JP2022507283A - 脊髄小脳失調症３型の治療のためのアタキシン－３のｒｎａｉ誘導低減 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＳＣＡ３の治療のための遺伝子治療アプローチ、特に、トータルノックダウンアプローチを利用するＲＮＡｉに基づく遺伝子治療アプローチに関する。本発明者らは、ＡＴＸＮ３遺伝子発現の高効率ノックダウンがヒト神経細胞において及びＳＣＡ３に関連するマウスモデルにおいて有利に得られる選択された標的領域及び／又は標的配列を提供する。【選択図】なし

Description

脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）、又はマシャド・ジョセフ病（ＭＪＤ）は、常染色体性顕性一遺伝子性致死性障害である。障害は、ヒトアタキシン－３遺伝子、ＡＴＸＮ３遺伝子（ＯＭＩＭ：６０７０４７、第１４染色体上の参照配列ヒト（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）アタキシン－３（ＡＴＸＮ３）、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ_００８１９８．２（配列番号１）とも称される、におけるＣＡＧ伸長によって生じる脳エリアの進行性の変性によって特徴付けられる。図１－１及び１－２に示すとおり、遺伝子及び遺伝子転写物の３’領域中、配列番号２のｎｔｓ９４２～１０６０に対応する配列に対応するエクソン配列中の（すなわち、図１－１及び１－２に示すエクソン１０に対応する大部分のＡＴＸＮ３転写バリアント中の）シトシン－アデニン－グアニン（ＣＡＧ）リピート領域は、１つ若しくは２つのＣＡＡコドン（図１－１及び１－２に示される、配列番号２のｎｔｓ．９４３～９８４に対応する）が組み入れられて又は組み入れられずに存在する。前記ＣＡＧ領域は、インフレームであり、ポリＱ領域、グルタミンの繰り返し配列を含むアタキシン－３タンパク質を生じる。図１－１及び１－２に示されるＣＡＧリピート領域は、疾患に関連しない領域を表す。健康な又は非症候性の個体は、４４個までのＣＡＧリピートをＡＴＸＮ３遺伝子中に含み得る。罹患した個体は、伸長を有し、５２～８６個の間又はそれを超えるＣＡＧリピートを有する場合があることが示されている。４５～５１個の間のＣＡＧリピートを有する個体は、不完全浸透度の疾患の症状を有する。前記伸長、ポリＱ領域及びＣＡＧリピートの長さ、並びにそれによりアタキシン－３内のポリＱ領域の拡張を有するアタキシン－３タンパク質を生じ、疾患進行と関連する場合がある、すなわち領域が長いほど通常、疾患は進行性である。

伸長したポリＱトラクトを有するアタキシン－３タンパク質は、毒性の特性を取得し（毒性の機能の獲得）、脳における神経細胞凝集物の形成は、神経病理学的特徴である。神経病理学研究は、ＳＣＡ３患者の小脳、視床、中脳、脳橋、延髄及び脊髄を含む種々のエリアにおいて広範な神経細胞の減少を検出した（Ｒｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ ２００８）。広範な病態が報告されているが、一致した意見は、主な病態が、小脳及び脳幹においてであることである（Ｅｉｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．ＡＪＮＭ Ａｍ Ｊ Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ，２０１１）。疾患は、完全な浸透を有し、それはヒトが５２個以上のＣＡＧの伸長を有する場合、彼らは必然的に疾患を発症し、彼らの子孫にそれを渡す５０％の確率を有することを意味する。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の配列特異的下方制御に関与する、天然に存在する機構である。ｍＲＮＡの下方制御は、発現されるタンパク質の量の低減を生じる。ＲＮＡ干渉は、２本鎖ＲＮＡによって引き起こされる。２本鎖ＲＮＡの鎖の一方の鎖は、その標的であるｍＲＮＡに実質的に又は完全に相補的である。この鎖はガイド鎖と称される。ＲＮＡ干渉の機序は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中のガイド鎖の組み込みを含む。この複合体は、相補的塩基対合によって標的ｍＲＮＡに結合する、多重代謝回転複合体である。標的ｍＲＮＡに結合すると、複合体は、ｍＲＮＡを切断するか又は翻訳効率を低減するのいずれかであり得る。ＲＮＡ干渉は、それが発見されてから、特定の標的遺伝子をノックダウンし、それにより続くタンパク質発現を低下させるために広く使用されてきた。ＲＮＡ干渉を誘導するための方法は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、及び／又は短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の使用を含む。追加的に、天然でＲＮＡｉをもたらすことができる分子、いわゆるｍｉＲＮＡは、それらの天然に存在する対応物を模倣する人工ｍｉＲＮＡを作製するために使用されている。これらの戦略は、共通して、選択した遺伝子を標的化するように設計されている実質的に２本鎖のＲＮＡ分子を提供する。ＲＮＡｉの配列特異的様式を利用するＲＮＡｉに基づく治療アプローチは、開発中であり、いくつかは現在臨床試験中である。

ＲＮＡｉ遺伝子治療アプローチは、ＳＣＡ３の治療として提案された。このようなアプローチの焦点は、主に、伸長されたリピートを含むヒトＡＴＸＮ３転写物を選択的にノックダウンすることであった（Ａｌｖｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ、Ｖｏｌ．３ Ｉｓｓ．１０，２００８；Ｆｉｓｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１３：６、２０１２；国際公開第２００６０３１２６７号；及びＲｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｌｅｂｒｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．２１，ｎｏ．１０，２０１３）。この選択的ノックダウンは、健康な、すなわちＳＣＡ３を罹患していないヒトに関連する遺伝子では見出されない疾患関連転写物中のＳＮＰの標的化を含む。小脳におけるＡＴＸＮ３の有効な抑制及び使用されたノックダウンアプローチの安全性は実証されたが、運動表現型及び生存期間から見ると、運動障害は回復されず、生存期間は延長されなかったことが観察された（Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，ｖｏｌ．２１，ｎｏ．１０，２０１３）。したがって、ＳＣＡ３の治療としての改善されたＲＮＡｉ遺伝子治療アプローチが必要とされている。

本発明は、疾患に関連する転写物を選択的に標的化することを目的とするよりも、疾患及び非疾患関連ＡＴＸＮ３転写物（ＯＭＩＭ：６０７０４７）の両方のノックダウンを得ることを目的とする新規ＲＮＡｉアプローチを提供する。特に、疾患及び非疾患関連ＡＴＸＮ３転写物の非常に効率的なノックダウンは、ＣＡＧリピートから５’の配列を標的化することによって得ることができる。好ましくは、標的化される配列は、配列番号２のヌクレオチド３９０～９４１に対応する領域に見出される。配列番号２は、図１－１及び１－２に示される。図１－１及び１－２に示される配列において、この好ましい標的配列は、エクソン５、６、７、８及び９に対応する。ＡＴＸＮ３転写物がさまざまなエクソンから構成されてよく、それによりエクソンの順番は、図１－１及び１－２に示されるものと異なっている場合があることは理解される（Ｂｅｔｔｅｎｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０１０）。図１－１及び１－２に示され、配列番号２のヌクレオチド３９０～４５６、４５７～５４４、５４５～６７７、６７８～８４４及び８４５～９４１にそれぞれ対応するエクソン５、６、７、８及び９に対応する配列は、ＡＴＸＮ３転写物に含まれる。ＡＴＸＮ３転写バリアントが異なるエクソン組成を有し得ることから、異なるエクソン組成を示す標的化配列も、標的配列がスプライスされたＡＴＸＮ３転写物のＣＡＧリピートの３’から直接見出される約５５０ヌクレオチドに含まれる限り、本発明に包含され、このような標的配列は、本発明により検討され得る。同様に、ＡＴＸＮ３転写バリアントがさまざまなエクソン組成を有し得ることから、さまざまなエクソン組成を示す標的化配列は、標的配列が図１－１及び１－２に示されるエクソン５、６、７、８及び９に対応する、及び配列番号２のヌクレオチド３９０～４５６、４５７～５４４、５４５～６７７、６７８～８４４及び８４５～９４１にそれぞれ対応する少なくとも１つの配列に含まれる限り本発明により包含され、このような標的配列は、本発明により検討される。これは、実施例において示されるとおり、多数の代替的スプライスバリアントがこの領域中に生成されたが、ＣＡＧリピートから５’領域においてＡＴＸＮ３遺伝子発現の非常に効果的なノックダウンが達成され得たためである。疾患及び非疾患関連転写物の両方を低減する、及び／又はＣＡＧリピートからの５’を標的化することによって、アタキシン－３タンパク質の非常に効率的な低下が得られた。ＣＡＧリピート領域からの５’を標的化することは、天然で生じるスプライスバリアントの大部分が標的化されることから、伸長されたポリＱを含有するアタキシン－３の最も効率的なノックダウンを得ることも可能にした。

