CN102625839A - Sparc反义组合物和其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了SPARC反义寡核苷酸和它们用于增殖性疾病例如癌症和肝纤维化的方法。

Description

SPARC反义组合物和其用途
相关申请的交叉参考
本申请要求2009年7月9日提交的美国临时申请号61/224,431的权益，将其通过引用方式并入本文。
发明背景
酸性的富含半胱氨酸的分泌蛋白(也被称作骨粘连蛋白(osteonectin)，BM40或SPARC)(下文中“SPARC”)是引发细胞形状改变、抑制细胞周期进展和影响细胞外基质合成的基质相关蛋白(Bradshaw等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 100：6045-6050(2003))。鼠SPARC基因克隆于1986年(Mason等人，EMBO J.5：1465-1472(1986))，全长人SPARC cDNA(SEQ ID NO：1)于1987年被克隆和测序(Swaroop等人，Genomics 2：37-47(1988))。SPARC的表达在发育上受到调控，主要在正常发育或响应于损伤的过程中发生重塑的组织中表达。例如，在发育中的骨和牙齿中表达高水平的SPARC蛋白(参见，例如，Lane等人，FASEB J.，8，163173(1994)；Yan & Sage，J.Histochem.Cytochem.47：1495-1505(1999))。
SPARC在几种侵袭性癌症中高表达，同时在相应的正常组织(例如，膀胱、肝、卵巢、肾、肠和乳腺)中不存在(Porter等人，J.Histochem.Cytochem.，43，791(1995))。在膀胱癌中，例如，SPARC表达与晚期癌相关联。已显示T2期或更晚期的侵入性膀胱肿瘤相对于T期的膀胱肿瘤(或更加浅表的肿瘤)表达更高水的SPARC，以及更糟的预后(参见，例如，Yamanaka等人，J.Urology，166，2495 2499(2001))。在脑膜瘤中，SPARC的表达只与侵入性肿瘤关联(参见，例如，Rempel等人，Clincal Cancer Res.，5,237 241(1999))。还已在74.5％的原位侵入性乳腺癌损伤(参见，例如，Bellahcene，等人，Am.J.Pathol.，146，95100(1995))和54.2％的乳腺的浸润性导管癌(参见，例如，Kim等人，J.Korean Med.Sci.，13，652 657(1998))中检测到SPARC表达。
SPARC还在非肿瘤性增生疾病(non-neoplastic proliferativedisease)中起着重要作用。肾小球膜细胞增生是许多肾小球疾病的特征性质并且通常先于细胞外基质扩张和肾小球硬化(glomerulosclerosis)。在实验性系膜增生性肾小球肾炎的模型中，SPARC mRNA在第7天增加到5倍，并且通过原位杂交在肾小球膜中被鉴定。SPARC牵涉动脉粥样硬化病变的发病机制。血浆SPARC水平在冠状动脉疾病患者中升高(Masahiko等人，Obesity Res.9：388-393(2001))。动脉内血管平滑肌细胞的增殖在动脉粥样硬化的发病机制中起着中心作用。SPARC在血管平滑肌细胞和与动脉粥样硬化病变相关的巨噬细胞中表达。此外，已假定SPARC在血管损伤过程调节中血小板衍生生长因子的作用(Masahiko等人，Obesity Res.9：388-393(2001)；Raines等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：1281-1285(1992))。已经报导了在血管损伤的位置SPARC对内皮PAI-1产生的刺激作用(Hasselaar等人，J.Biol.Chem.266：13178-13184(1991))并且假定其加速动脉粥样硬化(Masahiko等人，Obesity Res.9：388-393(2001))。
最近，已经将SPARC的遗传多态性与对硬皮病的易感性相关。转化生长因子β1(TGFβ1)是刺激硬皮病或其他纤维变性疾病患者中过量胶原产生的促纤维化细胞因子。外源TGFβ在培养的正常人成纤维细胞中诱导增加表达SPARC和I型胶原，但该应答在被SPARCsiRNA转染的成纤维细胞中被显著减弱。虽然所使用的SPARC siRNA抑制SPARC在培养的人成纤维细胞中表达，但该作用需要体外转染siRNA(Zhou等人，Arthritis Rheum.52(1)：257-61(2005))。
可通过延长的硫代乙酰胺的腹膜内施用在Sprague-Dawley大鼠中诱导晚期肝纤维化。肝SPARC表达在肝纤维化的发展中显著增加。携带反义SPARC的重组腺病毒(AdasSPARC)显著减弱用硫代乙酰胺处理的大鼠的肝纤维化的发展，如通过减少的胶原沉着、更低的羟脯氨酸的肝含量和更少的纤维化晚期形态分期所评估的。AdasSPARC处理也降低了炎症活性(Knodell评分)并且在体内抑制肝星形细胞至成肌纤维细胞样表型的转分化(Camino等人，J Gene Med.10(9)：993-1004(2008))。
因此，存在对开发可在各种条件下控制SPARC表达的水平，特别是降低SPARC表达的水平的治疗方法的需要。此外，虽然已开发了抑制SPARC表达的反义方法，但这些方法需要复杂的腺病毒载体或直接的细胞转染，因此存在对抑制SPARC表达的更高效的潜在治疗性反义方法的需要。
发明概述
本发明提供了包含DNA、RNA、混合的DNA/RNA、锁核酸(LNA)或肽核酸(PNA)中的一种或多种的SPARC反义寡核苷酸，其与SEQID NO：1或SEQ ID NO：5互补。
反义寡核苷酸可包含例如SEQ ID NO：2-4和7-13的一种或多种。反义组合物可任选地包含药学上可接受的载体。
在一个方面中，SPARC反义寡核苷酸包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5互补的10至30个碱基，其中给细胞施用SPARC反义寡核苷酸降低了细胞的SPARC蛋白的水平。优选，所述组合物的施用降低该细胞中SEQ ID NO：1的RNA或SPARC蛋白的水平至少30％，优选至少80％，更优选至少100倍，最优选至少1,000倍。
在另一个方面，本发明提供了用于治疗或预防动物的疾病的方法，包括施用治疗有效量的包含SPARC反义寡核苷酸的组合物，其中SPARC反义寡核苷酸包含SEQ ID NO：2-4和7-13的核酸或其组合。
在另一个方面，本发明提供了用于使用SPARC反义寡核苷酸进行靶向的SPARC cDNA的位置。具体地，提供了与12至19个碱基的反义寡核苷酸，其在SEQ ID NO：1的核苷酸212、311、312、521、825、841、969、985、1001、1017的一个或多个上与SEQ ID NO：1互补。
合适的增殖性疾病包括但不限于癌症、再狭窄、纤维化、骨质疏松症、炎性疾病包括关节炎或扩大的伤口愈合。
用于施用本发明提供SPARC反义组合物和应用本发明提供的方法以治疗或预防增殖性疾病的合适动物包括但不限于人患者。
附图概述
图1描述了SPARC-GFP表达载体的限制性图谱。
图2描述了与未感染的细胞系相比较，在示例性稳定转染的细胞系中对SPARC-GFP融合构建体表达的荧光光谱法的结果。
图3描述了用siRNA SPARC 1、siRNA SPARC-2和siRNASPARC-3转染的表达SPARC-GFP的细胞中与阴性对照单独的乱序miR和DharmaFectTM转染剂(Dharmacon，Lafayette，CO)相比较的GFP发光。
图4描述了在用LNA抗-SPARC-1、LNA抗-SPARC-2和LNA抗-SPARC-3转染的表达SPARC-GFP的细胞中的GFP发光。
图5A描述了温育的第24小时，在用si13347、si13346、si13345(分别地SEQ ID NO：201-203)、PO-SPARC-1、PO-SPARC-1-1和阴性对照转染的表达SPARC-GFP的细胞中的GFP发光。
图5B描述了温育的第48小时，在用si13347、si13346、si13345(分别地SEQ ID NO：201-203)、PO-SPARC-1、PO-SPARC-1-1和阴性对照转染的表达SPARC-GFP的细胞中的GFP发光。
图6A描述了温育的第24小时，在用LNA PO-SPARC-1、LNAPO-SPARC 1-1、LNA抗-SPARC 2、抗SP-53、siRNA SPARC-2和单独的DharmaFect1TM转染剂(Dharmacon，Lafayette，CO)转染的表达SPARC-GFP的细胞中的GFP发光。
图6B描述了温育的第48小时，在用LNA PO-SPARC-1、LNAPO-SPARC 1-1、LNA抗-SPARC 2、抗SP-53、siRNA SPARC-2和单独的DharmaFect1TM转染剂(Dharmacon，Lafayette，CO)转染的表达SPARC-GFP的细胞中的GFP发光。
图6C描述了温育的第72小时，在用LNA PO-SPARC-1、LNAPO-SPARC 1-1、LNA抗-SPARC 2、抗SP-53、siRNA SPARC-2和单独的DharmaFect1TM转染剂(Dharmacon，Lafayette，CO)转染的表达SPARC-GFP的细胞中的GFP发光。
图7A描述了温育的第48小时，在用LNA PO-SPARC-1、LNAPO-SPARC 1-1、LNA抗-SPARC 2、抗SP-53、siRNA SPARC-2和单独的DharmaFect1TM转染剂(Dharmacon，Lafayette，CO)转染的表达SPARC-GFP的细胞中的细胞毒性。
图7B描述了温育的第72小时，在用LNA PO-SPARC-1、LNAPO-SPARC 1-1、LNA抗-SPARC 2、抗SP-53、siRNA SPARC-2和单独的DharmaFect1TM转染剂(Dharmacon，Lafayette，CO)转染的表达SPARC-GFP的细胞中的细胞毒性。
图8A描述了温育的第48小时，在用AS-SPARC-12(SEQ IDNO：11)、AS-SPARC-13(SEQ ID NO：12)、AS-SPARC-32(SEQ IDNO：13)、siRNA-SPARC-2(SEQ  ID  NO：202)和阴性对照(DharmaFect1TM转染剂(Dharmacon，Lafayette，CO))转染的表达SPARC-GFP的细胞中的GFP发光。
图8B描述了温育的第48小时，在用AS-SPARC-12(SEQ IDNO：11)、AS-SPARC-13(SEQ ID NO：12)、AS-SPARC-32(SEQ IDNO：13)、siRNA-SPARC-2(SEQ ID NO：202)和阴性对照(DharmaFect1TM转染剂(Dharmacon，Lafayette，CO))转染的表达SPARC-GFP的细胞中的细胞毒性。
图9描述了人SPARC cDNA序列(SEQ ID NO：1)。
图10描述了人SPARC全长/未加工的(SEQ ID NO：5)和成熟/已加工的(SEQ ID NO：6)氨基酸序列。
图11概念地描述了用SPARC反义寡核苷酸靶向的SPARC cDNA中的热点。
发明详述
I.定义
如本文中所使用的，术语“SPARC蛋白”是指这具有与未加工的(SEQ ID NO：5)或成熟SPARC多肽(SEQ ID NO：6)或从SEQ ID NO：1产生的天然剪接变体相同的序列的多肽，或具有与SEQ ID NO：5或6大体上相同的序列并且大体上保留成熟SPARC多肽的功能的多肽。“大体上相同的序列”是指所述序列与SEQ ID NO：5或6至少80％相同，优选至少85％相同，更优选至少90％相同，甚至更优选至少95％相同，和最优选至少99％相同。
“大体上保留成熟SPARC的功能”意指所述多肽具有对于本领域普通技术人员已知的SPARC的一种或多种生物/生物化学活性，特别是影响(维持、支持、诱导、引起、减小、预防或抑制)疾病状态的活性，包括例如影响血管生成、细胞形状、细胞运动性、细胞粘附、细胞凋亡、细胞增殖或细胞外基质的组成。术语“SPARC蛋白”包括的所述多肽还包括具有添加至与SEQ ID NO：5或6相同或大体上相同的序列的氨基和/或羧基末端的约50个氨基酸，优选约40个氨基酸，更优选约30个氨基酸，甚至更优选约20个氨基酸，和最优选约10个氨基酸。
本文中所使用的序列的选择提供于表1。
表1
Figure BDA0000139239360000061
Figure BDA0000139239360000071
*，表示PS
+，表示LNA
大写字母(例如，C、G、A、T)表示LNA(除了在SEQ ID NO：11-13中外，其中其不具有意义)
小写字母(例如，c、g、a、t)表示无修饰。
如本文中所使用的，术语“SPARC RNA”是指包含SPARC蛋白的编码序列的RNA分子。
如本文中所使用的，术语“核酸”或“寡核苷酸”是指多个核苷酸(即包含连接于磷酸基团和可互换的有机碱的糖(例如核糖或脱氧核糖)的分子，其是取代的嘧啶(例如，胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))或取代的嘌呤(例如，腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))。术语还包括多核苷(即多核苷酸除去磷酸)和任何其他包含有机碱的聚合物。嘌呤和嘧啶包括但不限于腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、肌苷、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤以及其他天然和非天然存在的核碱基、取代的和未取代的芳香族部分。天然核酸具有脱氧核糖或磷酸核糖主链。人工或合成多核苷酸是在体外或在无细胞系统中聚合的并且包含相同或相似的碱基但可包含除了天然磷酸核糖主链外的类型的主链的任何多核苷酸。此类主链包括：PNA(肽核酸)、硫代磷酸酯、二氨基磷酸酯、吗啉代和天然核酸的磷酸酯主链的其他变体。其他此类修饰对于本领域普通技术人员来说是公知的。因此，术语核酸还包括在例如碱基和/或糖中具有置换或修饰的核酸。
