및 다른 구성물의 자가 소화를 초래한다. 자식증은 그의 한계에 도달하게 되는 경우 궁극적으로 세포 사멸할 수 있는 반면, 자식증은 스트레스 조건 하에서 세포에게 일시적인 생존 메커니즘을 제공할 수 있고, 그러나 또한 특정 상황 하에 세포가 몇몇 형태의 세포 사멸에 취약하도록 만들 수 있다. 자식증의 억제는 사용되는 조건 및 제제에 따라 세포 사멸을 촉진하거나 억제할 수 있다 (문헌 [Amaravadi, R.K., D. Yu, J.J. Lum, T. Bui, M.A. Christophorou, G.I. Evan, A. Thomas-Tikhonenko, and C.B. Thompson, (2007), Autophagy inhibition enhances therapy-induced apoptosis in a Myc-induced model of lymphoma. J Clin Invest. 117:326-336]; [Kroemer, G., and M. Jaattela. 2005. Lysosomes and autophagy in cell death control. Nat Rev Cancer. 5:886-97]; [Levine, B., and J. Yuan, (2005), Autophagy in cell death: an innocent convict. J Clin Invest. 115:2679-2688]; [Lockshin, R.A., and Z. Zakeri, (2004), Apoptosis, autophagy, and more. Int J Biochem Cell Biol. 36:2405-19]). 자식증은 별개의 기를 갖는 이화 과정이다. 이들은 유도, 격리, 융합 및 분해 기를 포함한다. 자식증 억제제는 1개 이상의 기를 억제할 수 있다. 한 실시양태에서, 자식증 억제제는 늦은 단계의 자식증을 억제한다. 한 예에서, 자식증 억제제는 격리, 융합 및 분해 기의 자식증을 억제한다. 한 예에서, 자식증 억제제는 융합 및 분해 기의 자식증을 억제한다. 한 예에서, 자식증 억제제는 분해 기의 자식증을 억제한다. 유용한 자식증 억제제는 siRNA; 안티센스 RNA; LAMP2, LAMP1 또는 자식증 (Atg) 유전자 (예를 들어, Atg1, Atg4, Atg8, Atg5, Atg7 또는 Atg12)의 발현 또는 기능을 억제하는 제제; 3-메틸아데닌; 또한 항기생충성일 수 있는 라이소좀자극제, 예를 들어 클로로퀸, 히드록시클로로퀸 또는 수라민, 공포 양성자-에이티피아제(ATPase) 억제제, 예를 들어 바필로마이신 A1, 순환계에서 작용하는 제제, 예를 들어 아미오다론 또는 페르헥실렌, 세포독성제, 예를 들어 빈블라스틴, 지질 대사에 영향을 미치는 제제, 항생제, 예를 들어 모넨신, 또는 호르몬, 예를 들어 글루카곤 또는 에스트라디올, 라이소좀자극제, 예를 들어 암모늄 클로라이드, cAMP 또는 메틸아민, 에이티피아제 억제제, 프로테아제 억제제, 라이소좀 프로테아제 억제제, 예를 들어 카텝신 억제제 및 카텝신 녹다운, 및 또한 LAMP 녹다운, 예를 들어 LAMP1 및 LAMP2를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 신생물을 위한 조합 요법을 제공하기 위해, 라이소좀 활성 조절제는 자식증을 유도하는 키나제 억제제와 조합될 수 있다. 라이소좀은 소화 효소 (산성 히드로라아제)를 함유하는 세포소기관이다. 상기 효소는 리파아제 (지질을 소화시킴), 카르보히드라제 (카르보히드레이트 (예를 들어, 당)를 소화시킴), 프로테아제 (단백질을 소화시킴), 뉴클레아제 (핵산을 소화시킴) 및 인산 모노에스테르를 포함한다. 한 예에서, 조절제는 라이소좀 활성을 억제하도록 작용한다. 한 실시양태에서, 조합물은 상승작용적 효과를 제공한다.
키나제 억제제
수 백의 키나제가 존재하지만, 또한 모든 키나제 억제제가 자식증을 유도하지는 않는다. 예를 들어, bRaf 및 MEK 키나제의 억제제는 자식증을 유도하지 않는다. 한 예에서, MEK 억제제 (R)-N-(2,3-디히드록시프로폭시)-3,4-디플루오로-2-(2-플루오로-4-요오도페닐아미노)벤즈아미드 (VII)는 자식증의 증가를 유도하지 않는다. 또다른 예에서, CQ는 화합물 VII과 조합되는 경우 암 세포 (예를 들어, 흑색종 및 유방암)에서 아폽토시스를 유도하지 않는다. 키나제 억제제가 또한 자식증을 유도하는지의 여부를 결정하는 검정이 본원에 기재된다. 자식증을 유도하는 키나제의 억제제는 Akt (예를 들어, Akt-1, Akt-2 및 Akt-3), PI3K, mTOR, PDK1 및 p70S6K의 억제제를 포함한다. Akt 키나제 억제제는 팬(pan)-Akt 억제제, 알로스테리 Akt 억제제, 또는 Akt-1, Akt-2 또는 Akt-3의 선택적 억제제일 수 있다.
한 실시양태에서, Akt 키나제 억제제는 하기 화학식 I의 화합물, 및 그의 호변이성질체, 분할된 거울상이성질체, 분할된 부분입체이성질체, 용매화물 및 염이다.
<화학식 I>
Figure pct00001
상기 식에서,
R1은 H, Me, Et 및 CF3이고;
R2는 H 또는 Me이고; R5는 H 또는 Me이고;
A는
Figure pct00002
이고;
여기서, G는 1 내지 4개의 R9 기에 의해 임의로 치환된 페닐, 또는 할로겐에 의해 임의로 치환된 5-6원 헤테로아릴이고;
R6 및 R7은 독립적으로 H, OCH3, (C3-C6 시클로알킬)-(CH2), (C3-C6 시클로알킬)-(CH2CH2), V-(CH2)0-1이고, 여기서 V는 5-6원 헤테로아릴, W-(CH2)1-2이고, 여기서 W는 F, Cl, Br, I, OMe, CF3 또는 Me로 임의로 치환된 페닐; C1-C3 알킬 또는 O(C1-C3 알킬)로 임의로 치환된 C3-C6-시클로알킬; 히드록시-(C3-C6-시클로알킬); 플루오로-(C3-C6-시클로알킬); CH(CH3)CH(OH)페닐; F, OH, C1-C3 알킬, 시클로프로필메틸 또는 C(=O)(C1-C3 알킬)로 임의로 치환된 4-6원 헤테로사이클; 또는 OH, 옥소, O(C1-C6-알킬), CN, F, NH2, NH(C1-C6-알킬), N(C1-C6-알킬)2, 시클로프로필, 페닐, 이미다졸릴, 피페리디닐, 피롤리디닐, 모르폴리닐, 테트라히드로푸라닐, 옥세타닐 또는 테트라히드로피라닐로부터 독립적으로 선택된 1개 이상의 기로 임의로 치환된 C1-C6-알킬이거나, 또는 R6 및 R7은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 OH, 할로겐, 옥소, CF3, CH2CF3, CH2CH2OH, O(C1-C3 알킬), C(=O)CH3, NH2, NHMe, N(Me)2, S(O)2CH3, 시클로프로필메틸 및 C1-C3 알킬로부터 독립적으로 선택된 1개 이상의 기로 임의로 치환된 4-7원 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
Ra 및 Rb는 H이거나, 또는 Ra는 H이고, Rb 및 R6은 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 1 또는 2개의 고리 질소 원자를 갖는 5-6원 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
Rc 및 Rd는 H 또는 Me이거나, 또는 Rc 및 Rd는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 시클로프로필 고리를 형성하고;
R8은 H, Me, F 또는 OH이거나, 또는 R8 및 R6은 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 1 또는 2개의 고리 질소 원자를 갖는 5-6원 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
각각의 R9는 독립적으로 할로겐, C1-C6-알킬, C3-C6-시클로알킬, O-(C1-C6-알킬), CF3, OCF3, S(C1-C6-알킬), CN, OCH2-페닐, CH2O-페닐, NH2, NH-(C1-C6-알킬), N-(C1-C6-알킬)2, 피페리딘, 피롤리딘, CH2F, CHF2, OCH2F, OCHF2, OH, SO2(C1-C6-알킬), C(O)NH2, C(O)NH(C1-C6-알킬) 및 C(O)N(C1-C6-알킬)2이고;
R10은 H 또는 Me이고;
m, n 및 p는 독립적으로 0 또는 1이다.
또다른 실시양태는 R1이 메틸이고; R2, R5 및 R10이 H이고; G가 1 내지 3개의 R9로 임의로 치환된 페닐이고; R9가 할로겐, C1-C3 알킬, NC, CF3, OCF3 OCH3 또는 OCH2페닐이고; Rc 및 Rd가 H 또는 메틸이고; m, n 및 p가 0 또는 1이고; R8이 H 또는 메틸인 화학식 I의 Akt 억제제를 포함한다.
또다른 실시양태는 화합물
Figure pct00003
Figure pct00004
을 비롯한 화학식 I의 Akt 억제제를 포함한다.
화학식 I의 화합물의 제조
화학식 I의 화합물은 2007년 7월 5일자로 출원된 발명의 명칭 "Hydroxylated and Methoxylated Pyrimidyl Cyclopentanes as Akt Protein Kinase Inhibitors"의 미국 특허 출원 일련 번호 11/773,949에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있으며, 이는 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
화학식 I의 화합물은 단독으로, 또는 적어도 2종, 예를 들어 5 내지 1,000종의 화합물, 또는 10 내지 100종의 화합물을 포함하는 화합물 라이브러리로서 제조될 수 있다. 화학식 I의 화합물의 라이브러리는 조합적인 '분리 및 혼합' 접근법 또는 다중 병행 합성법 의해, 용액상 또는 고체상 화학을 이용하여 제조할 수 있다.
예시적 목적을 위해, 반응식 1 내지 4는 화학식 I의 화합물뿐만 아니라 핵심 중간체를 제조하는 일반적인 방법을 보여준다. 당업자는 다른 합성 경로를 이용할 수 있음을 인지할 것이다. 구체적인 출발 물질 및 시약이 반응식에 도시되고 하기 논의되어 있지만, 다른 출발 물질 및 시약으로 쉽게 대체하여 다양한 유도체 및/또는 반응 조건을 제공할 수 있다. 추가로, 하기 기재된 방법으로 제조된 많은 화합물이 당업자에게 널리 공지된 통상적인 화학을 이용하여 본 개시내용에 비추어 추가로 변형될 수 있다.
<반응식 1>
Figure pct00005
반응식 1은, R1이 H이고, R2가 OH이고, R5가 H인 화학식 I의 화합물 10의 제조 방법을 나타낸다. 피리미딘 2의 형성은, 케토 에스테르 1을 에탄올과 같은 적절한 용매 중에서 KOH와 같은 염기의 존재 하에 티오우레아와 반응시킴으로써 달성될 수 있다. 표준 환원 조건 (예를 들어, 라니 Ni 및 NH4OH) 하에 화합물 2의 메르캅토 기를 환원시켜 화합물 3을 수득한 후, 히드록시피리미딘 3을 표준 조건 (예를 들어, DIEA/DCE 중 POCl3) 하에 염소화시켜 화합물 4를 수득할 수 있다. 이어서, 화합물 4를 표준 조건 (예를 들어, CHCl3과 같은 적절한 용매 중 MCPBA) 하에 산화시켜 피리미딘-옥시드 5를 수득한다. 피리미딘-옥시드를 아세트산 무수물로 처리하여 재배열 생성물 6을 수득한다. 화합물 7은, 화합물 6을 표준 SNAr 반응 조건 하에 적절하게 치환된 피페리딘과 반응시켜 화합물 7을 수득함으로써 얻어진다. 화합물 7을 가수분해하여 화합물 8을 수득한 후, 이를 탈보호시켜 중간체 9를 수득한다. 피페라지닐 시클로펜타[d]피리미딘 9를 HBTU와 같은 커플링 시약의 존재 하에 적절한 아미노산으로 아실화한 후에 필요한 경우 탈보호하여 화학식 I의 화합물 10을 수득한다.
<반응식 2>
Figure pct00006
반응식 2는, R1, R2 및 R5가 메틸인 화학식 I의 화합물 22, 25 및 27을 제조하는 방법을 나타낸다. 반응식 2에 따라, (+)-풀레곤 11을 브로민으로 브로민화시켜 디브로마이드 12를 수득한다. 디브로마이드 12를 염기, 예컨대 나트륨 에톡시드로 처리하여 풀레게네이트 13을 수득한다. 풀레게네이트 13의 오존분해에 의해 케토에스테르 14를 수득한다. 에탄올 중에서 KOH와 같은 염기의 존재 하에 케토 에스테르 14를 티오우레아로 처리한 후, 표준 조건 (예를 들어, 암모니아 중 라니 Ni 촉매) 하에 메르캅토 기를 환원시켜 히드록시피리미딘 16을 수득한다. 히드록시피리미딘 16을 표준 조건 (예를 들어, POCl3) 하에 염소화시켜 4-클로로피리미딘 17을 수득한다. 4-클로로피리미딘 17을 MCPBA 또는 과산화수소와 같은 산화제로 산화시켜 N-옥시드 18을 수득한다. N-옥시드 18을 아세트산 무수물로 재배열하여 중간체 19를 수득한다. 화합물 19를 반응식 1에 기재된 절차에 따라 바람직한 피페라진과 반응시켜, R5가 H인 화합물 20 및 R5가 Me인 화합물 23을 수득한다. 화합물 20 및 23을 키랄 정지 상을 사용하는 HPLC를 이용하여 키랄 분리한 후, 수산화리튬과 같은 염기로 처리하여 가수분해함으로써 각각 화합물 21 및 24를 수득한다. 탈보호한 후, 화합물 21 및 24를 적절한 아미노산과 반응시켜 각각 화합물 22 및 25를 수득한다.
대안적으로, 화합물 24의 7-히드록시 기를 NaH 또는 KOH와 같은 염기의 존재 하에 알킬 할라이드와 같은 알킬화 시약으로 알킬화시켜 R2가 Me인 화합물 26을 수득할 수 있다. 탈보호한 후, 화합물 26을 적절한 아미노산과 반응시켜 화합물 27을 수득한다.
<반응식 3>
Figure pct00007
반응식 3은 화합물 73 및 74의 대안적 제조 방법을 나타낸다. 반응식 3에 따라, 암모니아 합성단위체를 사용하여 14를 아민화함으로써 63을 수득한다. 50℃ 내지 250℃ 및/또는 고압에서 포름아미드의 존재 하에, 예를 들어 암모늄 포르메이트를 사용하여 피리미딘을 형성하여 비시클릭 단위 64를 수득한다. 예를 들어, POCl3 또는 SOCl2를 사용하여 64를 활성화시켜 활성화 피리미딘 65를 수득한다. 0℃ 내지 150℃에서 적합한 보호된/치환된 피페리딘을 사용하여 상기 이탈기를 대체하여 피페리딘 66을 수득한다. -20℃ 내지 50℃에서, 예를 들어 m-클로로퍼옥시벤조산 ("MCPBA" 또는 "m-CPBA") 또는 옥손(Oxone)®을 사용하여 산화시켜 N-옥시드 67을 수득한다. 아실화제 (예를 들어, 아세트산 무수물)로 처리한 후에 가열하여 (40℃에서 200℃) 재배열을 유발함으로써 화합물 68을 수득한다. 0℃ 내지 50℃에서 예를 들어 LiOH 또는 NaOH를 이용한 가수분해에 의해 알콜 69를 수득한다. 적절한 온도에서, 예를 들어 스원(Swern) 조건, MnO4 또는 피리딘-SO3 복합체를 이용한 산화에 의해 케톤 70을 수득한다. 예를 들어, 촉매성 키랄 촉매 (수소의 존재 하에), CBS 촉매 또는 보로히드라이드 환원제 (키랄 리간드의 존재 하에)를 사용한 비대칭 환원에 의해 (R) 또는 (S) 입체화학의 알콜 71 또는 72를 생성시킨다. 대안적으로, 비-키랄 환원제 (예를 들어, H2, Pd/C)를 사용하여, 시클로펜탄 단위 상의 메틸 기가 평면 선택성 및 궁극적으로는 부분입체선택성을 제공하도록 할 수 있다. 상기 환원이 낮은 부분입체선택성을 제공하는 경우, (예를 들어) 크로마토그래피, 결정화 또는 유도체화에 의해 부분입체이성질체를 분리할 수 있다. 최종적으로, 0℃ 내지 50℃에서, 예를 들어 산을 사용하여 Boc-기를 탈보호하고, 적절하게 관능화된 아미노산을 사용하여 아실화하고, 이 아미노산의 아민을 최종적으로 관능화시켜 (예를 들어, 임의의 보호기의 제거, 알킬화, 환원성 아민화 또는 아실화에 의해 새로운 치환기를 도입시킴) 최종 화합물 73 및 74를 수득한다.
<반응식 4>
Figure pct00008
표준 아실화 절차에 의해 화합물 (1)에 키랄 보조제 (예를 들어 에반스 옥사졸리디논 등)를 도입하여 접합체 (2)를 수득할 수 있다. 예를 들어, 아민 염기의 존재 하에 -20℃ 내지 100℃에서, 산의 활성화제 (예를 들어 COCl2)로의 처리 또는 혼합 무수물 형성 (예를 들어 2,2-디메틸프로파노일 클로라이드), 이어서 적절한 키랄 보조제 X로의 처리로 화합물 (2)를 수득한다. 키랄 보조제의 입체화학 및 선택은 새롭게 생성된 키랄 중심 및 부분입체선택성의 입체화학을 결정할 수 있다. 화합물 (2)를 저온 (예를 들어 -20℃ 내지 -100℃)에서 루이스 산 (예를 들어 TiCl4)으로 처리하고 아민 염기 (예를 들어 휘니그 염기)로 처리한 후, 저온에서 적절하게 치환된 이미늄 이온 전구체 (3)을 이용하여 화합물 (4)를 생성시킨다. 온도, 루이스 산 및 키랄 보조제가 모두 추가 부가물의 부분입체선택성에 영향을 미칠 것으로 예상할 수 있다. 최종적으로, 온화한 조건 (예를 들어 -10℃ 내지 30℃에서 LiOH/H2O) 하의 비누화로 목적 산 (5)를 생성시킨다.
또다른 실시양태에서, 키나제 억제제는 하기 화학식의 Akt 억제제, 또는 그의 입체이성질체, 호변이성질체 또는 제약상 허용되는 염이다.
Figure pct00009
상기 식에서,
G는 1 내지 3개의 Ra 기로 임의로 치환된 페닐 또는 할로겐에 의해 임의로 치환된 5-6원 헤테로아릴이고;
R1 및 R1a는 독립적으로 H, Me, CF3, CHF2 또는 CH2F 으로부터 선택되고;
R2는 H, F 또는 -OH이고;
R2a는 H이고;
R3은 H이고;
R4는 H, 또는 F, -OH 또는 -O(C1-C3 알킬)로 임의로 치환된 C1-C4 알킬이고;
R5 및 R5a는 독립적으로 H 및 C1-C4 알킬로부터 선택되거나, 또는 R5 및 R5a는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 5-6원 시클로알킬 또는 5-6원 헤테로사이클 (여기서, 헤테로사이클은 산소 헤테로원자를 가짐)을 형성하고;
각각의 Ra는 독립적으로 할로겐, C1-C6-알킬, C3-C6-시클로알킬, -O-(C1-C6-알킬), CF3, -OCF3, S(C1-C6-알킬), CN, -OCH2-페닐, NH2, -NO2, -NH-(C1-C6-알킬), -N-(C1-C6-알킬)2, 피페리딘, 피롤리딘, CH2F, CHF2, -OCH2F, -OCHF2, -OH, -SO2(C1-C6-알킬), C(O)NH2, C(O)NH(C1-C6-알킬) 및 C(O)N(C1-C6-알킬)2이고;
j는 1 또는 2이다.
또다른 실시양태는
Figure pct00010
을 비롯한 Akt 억제제 화합물을 포함한다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 하기 화학식 II의 Akt 억제제 화합물이다.
<화학식 II>
Figure pct00011
상기 식에서, R1 및 R2는 독립적으로 수소, C1-C5 알킬, 히드록실, C1 -5 알콕시 또는 아민이고; p는 1 내지 6의 정수이고; A는 5-14개의 탄소 시클릭, 비시클릭 또는 트리시클릭 방향족 또는 헤테로방향족 고리이고, 이는 할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노, C1-C6-알킬 또는 페닐 (할로겐, OH, C1-C3 알킬 또는 시클로프로필메틸로 임의로 치환됨)로 임의로 치환될 수 있고; 한 실시양태에서 A는 하기 구조:
Figure pct00012
중 하나를 갖고;
여기서, D 및 E는 독립적으로 -CH 또는 N이고;
여기서, R3 및 R4는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노 또는 C1-C6-알킬 (할로겐, OH, C1-C3 알킬 또는 시클로프로필메틸로 임의로 치환됨)이고;
R5는 할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노 또는 C1-C6-알킬 (할로겐, OH, C1-C3 알킬 또는 시클로프로필메틸로 임의로 치환됨)로 임의로 치환된 5 또는 6원 방향족 또는 헤테로방향족 고리이고; 한 실시양태에서 R5는 페닐이고;
B는 화학식
Figure pct00013
을 갖는 방향족, 헤테로방향족, 시클릭 또는 헤테로시클릭 고리이고;
여기서, Q, T, X 및 Y는 각각 독립적으로 -CH, -CH2, C=O, N 또는 O로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Z는 -CH, -CH2, C=O, N, O 또는 -C=C-이고;
R6 및 R7은 독립적으로 수소, 할로겐, 카르보닐 및 5 또는 6원 방향족 또는 헤테로방향족 고리 (할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노 또는 C1-C6-알킬 (할로겐, OH, C1-C3 알킬 또는 시클로프로필메틸로 임의로 치환됨)로 임의로 치환됨)로 이루어진 군으로부터 선택되고; 한 실시양태에서, R6 또는 R7은 피리디닐이거나, 또는 R6 및 R7은 함께 5-6원 방향족, 헤테로방향족, 시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성하고, 이는 할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노 또는 C1-C6-알킬 (할로겐, OH, C1-C3 알킬 또는 시클로프로필메틸로 임의로 치환됨)로 임의로 치환될 수 있고; 한 실시양태에서, B는 하기 구조:
Figure pct00014
중 하나를 갖고,
여기서, X, Y, Q, R6 및 R7은 상기 기재된 바와 같고, X', Q' 및 T'는 -CH 또는 N이다.
또다른 실시양태에서, Akt 억제제는 하기 화학식을 갖는 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체를 포함한다.
Figure pct00015
상기 식에서, a는 0 또는 1이고; b는 0 또는 1이고; m은 0, 1 또는 2이고; n은 0, 1 또는 2이고; p는 0, 1 또는 2이고; r은 0 또는 1이고; s는 0 또는 1이고;
Q는 -NR7R8,
Figure pct00016
로부터 선택되고;
R1은 독립적으로 (C=O)aObC1-C6 알킬, (C=O)aOb아릴, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, (C=O)aOb헤테로시클릴, (C=O)aObC3-C6 시클로알킬, CO2H, 할로겐, CN, OH, ObC1-C6 퍼플루오로알킬, Oa(C=O)bNR7R8, NRc(C=O)NR7R8, S(O)mRa, S(O)2NR7R8, NRcS(O)mRa, 옥소, CHO, NO2, NRc(C=O)ObRa, O(C=O)ObC1-C6 알킬, O(C=O)ObC3-C6 시클로알킬, O(C=O)Ob아릴 및 O(C=O)Ob-헤테로사이클로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 아릴, 알케닐, 알키닐, 헤테로시클릴 및 시클로알킬은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
R2는 독립적으로 C1-C6 알킬, 아릴, 헤테로시클릴, CO2H, 할로, CN, OH 및 S(O)2NR7R8로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 아릴 및 헤테로시클릴은 Rz로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 임의로 치환되고;
R7 및 R8은 독립적으로 H, (C=O)ObC1-C10 알킬, (C=O)ObC3-C8 시클로알킬, (C=O)Ob아릴, (C=O)Ob헤테로시클릴, C1-C10 알킬, 아릴, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, 헤테로시클릴, C3-C8 시클로알킬, SO2Ra 및 (C=O)NRb 2로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 알케닐 및 알키닐은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되거나, 또는
R7 및 R8은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께, 각 고리 내에 5 내지 7개의 구성원을 가지며 상기 질소 이외에도 N, O 및 S로부터 선택된 1 또는 2개의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하는 모노시클릭 또는 비시클릭 헤테로사이클을 형성할 수 있고, 상기 모노시클릭 또는 비시클릭 헤테로사이클은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
Rz는 (C=O)rOs(C1-C10) 알킬, Or(C1-C3)퍼플루오로알킬, (C0-C6)알킬렌-S(O)mRa, 옥소, OH, 할로, CN, (C=O)rOs(C2-C10) 알케닐, (C=O)rOs(C2-C10) 알키닐, (C=O)rOs(C3-C6) 시클로알킬, (C=O)rOs(C0-C6) 알킬렌-아릴, (C=O)rOs(C0-C6) 알킬렌-헤테로시클릴, (C=O)rOs(C0-C6) 알킬렌-N(Rb)2, C(O)Ra, (C0-C6)알킬렌-CO2Ra, C(O)H, (C0-C6)알킬렌-CO2H, C(O)N(Rb)2, S(O)mRa, 및 S(O)2N(Rb)2, NRc(C=O)ObRa, O(C=O)ObC1-C10 알킬, O(C=O)ObC3-C8 시클로알킬, O(C=O)Ob아릴, 및 O(C=O)Ob-헤테로사이클로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴 및 헤테로시클릴은 Rb, OH, (C1-C6)알콕시, 할로겐, CO2H, CN, O(C=O)C1-C6 알킬, 옥소 및 N(Rb)2로부터 선택된 3개 이하의 치환기로 임의로 치환되고;
Ra는 (C1-C6)알킬, (C3-C6)시클로알킬, 아릴 또는 헤테로시클릴이고;
Rb는 H, (C1-C6)알킬, 아릴, 헤테로시클릴, (C3-C6)시클로알킬, (C=O)OC1-C6 알킬, (C=O)C1-C6 알킬 또는 S(O)2Ra이고;
Rc는 H, C1-C6 알킬, 아릴, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 헤테로시클릴, C3-C8 시클로알킬 및 C1-C6 퍼플루오로알킬로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 알케닐 및 알키닐은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
또다른 실시양태에서, Akt 억제제는 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체를 포함한다.
Figure pct00017
상기 식에서, a는 0 또는 1이고; b는 0 또는 1이고; m은 0, 1 또는 2이고; n은 0, 1, 2 또는 3이고; p는 0, 1 또는 2이고; r은 0 또는 1이고; s는 0 또는 1이고; u, v, w 및 x는 독립적으로 CH 및 N으로부터 선택되고, 단 u, v, w 및 x 중 1개만이 N일 수 있고;
Q는 -NR5R6,
Figure pct00018
로부터 선택되고;
R1은 독립적으로 (C=O)aObC1-C6 알킬, (C=O)aOb아릴, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, (C=O)aOb헤테로시클릴, (C=O)aObC3-C6 시클로알킬, CO2H, 할로겐, CN, OH, ObC1-C6 퍼플루오로알킬, Oa(C=O)bNR7R8, NRc(C=O)NR7R8, S(O)mRa, S(O)2NR7R8, NRcS(O)mRa, 옥소, CHO, NO2, NRc(C=O)ObRa, O(C=O)ObC1-C6 알킬, O(C=O)ObC3-C6 시클로알킬, O(C=O)Ob아릴 및 O(C=O)Ob-헤테로사이클로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 아릴, 알케닐, 알키닐, 헤테로시클릴 및 시클로알킬은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
R2는 독립적으로 C1-C6 알킬, 아릴, 헤테로시클릴, CO2H, 할로, CN, OH 및 S(O)2NR7R8로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 아릴 및 헤테로시클릴은 Rz로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 임의로 치환되고;
R7 및 R8은 독립적으로 H, (C=O)ObC1-C10 알킬, (C=O)ObC3-C8 시클로알킬, (C=O)Ob아릴, (C=O)Ob헤테로시클릴, C1-C10 알킬, 아릴, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, 헤테로시클릴, C3-C8 시클로알킬, SO2Ra 및 (C=O)NRb 2로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 알케닐 및 알키닐은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되거나, 또는
R7 및 R8은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께, 각 고리 내에 5 내지 7개의 구성원을 가지며 상기 질소 이외에도 N, O 및 S로부터 선택된 1 또는 2개의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하는 모노시클릭 또는 비시클릭 헤테로사이클을 형성할 수 있고, 상기 모노시클릭 또는 비시클릭 헤테로사이클은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
Rz는 (C=O)rOs(C1-C10) 알킬, Or(C1-C3)퍼플루오로알킬, (C0-C6)알킬렌-S(O)mRa, 옥소, OH, 할로, CN, (C=O)rOs(C2-C10) 알케닐, (C=O)rOs(C2-C10) 알키닐, (C=O)rOs(C3-C6) 시클로알킬, (C=O)rOs(C0-C6) 알킬렌-아릴, (C=O)rOs(C0-C6) 알킬렌-헤테로시클릴, (C=O)rOs(C0-C6) 알킬렌-N(Rb)2, C(O)Ra, (C0-C6)알킬렌-CO2Ra, C(O)H, (C0-C6)알킬렌-CO2H, C(O)N(Rb)2, S(O)mRa, 및 S(O)2N(Rb)2, NRc(C=O)ObRa, O(C=O)ObC1-C10 알킬, O(C=O)ObC3-C8 시클로알킬, O(C=O)Ob아릴, 및 O(C=O)Ob-헤테로사이클로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴 및 헤테로시클릴은 Rb, OH, (C1-C6)알콕시, 할로겐, CO2H, CN, O(C=O)C1-C6 알킬, 옥소 및 N(Rb)2로부터 선택된 3개 이하의 치환기로 임의로 치환되고;
Ra는 (C1-C6)알킬, (C3-C6)시클로알킬, 아릴 또는 헤테로시클릴이고;
Rb는 H, (C1-C6)알킬, 아릴, 헤테로시클릴, (C3-C6)시클로알킬, (C=O)OC1-C6 알킬, (C=O)C1-C6 알킬 또는 S(O)2Ra이고;
Rc는 H, C1-C6 알킬, 아릴, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 헤테로시클릴, C3-C8 시클로알킬 및 C1-C6 퍼플루오로알킬로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 알케닐 및 알키닐은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
또다른 실시양태에서, Akt 억제제는 하기 화학식의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 입체이성질체를 포함한다.