ＣＡＧリピート領域（エクソン１０に含まれる）を含むＡＴＸＮ３ ｃＤＮＡ配列の一部及び示される選択された標的ＲＮＡ配列（配列番号３～１３）の模式図である。列挙される配列はＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００４９９３．５の一部であり、配列は、本明細書において配列番号２と称され、そのヌクレオチド１～１３２９に対応し、スプライスされたＡＴＸＮ３転写物（の一部）のＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）を表す。それにより、対応するＲＮＡは、図１－１及び１－２及び配列番号２に示されるとおりＴの代わりにＵを有することを除いて同じ配列を有する、ヌクレオチド１～９３はエクソン１を表し、ヌクレオチド９４～２５８はエクソン２を表し、ヌクレオチド２５９～３０３はエクソン３を表し、ヌクレオチド３０４～３８９はエクソン４を表す。ヌクレオチド３９０～９４１はエクソン５、６、７、８及び９を包含する。エクソン５、６、７、８及び９は、それぞれ３９０～４５６、４５７～５４４、５４５～６７７、６７８～８４４及び８４５～９４１によって表される。エクソン１０配列は、配列番号２の９４２～１０６０に対応し、１２個のＣＡＧを含む１４コドンのリピート領域を含む。選択された標的ＲＮＡ配列（表１に列挙のとおり）、すなわちそれに対応するＤＮＡ配列は、同様に図１－１及び１－２に示されている。配列番号３はエクソン１中のヌクレオチド４６～６７に対応する；配列番号４はエクソン１中のヌクレオチド６３～８４に対応する；配列番号５はエクソン２～３中のヌクレオチド２５４～２７５に対応する；配列番号６はエクソン３中のヌクレオチド２６３～２８４に対応する；配列番号７はエクソン４中のヌクレオチド３２３～２４４に対応する；配列番号８はエクソン４中のヌクレオチド３３８～３５９に対応する；配列番号９はエクソン５中のヌクレオチド４２２～４４３に対応する；配列番号１０はエクソン５～６中のヌクレオチド４４３～４６４に対応する；配列番号１１はエクソン８～９中のヌクレオチド８３４～８５５に対応する；配列番号１２はエクソン９中のヌクレオチド８９７～９１８に対応する；配列番号１３はエクソン９中のヌクレオチド９１８～９３９に対応する。 ＣＡＧリピート領域（エクソン１０に含まれる）を含むＡＴＸＮ３ ｃＤＮＡ配列の一部及び示される選択された標的ＲＮＡ配列（配列番号３～１３）の模式図である。列挙される配列はＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００４９９３．５の一部であり、配列は、本明細書において配列番号２と称され、そのヌクレオチド１～１３２９に対応し、スプライスされたＡＴＸＮ３転写物（の一部）のＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）を表す。それにより、対応するＲＮＡは、図１－１及び１－２及び配列番号２に示されるとおりＴの代わりにＵを有することを除いて同じ配列を有する、ヌクレオチド１～９３はエクソン１を表し、ヌクレオチド９４～２５８はエクソン２を表し、ヌクレオチド２５９～３０３はエクソン３を表し、ヌクレオチド３０４～３８９はエクソン４を表す。ヌクレオチド３９０～９４１はエクソン５、６、７、８及び９を包含する。エクソン５、６、７、８及び９は、それぞれ３９０～４５６、４５７～５４４、５４５～６７７、６７８～８４４及び８４５～９４１によって表される。エクソン１０配列は、配列番号２の９４２～１０６０に対応し、１２個のＣＡＧを含む１４コドンのリピート領域を含む。選択された標的ＲＮＡ配列（表１に列挙のとおり）、すなわちそれに対応するＤＮＡ配列は、同様に図１－１及び１－２に示されている。配列番号３はエクソン１中のヌクレオチド４６～６７に対応する；配列番号４はエクソン１中のヌクレオチド６３～８４に対応する；配列番号５はエクソン２～３中のヌクレオチド２５４～２７５に対応する；配列番号６はエクソン３中のヌクレオチド２６３～２８４に対応する；配列番号７はエクソン４中のヌクレオチド３２３～２４４に対応する；配列番号８はエクソン４中のヌクレオチド３３８～３５９に対応する；配列番号９はエクソン５中のヌクレオチド４２２～４４３に対応する；配列番号１０はエクソン５～６中のヌクレオチド４４３～４６４に対応する；配列番号１１はエクソン８～９中のヌクレオチド８３４～８５５に対応する；配列番号１２はエクソン９中のヌクレオチド８９７～９１８に対応する；配列番号１３はエクソン９中のヌクレオチド９１８～９３９に対応する。 図２のａは、設計された第１のＲＮＡ配列を示す、ｍｉＲ４５１スキャホールドＲＮＡ構造の模式図である。２のｂ）ｍｉＲＮＡスキャホールドの発現カセットの模式図である。２のｃ）ウミシイタケ／ホタルコンストラクトを示す模式図であって、ウミシイタケコンストラクトは、挿入された標的配列（黒四角）を含む。 配列番号３～１３を標的化することによるＡＴＸＮ３レポーターのサイレンシングを示すグラフである。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１：０．１～１００の比でルシフェラーゼレポーターコンストラクト及び配列番号３～１を標的化するさまざまなスキャホールドを用いて同時トランスフェクトされた。ウミシイタケ及びホタルは、トランスフェクション２日後に測定され、ウミシイタケはホタル発現に標準化された。スクランブルｍｉＲＮＡ（ＣＴＲＬ）は陰性対照として作用し、１００％（ｙ軸）に設定された。配列番号９～１３を標的化することは、配列番号１１を用いた標的化が最も顕著なノックダウンを示して（＞９０％）、最も強いノックダウンを生じ、最高レベルで７５％以上のノックダウンを達成した。 図４のａは、ウエスタンブロット、４のｂ）は、２９３Ｔ細胞における内在性アタキシン－３タンパク質の低下を示すその定量を示す図である。 図５のａは、ｉＰＳＣ由来神経細胞におけるＡＡＶ－ｍｉＲＮＡ 形質導入の用量応答を示すグラフである。１０ｅｘｐ１０、１０ｅｘｐ１１及び１０ｅｘｐ１２の範囲で増加させた投薬量を神経細胞を形質導入するために使用した。成熟ｍｉＲＮＡを神経細胞中で決定し、用量が高いほど高いレベルの発現を示す用量応答曲線が示されている。５のｂ）この用量応答曲線は、ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡレベルを決定する場合とは逆のイメージを有する用量応答曲線となり、ＡＡＶの用量が高いほど、検出されるＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡレベルが低かった。ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの最も低い量は、配列番号１１を標的とした場合に検出された。 図６のａは、配列番号９、１１及び１３を標的化するＡＡＶのｉｎ ｖｉｖｏの投与を示す図である。ＡＡＶは、マウスに注射された。ゲノムＤＮＡあたりに検出されたｇｃの量は、各投与及び各エリアについて決定された。エリアごとに検出されたｇｃは、注射部位間に変動を有して注射部位ごとと同様であった。６のｂ）ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡのノックダウンが髄質において決定された。３つすべての標的領域は、ｍＲＮＡの似通った低減を示した。 図７は、配列番号１１を標的化する２２ヌクレオチドの第１のＲＮＡ配列を含むｍｉＲ４５１スキャホールドをコードする発現コンストラクト（配列番号４９）のＤＮＡ配列を示す図である。発現カセットは太字で示されるＣＡＧプロモーター（４３～１７１２位）を含み、第１のＲＮＡ配列をコードする配列は、太字及び下線付きで示されており（配列番号１６をコードする２０３１～２０５２位）、第２のＲＮＡ配列をコードする配列は下線付きで示されている（配列番号２０をコードする２０５３～２０７０位）、ｈＧＨポリＡシグナルは太字及び斜体で示されている（２３１８～２４１４）。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列は、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列を含む。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡコード配列は［角括弧］の間に示されている（配列番号２８をコードする２０１５～２０８６位）。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列を含み、それをコードする配列は、通常又は太字のいずれかで下線付きで示されている（２０３１～２０７０位）（配列番号２４をコードする）。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡコード配列は、それぞれ表４及び５に列挙され、図８に示されるとおり例えばｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡをコードする配列によって置き換えられ得る。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡの第１のＲＮＡ配列は、ＡＴＸＮ３遺伝子中の配列に、好ましくは、例えば表１に列挙されるなどのＡＴＸＮ３遺伝子のＣＡＧリピート領域から５’の標的ヌクレオチド配列に結合し、標的化するように選択された２２ヌクレオチドの任意の配列であってもよい。第２のＲＮＡ配列は、選択され、第１のＲＮＡ配列に相補的となるように適合される。フォールディングのために二次構造を、フォールディング温度を摂氏３７度に固定したＲＮＡフォールディング形態を利用する標準設定を使用してＲＮＡ配列をフォールディングすることによって、ｍｆｏｌｄで確認し（オンラインで利用可能、＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｕｎａｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄ＞；Ｚｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１３），３４０６～１５，（２００３））、必要に応じて図２のａ及び８に示されるｍｉＲ－４５１ ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構造に適合させる。 ｍｉＲ４５１スキャホールドにおける選択されたｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ（Ａ－Ｄ）及びｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ（Ｅ－Ｈ）配列の予測ＲＮＡ構造を示す図である。配列Ａ及びＥ、Ｂ及びＦ、Ｃ及びＧ、Ｄ及びＨは、それぞれの標的配列、配列番号９、１０、１１及び１３を標的化する予測ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ及びｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構造である。示される二次ＲＮＡ配列の配列は、表４及び５に列挙されている。構造は、ＲＮＡフォールディング形態を利用して、標準設定を使用するＭ－ｆｏｌｄを使用して作成された（オンラインで利用可能、＜ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｕｎａｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄ＞；Ｚｕｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１３），３４０６～１５、（２００３）。ｍ－ｆｏｌｄバージョン３．５のために使用された標準設定は、次のとおり：ＲＮＡ配列は直鎖、フォールディング温度は３７℃に固定、イオン条件：１Ｍ ＮａＣｌ、二価イオンなし、ｐｅｒｃｅｎｔ ｓｕｂｏｐｔｉｍａｌｉｔｙ ｎｕｍｂｅｒは５、ｉｎｔｅｒｉｏｒ／ｂｕｌｇｅ ｌｏｏｐ ｓｉｚｅは３０、ｍａｘｉｍｕｍ ａｓｙｍｍｅｔｒｙ ｏｆ ａｎ ｉｎｔｅｒｉｏｒ／ｂｕｌｇｅ ｌｏｏｐは３０、ｍａｘｉｍｕｍ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐａｉｒｅｄ ｂａｓｅｓはなし。 Ｆ５１２ ＳＣＡ３マウスにおけるＡＡＶ５のベクターコピー分布を示す図である。Ａ）投与の経路の模式図である。３カ月齢マウス（Ｎ－３）は、ＩＣＶ又は大槽又はＤＣＮにＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３＿９、ＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３＿１１又はＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３＿１３を注射された。１０μｌのＡＡＶ５はＩＣＶ又は大槽のいずれかに注射され、２μｌはＤＣＮに両側性に注射された。注射部位は、暗灰色で描かれ、矢印で示されている。すべてのマウスは、手術の６週間後に屠殺された。Ｂ～Ｄ）皮質、小脳及び脳幹におけるベクターコピー分布。ＤＮＡは、皮質、小脳及び脳幹組織から単離され、ｑＰＣＲはベクターコピー分布を決定するために実施された。ＤＮＡ １μｇ当たりのゲノムコピーは、標準曲線を使用して各脳領域について算出された。 Ｆ５１２マウスにおける変異体アタキシン－３のサイレンシングを示す図である。Ａ）ＤＣＮ投与後の小脳における成熟ｍｉＡＴＸＮ３ガイド鎖の発現。総ＲＮＡは、低分子ＲＮＡ ＴａｑＭａｎのために小脳から単離された。マイクロＲＮＡインプットレベルはＵ６低分子核ＲＮＡに標準化され、ＡＡＶ－ＧＦＰ処置マウスと比較した。Ｂ）ＤＣＮ注射マウスの小脳における総ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの低下。総ＲＮＡは小脳から単離され、ＲＴ－ｑＰＣＲはマウス野生型ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ検出するために実施された。ＲＮＡインプットレベルはＧＡＰＤＨに標準化され、ＡＡＶ－ＧＦＰ処置マウスと比較した。Ｃ）大槽投与後の脳幹における成熟ｍｉＡＴＸＮ３ガイド鎖の発現。図１０のＡについて記載のとおり実施。Ｄ）大槽注射マウスの小脳における総ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの低下。図１０のＢについて記載のとおり実施。Ｅ）大槽投与後の脳幹における成熟ｍｉＡＴＸＮ３ガイド鎖の発現。図１０のＡについて記載のとおり実施。Ｆ）大槽注射マウスの脳幹における総ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの低下。図１０のＢについて記載のとおり実施。Ｇ）大槽送達後の脳幹における変異体アタキシン－３タンパク質の低減。ＴＲ－ＦＲＥＴイムノアッセイは、変異体アタキシン－３を特異的に検出する（野生型マウスアタキシン－３を検出しない）ように組織可溶化物に実施した。タンパク質発現は、対照（未処置）マウスと比較した百分率で示されている。６４．５％に至る脳幹における変異体アタキシン－３タンパク質の強い低下が観察された。Ｈ）大槽送達後の小脳における変異体アタキシン－３タンパク質の低減。小脳における５３．１％のアタキシン－３タンパク質の強い低下が観察された。 ＳＣＡ３マウス脳におけるｍｉＡＴＸＮ３媒介アタキシン－３ノックダウン マウスは、２カ月齢で、変異体アタキシン－３レンチウイルス発現カセットとＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３＿１１との混合物を、両方の線条体に定位的に注射された。レンチウイルスコンストラクトは、研究期間中に、線条体全体に変異体アタキシン－３の発現を生じる。Ａ）マウスの体重は、ｍｉＡＴＸＮ３のいずれの試験用量によっても悪影響を受けなかった。 ＳＣＡ３マウス脳におけるｍｉＡＴＸＮ３媒介アタキシン－３ノックダウン マウスは、２カ月齢で、変異体アタキシン－３レンチウイルス発現カセットとＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３＿１１との混合物を、両方の線条体に定位的に注射された。レンチウイルスコンストラクトは、研究期間中に、線条体全体に変異体アタキシン－３の発現を生じる。Ｂ）ｑＰＣＲ分析は、ＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３処置の７週間後に線条体における変異体ＡＴＸＮ３発現の強い用量依存的ノックダウンを明らかにした。 ＳＣＡ３マウス脳におけるｍｉＡＴＸＮ３媒介アタキシン－３ノックダウン マウスは、２カ月齢で、変異体アタキシン－３レンチウイルス発現カセットとＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３＿１１との混合物を、両方の線条体に定位的に注射された。レンチウイルスコンストラクトは、研究期間中に、線条体全体に変異体アタキシン－３の発現を生じる。Ｃ）可溶性アタキシン－３タンパク質レベルは、ウエスタンブロット分析を通じて定量されたとおり高用量のｍｉＡＴＸＮ３後に線条体において９０％に至って低減された。 ＳＣＡ３マウス脳におけるｍｉＡＴＸＮ３媒介アタキシン－３ノックダウン マウスは、２カ月齢で、変異体アタキシン－３レンチウイルス発現カセットとＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３＿１１との混合物を、両方の線条体に定位的に注射された。レンチウイルスコンストラクトは、研究期間中に、線条体全体に変異体アタキシン－３の発現を生じる。Ｄ）線条体における不溶性及び凝集アタキシン－３タンパク質画分は、ｍｉＡＴＸＮ３の中及び高用量処置によってほとんど完全に消失した。ＬＤ＝低用量（２×１０^９ｇｃ）、ＭＤ＝中用量（１×１０^１０ｇｃ）ＨＤ＝高用量（２×１０^１０ｇｃ）ＰＢＳ ｎ＝８、ＡＡＶ５ ＨＤ ｎ＝８；ＡＡＶ５ ＭＤ ｎ＝８；ＡＡＶ５ ＬＤ ｎ＝８。一元配置ＡＮＯＶＡ（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１ ^＊＊＊ｐ＜０．００１及び^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。 ＳＣＡ３マウスにおけるアタキシン－３封入物及びｄａｒｐｐ３２病変サイズの低減。ｍｉＡＴＸＮ３処置ＳＣＡ３マウスの右半球からの線条体は、アタキシン－３及びｄａｒｐｐ－３２（ドーパミン－及びｃＡＭＰ－制御ニューロンリン酸化タンパク質）について染色された。Ａ）ｍｉＡＴＸＮ３処置７週間後に屠殺されたマウスのアタキシン－３染色（１Ｈ９）線条体は、ＰＢＳ処置ＳＣＡ３マウスにおける核封入体の存在を示している。Ｂ）マウスの右半球は、中脳ドーパミン神経細胞マーカーｄａｒｐｐ－３２を用いて染色された。早期神経機能障害を表すｄａｒｐｐ－３２枯渇病変は、ＰＢＳ処置動物の注射部位近くに見ることができる（線条体の上左）。 ＳＣＡ３マウスにおけるアタキシン－３封入物及びｄａｒｐｐ３２病変サイズの低減。ｍｉＡＴＸＮ３処置ＳＣＡ３マウスの右半球からの線条体は、アタキシン－３及びｄａｒｐｐ－３２（ドーパミン－及びｃＡＭＰ－制御ニューロンリン酸化タンパク質）について染色された。Ｃ）線条体における核アタキシン－３封入物の定量。低用量ｍｉＡＴＸＮ３処置は、アタキシン－３封入物の数を約５０％まで顕著に低減した。核アタキシン－３封入物の存在は、中及び高用量ｍｉＡＴＸＮ３処置動物においてほとんど完全に消失した。Ｄ）ｄａｒｐｐ－３２枯渇体積の定量。総病変サイズを間を置いた切片に基づいて線条体全体について算出した。病変サイズは、ＰＢＳ処置動物と比較して、ｍｉＡＴＸＮ３処置後に用量依存的に有意に低減し、これは神経機能障害の低減を示す。ＰＢＳ ｎ＝８、ＡＡＶ５ ＨＤ ｎ＝８；ＡＡＶ５ ＭＤ ｎ＝７；ＡＡＶ５ ＬＤ ｎ＝８ 一元配置ＡＮＯＶＡ（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１ ^＊＊＊ｐ＜０．００１及び^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１） 内在性マウスアタキシン－３タンパク質レベルへのｍｉＡＴＸＮ３処置の効果を示す図である。図１１Ａ～１１Ｄ由来のｑＰＣＲ及びウエスタンブロットデータに基づいた。マウスアタキシン－３ ＲＮＡ（Ａ）及びタンパク質（Ｂ）の定量は、マウス線条体において高用量のＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３（２×１０^９）で内在性アタキシン－３のわずかな下方制御だけを示している。内在性マウスアタキシン－３は、標的配列中に１つのヌクレオチドミスマッチを保有している。^＊＊ｐ＜０．０１、一元配置ＡＮＯＶＡ。 内在性非ヒト霊長類アタキシン－３タンパク質レベルへのｍｉＡＴＸＮ３のくも膜下腔内投与の効果を示す図である。マカカ・ファシクラリス（macaca fascicularis）アタキシン－３タンパク質の定量は、非ヒト霊長類脳における内在性アタキシン－３の下方制御を示している。時間分解蛍光エネルギー移動（ＴＲ－ＦＲＥＴ）は、アタキシン－３タンパク質を定量するために使用され、発現レベルは対照マイクロＲＮＡ（ｍｉＣＲＴＬ）処置サンプルの平均と比較して算出された。分析された脳パンチは；ｐ２６運動皮質；ｐ３２被殻；ｐ６９、ｐ７０、ｐ７１脳橋；ｐ７２後頭皮質、ｐ７８深部小脳核；ｐ８９及びｐ９１小脳皮質。処置あたりＮ＝３。

