CN109477110A - 抑制mex3b基因的表达的核酸、mex3b基因表达抑制试剂、抑制mex3b基因表达的方法及由mex3b基因表达所引起的疾病的预防或治疗剂 - Google Patents

抑制mex3b基因的表达的核酸、mex3b基因表达抑制试剂、抑制mex3b基因表达的方法及由mex3b基因表达所引起的疾病的预防或治疗剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供作为副作用的细胞毒性低且能够抑制MEX3B基因的表达的核酸、包含上述核酸的MEX3B基因表达抑制试剂、抑制MEX3B基因表达的方法及由MEX3B基因表达所引起的疾病的预防或治疗剂。抑制MEX3B基因的表达的核酸，所述核酸为：反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸具有与MEX3B基因的外显子中的非翻译区中的包含至少10个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列；或者双链RNA或编码上述双链RNA的DNA，所述双链RNA包含上述非翻译区中的至少20个连续核苷酸。

Description

抑制MEX3B基因的表达的核酸、MEX3B基因表达抑制试剂、抑制 MEX3B基因表达的方法及由MEX3B基因表达所引起的疾病的预 防或治疗剂
技术领域
本发明涉及抑制MEX3B基因的表达的核酸、包含上述核酸的MEX3B基因表达抑制试剂、抑制MEX3B基因表达的方法及由MEX3B基因表达所引起的疾病的预防或治疗剂。
背景技术
MEX3B基因最初被鉴定为由TGF-β活化的基因，根据之后的解析已获知，MEX3B蛋白质是与各种mRNA结合并对这些mRNA的功能(即翻译为蛋白质)进行控制的分子(例如，非专利文献1)。
另外，已知MEX3B蛋白质为诱导细胞凋亡的蛋白质(例如，专利文献1)。
已知细胞凋亡除参与正常的生理学过程以外，还参与神经变性病等严重疾病的发病。例如，认为细胞凋亡的异常亢进是神经变性病(例如，阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿舞蹈病等)的病因(例如，非专利文献2)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4429269号公报
非专利文献
非专利文献1：Nucleic Acids Res.2007，35(4)：1289-300。
非专利文献2：Wolozin，B.等人，(1996)Science，274，1710-1713
发明内容
发明要解决的课题
在上述背景下，要求开发出能够在抑制副作用的同时抑制MEX3B基因的表达的核酸医药品。
本发明是鉴于上述情况而作出的，目的在于提供作为副作用的细胞毒性低且能够抑制MEX3B基因的表达的核酸、包含上述核酸的MEX3B基因表达抑制试剂、抑制MEX3B基因表达的方法及由MEX3B基因表达所引起的疾病的预防或治疗剂。
用于解决课题的手段
本申请的发明人发现，使用具有与MEX3B基因的外显子中的编码氨基酸的区域(CDS)中包含的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸来抑制MEX3B基因的mRNA表达时，容易出现细胞毒性。
与此相对，使用具有与外显子中的不编码氨基酸的非翻译区(UTR)中包含的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸时，惊奇地发现，作为副作用的细胞毒性低，并且能够抑制MEX3B基因的mRNA表达。
推测作为副作用的细胞毒性低是基于以下原因：与CDS相比，UTR与MEX3B同源物的同源性更低，不易产生脱靶效应。
基于上述发现完成了本发明。
具体而言，本发明如下所述。
本发明的第1方式为抑制MEX3B基因的表达的核酸，所述核酸为：
反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸具有与MEX3B基因的外显子中的非翻译区中的包含至少10个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列；或者
双链RNA或编码上述双链RNA的DNA，所述双链RNA包含上述非翻译区中的至少20个连续核苷酸。
本发明的第2方式为MEX3B基因表达抑制试剂，其包含第1方式涉及的核酸。
本发明的第3方式为抑制MEX3B基因表达的方法，所述方法包括使第2方式涉及的试剂与对象(不包括人类个体)接触的步骤。
本发明的第4方式为由MEX3B基因表达所引起的疾病的预防或治疗剂，其包含第2方式涉及的试剂。