Figure pct00019
상기 식에서, a는 0 또는 1이고; b는 0 또는 1이고; m은 0, 1 또는 2이고; n은 0, 1, 2 또는 3이고; p는 0, 1 또는 2이고; r은 0 또는 1이고; s는 0 또는 1이고; u, v 및 x는 독립적으로 CH 및 N으로부터 선택되고; W는 결합, CH 또는 N이고;
Q는 -NR5R6,
Figure pct00020
로부터 선택되고;
R1은 독립적으로 (C=O)aObC1-C6 알킬, (C=O)aOb아릴, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, (C=O)aOb헤테로시클릴, (C=O)aObC3-C6 시클로알킬, CO2H, 할로겐, CN, OH, ObC1-C6 퍼플루오로알킬, Oa(C=O)bNR7R8, NRc(C=O)NR7R8, S(O)mRa, S(O)2NR7R8, NRcS(O)mRa, 옥소, CHO, NO2, NRc(C=O)ObRa, O(C=O)ObC1-C6 알킬, O(C=O)ObC3-C6 시클로알킬, O(C=O)Ob아릴 및 O(C=O)Ob-헤테로사이클로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 아릴, 알케닐, 알키닐, 헤테로시클릴 및 시클로알킬은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
R2는 독립적으로 C1-C6 알킬, 아릴, 헤테로시클릴, CO2H, 할로, CN, OH 및 S(O)2NR7R8로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 아릴 및 헤테로시클릴은 Rz로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 치환기로 임의로 치환되고;
R7 및 R8은 독립적으로 H, (C=O)ObC1-C10 알킬, (C=O)ObC3-C8 시클로알킬, (C=O)Ob아릴, (C=O)Ob헤테로시클릴, C1-C10 알킬, 아릴, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, 헤테로시클릴, C3-C8 시클로알킬, SO2Ra 및 (C=O)NRb 2로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 알케닐 및 알키닐은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되거나, 또는
R7 및 R8은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께, 각 고리 내에 5 내지 7개의 구성원을 가지며 상기 질소 이외에도 N, O 및 S로부터 선택된 1 또는 2개의 추가의 헤테로원자를 임의로 함유하는 모노시클릭 또는 비시클릭 헤테로사이클을 형성할 수 있고, 상기 모노시클릭 또는 비시클릭 헤테로사이클은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환되고;
Rz는 (C=O)rOs(C1-C10) 알킬, Or(C1-C3)퍼플루오로알킬, (C0-C6)알킬렌-S(O)mRa, 옥소, OH, 할로, CN, (C=O)rOs(C2-C10) 알케닐, (C=O)rOs(C2-C10) 알키닐, (C=O)rOs(C3-C6) 시클로알킬, (C=O)rOs(C0-C6) 알킬렌-아릴, (C=O)rOs(C0-C6) 알킬렌-헤테로시클릴, (C=O)rOs(C0-C6) 알킬렌-N(Rb)2, C(O)Ra, (C0-C6)알킬렌-CO2Ra, C(O)H, (C0-C6)알킬렌-CO2H, C(O)N(Rb)2, S(O)mRa, 및 S(O)2N(Rb)2, NRc(C=O)ObRa, O(C=O)ObC1-C10 알킬, O(C=O)ObC3-C8 시클로알킬, O(C=O)Ob아릴, 및 O(C=O)Ob-헤테로사이클로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 아릴 및 헤테로시클릴은 Rb, OH, (C1-C6)알콕시, 할로겐, CO2H, CN, O(C=O)C1-C6 알킬, 옥소 및 N(Rb)2로부터 선택된 3개 이하의 치환기로 임의로 치환되고;
Ra는 (C1-C6)알킬, (C3-C6)시클로알킬, 아릴 또는 헤테로시클릴이고;
Rb는 H, (C1-C6)알킬, 아릴, 헤테로시클릴, (C3-C6)시클로알킬, (C=O)OC1-C6 알킬, (C=O)C1-C6 알킬 또는 S(O)2Ra이고;
Rc는 H, C1-C6 알킬, 아릴, C2-C6 알케닐, C2-C6 알키닐, 헤테로시클릴, C3-C8 시클로알킬 및 C1-C6 퍼플루오로알킬로부터 선택되고, 여기서 상기 알킬, 시클로알킬, 아릴, 헤테로시클릴, 알케닐 및 알키닐은 Rz로부터 선택된 1개 이상의 치환기로 임의로 치환된다.
예시적인 Akt 억제제는 하기 화학식을 포함한다.
<화학식 II-1>
Figure pct00021
<화학식 II-4>
Figure pct00022
<화학식 II-2>
Figure pct00023
및
<화학식 II-3>
Figure pct00024
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 Akt-1 선택적 억제제이고, 하기 화학식 IV의 화합물이다.
<화학식 IV>
Figure pct00025
상기 식에서, A, B, D 및 E는 독립적으로 S, -CH, O 또는 N이고, 여기서 A, B, D 및 E에 따라, 화학식 IV에 제시된 고리는 방향족, 헤테로방향족, 시클릭 또는 헤테로시클릭일 수 있고;
p는 1 내지 6의 정수이고;
R15 및 R16은 독립적으로 수소, 할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노 및 C1-C6-알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Q는 5-6원 방향족 또는 헤테로방향족 고리이고; 한 실시양태에서 Q는 하기 구조:
Figure pct00026
이고,
상기 식에서, G 및 G'은 독립적으로 N, S 또는 -C=C-이고;
R' 및 R"은 이들이 부착되어 있는 N과 함께 취해져, 5, 6 또는 7원 헤테로시클릭 고리를 형성하고, 이는 할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노, C1-C6-알킬로 임의로 치환될 수 있고, 예를 들어 하기 구조를 가지고, 이는 G'에 따라 헤테로방향족 또는 헤테로시클릭일 수 있고, 이는 상기 열거된 치환기를 추가로 함유할 수 있고,
Figure pct00027
상기 식에서, G'은 상기 기재된 바와 같고,
J는 비치환된 또는 치환된 아미드이고;
R17은 5-14원 방향족 또는 헤테로방향족 고리계이고, 이는 임의로 치환될 수 있고; 한 실시양태에서 R17은 하기 구조:
Figure pct00028
중 하나를 가지며:
상기 식에서, X 및 Y는 독립적으로 N, O, S 또는 -CH이고;
R18, R19 및 R20은 독립적으로 할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노, C1-C6-알킬 또는 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이는 할로겐, OH, C1-C3 알킬 또는 시클로프로필메틸로 임의로 치환되거나; 또는 R18 및 R19는 함께 취해져 방향족, 헤테로방향족, 시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성한다.
화학식 IV의 화합물은 하기 화학식을 포함한다.
<화학식 IV-1>
Figure pct00029
및
<화학식 IV-2>
Figure pct00030
또다른 실시양태는 화학식
Figure pct00031
을 갖는 Akt 억제제, 예컨대 페리포신을 포함한다.
또다른 실시양태는 서열: 5' ccagcccccaccagtccact 3', 5' cgccaaggagatcatgcagc 3', 5' gctgcatgatctccttggcg 3', 5' agatagctggtgacagacag 3', 5' cgtggagagatcatctgagg 3', 5' tcgaaaaggtcaagtgctac 3', 5' tggtgcagcggcagcggcag 3' 및 5' ggcgcgagcgcgggcctagc 3'를 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 비롯한 올리고뉴클레오티드와 같은 Akt 억제제를 포함한다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 하기 화학식 III의 화합물이다. 한 예에서, 화학식 III의 화합물은 PI3-k 억제제를 포함한다. 또다른 예에서, 화학식 III의 화합물은 mTOR 억제제를 포함한다. 화학식 III의 화합물은 하기 화학식을 갖는다:
<화학식 III>
Figure pct00032
상기 식에서,
A, B, D 및 E는 독립적으로 -CH 또는 N이고;
R8 및 R9는 함께, 임의로 치환될 수 있는 5- 또는 6-원 방향족, 헤테로방향족, 시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성한다. 예를 들어, R8 및 R9는 이들이 부착되어 있는 화학식 III의 탄소와 함께, 9- 내지 10-원 비시클릭 고리계를 형성할 수 있다. 비시클릭 고리계의 실시양태는
Figure pct00033
이 화학식 III 고리의 결합을 나타내는 하기 구조:
Figure pct00034
를 포함하고;
여기서, R11 및 R12는 수소, 할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노, C1-C6-알킬, -C(=O)O-(CRyRz)n-W 또는 페닐 (할로겐, OH, C1-C3 알킬 또는 시클로프로필메틸로 임의로 치환됨)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며, 여기서 W는 C5 -12 아릴 또는 헤테로아릴이고, Ry 및 Rz는 독립적으로 수소, 할로겐, -OH 또는 C1 -6 알킬이거나; 또는 R11 및 R12는 함께, 5- 내지 14-원 방향족 또는 헤테로방향족 고리를 형성한다. 예를 들어, R11 및 R12는 이들이 부착되어 있는 탄소 및 상기 화학식 III의 고리와 함께, 12- 내지 14-원 트리시클릭 고리계를 형성할 수 있으며, 한 실시양태에서 화학식
Figure pct00035
을 가지고;
R' 및 R"는 이들이 결합된 N과 함께, 하기 구조:
Figure pct00036
(여기서, G 및 G'는 독립적으로 C, O 또는 N임) 중 하나를 갖는 5-, 6- 또는 7-원 헤테로시클릭 고리 (할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노, C1-C6-알킬로 임의로 치환될 수 있음)를 형성하며, 상기 기재된 치환체를 추가로 함유할 수 있고;
R10은 하기 구조:
Figure pct00037
을 갖는 방향족 또는 헤테로방향족 고리이고;
여기서, X, Y, Z 및 Z'는 독립적으로 -CH 또는 N이고;
R13은 수소, 할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노, C1-C6-알킬 또는 -N-(C=O)-N-R14 (여기서, R14는 C1-C6-알킬임)이다. R10의 한 예는
Figure pct00038
(여기서, J는 -N-(C=O)-N-이고, R14는 C1-C6-알킬임)이다.
화학식 III의 화합물의 한 예는 하기 화학식 III-5의 PI3-k 억제제를 포함한다:
<화학식 III-5>
Figure pct00039
.
또다른 실시양태는 하기 화학식을 갖는 mTOR 억제제, 그의 입체이성질체, 호변이성질체 또는 제약상 허용되는 염을 포함한다:
Figure pct00040
상기 식에서,
A는 모르폴린-4-일, 3,4-디히르도-2H-피란-4-일, 3,6-디히르도-2H-피란-4-일, 테트라히드로-2H-피란-4-일, 1,4-옥사제판-4-일, 피페리딘-1-일로 이루어진 군으로부터 선택된 고리이고, -C(O)ORa, -C(O)NRaRb, -NRaRb, -ORa, -SRa, -S(O)2Rc, -S(O)Rc, -Rc, 할로겐, -NO2, -CN 및 -N3으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 2개의 치환체로 임의로 치환되며, 여기서 Ra 및 Rb는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2-6 알케닐 및 C3 -6 시클로알킬로부터 각각 독립적으로 선택되거나 또는 Ra 및 Rb는 이들 각각이 부착되어 있는 질소와 함께 합쳐져, 3- 내지 6-원 고리를 형성하고, Rc는 C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C3 -6 시클로알킬로부터 선택되고;
R1 및 R2는 이들이 부착되어 있는 원자와 합쳐져, 임의로 치환된 피롤리딘, 피페리딘 또는 호모피페리딘 고리를 형성하며, 여기서 상기 피롤리딘, 피페리딘 또는 호모피페리딘 고리의 질소 원자는 하기 기:
Figure pct00041
에 의해 치환되고;
여기서, E는 수소, C6 -10 아릴, C5 -10 헤테로아릴, C3 -10 시클로알킬, C3 -10 헤테로시클로알킬, C1 -6 알킬 또는 C1 -6 헤테로알킬이고; E는 할로겐, C1 -6 알킬, -NRdRe, -SRd, -ORd, -C(O)ORd, -C(O)NRdRe, -C(O)Rd, -NRdC(O)Re, -OC(O)Rf, -NRdC(O)NRdRe, -OC(O)NRdRe, -C(=NORd)NRdRe, -NRdC(=N-CN)NRdRe, -NRdS(O)2NRdRe, -S(O)2Rd, -S(O)2NRdRe, -Rf, -NO2, -N3, =O, -CN, -(CH2)1-4-NRdRe, -(CH2)1-4-SRd, -(CH2)1-4-ORd, -(CH2)1-4-C(O)ORd, -(CH2)1-4-C(O)NRdRe, -(CH2)1-4-C(O)Rd, -(CH2)1-4-NRdC(O)Re, -(CH2)1-4-OC(O)Rf, -(CH2)1-4-NRdC(O)NRdRe, -(CH2)1-4-OC(O)NRdRe, -(CH2)1-4-C(=NORd)NRdRe, -(CH2)1-4-NRdC(=N-CN)NRdRe, -(CH2)1-4 NRdS(O)2NRdRe, -(CH2)1-4-S(O)2Rd, -(CH2)1-4-S(O)2NRdRe, -(CH2)1-4-NO2, -(CH2)1-4-N3 또는 -(CH2)1-4-CN으로부터 선택된 1 내지 5개의 치환체로 임의로 치환되며; 여기서 Rd 및 Re는 수소, C1-6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -7 시클로알킬, C3 -7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 각각 독립적으로 선택되거나 또는 Rd 및 Re는 동일한 질소 원자에 부착되어 있는 경우에 합쳐져, 3- 내지 6-원 고리를 형성하고; Rf는 C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -7 시클로알킬, C3 -7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 선택되고;
F는 C1 -6 알킬렌, C2 -6 알케닐렌, C2 -6 알키닐렌 및 C1 -6 헤테로알킬렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고; F는 할로겐, -NRgRh, -SRg, -ORg, -C(O)ORg, -C(O)NRgRh, -NRgC(O)Ri, -OC(O)Ri, -NRgC(O)NRgRh, -OC(O)NRgRh, -NRgS(O)2NRgRh, -S(O)2Rg, -S(O)2NRgRh, -Ri, -NO2, -N3, =O, -CN, -(CH2)1-4-NRgRh, -(CH2)1-4-SRg, -(CH2)1-4-ORg, -(CH2)1-4-C(O)ORg, -(CH2)1-4-C(O)NRgRh, -(CH2)1-4-C(O)Rg, -(CH2)1-4-NRgC(O)Rh, -(CH2)1-4-OC(O)Ri, -(CH2)1-4-NRgC(O)NRgRh, -(CH2)1-4-OC(O)NRgRh, -(CH2)1-4-NRgS(O)2NRgRh, -(CH2)1-4-S(O)2Rg, -(CH2)1-4-S(O)2NRgRh, -(CH2)1-4-NO2, -(CH2)1-4-N3 및 -(CH2)1-4-CN으로 이루어진 군으로부터 선택된 0 내지 3개의 치환체로 독립적으로 치환되며; 여기서 Rg 및 Rh는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C1 -6 헤테로알킬, C3 -7 시클로알킬, C3 -7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 각각 독립적으로 선택되고, 임의로 Rg 및 Rh는 동일한 질소 원자에 부착되어 있는 경우에 합쳐져, 3- 내지 6-원 고리를 형성하고; Ri는 C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C3 -7 시클로알킬, C3 -7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 선택되고;
G는 -C(O)-, -OC(O)-, -NHC(O)-, -NHC(=NOH)-, -S(O)2- 및 -NHS(O)2-로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고;
m 및 p는 각각 독립적으로 0 내지 1의 정수이며, m 및 p 둘 다가 정수 0인 경우에, E는 C1 -6 알킬 또는 C1 -6 헤테로알킬이 아니고;
R1 및 R2가 합쳐져 형성된 피롤리딘, 피페리딘 또는 호모피페리딘 고리는 할로겐, -NRjRk, -SRj, -ORj, -C(O)ORj, -C(O)NRjRk, -NHC(O)Rj, -OC(O)Rj, -Rm, -CN 및 =O로 이루어진 군으로부터 선택된 0 내지 5개의 치환체로 추가로 치환되며, 여기서 Rj 및 Rk는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -5 시클로알킬 및 C3 -5 헤테로시클로알킬로부터 각각 독립적으로 선택되고, Rj 및 Rk는 동일한 질소 원자에 부착되어 있는 경우에 임의로 합쳐져, 3- 내지 6-원 고리를 형성하고; Rm은 C1-6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -5 시클로알킬 및 C3 -5 헤테로시클로알킬로부터 선택되고;
B는 페닐렌, 피리딜렌, 피리미딜렌, 피리다지닐렌 및 피라지닐린으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 할로겐, -CN, -N3, -NO2, -C(O)ORn, -C(O)NRnRo, -NRnC(O)Ro, -NRnC(O)NRnRo, -ORn, -NRnRo 및 Rp로부터 선택된 0 내지 4개의 치환체로 치환되며; 여기서 Rn 및 Ro는 수소 및 C1 -4 알킬, C1 -4 할로알킬, C1 -4 헤테로알킬, C3 -7 시클로알킬 및 C3 -7 헤테로시클로알킬로부터 독립적으로 선택되거나 또는 동일한 질소 원자에 부착되는 경우에 Rn 및 Ro는 임의로 합쳐져, 3- 내지 6-원 고리를 형성하고; Rp는 C1 -4 알킬, C1 -4 할로알킬, C3 -7 시클로알킬 및 C3 -7 헤테로시클로알킬이며, D 기를 포함하지 않으며 B의 인접 원자 상에 위치한 임의의 2개의 치환체는 임의로 합쳐져, 5- 내지 6-원 카르보시클릭, 헤테로시클릭, 아릴 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고;
D는 -NR3C(O)NR4R5, -NR4R5, -C(O)NR4R5, -OC(O)OR4, -OC(O)NR4R5, -NR3C(=N-CN)NR4R5, -NR3C(=N-OR4)NR4R5, -NR3C(=N-NR4)NR4R5, -NR3C(O)R4, -NR3C(O)OR4, -NR3S(O)2NR4R5 및 -NR3S(O)2R4로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이며, 여기서 R3은 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬 및 C2 -6 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되고; R4 및 R5는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -10 시클로알킬, C3 -10 헤테로시클로알킬, C6 -10 아릴 및 C5 -10 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고, R4 및 R5는 동일한 질소 원자에 부착되어 있는 경우에 임의로 합쳐져, 5- 내지 7-원 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고; R3, R4 및 R5는 할로겐, -NO2, -CN, -NRqRr, -ORq, -SRq, -C(O)ORq, -C(O)NRqRr, -NRqC(O)Rr, -NRqC(O)ORs, -(CH2)1-4-NRqRr, -(CH2)1-4-ORq, -(CH2)1-4-SRq, -(CH2)1-4-C(O)ORq, -(CH2)1-4-C(O)NRqRr, -(CH2)1-4-NRqC(O)Rr, -(CH2)1-4-NRqC(O)ORr, -(CH2)1-4-CN, -(CH2)1-4-NO2, -S(O)Rr, -S(O)2Rr, =O 및 -Rs로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 3개의 치환체로 추가로 치환되며; 여기서 Rq 및 Rr은 수소, C1-6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C1 -6 헤테로알킬, C3 -7 시클로알킬, C3 -7 헤테로시클로알킬, C6 -10 아릴, C5 -10 헤테로아릴로부터 선택되고; Rs는 각각의 경우에 C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C1 -6 헤테로알킬, C3 -7 시클로알킬, C3 -7 헤테로시클로알킬, C6 -10 아릴 및 C5 -10 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되고; D 기 및 B 고리의 인접 원자 상에 위치한 치환체는 임의로 합쳐져, 5- 내지 6-원 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴 고리를 형성한다.
특정 실시양태에서:
A는 모르폴린-4-일, 3,4-디히르도-2H-피란-4-일, 3,6-디히르도-2H-피란-4-일, 테트라히드로-2H-피란-4-일, 1,4-옥사제판-4-일, 피페리딘-1-일 (C1 -C6 알킬로 임의로 치환됨)로 이루어진 군으로부터 선택된 고리이고;
B는 페닐렌 및 피리미딜렌으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
D는 -NR3C(O)NR4R5, -NR4R5, -C(O)NR4R5, -OC(O)OR4, -OC(O)NR4R5, -NR3C(=N-CN)NR4R5, -NR3C(=N-OR4)NR4R5, -NR3C(=N-NR4)NR4R5, -NR3C(O)R4, -NR3C(O)OR4, -NR3S(O)2NR4R5 또는 -NR3S(O)2R4이며, 여기서 R3은 수소 또는 C1 -6 알킬이고; R4 및 R5는 각각 독립적으로 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬 또는 C3 -10 시클로알킬이거나 또는 R4 및 R5는 합쳐져, 5- 또는 6-원 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
R1 및 R2는 이들이 부착되어 있는 원자와 합쳐져, 치환된 피롤리딘, 피페리딘 또는 호모피페리딘 고리를 형성하며, 여기서 상기 고리의 질소 원자는 하기 기:
Figure pct00042
에 의해 치환되고;
여기서, E는 수소, C6 아릴, C5 -6 헤테로아릴, C1 -6 알킬 또는 C5 -6 헤테로시클로알킬이고; E는 할로겐, C1 -6 알킬, -NRdRe, -SRd, -ORd, -C(O)ORd, -C(O)NRdRe, -C(O)Rd, -NRdC(O)Re, -OC(O)Rf, -NRdC(O)NRdRe, -OC(O)NRdRe, -C(=NORd)NRdRe, -NRdC(=N-CN)NRdRe, -NRdS(O)2NRdRe, -S(O)2Rd, -S(O)2NRdRe, -Rf, -NO2, -N3, =O, -CN, -(CH2)1-4-NRdRe, -(CH2)1-4-SRd, -(CH2)1-4-ORd, -(CH2)1-4-C(O)ORd, -(CH2)1-4-C(O)NRdRe, -(CH2)1-4-C(O)Rd, -(CH2)1-4-NRdC(O)Re, -(CH2)1-4-OC(O)Rf, -(CH2)1-4-NRdC(O)NRdRe, -(CH2)1-4-OC(O)NRdRe, -(CH2)1-4-C(=NORd)NRdRe, -(CH2)1-4-NRdC(=N-CN)NRdRe, -(CH2)1-4-NRdS(O)2NRdRe, -(CH2)1-4-S(O)2Rd, -(CH2)1-4-S(O)2NRdRe, -(CH2)1-4-NO2, -(CH2)1-4-N3 또는 -(CH2)1-4-CN으로부터 선택된 1 내지 5개의 치환체로 임의로 치환되며; 여기서 Rd 및 Re는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -7 시클로알킬, C3 -7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 각각 독립적으로 선택되거나 또는 Rd 및 Re는 동일한 질소 원자에 부착되는 경우에 합쳐져, 3- 내지 6-원 고리를 형성하고; Rf는 C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C3 -7 시클로알킬, C3 -7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 선택되고;
F는 C1 -6 알킬렌이고;
G는 -C(O)-, -OC(O)-, -NHC(O)-, -NHC(=NOH)-, -S(O)2- 또는 -NHS(O)2-이고;
m 및 p는 독립적으로 0 또는 1이다.
또다른 실시양태는 하기 화학식을 포함하는 mTOR 억제제 화합물, 그의 입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용되는 염을 포함한다:
Figure pct00043
상기 식에서, A는, N, O 및 S로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 고리 꼭지점으로서 갖고 0 내지 2개의 이중 결합을 갖는 5- 내지 8-원 헤테로시클릭 고리이며; A 고리는 C(O)ORa, -C(O)NRaRb, -NRaRb, -OC(O)Rc, -ORa, -SRa, -S(O)2Rc, -S(O)Rc, -Rc, -(CH2)1-4-NRaRb, -(CH2)1-4-NRaC(O)Rc, -(CH2)1-4-ORa, -(CH2)1-4-SRa, -(CH2)1-4-S(O)2Rc, -(CH2)1-4-S(O)Rc, 할로겐, -NO2, -CN 및 -N3으로 이루어진 군으로부터 선택된 0 내지 5개의 RA 치환체로 추가로 치환되며, 여기서 Ra 및 Rb는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C1 -6 헤테로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3-6 시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4(페닐)로부터 각각 독립적으로 선택되고, 임의로 Ra 및 Rb는 이들 각각이 부착되어 있는 질소 원자와 함께 합쳐져, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 7-원 헤테로시클릭 고리를 형성하고; Rc는 C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C1 -6 헤테로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3-6 시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4 (페닐)로부터 선택되고; 5- 내지 8-원 헤테로시클릭 고리의 동일한 원자에 부착되어 있는 임의의 2개의 치환체는 임의로 합쳐져, 3- 내지 5-원 카르보시클릭 또는 3- 내지 5-원 헤테로시클릭 고리를 형성하고; R1 및 R2는 이들이 부착되어 있는 원자와 합쳐져, -O-를 고리 꼭지점 중 하나로서 포함하는 5- 내지 8-원 모노시클릭 또는 가교된 비시클릭 헤테로시클릭 고리를 형성하며; R1 및 R2가 합쳐져 형성된 5- 내지 8-원 모노시클릭 또는 가교된 비시클릭 헤테로시클릭 고리는 추가로, N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 추가의 헤테로원자를 임의로 포함하고, 할로겐, -NRjRk, -SRj, -ORj, -C(O)ORj, -C(O)NRjRk, -NHC(O)Rj, -OC(O)Rj, -Rm, -CN, =O, =S, =N-CN, -(CH2)1-4-CN, -(CH2)1-4-ORj, -(CH2)1-4-NRjRk, -C1 -4 알킬렌-ORj, -C1 -4 알킬렌-Rm, -C2 -4 알케닐렌-Rm, -C2 -4 알키닐렌-Rm, -C1 -4 알킬렌-C1 -9 헤테로아릴, C2 -4 알케닐렌-C1 -9 헤테로아릴, C2 -4 알키닐렌-C1 -9 헤테로아릴, C1 -4 알킬렌-C6 -10 아릴, C2 -4 알키닐렌-C6 -10 아릴 및 C2 -4 알키닐렌-C6 -10 아릴로 이루어진 군으로부터 선택된 0 내지 5개 RR 치환체로 치환되며, 여기서 Rj 및 Rk는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C1 -6 헤테로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -7 시클로알킬, C2 -6 헤테로시클로알킬, 페닐, 피리딜 및 -(CH2)1-4-(Ph)로부터 각각 독립적으로 선택되고, Rj 및 Rk는 동일한 질소 원자에 부착되는 경우에 임의로 합쳐져, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 6-원 헤테로시클릭 고리를 형성하고; Rm은 C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C1 -6 헤테로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -7 시클로알킬, C2 -6 헤테로시클로알킬 및 -(CH2)1-4-(Ph)로부터 선택되며, 여기서 RR 치환체의 C3 -7 시클로알킬, C2 -6 헤테로시클로알킬, C1 -9 헤테로아릴 또는 C6 -10 아릴 부분은 F, Cl, Br, I, -NH(C1 -4 알킬), -N(디C1 -4 알킬), O(C1 -4 알킬), C1 -6 알킬, C1 -6 헤테로알킬, -C(O)O(C1-4 알킬), -C(O)NH(C1-4알킬), -C(O)N(디C1 -4 알킬), -NO2, -CN으로 이루어진 군으로부터 선택된 0 내지 3개의 치환체로 치환되고; R1 및 R2가 합쳐져 모노시클릭 5- 내지 8-원 헤테로시클릭 고리를 형성하는 경우에, 상기 5- 내지 8-원 헤테로시클릭 고리의 동일한 원자 또는 인접 탄소 원자에 부착되어 있는 임의의 2개의 RR 치환체는 임의로 합쳐져, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 고리 꼭지점으로서 포함하는 3- 내지 7-원 시클로알킬 고리 또는 3- 내지 7-원 헤테로시클로알킬 고리를 형성하고; B는 페닐렌 및 5- 내지 6-원 헤테로아릴렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이고, 할로겐, -CN, -N3, -NO2, -C(O)ORn, -C(O)NRnRo, -NRnC(O)Ro, -NRnC(O)NRnRo, -ORn, -NRnRo, -(CH2)1-4-C(O)ORn, -(CH2)1-4-C(O)NRnRo, -(CH2)1-4-ORn, -(CH2)1-4-NRnRo, -(CH2)1-4-SRp 및 Rp로부터 선택된 0 내지 4개의 RB 치환체로 치환되며; 여기서 Rn 및 Ro는 수소 및 C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C1 -6 헤테로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -7 시클로알킬, C2 -6 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-(페닐)로부터 독립적으로 선택되거나 또는 Rn 및 Ro는 동일한 질소 원자에 부착되는 경우에 임의로 합쳐져, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 6-원 헤테로시클릭 고리를 형성하고; Rp는 C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C1 -6 헤테로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -7 시클로알킬, C2 -6 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-(페닐)이며, D 기를 포함하지 않으며 B의 인접 원자 상에 위치한 임의의 2개의 치환체는 임의로 합쳐져, 5- 내지 6-원 카르보시클릭, 헤테로시클릭, 아릴 또는 헤테로아릴 고리를 형성하고; D는 -NR3C(O)NR4R5, -NR4R5, -C(O)NR4R5, -OC(O)OR4, -OC(O)NR4R5, -NR3C(=N-CN)NR4R5, -NR3C(=N-OR4)NR4R5, -NR3C(=N-NR4)NR4R5, -NR3C(O)R4, -NR3C(O)OR4, -NR3S(O)2NR4R5, -NR3S(O)2R4, -NR3C(=S)NR4R5 및 -S(O)2R4R5로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이며, 여기서 R3은 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬 및 C2 -6 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되고; R4 및 R5는 수소, C1 -6 알킬, C1-6 할로알킬, C1 -6 알킬아미노-C(=O)-, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -10 시클로알킬, C2-9 헤테로시클로알킬, C6 -10 아릴 및 C1 -9 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고, R4 및 R5는 동일한 질소 원자에 부착되는 경우에 임의로 합쳐져, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하는 5- 내지 7-원 헤테로시클릭 또는 5- 내지 6-원 헤테로아릴 고리를 형성하고; R3, R4 및 R5는 할로겐, -NO2, -CN, -NRqRr, -ORq, -SRq, -C(O)ORq, -C(O)NRqRr, -NRqC(O)Rr, -NRqC(O)ORs, -(CH2)1-4-NRqRr, -(CH2)1-4-ORq, -(CH2)1-4-SRq, -(CH2)1-4-C(O)ORq, -(CH2)1-4-C(O)NRqRr, -(CH2)1-4-NRqC(O)Rr, -(CH2)1-4-NRqC(O)ORr, -(CH2)1-4-CN, -(CH2)1-4-NO2, -S(O)Rr, -S(O)2Rr, -(CH2)1-4Rs, =O 및 -Rs로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 0 내지 3개의 RD 치환체로 추가로 치환되며; 여기서 Rq 및 Rr는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C1 -6 헤테로알킬, C3 -7 시클로알킬, C2 -6 헤테로시클로알킬, C6 -10 아릴, C1 -9 헤테로아릴로부터 선택되고; Rs는 각각의 경우에 C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C3 -7 시클로알킬, C2 -6 헤테로시클로알킬, C6-10 아릴 및 C1 -9 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되고; D 기 및 B 고리의 인접 원자 상에 위치한 치환체는 임의로 합쳐져, 1 내지 2개의 RD 치환체로 임의로 치환된 5- 내지 6-원 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴 고리를 형성한다.