本発明は、遺伝子治療に、特にヒトＡＴＸＮ３遺伝子（ＯＭＩＭ：６０７０４７）によってコードされるＲＮＡを標的化するための遺伝子治療におけるＲＮＡ干渉の使用に関する。ＡＴＸＮ３遺伝子中の伸長されたＣＡＧリピート、（ＣＡＧｎ）は、常染色体性顕性一遺伝子性致死性障害である脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）、マシャド・ジョセフ病（ＭＪＤ）とも称される、に関連する。このため、ＲＮＡ発現レベルを低減することは、伸長したＣＡＧリピートを含有するＲＮＡ及び／又はそれから翻訳される伸長したポリＱを含有するアタキシン－３タンパク質に関連する神経病態（neuropathology）を低減することを目的としている。本明細書において概説される遺伝子治療アプローチを使用する脳幹及び小脳の組合せ標的化は、それによりさらなる神経病態の減速又は完全な停止によって、冒されたヒト患者に非常に利益になる。

これにより、本発明は、第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列をコードする発現カセットであって、第１の及び第２のＲＮＡ配列が実質的に相補的であり、第１のＲＮＡ配列が少なくとも１９ヌクレオチドの長さの配列を有し、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子（ＯＭＩＭ：６０７０４７）によってコードされるＲＮＡに含まれる標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的である、発現カセットをここに提供する。特に、例えば図１－１及び１－２に示される配列番号２に示されるとおり、ＣＡＧリピートの５’にあるヒトＡＴＸＮ３遺伝子の配列を標的化することは、有用であることが見出された。このようにヒトＡＴＸＮ３を標的化することによって、本発明者らは、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子発現を非常に効率的に低減でき、それによりアタキシン－３タンパク質の形成を低減できた。最終的にはこれは、さらなる神経病態を停止及び／又は止めることができる。

本発明において発現される第１のＲＮＡ配列は、センス標的ＲＮＡ配列に対して相補的（「アンチ」）であることからアンチセンス鎖とも称されるガイド鎖に、その全体又は実質的な部分が含まれ、センス標的ＲＮＡ配列は、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子によってコードされるＲＮＡに含まれる。「センス鎖」とも称される第２のＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ配列に対して実質的な配列同一性を有し得る、又はそれと同一であり得る。第１の及び第２のＲＮＡ配列は２本鎖ＲＮＡに含まれ、実質的に相補的である。本発明による前記２本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉を誘導し、それにより転写物を含有するＣＡＧリピートのノックダウン、転写物を含有する疾患に関連する伸長したＣＡＧリピート及びＡＴＸＮ３転写物を含有する非疾患関連ＣＡＧリピートの両方の発現のノックダウンを含んで、ＡＴＸＮ３転写物の発現を低減する。標的化され得る転写物は、スプライスバリアントを含むスプライスされた、及び配列番号１によってコードされるなどのスプライスされていないＲＮＡ転写物を含み得る。それにより、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子によってコードされるＲＮＡは、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、イントロン及びエクソン配列に続く、３’ＵＴＲ及びポリＡテールを含むスプライスされていないｍＲＮＡ、並びにそのスプライスバリアントも含むことは理解される。本発明による前記２本鎖ＲＮＡは、転写サイレンシングも誘導できる。本発明により、発現カセットを提供する代わりに、本明細書に記載される第１の及び第２のＲＮＡ配列が提供されてよく、前記第１の及び第２のＲＮＡ配列は、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子によってコードされるＲＮＡを標的化することは理解される。

この文脈における「実質的に相補的」とは、第１の及び第２のＲＮＡ配列のすべてのヌクレオチドが塩基対合する、すなわち完全に相補的である、又は第１のＲＮＡ配列及び標的ＲＮＡ配列のすべてのヌクレオチドが塩基対合する必要はないことを意味すると理解される。２本鎖ＲＮＡがＲＮＡ干渉を誘導して、それによって標的ＲＮＡ配列を含む配列を配列特異的に標的化することができる限り、本発明においてはこのような実質的な相補性が予期される。

一実施形態では、本発明による２本鎖ＲＮＡは、第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列を含み、第１の及び第２のＲＮＡ配列は実質的に相補的であり、第１のＲＮＡ配列は少なくとも１９ヌクレオチドの長さの配列を有し、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子によってコードされるＲＮＡの標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的であり、第１のＲＮＡ配列は、ＲＮＡ干渉を誘導して標的ＲＮＡ配列を含むＲＮＡ転写物の発現を配列特異的に低減することができる。さらなる実施形態では、標的ＲＮＡ配列を含むＲＮＡ転写物の発現を低減するためのＲＮＡ干渉の前記誘導は、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子発現を低減するためであることを意味する。用語「ＲＮＡ配列」、「（ｍ）ＲＮＡ）」、「ＲＮＡ鎖」又は「ＲＮＡ分子」は、これらの用語が同じ物理的実体、すなわち、鎖中において共有結合で結合されたヌクレオチドモノマーからなる（バイオ）ポリマーを指して本明細書において使用されることは理解される。用語「二重鎖ＲＮＡ」は、共有結合で結合されたヌクレオチドモノマーからなる２本鎖に対応し得る、又は１本鎖、例えば、ｓｈＲＮＡのようにループ配列を形成した、共有結合で結合したヌクレオチドモノマーにより共有結合で結合した２本鎖に対応し得る、物理的実体も指す場合がある。

標的ＲＮＡ配列を含むＲＮＡ転写物の発現の低減を容易に決定できることは、実施例に記載される及び当技術分野において周知（例えば、Ｚｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．２００６ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００６；３４２：１８１～７）であるように、例えば標準的ルシフェラーゼレポーターアッセイ及び適切な対照を使用することによるものである。例えば、標的ＲＮＡ配列を含むルシフェラーゼレポーターは、本発明による２本鎖ＲＮＡが配列特異的ノックダウンをできることを示すために使用され得る。さらに、とりわけ実施例セクションにおいて示されるとおり、アタキシン－３タンパク質発現、及び／又はＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡのノックダウンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ神経細胞培養物において及び（トランスジェニック）動物モデルから得た脳組織において容易に測定され得る。

本発明による２本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導できる。ＲＮＡｉを誘導するために好適である２本鎖ＲＮＡ構造は、当技術分野において周知である。例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡｉを誘導できる。ｓｉＲＮＡは、２本の別々のＲＮＡ鎖、第１のＲＮＡ配列を含む一方の鎖及び第２のＲＮＡ配列を含む他方の鎖を含み得る。しばしば使用されるｓｉＲＮＡ設計は、３’オーバーハングを含む１９個の連続した塩基対を含む。第１の及び／又は第２のＲＮＡ配列は、３’オーバーハングを含み得る。好ましくは３’オーバーハングは、ｓｉＲＮＡの両鎖上のジヌクレオチドオーバーハングである。このような設計は、これらの特性を有するｓｉＲＮＡを生じる当技術分野において周知のより長い２本鎖ＲＮＡの観察されたエンドリボヌクレアーゼダイサープロセシングに基づく。３’オーバーハングは、第１のＲＮＡ配列に含まれ得る。３’オーバーハングは、第１のＲＮＡ配列に付加的であってもよい。ｓｉＲＮＡが構成される２本の鎖の長さは、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６若しくは２７ヌクレオチド又はこれを超える場合がある。第１のＲＮＡ配列を含む鎖は、第１のＲＮＡ配列からなってもよい。第１のＲＮＡ配列を含む鎖は、第１のＲＮＡ配列及びオーバーハング配列からなってもよい。

ｓｉＲＮＡは、ダイサー基質としても機能し得る。例えば、ダイサー基質は、２７個の連続塩基対を有するＲＮＡの２つの鎖からなる２７塩基長（ｍｅｒ）であってもよい。第１のＲＮＡ配列は、２７塩基長二重鎖の３’末端に位置する。ｓｉＲＮＡと同様に、ダイサー基質のそれぞれ又は片方の鎖は、２ヌクレオチドオーバーハングを３’末端に含み得る。３’オーバーハングは、第１のＲＮＡ配列中に含まれ得る。３’オーバーハングは、第１のＲＮＡ配列に付加的であってもよい。第１のＲＮＡ配列から５’に追加的な配列を含んでよく、追加的な配列は、標的ＲＮＡ配列に隣接する配列に相補的であり、それにより標的配列に相補的な配列の長さを拡張するか、又は相補的でない。ｓｉＲＮＡダイサー基質の他の末端は、平滑末端である。このダイサー基質設計は、ｓｉＲＮＡが、１９連続塩基対及び両方の３’末端に２ヌクレオチドオーバーハングを有する上に記載のｓｉＲＮＡ設計のように形成され得るように、ダイサーによるプロセシングにおいて選択性を生じる場合がある。いずれの場合でも、ｓｉＲＮＡなどは、２つの別々のＲＮＡ鎖から構成され（Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．１９９８，Ｎａｔｕｒｅ．１９９８ Ｆｅｂ １９；３９１（６６６９）：８０６～１１）、各ＲＮＡ鎖は、第１の又は第２のＲＮＡ配列を含む又はそれからなる。

第１の及び第２のＲＮＡ配列は、ｓｈＲＮＡにも含まれ得る。ｓｈＲＮＡは、５’末端から３’末端まで、次の配列を含む、又はこれらからなる：５’－第２のＲＮＡ配列－ループ配列－第１のＲＮＡ配列－任意選択で２ｎｔオーバーハング配列－３’。あるいは、ｓｈＲＮＡは、５’末端から３’末端まで、次の配列を含み得る：５’－第１のＲＮＡ配列－ループ配列－第２のＲＮＡ配列－任意選択で２ｎｔオーバーハング配列－３’。このようなＲＮＡ分子は、実質的に相補的な第１の及び第２のＲＮＡ配列により分子内塩基対を形成する。好適なループ配列は、当技術分野において十分周知である（とりわけ、Ｄａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ．２０１２ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１２ Ｏｃｔ；４０（１８）：９２５５～７１及びＳｃｈｏｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．２０１０ Ｍａｙ；８６（２）：２０４～１１に示されるとおり）。ループ配列は、ステムループ配列である場合もあり、それによりｓｈＲＮＡの２本鎖領域は拡張される。上に記載されるｓｉＲＮＡダイサー基質と同様に、ｓｈＲＮＡは、例えば１９個の連続塩基対及び２ヌクレオチドオーバーハングを両方の３’末端に有する上に記載されるｓｉＲＮＡ設計を有するｓｉＲＮＡを提供するように例えばダイサーによってプロセシングされ得る。ｓｈＲＮＡがダイサーによってプロセシングされる場合、第１の及び第２のＲＮＡ配列をｓｈＲＮＡの末端に有する、すなわちｓｉＲＮＡの推定鎖がステムループ配列を介して連結されることは好ましい、すなわち：５’－第１のＲＮＡ配列－ステムループ配列－第２のＲＮＡ配列－任意選択２ｎｔオーバーハング配列－３’。又は反対に、５’－第２のＲＮＡ配列－ステムループ配列－第１のＲＮＡ配列－任意選択で２ｎｔオーバーハング配列－３’。別のｓｈＲＮＡ設計は、ダイサープロセシングを必要としない活性化ＲＩＳＣ複合体（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１３，Ａｐｒ １；４１（６）：３７２３～３３及びＨｅｒｒｅｒａ－Ｃａｒｒｉｌｌｏ ａｎｄ Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，ＮＡＲ，２０１７，Ｖｏｌ．４５ Ｎｏ．１８ １０３６９～７９、両方とも参照により本明細書に組み込まれる）下に記載されるｍｉＲ４５１スキャホールドに非常に類似している構造に基づく、いわゆるＡｇｏｓｈＲＮＡ、を提供するようにＲＮＡｉ機構によってプロセシングされるｓｈＲＮＡ構造であり得る。このようなｓｈＲＮＡ構造は、第１のＲＮＡ配列のループ配列部分に含まれる。このようなｓｈＲＮＡ構造も第２のＲＮＡ配列が直後に続く第１のＲＮＡ配列からなってもよい。