发明的效果
可提供作为副作用的细胞毒性低且能够抑制MEX3B基因的表达的核酸、包含上述核酸的MEX3B基因表达抑制试剂、抑制MEX3B基因表达的方法及由MEX3B基因表达所引起的疾病的预防或治疗剂。
附图说明
[图1](a)为示出使用了不抑制MEX3B的作为阴性对照的Gapmer型核酸(TakaraBio公司制)而未遭受细胞毒性的细胞的显微镜照片的图，(b)为示出因比较例的Gapmer型核酸而遭受到细胞毒性的细胞的显微镜照片的图。
[图2]为示出通过转染各Gapmer型核酸而抑制MEX3B mRNA的表达水平的图。
[图3]为示出因以CDS为靶标的Gapmer型核酸而遭受到细胞毒性的细胞的显微镜照片、和未因以UTR为靶标的Gapmer型核酸而遭受细胞毒性的细胞的显微镜照片的图。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式详细地进行说明，但本发明并不受以下实施方式的任何限定，可以在本发明目的的范围内适当加以变更而实施。
(MEX3B基因)
MEX3B基因包含外显子1、内含子及外显子2，该结构在人、小鼠、其他哺乳动物中高度保守。
作为外显子中的不编码氨基酸的非翻译区(UTR)，在较起始密码子更靠上游处，存在有5’UTR，在较终止密码子更靠下游处，存在有3’UTR。
编码人MEX3B的mRNA的人MEX3B基因具有由后述的序列号1表示的序列。
序列号1中，第437～2146位的碱基序列为CDS，第1～436位的碱基序列为5’UTR，第2147～3532位的碱基序列为3’UTR。
编码小鼠MEX3B的mRNA的小鼠MEX3B基因具有由后述的序列号2表示的序列。
序列号2中，第319～2049位的碱基序列为CDS，第1～318位的碱基序列为5’UTR，第2050～3416位的碱基序列为3’UTR。
后述的序列号3表示人MEX3B基因的内含子区的836个碱基。
序列号10表示编码剪接前的人MEX3B的前体mRNA的碱基序列。由序列号10表示的编码人MEX3B的前体mRNA的序列中的第437～692位及第1529～2982位的碱基序列为CDS，第1～436位的碱基序列为5’UTR，第2983～4368位的碱基序列为3’UTR，第693～1528位的区域相当于由序列号3表示的人MEX3B基因的内含子区。
另外，编码MEX3B蛋白质(例如，具有由后述的序列号4或5表示的氨基酸序列的蛋白质)的基因均属于MEX3B基因。
(MEX3B基因的获取)
MEX3B基因的获取方法没有特别限定。可基于本说明书的序列表的序列号1、2、4、5及10中记载的碱基序列及氨基酸序列的信息来制备合适的探针、引物，并使用它们从人cDNA文库(按照常规方法而从表达MEX3B基因的合适细胞制备)中筛选期望的克隆，由此分离MEX3B基因。
<抑制MEX3B基因的表达的核酸>
第1方式涉及的抑制MEX3B基因的表达的核酸(以下，也简称为“第1方式涉及的核酸”。)为：
反义寡核苷酸，其具有与MEX3B基因的外显子中的非翻译区(UTR)中的包含至少10个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列；或者
双链RNA或编码上述双链RNA的DNA，所述双链RNA包含上述UTR中的至少20个连续核苷酸。
(反义寡核苷酸)
作为第1方式涉及的核酸的1个实施方式，为下述反义寡核苷酸，其具有与MEX3B基因的外显子中的UTR中的包含至少10个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列。
例如，优选的是，MEX3B基因的外显子中的UTR所包含的寡核苷酸和与其互补的上述反义寡核苷酸在导入细胞后形成杂交体(hybrid)，由此产生杂交双链，并利用对该杂交双链具有特异性的核酸酶(例如，核糖核酸酶H)将包含核苷酸链的MEX3B的mRNA降解。
作为上述反义寡核苷酸，可以为DNA，也可以为RNA，从与上述外显子中的UTR所包含的寡核苷酸形成杂交体的观点考虑，优选DNA。
作为具有与上述反义寡核苷酸互补的序列的包含至少10个连续核苷酸的寡核苷酸所存在于的UTR，5’UTR及3’UTR均可，从细胞毒性低的观点考虑，优选3’UTR。
作为上述反义寡核苷酸，优选为具有与MEX3B基因的碱基序列(外显子中的UTR)中的包含至少11个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，更优选为具有与包含至少12个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，进一步优选为具有与包含至少13个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，尤其优选为具有与包含至少14个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸。