또다른 실시양태는 하기 화학식을 포함하는 mTOR 억제제 화합물, 그의 입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용되는 염을 포함한다:
Figure pct00044
상기 식에서, R1은 6- 내지 10-원 아릴, 5- 내지 9-원 헤테로아릴, 3- 내지 12-원 헤테로시클로알킬, 3- 내지 12-원 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R1은 할로겐, F, Cl, Br, I, -NRaRb, -SRa, -ORa, -C(O)ORa, -C(O)NRaRb, -C(O)Ra, -NRaC(O)Rb, -OC(O)Rc, -NRaC(O)NRaRb, -OC(O)NRaRb, -NRaS(O)2NRaRb, -S(O)2Ra, -S(O)2NRaRb, -Rc, -NO2, -N3, =O, -CN, Rc1, -X1-NRaRb, -X1-SRa, -X1-ORa, -X1-C(O)ORa, -X1-C(O)NRaRb, -X1-C(O)Ra, -X1-NRaC(O)Rb, -X1-OC(O)Ra, -X1-NRaC(O)NRaRb, -X1-OC(O)NRaRb, -X1-NRaS(O)2NRaRb, -X1-S(O)2Ra, -X1-S(O)2NRaRb, -X1-NO2, -X1-N3, -X1-CN 및 X1-Rc1로 이루어진 군으로부터 선택된 0 내지 5개의 RR1 치환체로 치환되며; 여기서 Ra 및 Rb는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C1 -6 헤테로알킬, C2 -6 알케닐, C2-6 알키닐, C3 -7 시클로알킬, C2 -7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 각각 독립적으로 선택되고, 임의로 Ra 및 Rb는 동일한 질소 원자에 부착되는 경우에 합쳐져, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 6-원 헤테로시클릭 고리를 형성하고; Rc는 C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -7 시클로알킬, C2 -7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 선택되고; X1은 C1 -4 알킬렌, C2 -4 알케닐렌 및 C2 -4 알키닐렌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; Rc1은 페닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-이미다졸릴, 2-인돌릴, 1-나프틸, 2-나프틸, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피롤릴, 2-푸라닐 및 3-푸라닐로 이루어진 군으로부터 선택되며, Rc1은 F, Cl, Br, I, -NRaRb, -SRa, -ORa, -S(O)2Ra, -S(O)2NRaRb, -NO2, -N3, =O, -CN, 피리딜, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐 및 C1 -6 헤테로알킬로부터 선택된 0 내지 3개의 치환체로 치환되고; R2는 수소, C1 -6 알킬, C2-6 알케닐, C2 -6 알키닐, C1 -6 헤테로알킬, 6- 내지 10-원 아릴, 5- 내지 10-원 헤테로아릴, 3- 내지 12-원 헤테로시클로알킬, 3- 내지 12-원 시클로알킬, -L-C6 -10 아릴, -L-C1 -9 헤테로아릴, -L-C3 -12 시클로알킬 및 -L-C2 -12 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 L은 C1 -6 알킬렌, C2 -6 알케닐렌, C2 -6 알키닐렌 및 C1-6 헤테로알킬렌으로부터 선택되고, R2는 할로겐, F, Cl, Br, I, -NRdRe, -SRd, -ORd, -C(O)ORd, -C(O)NRdRe, -C(O)Rd, -NRdC(O)Re, -OC(O)Rf, -NRdC(O)NRdRe, -OC(O)NRdRe, -NRdS(O)2NRdRe, -S(O)2Rd, -S(O)2NRdRe, -Rf, -NO2, -N3, =O, -CN, -X2-NRdRe, -X2-SRd, -X2-ORd, -X2-C(O)ORd, -X2-C(O)NRdRe, -X2-C(O)Rd, -X2-NRdC(O)Re, -X2-OC(O)Rd, -X2-NRdC(O)NRdRe, -X2-OC(O)NRdRe, -X2-NRdS(O)2NRdRe, -X2-S(O)2Rd, -X2-S(O)2NRdRe, -X2-NO2, -X2-N3 및 -X2-CN으로 이루어진 군으로부터 선택된 0 내지 5개의 RR2 치환체로 치환되며; 여기서 Rd 및 Re는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C1 -6 헤테로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -7 시클로알킬, C2 -7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 각각 독립적으로 선택되고, 임의로 Rd 및 Re는 동일한 질소 원자에 부착되는 경우에 합쳐져, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 6-원 헤테로시클릭 고리를 형성하고; Rf는 C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -7 시클로알킬, C2 -7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 선택되고; X2는 C1 -4 알킬렌, C2 -4 알케닐렌 및 C2 -4 알키닐렌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; R3은 5- 내지 12-원 모노시클릭 또는 가교된 헤테로시클로알킬 고리이며, R3 기는 -C(O)ORg, -C(O)NRgRh, -NRgRh, -ORg, -SRg, -S(O)2Ri, -S(O)Ri, -Ri, 할로겐, F, Cl, Br, I, -NO2, -CN 및 -N3으로 이루어진 군으로부터 선택된 0 내지 3개의 RR3 치환체로 치환되며, 여기서 Rg 및 Rh는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C1 -6 헤테로알킬, C2 -6 알케닐 및 C3 -6 시클로알킬로부터 각각 독립적으로 선택되고, 임의로 Rg 및 Rh는 이들 각각이 부착되어 있는 질소 원자와 함께 합쳐져, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 6-원 헤테로시클릭 고리를 형성하고, Ri는 C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C3 -6 시클로알킬로부터 선택되고; R3이 모노시클릭 헤테로시클로알킬 고리인 경우에, R3의 동일한 원자에 부착되어 있는 임의의 2개의 RR3 기는 임의로 합쳐져, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 2개의 원자를 고리 꼭지점으로서 포함하는 3- 내지 7-원 카르보시클릭 또는 3- 내지 7-원 헤테로시클릭 고리를 형성하고; A1, A2, A3 및 A4는 각각 N, C(RA) 또는 C(h)로부터 독립적으로 선택된 구성원이고, A1, A2, A3 및 A4 중 적어도 3개는 각각 독립적으로 C(h) 또는 C(RA)이며, 여기서 RA는 각각의 경우에 F, Cl, Br, I, -NO2, -CN, C1 -4 알킬, C2 -4 알케닐, C2 -4 알키닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나 또는 인접 원자에 부착되어 있는 임의의 2개의 RA 기는 임의로 합쳐져, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 고리 꼭지점으로서 포함하는 C2 -6 헤테로시클릭 고리, C3 -7 시클로알킬 고리, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 고리 꼭지점으로서 포함하는 C1 -5 헤테로아릴 고리, 또는 페닐 고리를 형성하고; D는 -NR4C(O)NR5R6, -NR5R6, -C(O)NR5R6, -OC(O)OR5, -OC(O)NR5R6, -NR4C(=N-CN)NR5R6, -NR4C(=N-OR5)NR5R6, -NR4C(=N-NR5)NR5R6, -NR4C(O)R5, -NR4C(O)OR5, -NR4S(O)2NR5R6 및 -NR4S(O)2R5로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이며, 여기서 R4는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬 및 C2 -6 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되고; R5 및 R6은 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3-10 시클로알킬, C2 -10 헤테로시클로알킬, C6 -10 아릴 및 C1 -9 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고, R5 및 R6은 동일한 질소 원자에 부착되는 경우에 임의로 합쳐져, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 고리 꼭지점으로서 포함하는 5- 내지 7-원 헤테로시클릭 또는 5- 내지 9-원 헤테로아릴 고리를 형성하고, 0 내지 3개의 RD 치환체로 치환되고; R4, R5 및 R6은 0 내지 3개의 RD 치환체로 추가로 치환되며, 여기서 RD는 할로겐, F, Cl, Br, I, -NO2, -CN, -NRjRk, -ORj, -SRj, -C(O)ORj, -C(O)NRjRk, -NRjC(O)Rk, -NRjC(O)ORm, -X3-NRjRk, -X3-ORj, -X3-SRj, -X3-C(O)ORj, -X3-C(O)NRjRk, -X3-NRjC(O)Rk, -X3-NRjC(O)ORk, -X3-CN, -X3-NO2, -S(O)Rm, -S(O)2Rm, =O 및 -Rm으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; 여기서 Rj 및 Rk는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C1 -6 헤테로알킬, C3 -7 시클로알킬, C3 -7 헤테로시클로알킬, C6 -10 아릴, C1 -9 헤테로아릴로부터 선택되고; Rm은 각각의 경우에 C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C3 -7 시클로알킬, C3 -7 헤테로시클로알킬, C6 -10 아릴 및 C1 -9 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되고; X3은 C1 -4 알킬렌, C2 -4 알케닐렌 및 C2 -4 알키닐렌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; D 및 D가 부착되어 있는 원자에 인접한 원자에 부착되어 있는 RA 치환체는 임의로 합쳐져, 임의로 치환된 5- 내지 6-원 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴 고리 (0 내지 4개의 RD 치환체로 치환됨)를 형성한다.
또다른 실시양태는 하기 화학식을 포함하는 mTOR 억제제 화합물, 그의 입체이성질체, 호변이성질체 및 제약상 허용되는 염을 포함한다:
Figure pct00045
상기 식에서, Y1 및 Y2는 각각 독립적으로 N 또는 C(R1)이지만, Y1 및 Y2 둘 다가 N은 아니거나 또는 둘 다가 C(R1)은 아니며, 여기서 R1은 수소, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C1 -6 헤테로알킬, 6- 내지 10-원 아릴, 5- 내지 9-원 헤테로아릴, 3- 내지 12-원 헤테로시클로알킬, 3- 내지 12-원 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R1은 할로겐, F, Cl, Br, I, -NRaRb, -SRa, -ORa, -C(O)ORa, -C(O)NRaRb, -C(O)Ra, -NRaC(O)Rb, -OC(O)Rc, -NRaC(O)NRaRb, -OC(O)NRaRb, -NRaS(O)2NRaRb, -S(O)2Ra, -S(O)2NRaRb, -Rc, -NO2, -N3, =O, -CN, Rc1, -X1-NRaRb, -X1-SRa, -X1-ORa, -X1-C(O)ORa, -X1-C(O)NRaRb, -X1-C(O)Ra, -X1-NRaC(O)Rb, -X1-OC(O)Ra, -X1-NRaC(O)NRaRb, -X1-OC(O)NRaRb, -X1-NRaS(O)2NRaRb, -X1-S(O)2Ra, -X1-S(O)2NRaRb, -X1-NO2, -X1-N3, -X1-CN및 X1-Rc1로 이루어진 군으로부터 선택된 0 내지 5개의 RR1 치환체로 치환되며; 여기서 Ra 및 Rb는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C1-6 헤테로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -7 시클로알킬, C2 -7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 각각 독립적으로 선택되고, 임의로 Ra 및 Rb는 동일한 질소 원자에 부착되어 있는 경우에 합쳐져, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함하는 3 내지 6원 헤테로시클릭 고리를 형성하고; Rc는 C1 -6 알킬, C1-6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -7 시클로알킬, C2 -7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 선택되고; X1은 C1 -4 알킬렌, C2 -4 알케닐렌 및 C2 -4 알키닐렌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; Rc1은 페닐, 2-피리딜, 3-피리딜, 4-피리딜, 2-이미다졸릴, 2-인돌릴, 1-나프틸, 2-나프틸, 2-티에닐, 3-티에닐, 2-피롤릴, 2-푸라닐 및 3-푸라닐로 이루어진 군으로부터 선택되고, Rc1은 F, Cl, Br, I, -NRaRb, -SRa, -ORa, -S(O)2Ra, -S(O)2NRaRb, -NO2, -N3, =O, -CN, 피리딜, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐 및 C1 -6 헤테로알킬로부터 선택된 0 내지 3개의 치환체로 치환되고; R2는 수소, C1 -6 알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C1 -6 헤테로알킬, -L-C6 -10 아릴, -L-C1-9 헤테로아릴, -L-C3 -12 시클로알킬 및 -L-C2 -12 헤테로시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, 여기서 L은 C1 -6 알킬렌, C2 -6 알케닐렌, C2 -6 알키닐렌 및 C1 -6 헤테로알킬렌으로부터 선택되고, R2는 할로겐, F, Cl, Br, I, -NRdRe, -SRd, -ORd, -C(O)ORd, -C(O)NRdRe, -C(O)Rd, -NRdC(O)Re, -OC(O)Rf, -NRdC(O)NRdRe, -OC(O)NRdRe, -NRdS(O)2NRdRe, -S(O)2Rd, -S(O)2NRdRe, -Rf, -NO2, -N3, =O, -CN, -X2-NRdRe, -X2-SRd, -X2-ORd, -X2-C(O)ORd, -X2-C(O)NRdRe, -X2-C(O)Rd, -X2-NRdC(O)Re, -X2-OC(O)Rd, -X2-NRdC(O)NRdRe, -X2-OC(O)NRdRe, -X2-NRdS(O)2NRdRe, -X2-S(O)2Rd, -X2-S(O)2NRdRe, -X2-NO2, -X2-N3 및 -X2-CN으로 이루어진 군으로부터 선택된 0 내지 5개의 RR2 치환체로 치환되며; 여기서 Rd 및 Re는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C1 -6 헤테로알킬, C2-6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -7 시클로알킬, C2 -7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 각각 독립적으로 선택되고, 임의로 Rd 및 Re는 동일한 질소에 부착되어 있는 경우에 합쳐져, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 6-원 헤테로시클릭 고리를 형성하고; Rf는 C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -7 시클로알킬, C2 -7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 선택되고; X2는 C1 -4 알킬렌, C2 -4 알케닐렌 및 C2 -4 알키닐렌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; R3은 5- 내지 12-원 모노시클릭 또는 가교된 헤테로시클로알킬 고리이며, R3 기는 -C(O)ORg, -C(O)NRgRh, -NRgRh, -ORg, -SRg, -S(O)2Ri, -S(O)Ri, -Ri, 할로겐, F, Cl, Br, I, -NO2, -CN 및 -N3으로 이루어진 군으로부터 선택된 0 내지 3개의 RR3 치환체로 치환되며, 여기서 Rg 및 Rh는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C1 -6 헤테로알킬, C2 -6 알케닐 및 C3 -6 시클로알킬로부터 각각 독립적으로 선택되고, 임의로 Rg 및 Rh는 이들 각각이 부착되어 있는 질소 원자와 함께 합쳐져, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 포함하는 3- 내지 6-원 헤테로시클릭 고리를 형성하고, Ri는 C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C3 -6 시클로알킬로부터 선택되고; R3이 모노시클릭 헤테로시클로알킬 고리인 경우에, R3의 동일한 원자에 부착되어 있는 임의의 2개의 RR3 기는 임의로 합쳐져, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 2개의 원자를 고리 꼭지점으로서 포함하는 3- 내지 7-원 카르보시클릭 또는 3 내지 7원 헤테로시클릭 고리를 형성하고; A1, A2, A3 및 A4는 각각 N, C(RA) 또는 C(h)로부터 독립적으로 선택된 구성원이며, A1, A2, A3 및 A4 중 적어도 3개는 각각 독립적으로 C(h) 또는 C(RA)이며, 여기서 RA는 각각의 경우에 F, Cl, Br, I, -NO2, -CN, C1 -4 알킬, C2 -4 알케닐, C2 -4 알키닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나 또는 인접 원자에 부착되어 있는 임의의 2개의 RA 기는 임의로 합쳐져, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 2개의 헤테로원자를 고리 꼭지점으로서 포함하는 C2-6 헤테로시클릭 고리, C3 -7 시클로알킬 고리, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 고리 꼭지점으로서 포함하는 C1 -5 헤테로아릴 고리, 또는 페닐 고리를 형성하고; D는 -NR4C(O)NR5R6, -NR5R6, -C(O)NR5R6, -OC(O)OR5, -OC(O)NR5R6, -NR4C(=N-CN)NR5R6, -NR4C(=N-OR5)NR5R6, -NR4C(=N-NR5)NR5R6, -NR4C(O)R5, -NR4C(O)OR5, -NR4S(O)2NR5R6 및 -NR4S(O)2R5로 이루어진 군으로부터 선택된 구성원이며, 여기서 R4는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬 및 C2 -6 알케닐로 이루어진 군으로부터 선택되고; R5 및 R6은 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -10 시클로알킬, C2 -10 헤테로시클로알킬, C6 -10 아릴 및 C1 -9 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고, R5 및 R6은 동일한 질소 원자에 부착되어 있는 경우에 임의로 합쳐져, N, O 및 S로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 고리 꼭지점으로서 포함하는 5- 내지 7-원 헤테로시클릭 또는 5- 내지 9-원 헤테로아릴 고리를 형성하고, 0 내지 3개의 RD 치환체로 치환되고; R4, R5 및 R6은 0 내지 3개의 RD 치환체로 추가로 치환되며, 여기서 RD는 할로겐, F, Cl, Br, I, -NO2, -CN, -NRjRk, -ORj, -SRj, -C(O)ORj, -C(O)NRjRk, -NRjC(O)Rk, -NRjC(O)ORm, -X3-NRjRk, -X3-ORj, -X3-SRj, -X3-C(O)ORj, -X3-C(O)NRjRk, -X3-NRjC(O)Rk, -X3-NRjC(O)ORk, -X3-CN, -X3-NO2, -S(O)Rm, -S(O)2Rm, =O 및 -Rm으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; 여기서 Rj 및 Rk는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C1 -6 헤테로알킬, C3 -7 시클로알킬, C3 -7 헤테로시클로알킬, C6 -10 아릴, C1 -9 헤테로아릴로부터 선택되고; Rm은 각각의 경우에 C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C3 -7 시클로알킬, C3 -7 헤테로시클로알킬, C6 -10 아릴 및 C1 -9 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되고; X3은 C1-4 알킬렌, C2 -4 알케닐렌 및 C2 -4 알키닐렌으로 이루어진 군으로부터 선택되고; D 및 D가 부착되어 있는 원자에 인접한 원자에 부착되어 있는 RA 치환체는 임의로 합쳐져, 임의로 치환된 5- 내지 6-원 헤테로시클릭 또는 헤테로아릴 고리 (0 내지 4개의 RD 치환체로 치환됨)를 형성한다.
또다른 실시양태는 하기를 포함하는 mTOR 억제제 화합물을 포함한다:
Figure pct00046
Figure pct00047
.
또다른 실시양태는 mTOR 억제제 라파마이신
Figure pct00048
을 포함한다.
또다른 실시양태는 하기 화학식의 PI3-k 억제제 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함한다:
Figure pct00049
상기 식에서, R1 및 R2는 수소, 할로겐, C1 -6 알킬, -NRdRe, -SRd, -ORd, -C(O)ORd, -C(O)NRdRe, -C(O)Rd, -NRdC(O)Re, -OC(O)Rf, -NRdC(O)NRdRe, -OC(O)NRdRe, -C(=NORd)NRdRe, -NRdC(=N-CN)NRdRe, -NRdS(O)2NRdRe, -S(O)2Rd, -S(O)2NRdRe, -Rf, -NO2, -N3, =O, -CN, -(CH2)1-4-NRdRe, -(CH2)1-4-SRd, -(CH2)1-4-ORd, -(CH2)1-4-C(O)ORd, -(CH2)1-4-C(O)NRdRe, -(CH2)1-4-C(O)Rd, -(CH2)1-4-NRdC(O)Re, -(CH2)1-4-OC(O)Rf, -(CH2)1-4-NRdC(O)NRdRe, -(CH2)1-4-OC(O)NRdRe, -(CH2)1-4-C(=NORd)NRdRe, -(CH2)1-4-NRdC(=N-CN)NRdRe, -(CH2)1-4-NRdS(O)2NRdRe, -(CH2)1-4-S(O)2Rd, -(CH2)1-4-S(O)2NRdRe, -(CH2)1-4-NO2, -(CH2)1-4-N3 또는 -(CH2)1-4-CN으로부터 독립적으로 선택되며; 여기서 Rd 및 Re는 수소, C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C2 -6 알케닐, C2 -6 알키닐, C3 -7 시클로알킬, C3 -7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 각각 독립적으로 선택되거나 또는 Rd 및 Re는 동일한 질소에 부착되어 있는 경우에 합쳐져, 3- 내지 6-원 고리를 형성하고; Rf는 C1 -6 알킬, C1 -6 할로알킬, C3 -7 시클로알킬, C3-7 헤테로시클로알킬, 페닐 및 -(CH2)1-4-페닐로부터 선택되거나; 또는
R1 및 R2는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께, 융합된 5- 또는 6-원 헤테로시클릴 또는 헤테로아릴 고리 (옥소, 할로겐, C1-C3 알킬 또는 CF3에 의해 임의로 치환됨)를 형성한다.
PI3-k 억제제의 예는
Figure pct00050
를 포함한다.
한 실시양태에서, 키나제 억제제는 하기 화학식 V 및 VI의 PI3K 키나제 억제제, 또는 그의 입체이성질체, 기하학적 이성질체, 호변이성질체 또는 제약상 허용되는 염이다.
<화학식 V>
Figure pct00051
<화학식 VI>
Figure pct00052
상기 식에서,
R1은 H, F, Cl, Br, I, CN, -(CR14R15)mNR10R11, -C(R14R15)nNR12C(=Y)R10, -(CR14R15)nNR12S(O)2R10, -(CR14R15)mOR10, -(CR14R15)nS(O)2R10, -(CR14R15)nS(O)2NR10R11, -C(OR10)R11R14, -C(=Y)R10, -C(=Y)OR10, -C(=Y)NR10R11, -C(=Y)NR12OR10, -C(=O)NR12S(O)2R10, -C(=O)NR12(CR14R15)mNR10R11, -NO2, -NR12C(=Y)R11, -NR12C(=Y)OR11, -NR12C(=Y)NR10R11, -NR12S(O)2R10, -NR12SO2NR10R11, -SR10, -S(O)2R10, -S(O)2NR10R11, -SC(=Y)R10, -SC(=Y)OR10, C1-C12 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C3-C12 카르보시클릴, C2-C20 헤테로시클릴, C6-C20 아릴 및 C1-C20 헤테로아릴로부터 선택되고;
R2는 H, F, Cl, Br, I, CN, CF3, -NO2, -C(=Y)R10, -C(=Y)OR10, -C(=Y)NR10R11, -(CR14R15)mNR10R11, -(CR14R15)nOR10, -(CR14R15)t-NR12C(=O)(CR14R15)NR10R11, -NR12C(=Y)R10, -NR12C(=Y)OR10, -NR12C(=Y)NR10R11, -NR12SO2R10, OR10, -OC(=Y)R10, -OC(=Y)OR10, -OC(=Y)NR10R11, -OS(O)2(OR10), -OP(=Y)(OR10)(OR11), -OP(OR10)(OR11), SR10, -S(O)R10, -S(O)2R10, -S(O)2NR10R11, -S(O)(OR10), -S(O)2(OR10), -SC(=Y)R10, -SC(=Y)OR10, -SC(=Y)NR10R11, C1-C12 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C3-C12 카르보시클릴, C2-C20 헤테로시클릴, C6-C20 아릴 및 C1-C20 헤테로아릴로부터 선택되고;
R3은 탄소 연결된 모노시클릭 헤테로아릴, 탄소 연결된 융합된 비시클릭 C3-C20 헤테로시클릴 또는 탄소 연결된 융합된 비시클릭 C1-C20 헤테로아릴이고, 여기서 모노시클릭 헤테로아릴, 융합된 비시클릭 C3-C20 헤테로시클릴 및 융합된 비시클릭 C1-C20 헤테로아릴은 F, Cl, Br, I, -CN, -NR10R11, -OR10, -C(O)R10, -NR10C(O)R11, -N(C(O)R11)2, -NR10C(O)NR10R11, -NR12S(O)2R10, -C(=O)OR10, -C(=O)NR10R11, C1-C12 알킬 및 (C1-C12 알킬)-OR10으로부터 선택된 1개 이상의 기로 임의로 치환되고;
R10, R11 및 R12는 독립적으로 H, C1-C12 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C3-C12 카르보시클릴, C2-C20 헤테로시클릴, C6-C20 아릴 또는 C1-C20 헤테로아릴이거나, 또는
R10 및 R11은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께, 옥소, (CH2)mOR12, NR12R12, CF3, F, Cl, Br, I, SO2R12, C(=O)R12, NR12C(=Y)R12, NR12S(O)2R12, C(=Y)NR12R12, C1-C12 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C3-C12 카르보시클릴, C2-C20 헤테로시클릴, C6-C20 아릴 및 C1-C20 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된 1개 이상의 기로 임의로 치환된 C2-C20 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
R14 및 R15는 독립적으로 H, C1-C12 알킬 또는 -(CH2)n-아릴로부터 선택되거나,
또는 R14 및 R15는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께, 포화 또는 부분 불포화 C3-C12 카르보시클릭 고리를 형성하고; 여기서 상기 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보시클릴, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴은 F, Cl, Br, I, CN, CF3, -NO2, 옥소, R10, -C(=Y)R10, -C(=Y)OR10, -C(=Y)NR10R11, -(CR14R15)nNR10R11, -(CR14R15)nOR10, -NR10R11, -NR12C(=Y)R10, -NR12C(=Y)OR11, -NR12C(=Y)NR10R11, -(CR14R15)mNR12SO2R10, =NR12, OR10, -OC(=Y)R10, -OC(=Y)OR10, -OC(=Y)NR10R11, -OS(O)2(OR10), -OP(=Y)(OR10)(OR11), -OP(OR10)(OR11), -SR10, -S(O)R10, -S(O)2R10, -S(O)2NR10R11, -S(O)(OR10), -S(O)2(OR10), -SC(=Y)R10, -SC(=Y)OR10, -SC(=Y)NR10R11, C1-C12 알킬, C2-C8 알케닐, C2-C8 알키닐, C3-C12 카르보시클릴, C2-C20 헤테로시클릴, C6-C20 아릴 및 C1-C20 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택된 1개 이상의 기로 임의로 치환되고;
Y는 O, S 또는 NR12이고;
m은 0, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이고;
n은 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다.
PI3-k 억제제의 예는 하기 화학식 III-3 및 III-6을 포함한다:
<화학식 III-3>
Figure pct00053
<화학식 III-6>
Figure pct00054
화학식 V 및 VI 화합물의 제조
화학식 V 및 VI의 화합물은 WO 2006/046031 (모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 비롯하여 화학 업계에 널리 공지되어 있는 것들과 유사한 방법을 포함하는 합성 경로에 의해 합성할 수 있다. 출발 물질은 일반적으로 알드리치 케미칼스(Aldrich Chemicals; 위스콘신주 밀워키(Milwaukee, WI))와 같은 상업적 공급원으로부터 입수가능하거나, 또는 당업자에게 널리 공지되어 있는 방법을 이용하여 용이하게 제조된다 (예를 들어, 문헌 [Louis F. Fieser and Mary Fieser, Reagents for Organic Synthesis, v. 1-19, Wiley, N.Y. (1967-1999 ed.)] 또는 [Beilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl. ed. Springer-Verlag, Berlin] (부록 포함) (또한 바일스타인(Beilstein) 온라인 데이터베이스를 통해 이용가능함)에 일반적으로 기재된 방법에 의해 제조됨).
화학식 V 및 VI의 화합물은 다른 티오펜, 푸란 및 피리미딘 (US 6608053; US 6492383; US 6232320; US 6187777; US 3763156; US 3661908; US 3475429; US 5075305; US 2003/220365; GB 1393161; WO 93/13664); 및 다른 헤테로사이클 (문헌 [Comprehensive Heterocyclic Chemistry, Editors Katritzky and Rees, Pergamon Press, 1984]에 기재됨)의 제조 절차를 이용하여 제조할 수 있다.
화학식 V 및 VI의 화합물은 제약상 허용되는 염으로 전환될 수 있고, 염은 통상적인 방법에 의해 유리 화합물로 전환될 수 있다. 제약상 허용되는 염의 예는 무기 산, 예컨대 염산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 황산, 질산 및 인산; 및 유기 산, 예컨대 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프로피온산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 에탄술폰산, 아스파르트산 및 글루탐산과의 염을 포함한다. 염은 메실레이트, 히드로클로라이드, 포스페이트, 벤젠술포네이트 또는 술페이트일 수 있다. 염은 모노-염 또는 비스-염일 수 있다. 예를 들어, 메실레이트 염은 모노-메실레이트 또는 비스-메실레이트일 수 있다.
또한, 화학식 V 및 VI의 화합물 및 염은 수화물 또는 용매화물로 존재할 수 있다.
화학식 V 및 VI의 화합물의 제조에서 중간체의 관능기 (예를 들어, 1급 또는 2급 아민)를 보호할 필요가 있을 수 있다. 이러한 보호의 필요성은 원격 관능기(remote functionality)의 성질 및 제조 방법의 조건에 따라 달라질 것이다. 적합한 아미노-보호기에는 아세틸, 트리플루오로아세틸, t-부톡시카르보닐 (BOC), 벤질옥시카르보닐 (CBz) 및 9-플루오레닐메틸렌옥시카르보닐 (Fmoc)이 포함된다. 이러한 보호의 필요성은 당업자에 의해 쉽게 결정된다. 보호기 및 그의 사용에 대한 일반적인 설명에 대해서는 문헌 [T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991]을 참조한다.