本発明による２本鎖ＲＮＡは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡスキャホールドにも組み込まれ得る。マイクロＲＮＡ、すなわちｍｉＲＮＡは、例えば哺乳動物細胞において内因性に発現される２本鎖ＲＮＡ分子由来のガイド鎖である。ｍｉＲＮＡは、ｓｈＲＮＡ又は上に記載される拡張されたｓｉＲＮＡのプロセシングと同様にＲＮＡｉ機構によってｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ前駆体分子からプロセシングされ、活性化ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ Ｍ，Ｐｌａｓｔｅｒｋ ＲＨ． Ｄｉｃｅｒｓ ａｔ ＲＩＳＣ；ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ＲＮＡｉ．Ｃｅｌｌ．２００４ Ａｐｒ ２；１ １７（１）：１～３）。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡは、ヘアピンＲＮＡ分子であり、例えばイントロンに含まれ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡヘアピン分子を形成するようにドローシャによって最初にプロセシングされる、より大きなＲＮＡ分子（ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）の一部であり得る。ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡ様２本鎖ＲＮＡ二重鎖を生じるようにダイサーによって続いてプロセシングされ得るｓｈＲＮＡ様分子である。２本鎖ＲＮＡ二重鎖の一部であるｍｉＲＮＡ、すなわちガイド鎖は、次にＲＩＳＣに組み込まれる。天然に存在するようなＲＮＡ分子、すなわちｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ二重鎖は、選択した遺伝子を特異的に標的化する人工ｍｉＲＮＡを産生するためのスキャホールドとして使用され得る。例えば、標準設定を使用したｍ－ｆｏｌｄソフトウェアを使用して予測された天然に存在するＲＮＡ分子の予測ＲＮＡ構造に基づいて（Ｚｕｋｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１（１３），３４０６～３４１５，２００３）、ＲＮＡ構造中に存在する天然のｍｉＲＮＡ配列（すなわち二重鎖、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）及び、それに実質的に相補的である構造中に存在する配列は、除去され、本発明における第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列を用いて置き換えられる。第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列は、形成される予測二次ＲＮＡ構造、すなわちｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡ二重鎖のものが、天然ＲＮＡ配列の対応する予測される元の二次構造と似るように好ましくは選択される。天然に存在するｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡ二重鎖（相補的塩基対合を介してハイブリダイズする２本の別々のＲＮＡ鎖からなる）は、しばしば完全には塩基対合しない、すなわち、上に定義される第１の及び第２の鎖に対応するヌクレオチドの必ずしもすべてが塩基対合せず、第１の及び第２の鎖は、しばしば同じ長さではない。任意の選択された標的ＲＮＡ配列及び実質的に相補的な第１のＲＮＡ配列のためのスキャホールドとしてｍｉＲＮＡ前駆体分子をどのように使用するかは、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＬｉｕ ＹＰ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００８ Ｍａｙ；３６（９）：２８１１～２４に記載されている。

ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、細胞のＲＮＡｉ機構によってプロセシングされ得る。ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡヘアピンの５’末端の及び３’末端に隣接配列並びに／又はｓｈＲＮＡ様分子を含む。このようなｐｒｉ－ｍｉＲＮＡヘアピンは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡを産生するようにドローシャによってプロセシングされ得る。隣接配列の長さは、変動する場合があるが、長さおよそ８０ｎｔ付近であり得る（Ｚｅｎｇ ａｎｄ Ｃｕｌｌｅｎ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００５ Ｊｕｌ ２９；２８０（３０）：２７５９５～６０３；Ｃｕｌｌｅｎ，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００４ Ｄｅｃ ２２；１６（６）：８６１～５）。一実施形態では、本発明における第１の及び第２のＲＮＡ配列を保有するｐｒｉ－ｍｉＲＮＡスキャホールドは、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０又は少なくとも５０ヌクレオチドの予測されるｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ構造に隣接する５’配列及び隣接する３’配列を有する。好ましくは、ｍｉＲＮＡスキャホールドに含まれるｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ由来隣接配列（５’及び３’）は、同じ天然に存在するｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列に由来する。好ましくは、ｍｉＲＮＡスキャホールドに含まれるｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ並びに／又はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ由来隣接配列（５’及び３’）並びに／又はループ配列は、同じ天然に存在するｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ配列に由来する、例えば、ｍｉＲ４５１由来スキャホールドについての表５に示され、列挙されるとおり。内在性ｍｉＲＮＡ配列に含まれる（推定）ガイド鎖ＲＮＡが第１のＲＮＡ配列を含む（又はそれからなる）配列によって置き換えられることから、パッセンジャー鎖配列は、第２のＲＮＡ配列を含む（又はそれからなる）配列によって置き換えることができ、内在性配列のｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ又はｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ配列の隣接配列及び／又はループ配列が、スキャホールドｍｉＲＮＡ配列の予測構造（例えばＭ－ｆｏｌｆ予測構造）が内在性ｍｉＲＮＡ配列の予測構造と同じであるようなマイナーな配列修飾を含み得ることは理解される。

２本鎖ＲＮＡを形成できる本発明の第１の及び第２のＲＮＡ配列は、発現カセットによって好ましくはコードされる。２本鎖ＲＮＡが例えば、２本のＲＮＡ鎖からなるｓｉＲＮＡである場合、２個の発現カセットが必要である場合があることは理解される。１つは第１のＲＮＡ配列を含むＲＮＡ鎖をコードし、もう１つのカセットは第２のＲＮＡ鎖を含むＲＮＡ鎖をコードする。２本鎖ＲＮＡが、例えばｓｈＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡをコードする単一のＲＮＡ分子中に含まれる場合、１個の発現カセットで十分である場合がある。ｐｏｌ ＩＩ発現カセットは、プロモーター配列、発現されるＲＮＡをコードする配列に続いてポリアデニル化配列を含み得る。例えばｐｒｉ－ｍｉＲＮＡスキャホールドに含まれる場合、発現される２本鎖ＲＮＡは、イントロン配列及びエクソン配列並びに５’－ＵＴＲ及び３’－ＵＴＲをコードする場合がある。ｐｏｌ ＩＩＩ発現カセットは、プロモーター配列に続いて、ＲＮＡ（例えばｓｈＲＮＡ配列、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ又は、例えばｓｉＲＮＡ若しくは拡張されたｓｉＲＮＡに含まれる２本鎖ＲＮＡの１本の鎖）をコードする配列及び続いて、例えばポリＴ配列を一般に含み得る。ｐｏｌ Ｉ発現カセットは、ｐｏｌ Ｉプロモーターに続いて、配列をコードするＲＮＡ及び３’－ボックスを含み得る。２本鎖ＲＮＡのための発現カセットは、当技術分野において周知であり、いずれの種類の発現カセットも十分であり得、例えば、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ｐｏｌ ＩＩプロモーター又はｐｏｌ Ｉプロモーターを使用できる（とりわけ、ｔｅｒ Ｂｒａｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２００８ Ｍａｒ；１６（３）：５５７～６４，Ｍａｃｚｕｇａ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｊｕｌ ２４；１２：４２）。

上記から明らかであるとおり、２本鎖ＲＮＡに含まれる第１の及び第２のＲＮＡ配列は、追加的ヌクレオチド及び／又はヌクレオチド配列を含有する場合がある。２本鎖ＲＮＡは、単一のＲＮＡ配列に含まれてもよい、又は２つの別々のＲＮＡ鎖に含まれてもよい。どのような設計が使用されても、第１の及び第２のＲＮＡ配列から、本発明の第１のＲＮＡ配列の全体又はその実質的な部分を含むアンチセンスＲＮＡ分子は、その作用を有するように、すなわち、例えばヒトＡＴＸＮ３遺伝子によってコードされるＲＮＡに含まれるＲＮＡ標的配列に対するＲＮＡｉを誘導するようにＲＩＳＣ複合体に組み込まれてＲＮＡｉ機構によってプロセシングされ得るように設計される。第１のＲＮＡ配列を、全体又はその実質的な部分を含む又はそれらからなる配列は、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子によってコードされるＲＮＡを配列特異的に標的化できる。そのため、２本鎖ＲＮＡがＲＮＡｉを誘導できる限り、このような２本鎖ＲＮＡは、本発明において検討される。一実施形態では、本発明による２本鎖ＲＮＡは、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡスキャホールド、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡスキャホールド、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡに含まれる。好ましくは、発現カセットによってコードされる第１の及び第２のＲＮＡ配列は、単一の転写物中に含有されるものである。発現された転写物が、続くプロセシング、すなわち切断において複数の別々のＲＮＡ分子にプロセシングされる単一の転写物を生じることは理解される。

実質的に相補的である第１の及び第２のヌクレオチド配列は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）－活性化タンパク質キナーゼ経路を介して自然免疫応答を引き起こし得ることから、３０個連続する塩基対又はこれより長い２本鎖ＲＮＡを好ましくは形成しない。これにより、２本鎖ＲＮＡは、３０個未満の連続した塩基対を好ましくは有する。好ましくはｐｒｅ－ｍｉＲＮＡスキャホールド、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡスキャホールド、ｓｈＲＮＡ又は本明細書に記載される第１の及び第２のＲＮＡ配列を含む本発明により設計されたなどのｓｉＲＮＡは、３０個連続する塩基対を含まない。

用語「相補的」は、本明細書において、水素結合により別の核酸配列に結合できる核酸配列のヌクレオチド、すなわち、塩基対合できるヌクレオチドと定義される。リボヌクレオチド、ＲＮＡの構成要素は、糖、リン酸及び、プリン（グアニン、アデニン）又はピリミジン（ウラシル、シトシン）のいずれかである塩基を含有するモノマー（ヌクレオチド）からなる。相補的ＲＮＡ鎖は、２本鎖ＲＮＡを形成する。２本鎖ＲＮＡは、２つの別々の相補的ＲＮＡ鎖から形成され得る、又は２本の相補的ＲＮＡ鎖は、１本のＲＮＡ鎖に含まれる場合がある。相補的ＲＮＡ鎖では、ヌクレオチドシトシンとグアニン（ＣとＧ）とは塩基対を形成でき、同様にグアニンとウラシル（ＧとＵ）及びウラシルとアデニン（ＵとＡ）とは、塩基対を形成できる。用語、実質的な相補性は、第１の及び第２のＲＮＡ配列が完全に相補的である、又は第１のＲＮＡ配列及び標的ＲＮＡ配列若しくはヒトＡＴＸＮ３遺伝子によってコードされるＲＮＡの配列が完全に相補的である必要がないことを意味する。

第１のＲＮＡ配列と標的ＲＮＡ配列との間の実質的な相補性は、好ましくは最大２個のミスマッチヌクレオチドにある、より好ましくは１つのミスマッチヌクレオチドを有する、最も好ましくはミスマッチを有さない。１つのミスマッチヌクレオチドが、標的ＲＮＡ配列と塩基対合した場合に第１のＲＮＡ配列の全長にわたって１個のヌクレオチドが標的ＲＮＡ配列と塩基対合しないことを意味することは理解される。ミスマッチを有さないことは、第１のＲＮＡ配列のすべてのヌクレオチドが標的ＲＮＡ配列と塩基対合することを意味し、２個のミスマッチを有することは、第１のＲＮＡ配列の２個のヌクレオチドが標的ＲＮＡ配列と塩基対合しないことを意味する。

第１のＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ配列に相補性である必要がない追加的ヌクレオチドを含む場合もあり、例えば２２ヌクレオチドより長い場合がある。このようなシナリオでは、実質的な相補性は、標的ＲＮＡ配列の全長にわたって決定される。言い換えると、第１のＲＮＡ配列が、その標的配列（すなわち、選択され、それについて第１のＲＮＡ配列が選択された標的配列）を含むＲＮＡと塩基対合する場合、実質的な相補性は、選択された標的ＲＮＡ配列の全長にわたって決定され得る。実施例セクションに示されるとおり、第１のＲＮＡ配列は、特定の標的ＲＮＡ配列に完全に相補的である２２ヌクレオチドの設計であり（表１を参照されたい）、ｍｉＲＮＡスキャホールドに組み込まれた。細胞中で発現されたｍｉＲＮＡスキャホールドのプロセシングにおいて、ＲＮＡ分子は、第１のＲＮＡ配列の一部又はすべて、スキャホールドのいくつかのヌクレオチド（すなわち、第２のＲＮＡ配列の一部）を保持しているいくつかのＲＮＡ分子を含んで細胞によって生成された。このような生成されたＲＮＡ分子の長さは、これにより、設計される第１のＲＮＡ配列長さを超えて拡張している。このような追加的ヌクレオチドは、実質的な相補性を決定する場合には、考慮されないことは理解される。マイクロＲＮＡ ４５１ａ（ｍｉＲｂａｓｅ参照番号ＭＩ０００１７２９並びに、実施例及びとりわけ国際公開第２０１１１３３８８９号に記載されるとおり）に基づくスキャホールドを使用して、実質的な相補性は、設計された第１のＲＮＡ配列を表す５’末端から開始して最初の２２ヌクレオチドにわたって決定される（例えば、表２を参照されたい）。これは、標的ＲＮＡ配列が、第１のＲＮＡ配列と塩基対合した場合に、その全長にわたってミスマッチを有さないか、１つ又は２つのミスマッチを有するかのいずれかであり得ることを意味する。

実施例セクションにおいて示されるとおり、長さ２２ヌクレオチドの第１のヌクレオチド配列を含むように設計された２本鎖ＲＮＡは、検査された。これらの第１のＲＮＡ配列は、ミスマッチを有さないように設計され、標的ＲＮＡ配列と完全に相補的であった。第１のヌクレオチド配列と標的ＲＮＡ配列との間に少数のミスマッチを有することは、しかし、本発明による２本鎖ＲＮＡがルシフェラーゼレポーターなどの標的ＲＮＡ配列を含む転写物、又は例えば標的ＲＮＡ配列を含む転写物の発現を低減できる限り、本発明により許容され得る。本実施形態では、第１のＲＮＡ配列と標的ＲＮＡ配列との間の実質的な相補性は、第１のＲＮＡ配列又はヒトＡＴＸＮ３遺伝子のＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ配列のいずれか短い方の全長にわたってミスマッチを有さない、１つ又は２つのミスマッチを有することにある。