另外，作为上述反义寡核苷酸的碱基长度的上限值，优选为具有与MEX3B基因的碱基序列(外显子中的UTR)中的连续核苷酸为40个以下的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，更优选为具有与连续核苷酸为30个以下的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，进一步优选为具有与连续核苷酸为25个以下的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，尤其优选为具有与连续核苷酸为20个以下的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，最优选为具有与连续核苷酸为17个以下的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸。
作为上述反义寡核苷酸，例如，可举出具有与UTR中的包含12～20个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，优选为具有与序列号10(其表示人MEX3B的前体mRNA)的第4119～4293位的序列中的包含12～20个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸、或者具有与序列号2(其表示小鼠MEX3B基因)的UTR中的第3135～3149位的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，更优选为具有与序列号10(其表示人MEX3B的前体mRNA)的第4119～4134位的寡核苷酸、第4129～4144位的寡核苷酸、第4134～4149位的寡核苷酸、第4139～4154位的寡核苷酸、第4163～4178位的寡核苷酸、第4248～4263位的寡核苷酸、第4258～4273位的寡核苷酸、第4263～4278位的寡核苷酸、第4268～4283位的寡核苷酸或第4278～4293位的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸、或者具有与序列号2(其表示小鼠MEX3B基因)的UTR中的第3135～3149位的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸，进一步优选为具有与序列号10(其表示人MEX3B的前体mRNA)的第4134～4149位的寡核苷酸、第4139～4154位的寡核苷酸或第4278～4293位的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸。
作为上述反义寡核苷酸，优选为包含至少1个下述核苷酸的反义寡核苷酸，所述核苷酸具有选自由硫代磷酸酯结构、桥连结构及烷氧基结构组成的组中的至少1种结构。
例如，通过使磷酸二酯键部(其将核苷酸彼此连接)具有硫代磷酸酯结构，能够获得核酸酶抗性，另外，由于疏水性提高，所以还能够提高向细胞内或核内的摄入。
另外，通过使核苷酸的糖部具有2’，4’-BNA(2’，4’-桥连核酸，2’，4’-BridgedNucleic Acid；别称LNA(锁核酸，Locked Nucleic Acid))、ENA(2’-O，4’-C-亚乙基桥连核酸(2’-O，4’-C-Ethylene-bridged Nucleic Acid))等桥连结构、2’-O-甲基化、2’-O-甲氧基乙基化(2’-MOE)等烷氧基结构，能够获得核酸酶抗性并提高mRNA的结合能力。
上述反义寡核苷酸中，优选至少1个磷酸二酯键部(其将核苷酸彼此连接)具有硫代磷酸酯结构，更优选上述反义寡核苷酸中的磷酸二酯键中的50％以上具有硫代磷酸酯结构，进一步优选上述反义寡核苷酸中的磷酸二酯键中的70％以上具有硫代磷酸酯结构，尤其优选上述反义寡核苷酸中的磷酸二酯键中的90％以上具有硫代磷酸酯结构，最优选上述反义寡核苷酸中的全部磷酸二酯键均具有硫代磷酸酯结构。
上述反义寡核苷酸中，优选至少任意一个末端的核苷酸具有桥连结构或烷氧基结构，更优选上述反义寡核苷酸的两个末端的核苷酸具有桥连结构或烷氧基结构(所谓的Gapmer型反义寡核苷酸)，进一步优选在上述反义寡核苷酸的两个末端、独立地自末端起4个以下的碱基具有桥连结构或烷氧基结构，尤其优选自末端起2个或3个碱基具有桥连结构或烷氧基结构。
(siRNA)