예시의 목적으로, 하기 반응식 5 내지 11은 본 발명의 화합물 뿐만 아니라 핵심 중간체를 제조하는 일반적인 방법을 나타낸다. 개개의 반응 단계의 보다 상세한 설명에 대해서는 하기 실시예 섹션을 참조한다. 당업자는 다른 합성 경로를 이용하여 본 발명의 화합물을 합성할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 구체적인 출발 물질 및 시약이 반응식에 도시되고 하기 논의되어 있지만, 다른 출발 물질 및 시약으로 쉽게 대체하여 다양한 유도체 및/또는 반응 조건을 제공할 수 있다. 추가로, 하기 기재된 방법으로 제조되는 많은 화합물은 당업자에게 널리 공지된 통상적인 화학을 이용하여 본 개시내용에 비추어 추가로 변형시킬 수 있다.
<반응식 5>
Figure pct00055
반응식 5는 2-카르복시에스테르, 3-아미노 티오펜, 및 2-아미노, 3-카르복시 에스테르 티오펜 시약, 각각 중간체 (51) 및 (52)로부터 티에노피리미딘 중간체 (55) 및 (56), 또는 그에 대한 전구체 또는 전구약물을 제조하기 위한 일반적 방법을 보여주며, 여기서 Hal은 Cl, Br 또는 I이고; R1, R2 및 R10은 화학식 V 및 VI의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
<반응식 6>
Figure pct00056
반응식 6은 유기 용매 중에서 염기성 조건 하에 비스-할로 티에노피리미딘 중간체 (57) 및 (58)로부터의 4-할라이드를 모르폴린으로 선택적으로 대체하여 각각 2-할로, 4-모르폴리노 티에노피리미딘 화합물 (59) 및 (60), 또는 그에 대한 전구체 또는 전구약물을 제조하는 일반적 방법을 보여주며, 여기서 Hal은 Cl, Br 또는 I이고; R1 및 R2는 화학식 V 및 VI의 화합물에 대해 정의된 바와 같다.
<반응식 7>
Figure pct00057
반응식 7은 R1이 H인 경우의 2-할로, 4-모르폴리노, 6-수소 티에노피리미딘 화합물 (61) 및 (62)의 6-위치를 유도체화하는 일반적 방법을 나타낸다. 리튬화 시약으로 (61) 또는 (62)를 처리하여 6-위치 양성자를 제거한 후, 아실화 시약 R10C(O)Z (여기서, Z는 이탈기, 예컨대 할라이드, NHS 에스테르, 카르복실레이트 또는 디알킬아미노임)를 첨가하여, 2-할로, 4-모르폴리노, 6-아실 티에노피리미딘 화합물 (63) 및 (64), 또는 그에 대한 전구체 또는 전구약물을 수득하며, 여기서 Hal은 Cl, Br 또는 I이고; R2 및 R10은 화학식 V 및 VI의 화합물에 대해 정의된 바와 같다. 6-포르밀 화합물 (R10 = H)을 제조하기 위한 R10C(O)Z의 예는 N,N'-디메틸포름아미드 (DMF)이다.
<반응식 8>
Figure pct00058
반응식 8은 2-할로 피리미딘 중간체 ((65) 및 (66))를 모노시클릭 헤테로아릴, 융합된 비시클릭 헤테로시클릴 또는 융합된 비시클릭 헤테로아릴 보로네이트 산 (R15 = H) 또는 에스테르 (R15 = 알킬) 시약 (67)과 스즈끼-유형 커플링시켜 화학식 V 및 VI의 2-치환된 (Hy), 4-모르폴리노 티에노피리미딘 화합물 ((68) 및 (69)), 또는 그에 대한 전구체 또는 전구약물을 제조하는 일반적 방법을 보여주며, 여기서 Hal은 Cl, Br 또는 I이고; R1 및 R2는 화학식 V 및 VI의 화합물에 대해 정의된 바와 같다. 스즈끼 반응의 검토를 위해서는 문헌 [Miyaura et al. (1995) Chem. Rev. 95:2457-2483]; [Suzuki, A. (1999) J. Organomet. Chem. 576:147-168]; [Suzuki, A. in Metal-Catalyzed Cross-Coupling Reactions, Diederich, F., Stang, P.J., Eds., VCH, Weinheim, DE (1998), pp 49-97]을 참조한다. 팔라듐 촉매는 스즈끼-유형 교차-커플링에 통상적으로 사용되는 임의의 것, 예컨대 PdCl2(PPh3)2, Pd(PPh3)4, Pd(OAc)2, PdCl2(dppf)-DCM, Pd2(dba)3/Pt-Bu)3일 수 있다 (문헌 [Owens et al. (2003) Bioorganic & Med. Chem. Letters 13:4143-4145]; [Molander et al. (2002) Organic Letters 4(11):1867-1870]; US 6448433).
<반응식 9>
Figure pct00059
반응식 9는 화합물 (72) 및 (73)의 알키닐화 유도체의 제조에 사용될 수 있는 알킨 (71)의 합성을 위한 일반적인 방법을 도시한다. 적절한 염기 (Cs2CO3 등)의 존재 하에 프로파르길 브로민화물 (70)을 화학식 R10R11NH의 아민 (여기서, R10 및 R11은 독립적으로 H, 알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 선택되거나, 또는 R10 및 R11은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성함)과 반응시킴으로써 프로파르길 아민 (71)을 제조할 수 있다. 알키닐 아민 및 관련 합성의 검토를 위해서는 문헌 [Booker-Milburn, K.I., Comprehensive Organic Functional Group Transformations (1995), 2:1039-1074]; 및 [Viehe, H.G., (1967) Angew. Chem., Int. Ed. Eng., 6(9):767-778]을 참조한다. 후속적으로, 알킨 (71)을 중간체 (72) (X2 = 브로모 또는 아이오도) 또는 (73)과 (소노가시라(Sonogashira) 커플링을 통해) 반응시켜, 각각 화합물 (74) 및 (75), 또는 그에 대한 전구체 또는 전구약물 (여기서, R2 및 R3은 화학식 V 및 VI의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)을 수득할 수 있다.
<반응식 10>
Figure pct00060
반응식 10은 화합물 (72) 및 (73)의 알키닐화 유도체를 제조하는데 사용될 수 있는 알킨 (77)의 합성을 위한 일반적인 방법을 도시한다. Gem-디알킬 프로파르길 아민 (77)은 문헌 [Zaragoza et al. (2004) J. Med. Chem., 47:2833]에 기재된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 반응식 6에 따르면, CuCl 및 적절한 염기 (예를 들어, TEA 등)의 존재 하에 gem-디알킬 클로라이드 (76) (R14 및 R15는 독립적으로 메틸, 에틸 또는 다른 알킬 기임)을 화학식 R10R11NH의 아민 (여기서, R10 및 R11은 독립적으로 H, 알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 선택되거나, 또는 R10 및 R11은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성함)과 반응시켜, 알킨 (77)을 수득할 수 있다. 알킨 (77)을 중간체 (72) 또는 (73)과 (소노가시라 커플링을 통해) 반응시켜, 각각 화합물 (78) 및 (79), 또는 그에 대한 전구체 또는 전구약물 (여기서, R2 및 R3은 화학식 V 및 VI의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)을 수득할 수 있다.
<반응식 11>
Figure pct00061
반응식 11은 화합물 (72) 및 (73)의 알키닐화 유도체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 알킨 (81)의 합성을 위한 일반적인 방법을 도시한다. 부트-3-인-1-아민 (81) (여기서, R14 및 R15는 독립적으로 H, 알킬, 아릴, 헤테로아릴이거나, 또는 R14 및 R15는 이들이 부착되어 있는 탄소 원자와 함께 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성함)은 문헌 [Olomucki M. et al. (1960) Ann. Chim. 5:845]에 기재된 프로토콜을 이용하여 알킨 (80) (LG = 토실레이트 또는 다른 이탈기)을 화학식 R10R11NH의 아민 (여기서, R10 및 R11은 H, 알킬, 아릴 및 헤테로아릴로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R10 및 R11은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 헤테로시클릭 고리를 형성함)과 반응시킴으로써 제조할 수 있다. 후속적으로, 반응식 5 및 6에 제공된 설명에 따라 알킨 (81)을 중간체 (72) 또는 (73)과 (소노가시라 커플링을 통해) 반응시켜, 각각 화합물 (82) 및 (83), 또는 그에 대한 전구체 또는 전구약물 (여기서, R2 및 R3은 화학식 V 및 VI의 화합물에 대해 정의된 바와 같음)을 수득할 수 있다.
화학식 I 내지 VI의 티에노피리미딘 화합물의 제약상 허용되는 염은 통상적인 기법을 이용하여 제조할 수 있다. 전형적으로, 방법은 상기 정의된 것과 같은 화학식 I의 티에노피리미딘을 적합한 용매 중에서 적합한 산으로 처리하는 것을 포함한다.
상기에 정의된 바와 같은 본 발명의 방법에서, 아미노화 단계 및 Pd-매개 교차-커플링 단계 모두는 통상적인 조건 하에 일어난다. 팔라듐 촉매는 스즈끼-유형 교차-커플링을 위해 전형적으로 사용되는 임의의 것, 예컨대 PdCl2(PPh3)2일 수 있다. 환원제는 전형적으로 보로히드라이드, 예컨대 NaBH(OAc)3, NaBH4 또는 NaCNBH4이다.
신생물의 치료 방법
소정 실시양태는 (i) 자식증을 유도하는 키나제의 억제제, 및 (ii) 신생물의 치료에 유효한 양의 자식증의 억제제의 조합물을 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 신생물을 치료하는 방법을 포함한다. 키나제의 억제제 및 자식증의 억제제는 함께 또는 개별적으로 동시에 또는 상이한 시간대에 투여할 수 있다. 소정 실시양태에서, 자식증을 유도하는 키나제의 억제제 및 상기 자식증의 억제제는 상승작용적 유효량으로 존재한다.
또 다른 실시양태에서, (i) 자식증을 유도하는 키나제의 억제제, 및 (ii) 신생물의 치료에 유효한 양의 자식증의 억제제의 조합물을 투여하는 것을 포함하는포유동물에서 신생물을 치료하는 방법은 프로테아제 억제제를 투여하는 것을 더 포함한다. 프로테아제 억제제는 당업계에 잘 알려져 있다. 한 실시양태에서, 프로테아제 억제제는 라이소좀 시스테인 프로테아제 활성 또는 아스파르트산 프로테아제, 예컨대 펩스사틴 A를 억제한다. 키나제의 억제제, 자식증의 억제제 및 프로테아제 억제제는 하나로, 또는 임의의 조합으로 함께 또는 개별적으로 동시에 또는 상이한 시간대에 투여할 수 있다.
또한, 재발 종양 성장 또는 재발 암 세포 성장을 차단하거나 또는 감소시키는 방법이 제공된다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 대상체는 암 치료를 받았거나 또는 현재 받고 있다. 본원에 기재된 조합 요법의 투여는 재발 종양 성장 또는 재발 암 세포 성장을 차단하거나 또는 감소시킨다.
또 다른 실시양태는 (i) 자식증을 유도하는 키나제의 억제제, 및 (ii) 아폽토시스의 유도에 유효한 양의 자식증의 억제제를 암 세포에 투여하는 것을 포함하는, 암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 방법을 제공한다. 한 예에서, 유효량의 상기 키나제 억제제 및/또는 자식증의 억제제는 상승적 아폽토시스 유도 작용을 생성한다. 또 다른 예에서, 유효량의 상기 키나제 및/또는 상기 자식증의 억제제는 키나제 억제제 또는 자식증의 억제제 단독의 ED50, ED75 또는 ED90에 비해 낮은 ED50, ED75 또는 ED90을 갖는다. 한 예에서, 키나제 억제제 및 자식증의 억제제는 약 2:1 내지 약 1:50, 다르게는 약 1.25:1 내지 약 1:12, 다르게는 약 1:1 내지 약 1:5 범위의 비로 주어진다. 한 예에서, III-4는 CQ와 함께 약 1:25, 1:12.5, 1:1.5, 또는 1.3:1의 비로 투여된다.
임의의 변수가 임의의 구성성분 또는 화학식 I, II, III, IV, V 또는 VI에서 1개 초과 존재하는 경우에, 각 경우에서의 그의 정의는 모든 다른 경우에서의 그의 정의와는 무관하다. 또한, 치환기 및/또는 변수의 조합은 그러한 조합이 허용가능한 원자가를 생성하는 경우에만 허용된다.
본원에 기재된 신생물을 치료하는 방법은 RNA 간섭 (RNAi) 구축물인 자식증을 유도하는 키나제의 억제제를 자식증의 억제제와 함께 투여하는 것을 포함할 수 있다. 도 23은 이러한 RNAi 구축물이 RNA, DNA, 또는 RNA로 전사되는 DNA를 포함할 수 있음을 나타낸다. 바람직하게는, 자식증 억제제와 함께 본 방법에서의 RNAi 구축물의 사용은 신생물에 대한 상승적 사멸 또는 억제 효과를 유발한다.
RNA 구축물
또 다른 실시양태에서, 본원에 개시된 특징부는 본원에 기재된 RNAi 구축물에 관한 것이다. RNAi 구축물은 Akt의 유용한 억제제이다.
본원에서 사용되는 RNAi 구축물에는 shRNA, siRNA, DNA 지향 shRNA 및 siRNA, 및 또한 본원에 기재된 DNA 자체, DNA 올리고스 및 벡터가 포함된다. 특정 실시양태에서, siRNA 또는 shRNA는 1개 이상의 Akt 유전자에서의 표적 서열에 실질적으로 상응하는 핵산 서열을 포함하는 RNAi 구축물로부터 전사된다. 바람직하게는, 서열은 서열 39-48 및 그의 조합으로부터 선택된다. 세포로 도입되는 경우에, 이러한 RNAi 구축물은 1개 이상의 Akt 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다. 단백질의 발현의 감소는, 발현이 RNAi 구축물이 도입되지 않은 경우에 비해 세포에서 보다 적다는 것을 의미한다. 발현의 수준을 검출하기 위한 방법은 본원에 기재되어 있거나 또는 당업계에 알려져 있다. RNAi 구축물은 Akt1, Akt2, Akt3 및 그의 조합을 비롯한 AKT 동형체의 발현을 감소시킬 수 있다.
RNAi 구축물은 서열 1-18로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 실질적으로 상응하는 1개 이상의 DNA 서열을 포함할 수 있다. DNA 서열은 본원에 기재된 것과 같은 셔틀(shuttle)로 합성 및 클로닝될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 1개 이상의 Akt 단백질의 발현을 감소시킬 수 있는 RNAi 구축물은 서열 19-38 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 실질적으로 상응하는 RNA 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, RNAi 구축물은 센스 RNA 가닥 및 실질적으로 상보적 안티센스 RNA 가닥을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 안티센스 가닥은 서열 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 및 38로부터 선택된 서열에 실질적으로 상응하는 1개 이상의 서열을 포함하고, 여기서 상기 센스 및 안티센스 가닥은 RNA 이중나선으로서 어닐링된다. 이중나선은 서열 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35 및 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 실질적으로 상응하는 1개 이상의 서열을 포함하는 센스 가닥을 포함할 수 있다. 센스 및 안티센스 가닥은 하기를 포함하는 서열 쌍의 조합에서 이중나선을 형성하도록 어닐링될 수 있다: 서열 19:20, 21:22, 23:24, 25:26, 27:28, 29:30, 31:32, 33:34, 35:36 및 37:38, 및 상기 서열 쌍 중 1개 초과를 포함하는 조합. RNAi 구축물은 센스 가닥 및 안티센스 가닥을 공유적으로 연결하는 헤어핀(hairpin)을 함유할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 1개 이상의 Akt 단백질의 발현을 감소시킬 수 있는 RNAi 구축물이 본원에 기재되어 있다. 이러한 RNAi 구축물의 비제한적인 예에는 서열 32에 실질적으로 상응하는 뉴클레오티드 서열 및 추가적으로 서열 22, 26 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 실질적으로 상응하는 서열을 포함하는 구축물이 포함된다. 또 다른 비제한적인 예는 서열 31에 실질적으로 상응하는 뉴클레오티드 서열 및 추가적으로 서열 21, 25 및 35로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열에 실질적으로 상응하는 서열을 포함한다. 표적 Akt 동형체의 발현을 감소시키는 다른 조합은 본 개시내용으로부터 쉽게 얻을 수 있다.
또 다른 실시양태는 Akt 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 RNAi 구축물에 관한 것이며, 여기서 구축물은 다이서(Dicer)에 대한 기질이다. 또 다른 실시양태는 본원에 기재된 것과 같은 단리된 뉴클레오티드 또는 핵산 서열에 관한 것이다. 본원에 기재된 것과 같은 RNAi 구축물은 임의의 알려진 방법에 의해 제조할 수 있다 (문헌 [McIntyre, GJ, and Fanning GC, BMC Biotechnology (2006), 6:1]).
제약 제제
본 발명의 제약 조성물 또는 제제는 화학식 I 내지 VI의 화합물, 및 본원에 기재된 다른 화합물의 조합물, 자식증의 억제제, 및 1개 이상의 제약상 허용되는 담체, 활택제, 희석제 또는 부형제를 포함한다.
화학식 I 내지 VI의 화합물, 및 본원에 기재된 다른 화합물, 및 본 발명의 자식증의 억제제는 비-용매화된 형태, 및 또한 제약상 허용되는 용매, 예컨대 물, 에탄올 등으로의 용매화된 형태로 존재할 수 있으며, 본 발명은 용매화된 형태 및 비-용매화된 형태 둘 다를 포함하려고 한다.
또한, 화학식 I 내지 VI의 화합물, 및 본원에 기재된 다른 화합물, 및 본 발명의 자식증의 억제제는 상이한 호변이성질체 형태로 존재할 수 있으며, 이러한 형태 모두는 본 발명의 범주 내에 포함된다. 용어 "호변이성질체" 또는 "호변이성질체 형태"는 낮은 에너지 장벽을 통해 상호전환될 수 있는 상이한 에너지의 구조적 이성질체를 의미한다. 예를 들어, 양성자 호변이성질체 (또한, 양성자성 호변이성질체로도 알려져 있음)는 양성자의 이동을 통한 상호전환, 예컨대 케토-에놀 및 이민-엔아민 이성질체화를 포함한다. 원자가 호변이성질체는 일부 결합 전자의 재구성에 의한 상호전환을 포함한다.
제약 조성물은 임의의 제약상 불활성인 부형제, 희석제, 담체 또는 활택제와 함께 화학식 I 내지 VI 화합물, 및 본원에 기재된 추가의 제제의 목록으로부터 선택되는 자식증의 억제제를 포함하는 1종 초과 (예를 들어, 2종)의 제약 활성 제제로 구성된 벌크 조성물 및 개별 투여 단위 둘 다를 포함한다. 벌크 조성물 및 각각의 개별 투여 단위는 고정된 양의 상기 제약 활성 제제를 함유할 수 있다. 벌크 조성물은 아직 개개 투여 단위로 형성되지 않은 물질이다. 예시적인 투여 단위는 구강 투여 단위, 예컨대 정제, 환제, 캡슐 등이다. 유사하게, 본 발명의 제약 조성물의 투여에 의해 환자를 치료하는 본원에 기재된 방법은 또한 벌크 조성물 및 개별 투여 단위의 투여를 포함하려고 한다.
또한, 제약 조성물은 본원에서 언급된 것과 동일하지만 1개 이상의 원자가 자연에서 보통 발견되는 원자 질량 또는 질량수와는 상이한 원자 질량 또는 질량수를 갖는 원자에 의해 대체된 것인 본 발명의 동위원소 표지된 화합물을 포함한다. 명시된 것과 같은 임의의 특정 원자 또는 원소의 모든 동위원소 및 그의 사용이 본 발명의 화합물의 범주 내로서 고려된다. 본 발명의 화합물에 도입될 수 있는 예시적 동위원소는 수소, 탄소, 질소, 산소, 인, 황, 불소, 염소 및 요오드의 동위원소, 예컨대 2H, 3H, 11C, 13C, 14C, 13N, 15N, 15O, 17O, 18O, 32P, 33P, 35S, 18F, 36Cl, 123I 및 125I를 포함한다. 본 발명의 소정의 동위원소 표지된 화합물 (예를 들어, 3H 및 14C로 표지된 화합물)은 화합물 및/또는 기질 조직 분포 분석에 유용하다. 삼중수소화 (3H) 및 탄소-14 (14C) 동위원소가 제조 용이성 및 검출감도에 대하여 유용하다. 추가적으로, 보다 무거운 동위원소, 예컨대 중수소 (2H)로의 대체는 보다 큰 대사 안정성으로부터 기인하는 소정의 치료적 이점 (예를 들어, 증가된 생체내 반감기 또는 감소된 투여 요구량)을 수득할 수 있으며, 따라서 몇몇 상황에서 바람직할 수 있다. 양전자 방출 동위원소, 예컨대 15O, 13N, 11C 및 18F는 기질 수용체 점유를 검사하기 위한 양전자 방출 단층촬영 (PET) 연구에 유용하다. 본 발명의 동위원소 표지 화합물은 일반적으로 비-동위원소 표지 시약을 동위원소 표지 시약으로 대체하여 하기 본원에서의 반응식 및/또는 실시예에 개시된 것과 유사한 하기 절차에 의해 제조할 수 있다.
화학식 I 내지 VI의 화합물, 및 본원에 기재된 다른 화합물, 및 자식증의 억제제는 인간을 비롯한 포유동물에서의 과다증식성 장애의 치유적 치료 (예방적 치료 포함)를 위한 치료용 조합물에서 사용하기 위해 표준 제약 실무에 따라서 제제화된다. 본 발명은 화학식 I 내지 VI의 화합물을 1개 이상의 제약상 허용되는 담체, 활택제, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
적합한 담체, 희석제 및 부형제는 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 탄수화물, 왁스, 수용성 및/또는 팽윤성 중합체, 친수성 또는 소수성 물질, 젤라틴, 오일, 용매, 물 등과 같은 물질이 포함된다. 사용되는 특정 담체, 희석제 또는 부형제는 본 발명의 화합물이 적용되는 수단 및 목적에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 용매는 포유동물에 투여되기에 안전한 것으로 당업자에게 인식되는 (GRAS) 용매를 기초로 하여 선택된다. 일반적으로, 안전한 용매는 비독성 수성 용매, 예컨대 물, 및 물에 가용성 또는 혼화성인 다른 비독성 용매이다. 적합한 수성 용매에는 물, 에탄올, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들어, PEG 400, PEG 300) 등 및 이들의 혼합물이 포함된다. 또한, 제제는 하나 이상의 완충제, 안정화제, 계면활성제, 습윤제, 윤활제, 유화제, 현탁화제, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 활택제, 가공 보조제, 착색제, 감미제, 방향제, 향미제, 및 약물 (즉, 본 발명의 화합물 또는 그의 제약 조성물)을 모양 좋게 제공하거나 제약 생성물 (즉, 의약)의 제조를 돕는 다른 공지된 첨가제를 포함할 수도 있다.
제제는 통상적인 용해 및 혼합 절차를 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 벌크 약물 물질 (즉, 본 발명의 화합물 또는 안정화된 형태의 화합물 (예를 들어, 시클로덱스트린 유도체 또는 다른 공지된 복합체화제를 사용한 복합체))을 상기 기재된 부형제 중 하나 이상의 존재 하에 적합한 용매 중에 용해시킨다. 통상적으로, 본 발명의 화합물은 쉽게 제어가능한 투여량의 약물을 제공하고 환자가 처방된 투약법에 순응할 수 있도록 하기 위한 제약 투여 형태로 제제화된다.
적용될 제약 조성물 (또는 제제)은 약물 투여에 이용되는 방법에 따라 다양한 방식으로 포장될 수 있다. 일반적으로, 분배용 물품은 적절한 형태의 제약 제제가 안에 들어 있는 용기를 포함할 수 있다. 적합한 용기는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 병 (플라스틱 및 유리), 사쉐, 앰플, 플라스틱 백, 금속 실린더 등과 같은 재료가 포함된다. 용기는 또한 포장 내용물에 부주의하게 접근하는 것을 방지하기 위해 변경이 불가능한 조립물을 포함할 수 있다. 추가로, 용기에는 용기의 내용물을 기재한 라벨이 그 위에 부착되어 있다. 라벨은 또한 적절한 경고문을 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물의 제약 제제는 다양한 투여 경로 및 유형에 대해 제조될 수 있다. 예를 들어, 목적하는 정도의 순도를 갖는 화학식 I 내지 VI의 화합물 또는 본원에 기재된 또 다른 화합물을 동결건조된 제제, 분쇄된 분말, 또는 수용액의 형태로 임의로 제약상 허용되는 희석제, 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합할 수 있다 (문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (1995) 18th edition, Mack Publ. Co., Easton, PA]). 제제화는 주위 온도에서 및 적절한 pH에서 목적하는 정도의 순도로 생리학상 허용되는 담체, 즉, 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성인 담체와 혼합함으로써 수행될 수 있다. 제제화의 pH는 주로 특정 용도 및 화합물의 농도에 따라 달라지지만, 약 3 내지 약 8의 범위일 수 있다.
제약 제제는 바람직하게는 멸균된다. 특히, 생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이러한 멸균은 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
제약 제제는 통상 고체 조성물, 동결건조된 제제 또는 수용액으로서 보관될 수 있다.
본 발명의 제약 제제는 양호한 의료 행위에 부합하는 방식, 즉, 투여의 양, 농도, 스케쥴, 과정, 비히클 및 경로로 투약 및 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 요인에는 치료할 특정 장애, 치료받을 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄 및 의료 전문인에게 공지된 기타 요인이 포함된다. 투여될 화합물의 "치료적 유효량"은 이러한 고려사항에 따라 달라질 것이며, 응고 인자 매개 장애를 예방, 완화 또는 치료하는데 필요한 최소량이다. 이러한 양은 바람직하게는 수용자에게 독성인 양 미만이거나 또는 수용자를 출혈에 유의하게 더욱 민감하게 하는 양 미만이다.
일반적인 제시로서, 용량 당 경구 또는 비경구 투여되는, 화학식 I 내지 VI의 화합물, 또는 본원에 기재된 또 다른 화합물의 초기 제약상 유효량은 약 0.01-100 mg/kg, 즉, 약 0.1 내지 20 mg/환자 체중 kg/일의 범위일 것이며, 사용된 화합물의 전형적인 초기 범위는 0.3 내지 15 mg/kg/일이다.
허용되는 희석제, 담체, 부형제 및 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이며, 여기에는 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 복합체 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 포함된다. 활성 제약 성분은 또한 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 매크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, (1995) Mack Publ. Co., Easton, PA]에 개시되어 있다.
화학식 I 내지 VI의 화합물, 및 본원에 기재된 다른 화합물의 지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예에는 화학식 I의 화합물을 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 성형품의 형태, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (US 3773919), L-글루탐산 및 감마-에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.
제약 제제는 본원에 상술된 투여 경로에 적합한 제제를 포함한다. 제제는 편리하게 단위 투여 형태로 제조될 수 있으며, 약학계에 널리 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 기술 및 제제는 통상 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 18th Ed. (1995) Mack Publishing Co., Easton, PA]에 나타나 있다. 이러한 방법은 활성 성분과 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와의 회합을 수행하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분과 액체 담체 또는 미분된 고체 담체 또는 이들 둘 다와의 회합을 균일하게 및 밀접하게 수행하고, 이어서 필요한 경우에 제품을 성형함으로써 제조된다.
경구 투여에 적합한 화학식 I 내지 VI의 화합물, 및 본원에 기재된 다른 화합물, 및 자식증의 억제제의 제제를 각각 미리 정해진 양의 화학식 I 내지 VI의 화합물 또는 본원에 기재된 또 다른 화합물, 및 자식증의 억제제를 함유하는 분리된 단위, 예컨대 환제, 경질 또는 연질, 예를 들어 젤라틴, 캡슐, 사쉐, 트로키, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁액제, 분산가능한 산제 또는 입제, 에멀젼, 시럽 또는 엘릭시르로 제조할 수 있다. 이러한 제제는 제약 조성물의 제조에 대해 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 제조할 수 있으며, 이러한 조성물은 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제를 비롯한 하나 이상의 제제를 함유하여 미감이 향상된 제제를 제공할 수 있다. 압축 정제는 적합한 기계에서 자유 유동 형태, 예컨대 분말 또는 과립 형태의 활성 성분을 임의로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 계면 활성제 또는 분산제와 혼합하여 압축함으로써 제조될 수 있다. 주형정(molded tablet)은 적합한 기계에서 습윤화된 분말 활성 성분과 불활성 액체 희석제의 혼합물을 성형하여 제조될 수 있다. 정제는 임의로 코팅 또는 스코어링될 수 있고, 임의로 활성 성분의 지연 또는 제어 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다.
본 발명의 제약 제제의 정제 부형제에는 다음이 포함될 수 있다: 정제를 구성하는 분말화된 약물의 벌크 부피를 증가시키는 충전제 (또는 희석제); 삼켰을 때 정제를 작은 파편으로, 이상적으로는 개별 약물 입자로 분해시키는 것을 촉진하고, 약물의 빠른 용해 및 흡수를 증진하는 붕해제; 필요한 기계적 강도로 입제 및 정제를 형성할 수 있게 하고, 압축 후에 함께 정제를 유지시키며, 이들이 포장, 운송 및 통상의 취급 중에 그의 성분 분말로 분해되는 것을 방지하는 결합제; 생산 중에 정제를 구성하는 분말의 유동성을 개선하는 활택제; 제조 중에 정제를 압착하는데 이용되는 장치에 정제화된 분말이 부착되지 않게 하는 윤활제 (이는 압착으로부터 분말 혼합물의 유동성을 개선하고, 완성된 정제를 장치로부터 배출시켜 마찰 및 파손을 최소화함); 정제를 구성하는 분말 및 제조 중에 정제의 모양을 만드는데 사용되는 기계 사이의 점착을 감소시는, 활택제의 기능과 유사한 기능을 갖는 점착방지제; 정제에 혼입되어 더욱 향상된 미감을 제공하거나 또는 불쾌한 미감을 차폐하는 향미제, 및 식별 및 환자의 순응을 돕는 착색제.