前記のとおり、本発明におけるミスマッチは、第１のＲＮＡ配列のヌクレオチドがヒトＡＴＸＮ３遺伝子のＲＮＡによってコードされる標的ＲＮＡ配列と塩基対合しないことを意味する。塩基対合しないヌクレオチドは、ＡとＡ、ＧとＧ、ＣとＣ、ＵとＵ、ＡとＣ、ＣとＵ又はＡとＧである。ミスマッチは、ヌクレオチドの欠失又はヌクレオチドの挿入からも生じ得る。ミスマッチが第１のＲＮＡ配列中の欠失である場合、これは、第１のＲＮＡ配列の全長で比較した場合に、標的ＲＮＡ配列のヌクレオチドが第１のＲＮＡ配列と塩基対合しないことを意味する。塩基対合できるヌクレオチドは、Ａ－Ｕ、Ｇ－Ｃ及びＧ－Ｕである。Ｇ－Ｕ塩基対合は、Ｇ－Ｕゆらぎ又はゆらぎ塩基対とも称される。一実施形態では、第１のＲＮＡ配列と標的ＲＮＡ配列との間のＧ－Ｕ塩基対の数は、０個、１個若しくは２個又はこれより多い。これは、標的ＲＮＡ配列がある位置にＵを含む場合、第１のＲＮＡ配列は、Ｇ－Ｕ又はＡ－Ｕ塩基対を形成するように反対の位置にＡ又はＧのいずれかを含み得ることを意味する。これは、標的ＲＮＡ配列がある位置にＧを含む場合、第１のＲＮＡ配列は、Ｇ－Ｃ又はＧ－Ｕ塩基対を形成するように反対の位置にＣ又はＵのいずれかを含み得ることも意味する。

一実施形態では、第１のＲＮＡ配列と標的ＲＮＡ配列との間にミスマッチはなく、１つ又は複数のＧ－Ｕ塩基対は許容される。第１のＲＮＡ配列と標的ＲＮＡ配列との間にＧ－Ｕ塩基対はない、又は第１のＲＮＡ配列及び標的ＲＮＡ配列はＡ－Ｕ若しくはＧ－Ｃである塩基対だけを有する。好ましい実施形態では、第１のＲＮＡ配列と標的ＲＮＡ配列との間にＧ－Ｕ塩基対はなく、ミスマッチはない。本発明による２本鎖ＲＮＡの第１のＲＮＡ配列は、好ましくは標的ＲＮＡ配列に完全に相補的であり、かかる相補性は、Ｇ－Ｕ、Ｇ－Ｃ及びＡ－Ｕ塩基対からなる。本発明による２本鎖ＲＮＡの第１のＲＮＡ配列は、より好ましくは標的ＲＮＡ配列に完全に相補的であってよく、かかる相補性はＧ－Ｃ及びＡ－Ｕ塩基対からなる。

一実施形態では、第１のＲＮＡ配列及び標的ＲＮＡ配列は、塩基対合する少なくとも１５、１６、１７、１８又は１９ヌクレオチドを有する。好ましくは第１のＲＮＡ配列と標的ＲＮＡ配列とは実質的に相補的であり、かかる相補性は少なくとも１９塩基対を含む。別の実施形態では、第１のＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ配列の連続ヌクレオチドと塩基対合する少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３又は１４個の連続するヌクレオチドを有する。別の実施形態では、第１のＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ配列の連続ヌクレオチドと塩基対合する少なくとも１９個の連続ヌクレオチドを有する。別の実施形態では、第１のＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ配列の１９個の連続するヌクレオチドと塩基対合する少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含む。さらに別の実施形態では、第１のＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ配列と塩基対合する少なくとも１７個のヌクレオチドを有し、標的ＲＮＡ配列の連続ヌクレオチドと塩基対合する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを有する。第１のヌクレオチドの配列長は、好ましくは最大２１、２２、２３、２４、２５、２６又は２７ヌクレオチドである。別の実施形態では、第１のＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ配列の２０個の連続するヌクレオチドと塩基対合する少なくとも２０個の連続するヌクレオチドを有する。別の実施形態では、第１のＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ配列の２１個の連続するヌクレオチドと塩基対合する少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含む。

前記のとおり、そのため第１のＲＮＡ配列は、遺伝子発現の十分な抑制をまだ可能にできるように第１のＲＮＡ配列と標的ＲＮＡ配列との間に完全な相補性（すなわち、完全な塩基対合（ミスマッチなし）及びＧ－Ｕ塩基対を有さない）を有することは必要でない場合がある。同様に、完全な相補性を有さないことは、例えば、標的ＲＮＡ配列を含む転写物の配列特異的阻害を維持する一方で、オフターゲットＲＮＡ配列特異的遺伝子抑制（第１のＲＮＡ配列を含むＲＮＡ鎖及び／又は第２のＲＮＡ配列を含むＲＮＡ鎖による）を回避又は低減するために検討され得る。しかし、さらに強力な阻害を生じ得ることから、完全な相補性を有することは好ましい場合がある。第１のＲＮＡ配列と標的ＲＮＡ配列との間に完全な相補性を有することは、その標的ＲＮＡ配列を切断するための前記第１のＲＮＡ配列（又はその実質的な部分）を含む、活性化ＲＩＳＣ複合体を可能にでき、一方ミスマッチを有することは、切断を妨害でき、及び翻訳の阻害を主に可能にでき、後者はあまり強力でない阻害をもたらし得る。

第２のＲＮＡ配列に関して、この第２のＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列と実質的に相補的である。第１のＲＮＡ配列と組み合わされた第２のＲＮＡ配列は、２本鎖ＲＮＡを形成する。前記のとおり、これは、第１のＲＮＡ配列由来のガイド配列が、例えば、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子によってコードされるその標的ＲＮＡの発現を配列特異的に阻害するようにＲＩＳＣ複合体に含まれるようなＲＮＡ干渉機構のために好適な基質を形成する。第２のＲＮＡ配列の配列は、標的ＲＮＡ配列に類似性を有する配列を有する。しかし、第２のＲＮＡ配列の第１のＲＮＡ配列との実質的な相補性は、第１のＲＮＡ配列と標的ＲＮＡ配列との間の実質的な相補性と比較して、低い実質的な相補性を有するように選択され得る。これにより、第２のＲＮＡ配列は、０、１、２、３、４又はこれより多いミスマッチ、０、１、２、３、４又はこれより多いＧ－Ｕゆらぎ塩基対を含む場合があり、０、１、２、３、４ヌクレオチドの挿入及び／又は０、１、２、３、４、ヌクレオチドの欠失を含む場合がある。好ましくは、第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列は、実質的に相補的であり、かかる相補性は０、１、２、３若しくは４個のＧ－Ｕ塩基対を含み、かつ／又は、かかる相補性は少なくとも１７塩基対を含む。これらのミスマッチ、Ｇ－Ｕゆらぎ塩基対、挿入及び欠失は、第１のＲＮＡ配列、すなわち第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間で形成される２本鎖領域に関する。第１の及び第２のＲＮＡ配列が、実質的に塩基対合でき、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子によってコードされるＲＮＡの配列特異的阻害を誘導することができる限り、このような実質的な相補性は、本発明により許容される。第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間の実質的な相補性が選択される２本鎖ＲＮＡ設計に依存する場合があることは、理解される。これは、例えば２本鎖ＲＮＡが組み込まれるように選択されたｍｉＲＮＡスキャホールドに依存する場合がある。

上記から明らかであるとおり、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列との間の実質的な相補性は、完全に相補性である（すなわち、完全に塩基対合する）第１の及び第２のＲＮＡ配列に対してミスマッチ、欠失及び／又は挿入を含み得る。一実施形態では、第１の及び第２のＲＮＡ配列は、少なくとも１１個の連続する塩基対を有する。このため、第１のＲＮＡ配列の少なくとも１１個の連続するヌクレオチドと第２のＲＮＡ配列の少なくとも１１個の連続するヌクレオチドとは、完全に相補的である。別の実施形態では、第１の及び第２のＲＮＡ配列は、塩基対合する少なくとも１５ヌクレオチドを有する。第１のＲＮＡ配列の少なくとも１５ヌクレオチドと、第２のＲＮＡ配列の少なくとも１５ヌクレオチドとの間の前記塩基対合は、Ｇ－Ｕ、Ｇ－Ｃ及びＡ－Ｕ塩基対からなってもよい、又はＧ－Ｃ及びＡ－Ｕ塩基対からなってもよい。別の実施形態では、第１の及び第２のＲＮＡ配列は、塩基対合する少なくとも１５ヌクレオチドを有し、少なくとも１１個の連続する塩基対を有する。別の実施形態では、第１のＲＮＡ配列と第２のＲＮＡ配列とは、実質的に相補的であり、ここでかかる相補性は、少なくとも１７塩基対を含む。前記１７塩基対は、好ましくは１７個の連続する塩基対であってよく、前記塩基対合は、Ｇ－Ｕ、Ｇ－Ｃ及びＡ－Ｕ塩基対からなる、又はＧ－Ｃ及びＡ－Ｕ塩基対からなる。

前記のとおり、本発明は、第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列をコードする発現カセットも提供し、ここで第１の及び第２のＲＮＡ配列は実質的に相補的であり、第１のＲＮＡ配列は少なくとも１９ヌクレオチドの長さの配列を有し、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子によってコードされるＲＮＡに含まれる標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的である。好ましくは、前記第１のＲＮＡ配列は、ＣＡＧリピート領域の５’であるヒトＡＴＸＮ３遺伝子によってコードされるＲＮＡの領域に含まれる標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的である、又は相補的である。好ましくは、前記標的ＲＮＡ配列は、細胞に存在する両方のヒトＡＴＸＮ３対立遺伝子によって発現される両方のＲＮＡ中に存在し、疾患と関連するＣＡＧ伸長を含むＲＮＡだけを低減する目的の選択的ノックダウンアプローチとは反対に、トータルノックダウンアプローチと称される。

好ましくは、標的化される配列は、配列番号２のヌクレオチド１～９４１に対応する領域中に見出される。配列番号２は、図１－１及び１－２に記されている。図１－１及び１－２に記される配列は、ＤＮＡ配列を表す。ＡＴＸＮ３遺伝子のスプライスされたｍＲＮＡをコードする前記ＤＮＡ配列、ＡＴＸＮ３遺伝子についての参照遺伝子配列は、配列番号１（すなわちＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００８１９８．２）によって提供される。この参照配列、すなわち配列番号１は、配列番号２のエクソン１～１０配列に対応するエクソン１～１０配列を含み、図１－１及び１－２に示されている、すなわち、エクソン１は、ｎｔｓ．５００１～５０９３に対応し；エクソン２はｎｔｓ．１４７８４～１４９４８に対応し；エクソン３はｎｔｓ．１５４８５～１５５２９に対応し；エクソン４はｎｔｓ．１７７９１～１７８７６に対応し；エクソン５はｎｔｓ．１８３０４～１８３７０に対応し；エクソン６はｎｔｓ．２２８０５～２２８９２に対応し；エクソン７はｎｔｓ．２８３６４～２８４９６に対応し；エクソン８はｎｔｓ．２９１５６～２９３２２に対応し；エクソン９はｎｔｓ．３０５６１～３０６５７に対応し；エクソン１０はｎｔｓ．４０５６９～４０６８７に対応し、ｎｔｓ．４７２０８～５３０７０に対応するエクソン１１の配列も含む。本明細書におけるいずれの箇所でも参照物は、ＤＮＡ配列に対応する又は含まれる配列を標的化するために作製され、前記標的化は、前記ＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡのものである、すなわち図１－１及び１－２に列挙される同じ配列及び配列番号２は、同じコードによって表されるが、Ｔの位置に代わりにＵを有することは理解される。

図１－１及び１－２に示される配列において、好ましい標的配列は、エクソン５、６、７、８及び９のうちの１つに含まれる標的配列に対応する。より好ましい標的配列は、エクソン６、７、８及び９のうちの１つに、又はさらにより好ましくはエクソン７、８、９のうちの１つに含まれる標的配列に対応する。エクソン５、６、７、６及び９の配列は、配列番号２のヌクレオチド３９０～４５６、４５７～５４４、５４５～６７７、６７８～８４４及び８４５～９４１にそれぞれ対応する。ＡＴＸＮ３転写物が、代替的スプライシングにより異なるエクソン組成を有し、それによりすべての転写物は、必ずしも同じエクソン組成を有するとは限らない、すなわち図１－１及び１－２に示される１つ又は複数のエクソンが失われている可能性がある、及び／又は代替的スプライス部位が使用される場合があることは理解される。しかし、図１－１及び１－２に示されるエクソン５、６、７、８及び９に対応する及び配列番号２のヌクレオチド３９０～９４１に対応する配列は、大部分のＡＴＸＮ３転写物に含まれている。