作为第1方式涉及的核酸的另一实施方式，为双链RNA(siRNA(小干扰RNA，smallinterfering RNA))或编码上述双链RNA的DNA，所述双链RNA包含从MEX3B基因的碱基序列转录而成的RNA的碱基序列中的UTR的至少20个连续核苷酸。
作为上述双链RNA中包含的至少20个连续核苷酸所存在于的UTR，5’UTR及3’UTR均可，优选3’UTR。
优选为下述双链RNA或编码上述双链RNA的DNA，所述双链RNA包含从MEX3B基因的碱基序列转录而成的RNA的碱基序列中的UTR的至少21个连续核苷酸。
优选为下述双链RNA或编码上述双链RNA的DNA，所述双链RNA包含从MEX3B基因的碱基序列转录而成的RNA的碱基序列中的UTR的30个以下连续核苷酸；更优选为下述双链RNA或编码上述双链RNA的DNA，所述双链RNA包含从MEX3B基因的碱基序列转录而成的RNA的碱基序列中的UTR的25个以下连续核苷酸。
作为上述双链RNA或编码上述双链RNA的DNA，例如可举出包含序列号10(其表示人MEX3B的前体mRNA)的UTR中的第4119～4293位的至少21个连续核苷酸的双链RNA或编码上述双链RNA的DNA、包含序列号2(其表示小鼠MEX3B基因)的UTR中的第3135～3149位的寡核苷酸的双链RNA或编码上述双链RNA的DNA等，优选为包含序列号10(其表示人MEX3B的前体mRNA)的UTR中的第4119～4134位的寡核苷酸、第4129～4144位的寡核苷酸、第4134～4149位的寡核苷酸、第4139～4154位的寡核苷酸、第4163～4178位的寡核苷酸、第4248～4263位的寡核苷酸、第4258～4273位的寡核苷酸、第4263～4278位的寡核苷酸、第4268～4283位的寡核苷酸或第4278～4293位的寡核苷酸的双链RNA或编码上述双链RNA的DNA、或者包含序列号2(其表示小鼠MEX3B基因)的UTR中的第3135～3149位的寡核苷酸的双链RNA或编码上述双链RNA的DNA。
所谓RNAi(RNA干扰)，是指下述现象：当向细胞中导入将mRNA(其编码某靶基因的一部分)的一部分双链化而得到的RNA(双链RNA(double stranded RNA)：dsRNA)时，靶基因的表达被抑制。
作为编码双链RNA的DNA，例如可举出具有MEX3B的部分序列的反向重复序列的DNA。
通过将具有这样的反向重复序列的DNA导入哺乳动物的细胞中，能够使得靶基因(MEX3B)的反向重复序列在细胞内表达，由此能够利用RNAi效应抑制靶基因(MEX3B)的表达。
反向重复序列是指靶基因及其反向序列隔着适当的序列而并排的序列。具体而言，在靶基因具有以下所示的由n个碱基序列组成的双链的情况下，
5’-X1X2……Xn-1Xn-3’
3’-Y1Y2……Yn-1Yn-5’
其反向序列具有以下的序列。
5’-YnYn-1……Y2Y1-3’
3’-XnXn-1……X2X1-5’
(此处，在X表示的碱基和Y表示的碱基中，下标数字相同的碱基为彼此互补的碱基)
反向重复序列为上述两种序列隔着适当的序列而形成的序列。作为反向重复序列，认为存在以下两种情况：靶基因的序列位于反向序列的上游的情况；和反向序列位于靶基因的序列的上游的情况。本发明中使用的反向重复序列可以为上述中的任一者，优选反向序列存在于靶基因的序列的上游。
存在于靶基因的序列与其反向序列之间的序列是在向RNA转录时形成发夹环的区域(shRNA：短发夹RNA，small hairpin RNA)。就该区域的长度而言，只要能够形成发夹环即可，没有特别限定，优选为0～300bp左右，更优选为0～100bp左右。该序列中可以存在限制性内切酶位点。
本发明中，通过将靶基因的反向重复序列嵌入可在哺乳动物中起作用的启动子序列的下游，从而能够使靶基因的反向重复序列在哺乳动物的细胞内表达。本发明中使用的启动子序列只要能够在哺乳动物中起作用即可，没有特别限定。
第1方式涉及的核酸可以使用DNA合成仪及已知的有机合成技术、利用常规方法制造。
在体内(in vivo)或体外(in vitro)，向细胞内的摄入可以通过使第1方式涉及的核酸与细胞接触(例如，向培养任意细胞的培养基中添加第1方式涉及的核酸)而实现，通过使第1方式涉及的核酸具有选自由硫代磷酸酯结构、桥连结构及烷氧基结构组成的组中的至少1种结构，能够进一步提高向细胞内的摄入。
通过使第1方式涉及的核酸具有选自由硫代磷酸酯结构、桥连结构及烷氧基结构组成的组中的至少1种结构、并与后述的脂质体转染(lipofection)用载体组合使用，能够进一步提高向细胞内的摄入。
作为第1方式涉及的核酸向细胞的导入方法，可以为插入合适的载体(vector)中、进而导入至合适的宿主细胞中的方法。