术语“碱基”包括DNA和RNA的任何已知碱基类似物。碱基包括嘌呤和嘧啶，其还包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物。嘌呤和嘧啶的合成衍生物包括但不限于置有新反应性基团例如但不限于胺、醇、硫醇、羧化物和卤烃的修饰。
当应用于RNA时，术语“分离的核酸”主要指由如上定义的分离的DNA分子编码的RNA分子。备选地，所述术语可以指已与与其在天然状态下(即，在细胞或组织中)结合的其他核酸充分分离的RNA分子。分离的核酸(DNA或RNA)还可代表通过生物学或合成方法直接产生的并且在其产生过程中与其他成分离的分子。
此外，如本文中所使用的，术语“核酸”包括肽核酸。锁核酸(LNA)是一类其中核糖环被连接2’-O原子与4’-C原子的亚甲基桥“锁住”的核酸类似物。LNA核酸包含普通核碱基(T、C、G、A、U和mC)并且能够根据标准Watson-Crick碱基配对法则形成碱基对。然而，通过用亚甲基桥“锁住”分子，LNA被限制在进行Watson-Crick结合的理想构象中。当掺入DNA寡核苷酸时，LNA从而使得与互补核苷酸链更快速地配对并且增加所得的双链体的稳定性。
此外，如本文中所使用的，术语“分离RNA”包括制备组织切片处中的RNA以用于原位杂交。
“肽”和“多肽”在本文中可互换使用并且是指由通过肽键连接的氨基酸残基的链构成的化合物。多肽的“活性部分”意指不如全长多肽长，但保持可测量的生物学活性并保持生物检测的肽。
“LNA/DNA mixmer”或“mixmer”用于指包含至少一个LNA单位和至少一个RNA或DNA单位(例如，天然存在的RNA或DNA单元)的核酸。
“gapmer”基于通常邻侧有1至6个残基的2′-O修饰核苷酸(在我们的情况中是β-D-氧-LNA，邻侧)的4-12个碱基DNA(缺口)的中心区段，其能够通过RNA酶H介导的机制降低靶序列的水平。
“headmer”被定义为在5′-末端后有朝向3′-末端的可被RNA酶H识别和切割的DNA或经修饰的单体的连续区段的β-D-氧-LNA或LNA衍生物的连续区段，“tailmer”被定义为在5′-末端后有朝向3′-末端连接有β-D-氧-LNA或LNA衍生物的连续区段的可被RNA酶H识别和切割的DNA或经修饰的单体的连续区段。适当地，在一个这样的“gapmer”实施方案中，所述子序列包含如本文中所定义的4个核苷酸类似物例如LNA核苷酸类似物的区段，后接8个核苷酸的区段，其后是4个核苷酸类似物例如本文中定义的LNA核苷酸类似物的区段，其任选地在3′末端具有单个核苷酸。
在一个另外的“gapmer”实施方案中，所述序列包含本文中定义的3个核苷酸类似物，例如LNA核苷酸类似物的区段，后接9个核苷酸的区段，其后是3个核苷酸类似物例如本文中定义的LNA核苷酸类似物的区段，任选地在3′末端具有单个核苷酸。已令人惊讶地发现这样设计非常有效。
在一个另外的“gapmer”实施方案中，所述序列包含例如本文中定义的4个核苷酸类似物例如LNA核苷酸类似物的区段，后接8个核苷酸的区段，其后是3个核苷酸类似物例如本文中定义的LNA核苷酸类似物的区段，任选地在3′末端具有单个核苷酸。
术语“缀合物”或“标签”是指化学部分，是核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸或氨基酸、肽或蛋白质或者其他化学品，当将所述化学部分添加至另一个序列时，提供了额外的用途或赋予有用的性质，特别是在该序列的递送、运输、检测或分离中。优选，缀合物是添加至MRE-隐蔽LNA的3′末端的胆固醇，其赋予本发明的LNA为细胞可渗透的能力。在蛋白质标签的情况下，可将组氨酸残基(例如，4-8个连续组氨酸残基)添加至蛋白质的氨基或羧基末端以通过螯合金属层析促进蛋白质分离。备选地，可将代表与特定抗体分子或其他分子反应的表位或结合决定簇(例如，flag表位、c-myc表位、流感病毒A型病毒血凝素蛋白的跨膜表位、蛋白A、纤维素结合结构域、钙调素结合蛋白、麦芽糖结合蛋白、壳多糖结合结构域、谷胱甘肽S-转移酶等)的氨基酸序列、肽、蛋白质或融合伴侣添加至蛋白质，以促进通过例如亲和或免疫亲和层析的方法的蛋白质分离。许多其他标签部分对于本领域普通技术人员是已知的，并且可由本领域普通技术人员设计，并且预期在本定义的范围内。
如本文中所使用的，术语“肿瘤”是指任何赘生性生长、增殖或细胞团，无论是良性的还是恶性的(癌性的)，无论是原发性位点损伤还是转移灶。
如本文中所使用的，术语“癌症”是指由已丧失对正常生长控制的易感性的细胞的增殖引起或表征的增殖性障碍。相同组织类型的癌症通常始于相同组织，并且可基于它们的生物特征被分成不同亚型。癌症的4个一般种类是癌(上皮细胞衍生的)、肉瘤(结缔组织或中胚层衍生的)、白血病(形成血液的组织衍生的)和淋巴瘤(淋巴组织衍生的)。已知有200多种不同类型的癌症，并且可影响身体的每一个器官和组织。不限制癌症的定义的癌症的具体实例可包括黑素瘤、白血病、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、视网膜母细胞瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、何杰金氏淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病。可受不同癌症影响的器官和组织的实例包括胰、乳腺、甲状腺、卵巢、子宫、睾丸、前列腺、脑垂体、肾上腺、肾、胃、食管、直肠、小肠、结肠、肝、胆囊、头与颈、舌、嘴、眼和眼眶、骨、关节、脑、神经系统、皮肤、血液、鼻咽组织、肺、喉、泌尿道、宫颈、阴道、外分泌腺、和内分泌腺。备选地，癌症可以是多中心的或可以是原发部位不明(CUPS)的。
如本文中所使用的“治疗有效量”是指缓解(至一定程度，如由熟练医疗工作者判断的)哺乳动物的疾病或病况的一种或多种症状的组合物的量。此外，组合物的“治疗有效量”是指与疾病或病况相关或诱发疾病或病况的生理或生化参数部分或完全回复至正常的量。本领域临床医生可确定当例如静脉内、皮下、腹膜内、口服或通过吸入施用其时，为了治疗或预防特定病况或障碍所需的组合物的治疗有效量。治疗有效所需的组合物的精确量，除了许多患者的特殊考虑外，将取决于许多因素例如活性剂的比活性、使用的递送设备、试剂的物理特征、施用目的。但在理解本文中所示的公开内容后，治疗有效量的确定在本领域临床医生的能力之内。
在某些实施方案中，术语“治疗有效量”是指显著降低表达的水平的结果，包括例如，约20％的降低，优选约25％的降低，更优选约30％的降低，甚至更优选约33％的降低，甚至更优选约50％的降低，甚至更优选约67％的降低，甚至更优选约80％的降低，甚至更优选约90％的降低，甚至更优选约95％的降低，甚至更优选约99％的降低，甚至更优选1/50倍降低，甚至更优选100倍降低，甚至更优选1,000倍降低，甚至更优选10,000倍降低，和最优选完全沉默。
如本文中所使用的，术语“治疗”、“处理”、“疗法”和“治疗性处理”是指治愈性疗法、预防性疗法或防治性疗法。“预防性疗法”的实例是预防或减少所靶向疾病(例如，癌症或其他增殖性疾病)或与其相关的病况的机会。需要处理的人包括已患有疾病或病况的人以及易于患有待预防的疾病或病况的人。如本文中所使用的术语“治疗”、“处理”、“疗法”和“治疗性处理”也描述了目的在于抵抗疾病或相关病况的哺乳动物的管理和护理，并且包括施用组合物以缓解疾病、病况的症状、副作用或其他并发症。癌症的治疗性处理包括但不限于手术、化学疗法、放射疗法、基因疗法和免疫疗法。
如本文中所使用的，术语“试剂”或“药物”或“治疗剂”是指怀疑具有治疗性质的化合物、化合物的混合物、生物大分子或从生物材料例如细菌、植物、真菌或动物(特别地哺乳动物)细胞或组织制备的提取物。可纯化、大体上纯化或部分纯化试剂或药物。根据本发明的“试剂”还包括放射治疗剂或“化学治疗剂”。
如本文中所使用的，术语“诊断剂”是指用于患病组织例如肿瘤成像的任何化学药品。
如本文中所使用的，术语“化学治疗剂”是指具有抗癌症、赘生和/或增殖性疾病的活性或具有直接杀伤癌细胞的能力的试剂。
如本文中所使用的，“药物制剂”包括用于人和兽医学用途，不具有明显的有害理学效应的制剂。如本文中所使用的“药学上可接受的制剂”是指允许本发明的核酸分子有效地分布在最适合于它们期望的活性的物理位置的组合物或制剂。
如本文中所使用的，术语“药学上可接受的载体”意欲包括与药物施用相容的任何和全部溶剂、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域是公知的。除非任何常规介质或试剂不与活性化合物相容外，否则包括其在组合物中的用途。
如本文中所使用的，“治疗有效量“是指缓解(至一定程度，如由熟练医疗工作者判断的)哺乳动物的疾病或病况的一种或多种症状的组合物的量。此外，“治疗有效量”意指与疾病或病况相关或诱发疾病或病况的生理或生化参数部分或完全回复至正常的组合物的量。本领域临床医生可确定当例如静脉内、皮下、腹膜内、口服或通过吸入施用其时，为了治疗或预防特定病况或障碍所需的组合物的治疗有效量。治疗有效所需的组合物的精确量，除了许多患者的特殊考虑外，将取决于许多因素例如活性剂的比活性、使用的递送设备、试剂的物理特征、施用目的。但在理解本文中所示的公开内容后，治疗有效量的确定在本领域临床医生的能力之内。
如本文中所使用的，术语“试剂”或“药物”或“治疗剂”是指怀疑具有治疗性质的化合物、化合物的混合物、生物大分子或从生物材料例如细菌、植物、真菌或动物(特别地哺乳动物)细胞或组织制备的提取物。可纯化、大体上纯化或部分纯化试剂或药物。根据本发明的“试剂”还包括放射治疗剂或“化学治疗剂”。
如本文中所使用的，术语“诊断剂”是指用于患病组织例如肿瘤成像的任何化学药品。
如本文中所使用的，术语“化学治疗剂”是指具有抗癌症、赘生和/或增殖性疾病的活性的试剂。
如本文中所使用的，术语“放射治疗方案”或“放射疗法”是指施用辐射以杀伤癌细胞。辐射与细胞内的不同分子相互作用，但导致细胞死亡的主要靶标是脱氧核糖核酸(DNA)。然而，放射疗法通常也导致对细胞和细胞核膜和其他细胞器的损伤。DNA损伤通常包括糖-磷酸主链的单链和双链断裂。此外，存在可破坏细胞功能的DNA和蛋白质的交联。取决于辐射类型，DNA损伤的机制可变化，相对生物效率亦变化。例如，重粒子(即，质子、中子)直接破坏DNA并且具有更大的相对生物效率。然而，电磁辐射通过主要由细胞的水的电离产生的短暂的、羟基自由基导致间接的离子化作用。辐射的临床应用由外射线束放射(来自外部来源)和近距离放射疗法(使用植入或插入患者的辐射源)组成。外射线束辐射由由X射线和/或γ射线组成，然而近距离放射疗法使用衰变并且发射α粒子或β粒子连同γ射线的放射性核。
如本文中所使用的，术语“备选治疗方案”或“备选疗法”(非上述一线化学治疗方案)可包括例如受体酪氨酸激酶抑制剂(例如IressaTM(吉非替尼)、TarcevaTM(埃罗替尼)、ErbituxTM(西妥昔单抗)、伊马替尼甲磺酸(GleevecTM)、蛋白体抑制剂(例如硼替佐米、VelcadeTM)；VEGFR2抑制剂例如PTK787(ZK222584)、极光激酶抑制剂(例如ZM447439)；雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)抑制剂、环氧化酶-2(COX-2)抑制剂、雷帕霉素抑制剂(例如西罗莫司、RapamuneTM)；法呢酰基转移酶抑制剂(例如替吡法尼(tipifarnib)、Zarnestra)；基质金属蛋白酶抑制剂(例如BAY 12-9566；磺化多糖替可加兰(sulfated polysaccharide tecogalan))；血管生成抑制剂(例如AvastinTM(贝伐单抗)；烟曲霉素(Fumagillin)的类似物例如TNP-4；羧胺三唑(carboxyaminotriazole)；BB-94和BB-2516；沙利度胺；白细胞介素-12；利诺胺(linomide)；肽片段；和抗血管生长因子和血管生长因子受体的抗体)；血小板衍生生长因子受体抑制剂、蛋白激酶C抑制剂、丝裂原-激活激酶抑制剂、丝裂原-激活蛋白激酶激酶抑制剂、劳斯肉瘤病毒转化癌基因(SRC)抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、小缺氧诱导因子抑制剂、hedgehog抑制剂和TGF-β信号传导抑制剂。此外，免疫治疗剂也可被认为是备选的治疗方案。例如，血清或含γ球蛋白的形成的抗体；非特异性免疫刺激佐剂；活性特异性免疫疗法；和过继免疫疗法。此外，备选的疗法可包括其他基于生物学的化学实体例如多核苷酸，包括反义分子、多肽、抗体、基因疗法载体等。可单独或组合地或与本文中描述的其他治疗方案组合地施用此类备选的治疗剂。联合疗法中备选治疗方案中使用的化学治疗剂或其他试剂的使用方法(包括给药和施用方案)对于本领域普通技术人员来说也是已知的。
术语“共施用”和“联合疗法”是指给受试者施用两种或更多种治疗活性剂。试剂可包含在单一药物组合物中并且在同一时间施用，或者试剂可包含在分开的制剂中并且可相继给受试者施用。只要两种试剂可在同一时间在受试者中被检测到，那么两种试剂被称作是共施用的。
II.寡核苷酸
本发明提供了包含与SEQ ID NO：1或5互补的DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸中的一种或多种的SPARC反义寡核苷酸。
在优选实施方案中，所述寡核苷酸具有选自SEQ ID NO：2-4和7-13的序列。在其他实施方案中，所述序列与SEQ ID NO：2-4和7-13的任一个至少80％同一，至少90％同一，至少95％同一或至少99％同一。然而，在任何预期的实施方案中，所述寡核苷酸能够与SEQ IDNO：1或SEQ ID NO：5的序列特异性杂交。