ＡＴＸＮ３転写バリアントは、わずかに異なるエクソン組成を有する場合があることから、標的配列がスプライスされたＡＴＸＮ３転写物のＣＡＧリピートからの３’に直接見出される５５０ヌクレオチドに含まれる限り、バリアント転写配列を標的化することも本発明により包含され、このような標的配列は、本発明により検討され得る。ＡＴＸＮ３転写バリアントがわずかに異なるエクソン組成物を有する場合があることから、標的配列が配列番号２のヌクレオチド３９０～４５６、４５７～５４４、５４５～６７７、６７８～８４４及び８４５～９４１にそれぞれ対応するエクソン５、６、７、６及び９のうちの１つ又は２つの配列に含まれる限り、バリアント転写配列を標的化することも本発明により包含され、このような標的配列も本発明により検討され得る。２つのエクソン配列が標的化される場合、これは、スプライスジャンクション（エクソンが連結される部位）にある標的配列を包含できることは、理解される。これは、実施例において示されるとおり、ＣＡＧリピートからの領域５’中にＡＴＸＮ３遺伝子発現を低減するために非常に効果的な標的配列が、見出されるためである。本発明における前記第１の及び第２のＲＮＡ配列は、細胞において発現されると、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子によってコードされるＲＮＡの発現を細胞核中及び細胞質中の両方で低減できる。標的ＲＮＡ配列は、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子から発現されるスプライスされた及びスプライスされていないＲＮＡに含まれるように選択され得る。これにより、好ましくは、ＡＴＸＮ３転写物は、配列番号１によってコードされるとおり、又は配列番号２によってコードされるとおり、配列番号２の３９０～４５６に対応する配列（図１－１及び１－２に示されるエクソン５）から配列番号２の８４５～９４１に対応する配列（図１－１及び１－２に示されるエクソン９）の範囲の配列に含まれる標的配列を選択することによって標的化される。この範囲中にエクソン５及びエクソン９配列が含まれることは理解される。ＡＴＸＮ３転写物は、配列番号１によってコードされる又は配列番号２によってコードされるとおり、配列番号２の４５７～５４４に対応する配列（図１－１及び１－２に示されるエクソン６）から配列番号２の８４５～９４１に対応する配列（図１－１及び１－２に示されるエクソン９）の範囲の配列に含まれる標的配列を選択することによってさらに標的化され得る。この範囲中にエクソン６及びエクソン９配列が含まれることは理解される。

一部の標的ＲＮＡ配列は、標的配列が近接するエクソン、例えば配列番号１０及び配列番号１１などに含まれることから、スプライスされたＲＮＡだけを標的化する場合がある。これにより、標的ＲＮＡ配列は、エクソン８～エクソン９のスプライスジャンクションに対応する配列番号２のヌクレオチド８２８～８６２、又はエクソン５～エクソン６のスプライスジャンクションに対応する配列番号２のヌクレオチド４３９～４７３に対応する配列を標的化するために選択され得る。好ましくは配列は、図１－１及び１－２に示されるエクソン５、６、８及び９に対応する配列に含まれて標的化される。このような配列は、エクソン５と６との間のスプライスジャンクション、及びエクソン８と９との間のスプライスジャンクションを含み得る。より好ましくは、標的ＲＮＡ配列は、図１－１及び１－２に示されるエクソン９の配列に含まれる。最も好ましくは、標的ＲＮＡ配列は、図１－１及び１－２に示される、エクソン８と９との間のスプライスジャンクションに含まれる。

したがって、好適である可能性がある標的ＲＮＡ配列は、下の表１に列挙されている。これにより一実施形態では、発現カセットは、第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列をコードして提供され、ここで第１の及び第２のＲＮＡ配列は実質的に相補的であり、第１のＲＮＡ配列は少なくとも１９ヌクレオチドの長さの配列を有し、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子によってコードされるＲＮＡ中に含まれ、表１に列挙される群から選択される標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的である。

選択された標的ＲＮＡ配列は、下の表１に好ましくは列挙されている。

これらの標的ＲＮＡ配列から、非常に有利で好適な第１の及び第２のＲＮＡ配列が、前記第１のＲＮＡ配列及び前記第２のＲＮＡ配列をコードする発現カセットであって、第１の及び第２のＲＮＡ配列が実質的に相補的であり、第１のＲＮＡ配列が少なくとも１９ヌクレオチドの長さの配列を有し、ＡＴＸＮ３遺伝子発現を低減するためにＲＮＡｉを非常に効率的に誘導する前記標的ＲＮＡ配列のうちの１つに実質的に相補的である、発現カセットを提供するために本発明により作製され得ることが驚くべきことに見出された。

実施例に示されるとおり、本発明の第１の及び第２のＲＮＡ配列は、マイクロＲＮＡ ４５１ａ由来のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ又はｐｒｉ－ｍｉＲＮＡスキャホールドに好ましくは組み込まれ得る。用語「マイクロＲＮＡ４５１ａ」、「ｍｉＲ４５１」、「４５１スキャホールド」又は単に「４５１」は、本明細書を通じて互換的に使用される。ｍｉＲ４５１についてのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡスキャホールドは、図２のａに示されている。このスキャホールドは、ガイド鎖誘導ＲＮＡ干渉だけを生じるＲＮＡ干渉を誘導することを可能にする。ｐｒｉ－ｍｉＲ４５１スキャホールドは、プロセシングが古典的なｍｉＲＮＡプロセシング経路と異なることから、パッセンジャー鎖を生じない（Ｃｈｅｌｏｕｆｉ ｅｔ ａｌ．，２０１０ Ｊｕｎ ３；４６５（７２９８）：５８４～９及びＹａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１０ Ａｕｇ ２４；１０７（３４）：１５１６３～８）。これにより、このスキャホールドは、パッセンジャー鎖による望ましくない潜在的なオフターゲットが、完全にではないが、大きく回避されることから、遺伝子治療産物を開発するための優秀な候補を示している。ｍｉＲ４５１スキャホールドへの代替として、同様のダイサー非依存構造は、本明細書の記載及びとりわけ、参照により本明細書に組み込まれるＨｅｒｒｅｒａ－Ｃａｒｒｉｌｌｏ ａｎｄ Ｂｅｒｋｈｏｕｔ，ＮＡＲ、２０１７、Ｖｏｌ．４５ Ｎｏ．１８ １０３６９～７９に記載されるとおり使用され得る。パッセンジャー鎖がオフターゲット化を生じ得ること、例えば、ＡＴＸＮ３ ＲＮＡ以外の転写物を標的化することから、このようなスキャホールドを使用することは、このような望ましくない標的化を回避することを可能にする。それにより、いずれのスキャホールドが選択されても、５％未満のパッセンジャー鎖、より好ましくは４％未満、最も好ましくは３％未満のパッセンジャー鎖を産生するスキャホールドが選択されることは好ましい。第２のＲＮＡ配列由来の少なくとも１６ヌクレオチドの配列を含むＲＮＡスキャホールドから産生される鎖の総量を決定し、それを、例えば実施例セクションにおいて記載されるヒト神経細胞で産生される第２のＲＮＡ配列及び第１のＲＮＡ配列由来の少なくとも１６ヌクレオチドの配列を含む前記ＲＮＡスキャホールドから産生される鎖の総量で割ることによってパッセンジャー鎖の百分率は算出される。

実施例に示されるとおり、長さ２２ヌクレオチドの第１のＲＮＡ配列（例えば、ｍｉＲ４５１について）は、選択され、ｍｉＲＮＡスキャホールドに組み込まれ得る。このようなｍｉＲＮＡスキャホールド配列は、細胞に存在するＲＮＡｉ機構によって次にプロセシングされる。ｍｉＲＮＡスキャホールドを参照する場合、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ構造又はｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ構造を含むことは理解される。実施例に示されるとおり、神経細胞においてプロセシングされる場合、このようなｍｉＲＮＡスキャホールドは、第１のＲＮＡ配列又はその実質的な部分を４５１スキャホールドについて長さ２１～３０ヌクレオチドの範囲で含むガイド配列を生じる。このようなガイド鎖は、選択された標的配列を標的化することによってヒトＡＴＸＮ３遺伝子発現を低減することができる。上記から明らかである及び実施例に示されるとおり、本発明の発現カセットによってコードされる第１のＲＮＡ配列は、細胞のＲＮＡｉ機構によってプロセシングされた場合に一部又は全体がガイド鎖に含まれる。それにより、発現カセットによってコードされるＲＮＡから生成され、第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列を含むガイド鎖は、第１のＲＮＡ配列の少なくとも１８ヌクレオチドを含む。好ましくは、このようなガイド鎖は、少なくとも１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド又は少なくとも２２ヌクレオチド含む。ガイド鎖は、第１のＲＮＡ配列を全体でも含み得る。例えば、ヒトなどに天然に存在するｍｉＲＮＡスキャホールドからｍｉＲＮＡスキャホールドを選択する場合、第１のＲＮＡ配列は、元のガイド鎖を置き換えるように選択されてもよい。実施例セクションにおいて示されるとおり、これが必ずしも必要でないことは、このような人工スキャホールドから産生されるガイド鎖が、選択された第１のＲＮＡ配列と長さが同一である、又は第１のＲＮＡ配列が産生されるガイド鎖にその全体で見出される必要がない場合があることを意味する。

実施例に示されるとおり、並びに図２のａ及び図８に示されるとおり、ｍｉＲＮＡ４５１スキャホールドは、好ましくは５’から３’に、最初に５’－ＣＵＵＧＧＧＡＡＵＧＧＣＡＡＧＧ－３’（配列番号５０）、続いて第１のＲＮＡ配列を含む又はそれからなる２２ヌクレオチドの配列、続いて２２ヌクレオチドの前記配列のヌクレオチド２～１８とその全長にわたって相補的である第２のＲＮＡ配列であると考えられ得る１７ヌクレオチドの配列、次に続いて配列５’－ＣＵＣＵＵＧＣＵＡＵＡＣＣＣＡＧＡ－３’（配列番号．５１）を含む。好ましくは後者の配列の最初の５’－Ｃヌクレオチドは、第１のＲＮＡ配列の第１のヌクレオチドと塩基対合しない。このようなスキャホールドは、元のｐｒｉ－ｍｉＲ４５１スキャホールドに見出される隣接配列をさらに含み得る。代替的に隣接配列、５’－ＣＵＵＧＧＧＡＡＵＧＧＣＡＡＧＧ’－３’及び５’－ＣＵＣＵＵＧＣＵＡＵＡＣＣＣＡＧＡ－３’は、他のｐｒｉ－ｍＲＮＡ構造の隣接配列によって置き換えられ得る。ｍｉＲ４５１スキャホールドがステム配列の長さによってだけガイド鎖を提供できることから、代替的隣接配列が１７個の連続塩基対のステム長を拡張しないことは好ましいことは理解される。上記から明らかであるとおり、スキャホールドの配列は、野生型スキャホールド（図２のａ）に存在する（推定）ガイド鎖配列及びそれに相補的な配列に関して異なるだけでなく、５’配列、ループ配列及び３’配列に追加的変異も含む場合があり、追加的変異は、野生型スキャホールドの二次構造を模倣するように予測されるＲＮＡ構造を提供するために必要である場合がある、及び／又は１７個の連続する塩基対を越えて拡張するステムを有さない。このようなスキャホールドは、例えば５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ並びにポリＡを含む、さらに大きなＲＮＡ転写物、例えばｐｏｌ ＩＩ発現転写物を含み得る。隣接構造は、非存在である場合もある。それにより本発明による発現カセットは、２２ヌクレオチドの配列を有するｓｈＲＮＡ様構造を発現し、第１のＲＮＡ配列を含む又はそれからなり、２２ヌクレオチドの前記配列のヌクレオチド２～１８の全長にわたって相補的である第２のＲＮＡ配列であると考えられる１７ヌクレオチドの配列が続き、第１のＲＮＡ配列と塩基対を形成しないと予測される１個又は複数個の追加的ヌクレオチドをさらに含む。ｍｉＲ４５１スキャホールド由来の後者のｓｈＲＮＡ様構造は、ｍｉＲ４５１由来のｐｒｅ－ｍｉＲＮＡスキャホールドと称され得る。

別の実施形態では、本発明による発現カセットであって、前記第１のＲＮＡ配列が、配列番号９、１０、１１又は配列番号１３からなる群から選択される標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的である発現カセットは、提供される。実施例セクションにおいて示されるとおりこれらの特定の標的ＲＮＡ配列は、神経細胞などのヒト細胞におけるレポーター及び／又はＡＴＸＮ３発現の最も強力な阻害を提供することが見出された。好ましくは前記第１のＲＮＡ配列は、１９、２０、２１又は２２ヌクレオチドの長さを有する。より好ましくは前記第１のＲＮＡ配列は、前記第１のＲＮＡ標的配列とその全長にわたって完全に相補的である。最も好ましくは、前記第１のＲＮＡ配列は、１９、２０、２１又は２２ヌクレオチドの長さを有し、前記第１のＲＮＡ配列は、前記第１のＲＮＡ標的配列とその全長にわたって完全に相補的である。好ましくは、前記第１のＲＮＡ配列は、配列番号１４、１５、１６及び１７からなる群から選択される。

このような第１のＲＮＡ配列は、第２のＲＮＡ配列と組み合わされる。本明細書に記載のとおり、当業者は、細胞において発現された場合にＲＮＡ干渉を誘導できる第１の及び第２のＲＮＡ配列を提供するために好適な第２のＲＮＡ配列を設計及び選択することが十分できる。検討され得る好適な第２のＲＮＡ配列は、下の表３に列挙され得る。

前記第１のＲＮＡ配列は、実施例において示されるなどの好ましくはｍｉＲＮＡスキャホールドに、より好ましくはｍｉＲ４５１スキャホールドに含まれる。本発明における第１の及び第２のＲＮＡ配列を含む好適なスキャホールドは、下の表４及び５に列挙されるなどの配列であり得る。表４に列挙される配列は、さらなる配列を含む場合があり、表５に列挙されるなどのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡスキャホールドに含まれ得る。

上に記載されるこのような第１のＲＮＡ配列は、発現カセットに含まれ得る。このような第１のＲＮＡ配列は、発現カセットによってコードされるＲＮＡ構造に含まれ得る。上に記載されるこのような第１の及び第２のＲＮＡ配列は、発現カセットに含まれ得る。このような第１の及び第２のＲＮＡ配列は、発現カセットによってコードされるＲＮＡ構造に含まれ得る。