上述合适的载体的种类没有特别限定，例如可以为自主复制的载体(例如，质粒等)，优选为在被导入宿主细胞时整合至宿主细胞的基因组中、与经整合的染色体一起被复制的载体。
作为上述合适的载体，可以利用来自大肠杆菌的质粒(例如，pBR322、pUC118以及其他)、来自枯草杆菌的质粒(例如，pUB110、pSH19以及其他)、以及噬菌体、逆转录病毒、牛痘病毒等动物病毒等。进行重组时，也可以使用合适的合成DNA接头来添加翻译起始密码子、翻译终止密码子。
另外，根据需要，第1方式涉及的核酸可以与合适的终止子功能性地结合，例如人生长激素终止子、或者对于真菌宿主而言为TPI1终止子或ADH3终止子。重组载体可以还具有下述这样的要素：多聚腺苷酸化信号(例如来自SV40或5型腺病毒E1b区的多聚腺苷酸化信号)；转录增强子序列(例如SV40增强子)；及翻译增强子序列(例如编码腺病毒VARNA的序列)。
重组载体可以还具备能够使该载体在宿主细胞内进行复制的DNA序列，作为其一例，可举出SV40复制起点(宿主细胞为哺乳动物细胞时)。
重组载体可以还含有筛选标记。作为筛选标记，例如可举出：二氢叶酸还原酶(DHFR)或粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)TPI基因等这样的其补体在宿主细胞内欠缺的基因；或者例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素或潮霉素这样的药剂的抗性基因。
第1方式涉及的核酸或包含其的载体所导入的宿主细胞可举出高等真核细胞、细菌、酵母、真菌等，优选哺乳动物细胞。
作为哺乳动物细胞的例子，可举出HEK293细胞、HeLa细胞、COS细胞(例如，COS-7细胞等)、BHK细胞、CHL细胞或CHO细胞、BALB/c小鼠细胞(例如，BALB/c小鼠胚胎成纤维细胞)等。对哺乳动物细胞进行转化、使导入至该细胞中的基因表达的方法也是已知的，例如可以使用脂质体转染法、电穿孔法、磷酸钙法等。
就由第1方式涉及的核酸带来的MEX3B基因表达的抑制而言，只要以MEX3B基因的碱基序列信息为基础，则在体内、体外均可通过利用例如具有该基因的一部分或全部的碱基序列的探针或引物来进行检测。
特别地，MEX3B基因的mRNA水平上的表达量的测定可利用RT-PCR、Northern印迹法等常规方法进行。
进行PCR时，引物只要能够特异性地仅将MEX3B基因扩增即可，没有特别限定，可基于MEX3B基因的序列信息进行适当设定。例如，可以将包含MEX3B基因中的至少10个连续核苷酸的寡核苷酸、以及具有与该寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸作为探针或引物使用。更具体而言，可以使用具有MEX3B基因中的10～60个连续残基(优选10～40个连续残基)的碱基序列的寡核苷酸、以及具有与该寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸。
另外，MEX3B蛋白质水平上的表达量的测定可以利用Western印迹法或ELISA等通常的免疫分析进行。具体而言，可利用《分子克隆》(Molecular Cloning)第2版或《最新分子生物学实验方法汇编》(Current Protocols in Molecular Biology)等中记载的本领域技术人员已知的常规方法进行。
<MEX3B基因表达抑制试剂>
第2方式涉及的MEX3B基因表达抑制试剂(以下，也简称为“第2方式涉及的试剂”。)包含第1方式涉及的核酸。
从提高向细胞内的摄入的观点考虑，第2方式涉及的MEX3B基因表达抑制试剂可以还包含脂质体转染用载体，也可以不包含脂质体转染用载体。
作为脂质体转染用载体，可举出与细胞膜的亲和性高的载体(例如脂质体(liposome)、胆固醇等)，优选Lipofectamine或Lipofectin，更优选Lipofectamine。
通过使第1方式涉及的核酸具有选自由硫代磷酸酯结构、桥连结构及烷氧基结构组成的组中的至少1种结构、并与脂质体转染用载体组合使用，能够进一步提高向细胞内的摄入。
例如，优选地，在共存有脂质体转染用载体的情况下，使具有选自由硫代磷酸酯结构、桥连结构及烷氧基结构组成的组中的至少1种结构的第1方式涉及的核酸与后述的对象接触。
第2方式涉及的试剂可以为将第1方式涉及的核酸、上述脂质体转染用载体及其他任选成分(例如，水、缓冲液等)混合而包含在内的形态，也可以为将第1方式涉及的核酸及其他任选成分、与上述脂质体转染用载体及其他任选成分包装于分开的容器内的试剂盒的形态。