本发明还提供了用于使用SPARC反义寡核苷酸靶向的在SPARCcDNA中的位置。具体地，提供了在SEQ ID NO：1的核苷酸212、311、312、521、825、841、969、985、1001、1017的一个或多个上与SEQID NO：1互补的12至19个碱基的反义寡核苷酸，如图11中概念性显示的。即，提供了与上文中鉴定的SEQ ID NO：1的核苷酸的一个或多个以及位于所述鉴定的核苷酸的一端或两端上的额外连续核苷酸互补的反义寡核苷酸。本领域普通技术人员将理解，还可包括简并或经修饰的核苷酸，但所述核苷酸必须也能够与SEQ ID NO：1的序列特异性杂交。例如，寡核苷酸可与互补序列相异3个核苷酸、2个核苷酸或优选1个核苷酸，虽然本身具有互补序列的寡核苷酸是最优选的。
关于单链核酸，特别是寡核苷酸，术语“特异性杂交”是指在本领域内通常使用的预定条件下允许这样的杂交的充分互补(有时称为“大体上互补”)序列的两条单链核苷酸分子之间的结合。具体地，该术语是指寡核苷酸与RNA分子中包含的大体上互补序列的杂交，以基本上排除寡核苷酸与非互补序列的单链核酸的杂交。使得不同互补性的单链核酸分子能够特异性杂交的适当条件在本领域是公知的。
合适的寡核苷酸可以是未修饰的或化学修饰的单链寡核苷酸。合适的寡核苷酸在长度上为约10至约30个碱基，优选在长度上为约12至约25个碱基。最优选，寡核苷酸在长度上为约12至约19个碱基。
根据本发明的SPARC反义寡核苷酸包括其中DNA、RNA、LNA或PNA分子中的一种或多种包含SEQ ID NO：2-4和7-13的任何一种或多种的组合物。在优选实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：3和/或8的SPARC反义寡核苷酸。根据本发明的SPARC反义寡核苷酸还可包括药学上可接受的载体。
本发明提供的SPARC反义寡核苷酸可包括gapmer、mixmer、2’-MOE、硫代磷酸boranophosphate、2’-O-甲基、2’-氟、末端倒转-dT碱基、PEG、2’tBDMS、2’-TOM、t’-ACE或其组合的一种或多种。本发明提供的SPARC反义寡核苷酸包括其中所述DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸中一种或多种的至少一种通过添加胆固醇、双胆固醇、PEG、PEG化碳纳米管、多聚-L-赖氨酸、环糊精、聚乙烯亚胺聚合物或肽部分的任一种而被修饰的SPARC反义寡核苷酸。此外，本发明提供的SPARC反义寡核苷酸包括其中所述DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸中的一种或多种的每一种通过添加胆固醇、双胆固醇、PEG、PEG化碳内米管、多聚-L-赖氨酸、环糊精、聚乙烯亚胺聚合物或肽部分的任一个而被修饰的反义寡核苷酸。此外，根据本发明的寡核苷酸可被包括合成或天然存在的聚合物或蛋白质的任何聚合物种类修饰。
用于根据本发明的用途的合适的寡核苷酸可由天然存在的核碱基、糖和核苷间(主链)连接以及类似地起作用或具有特定的改善的功能的非天然存在的部分的寡核苷酸组成。完全或部分修饰或置换的寡核苷酸通常由于这些寡核苷酸的几个期望的性质(例如，穿过细胞膜的能力、良好的对细胞外和细胞内核酸酶的抗性、对于核酸靶标的高亲和力和特异性)而优于天然形式。
优选地，根据本发明的寡聚化合物例如反义寡核苷酸包含至少一个锁核酸(LNA)单元例如3、4、5、6、7、8、9或10个锁核酸(LNA)单位，优选4至9个LNA单位，例如6-9个LNA单位，最优选6、7或8个LNA单元。优选LNA单元包含至少一个β-D-氧-LNA单元，例如4、5、6、7、8、9或10个β-D-氧-LNA单元。所有LNA单元可以例如是β-D-氧-LNA单元，虽然认为寡聚化合物例如反义寡核苷酸可包含超过一种类型的LNA单元。适当地，寡聚化合物可包含β-D-氧-LNA和下列LNA单元的一种或多种：硫代-LNA、氨基-LNA、氧-LNA、ena-LNA和/或α-LNA，以D-β或L-α构型或其组合。
本发明的实施方案可包含核苷酸类似物，例如LNA核苷酸类似物，子序列通常可包含2-6个核苷酸类似物例如本文中定义的LNA核苷酸类似物的区段，后接4-12个核苷酸，之后是2-6个核苷酸类似物例如本文中定义的LNA核苷酸类似物的区段。一个合适的实施方案，本发明的寡核苷酸包含经修饰的碱基以便所述寡核苷酸保持它们结合其他核酸序列的能力，但不能与蛋白质例如RNA降解机器显著结合。LNA赋予靶标增加的亲和力，并且是本发明的范围内优选实施方案。为了增加的核酸酶抗性和/或对靶标的结合亲和力，本发明中表征的寡核苷酸试剂还可包含2′-O-甲基、2′-氟、2′-O-甲氧基乙基、2′-O-氨基丙基、2′-氨基和/或硫代磷酸酯连接等。LNA、乙烯核酸(ENAS)例如2′-4′-乙烯-桥连核酸和某些核碱基修饰例如2-氨基-A、2-硫代(例如，2-硫代-U)、G钳(G-clamp)修饰也可增加对靶标的结合亲和力。
天然核酸具有脱氧核糖-或核糖-磷酸主链。人工或合成多核苷酸是在体外或在无细胞系统中聚合的任何多核苷酸并且包含相同或相似的碱基但还可包含除了天然核糖-磷酸主链外的类型的主链。这些主链包括：PNA(肽核酸)、硫代磷酸酯、磷酰二胺、吗啉代和天然核酸的磷酸主链的其他变体。碱基包括嘌呤和嘧啶，其还包括天然化合物腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、肌苷和天然类似物。嘌呤和嘧啶的合成衍生物包括但不限于安置了新反应基团例如但不限于胺、醇、硫醇、羧化物和卤烃的修饰。术语碱基包括DNA和RNA的已知的碱基类似物的任一种。
虽然脱氧核糖核酸磷酸二酯寡核苷酸适合于根据本发明的用途，但它们不是优选的。甲基膦酸酯寡核苷酸是不带电荷的寡聚物，其中寡核苷酸链中的每一个磷上的非桥连氧原子被甲基替代。硫代磷酸酯非对映体中的磷代磷酸酯具有改善的核酸酶稳定性。优选实施方案包括O-烷基，最常见地甲基对核糖的2′-位置上的氢的替代。这些寡核苷酸与靶向的mRNA形成高熔解异源双链体并且通过非RNA酶H依赖性机制诱导反义效应。
合适的寡核苷酸还包括不具有天然磷酸-核酸主链的实施方案。肽核酸(PNA)是包含不带电荷的、柔性聚酰胺主链的核酸类似物，所述聚酰胺主链由核碱基通过亚甲基羰基接头与其连接的重复N-(2-氨乙基)甘氨酸单元组成。这些寡聚物可与核酸：单链或双链DNA或RNA形成非常稳定的双链体或三链体。高亲和力核酸结合的性质可通过因为PNA寡聚物上不存在负电荷从而缺少静电排斥来解释。因为PNA不是RNA酶H或其他RNA酶的底物，因此PNA的反义机制依赖于空间位阻。PNA还可结合DNA并抑制RNA聚合酶起始和延伸，以及转录因子例如核因子κB的结合和作用。PNA还可结合mRNA和抑制剪接或翻译起始及延伸。
其中脱氧核糖部分被吗啉环替代并且磷酸二酯亚单位间连接被不带电荷的磷酸二酰胺连接替代的磷酰二胺吗啉代寡聚物也适合于根据本发明的用途。这些寡核苷酸在生物系统中是非常稳定的并且在无细胞翻译系统和少数培养的动物细胞系中展示有效率的反义活性。
适当类型的寡核苷酸的另一个实例是N3′→P5′PN，其因核糖的3′位置上的氧被胺基替代而产生。这些寡核苷酸可相对于它们的同序列(isosequential)磷酸二酯对应物，与RNA和单链或双链DNA形成非常稳定的复合物。可通过使用嵌合寡核苷酸来增加特异性以及效力，在所述嵌合寡核苷酸中，RNA酶H感受区段(RNase H-competentsegment)，通常硫代磷酸酯部分，通过经修饰RNA的更高亲和力区域例如2′O-烷基寡核苷酸而结合在一个或两个末端上。该置换不仅增加寡核苷酸对于其靶标的亲和力而且还减少非靶向mRNA被RNA酶H切割。
在优选实施方案中，给细胞施用SPARC反义组合物使该细胞中SEQ ID NO：1的RNA或SPARC蛋白质的水平降低至少25％，至少30％，至少80％，至少100倍，或最优选至少1,000倍。
III.药物组合物
在某些实施方案中，本发明的SPARC反义组合物还可包含药学上可接受的载体。
本发明的组合物还可包含活性剂。在某些实施方案中，活性剂是直接能够展示其药理学作用的药物活性治疗剂。在其他实施方案中，活性剂是诊断剂。在优选实施方案中，活性剂是缀合于SPARC反义寡核苷酸的诊断或治疗活性剂。应理解，某些活性剂同时用作诊断和治疗剂，从而这样的术语不是相互排斥的。
活性剂可以是任何合适的治疗剂或诊断剂，例如化学治疗剂或抗癌剂。用于根据本发明的用途的合适的化学治疗剂或其他抗癌剂包括但不限于酪氨酸激酶抑制剂(genistein)、生物学活性剂(TNF或tTF)、放射性核素(131I、90Y、111In、211At、32P和其他已知的治疗性放射性核素)、阿霉素、安莎霉素类抗生素(ansamycin antibiotics)、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺铂、卡铂、卡莫司汀、卡培他滨、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、达卡巴嗪、更生霉素(dactinomycin)、道诺霉素(daunorubicin)、右雷佐生、多西他赛、多柔比星、依托泊苷、埃博霉素(epothilones)、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巯嘌呤、美法仑、甲氨蝶呤、雷帕霉素(西罗莫司)及衍生物、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲(nitrosurea)、紫杉醇、帕米膦酸(pamidronate)、喷司他丁、普卡霉素(plicamycin)、丙卡巴肼、利妥昔单抗、链佐星(streptozocin)、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、塞替派、紫杉烷类(taxanes)、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、泰素、考布他汀(combretastatins)、discodermolides和反铂(transplatinum)。
用于根据本发明的用途的其他合适的化学治疗剂包括但不限于抗代谢药(antimetabolites)(例如，天冬酰胺酶)、抗有丝分裂物质(antimitotics)(例如，长春花生物碱(vinca alkaloids))、DNA损伤剂(例如，顺铂)、促细胞凋亡剂(诱导程序化细胞死亡或细胞凋亡的试剂)(例如，表鬼臼毒素(epipodophylotoxins))、分化诱导剂(例如，类视黄醇)、抗生素(例如，博来霉素)和激素(例如，他莫昔芬、己烯雌酚(diethylstilbestrol))。此外，用于根据本发明的用途的合适的化学治疗剂包括抗血管生成剂(血管生成抑制剂)例如，INF-α、夫马洁林、血管他丁、内皮他丁、沙立度胺等。
优选化学治疗剂包括多西紫杉醇、紫杉酚及其组合。“其组合”是指包含超过1种药物例如多西紫杉醇和紫杉酚的剂型的施用，以及多西紫杉醇与紫杉酚的连续地但时间上不同的施用(例如，在一个周期中使用多西紫杉醇但在下一周期中使用紫杉酚)。特别优选化学治疗剂包含蛋白质结合药物的颗粒，包括但不限于，其中组成蛋白质结合药物颗粒的蛋白质包括白蛋白，包括其中超过50％的化学治疗剂以纳米颗粒形式存在。最优选，化学治疗剂包含白蛋白结合紫杉酚的颗粒，例如Abraxane
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可按照本发明使用此类白蛋白结合紫杉酚制剂，其中施用的紫杉酚剂量为约30mg/mL至约1000mg/mL，约3周的给药周期(即，每约3周一次施用紫杉酚的剂量)。此外，期望地，施用的紫杉酚的剂量为约50mg/mL至约800mg/mL，优选约80mg/mL至约700mg/mL，最优选约250mg/mL至约300mg/mL，约3周的给药周期。
其他治疗剂还包括但不限于生物学活性多肽、抗体和其片段、凝集素和毒素(例如篦麻毒素A)或放射性核素。用作根据本发明的活性剂的适当抗体包括但不限于缀合(偶联的)或未缀合的(未偶联的)抗体、单克隆或多克隆抗体、人源化或非人源化的抗体以及Fab′、Fab或Fab2片段、单链抗体等。涉及的抗体或抗体片段可以是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM的Fc片段。在不同优选实施方案中，活性剂是单链抗体、Fab片段、微型双功能抗体(diabody)等。在更优选实施方案中，抗体或抗体片段介导补体激活、细胞介导的细胞毒性和/或调理素作用。
此外，药物活性剂可以是siRNA。在优选实施方案中，siRNA分子抑制与肿瘤相关的基因(例如c-Sis和其他生长因子、EGFR、PDGFR、VEGFR、HER2、其他受体酪氨酸激酶、Src-家族基因、Syk-ZAP-70家族基因、BTK家族基因、其他细胞质酪氨酸激酶、Raf激酶、细胞周期蛋白依赖性激酶、其他细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶、Ras蛋白和其他调节性GTP酶)的表达。
还可将SPARC反义寡核苷酸缀合于聚乙二醇(PEG)。PEG缀合能够增加蛋白质的循环半衰期，降低蛋白质的免疫原性和抗原性，并改善其生物学活性。可以使用任意合适的缀合方法，包括但不限于：使甲氧基-PEG与SPARC反义寡核苷酸的可供利用的氨基或其它活性反应位点例如组氨酸或半胱氨酸反应。此外，可以使用重组DNA法将具有PEG反应活性基团的氨基酸添加到本发明的SPARC反义寡核苷酸中。可在将PEG与SPARC反义寡核苷酸反应之前加工PEG，例如，可将接头基团添加到PEG。此外，可以根据本发明使用可释放的和杂合的PEG化策略，例如SPARC反义寡核苷酸的PEG化，以便添加到SPARC反义寡核苷酸中的某些位点的PEG分子在体内被释放。此类PEG缀合方法是本领域已知的(参见，例如，Greenwald等人，Adv.Drug Delivery Rev.55：217-250(2003))。