활성 성분을 정제의 제조에 적합한 비독성의 제약상 허용되는 부형제와 혼합하여 함유하는 정제가 허용된다. 이러한 부형제는, 예를 들어 불활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘 또는 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨; 과립화제 및 붕해제, 예컨대 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예컨대 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 활석일 수 있다. 정제는 비코팅될 수 있거나, 또는 마이크로캡슐화를 비롯한 공지된 기술로 코팅되어 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시킴으로써 장기간에 걸쳐 지효성을 제공할 수 있다. 예를 들어, 시간 지연 물질, 예컨대 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 단독으로 또는 왁스와 함께 사용할 수 있다.
눈 또는 기타 외부 조직, 예를 들어 구강 및 피부의 치료를 위해, 제제는 바람직하게는 예를 들어 0.075 내지 20％ w/w의 양으로 활성 성분을 함유한 국소 연고 또는 크림으로 도포된다. 연고로 제제화되는 경우, 활성 성분은 파라핀 또는 수-혼화성 연고 기제와 함께 사용될 수 있다. 다르게는, 활성 성분을 수중유 크림 기제를 사용하여 크림으로 제제화할 수 있다.
원한다면, 크림 기제의 수성 상은 다가 알콜, 즉, 2개 이상의 히드록실기를 갖는 알콜, 예컨대 프로필렌 글리콜, 부탄 1,3-디올, 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜 (예를 들어, PEG 400), 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 국소 제제는 바람직하게는 피부 또는 다른 영향을 받는 부위를 통한 활성 성분의 흡수 또는 침투를 증진시키는 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 피부 침투 증진제의 예에는 디메틸 술폭시드 및 관련 유사체가 포함된다.
하나 이상의 유화제와 지방 또는 오일, 또는 지방 및 오일 둘 다와의 혼합물을 포함한 본 발명의 에멀젼의 오일 상은 공지된 성분으로부터 공지된 방식으로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 친수성 유화제는 안정화제로 작용하는 친유성 유화제와 함께 포함된다. 또한, 안정화제를 갖거나 갖지 않은 유화제는 유화 왁스를 구성하고, 오일 및 지방을 함께 갖는 왁스는 크림 제제의 오일 분산 상을 형성하는 유화 연고 기제를 포함한다. 본 발명의 제제에서 사용하기에 적합한 유화제 및 에멀젼 안정화제에는 트윈® 60, 스판(Span)® 80, 세토스테아릴 알콜, 벤질 알콜, 미리스틸 알콜, 글리세릴 모노-스테아레이트 및 나트륨 라우릴 술페이트가 포함된다.
본 발명의 제약 제제의 수성 현탁액은 활성 물질을 수성 현탁액을 제조하기에 적합한 부형제와 혼합하여 함유한다. 이러한 부형제에는 현탁화제, 예컨대 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 크로스카르멜로스, 포비돈, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트래거캔스 검 및 아카시아 검, 및 분산제 또는 습윤제, 예컨대 자연 발생 포스파티드 (예를 들어, 레시틴), 알킬렌 옥시드와 지방산의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 옥시드와 장쇄 지방족 알콜의 축합 생성물 (예를 들어, 헵타데카에틸렌옥시세탄올), 에틸렌 옥시드와, 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분 에스테르의 축합 생성물 (예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)이 포함된다. 수성 현탁액은 또한 하나 이상의 보존제, 예컨대 에틸 또는 n-프로필 p-히드록시벤조에이트, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 향미제 및 하나 이상의 감미제, 예컨대 수크로스 또는 사카린을 함유할 수 있다.
제약 조성물은 멸균 주사가능한 제제, 예컨대 멸균 주사가능한 수성 또는 유성 현탁액의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액은 상기 언급된 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제제화될 수 있다. 멸균 주사가능한 제제는 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 용액 또는 현탁액, 예컨대 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있거나, 또는 동결건조된 분말로부터 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이다. 또한, 멸균 고정유가 용매 또는 현탁 매질로서 통상적으로 사용될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노글리세리드 또는 디글리세리드를 포함하는 임의의 완하성 고정유가 사용될 수 있다. 추가로, 올레산과 같은 지방산도 또한 주사제의 제조에 사용할 수 있다.
단일 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료받는 수용자 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 인간에게 경구 투여되는 지속 방출 제제는 총 조성물의 약 5 내지 약 95％ (중량:중량)로 다양할 수 있는 적절하고 편리한 양의 담체 물질과 혼합된 약 1 내지 1000 mg의 활성 물질을 함유할 수 있다. 제약 조성물은 투여시 용이하게 측정가능한 양을 제공하도록 제조될 수 있다. 예를 들어, 정맥내 투입되는 수용액은 약 30 mL/hr의 속도로 적합한 부피의 투입이 일어날 수 있도록 용액 1 mL 당 약 3 내지 500 ㎍의 활성 성분을 함유할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제제에는 항산화제, 완충제, 정균제, 및 제제가 해당 수용자의 혈액과 등장성이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁화제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액이 포함된다.
또한, 눈에 국소 투여하기에 적합한 제제에는, 활성 성분이 적합한 담체, 특히 활성 성분을 위한 수성 용매에 용해 또는 현탁되어 있는 점안액이 포함된다. 활성 성분은 바람직하게는 이러한 제제에 약 0.5 내지 20％ w/w, 예를 들어 약 0.5 내지 10％ w/w, 예를 들어 약 1.5％ w/w의 농도로 존재한다.
구강에 국소 투여하기에 적합한 제제에는, 활성 성분을 향미 기제, 통상 수크로스 및 아카시아 또는 트래거캔스 중에 포함한 로젠지; 활성 성분을 불활성 기제, 예컨대 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아 중에 포함한 정제(pastille); 및 활성 성분을 적합한 액체 담체 중에 포함한 구강세정제가 포함된다.
직장 투여용 제제는 예를 들어 코코아 버터 또는 살리실레이트를 포함한 적합한 기제를 갖는 좌제로 제공될 수 있다.
폐내 또는 비측 투여에 적합한 제제는 예를 들어 0.1 내지 500 ㎛ 범위의 입자 크기 (예를 들어, 0.5, 1, 30 ㎛, 35 ㎛ 등과 같은 ㎛ 증가분의 0.1 내지 500 ㎛ 범위의 입자 크기)를 가지며, 이는 비도를 통한 신속한 흡입 또는 구강을 통한 흡입에 의해 투여되어 폐포낭에 이르게 된다. 적합한 제제는 활성 성분의 수성 또는 유성 용액을 포함한다. 에어로졸 또는 건조 분말 투여에 적합한 제제는 통상의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 다른 치료제, 예컨대 하기 기재된 바와 같이 장애의 치료 또는 예방에 사용되는 화합물과 함께 전달될 수 있다.
질 투여에 적합한 제제는 활성 성분에 추가하여 당업계에 적절한 것으로 공지된 바와 같은 담체를 함유하는 페사리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 발포체 또는 스프레이 제제로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 제제 (예를 들어, DNA, RNAi, shRNA, siRNA, 키나제 억제제, 화학요법제 또는 항암제)를 대상체에게 유전자 요법으로 투입할 수 있다는 것이 고려된다. 유전자 요법은 대상체에게 핵산을 투여함으로써 수행되는 요법을 나타낸다. 유전자 요법 적용에서, 유전자를 세포 내로 투입하여 치료적으로 효과적인 유전자 산물의 생체내 합성, 예를 들어 결손 유전자의 대체를 달성한다. "유전자 요법"은 단일 치료에 의해 지속적인 효과가 달성되는 통상적인 유전자 요법 및 치료적으로 효과적인 DNA 또는 mRNA의 1회 또는 반복 투여를 포함하는 유전자 치료제의 투여 둘 다를 포함한다. 안티센스 RNA 및 DNA가 생체내 특정 유전자의 발현을 차단하기 위한 치료제로 사용될 수 있다. 짧은 안티센스 올리고뉴클레오티드가, 세포막에 의한 그의 제한된 흡수로 인해 유발된 그의 낮은 세포내 농도에도 불구하고, 세포 내로 유입되어 억제제로 작용할 수 있다는 것은 이미 알려져 있다 (문헌 [Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 (1986)]). 올리고뉴클레오티드를, 예를 들어 그의 음전하 포스포디에스테르 기를 비전하 기로 대체함으로써 그의 흡수가 향상되도록 변형시킬 수 있다. 유전자 요법의 방법에 대한 개괄을 위해, 예를 들어 문헌 [Goldspiel et al. Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993)]; [Wu and Wu Biotherapy 3:87-95 (1991)]; [Tolstoshev Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993)]; [Mulligan Science 260:926-932 (1993)]; [Morgan and Anderson Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993)]; 및 [May TIBTECH 11:155-215 (1993)]을 참조한다. 이용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야에 통상 공지된 방법은 문헌 [Ausubel et al. eds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY]; 및 [Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY]에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, RNAi 구축물 또는 본 발명의 RNA 구축물을 형성하기 위한 DNA는 치료를 위해 세포로 전달되며, 자식증의 억제제와 조합하여 전달될 수 있다. DNA/RNA (임의로 벡터 내에 포함됨)를 환자의 세포로 생체내 및 생체외 투입하는 2가지 주요 접근법이 있다. 생체내 전달의 경우, DNA/RNA를 일반적으로 DNA/RNA가 필요한 부위로 환자에게 직접 주사한다. 생체외 치료의 경우, 환자의 세포를 꺼내어 DNA/RNA를 상기 단리된 세포에 투입하고, 변형된 세포를 환자에게 직접, 또는 예를 들어 환자에게 이식될 다공성 막 내로 캡슐화하여 투여한다 (예를 들어, 미국 특허 제4,892,538호 및 동 제5,283,187호 참조). 핵산을 생존가능한 세포로 투입하는데 이용가능한 다양한 기술들이 있다. 이러한 기술은 올리고뉴클레오티드를 배양된 세포로 시험관내 이동시키는지 또는 해당 수용자의 세포로 생체내 이동시키는지에 따라 달라진다. 올리고뉴클레오티드의 포유동물 세포로의 시험관내 이동에 적합한 기술에는 리포솜의 사용, 전기천공, 미세주입, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전 방법 등이 포함된다. 유전자의 생체외 전달에 통상 사용되는 벡터는 레트로바이러스 벡터이다.
생체내 핵산 이동 기술의 예에는 바이러스 벡터 (예컨대, 아데노바이러스, 단순포진 I 바이러스 또는 아데노-관련 바이러스) 및 지질-기재 시스템 (예를 들어, 유전자의 지질-매개 이동에 유용한 지질은 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임)을 이용한 형질감염이 포함된다. 현재 공지된 유전자 표시 및 유전자 요법 프로토콜의 개괄을 위해 문헌 [Anderson et al., Science 256:808-813 (1992)]을 참조한다. 또한, WO 93/25673 및 여기서 언급된 참고문헌을 참조한다. 유전자 요법에서의 바이러스 벡터 사용의 예는 문헌 [Clowes et al. J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994)]; [Kiem et al. Blood 83:1467-1473 (1994)]; [Salmons and Gunzberg Human Gene Therapy 4:129-141 (1993)]; [Grossman and Wilson Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993)]; [Bout et al. Human Gene Therapy 5:3-10 (1994)]; [Rosenfeld et al. Science 252:431-434 (1991)]; [Rosenfeld et al. Cell 68:143-155 (1992)]; [Mastrangeli et al. J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993)]; 및 [Walsh et al. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993)]에서 찾을 수 있다.
몇몇 상황에서, 핵산 공급원에 표적 세포를 표적화하는 제제, 예컨대 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등에 특이적인 항체를 제공하는 것이 바람직하다. 리포솜을 사용하는 경우, 엔도시토시스(endocytosis)와 관련된 세포 표면 막 단백질과 결합한 단백질, 예를 들어 특정 세포 유형에 대해 영양성인 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 순환시 내재화되는 단백질에 대한 항체, 세포내 국소화를 표적화하고 세포내 반감기를 향상시키는 단백질을 표적화 및/또는 흡수를 용이하게 하는데 사용할 수 있다. 수용체-매개 엔도시토시스의 기술은 예를 들어 문헌 [Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987)]; 및 [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)]에 기재되어 있다. 유전자 표시 및 유전자 요법 프로토콜의 개괄을 위해 문헌 [Anderson et al., Science 256, 808-813 (1992)]을 참조한다.
제제는 또한 단위-투여 또는 다중-투여 용기, 예를 들어 밀봉된 앰플 및 바이알에 포장될 수 있고, 사용 직전에 주사를 위해 멸균 액체 담체, 예를 들어 물의 첨가만이 요구되는 냉동-건조 (동결건조) 상태로 저장될 수 있다. 즉시투여용 주사 용액 및 현탁액은 앞서 기재한 종류의 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조된다. 바람직한 단위 투여 제제는 활성 성분을 본원에 상기 언급한 바와 같은 1일 용량 또는 단위 1일 분할-용량 또는 그의 적절한 분획으로 함유하는 것이다.
추가로, 본 발명은 상기 정의된 바와 같은 하나 이상의 활성 성분을 이를 위한 수의학적 담체와 함께 포함하는 수의학적 조성물을 제공한다. 수의학적 담체는 조성물 투여 목적에 유용한 물질이고, 불활성이거나 수의학 업계에서 허용되는 고체, 액체 또는 기체 물질일 수 있고, 활성 성분과 상용성이다. 이러한 수의학적 조성물은 비경구, 경구 또는 임의의 다른 원하는 경로로 투여될 수 있다.
조합 요법
조합 요법은 동시적 또는 순차적 치료계획(regimen)으로서 투여될 수 있다. 순차적으로 투여되는 경우, 조합은 2개 이상의 투여로 투여될 수 있다. 조합 투여는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 이용한 공동투여, 및 임의의 순서의 연속적 투여를 포함하며, 여기서 바람직하게는 둘 다의 (또는 모든) 활성제가 그의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 일정 시간의 기간이 존재한다.
상기 임의의 공동투여된 제제에 대한 적합한 투여량은 현재 사용되는 것이며, 새로 확인된 제제 및 자식증 또는 치료의 다른 억제제의 조합 작용 (상승작용) 때문에 감소될 수 있다.
항암 요법의 특정 실시양태에서, 화학식 I 내지 VI의 화합물 또는 본원에 기재된 다른 화합물 또는 그의 입체이성질체, 기하이성질체, 호변이성질체, 용매화물, 대사물질 또는 제약상 허용되는 염은 자식증의 억제제와 조합되며, 추가로 수술 요법 및 방사능요법과 조합된다. 화학식 I 내지 VI의 화합물(들) 또는 본원에 기재된 다른 화합물 및 자식증의 억제제(들)의 양 및 투여의 상대적 시기는 원하는 조합 치료 효과를 달성하기 위하여 선택될 것이다. 한 실시양태에서, 치료 효과는 상승 효과이다.
본 발명의 화합물은 치료할 상태에 적절한 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 적합한 경로는 경구, 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 동맥내, 흡입, 피내, 척수강내, 경막외 및 주입 기술 포함), 경피, 직장, 비측, 국소 (협측 및 설하 포함), 질, 복강내, 폐내 및 비강내를 포함한다. 국소 투여는 또한 경피 패치 또는 이온도입 장치와 같은 경피 투여의 이용을 포함할 수 있다. 약물의 제조는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., (1995) Mack Publishing Co., Easton, PA]에 논의된다. 약물 제조의 다른 예는 문헌 [Liberman, H. A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, Vol 3, 2nd Ed., New York, NY]에서 발견할 수 있다. 국소 면역억제 치료를 위하여, 화합물은 이식 전 이식편을 억제제로 관류하거나 달리 접촉하는 것을 비롯하여 병변내 투여에 의해 투여할 수 있다. 바람직한 경로는 예를 들어 수용자의 상태에 따라 달라질 수 있음을 알 것이다. 화합물이 경구 투여되는 경우, 이는 제약상 허용되는 담체, 활택제, 또는 부형제를 이용하여 환제, 캡슐제, 정제 등으로 제제화될 수 있다. 화합물이 비경구 투여되는 경우, 이는 제약상 허용되는 비경구 비히클 또는 희석제를 이용하여 하기 상술하는 바와 같은 단위 투여량 주사용 형태로 제제화될 수 있다.
인간 환자를 치료하기 위한 투여량은 화학식 I 내지 VI 화합물 약 10 mg 내지 약 1000 mg 범위일 수 있다. 전형적인 투여량은 화합물 약 100 mg 내지 약 300 mg일 수 있다. 투여량은 1일 1회 (QID), 1일 2회 (BID), 또는 특정 화합물의 흡수, 분포, 대사 및 배출을 비롯하여 약동학 (PK) 및 약력학 (PD) 특성에 따라 더욱 빈번하게 투여될 수 있다. 또한, 독성 인자는 투여량 및 투여 치료계획에 영향을 줄 수 있다. 경구 투여되는 경우, 환제, 캡슐제 또는 정제가 매일 또는 특정 기간 동안 덜 빈번하게 섭취될 수 있다. 치료계획은 다수의 치료 주기 동안 반복될 수 있다.
제조 용품
자식증을 유도하는 키나제의 억제제 및 자식증의 억제제의 조합의 키트도 또한 제공된다. 특정 실시양태에서, 키트는 자식증을 유도하는 키나제의 억제제 및 자식증의 억제제, 제약상 허용되는 담체, 비히클 또는 희석제 및 용기를 포함한다. 사용을 위한 설명서도 또한 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 상기 제시된 질환 및 장애의 치료에 유용한 화학식 I 내지 VI의 화합물을 함유하는 제조 용품 또는 "키트"가 제공된다. 한 실시양태에서, 키트는 화학식 I의 화합물, 또는 그의 입체이성질체, 기하이성질체, 호변이성질체, 용매화물, 대사물질, 또는 제약상 허용되는 염을 포함하는 용기를 포함한다. 키트는 상기 용기 상에 또는 그와 함께 라벨 또는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 시판되는 포장물 내에 통상적으로 포함되어 있으며 이러한 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 사용법, 투여량, 투여, 금기 사항 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 지침서를 지칭하는데 사용된다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, 블리스터 팩 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예를 들어 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 화학식 I 내지 VI의 화합물 또는 상태를 치료하기에 효과적인 그의 제제를 보유할 수 있고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 스토퍼를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물에서의 하나 이상의 활성제는 화학식 I 내지 VI의 화합물, 또는 본원에 기재된 화합물이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 암과 같은 선택된 상태를 치료하기 위해 사용된다고 기재한다. 한 실시양태에서, 라벨 또는 패키지 삽입물은 화학식 I 내지 VI의 화합물, 또는 본원에 기재된 화합물을 포함하는 조성물이 비정상 세포 성장으로 야기된 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다고 기재한다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 또한 다른 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다고 기재할 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 제조 용품은 주사용 정균수 (BWFI), 인산염-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 제약상 허용되는 완충제를 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 비롯하여 시판되는 사용자 입장에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
키트는 추가로 화학식 I 내지 VI의 화합물 또는 본원에 기재된 화합물 및 존재한다면, 제2 제약 제제의 투여를 위한 설명서를 포함할 수 있다. 예를 들어, 키트가 화학식 I 내지 VI의 화합물 또는 본원에 기재된 화합물을 포함하는 제1 조성물 및 제2 제약 제제를 포함하는 경우, 키트는 추가로 그를 필요로 하는 환자로의 제1 및 제2 제약 조성물의 동시적, 순차적 또는 별개의 투여를 위한 설명서를 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 키트는 정제 또는 캡슐과 같은 화학식 I 내지 VI의 화합물 또는 본원에 기재된 화합물의 고체 경구 형태를 전달하는 데 적합하다. 바람직하게는, 이러한 키트는 수많은 단위 투여량을 포함한다. 이러한 키트는 의도된 사용 순서로 배열된 투여량을 갖는 카드를 포함할 수 있다. 이러한 키트의 예는 "블리스터 팩"이다. 블리스터 팩은 포장 산업에 널리 공지되어 있으며, 제약 단위 투여 형태를 포장하기 위해 널리 이용된다. 바람직한 경우, 기억 보조품이 예를 들어 숫자, 문자 또는 다른 표기 형태로, 또는 투여량이 투여될 수 있는 치료 스케쥴에서 날짜가 지정되어 있는 달력 삽입물과 함께 제공될 수 있다.
한 실시양태에 따르면, 키트는 (a) 제1 용기와 거기에 함유된 화학식 I 내지 VI의 화합물 또는 본원에 기재된 화합물, 및 임의로 (b) 제2 용기와 거기에 함유된 제2 제약 제제를 포함할 수 있고, 여기서 제2 제약 제제는 항-과증식성 활성을 갖는 제2 화합물을 포함한다. 다르게는 또는 추가로, 키트는 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 인산염-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제3 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 비롯하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
키트가 화학식 I 내지 VI의 조성물 또는 본원에 기재된 화합물, 및 제2 치료 제제, 즉, 자식증의 억제제를 포함하는 경우, 키트는 분할된 병 또는 분할된 호일 패킷과 같이 별개의 조성물을 함유하기 위한 용기를 포함할 수 있지만, 상기 별개의 조성물은 또한 단일의 미분할 용기에 함유되어 있을 수도 있다. 전형적으로, 키트는 별개의 성분들을 투여하기 위한 설명서를 포함한다. 키트 형태는 별도의 성분을 바람직하게는 상이한 투여 형태 (예를 들어, 경구 및 비경구)로 투여하거나, 상이한 투여 간격으로 투여하거나, 또는 처방의가 조합물의 개별 성분의 적정이 바람직하다고 한 경우에 특히 유리하다.
자식증을 유도하는 키나제 억제
본원에 제공된 데이타는 Akt 억제, 및 유사하게, 다른 특정 키나제의 억제가 분명한 아폽토시스 반응을 항상 유도하는 것은 아님을 나타낸다. 자식증은 팬-Akt 넉다운 또는 억제, Akt-이소형 선택적 넉다운 또는 억제, 또는 Akt, PI3K, mTOR, PDK1 또는 p70S6K 경로의 소분자 억제제에 대한 쉽게 검출가능한 반응이다. 키나제-억제-유도된 자식증은 종양 세포를 상기 리소좀 분해 경로를 표적으로 하는 제제에 감수성이게 할 수 있다. 실로, 리소좀 분해 기능을 차단하는 제제는, 자식증을 유도하고 전임상 모델에서의 완전한 종양 경감을 촉진하는 키나제 억제제와 조합되는 경우, 세포 사멸에 참여할 수 있다. 자식 반응을 억제, 표현 또는 차단하는 것은 자식증을 유도하는 키나제 억제제, 예를 들어 Akt, PI3K, mTOR, PDK-1 및 p70S6K 억제제의 치료 효과를 증가시키는 유망한 전략일 수 있다.
자식증은 예를 들어 암 세포주에서의 아폽토시스보다 Akt 억제에 보다 감수성인 반응이다. 수많은 보고들이 다양한 암에서의 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K)/Akt 경로의 탈규제를 기재하였으며, 이는 제어되지 않은 성장 및 증식 뿐 아니라, 다양한 세포 사멸 자극에 대한 저항성을 유발한다 (Manning BD, Cantley LC. AKT/PKB signaling: navigating downstream. Cell 2007; 129:1261-74; Samuels Y, Ericson K. Oncogenic PI3K and its role in Cancer. Curr Opin Oncol 2006; 18:77-82). 따라서, 예를 들어 상기 경로의 중심절에서의 세린/트레오닌 키나제인 Akt 또는 억제가 자식증을 유도하는 다른 키나제를 표적화하는 것은 악성 세포의 성장 및 생존 둘 다를 억제할 수 있다.
Akt가 다양한 프로-아폽토시스 공격 후의 프로그래밍된 세포 사멸로부터 세포를 보호하는 데에 있어 결정적인 역할을 한다고 여겨지지만 (Manning BD, et al.; Downward J. Mechanisms and consequences of activation of protein kinase B/Akt. Curr Opin Cell Biol 1998; 10:262-7), 아폽토시스가 Akt 활성을 단독으로 억제하는 것에 대한 우세한 반응인지의 여부를 결정하는 일이 남는다. 조사된 암 세포주의 유의한 비율에서의 특이적 억제제 결과 뿐만 아니라 3개의 Akt 이소형 각각을 특이적으로 넉다운시키는 RNA 간섭 기술은 3개의 Akt 이소형 모두가 크게 감소된 때조차 아폽토시스를 쉽게 경험하지 않는다. (Koseoglu S, Lu Z, Kumar C, Kirschmeier P, Zou J. AKT1, AKT2 and AKT3-dependent cell survival is cell line-specific and knockdown of all three isoforms selectively induces apoptosis in 20 human tumor cell lines. Cancer Biol Ther 2007; 6:755-62). 이는 총 Akt 활성의 오직 작은 부분만이 마우스 배아 섬유아세포 (MEF) 세포에서의 아폽토시스 억제에 요구된다는 보고와 일치한다 (Liu X, Shi Y, Birnbaum MJ, Ye K, De Jong R, Oltersdorf T, Giranda VL, Luo Y. Quantitative analysis of anti-apoptotic function of Akt in Akt1 and Akt2 double knock-out mouse embryonic fibroblast cells under normal and stressed conditions. J Biol Chem 2006; 281:31380-8). Akt 억제시 아폽토시스 유도에 대한 암 세포의 감수성은 그의 유전적 배경 및 환경적 조건 둘 다에 대해 의존성일 가능성이 있다. 예를 들어, 활성화된 Akt의 더 높은 수준이 상기 경로에 대한 종양 세포의 상대적 의존성을 시사할 수 있고, Akt 억제에 대한 아폽토시스 반응의 약간 더 나은 예측변수일 수 있지만, 아폽토시스에 대한 저항이 또한 PI3K/Akt 활성을 음으로 조절하는 종양 억제자인 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN)의 손실을 갖는 것을 비롯하여 Akt 활성화를 가진 세포에서 관찰된다 (Koseoglu S, et al). 아폽토시스가 엄중한 선택 압력을 통한 그의 진화의 결과로서 진행된 암 세포에서의 다중 메카니즘에 의해 억제될 수 있다고 생각할 수 있다.
반대로, PTEN-null 세포주 PC3 및 U87MG이 둘 다 3개 모든 Akt 이소형 (shAkt123)의 유도성 shRNA 넉다운에 대해 반응하는 아폽토시스에 저항성이지만, 데이타는 두 세포주 모두에서의 유의하게 상승된 자식증을 나타낸다. 자식증은 아폽토시스가 이들 세포에서 유도되든 아니든, 특이적 shRNA 넉다운 또는 다양한 세포주에서의 경로의 선택적 억제제에 의해 유발되는 감소된 Akt 활성에 대해 보다 감수성인 반응인 것으로 보인다 (Degtyarev and Lin, 상기 작업물 및 비공개 데이타).
자식 분해 차단은 Akt 억제와 조합으로 세포 사멸을 가속화하였다. 자식증은 상황 및 세포 사정에 따라 세포 사멸의 메카니즘 및 세포보호 과정 둘 다로서 연루되었다 (Scarlatti F, Granata R, Meijer AJ, Codogno P. Does autophagy have a license to kill mammalian cells? 2008). 그러나, shAkt123을 발현하는 PC3 세포는 감소된 혈청 조건 하에서조차 생존력의 유의한 손실 없이 연장된 기간 동안 생존할 수 있다. 이종이식 종양으로서 성장되는 경우, shAkt123의 연속적인 발현이 종양 성장을 최초로 효과적으로 억제할 수 있지만, 종양의 대부분은 완전히 퇴행하는 데에 실패하였고, 억제를 궁극적으로 극복하였고, 2-3주 내에 되돌아왔다. 이는 Akt를 단독으로 억제함으로써 유도된 자식증이 상기 조건하에서 암 세포를 효과적으로 제거하지 않음을 시사한다.
자식증이 Akt 넉다운 또는 소분자 억제제에 대해 보다 감수성인 반응이기 때문에, 효과적인 자식증을 차단하는 것은 Akt 억제와 조합으로 세포 사멸을 가속화할 수 있다. 라이소좀자극제 클로로퀸 (CQ)은, shAkt123을 발현하거나 경로의 상대적으로 특이적인 소분자 억제제인 PI-103 (클래스 III PI3K보다 클래스 I에 대해 1,000x 더 강력한 PI3K/mTOR 억제제) (Knight ZA, Gonzalez B, Feldman ME, Zunder ER, Goldenberg DD, Williams O, Loewith R, Stokoe D, Balla A, Toth B, Balla T, Weiss WA, Williams RL, Shokat KM. A pharmacological map of the PI3-K family defines a role for p110alpha in insulin signaling. Cell 2006; 125:733-47) 및 Akti-1/2 (선택적 듀얼 Akt1,2 억제제) (Barnett SF, Defeo-Jones D, Fu S, Hancock PJ, Haskell KM, Jones RE, Kahana JA, Kral AM, Leander K, Lee LL, Malinowski J, McAvoy EM, Nahas DD, Robinson RG, Huber HE. Identification and characterization of pleckstrin-homology-domain-dependent and isoenzyme-specific Akt inhibitors. Biochem J 2005; 385:399-408) (이들은 둘 다 명시적인 자식증을 유도하였음)로 처리된 세포에서 사망률을 유의하게 가속화하였다. 리소좀 산성화를 손상시키는 공포 양성자 펌프 (V-H+-에이티피아제)의 억제제인 바필로마이신 A1로 유사한 결과가 얻어졌다 (Yamamoto A, Tagawa Y, Yoshimori T, Moriyama Y, Masaki R, Tashiro Y. Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct 1998; 23:33-42). CQ 및 Akt 억제제의 상승적 성장 억제 효과가 또한 암 세포주의 확대된 패널에서 관찰되었다.