作为第2方式涉及的试剂的形态，没有特别限定，可以以液体、颗粒、片剂、胶囊剂、贴剂等形态使用。在体内的情况下，可以将第2方式涉及的试剂直接暴露于组织。更优选地，可利用下述手段向生物体内施予：暴露(液体等)于生物体；或经口施予；或者向静脉或动脉等的血管内、口腔内、舌下、直肠内、腹腔内、皮肤、皮下、皮内、膀胱内、气管(支气管)、眼、鼻、耳内等的注入、喷雾、或涂布等。
<抑制MEX3B基因表达的方法>
第3方式涉及的抑制MEX3B基因表达的方法包括使第2方式涉及的试剂与对象接触的步骤。
作为对象，可举出生物个体、微生物、原虫、生物组织、生物组织切片、人类细胞、动物细胞等。
作为接触的方式，没有特别限制，例如，可以将第2方式涉及的试剂添加至包含对象的介质，或者准备预先含有第2方式涉及的试剂的上述介质。接触时的温度、时间等没有特别限制，可根据对象的种类等进行适当设定。
<由MEX3B基因表达所引起的疾病的预防或治疗剂>
第4方式涉及的由MEX3B基因表达所引起的疾病的预防或治疗剂包含第2方式涉及的MEX3B基因表达抑制试剂。
白介素6(IL-6)是参与炎症、造血、骨代谢、肿瘤恶化等的重要细胞因子，已知其活性主要促进从急性炎症向获得性免疫反应的转变、慢性炎症性疾病的发病(例如，JAsthma.2008，45 Suppl 1：41-4.)。
就白介素13(IL-13)而言，已知其作为炎性细胞因子发挥进一步加重末梢组织处的过敏性炎症的作用，并且已知其不仅促进作为过敏性哮喘的主要原因的过敏反应，而且参与哮喘的难治化(使得类固醇试剂变得无效)。另外，IL-13不仅参与哮喘，而且在炎症性肠病、特应皮肤炎中也参与其病情的形成(例如，J Allergy(Cairo).2012，2012：316049；NEngl J Med 2011，365：1088-1098)。
TNF(肿瘤坏死因子：Tumor Necrosis Factor)中的TNF-α为诱发炎症反应的信号因子，从抗感染的观点考虑，其是重要的因子，另一方面，已知其同时也参与了由炎症亢进所造成的障碍。即，在各种疾病中，TNF参与了病情的恶化，已知其主要参与关节疾病(类风湿性关节炎、干癣性关节炎、脊柱关节炎、强直性脊柱炎)、炎症性肠病(溃疡性大肠炎、克罗恩病(Crohn disease))、癌(卵巢癌、乳腺癌)、精神疾病(抑郁、双极性情感障碍、癫痫、阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化症)、心血管疾病(心力衰竭、动脉硬化)、呼吸器官疾病(支气管哮喘、慢性支气管炎、慢性阻塞性肺疾病、急性肺损伤)、2型糖尿病、肾病(缺血性肾损伤、移植后排斥反应、肾小球肾炎)等(例如，J Allergy Clin Immunol.2008Jan，121(1)：5-10；J Pathol.2008Jan，214(2)：149-60.)。
另外，已知G-CSF(粒细胞集落刺激因子：Granulocyte-Colony StimulatingFactor)具有促进粒细胞生成、提升嗜中性粒细胞的功能的作用。
另外，已知IL-13、TNF、G-CSF也参与哮喘的重症化(例如，Curr OpinImmunol.2013 Dec，25(6)：755-60.)。
另外，CXCL1、CXCL2、CXCL5属于炎性趋化因子CXC亚家族。
在因呼吸道黏膜中的炎症过度亢进而在肺组织内分泌CXCL1、CXCL2、CXCL5的情况下，高度表达CXCR2(其为CXCL1、CXCL2、CXCL5的受体)的嗜中性粒细胞的浸润被促进。结果，类固醇抗性的嗜中性粒细胞浸润引起重症哮喘，由此诱发慢性炎症(其诱导呼吸道的不可逆重塑)。
本申请的发明人发现MEX3B基因与由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的疾病的发病有关。
因此，认为第4方式涉及的预防或治疗剂作为由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5表达增加所引起的疾病(例如，重症哮喘、慢性阻塞性肺疾病、类风湿性关节炎、大肠炎、克罗恩病、特应性皮炎、系统性红斑狼疮、癌等中的由IL-6、IL-13、TNF、G-CSF、CXCL1、CXCL2、或CXCL5所引起的重症哮喘、慢性阻塞性肺疾病、类风湿性关节炎、大肠炎、克罗恩病、特应性皮炎、系统性红斑狼疮、癌等(Int Immunol.2015Jan，27(1)：21-9，CancerDiscov.2016Jan，6(1)：80-95.))的预防或治疗剂是有效的。
另外，已知MEX3B蛋白质为诱导细胞凋亡的蛋白质(例如，日本专利第4429269号公报)。