涉及的SPARC反义寡核苷酸和其缀合物，可以配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)以及与无机酸例如盐酸或磷酸形成的盐，或者与有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的盐。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱例如异丙胺、三甲基胺、组氨酸、普鲁卡因等。
通常在具有载体例如药学上可接受的载体的制剂中本发明的组合物。载体通常是液体，但也可以是固体，或液体与固体成分的组合。载体优选为生理学上可接受的(例如药学上可接受的或药理学上可接受的)载体(例如赋形剂或稀释剂)。生理学上可接受的载体是本领域公知的并且是可以容易获得的。合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、摩尔渗透压浓度调节剂、缓冲剂和pH调整剂。合适的添加剂包括生理学上生物相容性缓冲剂、螯合剂或钙螯形络合物的添加或任选地钙或钠盐的添加。可包装药物组合物以以液体形式使用，或可进行冷冻干燥。优选生理学上可接受的载体介质是水、缓冲的水、生理盐水、0.4％的盐水、0.3％的甘氨酸、透明质酸等。载体的选择可至少部分地通过靶组织和/或细胞的位置和用于施用组合物的具体方法来确定。
可配制用于通过途径包括静脉内、动脉内、肌肉内、腹膜内、鞘内、硬膜上、局部、经皮、皮下、经粘膜(包括例如肺)、鼻内、经直肠、经阴道或口服施用的组合物。所述组合物还包含另外的成分例如稀释剂、佐剂、赋形剂、防腐剂和pH调整剂等。
适合用于注射施用的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与目标接受体的血液等渗的溶质；水性和非水性的无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、冷冻保护剂和防腐剂。制剂的形式可以是单元剂量或多剂量的密封的容器，例如安瓿和小瓶，并且可以储存在冷冻干燥(冻干)的条件下，在临使用前，仅需要添加无菌的液体载体例如用于注射的水。可以从无菌粉末、颗粒和片剂来制备即用型的注射溶液和悬浮液。
可通过以所需的量将活性剂与一种上面例举的成分或其组合(根据需要)一起掺入合适的溶剂，然后过滤灭菌来制备无菌注射液。优选地用于注射的溶液不含内毒素。通常，通过将活性化合物掺入包含基本分散介质和来自上面列举的成分的所需其他成分的无菌媒介物来制备分散体。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，所述干燥可产生活性成分+来自其先前无菌过滤的液体的任何另外期望的成分的粉末。在所有情况下，制剂必须是无菌的并且其流动性必须达到容易注射的程度。其在生产和储存的条件下必须是稳定的，并且必须能抗微生物例如细菌和真菌的污染作用而保存。可以在水中通过适宜地与表面活性剂例如羟基纤维素混合来制备游离碱或药学上可接受盐形式的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物以及在油中制备分散液。在通常的储存和使用条件下，这些制备物含有防腐剂以阻止微生物的生长。
在优选实施方案中，可以将活性成分捕获在例如通过凝聚技术或通过界面聚合法制备的微胶囊中，例如，分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)或大乳剂中的羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。此类技术公开于Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.Ed.(1980)。具体地，可通过如Rezler等人，J.Am.Chem.Soc.129(16)：4961-72(2007)；Samad等人，Curr.Drug Deliv.4(4)：297-305(2007)；以及美国专利4,485,045和4,544,545中描述的方法来制备包含SPARC反义寡核苷酸的脂质体。具有增加的循环时间的脂质体公开于美国专利5,013,556中。白蛋白纳米颗粒在本发明的组合物中是特别优选的。
特别有用的脂质体可通过例如反相蒸发法利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物产生。可通过确定孔径的过滤器挤出脂质体以产生具有期望直径的脂质体。可使用Werle等人，Int.J.Pharm.370(1-2)：26-32(2009)中描述的方法将本发明的多核苷酸缀合于脂质体。
本发明还提供了细胞穿膜肽(Cell-Penetrating Peptide，CPP)用于帮助递送本文中公开的SPARC反义分子的用途。CPP是能够有效地穿过细胞脂双层的肽。由于该性质，它们可被用于获得基因表达的改变。CPP已在体内和体外实验中被用作不同生物学活性货物(bioactive cargo)的递送载体。具体地，CPP已被用作基因表达的多种效应物例如用于反义的寡核苷酸、siRNA(小干扰RNA)和诱饵dsDNA(双链DNA)应用，和用作用于质粒递送的转染剂。任何合适的缀合方法可用于偶联CPP与寡核苷酸(Heitz等人，Br J Pharmacol.2009 157(2)：195-206.)。合适的CPP包括但不限于Tat、Penetratin、Transportan、VP-22、MPG、Pep-1、MAP、PPTG1、SAP、寡精氨酸、SynB、Pvec和hCT(9-32)(Heitz等人，Br J Pharmacol.2009157(2)：195-206.)。
在其他实施方案中，可使用天然病毒或病毒样颗粒、树状聚合物、碳纳米装配物、聚合物载体、顺磁颗粒、铁磁性颗粒、聚合物小体(polymersome)、丝状胶束(filomicelle)、胶束或脂蛋白递送组合物。
至气道内的施用可提供全身性或局部施用，例如至气管和/或肺。此类施用可使用气雾剂、溶液和设备例如支气管镜通过吸入或通过物理应用来进行。对于吸入，本文中的组合物可方便地从吹入器、喷雾器、泵、加压包装物(pressurized pack)或用于递送气雾剂的其他方便的方法、粉剂的非气雾喷雾器或液体的非气雾喷雾器(noon-aerosolspray)进行递送。加压包装物可包括合适的推进剂例如液化气体或压缩气体。液体气体包括例如氟化氯化烃类、氢氯氟烃类、氢氯烃类(hydrochlorocarbons)、烃类和烃醚类。压缩气体包括例如氮、氧化亚氮和二氧化碳。具体地，涉及二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷，、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体的使用。在加压气雾剂的情况下，可通过提供阀门以递送控制的量来测定剂量单位。在施用干燥粉剂组合物中，粉剂混合物可包括合适的粉末基质例如乳糖或淀粉。粉剂组合物可以以单位剂型例如可借助于吸入器或吹入器从其施用粉剂的胶囊、药筒或泡罩包装(blister pack)提供。
还可通过经粘膜或经皮肤方法进行全身性施用。对于经粘膜或经皮肤施用，将适合于待穿过的屏障的渗透剂用于制剂中。此类渗透剂在本领域内通常是已知的，并且对于经粘膜施用，包括例如去垢剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可通过使用鼻腔喷雾、吸入的气雾剂、直肠或阴道栓剂、漱口药、速溶片剂或锭剂来实现。对于经皮肤施用，将活性成分配制成软膏、药膏、凝胶、泡沫或乳膏剂中，如本领域内通常已知的。
可使用药物递送系统递送药物组合物。此类递送系统包括透明质酸溶液或胶原片段的悬液。可将药物配制在微胶囊中，利用合适的聚合材料设计以用于控制释放，例如聚乳酸、乙羟纤维素、聚己酸内酯、聚己酸内酯二醇(polycaprolactone diol)、多聚赖氨酸、聚乙醇酸、聚马来酸、聚[N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺]等。使用药物递送系统的特定制剂可以以液体悬液、软膏、绷带的复合物、胶原罩(collagenshield)等的形式存在。
组合物还可包含任何其他合适的成分，特别地用于增强组合物的稳定性和/或其最终用途。因此，存在众多种本发明的组合物的合适制剂。
持续释放的组合物也可用于本发明的组合物，例如在例如美国专利5,672,659和5,595,760中描述的组合物。立即或持续释放组合物的使用取决于所治疗病况的性质。如果病况由急性或超急性发作的障碍组成，则利用立即释放形式的治疗优于延长释放组合物。备选地，对于某些预防性或长期治疗，持续释放组合物可以是合适的。
此外，组合物可包含额外的治疗或生物学活性剂。例如，可存在在特定适应症的治疗中有用的治疗因子。控制炎症的因子例如布洛芬或甾类可以是组合物的部分以减小与药物组合物的体内施用和心理压力相关的肿胀和炎症。
由本发明提供的组合物可包括例如约0.5mL至约4mL的具有偶联至SPARC反义寡核苷酸的活性剂的水性或有机液体，活性剂的浓度为约10mg/mL至约100mg/mL，优选约1mg/mL至约10mg/mL，更优选约0.1mg/mL至约1mg/mL的活性剂浓度。活性剂可以以任何合适的和治疗上有效的浓度存在，例如，浓度为约10mg/mL至约50mg/mL的阿瓦斯丁。
IV.方法
本发明提供了治疗或预防动物的增殖性疾病的方法，包括施用治疗有效量的一种或多种本发明提供的SPARC反义组合物。在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗哺乳动物的疾病的方法，包括施用有效量的包含SPARC反义寡核苷酸的组合物。使用上述任何SPARC反义寡核苷酸的任何合适的组合物可用于本发明的方法。
根据本发明治疗动物的增殖性疾病的方法包括例如方法，其包括：(a)从动物的损伤组织分离RNA或蛋白质，(b)从对应的正常组织分离RNA或蛋白质，(c)测量所述损伤组织的SPARC RNA或蛋白质的水平，(d)测量所述对应的正常组织的SPARC RNA或蛋白质的水平，(e)将所述损伤组织的SPARC RNA或蛋白质的水平与所述对应的正常组织的SPARC RNA水平相比较，和(f)当步骤(e)中的比较显示相对于对应的正常组织的SPARC RNA的水平在损伤组织中存在更高水平的SPARC RNA或蛋白时，给动物施用治疗有效量的本发明的SPARC反义组合物。SPARC RNA的水平可通过任何合适的技术包括例如原位杂交、印迹杂交、PCR、TMA、侵入检测(invader)或微阵列来测定。SPARC蛋白的水平可通过任何合适的技术包括例如免疫组织学、免疫印迹、抗体微阵列或质谱法来测定。
备选地，根据本发明治疗动物的增殖性疾病的方法包括不测定或比较损伤的SPARC RNA或蛋白质的水平的方法。
根据本发明的方法，可给哺乳动物施用治疗有效量的组合物以相对于单独的活性剂递送增加活性剂至疾病位点的递送，或增加清除，从而导致SPARC的血液水平的下降。在优选实施方案中，SPARC的血液水平的下降为至少约10％。在更优选实施方案中，SPARC的血液水平的下降为至少约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或最优选至少约50％。
本方法可用于特征在于SPARC的过表达的任何病况。本发明对于其是有用的示例性疾病包括任意身体组织包括软组织、结缔组织、骨、实体器官、血管等中增殖、组织重构、增生、扩大的伤口愈合的异常病况。可使用本发明的方法和组合物治疗或诊断的疾病的实例包括癌症、糖尿病或其它肾病、炎症、关节炎、血管或人工血管移植物或血管内装置的再狭窄等。
根据本发明进行治疗或预防的合适增殖性疾病包括但不限于癌症、再狭窄或其他增殖性疾病、纤维化、骨质疏松症或扩大的伤口愈合。具体，此类合适的疾病包括但不限于，其中：(a)癌症选自原位癌、非典型增生、癌、肉瘤、癌肉瘤、肺癌、胰腺癌、皮肤癌、黑素瘤、血液肿瘤、乳腺癌、脑癌、结肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头颈癌、多发性骨髓瘤、肝癌、白血病、淋巴瘤、口癌、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、和甲状腺癌，(b)再狭窄选自冠状动脉再狭窄、大脑动脉再狭窄、颈动脉再狭窄、肾动脉再狭窄、股动脉再狭窄、周围动脉再狭窄或其组合，(c)其他增殖性疾病选自超常增生(hyperlasias)、子宫内膜异位症、增生性疤痕(hypertrophicscars)和疤痕疙瘩(keloid)、增生性糖尿病视网膜病变、肾小球肾炎、proliferatve、肺动脉高压、类风湿关节炎、动静脉畸形、粥样硬化斑块、冠状动脉疾病、延迟的伤口愈合、血友病性关节(hemophilicjoints)、不连接骨折(nonunion fractures)、奥-韦综合征(Osler-Webersyndrome)、银屑病、化脓性肉芽肿、硬皮病、tracoma、月经过多、血管粘附蛋白(vascular adhesions)和乳头状瘤，和(d)纤维化疾病选自肝纤维化、肺纤维化和腹膜后纤维化。
根据本发明的方法包括但不限于其中将SPARC反义组合物静脉内、皮下、肌肉内、经鼻、腹膜内、经阴道、经肛门、口服、眼内或鞘内直接施用至生物体的患病组织的方法。根据本发明的方法包括例如其中动物也经历选自手术、化学疗法、放射疗法、热疗法、免疫疗法、激素疗法和激光疗法的一种或多种癌症疗法的联合疗法。
也可按照本发明的方法施用一种或多种剂量的一种或多种化学治疗剂，例如上述化学治疗剂。本发明方法中使用的化学治疗剂的类型和数目将取决于用于特定肿瘤类型的标准化学治疗方案。换句话说，虽然可利用单一化学治疗剂常规地治疗特定癌症，但也可用化学治疗剂的组合常规地治疗另一种特定癌症。用于将合适的治疗剂、化学治疗剂、放射性核素等用于抗体或其片段的联合疗法的方法在本领域是公知的。