CQ 및 Akt 경로 억제제 둘 다로 처리된 세포에서의 세포 사멸의 개시는 확대된 자가리소좀-유사 공포의 축적의 후에 일어났다. Akt 억제 및 CQ가 둘 다 단독으로 자식 공포 (AV)의 축적을 유도하였지만 (도 25a-c), 추가의 분석으로 Akt 억제가 단독으로 카텝신 D 및 리소좀 활성의 생성 및 성숙의 증가를 유발한 반면, CQ는 카텝신 D의 성숙을 차단하여 Akt 억제가 있는 세포에서 매우 크고 분해-결손의 가능성이 있는 공포의 축적을 유발하였음이 드러났다. 이는 카스파제 3의 활성화 및 아폽토시스 핵에서의 극적인 증가와 상관되었다 (도 25d,e). Akt 억제제 단독으로 처리된 세포에서 미토콘드리아 탈분극 및 활성 산소종 (ROS) 발생의 증가가 존재하였다. 세포질 ROS 발생은 Akt 억제제 단독으로 48시간 이내에 감소되었으나, CQ 공동-처리는 세포질 및 공포에서 둘 다 연장된 ROS 축적을 유발하였다. 증가된 리소좀 막 투과성 (LMP)으로 인한 카텝신 D의 세포질 전좌 및 그 후의 세포질 ROS 스캐빈저 티오레독신의 분해는 또다른 자식증 유도자와 조합하여 ROS 축적 및 CQ에 의한 세포 사멸 유도의 메카니즘으로서 이전에 제안되었다 (Carew JS, Nawrocki ST, Kahue CN, Zhang H, Yang C, Chung L, Houghton JA, Huang P, Giles FJ, Cleveland JL. Targeting autophagy augments the anticancer activity of the histone deacetylase inhibitor SAHA to overcome Bcr-Abl-mediated drug resistance. Blood 2007; 110:313-22). LMP가 여전히 세포 사멸에 기여하는 가능한 다운스트림 사건일 수 있지만, 우리의 시스템에서 세포 사명의 개시 이전에 티오레독신 분해의 유의한 증가 (Degtyarev and Lin, 미공개 데이타)는 관찰되지 않았다. 반대로, 카텝신 D 넉다운 또는 리소좀 프로테아제 활성의 억제는 CQ/Akti-1/2-유도된 세포 사멸로부터 세포를 보호할 수 없으나, 오히려 Akti-1/2와 조합되는 경우 세포 사멸을 촉진시키는 데에 있어 CQ와 유사한 효과를 가졌다. 이는 카텝신 D 성숙에 대한 CQ 및 Akti-1/2의 반대 효과와 일치하며, (상승된) 리소좀 분해 활성을 보존하는 것이 Akt 억제에 의해 유도된 상승된 자식 활성의 존재 하에 세포 생존을 위해 결정적일 수 있음을 시사한다. 종합하면, 이러한 발견은 Akt 억제에 의해 유발된 제한된 미토콘드리아 탈분극이 자식증을 촉진하는 ROS 신호 증가를 유발하고 (Scherz-Shouval R, Shvets E, Fass E, Shorer H, Gil L, Elazar Z. Reactive oxygen species are essential for autophagy and specifically regulate the activity of Atg4. Embo J 2007; 26:1749-60), 이는 차례로 손상된 미토콘드리아를 제거하고 산화 스트레스를 완화한다는 모델을 뒷받침한다. CQ에 의해 유발된 자가리소좀 소화의 손상은 유해한 산화 산물의 응집을 유발하였고, 이는 ROS 손상을 추가로 증폭시킬 수 있었다 (Moore MN, Viarengo A, Donkin P, Hawkins AJ. Autophagic and lysosomal reactions to stress in the hepatopancreas of blue mussels. Aquat Toxicol 2007; 84:80-91). 카스파제 활성화 및 아마도 LMP를 비롯한 다중 다운스트림 사건은 아폽토시스-유사 및 비-아폽토시스 세포 사멸 둘 다를 유발할 수 있다 (도 24). 이론에 구속되지 않으면서, 도 24는 자식증 억제제 (클로로퀸)와 조합된 Akt 억제에 의한 세포 사멸의 메카니즘의 모델을 도시한다.
팬-Akt 억제제의 투여는 그의 부작용, 가장 현저하게는 인슐린 신호전달의 억제로 인한 대사 사건에 의해 제한될 가능성이 있을 것이다 (Amaravadi et al, 2005). 우리의 데이타는 적어도 PTEN-null PC3 이종이식 종양과 같은 암 모델에서, 종양 세포의 완전한 제거가 연속적인 팬-Akt 넉다운 단독으로 달성가능하지 않을 수 있음을 시사한다. 그러나, CQ 단독으로는 유의한 효과를 갖지 않았지만, CQ와의 조합 처리는 이종이식 모델에서의 완전한 종양 경감의 발생을 유의하게 증가시켰다. 이는 Akt 억제를 통한 자식증 유도가 다른 적응증에 대해 임상적으로 허가된 상기 상대적으로 비독성인 약물에 대해 종양을 감수성이게 할 수 있음을 시사한다.
자식증의 부적절한 억제는 그의 종양 억제 기능의 손실을 유발할 수 있거나 다른 생존 경로의 상향조절을 유발할 수 있다 (Levine B. Cell biology: autophagy and cancer. Nature 2007; 446:745-7; Wang Y, Singh R, Massey AC, Kane SS, Kaushik S, Grant T, Xiang Y, Cuervo AM, Czaja MJ. Loss of macroautophagy promotes or prevents fibroblast apoptosis depending on the death stimulus. J Biol Chem 2008; 283:4766-77). 본원의 데이타는 결함이 있는 자가리소좀의 축적이 CQ의 효과를 위해 요구됨을 시사한다. 자식 격리가 발생하도록 하면서 분해를 차단하는 것의 한 잠재적인 장점은 이것이 리포푸신과 같은 결함이 있는 자가리소좀에서 보다 독성인 ROS 발생자의 형성을 유발할 수 있고 (Terman A, Gustafsson B, Brunk UT. The lysosomal-mitochondrial axis theory of postmitotic aging and cell death. Chem Biol Interact 2006; 163:29-37; Moore MN, Viarengo A, Donkin P, Hawkins AJ. Autophagic and lysosomal reactions to stress in the hepatopancreas of blue mussels. Aquat Toxicol 2007; 84:80-91), 따라서 보다 신속한 세포 사멸 유도를 야기한다는 것이다. 또한, 세포는 자식 반응에 이미 잘 연합된 후에는 쉬운 탈출을 발견할 수 없다.
PI3K/Akt 경로는 인간 암에서의 임의의 다른 경로보다 더욱 빈번하게 게놈 일탈에 의해 표적화된 다중 요소를 가진 세포 성장 및 생존의 많은 측면에 결정적이어서, 이는 암 요법에 대한 매력적인 표적이 된다. Akt 억제제의 임상 결과의 기저를 이루는 결정적인 질문은 필요한 3개의 이소형 사이의 선택성의 정도 및 이들 키나제를 억제하는 것으로부터 예상되는 종양 세포 성장 및 생존에 대한 효과이다. Akt1 및 Akt2를 향한 전례 없는 선택성을 가진 최근 기재된 알로스테리 Akt 억제제는 이들 질문을 다루기 시작하는 소중한 도구를 제시한다 (Barnett, S.F., M.T. Bilodeau, and C.W. Lindsley, (2005), The Akt/PKB family of protein kinases: a review of small molecule inhibitors and progress towards target validation. Curr Top Med Chem. 5:109-25). 그러나, 지금까지 소분자 억제제는 달성될 수 있는 특이성의 정도에서 제한되고, 보고된 화합물의 생체내 효과는 불량한 약리학적 특성 때문에 평가되지 않았다. 또한, Akt3 선택적 화합물은 보고된 적이 없다.
RNA 간섭은 유전자 발현을 저해하기 위한 강력한 방법이다. Dox-유도성 shRNA 접근법을 이용하여, 우리는 생체내 종양 성장의 유지에서 각각의 이소형의 요건을 평가하기 위하여, 개별적으로 및 모든 가능한 조합으로, 각각의 Akt 이소형의 특이적 KD를 달성할 수 있다. 본원에 제공된 데이타 결과는 Pten-안드로겐-독립적 전립선암 암 모델 PC3 및 교모세포종 모델 U87MG 둘 다에서, Akt1가 종양 성장을 유지하는 데에 가장 중요한 이소형임을 시사한다. 이는 Akt1 결핍이 Pten+/- 마우스에서, Akt1이 우세하게 발현된 이소형인 조직 및 Akt1가 그렇지 않은 조직 둘 다에서, 종양의 발생을 현저히 감소시킬 수 있다는 최근의 보고와 상응한다 (Chen et al., 2006). 그러나, 마우스 유전자 연구에서, Akt1은 Pten+/- 마우스에서 종양의 발전 전에 제거된 반면, 본 연구에서 우리는 Akt1 KD가 유도되기 전에 종양이 확립하게 하였다. 따라서, Akt1 활성을 감소시키는 것은 종양이 발전하지 않게 할 뿐 아니라, 인간 암 모델에서 PTEN 결핍을 가진 확립된 종양의 성장을 억제한다.
Akt2 및 Akt3의 추가의 KD는 보다 일관되고 확연한 종양 성장 억제를 야기하였다. 이는 Akt2 및 Akt3 활성이 종양 성장을 유지함에 있어 감소된 Akt1 활성에 대해 부분적으로 보상할 수 있음을 시사한다. 이는 조합된 Akt KD로 관찰된 다운스트림 표적의 보다 효과적인 억제와 일치한다. Akt2의 동시적 KD에 의해 대항될 수 있는 Akt1 단독 억제와 연합된 침습력 증가에 대한 최근 보고를 종합하면, 고도로 선택적인 Akt1 억제가 바람직하지 않을 수 있다. 본원에 제시된 데이타는 3개 모든 이소형의 부분적 KD가 종양 성장 억제에 보다 효과적일 수 있음을 시사한다. 그럴싸한 시나리오는 3개 모든 Akt 이소형을 (그러나 상이한 활성 KD의 정도로) 억제하여 그의 정상 생리 기능을 위한 결정적인 수준의 이소형 활성을 보존하면서, 종양 성장 및 진행에 대한 최대 억제 효과를 달성하는 것일 수 있다.
Akt의 가장 두드러진 기능 중 하나는 세포 생존을 매개하는 것이다. 본질적으로 활성인 Akt는 다양한 프로-아폽토시스 공격 후의 프로그래밍된 세포 사멸로부터 세포를 보호한다고 보고되었다. 그러나, 특히 아폽토시스가 다양한 유전자 변경으로 인해 종종 저해되는 암 세포에서, 아폽토시스가 Akt 억제에 대한 일차 반응인지의 여부는 덜 분명하다. PI3K/Akt 경로의 소분자 억제제를 이용하는 이전의 실험은 종종 이들 화합물의 불가피한 비-특이적 효과에 의해 모호하게 되는 상충되는 결과를 생성한다. 본원에 제시된 데이타는 정상 세포 배양 조건하에서, 임의의 또는 모든 3개의 Akt 이소형의 특이적 KD가 유의한 아폽토시스를 촉진하지 않으면서 세포 주기 지연을 유발할 수 있음을 나타낸다. 이는 총 Akt 활성 중 단지 작은 부분만이 정상 성장 조건하에서 아폽토시스 억제를 위해 요구된다는 최근의 보고와 일치한다 (Liu, X., Y. Shi, M.J. Birnbaum, K. Ye, R. De Jong, T. Oltersdorf, V.L. Giranda, and Y. Luo, (2006), Quantitative analysis of anti-apoptotic function of Akt in Akt1 and Akt2 double knock-out mouse embryonic fibroblast cells under normal and stressed conditions. J Biol Chem. 281:31380-8). 반대로, 유의하게 증가된 자식증이 Akt KD가 있는 PC3 및 U87MG 세포 둘 다에서 관찰되었으며, 이는 자식증이 감소된 Akt 활성에 대한 보다 감수성인 반응임을 시사한다. 이는 듀얼 PI3K/mTOR 억제제 및 듀얼 Akt1,2 억제제를 비롯하여 경로의 상대적으로 특이적인 억제제를 사용함으로써 추가로 입증된다.
Akt 억제-유도된 자식증의 분자 메카니즘이 추가로 설명되어야 하는 것으로 남아 있지만, 몇몇 가능성은 존재한다. 첫째, Akt를 억제하는 것은 공지된 자식증의 억제제인 mTOR의 억제를 야기할 수 있다. 흥미롭게도, Akt의 본질적으로 활성인 형태는 라파마이신에 의한 자식증의 유도를 저해하는 것으로 나타났고 (Takeuchi, H., Y. Kondo, K. Fujiwara, T. Kanzawa, H. Aoki, G.B. Mills, and S. Kondo, (2005), Synergistic augmentation of rapamycin-induced autophagy in malignant glioma cells by phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B inhibitors. Cancer Res. 65:3336-46), 이는 자식증에 대한 Akt의 효과가 Akt의 랩터-mTOR 활성 다운스트림을 통해 완전히 매개될 수는 없거나, 라파마이신의 효과가 적어도 부분적으로 Akt 억제를 통해, 예를 들어 연장된 처리 후 mTORC2의 어셈블리의 억제를 통해 매개될 수 있다는 가능성을 제기하였다 (Sarbassov, D.D., S.M. Ali, S. Sengupta, J.H. Sheen, P.P. Hsu, A.F. Bagley, A.L. Markhard, and D.M. Sabatini, (2006), Prolonged rapamycin treatment inhibits mTORC2 assembly and Akt/PKB. Mol Cell. 22:159-68. Epub 2006 Apr 6). 둘째, Akt의 다른 신호전달 산출, 예를 들어 글루코스 섭취 및 대사, 또는 세포 주기 조절이 또한 mTOR에 독립적인 자식증 조절에 공헌할 수 있음이 가능하다. 그 중에서도, Akt 억제는 p27kip1을 안정화하며, 이는 성장 인자 철수 하에서 자식증을 매개하는 것으로 최근 나타났다 (Liang, J., S.H. Shao, Z.X. Xu, B. Hennessy, Z. Ding, M. Larrea, S. Kondo, D.J. Dumont, J.U. Gutterman, C.L. Walker, J.M. Slingerland, and G.B. Mills, (2007), The energy sensing LKB1-AMPK pathway regulates p27(kip1) phosphorylation mediating the decision to enter autophagy or apoptosis. Nat Cell Biol. 9:218-24). 셋째, 본원에 제시된 데이타는 Akt 억제가 미토콘드리아 막 탈분극 및 증가된 ROS 발생을 유도함을 나타낸다. 기아가 미토콘드리아에서의 ROS 형성을 자극하고, 이는 자식증을 활성화하는 신호로서 작용함이 최근 드러났다 (Scherz-Shouval, R., E. Shvets, E. Fass, H. Shorer, L. Gil, and Z. Elazar, (2007), Reactive oxygen species are essential for autophagy and specifically regulate the activity of Atg4. Embo J. 26:1749-60). Akt 억제가 유사한 메카니즘을 통해 자식증을 유도할 수 있고, 증가된 자식증이 차례로 이들 손상된 미토콘드리아를 재활용하고 해로운 수준으로 ROS가 축적하는 것을 막는다고 생각할 수 있다.
과도한 자식증이 그의 한계까지 도달하게 될 때 세포 사멸을 유도할 수 있지만, Akt 억제 단독은 우리가 조사한 PTEN-null 암 세포주에서 감소된 혈청 조건 하에서조차 세포 사멸에 분명히 매우 비효과적이다. 생체내 종양 성장 조건하에서, 자식증은 Akt 억제가 종양 성장을 제한하는 잠재적인 메카니즘일 수 있으나, 또한 Akt 억제에 의해 부과되는 대사 및 산화 스트레스로부터 일시적인 완화를 제공할 수도 있고, 이는 저항이 발생하게 만들 수 있다. 실로, Akt KD 단독으로 처리된 대부분의 종양은 초기 회귀 또는 정체 후에 저항성이고 되돌아오게 되었다. 초기 단계에서 자식증을 억제하는 것은 이러한 일시적인 보호 효과를 막을 수 있으나, 자식증의 가능한 종양 억제 효과에 대항할 수도 있다. 후기 단계에서 자식증 종료를 차단하는 것은 상기 대항 효과를 피할 수 있다. 실로, 라이소좀자극제와 Akt 억제의 조합은 제거될 수 없는 분해-결함이 있는 자가리소좀-유사 공포의 과도한 축적을 야기하였고, 이로써 세포 사멸이 가속화되었다. 상기 조합은 ROS 스캐빈저 및 자식증의 자기-재생 기능을 방해할 수 있을 뿐 아니라 결함이 있는 자가리소좀의 파괴 및 시토졸로의 리소좀 함량의 방출을 촉진할 수 있고, 추가로 산화 스트레스 및 미토콘드리아 손상을 증가시켜 궁극적인 세포 사멸을 유발할 수 있다. 최근, 요법에 대한 적응 생존 반응으로서 유도된 자식증의 억제가 림프종의 Myc-유도된 마우스 모델에서 아폽토시스를 증대시킬 수 있다고 보고되었다 (Amaravadi et al., 2007). 본원에 보고된 바와 같이, Akt/PI3K 억제로 유도된 자식증을 라이소좀자극제를 이용하여 활용하여 PTEN-null 인간 종양 이종이식의 경감을 촉진할 수 있다. 상기 효과가 주어진 처리로 유도된 자식증의 정도와 양의 상관관계를 갖는다고 예상되기 때문에, 대규모 자식증을 유도하는 제제, 예를 들어 Akt 경로 억제제와 라이소좀자극제의 독창적인 조합은 그의 항암 효과에 깊이 영향줄 수 있다. 데겐하르트(Degenhardt) 등은 Akt 과발현에 의한 자식증 억제가 종양 중심에서의 괴사를 야기할 수 있는 반면, 주변 종양 세포는 괴사-유도된 염증 반응 및 Akt-자극된 증식의 조합 효과의 결과로 가속화된 성장의 반응을 보일 수 있음을 제안하였다. 그러나, Akt 억제의 존재하에서, 종양 세포 증식이 크게 감소되기 때문에, CQ-유도된 늦은 자식증 억제로 유발된 가속화된 세포 사멸은 가능한 염증 반응으로 인해 다시 성장할 시간을 갖기 전에 종양 세포를 완전히 제거할 수 있다. 본원에 제시된 데이타는 PTEN 결핍이 있는 세포가 무손상 PTEN이 있는 세포보다 상기 조합에 보다 감수성임을 나타내며, 이는 합리적인 치료 범위가 달성될 수 있음을 시사한다. CQ는 몇몇 질환에서의 치료 효과를 이미 발견하였고, 내성이 우수하였다(well tolerated) (Gustafsson, L.L., O. Walker, G. Alvan, B. Beermann, F. Estevez, L. Gleisner, B. Lindstrom, and F. Sjoqvist, (1983), Disposition of chloroquine in man after single intravenous and oral doses. Br J Clin Pharmacol. 15:471-9; Hagihara, N., S. Walbridge, A.W. Olson, E.H. Oldfield, and R.J. Youle, (2000), Vascular protection by chloroquine during brain tumor therapy with Tf-CRM107. Cancer Res. 60:230-4). 항암제의 연장 목록이 자식증을 유도한다고 보고된 바, CQ 및 다른 라이소좀자극제는 암 요법에서 유망한 신규 치료 값을 발견할 수 있다.
실시예
물질 및 방법
세포 배양 및 시약: PTEN-/- 및 PTEN+/+ MEF를 이전에 기재한 바와 같이 유지하였다 (Sun, H., R. Lesche, D.M. Li, J. Liliental, H. Zhang, J. Gao, N. Gavrilova, B. Mueller, X. Liu, and H. Wu, (1999), PTEN modulates cell cycle progression and cell survival by regulating phosphatidylinositol 3,4,5,-trisphosphate and Akt/protein kinase B signaling pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 96:6199-204). PC3 및 U87MG 세포를 37℃ 및 5% CO2에서 10% 테트라사이클린-비함유 태아 소 혈청을 함유하는 DMEM/Ham의 F-12 (1:1) 중에서 유지하였다. II-4는 칼바이오켐(Calbiochem) (Akt 억제제 VIII) 제품이었다 (Barnett, S.F., D. Defeo-Jones, S. Fu, P.J. Hancock, K.M. Haskell, R.E. Jones, J.A. Kahana, A.M. Kral, K. Leander, L.L. Lee, J. Malinowski, E.M. McAvoy, D.D. Nahas, R.G. Robinson, and H.E. Huber, (2005), Identification and characterization of pleckstrin-homology-domain-dependent and isoenzyme-specific Akt inhibitors. Biochem J. 385:399-408). 자식증을 억제하기 위하여, 세포를 5-10 μM 클로로퀸, 2.5 nM 바필로마이신 A1 또는 1 mM 3-MA (모두 시그마(Sigma) 제품)로 처리하고, 지정된 시점에서 분석하였다. Image-iT 라이브 그린(LIVE Green) 활성 산소종 검출 키트를 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)에서 구입하였다. MitoPT 미토콘드리아 침투성 전환 검출 키트를 이뮤노케미스트리 테크놀로지스, 엘엘씨(Immunochemistry Technologies, LLC)에서 구입하였다.
유도성 shRNA 구축 및 유도성-shRNA 클론의 생성: pHUSH 테트라사이클린-유도성 레트로바이러스 유전자 전이 벡터는 다른 곳에 기재된 바 있다 (Gray, D., A.M. Jubb, D. Hogue, P. Dowd, N. Kljavin, S. Yi, W. Bai, G. Frantz, Z. Zhang, H. Koeppen, F.J. de Sauvage, and D.P. Davis, (2005), Maternal embryonic leucine zipper kinase/murine protein serine-threonine kinase 38 is a promising therapeutic target for multiple cancers. Cancer Res. 65:9751-61; Hoeflich, K.P., D.C. Gray, M.T. Eby, J.Y. Tien, L. Wong, J. Bower, A. Gogineni, J. Zha, M.J. Cole, H.M. Stern, L.J. Murray, D.P. Davis, and S. Seshagiri, (2006), Oncogenic BRAF is required for tumor growth and maintenance in melanoma models. Cancer Res. 66:999-1006; US 2007/0026002, 이의 전문이 본원에 참고로 포함됨). 상보적 이중-가닥 shRNA 올리고를 셔틀 벡터, 이어서 이전에 기재된 바와 같은 게이트웨이(Gateway) 재조합 반응 (인비트로젠(Invitrogen))을 이용하여 상기 벡터 시스템으로 삽입하였다 (Grunwald, V., L. DeGraffenried, D. Russel, W.E. Friedrichs, R.B. Ray, and M. Hidalgo, (2002), Inhibitors of mTOR reverse doxorubicin resistance conferred by PTEN status in prostate cancer cells. Cancer Res. 62:6141-5; 또한 본원의 도 23 참조). 본 연구에서 사용된 shRNA 서열은 표 2에 요약한다. 모든 구축물을 서열분석으로 증명하였다. 레트로바이러스 감염을 기재된 바와 같이 수행하였다 (Gray et al., 2005; Hoeflich et al., 2006). 단일 Akt 이소형 넉다운의 경우, 세포를 각각의 Akt 이소형을 단독으로 표적으로 하는 shRNA 구축물 (Akt1의 경우 구축물 252 및 253, Akt2의 경우 구축물 254 및 255, 및 Akt3의 경우 구축물 259 및 260)을 코딩하는 하나의 레트로바이러스 벡터로 감염시키고, 5 ㎍/ml 퓨로마이신을 이용하여 안정한 클론을 선택하였다. 듀얼 Akt1 및 Akt2 KD의 경우, Akt1 및 2를 둘 다 동시에 표적으로 하는 단일 shRNA (구축물 256 및 257)를 사용하였다. 듀얼 Akt2 및 3 (구축물 255 및 261), 또는 트리플 Akt1, 2 및 3 (구축물 257 및 261) 넉다운은 세포를 각각 하나의 단일 shRNA를 코딩하는 상이한 항생제 선택 마커 (퓨로마이신 및 히그로마이신)를 함유하는 2개의 레트로바이러스 벡터으로 공동감염시킴으로써 달성하였고, 5 ㎍/ml 퓨로마이신 및 300 ㎍/ml 히그로마이신을 이용하여 안정한 클론을 선택하였다. 듀얼 Akt1 및 3 KD의 경우, Akt1 및 3 둘 다를 표적으로 하는 단일 shRNA (구축물 258) 또는 2개의 shRNA 벡터로의 공동감염 (구축물 253 및 261)을 사용하였다.
웨스턴 블롯 분석, 면역형광, IHC 및 TUNEL 검정: 웨스턴 블롯 분석을 위하여, 총 단백질 용해물을 SDS-PAGE에 적용시키고, 니트로셀룰로스로 이동시켰다. 사용된 항체는 항-Akt1, 항-Akt2, 항-Akt3, 항-전체-Akt, 항-p-Akt (Ser473), 항-p-Akt (Thr308), 항-p-S6 (Ser235/236), 항-PARP 및 항-절단된 카스파제-3 (셀 시그날링 테크놀로지(Cell Signaling Technology)); 항-p-PRAS40 (인비트로젠(Invitrogen)); 항-p27Kip1 (산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology)); 항-LC3 (노부스(Novus)); 항-LAMP2 및 항-카텝신 D (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences)); 및 항-GAPDH (어드밴스드 이뮤노케미칼 인크.(Advanced Immunochemical Inc.))이었다. 일차 항체를 IR 다이(Dye) 800-접합된 (록클랜드(Rockland)) 및 알렉사-플루오로 680-접합된 (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)) 종-선택적 이차 항체를 이용하여 검출하였다. 오디세이(Odyssey) 적외선 스캐너 (LICOR)를 이용하여 제조업자의 소프트웨어를 이용하여 검출 및 정량화를 수행하였다. 면역형광 염색을 위하여, 세포를 3% 파라포름알데히드로 고정하고, PBS 중의 0.01% 디기토닌로 침투시키고, 그 후 토끼 폴리클로날 항-LC3 (앱젠트(Abgent)) 일차 항체를 cy3-접합된 항-토끼 이차 항체 (잭슨 이뮤노리서치(Jackson Immunoresearch))로 검출하였다. IHC를 위하여, 포르말린-고정된, 파라핀-내장된 시편을 수집하였다. 다코(Dako) ARK 키트 (다코 코퍼레이션(Dako Corporation))와 항-Ki-67 (MIB-1, DakoCytomation) 항체를 사용하여 5-㎛-두께 파라핀-내장된 섹션을 염색하였다. 조직을 헤마톡실린으로 대조염색하고, 탈수하고, 탑재하였다. 모든 경우에, 항원 회수를 제조업자의 지시에 따라 다코 타겟 회수 키트로 수행하였다. TUNEL 검정을 위하여, 포르말린-고정된, 파라핀-내장된 섹션을 제조업자의 지시에 따라 계내 세포 사멸 검출 키트 (POD; 로슈 다이아그노스틱(Roche Diagnostic))를 이용하여 염색하였다.
이종이식 연구: 6- 내지 8-주령 암컷 무흉선 누드 nu/nu 마우스를 찰스 리버 래버러토리즈(Charles River Laboratories)로부터 구입하고, 제넨테크(Genentech)의 통상적인 동물 시설에 유지하였다. 마우스를 200 ㎕ 행크 평형 염 용액 (인비트로젠)에 재현탁된 5~7.5 x 106개 세포로 우측 옆구리에 주사하였다. 종양이 100~300 mm3의 평균 부피에 이르렀을 때, 유사한 크기의 종양을 갖는 마우스를 치료 집단으로 그룹화하였다. 마우스는 대조군 및 KD 집단에 대해 각각 식수 중의 5% 수크로스 또는 5% 수크로스와 1 mg/ml Dox를 투여하였다. 호박색의 물병을 사용하였고, 1주 당 3회 변경하였다. CQ를 0.9% 생리 식염수에 용해시키고, 필터-살균하고, 복강내 또는 피하 경로를 통하여 45 mg/kg로 투여하였다. 종양을 캘리퍼스로 측정하고, 마우스를 1주 당 2회 칭량하였다. 종양이 2000 mm3에 이르렀거나 20% 넘게 체중이 감량된 마우스를 안락사하였다. 8 내지 10마리 마우스를 각각의 처리군에 대해 사용하였다. JMP 소프트웨어 (SAS 인스티튜트, 인크.)를 사용하여 통계적 유의성을 분석하였다.
전자 현미경: 세포를 플라스틱 플라스크에서 단층으로 성장시키고, 절반-강도의 카르노브스키(Karnovsky) 정착액 (2% 파라포름알데히드, 2.5% 글루타르알데히드, 0.025% CaCl2.2H2O 및 0.1 M 나트륨 카코딜레이트 완충제, pH 7.4)에서 고정시키고; 종양을 작은 큐브 (~1 mm3)로 절단하고, 동일한 정착액 또는 면역전자 현미경에 사용되는 정착액에 침지로 고정하였다. 세포 및 조직을 1% OsO4 및 1% K4Ru(II)(CN)6 또는 1.5% K3Fe(CN)6으로 부가(postfix)하고, 에탄올 중에서 탈수하고, Epon에 내장하였다. 초박 섹션을 아세트산우라닐 및 시트르산납으로 염색하였다. 시스템적으로 샘플링된 4.5 ㎛2 세포질 영역에서 AV의 수를 계수하였다 (조건 당 n≥64). 각각의 세트가 80 ㎛2 이상의 세포질 영역을 커버하는 시스템적으로 샘플링된 현미경사진의 5 세트 이상을 덮는 사각 메쉬 격자로 AV 영역의 백분율을 측정하였다. 종양 조직에서 아폽토시스 핵의 평균 백분율을 100개의 시스템적으로 계수된 종양 세포 핵의 3 내지 4 세트에서의 아폽토시스 핵의 수로부터 계산하였다.
면역전자 현미경. 작은 종양 블록을 0.1 M 인산염 완충제 (pH 7.4) 중의 2% 파라포름알데히드, 0.2% 글루타르알데히드에서 5시간 동안 4℃에서 침지로 고정하였다. PBS로 세정한 후, 블록을 12% 젤라틴에 장착하고, 2.3 M 수크로스로 동결방지하고, 액체 질소에서 동결하였다. 초박 동결절단물을 -120℃에서 절단하고, 1% 메틸셀룰로스, 1.2 M 수크로스로 집어내고, 해동하고, 구리 격자에 수집하였다. 0.02 M 글리신 함유 PBS로 세척한 후, 절단물을 토끼 항-인간 LAMP1 항체 (gift of M. Fukuda, (Carlsson, S.R., J. Roth, F. Piller, and M. Fukuda. 1988. Isolation and characterization of human lysosomal membrane glycoproteins, h-lamp-1 and h-lamp-2. Major sialoglycoproteins carrying polylactosaminoglycan. J Biol Chem. 263:18911-9) 또는 래트 모노클로날 항-마우스 LAMP-1 항체 ID4B (티. 어거스트, 디벨롭멘탈 스터디즈 하이브리도마 뱅크(Developmental Studies Hybridoma Bank), 미국 아이오와주 아이오와 시티), 이어서 2차 토끼 항-래트 IgG 항체 (다코)와 인큐베이션하였다. 그 후, 이를 10 nm 콜로이드성 금 입자로 접합된 단백질 A로 표지하고, 1.8% 메틸셀룰로스, 0.6% 아세트산우라닐 혼합물로 대조하였다.