已知细胞凋亡除参与正常的生理学过程以外，还参与神经变性病等严重疾病的发病。例如，认为细胞凋亡的异常亢进是神经变性病(例如，阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、亨廷顿舞蹈病等)的病因(Wolozin，B.等人，(1996)Science，274，1710-1713)。
因此，认为第4方式涉及的预防或治疗剂作为神经变性病的预防或治疗剂是有效的。
第4方式涉及的预防或治疗剂可以以经口或非经口的方式全身或局部地施予。作为非经口的施予方法，可举出滴注等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射等。可根据患者的年龄、症状选择适当的施予方法。其施予量根据年龄、施予途径、施予次数的不同而不同，本领域技术人员可适当选择。
作为适于非经口施予的制剂形态，例如可举出含有稳定剂、缓冲剂、防腐剂、等渗剂等添加剂的形态，也可以还包含药学上允许的载体、添加物。作为这样的载体及添加物的例子，可举出水、有机溶剂、高分子化合物(胶原、聚乙烯醇等)、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖、表面活性剂等，但并不限定于此。
关于作为有效成分的第1方式涉及的核酸的施予量，通常在每1次为0.1μg～100mg(相对于每lkg体重而言)左右的范围内。
实施例
以下，示出实施例，进一步具体地说明本发明，但本发明的范围并不限定于这些实施例。
《实施例1》
<Gapmer型核酸的制备>
(比较例)
作为比较例的Gapmer型核酸，制备与人MEX3B mRNA序列内的编码氨基酸的区域(CDS)中包含的、序列号1的第838～853位的碱基序列互补的Gapmer型核酸(全长为16个碱基)。
(实施例)
作为实施例的Gapmer型核酸，制备与序列号2(其表示小鼠Mex3B基因)中的3’UTR所包含的第3135～3149位的碱基序列互补的Gapmer型核酸(全长为15个碱基)。
在比较例及实施例的Gapmer型核酸的两个末端配置2个或3个碱基的LNA(2’，4’-BNA)，填充除此以外的片段的碱基为通常的DNA，将各核苷酸连接的磷酸二酯键进行了硫代磷酸酯化。
<利用Gapmer型核酸进行的转染>
使用比较例的Gapmer型核酸及实施例的Gapmer型核酸进行转染(导入细胞)。
Gapmer型核酸的转染中使用的细胞为小鼠肺上皮细胞MLE15细胞，采用Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen公司制)及其推荐规程以20nM的最终浓度导入细胞中。
<定量RT-PCR试验>
转染48小时后在显微镜下观察细胞的状态，然后将细胞回收，使用溶解缓冲液TRIsure(BIOLINE公司制)回收总RNA。利用Primescript(TAKARA公司制)进行逆转录反应，得到cDNA。
然后，使用Light Cycler480(ROCHE公司制)，进行定量RT-PCR。
定量RT-PCR试验中使用的引物序列如下。
小鼠MEX3B正向引物：
5’-CGTCGTCCTCTGTGGTCTTTCCCGGGGGTG-3’(序列号6)
小鼠MEX3B反向引物：
5’-TCAGGAAAAAATGCGGATGGCCTGAGTGAC-3’(序列号7)
小鼠GAPDH正向引物：
5’-AGAGACAGCCGCATCTTCTT-3’(序列号8)
小鼠GAPDH反向引物：
5’-GACAAGCTTCCCATTCTCGG-3’(序列号9)
上述定量RT-PCR的结果为，由与MEX3B基因的CDS所包含的碱基序列互补的比较例的Gapmer型核酸带来的MEX3B基因的mRNA表达抑制效果为约50％左右。但是，如图1(b)所示，细胞毒性强，大量细胞自培养皿底部剥落而浮起，观察到大量细胞死亡。
另一方面，就实施例的Gapmer型核酸而言，获得了与上述比较例的Gapmer型核酸同等的mRNA表达抑制效果，并且也未观察到细胞毒性等副作用。
《实施例2》
<Gapmer型核酸的制备>
制备与3’UTR的表1所示的各靶序列互补的反义寡核苷酸即Gapmer型核酸hmrGD-176(序列号11)、hmrGD-178(序列号12)、hmrGD-179(序列号13)、hmrGD-180(序列号14)、hmrGD-182(序列号15)、hmrGD-199(序列号16)、hmrGD-201(序列号17)、hmrGD-202(序列号18)、hmrGD-203(序列号19)或hmrGD-205(序列号20)、作为阴性对照的Gapmer型核酸(序列号21)、及作为阳性对照的与CDS区的表1所示的靶序列互补的反义寡核苷酸即Gapmer型核酸hmrGD-68(序列号22)。