通常，任何联合疗法可包括化学治疗剂、靶向剂如抗体；激酶抑制剂；激素试剂等的一种或多种。联合疗法还可包括常规疗法，包括但不限于抗体施用，疫苗施用，细胞毒素剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物和生物应答调节剂(biologic response modifier)的施用。可一起或相继使用两种或更多种组合的化合物。例如，在本领域内公知的并且可与本文中描述的组合物组合用作治疗的抗癌试剂包括但不限于本文中使用的抗癌试剂，一线“化学治疗剂”或一线化学疗法是可用于治疗癌症并且通常具有直接杀伤癌细胞的能力的药剂。化学治疗剂的实例包括烷化剂、抗代谢药、天然产物、激素和拮抗剂以及杂类试剂(miscellaneous agent)。烷化剂的实例包括氮芥例如例如氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑(L-sarcolysin)和苯丁酸氮芥；乙烯亚胺和甲基三聚氰胺例如六甲三聚氰胺和塞替派；烷基磺酸盐例如白消安；亚硝基脲例如卡莫司汀(BCNU)、司莫司汀(甲基-CCNU)、洛莫司汀(CCNU)和链佐星(streptozocin)(链脲佐菌素(streptozotocin))；DNA合成拮抗剂例如磷酸雌莫司汀；和三嗪(triazines)例如达卡巴嗪(DTIC、二甲基-三嗪咪唑羧酰胺)和替莫唑胺。抗代谢物的实例包括叶酸类似物例如甲氨蝶呤(氨甲蝶呤(amethopterin))；嘧啶类似物例如氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶、5-FU、5FU)、氟尿苷(氟脱氧尿苷、FUdR)、阿糖胞苷(cytarabine)(胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside))和吉西他滨；嘌呤类似物例如巯嘌呤(6-niercaptopurine、6-MP)、硫鸟嘌呤(6-硫鸟嘌呤，TG)和喷司他丁(pentostatin)(2′-脱氧肋间型霉素、脱氧肋间型霉素(deoxycoformycin))、克拉屈滨和氟达拉滨；和拓扑异构酶抑制剂例如安吖啶。天然产物的实例包括长春碱例如长春碱(VLB)和长春新碱；紫杉烷例如紫杉醇(Abraxane)和多西他赛(泰索帝)；表鬼臼毒素例如依托泊苷和替尼泊苷；喜树碱例如托泊替康和伊立替康；抗生素类例如更生霉素(dactinomycin)(放线菌素D(actinomycin D))、道诺霉素(柔红霉素(daunomycin)、正定霉素)、多柔比星、博来霉素、丝裂霉素(丝裂霉素C)、伊达比星、表柔比星；酶例如L-天冬酰胺酶；和生物应答调节剂例如干扰素-α和白细胞介素2。激素和拮抗剂的实例包括促黄体释放激素激动剂例如例如布舍瑞林；肾上腺皮质激素例如泼尼松和相关制备物；孕激素例如己酸羟孕酮、醋酸甲羟孕酮和醋酸甲地孕酮；雌激素例如己烯雌酚和炔雌醇和相关制备物；雌激素拮抗剂例如他莫昔芬和阿那曲唑；雄激素例如丙酸睾酮和氟甲睾酮和相关制备物；雄激素拮抗药例如氟他胺和比卡鲁胺；和促性腺素释放激素类似物例如亮丙瑞林。杂类试剂的实例包括沙利度胺；铂的配合物(platinum coordination complexes)例如顺铂(czs-DDP)、奥沙利铂和卡铂；蒽二酮例如米托蒽醌；取代的尿素例如羟基脲；甲基肼衍生物例如丙卡巴肼(procarbazine)(N-甲基肼(methylhydrazine)、MIH)；肾上腺皮质抑制剂例如米托坦(邻、对′-DDD)和氨鲁米特；RXR激动剂例如贝沙罗汀(bexarotene)；和酪氨酸激酶抑制剂例如伊马替尼。
如本文中所使用的，术语“放射治疗方案”或“放射疗法”是指施用辐射以杀伤癌细胞。辐射与细胞内的不同分子相互作用，但导致细胞死亡的主要靶标是脱氧核糖核酸(DNA)。然而，放射疗法通常也导致对细胞和核膜和其他细胞器的损伤。DNA损伤通常包括糖-磷酸主链的单链和双链断裂。此外，可存在可破坏细胞功能的DNA和蛋白质的交联。取决于辐射类型，DNA损伤的机制可变化，相对生物效率亦变化。例如，重粒子(即，质子、中子)直接破坏DNA并且具有更大的相对生物学效率。然而，电磁辐射通过主要由细胞水的电离产生的短暂的、羟基自由基导致间接的离子化作用。辐射的临床应用由外射线束放射(来自外部来源)和近距离放射疗法(使用植入或插入患者的辐射源)组成。外射线束辐射由由X射线和/或γ射组成，然而近距离放射疗法使用衰变并且发射α粒子或β粒子连同γ射线的放射性核。
如本文中所使用的，术语“备选治疗方案”或“备选疗法”(非上述一线化学治疗方案)可包括例如受体酪氨酸激酶抑制剂(例如IressaTM(吉非替尼)、TarcevaTM(埃罗替尼)、ErbituxTM(西妥昔单抗)、伊马替尼甲磺酸(GleevecTM)，蛋白体抑制剂(例如硼替佐米、VelcadeTM)；VEGFR2抑制剂例如PTK787(ZK222584)、极光激酶抑制剂(例如ZM447439)；雷帕霉素的哺乳动物靶子(mTOR)抑制剂、环氧化酶-2(COX-2)抑制剂、雷帕霉素抑制剂(例如西罗莫司、RapamuneTM)；法呢酰基转移酶抑制剂(例如替吡法尼(tipifarnib)、替匹法尼(Zarnestra))；基质金属蛋白酶抑制剂(例如BAY 12-9566；磺化多糖替可加兰(sulfated polysaccharide tecogalan))；血管生成抑制剂(例如AvastinTM(贝伐单抗)；烟曲霉素(Fumagillin)的类似物例如TNP-4；羧胺三唑(carboxyaminotriazole)；BB-94和BB-2516；沙利度胺；白细胞介素-12；三羧氨基喹啉(linomide)；肽片段；和抗血管生长因子和血管生长因子受体的抗体)；血小板衍生生长因子受体抑制剂、蛋白激酶C抑制剂、丝裂原-激活激酶抑制剂、丝裂原-激活蛋白激酶激酶抑制剂、劳斯肉瘤病毒转化癌基因(SRC)抑制剂、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、小缺氧诱导因子抑制剂、hedgehog抑制剂和TGF-β信号传导抑制剂。此外，免疫治疗剂也可被认为是可备选治疗方案。例如，血清或含γ球蛋白的形成的抗体；非特异性免疫刺激佐剂；活性特异性免疫疗法；和过继免疫疗法。此外，备选疗法可包括其他基于生物学的化学实体例如多核苷酸，包括反义分子、多肽、抗体、基因疗法载体等。可单独或组合地或者与本文中描述的其他治疗方案组合地施用此类备选治疗剂。联合疗法中备选治疗方案中使用的化学治疗剂或其他试剂的使用方法(包括给药和施用方案)对于本领域普通技术人员来说也是已知的。
为了使反义寡核苷酸下调基因表达，其必须渗入靶细胞。吸收通过主动运输发生，所述主动运输进而取决于温度、寡核苷酸的结构和浓度以及细胞。不期望受任何作用机制理论的束缚，认为吸附性内吞作用和液相胞饮是寡核苷酸内化的主要机制，内化物质的相对比例取决于寡核苷酸浓度。在相对低的寡核苷酸浓度上，内化可能通过与膜结合受体的相互作用而发生。在相对高的寡核苷酸浓度上，这些受体被饱和，并且胞饮过程假定起着更大的重要性。
载体在根据本发明的反义药物递送中的用途是任选的。使用裸露寡核苷酸进行利用反义寡核苷酸的临床试验。
然而，为了提高细胞吸收和寡核苷酸时空活性，已开发了许多技术和载体。合适的载体包括脂质体，其为通常由磷脂和胆固醇的双层组成的囊状胶体小囊泡。脂质体可以是中性的或阳离子的，取决于磷脂的性质。可容易地将寡核苷酸封装在脂质体内部，所述脂质体内部包含水性区室，或可通过静电相互作用将寡核苷酸连接于脂质体表面。此类载体因它们的正电荷而具有对细胞膜的高亲和力，所述细胞膜在生理条件下带负电荷。由于这些载体使用核内体途径来将寡核苷酸递送进入细胞，因此已将某些“辅助”分子添加进入脂质体来使寡核苷酸逃离核内体；此类分子包括种类例如氯喹和1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺。此类“辅助”分子最终诱导核内体膜去稳定化，从而允许寡核苷酸渗漏，随后所述寡核苷酸似乎以高浓度活跃地转运进入细胞核。许多商业载体例如Lipofectin和已知统称为Eufectin、Cytofectin、Lipofectamine等的化合物通常用于实验室研究。对于某些此类递送媒介物，并且在确定的条件下，可成功地使用≤50nm的寡核苷酸浓度。其他阳离子聚合物包括例如聚L-赖氨酸、PAMAM树状聚合物、聚氰基丙烯酸烷酯纳米颗粒、CPP和聚乙烯亚胺的用途也适合用于根据本发明的用途。
所有这些阳离子递送系统通过内吞机制内化寡核苷酸。为了避免所得的区室化问题，已考虑调节质膜通透性。通过使用碱性肽，可增加通过不依赖受体和转运蛋白的机制的寡核苷酸通过质膜。由于这些肽具有膜转位性质，因此与寡核苷酸的共价偶联可增加后者渗入细胞，将它们直接递送进入细胞质，从而最终递送进入细胞核。
用于寡核苷酸内化的其他的合适方法是产生质膜的瞬时透化，并允许裸露寡核苷酸通过扩散渗入细胞。该方法包括在膜中形成瞬时孔其通过链球菌溶血素O透化作用化学诱导的，通过显微注射或划痕加载机械产生的，或通过电穿孔产生的。
可将根据本发明的组合物与其他试剂例如另一种治疗剂或稳定寡核苷酸试剂的试剂例如与寡核苷酸试剂复合的蛋白质一起配制。其他试剂包括但不限于螯合剂、盐和RNA酶抑制剂(例如，RNAsin)。
用于直接注射和胃肠外施用的制剂在本领域是公知的。此类制剂可包括也包含缓冲剂、稀释剂和其他适当添加物的无菌水性溶液。为了进行静脉内使用，应当控制溶质的总浓度以使制备物等渗。
本发明表征的寡核苷酸试剂可包括递送媒介物例如脂质体(用于给受试者施用)、载体和稀释剂及其盐，和/或可存在于药学上可接受的制剂中。用于递送核酸分子的方法在本领域是公知的。
本发明表征的药物组合物还可包括常规药物赋形剂和/或添加剂。合适的药物赋形剂包括稳定剂、抗氧化剂、摩尔渗透压浓度调节剂、缓冲剂和pH调整剂。合适的添加剂包括生理学上生物相容性缓冲剂、螯合剂或钙螯形络合物的添加或任选地钙或钠盐的添加。可包装药物组合物以以液体形式使用，或可将其冷冻干燥。优选生理学上可接受的载体介质是水、缓冲的水、生理盐水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸、透明质酸等。
本发明还表征了制备用于贮存或施用的组合物，所述组合物在药学上可接受的载体或稀释剂中包含药物有效量的期望的寡核苷酸。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域中是公知的。
持续释放组合物例如在例如美国专利5,672,659和5,595,760中描述的那些。立即释放或持续释放组合物的用途取决于待治疗的病况的性质。如果病况由急性或超急性发作障碍组成，那么利用立即释放形式的处理优于延长释放组合物。备选地，对于某些预防性或长期处理，持续释放组合物可以是合适的。
本发明的药物组合物可以单次剂量或以多剂量施用。当通过输注释放这样的组合物时，输注可是单次持续给药或可以通过多次输注递送。可将试剂直接注射进入异常靶基因表达的位点上或位点附近的组织。可将试剂多次注射进入所述位点上或位点附近的组织。
为约1ug/kg至100mg/kg体重/施用的量级的剂量水平在疾病的治疗中是有用的。关于剂量，本发明的组合物可以以小于约75mg/kg体重或小于约70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg/kg体重和小于200nmol的反义组合物/kg体重或小于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075、0.00015nmol的反义组合物/kg体重的单位剂量施用。可以例如通过注射(例如，静脉内或肌肉内、鞘内或直接至器官内)、吸入或局部施用来施用单位剂量。
本领域普通技术人员也可容易地确定用于给给定的受试者施用本发明的反义组合物的合适剂量方案。在某些实施方案中，可给受试者施用组合物每天一次或二次，进行约3至约28天，更优选约7至约10天的时间段。在其他实施方案中，以低于每天一次，例如低于每2、4、8或30天一次的频率施用单位剂量。在其他实施方案中，不定期(例如，无有规律的频率)施用单位剂量。在另一个实施方案中，不定期(例如，无有规律的频率)施用单位剂量。在其他实施方案中，可给受试者施用SPARC反义组合物一次，如在不期望的靶核酸表达的位点上或其附近的单次注射或沉积。因为寡核苷酸试剂介导的上调可在施用反义组合物后持续数天，因此在许多情况下，可能以低于每天一次的频率施用组合物，或在某些情况下，在整个治疗方案中仅施用组合物一次。
当给药方案包括多个施用时，应理解施用给受试者的有效量的SPARC反义组合物可包括在整个给药方案期间施用的反义组合物的总量。本领域普通技术人员应理解，取决于多个因素稍微调整确切的单个剂量，所述因素包括待施用的特定SPARC反义组合物、施用时间、施用途径、制剂的性质、排泄速度、待治疗的具体障碍、障碍的严重度、寡核苷酸试剂的药效学以及患者的年龄、性别、体重和一般健康状况。考虑到不同施用途径的不同功效，预期存在必需剂量水平的广泛变异。
可在单次剂量或者在两次或更多次剂量中施用有效剂量，如在特定情况下适当期望或考虑的。如果期望促进重复或频率输注，递送设备例如泵、半永久性支架(例如，静脉内、腹膜内、脑池内或囊内)或储液池(reservoir)的植入可以是推荐的。在成功的处理后，可以期望使患者经历维持治疗以预防疾病状态的复发。反义组合物的浓度是足以有效地治疗或预防障碍或调节人的生理状况的量。施用的反义组合物的浓度或量将取决于就施用的试剂和方法测定的参数。
某些因素可影响有效地治疗受试者所需的剂量，包括但不限于疾病或障碍的严重度、先前的治疗、受试者的一般身体状况和/或年龄和其他现有疾病。还应理解，用于治疗的反义组合物的有效剂量可随着特定治疗过程而增加或减少。剂量的变化可产生和根据诊断测定的结果而变得显然。例如，可在施用反义组合物后监控受试者。基于来自监控的信息，可施用额外量的反义组合物。本领域普通技术人员可容易地确定最佳剂量、给药方案和重复率。