したがって、好ましくはＣＡＧ領域から５’の領域にあり、好ましくは表１に列挙されるなどの標的ＲＮＡ配列、より好ましくは配列番号９、１０、１１及び配列番号１３から選択される標的ＲＮＡ配列であり、上に記載される第１の及び第２のＲＮＡ配列を利用する標的ＲＮＡ配列を標的化することは、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子によってコードされるＲＮＡ転写物の発現を低減するために特に有用であることが見出された。

上に記載のとおり及び実施例に示されるとおり、これらの標的配列は、第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列をコードする発現カセットを利用するＲＮＡｉアプローチを介してＡＴＸＮ３遺伝子発現を低減するために特に好適であることが見出され、ここで第１の及び第２のＲＮＡ配列は実質的に相補的であり、第１のＲＮＡ配列は少なくとも１９ヌクレオチドの長さの配列を有し、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子によってコードされるＲＮＡに含まれる標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的である。

さらに、さらなる実施形態では、１つ又は複数の発現カセットは、標的ＲＮＡ配列の組合せ標的化のために提供される。そのため、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子転写物に含まれるＲＮＡ標的配列の組合せ標的化は、本発明において検討される。このような組合せ標的化は、さらに標的ＲＮＡ配列の単一標的と比較して、ＣＡＧ伸長を含有する転写物及びタンパク質を含む、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子転写物及び／又はアタキシン－３タンパク質の発現を低減するためである。ＲＮＡ標的配列の組合せ標的化は、例えば２つの別々の発現カセットを準備することによって得ることができる。代替的に及び好ましくは、ある発現カセットは、各標的について第２のＲＮＡ配列と組み合わせた第１のＲＮＡ配列をコードするように提供され、そのためこのような発現カセットは、２つの別々のガイド配列を提供するように細胞によってプロセシングされ得る少なくとも２つの別々の第１のＲＮＡ配列を含む単一のＲＮＡ転写物を発現し、それぞれ別のガイド配列は少なくとも２つの標的、すなわち第１の標的ＲＮＡ配列及び第２の標的ＲＮＡ配列のうちの１つを標的化する。このため一実施形態では、１つ又は複数の発現カセットは、配列番号９及び１０；配列番号９及び１１；配列番号９及び１３；配列番号１０及び１１；配列番号１０及び１３；配列番号１１及び１３の組合せ標的化のために準備される。別の実施形態では、１つ又は複数の発現カセットは、配列番号９、１０及び１１；配列番号９、１０及び１３；配列番号９、１１及び１３；配列番号１０、１１及び１３の組合せ標的化のために準備される。別の実施形態では、１つ又は複数の発現カセットは、配列番号９、１０、１１及び１３の組合せ標的化のために準備される。ヒトＡＴＸＮ３遺伝子転写物に含まれるＲＮＡ標的配列の組合せ標的化が、ＣＡＧ伸長を含有する転写物及びタンパク質を含む、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子転写物及び／又はアタキシン－３タンパク質の発現を低減できると予測されることから、標的ＲＮＡ配列の単一の標的化とさらに比較しても、このような組合せ標的化は、さらなる神経病態を減速する又は完全に停止することによって、冒されたヒト患者に顕著な利益を与え得る。

好ましくは、ＣＡＧプロモーターなどのｐｏｌ ＩＩプロモーター（とりわけ、Ｍｉｙａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ．７９（２）：２６９～７７；Ｎｉｗａ、Ｇｅｎｅ．１０８（２）：１９３～９）並びに例えば図２のｂ及び図７に示される、ＰＧＫプロモーター又はＣＭＶプロモーター（例えば、本明細書に参照により組み込まれる国際公開第２０１６１０２６６４号の図２に示されているなど）が使用される。神経細胞が疾患において冒されることから、神経細胞特異的な又は汎ニューロン（pan-neuronal）及び星状細胞特異的プロモーターを使用することは特に有用である場合がある。好適な神経細胞特異的プロモーターの例は、神経細胞特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、ヒトシナプシン１、ｃａＭＫキナーゼ及びチューブリンである（Ｈｉｏｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００７ Ｊｕｎ；１４（１１）：８７２～８２）。検討され得る他の好適なプロモーターは、誘導性又は抑制性プロモーター、すなわち宿主細胞がある特定の１つ又は複数の刺激に曝露される場合にだけ転写を開始する又はその逆のプロモーターである。

本発明による前記発現カセットは、例えばトランスフェクション法を使用して細胞に移行され得る。任意の好適な手段は、本発明による発現カセットを移行するために十分であり得る。好ましくは、上に記載されるヒトＡＴＸＮ３遺伝子の配列特異的阻害を誘導する２本鎖ＲＮＡの安定発現が達成され得るように、発現カセットを細胞に安定に移行する遺伝子治療ベクターが使用される。好適なベクターは、レンチウイルスベクター、レトロトランスポゾンベースベクター系又はＡＡＶベクターであり得る。例えばレンチウイルスベクターは、ＲＮＡゲノムを保有することから、細胞の形質導入後に、前記ＤＮＡ配列及び前記発現カセットが形成されるようにＲＮＡゲノムが前記発現カセットをコードすることは理解される。好ましくは、ＡＡＶなどのウイルスベクターは、使用される。使用され得る好ましいＡＡＶベクターは、血清型５のＡＡＶベクターである。血清型５のＡＡＶ（ＡＡＶ５とも称される）は、実施例において示されるとおり、ヒト神経細胞及びヒト星状細胞を形質導入するために特に有用である場合がある。したがって、ＡＡＶ５は、（ヒト誘導多能性幹細胞幹細胞由来）前頭部脳様神経細胞、ドーパミン作動性神経細胞、運動神経細胞及び星状細胞を含むＣＮＳのさまざまなヒト細胞型を効率的に形質導入でき、したがってＡＡＶ５は、ＳＣＡ３を含む神経生成的疾患を治療するためにＣＮＳに治療用遺伝子を送達するための好適なベクター候補である。特にＡＡＶ５は、本明細書に記載されるヒトＡＴＸＮ３を標的化するために使用され得る。目的の任意の発現カセットを含むＡＡＶベクターの産生は、例えば、その全体が本明細書に組み込まれる；国際公開第２００７／０４６７０３号、国際公開第２００７／１４８９７１号、国際公開第２００９／０１４４４５号、国際公開第２００９／１０４９６４号、国際公開第２０１１／１２２９５０号、国際公開第２０１３／０３６１１８号に十分に記載されている。

例えば、昆虫又は哺乳動物細胞株において産生されるＡＡＶベクターの産生のために本発明において使用され得るＡＡＶ配列は、任意のＡＡＶ血清型のゲノム由来であってもよい。一般にＡＡＶ血清型は、アミノ酸及び核酸レベルで顕著に相同なゲノム配列を有し、遺伝的機能の同一のセットを提供し、本質的に物理的及び機能的に等価であるビリオンを産生し、実際に同一の機構によって複製及びアセンブルされる。種々のＡＡＶ血清型のゲノム配列及びゲノム類似性の概要について、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８９７９０；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０１９０１；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０４３３０３；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０８５７１６；Ｃｈｌｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７、Ｊ．Ｖｉｒ．７１：６８２３～３３）；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．（１９８３，Ｊ．Ｖｉｒ．４５：５５５～６４）；Ｃｈｌｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９９，Ｊ．Ｖｉｒ．７３：１３０９～１３１９）；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８，Ｊ．Ｖｉｒ．７２：３０９～３１９）及びＷｕ ｅｔ ａｌ．（２０００，Ｊ．Ｖｉｒ．７４：８６３５～４７）を参照されたい。ＡＡＶ血清型１、２、３、４及び５は、本発明の文脈における使用のためのＡＡＶヌクレオチド配列の好ましい供給源である。好ましくは、本発明の文脈における使用のためのＡＡＶ ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、及び／又はＡＡＶ５由来である。同様にＲｅｐ５２、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ７８及び／又はＲｅｐ６８コード配列は、好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２及びＡＡＶ５由来である。しかし、本発明の文脈における使用のためのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質をコードする配列は、周知の４２の血清型のいずれかから、より好ましくはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８若しくはＡＡＶ９又は例えばカプシドシャッフリング技術によって得られた新たに開発されたＡＡＶ－様粒子から、及びＡＡＶカプシドライブラリーから得ることができる。ＡＡＶカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３からなり得るが、ＶＰ１及びＶＰ３からなってもよい。

別の実施形態では、宿主細胞は、本発明によるＤＮＡ配列又は発現カセットを含んで提供される。例えば、前記発現カセット又はＤＮＡ配列は、細菌に含有されるプラスミドに含まれ得る。前記発現カセット又はＤＮＡ配列は、例えばウイルスベクターを生じる産生細胞にも含まれ得る。前記発現カセットは、バキュロウイルスベクター中でも提供され得る。

実施例セクションにおいて示される、及び上に説明されるとおり、本発明による２本鎖ＲＮＡ、本発明によるＤＮＡ配列、本発明による発現カセット及び本発明による遺伝子治療ベクターは、医薬としての使用のため、特にＳＣＡ３の治療における医薬としての使用のためである。したがって、本発明による２本鎖ＲＮＡ、本発明によるＤＮＡ配列、本発明による発現カセット及び本発明による遺伝子治療ベクターは、医学的治療、特にＳＣＡ３の治療における使用のためである。さらに具体的には、ＳＣＡ３の治療における本発明による２本鎖ＲＮＡ、本発明によるＤＮＡ配列、本発明による発現カセット及び本発明による遺伝子治療ベクターの使用は、神経病態を遅延又は停止することが期待される。

一実施形態では、医学的治療における前記使用は、少なくとも５０％、より好ましくは、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％のＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの発現の低減（低下とも称される）を含む。ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの発現の６０％低減は、正常なＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ発現の４０％であるＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの発現を表すことは理解される。正常なＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ発現は、本発明における第１の及び第２のＲＮＡを発現していない細胞におけるＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ発現を表す。さらなる実施形態では、本発明による遺伝子治療ベクター（又は発現カセット）の前記使用は、少なくとも５０％、より好ましくは、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％のＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの発現の低減を含み、ここで前記低減は、ヒトｉＰＳＣ神経細胞において決定される。さらなる実施形態では、ヒトｉＰＳＣ神経細胞におけるＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ発現の低減は、実施例に記載されるように決定される。別の実施形態では、ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの低減は、実施例において記載されるように２９３Ｔ細胞において決定され、好ましくはＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの低減は、最高用量で約７５％以上で２９３Ｔ細胞において得られる。さらに別の実施形態では、ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ発現の前記低減は、実施例に示されるＦ５１２ ＳＣＡ３ノックインマウスモデルにおいてなどのｉｎ ｖｉｖｏで決定される。ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ発現の前記低減は、好ましくは、例えばＲＴ－ｑＰＣＲなどを使用して例えば決定されるＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ発現の低減を含む。ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ発現の前記低減は、好ましくは、脳幹及び／又は小脳においてである。

別の実施形態では、実施例セクションにおいて示されるとおり、医学的治療における前記使用は、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％のＡＴＸＮ３タンパク質発現の低減（低下とも称される）を含む。ＡＴＸＮ３タンパク質の発現の６０％低減は、正常なＡＴＸＮ３タンパク質発現の４０％であるＡＴＸＮ３タンパク質発現を表すことは理解される。前記低減は、可溶性及び不溶性凝集物の低減であり得るＡＴＸＮ３タンパク質凝集物の低減を提供できる。前記低減は、アタキシン－３核封入体の低減を提供できる。正常なＡＴＸＮ３タンパク質発現は、本発明における第１の及び第２のＲＮＡを発現しない細胞におけるＡＴＸＮ３タンパク質発現を表す。別の実施形態では、ＡＴＸＮ３タンパク質の前記低減は、約７５％の低減である実施例において記載されるなどの２９３Ｔ細胞において決定されるとおりである。別の実施形態では、ＡＴＸＮ３タンパク質発現の前記低減は、実施例に示されるＦ５１２ ＳＣＡ３ノックインマウスモデルにおいて決定されるとおりである。ＡＴＸＮ３タンパク質発現の前記低減は、好ましくは、時間分解蛍光エネルギー移動（ＴＲ－ＦＲＥＴ）イムノアッセイを使用して決定されるＡＴＸＮ３タンパク質発現の低減を含む（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ ＯＮＥ，Ａｐｒｉｌ ２０１３、Ｖｏｌ．８ Ｉｓｓｕｅ ４ ｅ６２０４３）。ＡＴＸＮ－３の前記低減、ＡＴＸＮ－３凝集物及び／又は核封入体の低減は、実施例セクションにおいて記載されるとおり、レンチウイルスベクター（変異体アタキシン－３（ａｔｘ３－７２Ｑ）をコードする）及びＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３の混合物を注射することを含むマウスモデルにおいて観察される低減でもあり得る。ＡＴＸＮ３タンパク質発現の前記低減は、好ましくは脳幹及び／又は小脳においてである。