需要说明的是，在各Gapmer型核酸的两个末端配置2个碱基的LNA(2’，4’-BNA)，填充除此以外的片段的碱基为通常的DNA，将各核苷酸连接的磷酸二酯键进行了硫代磷酸酯化，作为阴性对照的Gapmer型核酸的全长为15个碱基，除此以外的Gapmer型核酸的全长为16个碱基。
[表1]
<Gapmer型核酸的转染>
除了使用上文制备的各Gapmer型核酸以外，与实施例1同样地操作，进行转染。
<定量RT-PCR试验>
除了使用以下引物作为PCR引物以外，与实施例1同样地操作，进行定量RT-PCR试验。
人MEX3B正向引物：
5’-ACCCAGTTCTGAGCATGTCG-3’(序列号23)
人MEX3B反向引物：
5’-CGAACTGGGGTCTTGATGTAA-3’(序列号24)
人GAPDH正向引物：
5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’(序列号25)
人GAPDH反向引物：
5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’(序列号26)
由图2所示的定量RT-PCR的结果可知，与转染了对照Gapmer型核酸的细胞相比，在使用以3’UTR作为靶区域的各Gapmer型核酸hmrGD-176、hmrGD-178、hmrGD-179、hmrGD-180、hmrGD-182、hmrGD-199、hmrGD-201、hmrGD-202、hmrGD-203或hmrGD-205进行了转染的细胞中，检测到了抑制人MEX3B的mRNA表达的效果。
就具有与序列号1O(其表示人MEX3B的前体mRNA)的第4134～4149位的寡核苷酸互补的序列的Gapmer型核酸hmrGD-179、具有与第4139～4154位的寡核苷酸互补的序列的Gapmer型核酸hmrGD-180、具有与第4278～4293位的寡核苷酸互补的序列的Gapmer型核酸hmrGD-205而言，特别强地检测到了抑制人MEX3B的mRNA表达的效果。
如图3所示，确认到在使用与CDS区的序列互补的Gapmer型核酸hmrGD-68进行了转染的细胞中，细胞毒性显著地高，大量细胞自培养皿底部剥落而呈圆形地浮起，大量细胞死亡。
另一方面，如图3所示，就使用与UTR区的序列互补的Gapmer型核酸hmrGD-176、hmrGD-178、hmrGD-179、hmrGD-180、hmrGD-182、hmrGD-199、hmrGD-201、hmrGD-202、hmrGD-203或hmrGD-205进行了转染的细胞而言，与阴性对照同样地，未观察到细胞毒性等副作用。

Claims (7)

1.抑制MEX3B基因的表达的核酸，所述核酸为：
反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸具有与MEX3B基因的外显子中的非翻译区中的包含至少10个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列；或者
双链RNA或编码所述双链RNA的DNA，所述双链RNA包含所述非翻译区中的至少20个连续核苷酸。
2.如权利要求1所述的核酸，其中，所述非翻译区被包含于序列号1或2表示的MEX3B基因中。
3.如权利要求1或2所述的核酸，所述核酸为：
下述反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸具有与序列号10的非翻译区中的第4119～4293位的序列中的包含12～20个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列，所述序列号10表示人MEX3B的前体mRNA；或者
下述反义寡核苷酸，所述反义寡核苷酸具有与序列号2的非翻译区中的第3135～3149位的寡核苷酸互补的序列，所述序列号2表示小鼠MEX3B基因；或者
下述双链RNA或编码所述双链RNA的DNA，所述双链RNA包含序列号10的非翻译区中的第4119～4293位的至少21个连续核苷酸，所述序列号10表示人MEX3B的前体mRNA；或者
下述双链RNA或编码所述双链RNA的DNA，所述双链RNA包含所述第3135～3149位的寡核苷酸。
4.如权利要求1或2所述的核酸，其中，所述反义寡核苷酸为具有与所述非翻译区中的包含12～20个连续核苷酸的寡核苷酸互补的序列的反义寡核苷酸。
5.MEX3B基因表达抑制试剂，其包含权利要求1～4中任一项所述的核酸。
6.抑制MEX3B基因表达的方法，所述方法包括使权利要求5所述的试剂与对象接触的步骤，所述对象不包括人类个体。
7.由MEX3B基因表达所引起的疾病的预防或治疗剂，其包含权利要求5所述的试剂。
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