动物可以是需要治疗或诊断的任何患者或受试者。在优选实施方案中，动物是哺乳动物。在特别优选实施方案中，动物是人。在其他实施方案中，动物可以是小鼠、大鼠、兔子、猫、狗、猪、马、牛或非人灵长类动物。
下列实施例还举例说明了本发明，但当然不应当被解释为以任何方式限定其范围。
实施例1
本实施例显示SPARC-GFP报告子细胞系的构建。
使用PCR扩增BIO1 SPARC开放阅读框架(ORF)，同时引入N末端Kozak序列、C-末端6xHis-标签。通过TOPO-TA克隆将产物克隆入C末端GFP融合TOPO-TA表达载体。通过lipofectamine将所得的质粒pXL39-Bio1-GFP转染入293细胞。48小时后，利用1mg/mlG418选择细胞，挑拣单克隆，就最佳GFP信号对其进行筛选。
所得的pXL39-Bio1-GFP的图谱示于图1中。
然后，测试用pXL39-Bio1-GFP稳定转染的293个细胞的GFP信号。将细胞在来自T175的DMEM/FBS/G418中培养3天，在条件化培养基和细胞上进行GFP测量。在测定之前用HBSS洗涤106个细胞2次。使用QM3，利用激发395nm、发射峰510nm进行测量。如图2中显示的，对于SPARC-GFP报告子细胞系观察到比对照未转染的细胞显著更大的GFP活性。
从转染的细胞产生克隆，将其以100nM的起始浓度，0.5μL/孔DharmafectTM(Dharmacon，Inc.，Lafayette，CO)或LipofectamineTM(Invitrogen，Carlsbad，CA)转染剂用于经最优化以使本底荧光最小化(未据未显示)的条件化培养基(F12-K培养基，在转染复合物形成过程中向其中加入了0.375％FBS、0.25x NEAA和0.25mg/mL G418)。在第3天和一个月评估克隆的GFP信号和稳定性(数据未显示)，然后选择克隆AL2-11。将来自所选择的AL2-11细胞系的细胞以50K/孔接种，温育24和48小时。
利用victor 3板读数器和QM3检测GFP信号和稳定性，未例性结果示于图2中。
实施例2
本实施例显示响应siRNA和反义寡核苷酸的BIO1 SPARC-GFP信号的减少(“高低活性”)的测量。
三种抗-SPARC siRNA序列si13347、si13346、si13345(分别地SEQID NO：201-203)从Ambion(Austin，TX)商购获得。类似地使用SPARC开放阅读框架的步移分析(walk-through analysis)制备另外的反义寡核苷酸(SEQ ID NO：14-70)。制备用作阴性对照的相应有义寡核苷酸(SEQ ID NO：15-127)。还制备包括LNA的反义寡核苷酸(SEQ ID NO：128-200)的第二文库。
SEQ ID NO：15-203提供于下表2-5中。(*表示PS，+表示LNA)：
表2
  SEQ ID NO：   序列   序列名称
  201   ACTCCATAGACACCCTCGA   si13347
  202   GATGTAGCCCGGAACGTTTAT   si13346
  203   TCCCTACCTCCTGTTGTTGGAA   si13345
表3
  SEQ ID NO：   序列   序列名称
  14   +T+T*A*G*+A+T*C*A*+C+A*A*G*+A+T*C*C   抗-SP-1
  15   +T+T*G*T*+C+G*A*T*+A+T*C*C*+T+T*C*T   抗-SP-2
  16   +G+C*T*T*+G+A*T*G*+C+C*G*A*+A+G*C*A   抗-SP-3
  17   +G+C*C*G*+G+C*C*C*+A+C*T*C*+A+T*C*C   抗-SP-4
  18   +A+G*G*G*+C+G*A*T*+G+T*A*C*+T+T*G*T   抗-SP-5
  19   +C+A*T*T*+G+T*C*C*+A+G*G*T*+C+A*C*A   抗-SP-6
  20   +G+G*T*C*+T+C*G*A*+A+A*A*A*+G+C*G*G   抗-SP-7
  21   +G+T*G*G*+T+G*C*A*+A+T*G*C*+T+C*C*A   抗-SP-8
  22   +T+G*G*G*+G+A*T*G*+A+G*G*G*+G+A*G*C   抗-SP-9
  23   +A+C*G*C*+A+G*T*G*+G+A*G*C*+C+A*G*C   抗-SP-10
  24   +T+C*G*G*+T+G*T*G*+G+G*A*G*+A+G*G*T   抗-SP-11
  25   +A+C*C*C*+G+T*C*A*+A+T*G*G*+G+G*T*G   抗-SP-12
  26   +C+T*G*G*+T+C*C*A*+G+C*T*G*+G+C*C*G*   抗-SP-13
  27   +A+A*C*T*+G+C*C*A*+G+T*G*T*+A+C*A*G   抗-SP-14
  28   +G+G*A*A*+G+A*T*G*+T+A*C*A*+T+G*T*T   抗-SP-15
  29   +A+T*A*G*+T+T*C*T*+T+C*T*C*+G+A*A*G   抗-SP-16
  30   +T+C*C*C*+G+G*G*C*+C+A*G*C*+A+G*C*T   抗-SP-17
  31   +C+C*A*C*+G+G*G*G*+T+G*G*T*+C+T*C*C   抗-SP-18
  32   +T+G*C*C*+T+C*C*A*+G+G*C*G*+C+T*T*C   抗-SP-19
  33   +T+C*A*T*+T+C*T*C*+A+T*G*G*+A+T*C*T   抗-SP-20
  34   +T+C*T*T*+C+A*C*C*+C+G*C*A*+G+C*T*T   抗-SP-21
  35   +C+T*G*C*+T+T*C*T*+C+A*G*T*+C+A*G*A   抗-SP-22
  36   +A+G*G*T*+T+G*T*T*+G+T*C*C*+T+C*A*T   抗-SP-23
  37   +C+C*C*T*+C+T*C*A*+T+A*C*A*+G+G*G*T   抗-SP-24
  38   +G+A*C*C*+A+G*G*A*+C+G*T*T*+C+T*T*G   抗-SP-25
  39   +A+G*C*C*+A+G*T*C*+C+C*G*C*+A+T*G*C   抗-SP-26
  40   +G+C*A*G*+G+G*G*G*+A+A*T*T*+C+G*G*T   抗-SP-27
  41   +C+A*G*C*+T+C*A*G*+A+G*T*C*+C+A*G*G   抗-SP-28
 SEQ ID NO：   序列   序列名称
 42   +C+A*A*G*+G+G*G*G*+G+A*T*G*+T+A*T*T   抗-SP-29
 43   +T+G*C*A*+A+G*G*C*+C+C*G*A*+T+G*T*A   抗-SP-30
 44   +G+T*C*C*+A+G*G*T*+G+G*A*G*+C+T*T*G   抗-SP-31
 45   +T+G*G*C*+C+C*T*T*+C+T*T*G*+G+T*G*C   抗-SP-32
 46   +C+C*T*C*+C+A*G*G*+G+T*G*C*+A+C*T*T   抗-SP-33
 47   +T+G*T*G*+G+C*A*A*+A+G*A*A*+G+T*G*G   抗-SP-34
 48   +C+A*G*G*+A+A*G*A*+G+T*C*G*+A+A*G*G   抗-SP-35
 49   +T+C*T*T*+G+T*T*G*+T+C*A*T*+T+G*C*T   抗-SP-36
 50   +G+C*A*C*+A+C*C*T*+T+C*T*C*+A+A*A*C   抗-SP-37
 51   +T+C*G*C*+C+A*A*T*+G+G*G*G*+G+C*T*G   抗-SP-38
 52   +G+G*C*A*+G+C*T*G*+G+T*G*G*+G+G*T*C   抗-SP-39
 53   +C+T*G*G*+C+A*C*A*+C+G*C*A*+C+A*T*G   抗-SP-40
 54   +G+G*G*G*+T+G*T*T*+G+T*T*C*+T+C*A*T   抗-SP-41
 55   +C+C*A*G*+C+T*C*G*+C+A*C*A*+C+C*T*T   抗-SP-42
 56   +G+C*C*G*+T+G*T*T*+T+G*C*A*+G+T*G*G   抗-SP-43
 57   +T+G*G*T*+T+C*T*G*+G+C*A*G*+G+G*A*T   抗-SP-44
 58   +T+T*T*C*+C+G*C*C*+A+C*C*A*+C+C*T*C   抗-SP-45
 59   +C+T*C*T*+T+C*G*G*+T+T*T*C*+C+T*C*T   抗-SP-46
 60   +G+C*A*C*+C+A*T*C*+A+T*C*A*+A+A*T*T   抗-SP-47
 61   +C+T*C*C*+T+A*C*T*+T+C*C*A*+C+C*T*G   抗-SP-48
 62   +G+A*C*A*+G+G*A*T*+T+A*G*C*+T+C*C*C   抗-SP-49
 63   +A+C*A*G*+A+T*A*C*+C+T*C*A*+G+T*C*A   抗-SP-50
 64   +C+C*T*C*+T+G*C*C*+A+C*A*G*+T+T*T*C   抗-SP-51
 65   +T+T*C*C*+A+C*C*A*+C+C*T*C*+T+G*T*C   抗-SP-52
 66   +T+C*A*T*+C+A*G*G*+C+A*G*G*+G+C*T*T   抗-SP-53
 67   +C+T*T*G*+C+T*G*A*+G+G*G*G*+C+T*G*C   抗-SP-54
 68   +C+A*A*G*+G+C*C*C*+T+C*C*C*+G+G*C*C   抗-SP-55
 69   +A+G*G*C*+A+A*A*G*+G+A*G*A*+A+A*G*A   抗-SP-56
 70   +A+G*A*T*+C+C*A*G*+G+C*C*C*+T+C*A*T   抗-SP-57
表4
  SEQ ID NO：   序列   序列名称
  71   +A+T*G*A*+G+G*G*C*+C+T*G*G*+A+T*C*T   AZ-SP-1
  72   +T+C*T*T*+T+C*T*C*+C+T*T*T*+G+C*C*T   AZ-SP-2
  73   +G+G*C*C*+G+G*G*A*+G+G*G*C*+C+T*T*G   AZ-SP-3
  SEQ ID NO：   序列   序列名称
  74   +G+C*A*G*+C+C*C*C*+T+C*A*G*+C+A*A*G   AZ-SP-4
  75   +A+A*G*C*+C+C*T*G*+C+C*T*G*+A+T*G*A   AZ-SP-5
  76   +G+A*C*A*+G+A*G*G*+T+G*G*T*+G+G*A*A   AZ-SP-6
  77   +G+A*A*A*+C+T*G*T*+G+G*C*A*+G+A*G*G   AZ-SP-7
  78   +T+G*A*C*+T+G*A*G*+G+T*A*T*+C+T*G*T   AZ-SP-8
  79   +G+G*G*A*+G+C*T*A*+A+T*C*C*+T+G*T*C   AZ-SP-9
  80   +C+A*G*G*+T+G*G*A*+A+G*T*A*+G+G*A*G   AZ-SP-10
  81   +A+A*T*T*+T+G*A*T*+G+A*T*G*+G+T*G*C   AZ-SP-11
  82   +A+G*A*G*+G+A*A*A*+C+C*G*A*+A+G*A*G   AZ-SP-12
  83   +G+A*G*G*+T+G*G*T*+G+G*C*G*+G+A*A*A   AZ-SP-13
  84   +A+T*C*C*+C+T*G*C*+C+A*G*A*+A+C*C*A   AZ-SP-14
  85   +C+C*A*C*+T+G*C*A*+A+A*C*A*+C+G*G*C   AZ-SP-15
  86   +A+A*G*G*+T+G*T*G*+C+G*A*G*+C+T*G*G   AZ-SP-16
  87   +A+T*G*A*+G+A*A*C*+A+A*C*A*+C+C*C*C   AZ-SP-17
  88   +C+A*T*G*+T+G*C*G*+T+G*T*G*+C+C*A*G   AZ-SP-18
  89   +G+A*C*C*+C+C*A*C*+C+A*G*C*+T+G*C*C   AZ-SP-19
  90   +C+A*G*C*+C+C*C*C*+A+T*T*G*+G+C*G*A   AZ-SP-20
  91   +G+T*T*T*+G+A*G*A*+A+G*G*T*+G+T*G*C   AZ-SP-21
  92   +A+G*C*A*+A+T*G*A*+C+A*A*C*+A+A*G*A   AZ-SP-22
  93   +C+C*T*T*+C+G*A*C*+T+C*T*T*+C+C*T*G   AZ-SP-23
  94   +C+C*A*C*+T+T*C*T*+T+T*G*C*+C+A*C*A   AZ-SP-24
  95   +A+A*G*T*+G+C*A*C*+C+C*T*G*+G+A*G*G   AZ-SP-25
  96   +G+C*A*C*+C+A*A*G*+A+A*G*G*+G+C*C*A   AZ-SP-26
  97   +C+A*A*G*+C+T*C*C*+A+C*C*T*+G+G*A*C   AZ-SP-27
  98   +T+A*C*A*+T+C*G*G*+G+C*C*T*+T+G*C*A   AZ-SP-28