세포 생존력 및 세포 주기 분석. 세포 수 및 생존력은 Vi-Cell 분석기 (베컴 코울터(Beckman Coulter))를 이용하여 트립탄 블루 제외 검정을 이용하여 측정하거나, PBS/1% BSA 중의 1 ㎍/ml PI로 표지한 후 형광-활성화된 세포 분류기 (FACS) (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson))로 세포유동계측 분석하였다. FITC-접합된 아넥신(Annexin) V를 FACS 분석에 의한 포스파티딜세린 노출의 평가를 위해 사용하였다. 카스파제 활성화는 카스파제-글로 3/7 검정 키트 (프로메가)를 이용하여 분석하였다. 세포 주기 분석을 위하여, 세포를 냉장 70% 에탄올의 점적 첨가로 고정하고, PBS로 세척하고, 50 ㎍/ml PI 및 60 유닛 RNAse A를 함유하는 염색 용액 중에 재현탁시켰다. DNA 함량을 FlowJo 및 ModFit 소프트웨어 (벡톤 디킨슨)를 사용하여 유동 세포계측법으로 분석하였다.
다중스펙트럼 영상화 유동 세포계측법: 다양한 제제로 처리된 세포를 아크리딘 오렌지(Acridine Orange)로 염색하고, IDEAS 영상 분석 프로그램을 이용하여 이미지스트림(ImageStream) 시스템 (암니스 코퍼레이션(Amnis Corporation), 미국 워싱턴주 시애틀)으로 분석하였다. DNA AO 그린 영상 및 공포 AO 레드 영상을 먼저 별개의 채널로 보상한 후, 아폽토시스/무핵 세포 (AO 핵 형태 및 세기를 바탕으로) 및 공포가 있는 세포 (AO 레드+)의 백분율을 정량화하였다. AO 그린 밝은 세부 영역에 대한 AO 그린 세기를 플롯팅함으로써 3개의 구별되는 집단이 드러났다: R2 무핵 세포 (낮은 AO 그린 표지, 확산 세포질의 마스킹으로 인한 보다 높은 영역); R3 아폽토시스 세포 (중간 내지 낮은 AO 그린, 작고 밝은 농축된 핵 단편의 존재로 인한 매우 낮은 AO 그린 세부 영역); R4 살아있는 세포 (무손상 밝은 핵). AO 레드 세기는 가장 밝은 AO 레드 세기를 갖는 사건을 포함하도록 그려진 임의의 게이트 (R5)를 갖는 제2 막대그래프 상에 플롯팅하였다.
저속(time-lapse) 비디오 현미경검사: 24-웰 플레이트에서 배양된 세포를 환경적 대조군 하에서 (37℃ 및 5% CO2) 3일 동안 올림푸스(Olympus) IX81 도립 현미경 상에서 영상화하였다. 영상화는 화합물의 첨가 후 6시간에 시작하고, 1시간 간격으로 얻었다.
실시예 1
Akt 이소형의 유도성 shRNA KD 는 용량- 및 이소형 의존성 방식으로 PTEN -null 인간 종양 이종이식의 성장을 억제하였다.
종양 성장을 유지함에 있어서 3개의 Akt 이소형의 상대적 기여를 결정하기 위하여, H1 또는 U6 짧은 헤어핀을 위한 최근 기재된 레트로바이러스 벡터 시스템인 tet-유도성 플라스미드 벡터를 이용하여 tet-유도성 shRNA KD 방법을 이용하였다 (Gray et al., 2005; Hoeflich et al., 2006). PTEN-null 인간 전립선암 세포주 PC3 및 신경아교종 세포주 U87MG를 선택하였다 (Li, J., C. Yen, D. Liaw, K. Podsypanina, S. Bose, S.I. Wang, J. Puc, C. Miliaresis, L. Rodgers, R. McCombie, S.H. Bigner, B.C. Giovanella, M. Ittmann, B. Tycko, H. Hibshoosh, M.H. Wigler, and R. Parsons, (1997), PTEN, a putative protein tyrosine phosphatase gene mutated in human brain, breast, and prostate cancer. Science. 275:1943-7). 세포주 둘 다 3개의 모든 Akt 이소형을 발현하였고, PC3 세포에서, Akt1 단백질은 Akt2의 수준의 대략 두 배 발현되고, Akt3은 총 Akt의 10% 미만으로 기여한 반면, U87MG 세포에서, 3개의 모든 Akt 단백질은 동일한 수준으로 발현되었다 (도 18a). PC3 및 U87MG 세포의 안정한 클론이 모든 가능한 단일 및 조합 Akt 이소형을 표적으로 하는 유도성 shRNA 구축물을 보유하면서 생성되었다 (표 2). 각각의 Akt-표적화 shRNA (shAkt)는 독시사이클린 (Dox) 유도시 상응하는 Akt mRNA 및 단백질의 ~75-99% KD를 유발하였다 (도 1a, 도 18b, 및 표 3). 다운스트림 표적 PRAS40 및 S6의 감소된 정상-상태 인산화, p27Kip1의 상향 조절, 및 IRS1의 피드백 안정화가 KD에 대한 반응으로 다양한 정도로 관찰되었으며, 가장 강한 효과는 3개의 모든 Akt KD를 가진 세포에서 관찰되었다 (도 1a).
다음, 생체내 확립된 종양의 성장을 유지하는 PC3 세포의 능력에 대한 Akt KD의 효과를 조사하였다. Akt2 (shAkt2) 또는 Akt3 (shAkt3)의 Dox-유도된 KD는 단독으로 종양 성장의 유의한 억제를 야기하지 않았다 (도 1b 및 표 3). 반대로, Akt l (shAkt1)을 표적으로 하는 2개의 상이한 shRNA 구축물은 둘 다 3개의 독립적 클론 중 2개에서 각각 유의한 종양 성장 억제를 나타내었다. 종양 성장 지연 또는 정체는 이들 클론에서 전형적으로 관찰되었다 (도 1b, 도 18h, 및 표 3). Aktl,2 (shAkt12) 또는 Aktl,3 (shAkt13)의 동시적 KD는 또한 종양 성장을 억제하였고, Dox-처리된 마우스의 몇몇에서 거의 모든 종양 성장이 정지되고 종양 회귀가 관찰되었다. 흥미롭게도, Akt2 및 Akt3 (shAkt23) 둘 다의 KD는 또한 유의한 종양 성장 억제를 유발하였고, Dox 처리 2주 동안 종양 부피의 배가(doubling)는 없었는데, 이는 Akt1 활성 단독은 최적의 종양 성장을 유지하기에 충분치 않음을 시사한다. 마지막으로, 트리플-Akt KD (shAktI23)는 종양 성장을 가장 효과적으로 억제하였고, 처리의 처음 2주 동안 일관된 종양 회귀가 관찰되었다. 유사한 결과가 3개의 Akt 이소형의 유사한 수준을 발현하는 U87MG 세포에서 관찰되었다. 3개의 단일 KD 중에서, 오직 shAkt1만이 유의한 종양 정체를 나타내었고, 트리플-Akt KD로 종양 회귀가 다시 관찰되었다 (도 18, c-f). 따라서, Aktl의 KD는 단독으로 PC3 및 U87MG 이종이식 둘 다에서 종양 성장을 억제할 수 있으며, 상기 Akt1 의존은 단순히 총 Akt 용량 효과가 아니다. 그러나, 보다 분명한 종양 성장 억제 및 회귀는 3개의 모든 Akt 이소형의 KD를 가진 종양에서 발생하였다.
<표 1>
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
<표 2>
Figure pct00065
Figure pct00066
a shRNA의 안정한 발현을 확립하기 위하여 사용된 항생제 선택. Pur, 퓨로마이신; Hyg, 히그로마이신.
b 표적에서의 센스 서열 (모두 5'-3' 방향).
c 이들 19bp 핵심 서열을 함유하는 siRNA 이중나선 또는 shRNA 헤어핀은 또한 지시된 유전자에 대해 효과적이어야 한다 (센스 및 센스 서열 모두 5'-3' 방향임)
<표 3>
Figure pct00067
a 실시간 정량적 RT-PCR (태크맨(Taqman))에 의해 결정된 비처리된 대조군과 비교한 Dox 처리 72시간 후 메시지 수준의 백분율. 데이타는 적어도 3개의 독립적 실험의 평균 ± SEM을 나타낸다.
b 각각의 집단에서 분석된 종양의 수.
c 처리 시작시의 처음 크기의 2배 초과의 종양 부피로 정의되는, 14일까지 진행된 종양의 수.
d 처리 시작시의 처음 크기의 50% 미만의 종양 부피로 정의되는, 14일까지 퇴보된 종양의 수.
e 14일 또는 유의한 차이가 달성된 첫 날에서의 종양 성장 억제 (TGI)의 백분율, % TGI = % [Vc(dx-d0)-Vt(dx-d0)]/Vc(dx-d0)*100으로 계산되며, 여기서 Vc(dx-d0)는 분석일 (dx)과 처리 시작일 (d0) 사이의 대조군 집단 (Vc)의 평균 종양 부피의 차이이고, Vt(dx-d0)는 분석일 (dx)과 처리 시작일 (d0) 사이의 처리된 집단 (Vt)의 평균 종양 부피의 차이이다. % TGI > 100은 종양 회귀를 나타낸다.
f 유의성에 도달한 날, 대조군과 처리군 사이의 유의한 차이가 달성되기 전 처리 후 소요된 날의 수.
* 수크로스 비히클 처리군에 비해 P < 0.05, 스튜던트 t 시험으로 결정함.
실시예 2
Akt KD 는 유의한 아폽토시스 없이 세포 주기 지연을 유도하였다.
Akt KD가 있는 PC3 종양의 분석은 대조군 종양에 비해 증식 마커 Ki-67의 온화한 감소를 나타냈고, TUNEL-양성 세포의 유의한 증가는 없었다 (도 2a). 아폽토시스의 결여가 또한 시험관내 배양된 PC3 세포에서 관찰되었다. 10% FBS하에, G0/G I의 온화한 증가 및 S 기의 감소가 각각의 shAkt 구축물을 발현하는 세포에서 관찰되었다. G2/M 기에 있는 세포의 약간 증가된 축적은 또한 Akt1에 대한 shRNA를 발현하는 세포 단독에서 및 2 또는 3개의 Akt 이소형의 임의의 조합에서 관찰되었으며, 이는 이들 세포에서의 DNA 복제 및 유사분열 둘 다에서의 세포 주기 지연을 시사한다. 그러나, 어떠한 KD로도 유의한 sub-G1 집단은 관찰되지 않았다 (도 19, a 및 b). 추가의 실험은 또한 PC3 및 U87MG 세포 둘 다에서 Akt KD에 반응하는 유의한 카스파제 활성화를 검출하는 데에 실패하였다. 생체내 환경에서의 차선의 성장 조건을 부분적으로 모방하기 위하여, 배양중의 혈청 세포를 기아시키고, 세포가 Akt KD에 보다 감수성으로 되는지의 여부를 물었다. 실로, 완전한 혈청 기아 또는 0.5%로의 혈청 감소는 G0/G1 기에 있는 세포의 현저히 증가된 축적을 유발하였다. 그러나, 0% FBS에서 적어도 2일 동안 및 0.5% FBS에서 적어도 5일 동안 여전히 유의한 sub-G1 피크는 관찰되지 않았다 (도 2, b 및 c).
실시예 3
Akt KD 는 PC3 및 U87MG 세포에서의 자식증을 촉진하였다.
Akt가 자식증을 억제한다고 나타났기 때문에 (Arico, S., A. Petiot, C. Bauvy, P.F. Dubbelhuis, A.J. Meijer, P. Codogno, and E. Ogier-Denis, (2001), The tumor suppressor PTEN positively regulates macroautophagy by inhibiting the phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B pathway. J Biol Chem. 276:35243-6. Epub 2001 Jul 26; Degenhardt et al., 2006), 내생적 Akt의 특이적 KD가 자식증을 촉진할 수 있는지의 여부를 물었다. 실로, EM 분석으로, shAkt123을 발현하도록 유도된 PC3 및 U87MG 세포 둘 다에서 AV의 유의하게 증가된 축적이 나타났다 (도 3, a 및 b; 및 도 19c). AV 및 산성 소포체 (AVO)의 축적은 항-LC3 항체, 및 형광 염료 모노단실카다베린 (MDC) 및 아크리딘 오렌지 (AO)로 염색하는 자가포식소체 마커 GFP-LC3의 국소화로 추가로 확인되었다 (도 4a, 도 19, d-g).
EM에 의해 shAkt를 발현하는 이종이식 종양을 조사하였다. 대조군 GFP-표적화 shRNA-발현 PC3 종양은 세포-세포 접합에 의해 연결되는 건강해 보이는 세포로 이루어진다 (도 3c, a). 반대로, shAkt123-발현 종양에서의 세포는 Dox 처리 10-15일 후 퇴화 및 세포-세포 접촉 손실의 형태학적 표시를 나타낸다 (도 3 c, b). 인간 리소좀-관련 막 단백질 (LAMP)1에 양성인 후기 AV가 퇴화 종양 세포에서 발견되었다 (도 3c, b-d). 또한, 이들 세포는 종종 철저히 파괴된 팽윤된 미토콘드리아 및 확장된 RER을 함유하며, 이는 에너지 대사, ER 스트레스 및 자식증 사이의 연결을 시사한다. 전형적인 아폽토시스의 염색질 군집 및 파쇄 특성은 퇴화 종양 세포에서 거의 관찰되지 않았으며, 실로, 몇몇의 AV-함유 세포는 자식 퇴화를 겪는 세포를 대표하는 온화한 핵농축을 나타낸다 (도 3c, b 및 d).
AV 축적이 퇴화의 형태학적 표시 전에 종양 세포에서 발생했는 지의 여부를 결정하기 위하여, Akt KD의 5일 또는 3주로 U87MG 종양을 조사하였다. 5일 동안 shAkt 123을 발현하는 종양에서, 대부분의 세포는 비히클-처리된 대조군과 유사한 총 형태를 나타내었으나, AV 영역 백분율에서 대략 2배 증가를 가졌다 (대조군 종양에서의 0.78%에서 Dox-처리된 종양에서의 1.53%까지; P < 0.05; 도 3c, e-h). Akt KD의 3주 후, U87MG 종양은 15일 동안 처리된 PC3 종양과 유사한 다수의 세포에서 퇴화의 표시를 나타내었다 (비공개 데이타).
실시예 4
라이소좀자극제는 Akt KD 가 있는 PC3 세포에서 세포 사멸을 가속화하였다.
자식증 및 온화한 세포 주기 지연의 상승된 수준에도 불구하고, shAkt123을 발현하는 PC3 세포는 세포 사멸에서의 감지가능한 증가 없이 10% FBS 하에서 많은 계대배양 동안 배양 중에 생존할 수 있다. 감소된 혈청 (0.5% FBS) 하에서조차, 연장된 기간에 걸쳐 생존력의 오직 미미한 감소만이 존재하였다 (비공개 데이타). 문헌들이 세포 생존에 대한 초기 단계 자식증 억제의 효과에 논쟁적이었지만, 후기 단계에서의 자식증 차단은 자식증-유도 조건하에서 가속화된 세포 사멸을 유발하는 것으로 더욱 일관적으로 나타났다 (Kanzawa, T., I.M. Germano, T. Komata, H. Ito, Y. Kondo, and S. Kondo, (2004), Role of autophagy in temozolomide-induced cytotoxicity for malignant glioma cells. Cell Death Differ. 11:448-57; Boya, P., R.A. Gonzalez-Polo, N. Casares, J.L. Perfettini, P. Dessen, N. Larochette, D. Metivier, D. Meley, S. Souquere, T. Yoshimori, G. Pierron, P. Codogno, and G. Kroemer, (2005), Inhibition of macroautophagy triggers apoptosis. Mol Cell Biol. 25:1025-40; Gonzalez-Polo, R.A., P. Boya, A.L. Pauleau, A. Jalil, N. Larochette, S. Souquere, E.L. Eskelinen, G. Pierron, P. Saftig, and G. Kroemer, (2005), The apoptosis/autophagy paradox: autophagic vacuolization before apoptotic death. J Cell Sci. 118:3091-102. Epub 2005 Jun 28; Kroemer and Jaattela, 2005; Yu, L., F. Wan, S. Dutta, S. Welsh, Z. Liu, E. Freundt, E.H. Baehrecke, and M. Lenardo, (2006), Autophagic programmed cell death by selective catalase degradation. Proc Natl Acad Sci U S A. 103:4952-7). 그러므로, 세포 생존력에 대한 Akt KD에 의해 시작되는 자식증의 완료를 차단하는 효과를 조사하였다. GFP-LC3을 안정하게 발현하는 PC3-shAktl23 세포에서, Akt KD는 점상(punctate) GFP 신호를 야기하였고 (도 4a 및 도 19e), 내생적 LC3 (LC3-I)의 지질화되지 않은 전구체 형태의 상응하는 감소 및 지질화된 자가포식소체-국소화된 LC3-II의 약간의 증가를 야기하였고, 이는 자가리소좀에서 신속하게 턴오버된다 (도 4b; Klionsky et al., 2008). 자가포식소체의 분해성 자가리소좀으로의 성숙을 억제하기 위해 널리 사용되는 약염기 아민인 라이소좀자극제 클로로퀸 (CQ) (Boya, P., R.A. Gonzalez-Polo, N. Casares, J.L. Perfettini, P. Dessen, N. Larochette, D. Metivier, D. Meley, S. Souquere, T. Yoshimori, G. Pierron, P. Codogno, and G. Kroemer, (2005), Inhibition of macroautophagy triggers apoptosis. Mol Cell Biol. 25:1025-40; Kroemer and Jaattela, 2005; Lum, J.J., D.E. Bauer, M. Kong, M.H. Harris, C. Li, T. Lindsten, and C.B. Thompson, (2005), Growth factor regulation of autophagy and cell survival in the absence of apoptosis. Cell. 120:237-48)은 핵주위 구역에서의 작은 GFP-LC3 무리의 출현을 야기하였다. Akt KD와 CQ의 조합은 연속된 LC3-I 턴오버의 존재하에 LC3-II의 증가된 축적 뿐만 아니라 GFP-LC3 도트의 훨씬 더 강한 축적을 야기하였고, 이는 자가리소좀 분해에서의 결핍과 일치하였다. MDc+ 공포의 유사한 축적이 또한 관찰되었다 (도 19f). 이는 0.5%, 보다 명백하게는 0% FBS 하에서 CQ로 처리된 shAkt123-발현 세포에서의 가속화된 세포 사멸에 의해 수반되었다 (도 4, c 및 d). 공포 양성자 펌프 (VH+-에이티피아제)를 억제하고 리소좀 구획의 적절한 산성화를 막는 제2 라이소좀자극제인 바필로마이신 A1 (Ba) (Yamamoto, A., Y. Tagawa, T. Yoshimori, Y. Moriyama, R. Masaki, and Y. Tashiro, (1998), Bafilomycin A1 prevents maturation of autophagic vacuoles by inhibiting fusion between autophagosomes and lysosomes in rat hepatoma cell line, H-4-II-E cells. Cell Struct Funct. 23:33-42)은 또한 shAkt 123과 조합하여 세포 사멸을 촉진하였다. 증가된 아넥신 V-양성 집단 및 카스파제-3,7 활성은 Akt KD와 조합된 CQ 또는 Ba로 처리된 세포에서 관찰되었고, 이는 이들 세포에서의 폴리-ADP-리보스 폴리머라제 (PARP) 분할의 증가와 상관된다 (도 4b). 반대로, 자가포식소체 형성의 가장 초기 단계의 억제제 (그의 클래스 III PI3K 억제의 결과임)인 1 mM 3-MA로의 예비처리 (Seglen, P.O., and P.B. Gordon, (1982), 3-Methyladenine: specific inhibitor of autophagic/lysosomal protein degradation in isolated rat hepatocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 79:1889-92; Petiot, A., E. Ogier-Denis, E.F. Blommaart, A.J. Meijer, and P. Codogno, (2000), Distinct classes of phosphatidylinositol 3'-kinases are involved in signaling pathways that control macroautophagy in HT-29 cells. J Biol Chem. 275:992-8)는 shAkt 발현 세포에 대한 CQ 또는 Ba의 세포 사멸-촉진 효과를 억제하였다 (도 4, c 및 d). 이는 리소좀친화성 억제제에 의해 유발된 가속화된 세포 사멸이 비정상 AV의 축적에 의존함을 시사한다.
실시예 5
CQ 는 PI3K 및 Akt 억제제와 조합하여 세포 사멸을 가속화하였다.
최근, Akt 활성화를 억제하는 포스파티딜이노시톨 에테르 지질 유사체가 방사선감수성 효과를 갖는 자식증을 유도한다고 보고되었다 (Fujiwara et al., 2007). 포스파티딜이노시톨 에테르 지질 유사체가 추가의 세포 표적을 갖는다고 공지되어 있기 때문에 (Gills et al., 2006; Memmott et al., 2008), PI3K-Akt의 다른 특이적 억제제가 또한 자식증을 유도하고 세포를 후기 단계 자식증 억제에 감수성이게 할 수 있는지의 여부를 물었다. 먼저, 클래스 I PI3K 및 mTOR을 나노몰 농도에서 억제하지만 클래스 III PI3K에 대해 1,000배 초과로 덜 강력한 듀얼 PI3K/mTOR 억제제인 화합물 III-5 (PI-103)을 사용하였다 (Knight, Z.A., B. Gonzalez, M.E. Feldman, E.R. Zunder, D.D. Goldenberg, O. Williams, R. Loewith, D. Stokoe, A. Balla, B. Toth, T. Balla, W.A. Weiss, R.L. Williams, and K.M. Shokat, (2006), A pharmacological map of the PI3-K family defines a role for p110alpha in insulin signaling. Cell. 125:733-47). 클래스 I 및 III PI3K를 둘 다 억제함에 있어 동등효력이고 후자의 활성에 의해 야기된 자식증을 억제하는 넓은 스펙트럼의 PI3K 억제제 워트만닌 또는 LY294002와 반대로 (Petiot et al., 2000; Knight et al., 2006), III-5는 AV의 축적을 유도하는 데에 효력이 있었다 (도 5, b 및 c). Akt KD와 유사하게, CQ와의 조합은 III-5로 처리된 세포의 사멸을 가속화하였다 (도 5 a). 현저히 증가된 LC3-II 대 LC3-1 비율 및 MDC로 밝게 염색된 확대된 공포의 외양이 명백한 세포 사멸의 검출 전에 관찰되었다 (도 5, b 및 c). Akt KD로 관찰되는 바와 같이, 3-MA로의 예비처리는 LC3-II 대 -I 비율 및 MDC+ 공포의 축적을 둘 다 감소시켰고, 세포 사멸율을 낮추었다 (도 5, b 및 c). 반대로, CQ의 세포 사멸-촉진 효과는 자가포식소체의 자가리소좀으로의 성숙에 요구된다고 이전에 나타난 단백질인 LAMP2의 siRNA KD에 의해 부분적으로 모방되었다 (도 20, a 및 b); Gonzalez-Polo et al., 2005).
또한, 보고된 가장 선택적인 Akt 억제제 중 하나인 듀얼 Akt l,2 억제제 화합물 II-4 (Akti-1/2)로 CQ의 유사한 효과를 수득하였다 (Barnett et al., 2005). II-4 단독으로의 처리는 Ser473 및 Thr308 잔기 둘 다에서 Akt의 인산화를 효과적으로 억제하였고, 유의한 세포 사멸 유발 없이 다운스트림 표적 S6의 인산화를 유의하게 감소시켰다 (도 6, a 및 b). CQ와의 공동처리는 10일까지 관찰된 완전한 세포 사멸을 갖는 세포 생존력에서의 빠른 하락을 야기하였다. 면역블롯 분석은 II-4 처리 24시간 내에 LC3-II의 유의한 축적을 나타내었고, 이는 CQ 공동처리시 추가로 증가되었다 (도 6, b 및 c).
세포 사멸의 동력학을 뒤따르기 위하여, CQ 및 II-4로 처리된 살아있는 세포를 영상화하는 저속 현미경검사를 사용하였다 (도 7a). CQ 처리는 단독으로 세포 분열의 온화한 감소 및 핵주위 영역에서의 어두운 입자의 점차적인 축적을 야기하였다. AO 염색으로 이들 입자는 형성이 3-MA로 억제되는 AVO인 것으로 나타났다 (비공개 데이타). II-4로의 처리는 단독으로 명백한 세포 사멸 없이 세포 분열의 완벽에 가까운 억제를 야기하였다. 이들 세포는 세포질을 궁극적으로 채우는 AVO의 축적으로 평평해진 형태를 나타내었다. II-4 및 CQ 둘 다로 처리된 세포는 AVO의 유사한 축적을 나타내었으나, 세포 수축 및 원형질 파열이 48시간 내에 관찰되었다. 몇몇 경우에, 2개의 이웃 세포가 원형질의 파열 전 2개의 세포 사이의 완전한 융합으로 확장되는 막 접합부를 형성하는 것으로 발견되었다 (도 7a, 백색 화살촉).
다중스펙트럼 영상화 유동 세포계측법을 이용하여 AVO 축적과 세포 사멸 사이의 유사한 상관관계를 관찰하였다 (도 7, b 및 c). CQ 또는 II-4로의 처리는 단독으로 유의한 생존력 손실 없이 AVO 축적을 유도한 반면, 이 둘의 조합은 살아있는 세포에서의 AVO 축적의 추가 증가 및 농축된 아폽토시스 핵을 가진 세포의 수반되는 증가 및 괴사 세포의 무핵 집단 특성의 출현을 야기하였다.
실시예 6
자식증 억제 및 분해 결함이 있는 자가리소좀 축적은 둘 다 II -4와의 조합으로 CG 에 의해 유도된 가속화된 세포 사멸에 기여한다.
자식증 억제가 그 자체로 Akt 억제와의 조합으로 가속화된 세포 사멸을 유도하는 데에 충분한 지를 조사하기 위하여, 자가포식소체의 형성에 관련된 유전자인 KD Atg7에 siRNA를 사용하였다 (Ohsumi, Y. 2001. Molecular dissection of autophagy: two ubiquitin-like systems.). Atg7의 KD는 단독으로 세포 사멸에 대한 유의한 효과를 나타내지 않았으나, Akti와 조합되는 경우 3일까지 세포 생존력의 작은 강하를 유도하였다. 그러나, CQ 및 II-4 둘 다와 조합되는 경우, Atg7 KD는 2일에 세포 사멸의 일시적인 지연을 야기하였다 (도 20, c 및 d). 상기 언급된 3-MA의 효과와 함께, 이들 데이타는 자식증 억제 및 결함이 있는 AV 축적이 둘 다 Akt 억제와의 조합으로 CQ에 의해 유도된 가속화된 세포 사멸에 기여함을 시사한다.
자식증은 리소좀 구획의 중요한 기능이기 때문에 (Terman, A., B. Gustafsson, and U.T. Brunk, (2006), The lysosomal-mitochondrial axis theory of postmitotic aging and cell death. Chem Biol Interact. 163:29-37), 면역블롯팅에 의해 주된 리소좀 아스파르틱 프로테아제인 리소좀 마커 LAMPI 및 카텝신 D를 조사하였다 (도 6, b 및 c). 화합물 II-4는 단독으로 LAMP1 수준 증가를 유도하였고, 이는 상승된 리소좀 활성과 일치하였다. 카텝신 D는 공동번역으로 절단되고 글리코실화되어 46-kD 프로카텝신 D을 형성하는 43-kD 프리프로카텝신 D로서 합성되었고, 상기 46-kD 프로카텝신 D는 리소좀에 표적화되어 15-kD 경쇄 및 28-kD 중쇄로 이루어진 성숙한 효소로 추가로 절단되는 중간체를 생성한다. 28-kD 및 카텝신 D의 전구체 형태 둘 다를 검출하는 항체를 이용하여, II-4 처리 단독 후에, 43-50 kD의 카텝신 D의 성숙전 형태의 수준의 증가가 먼저 관찰되었고, 그 후 성숙 효소의 28-kD 중쇄의 증가가 관찰되었으며, 이는 다시 증가된 리소좀 활성을 나타내었다. CQ는 28-kD 쇄의 희생으로 전구체 형태의 축적을 야기하였고, 이는 카텝신 D의 진행 및 성숙에 요구되는 리소좀 시스테인 프로테아제 활성의 억제와 일치하였다 (Liaudet-Coopman, E., M. Beaujouin, D. Derocq, M. Garcia, M. Glondu-Lassis, V. Laurent-Matha, C. Prebois, H. Rochefort, and F. Vignon, (2006), Cathepsin D: newly discovered functions of a long-standing aspartic protease in cancer and apoptosis. Cancer Lett. 237:167-79). II-4 및 CQ 둘 다로 처리된 세포에서, 카텝신 D의 전구체 형태는 어느 하나의 단독으로보다 훨씬 높은 수준으로 축적된 반면, 성숙 28-kD 쇄는 점차적으로 감소하였다. 화합물 II-4 처리는 또한 자가리소좀에서 분해되는 자식 활성의 또다른 마커인 p62의 수준을 감소시킨 반면 (Klionsky et al., 2008), CQ는 II-4 처리시 및 미처리시 둘 다 p62 분해를 차단하였다 (도 22c). 총괄하여, 이들 데이타는 Akt 억제가 리소좀 효소의 증가된 생산 및 성숙을 야기하는 반면, CQ 공동처리는 마지막 자가리소좀 구획에서의 이들 효소의 성숙을 손상시켜, 결함이 있는 AVO의 축적을 야기함을 시사한다. 후자는 카스파제 활성 및 그의 기질 PARP의 절단의 상응하는 증가와 함께 (비공개 데이타) 2일 내에 카스파제 3의 활성형으로의 절단 증가 (도 6b)에 의해 수반된다. 팬카스파제 억제제인 zVAD.fmk는 모든 시험된 농도에서 세포 사멸을 부분적으로 구제하였다 (도 20e). zVAD.fmk가 또한 보다 높은 농도에서 리소좀 시스테인 프로테아제를 억제할 수 있지만, 후자는 카스파제-독립적 세포 사멸을 매개한다고 보고되었다 (Foghsgaard et al., 2001). 넓은 스펙트럼의 시스테인 프로테아제 억제제 zFA.fmk 및 N-아세틸-Leu-Leu-Nle-CHO나 보다 특이적인 카텝신 B 억제제 CA-074-Me나 모두 II-4 및 CQ에 의해 유도된 세포 사멸의 유의한 구제를 나타내지 않았다. 대신, 시스테인 프로테아제 억제제는 또한 보다 높은 농도에서 단독으로 세포독성을 나타내었지만, 10-50 μM 농도의 Akti와의 조합으로 세포 사멸을 증대시켰다 (도 20, f-h). 상기 결과는 II-4 및 CQ로 유도된 세포 사멸이 적어도 부분적으로 카스파제 의존성인 반면, 리소좀 프로테아제 활성은 Akt 억제 하에 세포의 생존에 요구될 수 있음을 시사한다.