  99   +A+A*T*A*+C+A*T*C*+C+C*C*C*+C+T*T*G   AZ-SP-29
  100   +C+C*T*G*+G+A*C*T*+C+T*G*A*+G+C*T*G   AZ-SP-30
  101   +A+C*C*G*+A+A*T*T*+C+C*C*C*+C*T*G*C   AZ-SP-31
  102   +G+C*A*T*+G+C*G*G*+G+A*C*T*+G+G*C*T   AZ-SP-32
  103   +C+A*A*G*+A+A*C*G*+T+C*C*T*+G+G*T*C   AZ-SP-33
  104   +A+C*C*C*+T+G*T*A*+T+G*A*G*+A+G*G*G   AZ-SP-34
  105   +A+T*G*A*+G+G*A*C*+A+A*C*A*+A+C*C*T   AZ-SP-35
  106   +T+C*T*G*+A+C*T*G*+A+G*A*A*+G+C*A*G   AZ-SP-36
  107   +A+A*G*C*+T+G*C*G*+G+G*T*G*+A+A*G*A   AZ-SP-37
  108   +A+G*A*T*+C+C*A*T*+G+A*G*A*+A+T*G*A   AZ-SP-38
  109   +G+A*A*G*+C+G*C*C*+T+G*G*A*+G+G*C*A   AZ-SP-39
  SEQ ID NO：   序列   序列名称
  110   +G+G*A*G*+A+C*C*A*+C+C*C*C*+G+T*G*G   AZ-SP-40
  111   +A+G*C*T*+G+C*T*G*+G+C*C*C*+G+G*G*A   AZ-SP-41
  112   +C+T*T*C*+G+A*G*A*+A+G*A*A*+C+T*A*T   AZ-SP-42
  113   +A+A*C*A*+T+G*T*A*+C+A*T*C*+T+T*C*C   AZ-SP-43
  114   +C+T*G*T*+A+C*A*C*+T+G*G*C*+A+G*T*T   AZ-SP-44
  115   +C+G*G*C*+C+A*G*C*+T+G*G*A*+C+C*A*G   AZ-SP-45
  116   +C+A*C*C*+C+C*A*T*+T+G*A*C*+G+G*G*T   AZ-SP-46
  117   +A+C*C*T*+C+T*C*C*+C+A*C*A*+C+C*G*A   AZ-SP-47
  118   +G+C*T*G*+G+C*T*C*+C+A*C*T*+G+C*G*T   AZ-SP-48
  119   +G+C*T*C*+C+C*C*T*+C+A*T*C*+C+C*C*A   AZ-SP-49
  120   +T+G*G*A*+G+C*A*T*+T+G*C*A*+C+C*A*C   AZ-SP-50
  121   +C+C*G*C*+T+T*T*T*+T+C*G*A*+G+A*C*C   AZ-SP-51
  122   +T+G*T*G*+A+C*C*T*+G+G*A*C*+A*A*T*G   AZ-SP-52
  123   +A+C*A*A*+G+T*A*C*+A+T*C*G*+C+C*C*T   AZ-SP-53
  124   +G+G*A*T*+G+A*G*T*+G+G*G*C*+C+G*G*C   AZ-SP-54
  125   +T+G*C*T*+T+C*G*G*+C+A*T*C*+A+A*G*C   AZ-SP-55
  126   +A+G*A*A*+G+G*A*T*+A+T*C*G*+A+C*A*A   AZ-SP-56
  127   +G+G*A*T*+C+T*T*G*+T+G*A*T*+C+T*A*A   AZ-SP-57
表5
 SEQ ID NO：   序列   序列名称
 128   +G*+G*G*T*+T*+T*A*G*+A*+G*A*C*+A*+G*G*C*A*+A*+C   AS-SPARC-20
 129   +G*+G*A*C*+C*+G*C*G*+G*+G*A*A*+T*+G*T*G*G*+A*+G   AS-SPARC-21
 130   +G*+C*T*C*+T*+C*C*G*+G*+G*C*A*+G*+T*C*T*G*+A*+A   AS-SPARC-22
 131   +C*+A*G*G*+C*+G*G*C*+A*+G*G*C*+A*+G*A*G*C*+G*+C   AS-SPARC-23
 132   +A*+C*C*C*+T*+C*A*G*+T*+G*G*C*+A*+G*G*C*A*+G*+G   AS-SPARC-24
 133   +G*+G*+C*+C*+C*T*C*A*T*G*G*T*G*C*+T*+G*+G*+G*+A   AS-SPARC-25
 134   +A*+A*+A*+G*+G*A*G*A*A*A*G*A*A*G*+A*+T*+C*+C*+A   AS-SPARC-26
 135   +A*+A*+G*+G*+C*C*C*T*C*C*C*G*G*C*+C*+A*+G*+G*+C   AS-SPARC-27
 136   +T*+T*+C*+T*+T*G*C*T*G*A*G*G*G*G*+C*+T*+G*+C*+C   AS-SPARC-28
 137   +C*+T*+G*+T*+C*T*C*A*T*C*A*G*G*C*+A*+G*+G*+G*+C   AS-SPARC-29
 138   +A*+C*+A*+G*+T*T*T*C*T*T*C*C*A*C*+C*+A*+C*+C*+T   AS-SPARC-30
 139   +T*+A*+C*+C*+T*C*A*G*T*C*A*C*C*T*+C*+T*+G*+C*+C   AS-SPARC-31
 140   +T*+C*+T*+C*+C*T*A*C*T*T*C*C*A*C*+C*+T*+G*+G*+A   AS-SPARC-33
 141   +C*+T*+C*+T*+G*C*A*C*C*A*T*C*A*T*+C*+A*+A*+A*+T   AS-SPARC-34
 SEQ ID NO：   序列   序列名称
 142   +C*+C*+A*+C*+C*T*C*C*T*C*T*T*C*G*+G*+T*+T*+T*+C   AS-SPARC-35
 143   +T*+G*+G*+C*+A*G*G*G*A*T*T*T*T*C*+C*+G*+C*+C*+A   AS-SPARC-36
 144   +G*+T*+G*+T*+T*T*G*C*A*G*T*G*G*T*+G*+G*+T*+T*+C   AS-SPARC-37
 145   +C*+C*+A*+G*+C*T*C*G*C*A*C*A*C*C*+T*+T*+G*+C*+C   AS-SPARC-38
 146   +A*+T*+G*+G*+G*G*G*T*G*T*T*G*T*T*+C*+T*+C*+A*+T   AS-SPARC-39
 147   +G*+G*+G*+G*+T*C*C*T*G*G*C*A*C*A*+C*+G*+C*+A*+C   AS-SPARC-40
 148   +T*+G*+G*+G*+G*G*C*T*G*G*G*C*A*G*+C*+T*+G*+G*+T   AS-SPARC-41
 149   +A*+C*+C*+T*+T*C*T*C*A*A*A*C*T*C*+G*+C*+C*+A*+A   AS-SPARC-42
 150   +C*+T*+T*+G*+T*T*G*T*C*A*T*T*G*C*+T*+G*+C*+A*+C   AS-SPARC-43
 151   +G*+G*+C*+A*+G*G*A*A*G*A*G*T*C*G*+A*+A*+G*+G*+T   AS-SPARC-44
 152   +C*+A*+C*+T*+T*T*G*T*G*G*C*A*A*A*+G*+A*+A*+G*+T   AS-SPARC-45
 153   +C*+T*+T*+G*+G*T*G*C*C*C*T*C*C*A*+G*+G*+G*+T*+G   AS-SPARC-46
 154   +G*+G*+T*+G*+G*A*G*C*T*T*G*T*G*G*+C*+C*+C*+T*+T   AS-SPARC-47
 155   +C*+A*+A*+G*+G*C*C*C*G*A*T*G*T*A*+G*+T*+C*+C*+A   AS-SPARC-48
 156   +G*+C*+A*+A*+G*G*G*G*G*G*A*T*G*T*+A*+T*+T*+T*+G   AS-SPARC-49
 157   +C*+G*+G*+T*+C*A*G*C*T*C*A*G*A*G*+T*+C*+C*+A*+G   AS-SPARC-50
 158   +C*+G*+C*+A*+T*G*C*G*C*A*G*G*G*G*+G*+A*+A*+T*+T   AS-SPARC-51
 159   +G*+A*+C*+G*+T*T*C*T*T*G*A*G*C*C*+A*+G*+T*+C*+C   AS-SPARC-52
 160   +T*+C*+T*+C*+A*T*A*C*A*G*G*G*T*G*+A*+C*+C*+A*+G   AS-SPARC-53
 161   +A*+G*+G*+T*+T*G*T*T*G*T*C*C*T*C*+A*+T*+C*+C*+C   AS-SPARC-54
 162   +C*+T*+T*+C*+T*G*C*T*T*C*T*C*A*G*+T*+C*+A*+G*+A   AS-SPARC-55
 163   +G*+G*+A*+T*+C*T*T*C*T*T*C*A*C*C*+C*+G*+C*+A*+G   AS-SPARC-56
 164   +A*+G*+G*+C*+G*C*T*T*C*T*C*A*T*T*+C*+T*+C*+A*+T   AS-SPARC-57
 165   +G*+G*+G*+G*+T*G*G*T*C*T*C*C*T*G*+C*+C*+T*+C*+C   AS-SPARC-58
 166   +C*+C*+C*+G*+G*G*C*C*A*G*C*A*G*C*+T*+C*+C*+A*+C   AS-SPARC-59
 167   +T*+T*+A*+T*+A*G*T*T*C*T*T*C*T*C*+G*+A*+A*+G*+T   AS-SPARC-60
 168   +T*+A*+C*+A*+G*G*G*A*A*G*A*T*G*T*+A*+C*+A*+T*+G   AS-SPARC-61
 169   +G*+C*+T*+G*+G*C*C*G*A*A*C*T*G*C*+C*+A*+G*+T*+G   AS-SPARC-62
 170   +T*+C*+A*+A*+T*G*G*G*G*T*G*C*T*G*+G*+T*+C*+C*+A   AS-SPARC-63
 171   +G*+G*+T*+G*+T*G*G*G*A*G*A*G*G*T*+A*+C*+C*+C*+G   AS-SPARC-64
 172   +C*+A*+C*+G*+C*A*G*T*G*G*A*G*C*C*+A*+G*+C*+T*+C   AS-SPARC-65
 173   +T*+C*+C*+A*+T*G*G*G*G*A*T*G*A*G*+G*+G*+G*+A*+G   AS-SPARC-66
 174   +A*+A*+A*+G*+C*G*G*G*T*G*G*T*G*C*+A*+A*+T*+G*+C   AS-SPARC-67
 175   +C*+C*+A*+G*+G*T*C*A*C*A*G*G*T*C*+T*+C*+G*+A*+A   AS-SPARC-68
 176   +G*+C*+G*+A*+T*G*T*A*C*T*T*G*T*C*+A*+T*+T*+G*+T   AS-SPARC-69
 177   +G*+C*+C*+G*+G*C*C*C*A*C*T*C*A*T*+C*+C*+A*+G*+G   AS-SPARC-70
Figure BDA0000139239360000401
用从0.1nM至1000nM的浓度不断增加的siRNA和反义寡核苷酸转染SPARC-GFP报告子细胞，相应地测定GFP信号发光。如图3中所显示的，来自Ambion(si13347、si13346、si13345(SEQ ID NO：201-203))的siRNA具有高水平的抗BIO1的敲减(knock-down)活性。如图4中所显示的，LNA抗-SPARC-2(SEQ ID NO：3)和LNA抗-SPARC-3(SEQ ID NO：4)也显示抗BIO1的敲低活性，尽管LNA抗-SPARC-1(SEQ ID NO：2)是无活性的。反义寡核苷酸PO-SPARC-1、PO-SPARC-1-1、(SEQ ID NO：7-8)来源于si13347、si13346和si13345(SEQ ID NO：201-203)，PO-SPARC-1-1(SEQ ID NO：8)和PO-SPARC-1(SEQ ID NO：7)显示与si13347、si13346和si13345(SEQID NO：201-203)相似的活性，示例性结果提供于图5A和5B中。这些结果显示与BIO1 SPARC互补的核苷酸，包括siRNA和反义寡核苷酸，能够体外抑制BIO1。
实施例3
本实施例显示反义寡核苷酸的细胞毒性活性的测量。
如实施例2中所述在第24、48和72小时以高至100nM的浓度进行核苷酸例如PO-SPARC1(SEQ ID NO：7)、PO-SPARC-1-1(SEQID NO：8)、LNA抗-SPARC-2(SEQ ID NO：3)、抗-SP-53(SEQ IDNO：66)、siRNA-SPARC-2(SEQ ID 202)以及阴性对照(DharmaFect1TM转染剂(Dharmacon，Lafayette，CO))的BIO1-GFP测定。此外，在第48和72小时通过620nm处的光谱学测定细胞毒性。在实施例2的GFP测定中，抗-SP-53(SEQ ID NO：66)与siRNA例如siRNA-SPARC-2(图6A-6C)相比较显示最低敲除活性。然而，抗-SP-53显示显著的细胞毒性(图7A-7B)。LNA PO SPARC1、LNA-PO-SPARC-1-1、LNA抗-SPARC-2显示敲低(图6A-C)和细胞毒性(图7A-B)，然而siRNASPARC 2具有与阴性对照相似的细胞毒性活性。