손상된 리소좀 분해가 Akt 억제와 조합하여 세포 사멸을 가속화할 수 있는지의 여부를 추가로 묻기 위하여, siRNA를 이용하여 카텝신 D를 녹다운시켰다. 실로, 이는 II-4와 조합시 세포 사멸을 유의하게 증가시켰고, 둘 다 II-4와 조합시 CQ의 세포-사멸 효과를 추가로 증대시켰다 (도 20i). 유사하게, 카텝신 D를 비롯한 아스파르틱 프로테아제의 억제제인 펩스타틴 A도 또한 Akti-112와 함께 세포 사멸을 촉진시켰다 (도 20j)
실시예 7
CQ 는 Akti -유도된 미토콘드리아 수퍼옥시드 및 세포 반응성 산소종 ( ROS ) 축적을 증가시켰다.
증가하는 증거들이 프로그래밍된 세포 사멸의 실행 중에 리소좀과 미토콘드리아 사이의 친밀한 관계를 시사하였다 (Bursch, W. (2001), The autophagosomal-lysosomal compartment in programmed cell death. Cell Death Differ. 8:569-81). The autophagosomal-lysosomal compartment in programmed cell death. Cell Death Differ. 8:569-81; Terman, A., T. Kurz, B. Gustafsson, and U.T. Brunk, (2006), Lysosomal labilization. IUBMB Life. 58:531-9). 그러므로, 미토콘드리아 막 전위에 대한 Akt 억제 및 CQ의 효과를 조사하였다. 미토콘드리아 세기를 유지함에 있어 Akt의 기능과 일치하게도 (Parcellier, A., L.A. Tintignac, E. Zhuravleva, and B.A. Hemmings, (2007), PKB and the mitochondria: AKTing on apoptosis. Cell Signal. 0:0), 유의한 수의 분극화된 미토콘드리아가 대다수의 세포에 여전히 존재하였지만, Akti-112는 단독으로 미토콘드리아 막 전위의 감소를 유발하였다. CQ는 단독으로 유의한 효과를 갖지 않았지만, CQ 및 II-4의 공동처리는 거의 완전한 미토콘드리아 전위의 손실을 유발하였고, 세포 생존력에서의 급강하가 따라왔다 (도 21, a 및 b).
미토콘드리아 ROS가 자식증 유도에 관련된다고 최근 보고되었다 (Scherz-Shouval et al., 2007). 미토콘드리아가 수퍼옥시드 (O2 -) 발생의 일차 세포내 공급원이기 때문에, 막 전위의 기능으로서 미토콘드리아에 축적되고 산화 및 그 후의 DNA로의 결합시 형광을 내는 O2 - 지표인 MitoSOX 레드를 이용하여 O2 - 생산을 분석하였다. 화합물 II-4는 단독으로 6시간 내에 MitoSOX 형광을 증가시켰다 (도 8, a 및 c; 및 도시되지 않음). 형광의 대부분은 핵 형광을 보이는 세포의 부분모집단을 가진 미토콘드리아 국소화 패턴을 나타내었고, 이는 이들 세포에서의 증가된 미토콘드리아 침투성과 일치하였다. CQ 단독으로는 오직 MitoSOX 신호에서의 온화한 증가를 유발하였지만, II-4와의 조합은 대부분의 세포가 강한 핵 염색 패턴을 나타내면서 형광 세기에서의 유의한 증가를 유발하였다. 일반적인 ROS-감수성 프로브를 이용하여 측정되는 바와 같이, O2 - 생산의 증가 후에 24시간 내에 전체적인 세포 ROS 수준의 증가가 뒤따랐다 (도 8, b 및 c). 흥미롭게도, II-4 단독으로 유도된 세포질 ROS 신호는 48시간 내에 감소된 반면, CQ로의 공동처리는 ROS 수준에서의 연장된 증가를 유발하였다 (도 21d 및 도시되지 않음). 이는 Akt 억제로 유발된 제한된 미토콘드리아 탈분극이 일시적인 ROS 신호를 유도하여 자식증을 증가시키고, 이는 종합적으로 손상된 미토콘드리아를 제거한다는 개념과 일치한다. CQ로 유발된 세포 구성요소의 손상된 소화는 세로이드/리포푸신과 같은 유해한 산화 산물의 자가리소좀 응집을 유발하며, 이는 ROS 손상을 추가로 증폭시켜 (Moore et aI., 2(06), 세포 사멸을 유도할 수 있다. 3-MA 예비처리는 II-4로 유도된 ROS 수준을 감소시켰고 (도 21c), 이는 기아-유도된 ROS 생산과 유사한 클래스 III PI3K 의존성을 시사한다 (Scherz-Shouval et al., 2007). 일반적인 ROS 스캐빈저 N-아세틸시스테인 (NAC)으로의 처리는 II-4 및 CQ의 존재하에 세포 생존력을 구제하였다 (도 22, a 및 b). 또한, NAC는 Akti-유도된 LC3 및 GFP-LC3 지질화, p62 분해, 및 GFP-LC3 점(puncta) 형성을 감소시켰고 (도 SS, C 및 D), 이는 자식증 유도에서의 ROS의 필수적인 역할과 일치하였다 (Scherz-Shouval et al., 2007).
실시예 8
CQ 는 시험관내 Akti -처리된 PTEN - null 세포에서의 세포 사멸을 선택적으로 가속화하였고, 생체내 Akt KD 의 항종양 효과를 증대시켰다.
PC3 세포가 PTEN null이기 때문에, 동질유전자형 PTEN+/+ 및 PTEN-/- 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)를 이용하여 PTEN 상태가 Akt 억제 단독 또는 CQ와 조합된 Akt 억제에 대한 세포의 감수성에 영향을 줄 수 있는지의 여부를 탐구하였다. PTEN-/- MEF는 Akt 경로 활성을 증가시켰다고 이전에 나타났고, PTEN+t+ MEF보다 mTOR 억제의 항증식 효과에 보다 감수성이다 (Sun et al., 1999). 도 9a에 나타난 바와 같이, PTEN-/- MEF는 또한 그의 PTEN+/+ 대응물보다 조합된 CQ 및 II-4의 세포-사멸 효과에 유의하게 더욱 감수성이었다. 이는 PTEN-/- 세포가 Akt 억제시 생존을 위해 자식 분해에 보다 의존성일 수 있고, 합리적인 치료 지수가 상기 전략을 이용하는 악성 PTEN-null 종양 세포의 선택적 표적화에 의해 달성가능할 수 있다는 가능성을 제기함을 시사한다.
PTEN-null 종양이 또한 생체내 Akt 억제시 자식 분해에 의존하는 지의 여부를 묻기 위하여, shAkt 123을 발현하는 PC3 이종이식 종양의 생존에 대한 CQ의 효과를 조사하였다. 도 9b에 나타난 바와 같이, CQ의 복강내 주사는 단독으로 종양 성장률에서의 작지만 무의미한 감소를 유발하였다. Akt KD는 단독으로 초기 종양 정체를 갖는 유의한 종양 성장 억제를 유발하였으나, 대부분의 종양은 완전히 퇴보하는 데에 실패하였고, 2-3주 내에 종양의 90%에서 되돌아감이 발생하였고, 완전한 경감은 달성되지 않았다. 반대로, Dox 및 CQ 둘 다로 처리된 종양의 40%에서 완전한 회귀가 관찰되었고, 연구 전반에 걸쳐 종양의 다른 20%에서 정체가 유지되었다 (도 9, c 및 d). CQ의 피하 종양주변 주사로 유사한 결과가 얻어졌다 (비공개 데이타). 5일에 얻은 종양 샘플의 EM 조사는 Dox 또는 CQ 단독으로 처리된 종양에서 AV 영역의 온화한 증가가 밝혀진 반면, >50% 회귀를 보인 Dox 및 CQ 둘 다로 처리된 종양에서 AV의 극적인 축적이 관찰되었다. 이들 AV는 Dox- 또는 CQ-단독 종양에서 발견된 것보다 더욱 크고, 밀집된 소화되지 않은 물질들을 함유하나, 보통 단일-막 자가리소좀 외양을 가지고 인간 LAMP1에 대해 양성으로 염색되며, 이는 자가포식소체-리소좀 융합 후의 손상된 분해와 일치한다. 이는 손상된 원형질 세기 및 비정상 미토콘드리아를 가진 AV-함유 세포 잔여물 뿐만 아니라 아폽토시스 형태를 나타내는 증가된 수의 종양 핵과 일치한다 (도 10). 따라서, CQ는 시험관내 Akt 억제와 조합하여 세포 사멸을 가속화할 뿐 아니라 생체내 완전한 종양 경감의 발생을 증가시켰다.
Dox-유도성 shRNA 접근을 이용하여, 각각의 Akt 이소형을 둘 다 개별적으로 및 모든 가능한 조합으로 특이적으로 녹다운시켜 종양 성장의 유지에서의 그의 요건을 평가하였다. 우리의 결과는 PTEN-null PC3 및 U87MG 세포에서, Aktl이 가장 중요한 이소형인 반면, Akt2 및 Akt3 활성은 종양 성장을 유지함에 있어 감소된 Aktl 활성을 부분적으로 보상할 수 있음을 시사한다. Akt2 억제의 잠재적인 대사 부작용 및 Akt2의 동시적 억제에 의해 대항될 수 있는 Akt 1 단독 억제와 관련된 보고된 침습력 증가 (Irie et al., 2005)를 둘 다 종합하면, 2 또는 3개 모두의 Akt 이소형을 동시에 억제하여 최대 종양 억제를 달성하지만 상이한 정도의 불활성화로 이소형 활성의 결정적인 수준을 보존하여 부작용을 감소시키는 것이 필요할 수 있다.
Akt의 가장 주된 기능 중 하나는 세포 생존이다. 본질적으로 활성인 Akt는 다양한 프로아폽토시스 공격 후에 프로그래밍된 세포 사멸로부터 세포를 보호한다고 보고되었다 (Downward, 1998). 그러나, 특히 아폽토시스가 다양한 유전자 변경 때문에 종종 저해되는 암 세포에서, 아폽토시스가 Akt 억제에 대한 일차 반응인지는 덜 분명하다. PI3K-Akt 경로의 소분자 억제제를 이용하는 이전의 실험은 종종 그의 비특이적 효과에 의해 모호해지는 상충되는 결과를 생성한다. 우리의 데이타는 Akt의 특이적 KD가 유의한 아폽토시스를 촉진하지 않으면서 세포 주기 지연을 유발할 수 있음을 나타낸다. 이는 총 Akt 활성의 소부분만이 아폽토시스 억제에 요구된다는 최근의 연구와 일치한다 (Liu et al., 2006). 반대로, 우리는 자식증이 특이적 shRNA KD 또는 경로의 선택적 억제제로 유발되는 감소된 Akt 활성에 대한 보다 감수성인 반응임을 발견하였다.
몇몇 메카니즘은 Akt 억제에 의한 자식증 유도에 기여할 수 있다. 첫째, Akt 억제는 mTORC1 억제를 야기할 수 있다. mTOR은 공지된 자식증의 억제제이다. 흥미롭게도, Akt의 본질적으로 활성인 형태는 라파마이신에 의한 자식증의 유도를 저해하며 (Takeuchi et al., 2005), 자식증에 대한 라파마이신의 효과가 적어도 부분적으로 mTORC2에 대한 그의 장기 효과를 통해 Akt를 억제함으로써 매개될 수 있다는 가능성을 제시한다 (Sarbassov et al., 2006). 둘째, Akt의 다른 신호전달 산물, 예를 들어 FoxO 단백질 (Zhao et al., 2008) 또는 글루코스 대사는 또한 mTOR에 독립적으로 자식증 조절에 기여할 수 있다. 셋째, 우리의 데이타는 Akt 억제가 자식증을 활성화할 수 있는 증가된 미토콘드리아 수퍼옥시드 및 세포 ROS 신호를 유도함을 나타낸다.
자식증 활성화는 그의 한계에 도달하게 될 때 궁극적인 세포 사멸을 야기할 수 있거나, 궁극적인 자식 세포 사멸 또는 아폽토시스와 같은 보다 빠른 사멸 프로그램으로의 전환을 통해 추가의 사멸-유도 자극에 대해 세포를 감수성이게 할 수 있다. 예를 들어, Akt 억제는 자식 반응을 증가시킴으로써 방사선감수성을 증가시킬 수 있는 반면 (Fujiwara et al., 2007), Atg5의 칼페인-매개된 절단은 자식증을 아폽토시스로 전환시킬 수 있다 (Yousefi et al., 2006). 여기서, Akt 억제 단독은 우리가 조사한 PTEN-null 암 세포에서의 세포 사멸에 비효과적이지만, 세포 사멸이 자가리소좀 분해 차단을 통해 가속화될 수 있음이 나타난다. 자식증은 Akt 억제가 종양 성장을 제한하는 잠재적 메카니즘일 수 있지만, 이는 또한 Akt 억제에 의해 부과되는 대사 및 산화 스트레스로부터의 일시적인 경감을 제공할 수도 있다. 초기 단계에서 자식증을 억제하는 것은 그의 일시적인 보호 효과를 예방할 수 있지만, 또한 별도의 생존 메카니즘을 통한 초기 탈출을 허용하면서 그의 종양 억제 효과에 대항할 수 있다. 그러나, 종양 세포가 위태로워지고 자식 분해에 의존하게 된 후 리소좀 기능을 차단하는 것은 유해한 산화 응집물의 축적을 통해 산화 손상 및 세포독성 효과를 증폭시키면서 상기 대항 효과를 회피할 수 있다 (Seehafer and Pearce, 2006). 실로, 우리의 데이타는 양립가능한 리소좀 분해 능력이 Akt 억제로 인해 유도된 상승된 자식 활성의 존재하에 세포 생존에 결정적이어서, 라이소좀자극제, 카텝신 D KD 또는 리소좀 프로테아제 억제제로 리소좀 기능을 억제하는 것이 모두 Akt 억제와 조합으로 세포 사멸을 침전시킬 수 있음을 시사한다. 자식증, 리소좀 변화, 및 산화 스트레스는 항암 치료의 연장 목록과 연합되었으며, 라이소좀자극제는 단독으로 또는 다른 치료제와 조합으로 항암 활성을 나타내었다 (Shoemaker and Dagher, 1979; Ohta et al., 1998; Ostenfeld et al., 2005; Amaravadi et al., 2007; Carew, J.S., S.T. Nawrocki, C.N. Kahue, H. Zhang, C. Yang, L. Chung, J.A. Houghton, P. Huang, F.J. Giles, and J.L. Cleveland, (2007), Targeting autophagy augments the anticancer activity of the histone deacetylase inhibitor SAHA to overcome Bcr-Abl-mediated drug resistance. Blood. 110:313-22; Fujiwara et al., 2007; GrothPedersen et al., 2007). 여기서, PTEN-null 인간 종양 이종이식의 경감을 촉진하기 위하여, Akt/PI3K/mTOR 억제로 유도된 자식증이 또한 라이소좀자극제, 예를 들어 내성이 우수한 약물 CQ를 이용하여 활용될 수 있음을 처음으로 보고한다. 상기 효과가 주어진 처리로 유도되는 자식증의 정도와 양의 상관관계가 있다고 예상되기 때문에, 강력한 자식증 유도제, 예컨대 Akt 경로 억제제와 상기 제제의 창조적인 조합이 그의 항암 효과에 깊이 영향을 줄 수 있다.
본원에 그 전문이 참고로 포함되는 미국 가출원 제61/103,198호에 대해 특별히 언급한다. 본원에 그 전문이 참고로 포함되는 미국 가출원 제61/160,169호에 대해 특별히 언급한다. 이제 본 발명을 전체적으로 기재하였지만, 당업자는 본 발명의 범위 또는 그의 임의의 실시양태에 영향을 미치지 않는다면 이는 넓은 동일한 범위의 조건, 제제, 및 다른 파라미터 내에서 수행할 수 있음을 이해할 것이다. 본원에 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
<서열 목록>
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073

Claims (61)

  1. (i) 자식증(autophagy)을 유도하는 키나제의 억제제 및 (ii) 자식증의 억제제의 조합물을 신생물(neoplasm)을 치료하기에 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서의 신생물의 치료 방법.
  2. 제1항에 있어서, 자식증을 유도하는 상기 키나제의 억제제 및 상기 자식증의 억제제가 상승작용적 유효량으로 존재하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 자식증의 억제제가 siRNA 또는 안티센스 RNA인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 자식증의 억제제가 LAMP2, LAMP1, 또는 자식증 (Atg) 유전자의 발현 또는 기능을 억제하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 Atg 유전자가 Atg1, Atg4, Atg8, Atg5, Atg7 또는 Atg12인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 자식증의 억제제가 자식증의 유도, 격리, 융합 또는 분해 기(phase)의 억제제인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 자식증의 억제제가 자식증의 유도 기의 억제제인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 자식증의 억제제가 3-메틸아데닌인 방법.
  9. 제6항에 있어서, 상기 자식증의 억제제가 자식증의 분해 또는 융합 기의 억제제인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 자식증의 분해 기의 억제제가 라이소좀자극제인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 라이소좀자극제가 항기생충제인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항기생충제가 클로로퀸, 히드록시클로로퀸 또는 수라민인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 상기 라이소좀자극제가 공포(vacuolar) 양성자-에이티피아제(ATPase) 억제제인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 공포 양성자-에이티피아제 억제제가 바필로마이신 A1인 방법.
  15. 제10항에 있어서, 상기 라이소좀자극제가 순환계에 작용하는 제제인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 제제가 아미오다론 또는 페르헥실렌인 방법.
  17. 제10항에 있어서, 상기 라이소좀자극제가 세포독성제인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 세포독성제가 빈블라스틴인 방법.
  19. 제10항에 있어서, 상기 라이소좀자극제가 지질 대사에 영향을 주는 제제, 항생제 또는 호르몬인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 호르몬이 글루카곤 또는 에스트라디올인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항생제가 모넨신인 방법.
  22. 제10항에 있어서, 상기 라이소좀자극제가 암모늄 클로라이드, cAMP 또는 메틸아민인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 자식증을 유도하는 키나제의 억제제가 Akt, PI3K, mTOR, PDK1 및 p70S6K 억제제로부터 선택된 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 자식증을 유도하는 키나제의 억제제가 Akt 또는 PI3K 키나제 억제제인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 자식증을 유도하는 키나제 억제제가 Akt 키나제 억제제인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 자식증의 억제제가 자식증의 분해 또는 융합 기 억제제인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 자식증의 분해 또는 융합 기 억제제가 라이소좀자극제인 방법.
  28. 제25항에 있어서, 상기 Akt 키나제 억제제가 팬(pan)-Akt 억제제인 방법.
  29. 제25항에 있어서, 상기 Akt 키나제 억제제가 Akt-1, Akt-2 또는 Akt-3 선택적 억제제인 방법.
  30. 제25항에 있어서, 상기 Akt 키나제 억제제가 Akt-1 및 Akt-2의 억제제인 방법.
  31. 제25항에 있어서, 상기 Akt 키나제 억제제가 알로스테리 Akt 억제제인 방법.
  32. 제23항에 있어서, 여기서 상기 Akt 키나제 억제제가 하기 화학식 I의 화합물, 및 그의 호변이성질체, 분할된 거울상이성질체, 분할된 부분입체이성질체, 용매화물 및 염인 방법.
    <화학식 I>
    Figure pct00074

    상기 식에서,
    R1은 H, Me, Et 및 CF3이고;
    R2는 H 또는 Me이고;
    R5는 H 또는 Me이고;
    A는
    Figure pct00075
    이고;
    여기서, G는 1개 내지 4개의 R9 기에 의해 임의로 치환된 페닐 또는 할로겐에 의해 임의로 치환된 5-6원 헤테로아릴이고;
    R6 및 R7은 독립적으로 H, OCH3, (C3-C6 시클로알킬)-(CH2), (C3-C6 시클로알킬)-(CH2CH2), V-(CH2)0-1이고, 여기서 V는 5-6 원 헤테로아릴, W-(CH2)1-2이고, 여기서 W는 F, Cl, Br, I, OMe, CF3 또는 Me로 임의로 치환된 페닐, C1-C3 알킬 또는 O(C1-C3 알킬)로 임의로 치환된 C3-C6-시클로알킬, 히드록시-(C3-C6-시클로알킬), 플루오로-(C3-C6-시클로알킬), CH(CH3)CH(OH)페닐, F, OH, C1-C3 알킬, 시클로프로필메틸 또는 C(=O)(C1-C3 알킬)로 임의로 치환된 4-6 원 헤테로사이클, 또는 OH, 옥소, O(C1-C6-알킬), CN, F, NH2, NH(C1-C6-알킬), N(C1-C6-알킬)2, 시클로프로필, 페닐, 이미다졸릴, 피페리디닐, 피롤리디닐, 모르폴리닐, 테트라히드로푸라닐, 옥세타닐 또는 테트라히드로피라닐로부터 독립적으로 선택된 1개 이상의 기로 임의로 치환된 C1-C6-알킬이거나,
    또는 R6 및 R7은 이들이 부착되어 있는 질소와 함께 OH, 할로겐, 옥소, CF3, CH2CF3, CH2CH2OH, O(C1-C3 알킬), C(=O)CH3, NH2, NHMe, N(Me)2, S(O)2CH3, 시클로프로필메틸 및 C1-C3 알킬로부터 독립적으로 선택된 1개 이상의 기로 임의로 치환된 4-7 원 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
    Ra 및 Rb는 H이거나,
    또는 Ra는 H이고, Rb 및 R6은 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 1개 또는 2개의 고리 질소 원자를 갖는 5-6 원 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
    Rc 및 Rd는 H 또는 Me이거나,
    또는 Rc 및 Rd는 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 시클로프로필 고리를 형성하고;
    R8은 H, Me, F 또는 OH이거나,
    또는 R8 및 R6은 이들이 부착되어 있는 원자와 함께 1개 또는 2개의 고리 질소 원자를 갖는 5-6 원 헤테로시클릭 고리를 형성하고;
    각각의 R9는 독립적으로 할로겐, C1-C6-알킬, C3-C6-시클로알킬, O-(C1-C6-알킬), CF3, OCF3, S(C1-C6-알킬), CN, OCH2-페닐, CH2O-페닐, NH2, NH-(C1-C6-알킬), N-(C1-C6-알킬)2, 피페리딘, 피롤리딘, CH2F, CHF2, OCH2F, OCHF2, OH, SO2(C1-C6-알킬), C(O)NH2, C(O)NH(C1-C6-알킬), 및 C(O)N(C1-C6-알킬)2이고;
    R10은 H 또는 Me이고;
    m, n 및 p는 독립적으로 0 또는 1이다.
  33. 제1항에 있어서, 상기 신생물이 육종인 방법.
  34. 제1항에 있어서, 상기 신생물이 암종인 방법.
  35. 제32항에 있어서, 상기 신생물이 편평 세포 암종인 방법.
  36. 제32항에 있어서, 상기 신생물이 선종 또는 선암종인 방법.
  37. 제1항에 있어서, 상기 암이 유방암, 난소암, 자궁경부암, 전립선암, 고환암, 음경암, 비뇨생식관암, 고환종, 식도암, 후두암, 위(gastric)암, 위(stomach)암, 위장암, 피부암, 각질극세포종, 소포 암종, 흑색종, 폐암, 소세포 폐 암종, 비-소세포 폐 암종 (NSCLC), 폐 선암종, 폐의 편평 암종, 결장암, 췌장암, 갑상선암, 유두암, 방광암, 간암, 담도암, 신장(kidney)암, 골암, 골수 장애, 림프구 장애, 털 세포암, 협강 및 인두 (구강(oral))암, 입술암, 설암, 구강(mouth)암, 침샘암, 인두암, 소장암, 결장암, 직장암, 항문암, 신장(renal)암, 전립선암, 외음암, 갑상선암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 뇌암, 중추 신경계암, 복막의 암, 간세포암, 두부암, 경부암, 호지킨암 및 백혈병으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  38. 제1항에 있어서, 상기 Akt 키나제 억제제가 하기 화학식 II의 화합물인 방법.
    <화학식 II>
    Figure pct00076

    상기 식에서,
    R1 및 R2는 독립적으로 수소, C1 -5 알킬, 히드록실, C1 -5 알콕시 또는 아민이고;
    p는 1 내지 6의 정수이고;
    A는 5-14개 탄소의 시클릭, 비시클릭 또는 트리시클릭 방향족 또는 헤테로방향족 고리이고, 이는 할로겐, OH, C1-C3 알킬 또는 시클로프로필메틸로 임의로 치환된 할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노, C1-C6-알킬 또는 페닐로 임의로 치환될 수 있고,
    B는 하기 화학식을 갖는 방향족, 헤테로방향족, 시클릭 또는 헤테로시클릭 고리이고,
    Figure pct00077

    여기서, Q, T, X 및 Y는 각각 -CH, CH2, N 또는 O로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
    Z는 -CH, CH2, N, O 또는 -C=C-이고;
    R6 및 R7은 수소, 할로겐 및 카르보닐로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나, 또는 R6 및 R7은 함께 취해져 5-6 원 방향족, 헤테로방향족, 시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성하고, 이는 할로겐, OH, C1-C3 알킬 또는 시클로프로필메틸로 임의로 치환된 할로겐, OH, 아미노, 디알킬아미노, 모노알킬아미노 또는 C1-C6-알킬로 임의로 치환될 수 있다.
  39. 제1항에 있어서, 상기 신생물이 해당작용 의존성 암 이외의 것인 방법.
  40. 제1항에 있어서, 상기 자식증을 유도하는 키나제의 억제제가 1개 이상의 Akt 단백질의 발현을 감소시키는 1개 이상의 RNA 간섭 (RNAi) 구축물을 포함하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 상기 1개 이상의 Akt 단백질이 Akt1, Akt2, Akt3 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  42. 제40항에 있어서, 상기 RNAi 구축물이 Akt 유전자 내의 서열에 실질적으로 상응하는 1개 이상의 DNA 서열을 포함하는 것인 방법.
  43. 제40항에 있어서, 상기 RNAi 구축물이 서열 1-18로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 실질적으로 상응하는 1개 이상의 DNA 서열을 포함하는 것인 방법.
  44. 제40항에 있어서, 상기 RNAi 구축물이 센스 RNA 가닥 및 실질적으로 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하고, 여기서 상기 안티센스 가닥은 서열 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 및 38로부터 선택된 서열에 실질적으로 상응하는 1개 이상의 서열을 포함하고, 상기 센스 및 안티센스 가닥은 RNA 이중나선으로서 어닐링된 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 센스 가닥이 서열 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35 및 37로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 실질적으로 상응하는 1개 이상의 서열을 포함하는 것인 방법.
  46. 제44항에 있어서, 상기 1개 이상의 센스 가닥 및 상기 1개 이상의 안티센스 가닥이 서열 19:20, 21:22, 23:24, 25:26, 27:28, 29:30, 31:32, 33:34, 35:36 및 37:38의 서열 쌍 및 이들 서열 쌍의 조합으로서 어닐링된 것인 방법.
  47. 제40항에 있어서, 상기 RNAi 구축물이 siRNA 또는 shRNA인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 siRNA 또는 shRNA가 서열 1-18로부터 선택된 서열에 실질적으로 상응하는 핵산 서열을 포함하는 RNAi 구축물로부터 전사되는 것인 방법.
  49. 1개 이상의 Akt 단백질의 발현을 감소시키는 RNAi 구축물.
  50. 제49항에 있어서, 1개 이상의 Akt 유전자 내의 서열에 실질적으로 상응하는 1개 이상의 DNA 서열을 포함하는 RNAi 구축물.
  51. 제50항에 있어서, 상기 1개 이상의 DNA 서열이 서열 39-48로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 RNAi 구축물.
  52. 제49항에 있어서, 서열 1-18로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 실질적으로 상응하는 1개 이상의 DNA 서열을 포함하는 RNAi 구축물.
  53. 제49항에 있어서, 상기 구축물이 siRNA 또는 shRNA인 RNAi 구축물.
  54. 제53항에 있어서, 센스 RNA 가닥 및 실질적으로 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하고, 상기 안티센스 가닥은 서열 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 및 38로부터 선택된 서열에 실질적으로 상응하는 1개 이상의 서열을 포함하고, 상기 센스 및 안티센스 가닥은 RNA 이중나선으로서 어닐링된 것인 RNAi 구축물.
  55. 제54항에 있어서, 상기 센스 가닥이 서열 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35 및 37로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 실질적으로 상응하는 1개 이상의 서열을 포함하는 것인 RNAi 구축물.
  56. 제55항에 있어서, 상기 1개 이상의 센스 가닥 및 상기 1개 이상의 안티센스 가닥이 서열 19:20, 21:22, 23:24, 25:26, 27:28, 29:30, 31:32, 33:34, 35:36 및 37:38의 서열 쌍 및 이들 서열 쌍의 조합으로서 어닐링된 것인 RNAi 구축물.
  57. 제56항에 있어서, 상기 센스 가닥 및 상기 안티센스 가닥이 단일-가닥 헤어핀에 의해 공유 연결된 것인 RNAi 구축물.
  58. 제49항에 있어서, 서열 32에 실질적으로 상응하는 뉴클레오티드 서열, 및 서열 22, 26 및 36으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 실질적으로 상응하는 서열을 포함하는 RNAi 구축물.
  59. 제49항에 있어서, 서열 31에 실질적으로 상응하는 뉴클레오티드 서열, 및 서열 21, 25 및 35로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 실질적으로 상응하는 서열을 포함하는 RNAi 구축물.
  60. RNA 서열로 전사되는 서열 1-18로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 실질적으로 상응하는 DNA 서열을 포함하는, 1개 이상의 Akt 단백질의 발현을 감소시킬 수 있는 RNAi 구축물.
  61. 서열 19-38 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 실질적으로 상응하는 RNA 서열을 포함하는, 1개 이상의 Akt 단백질의 발현을 감소시킬 수 있는 RNAi 구축물.
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