类似地在第48小时测定AS-SPARC-12(SEQ ID NO：11)、AS-SPARC-13(SEQ ID NO：12)、AS-SPARC-32(SEQ ID NO：13)、siRNA-SPARC-2(SEQ ID NO：202)和阴性对照(DharmaFect1TM转染剂(Dharmacon，Lafayette，CO))的敲低活性和细胞毒性。AS-SPARC-12、AS-SPARC-13、AS-SPARC-32各自显示强敲低活性和细胞毒性活性(图8A-8B)。相反地，siRNA-SPARC-2显示敲低活性而无细胞毒性活性。
本文引用的所有参考文献，包括公开物和专利通过引用方式并入本文，达到如同每篇参考文献都单独且特别被指明通过引用方式并入并以其全文显示于本文的程度。
在描述本发明的上下文中(尤其是以下权利要求的上下文中)术语“一个”和“一种”和“该”以及相似指代的使用应该被解释为涵盖了单数和复数，除非本文中另有指明或上下文明显矛盾。除非另有指明，否则术语“含有”、“具有”、“包括”和“包含”应该被解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)。除非本文另有指明，否则本文中提及的数值范围仅仅是作为单独提及落在该范围内的每个单独数值的简便方式，并且每个单独数值并入本说明书中，如同在本文中单独提及一样。除非本文另有指明或者上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以通过任意合适的顺序进行。除非另有要求，否则本文提供的任意和所有实施例或示例性语言(例如“例如“)仅仅意在更好地诠释本发明，而不对本发明的范围进行限制作用。本说明书中的任何语言不应被解释为指明未要求保护的要素对于本发明的实施是必不可少的。
在本文中描述了本发明的优选实施方式，包括本发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。本领域普通技术人员在阅读了上述说明书之后，那些优选实施方式的变体会变得明显。本发明人预期技术人员视情况而应用此类变体，本发明人想到本发明可以按照除了本文特异性描述以外的方式来实施。因此，本发明包括适用法律所允许的随附的权利要求中提及的主题的所有修饰和等同物。此外，除非本文另有指明或上下文明显矛盾，否则本发明中包括上述要素的以其所有可能变体进行的任意组合。

Claims (35)

1.一种SPARC反义组合物，其包含含有SEQ ID NO：2-4、7-8和11-13的一种或多种的DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸中的一种或多种。
2.一种SPARC反义组合物，其包含含有与SEQ ID NO：2-4、7-8和11-13的任一个的序列90％相同的核酸序列的DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸中的一种或多种，其中所述SPARC反义组合物至细胞的施用降低所述细胞中的SPARC蛋白的水平至少30％。
3.权利要求1的SPARC反义组合物，其中所述DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸中的一种或多种包含SEQ ID NO：11、12和13的任一种或多种。
4.权利要求1的SPARC反义组合物，其中所述DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸包含SEQ ID NO：11的核酸序列。
5.权利要求1的SPARC反义组合物，其中所述DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸包含SEQ ID NO：12的核酸序列。
6.权利要求1的SPARC反义组合物，其中所述DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸包含SEQ ID NO：13的核酸序列。
7.权利要求1的SPARC反义组合物，其中所述DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸中的一种或多种包含SEQ ID NO：2、3和4的任何一种或多种的核酸序列。
8.权利要求1的SPARC反义组合物，其中所述DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸包含SEQ ID NO：2的核酸序列。
9.权利要求1的SPARC反义组合物，其中所述DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸包含SEQ ID NO：3的核酸序列。
10.权利要求1的SPARC反义组合物，其中所述DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸包含SEQ ID NO：4的核酸序列。
11.权利要求1的SPARC反义组合物，其中所述DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸中的一种或多种包含SEQ ID NO：7和8的任何一种或多种的核酸序列。
12.权利要求1的SPARC反义组合物，其中所述DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸包含SEQ ID NO：7的核酸序列。
13.权利要求1的SPARC反义组合物，其中所述DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸包含SEQ ID NO：8的核酸序列。
14.权利要求1的SPARC反义组合物，其中所述DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸包含SEQ ID NO：7和8两者的核酸序列。
15.权利要求1-14的任一项的SPARC反义组合物，其中所述寡核苷酸包含gapmer、mixmer、2’-MOE、硫代磷酸酯boranophosphate、2’-O-甲基、2’-氟、末端倒转-dT碱基、PEG、2’tBDMS、2’-TOM、t’-ACE或其组合。
16.权利要求1-14的任一项的SPARC反义组合物，其中所述DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸中的一种或多种的至少一种通过添加胆固醇、双胆固醇、PEG、PEG化碳纳米管、多聚-L-赖氨酸、环糊精、聚乙烯亚胺聚合物、肽部分或细胞渗透性肽的任一种而被修饰。
17.权利要求1-14的任一项的SPARC反义组合物，其中所述DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸中的一种或多种的每一种通过添加胆固醇、双胆固醇、PEG、PEG化碳内米管、多聚-L-赖氨酸、环糊精、聚乙烯亚胺聚合物、肽部分或细胞渗透性肽的任一种而被修饰。
18.权利要求1-17的任一项的SPARC反义组合物，其还包含药学上可接受的载体。
19.治疗或预防动物的增殖性疾病的方法，包括施用治疗有效量的权利要求1-18中任一项的SPARC反义组合物。
20.权利要求19的方法，还包括施用选自化学治疗剂、抗血管生成剂和激酶抑制剂的一种或多种治疗剂。
21.权利要求20的方法，其中所述化学治疗剂选自紫杉醇、多西他赛、舒尼替尼、阿瓦斯丁、5FU、阿霉素、安莎霉素类抗生素、天冬酰胺酶、博来霉素、白消安、顺铂、卡铂、卡莫司汀、卡培他滨、苯丁酸氮芥、阿糖胞苷、环磷酰胺、喜树碱、达卡巴嗪、更生霉素、道诺霉素、右雷佐生、多西他赛、多柔比星、依托泊苷、埃博霉素、氟尿苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、洛莫司汀、氮芥、巯嘌呤、美法仑、甲氨蝶呤、雷帕霉素及其衍生物、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、亚硝基脲、紫杉醇、帕米膦酸钠、喷司他丁、普卡霉素、丙卡巴肼、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、硫鸟嘌呤、塞替派、紫杉烷类、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、考布他汀、discodermolide和反铂。
22.权利要求19的方法，其中将所述SPARC反义组合物静脉内、皮下、肌肉内、经鼻、腹膜内、经阴道、经肛门、口服、眼内或鞘内直接施用至动物的患病组织。
23.权利要求19的方法，其中将所述SPARC反义组合物施用给动物以治疗或预防癌症、再狭窄或其他增殖性疾病、纤维化、骨质疏松症或扩大的伤口愈合。
24.权利要求23的方法，其中
(a)所述癌症选自原位癌、非典型增生、癌、肉瘤、癌肉瘤、肺癌、胰腺癌、皮肤癌、黑素瘤、血液肿瘤、乳腺癌、脑癌、结肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头颈癌、多发性骨髓瘤、肝癌、白血病、淋巴瘤、口癌、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、和甲状腺癌，
(b)所述再狭窄选自冠状动脉再狭窄、大脑动脉再狭窄、颈动脉再狭窄、肾动脉再狭窄、股动脉再狭窄、周围动脉再狭窄或其组合，
(c)其他增殖性疾病选自超常增生、子宫内膜异位症、肥大性疤痕和疤痕疙瘩、增生性糖尿病视网膜病变、肾小球肾炎、proliferatve、肺动脉高压、类风湿关节炎、动静脉畸形、粥样硬化斑块、冠状动脉疾病、延迟的伤口愈合、血友病性关节、不连接骨折、奥-韦综合征、银屑病、化脓性肉芽肿、硬皮病、tracoma、月经过多、血管粘附蛋白和乳头状瘤；和
(d)所述纤维性疾病选自肝纤维化、肺纤维化和腹膜后纤维化。
25.权利要求19的方法，其中所述动物正在经历选自手术、化学疗法、放射疗法、热疗法、免疫疗法、激素疗法和激光疗法的一种或多种癌症疗法。
26.治疗动物的增殖性疾病的方法，包括：
(a)从动物的损伤组织分离RNA，
(b)从对应的正常组织分离RNA，
(c)测量所述损伤组织的SPARC RNA的水平，
(d)测量所述对应的正常组织的SPARC RNA的水平，
(e)将所述损伤组织的SPARC RNA的水平与所述对应的正常组织的SPARC RNA的水平相比较，和
(f)当步骤(e)中的比较显示相对于对应的正常组织的SPARC RNA的水平在损伤组织中存在更高水平的SPARC RNA时，给动物施用治疗有效量的权利要求1-18中任一项的SPARC反义组合物。
27.权利要求24的治疗增殖性疾病的方法，其中利用原位杂交、印迹杂交、PCR、TMA、侵入检测或微阵列来测定SPARC RNA的水平。
28.治疗动物的增殖性疾病的方法，包括：
(a)从动物的损伤组织分离蛋白质，
(b)从对应的正常组织分离蛋白质，
(c)测量所述损伤组织的SPARC蛋白的水平，
(d)测量所述对应的正常组织的SPARC蛋白的水平，
(e)将所述损伤组织的SPARC蛋白的水平与所述对应的正常组织的SPARC RNA的水平相比较，和
(f)当步骤(e)中的比较显示相对于对应的正常组织的SPARC蛋白的水平在损伤组织中存在更高水平的SPARC蛋白时，给动物施用治疗有效量的权利要求1-18中任一项的SPARC反义组合物。
29.权利要求24的治疗增殖性疾病的方法，其中SPARC蛋白的水平通过免疫组织学、免疫印迹、抗体微阵列或质谱法来测定。
30.权利要求19-29中任一项的方法，其中将所述SPARC反义组合物静脉内、皮下、肌肉内、经鼻、腹膜内、经阴道、经肛门、口服、眼内或鞘内直接施用至生物体的患病组织。
31.权利要求19-29中任一项的方法，其中给所述动物施用所述SPARC反义组合物以治疗或预防癌症、再狭窄或其他增殖性疾病、纤维化、骨质疏松症或扩大的伤口愈合。
32.权利要求31的方法，其中
(a)所述癌症选自原位癌、非典型增生、癌、肉瘤、癌肉瘤、肺癌、胰腺癌、皮肤癌、黑素瘤、血液肿瘤、乳腺癌、脑癌、结肠癌、膀胱癌、宫颈癌、子宫内膜癌、食管癌、胃癌、头颈癌、多发性骨髓瘤、肝癌、白血病、淋巴瘤、口癌、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、和甲状腺癌，
(b)所述再狭窄选自冠状动脉再狭窄、大脑动脉再狭窄、颈动脉再狭窄、肾动脉再狭窄、股动脉再狭窄、周围动脉再狭窄或其组合，
(c)其他增殖性疾病选自超常增生、子宫内膜异位症、肥大性疤痕和疤痕疙瘩、增生性糖尿病视网膜病变、肾小球肾炎、proliferatve、肺动脉高压、类风湿关节炎、动静脉畸形、粥样硬化斑块、冠状动脉疾病、延迟的伤口愈合、血友病性关节、不连接骨折、奥-韦综合征、银屑病、化脓性肉芽肿、硬皮病、tracoma、月经过多、血管粘附蛋白和乳头状瘤，和
(d)所述纤维性疾病选自肝纤维化、肺纤维化和腹膜后纤维化。
33.权利要求19-29中任一项的方法，其中所述动物也经历选自手术、化学疗法、放射疗法、热疗法、免疫疗法、激素疗法和激光疗法的一种或多种癌症疗法。
34.权利要求19-33中任一项的方法，其中所述动物是人患者。
35.一种SPARC反义组合物，其包含具有在SEQ ID NO：1的核苷酸212、311、312、521、825、841、969、985、1001、1017的一个或多个上与SEQ ID NO：1互补的核酸序列的DNA、RNA、LNA或PNA寡核苷酸中的一种或多种，其中所述寡核苷酸在长度上为12至19个核苷酸。
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