前記のとおり、本発明における第１のＲＮＡ配列が、細胞によって発現され、続いてプロセシングされる場合に全体又はその実質的な部分で、ガイド鎖に含まれるものであることは理解される。別の実施形態では、本発明により、細胞において発現される場合に前記第１のＲＮＡ配列及び前記第２のＲＮＡ配列は、第１のＲＮＡ配列を含むガイド配列を産生するように細胞によってプロセシングされ、ここで前記ガイド配列は、細胞によって産生される総ｍｉＲＮＡ数の最大１５％を占める。より好ましくは、前記ガイド配列は、細胞によって産生される総ｍｉＲＮＡ含有量の最大１０％、より好ましくは最大８％、最も好ましくは最大６％を占める。前記ガイド配列は、例えば決定された配列と第１のＲＮＡ配列との配列同一性によって評価されて、第１のＲＮＡ配列を全体又はその実質的な部分を含んで細胞によって産生される配列を表している。総ｍｉＲＮＡ数は、第１のＲＮＡ配列を含む配列の数と併せた内在性ｍｉＲＮＡ配列を表す配列の数を参照する。第１のＲＮＡ配列を、全体又はその実質的な部分を含むガイド配列を表すハイスループット配列決定によって決定される配列の例は、下の表に示されている。第１のＲＮＡ配列由来ガイド配列の総ｍｉＲＮＡでの前記百分率は、ｉＰＳＣ細胞において好ましくは決定される。別の実施形態では、第１のＲＮＡ配列由来ガイド配列の総ｍｉＲＮＡでの前記百分率は、実施例に示されるとおりｉＰＳＣ細胞において決定される。ＣＮＳへの送達は、実質内注射を含み得る（Ｓａｍａｒａｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１７ Ａｐｒ；２４（４）：２５３～２６１）。前記実質内送達は、線条体内若しくは視床内（intrathalamic）注射又は例えば深部小脳核への注射を含む小脳内（intracerebellar）注射も含み得る。ベクターが小脳及び／又は脳幹などの疾患における患部に、これらのエリアへの脳脊髄液の拡散を介して達することができることから、前記ＣＮＳ送達は、冒されたＣＮＳ領域が有効に形質導入され得る脳脊髄液（ＣＳＦ）への送達も含み得る。

このような送達方法は、冒された神経細胞を標的化するように冒された脳幹及び／又は小脳を含むＣＮＳに遺伝子治療ベクターを送達する効率的な方法を表している。このような注射は、ＭＲＩガイド下注射（MRI-guided injection）を通じて好ましくは実行される。かかる治療の方法は、ＳＣＡ３を有するヒト対象に特に有用である。

ＣＮＳへの送達は、ＣＳＦ内投与を含み得る。ＣＳＦ内送達法は、冒された神経細胞を標的化するために、冒された脳幹及び／又は小脳を含むＣＮＳに遺伝子治療ベクターを送達するための効率的な方法を表している。さらなる実施形態ではＣＮＳ送達は、ベクターのくも膜下腔内注射（例えば、国際公開第２０１５０６０７２２号；Ｂａｉｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１８ Ｆｅｂ １５；９：１６０～１７１；）、大槽内（intra cisterna magna）注射及び／又は軟膜下注射（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ．２０１６ Ｊｕｌ １３；３：１６０４６．）も含み得る。ＣＮＳ送達は、脳室内（ＩＣＶ）又は線条体内注射も含み得る。好ましくは送達は、実質内注射を、このような送達経路が障害を誘発するリスクを有する場合があることから含まない。ＣＮＳ送達は、上に列挙されるＣＮＳ送達法のいずれか２つ以上の組合せも含み得る。例えば、くも膜下腔内又は軟膜下注射は、脳室内及び／又は大槽内注射と組み合わされ得る。くも膜下腔内又は軟膜下注射は、実質内注射とも組み合わされ得る。方法の前記組合せは、同時、すなわち同じ時又は連続的、すなわちある一定の時間間隔内であってもよい。かかる治療の方法は、ＳＣＡ３を有するヒト対象に特に有用である。脳幹が非常に複雑な構造を有することから、高いリスクを伴う場合があるこのエリアへの直接注射を必要とせずに、遺伝子治療ベクターがこのエリアに達することができるように、遺伝子治療ベクターをこの脳エリアの近（物理的に）近接に送達することも検討される。

ＳＣＡ３の治療は、疾患の兆候をまだ示していないＳＣＡ３を発症する遺伝的素因を有するヒト対象を含む、ＳＣＡ３を有するヒト対象に関することは理解される。これにより、ＳＣＡ３を用いたヒト対象の治療は、ＳＣＡ３に関連するＣＡＧ伸長を有するＡＴＸＮ３遺伝子を保有する任意のヒト対象の治療を含む。前記治療が伸長されたＣＡＧリピートを含有するＲＮＡ及び／又は、それから翻訳された伸長されたポリＱを含有するアタキシン－３タンパク質と関連する神経病態を減速及び／又は停止することを含むことが期待される。一実施形態では、前記治療は、ＳＣＡ３マウスモデルに関連する脳病変のサイズの低減を生じる。別の実施形態では、前記治療は、ＳＣＡ３に関連するＡＴＸＮ－３タンパク質凝集物の低減を生じる。これにより患者は、本発明による遺伝子治療ベクター及び／又は発現カセットを用いた治療から利益を得ることができ、運動障害の回復及び生存期間の延長を示し得る。

ＡＴＸＮ３の５’領域を標的化するｍｉＲＮＡの設計
本発明者らは、トータルサイレンシングアプローチのための標的部位を選択した（図１－１及び１－２を参照されたい）。選択した標的配列を、上の表１に列挙する。ｍｉＲＮＡスキャホールド中の内在性ガイド鎖配列を置き換えるために使用した第１のＲＮＡ配列は、標準的ワトソン－クリック塩基対合（Ｇ－Ｃ及びＡ－Ｕ）を有して、表１の標的配列に完全に相補的であった。配列をヒトｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ ｍｉＲ－４５１スキャホールド配列に組み込んだ。２００ｎｔ ５’及び３’隣接領域は含まれ、ｍｆｏｌｄプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｕｎａｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄ）を、図８に示すとおり、候補が二次構造にフォールドされるかどうかを決定するために標準的設定で使用した。予測される二次構造にフォールドされない場合、正しい構造がプログラムによってフォールドされるように、第１のＲＮＡ配列を適合することに関与していない配列を適合させた。次に、ＤＮＡ配列をコードする完全なスキャホールドをＧｅｎｅＡｒｔ遺伝子合成（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に発注し、次にニワトリβ－アクチン（ＣＡＧ）プロモーター（Ｉｎｏｖｉｏ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ、ＰＡ）に融合したＣＭＶ最初期エンハンサーを含有する発現ベクターにクローニングした、その例は、図７に示されている。

レポーター系でのｍｉＲ４５１スキャホールドコンストラクトのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ｍｉＡＴＸＮ３候補の有効性を検査するために、本発明者らは、ウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）遺伝子に融合した相補的ＡＴＸＮ３標的領域を保有するＬｕｃレポーターを設計した（図２のｃ）。標的配列を合成し（ＧｅｎｅＡｒｔ）、ｐｓｉＣＨＥＣＫ－２ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）遺伝子の３’ＵＴＲにクローニングした。ホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）遺伝子もこのベクターで発現され、内部標準の役割を果たした。０．１、１、１０及び１００ｎｇと増量したレポーター及びコンストラクトの同時トランスフェクションを、標準的培養及びトランスフェクション条件を使用し、製造者の説明書に従ってリポフェクタミンを使用して２９３Ｔ細胞において実行した。トランスフェクション４８時間後、細胞を室温で受動的溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）において溶解し、ＦＬ及びＲＬ活性をデュアル－ルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて可溶化物中で測定した。相対的ルシフェラーゼ活性をＲＬとＦＬとの間の活性の比として算出した。結果（図３）は、５’領域、特にこれを含んでエクソン５を含みエクソン１０を含まない、は最も効率的なノックダウンがこの領域（標的配列、配列番号９～１３）から得られたことから、ＡＴＸＮ３遺伝子発現の非常に効率的な標的化のための良好な領域であることを示している。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験－内在性アタキシン－３タンパク質のノックダウン
内在性に発現されるＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ及びアタキシン－３タンパク質をサイレンシングする能力をＨＥＫ２９３Ｔ細胞において検査した。配列番号９、１１及び１３を標的化するｍｉＡＴＸＮ３候補を、対照としてのＧＦＰ発現カセットと共にトランスフェクトした。タンパク質をトランスフェクション３日後に単離した。次に、ウエスタンブロットを実行した。ブロットされたタンパク質をアタキシン－３について染色し、α－チューブリンをローディング対照として使用した（図４のａ）。１００％に設定した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）対照と比較してアタキシン－３タンパク質レベルを測定した。一元配置ＡＮＯＶＡは、ＧＦＰトランスフェクト細胞の発現と候補の発現との間に７５％までの低減を有して有意差を示した、Ｐ＜０．０００１（図４のｂ）。アタキシン－３については２つのバンドが見られ、両方のバンドは低減しており、異なる長さの対立遺伝子が標的化されたことを示している。

ＡＴＸＮ３ ｍｉＲＮＡを用いて形質導入した神経細胞培養物における用量依存的ＡＴＸＮ３低下
発現カセットをＡＡＶウイルスベクターゲノムに組み込んだ、続いて、ＡＡＶ５血清型に基づいて組換えウイルスベクターを昆虫細胞バキュロウイルスに基づく製造及び親和性クロマトグラフィー及びろ過法が挙げられるクロマトグラフィー法を利用する標準的下流プロセシングを使用して産生した（Ｌｕｂｅｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ，２０１５，Ｗｅｉｈｏｎｇ Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４，ＡＶＢ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｒｅｆ．２８－９２０７－５４ ＡＢ）。次に、これらのウイルスベクターは、（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ＳＭ、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００９）に記載されるＳＭＡＤシグナル伝達の二重阻害によってｉＰＳＣ（人工多能性幹細胞）由来前脳様神経細胞を形質導入するために使用した。投与量を増加させたＡＡＶベクター（１０ｅｘｐ１１、１０ｅｘｐ １２、１０ｅｘｐ １３、ゲノムコピーはｑＰＣＲを用いて決定）を神経細胞３＊１０^５個を含む各ウエルに加えた。明らかな用量応答が、配列番号９、１１及び１３を標的化した場合に、ｍｉＲＮＡ発現レベル及びＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡのノックダウンの両方について観察された（それぞれ、図５のａ及び５のｂ）。約６５％のＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの低減が観察された。内在性ＡＴＸＮ３遺伝子発現のノックダウンを評価することに加えて、これらのｉＰＳＣ由来神経細胞において発現されたｍｉＲＮＡスキャホールドのプロセシングをハイスループット低分子ＲＮＡ配列決定を使用して評価した。配列番号９、１１及び１３を標的化するｍｉＲＮＡは、形質導入されたｉＰＳＣ神経細胞において高度に発現された。総ｍｉＲＮＡ数の内、０．００３％から５．７％を成熟配列標的化ＡＴＸＮ３にアラインした。下の表６～８に列挙される配列は、形質導入された神経細胞培養物からの低分子ＲＮＡ配列決定によって決定された最も多い読み取りデータを示している。表６～８に列挙されている配列はＤＮＡ配列を表している一方で、これらの配列は、細胞によってプロセシングされたｍｉＲＮＡスキャホールド（とりわけ図２のａ及び８に示されているなど）由来のＲＮＡ配列を表していることに注目されたい（すなわちＴがＵである）。

細胞のＲＮＡｉ機構によってプロセシングされたＲＮＡ分子が長さ２１～３０ヌクレオチドの範囲であるＲＮＡ分子を産生することは注目される。２２ヌクレオチドを越えて拡張されるＲＮＡ分子は、第２のＲＮＡ配列を表す配列由来である最大８ヌクレオチドを含む。配列番号１１を標的化する４個の最も主要な分子種のものであるＲＮＡ分子について、３個は標的配列（すなわち、配列番号３５、３７及び３８）に１００％相補的である一方で、配列番号３６は１個のミスマッチをＲＮＡ配列の５’末端に有し、４個の最も主要な分子種は２１～２４ヌクレオチドの範囲の長さを有し、スキャホールドから産生されるＲＮＡ分子種の９０％までとなっていることはさらに注目される。プロセシングに基づいて、選択される好ましい標的ＲＮＡは、配列番号１１であってよく、そのために好ましくはｍｉＲ４５１に基づくｍｉＲＮＡスキャホールドは、配列番号２４若しくは配列番号２８など、又は配列番号４９によってコードされる配列を有して有用であり得る。

ＳＣＡ３のｉｎ ｖｉｖｏ低下
最も好ましいＲＮＡ標的配列のｉｎ ｖｉｖｏ活性を検査するために、ノックインマウスモデルにおいて、ＡＡＶベース遺伝子送達を検査した。使用したマウスモデルは新規Ｆ５１２ ＳＣＡ３ノックインマウスモデルであった。このマウスモデルでは、ＣＡＧ伸長は、内在性マウスＡｔｘｎ３遺伝子に挿入した。このモデルは、マウス（ＣＡＧ）６を切断し、次に、断続的なリピートを含む（ＣＡＡＣＡＧＣＡＧ）４８ドナーベクターを用いた続く相同組換えによって亜鉛フィンガー技術を使用して生成した。Ｆ５１２ ＳＣＡ３ノックインマウスモデルは、２３３グルタミンリピートを含む変異体アタキシン－３タンパク質を発現するように特徴付けた。このモデルは、配列番号９、１１及び１３のヒト配列を少なくとも表す標的配列を含有する。このモデルで配列番号１１に対応する内在性標的配列が、第１のＲＮＡ配列、配列番号１６にミスマッチを含有し、前記ミスマッチが配列番号１１の１位でのＡからＣを表す、ことは注目される。

ウイルスベクターをＦ５１２ ＳＣＡ３ノックインマウスの深部小脳核、ＩＣＶ又は大槽内に注射した（図６）。配列番号９、１１及び１３を標的化するＲＮＡ分子あたり動物３匹を使用した。６週間の生存後、動物を屠殺し、脳を精査した。ｇｃコピー数並びに小脳、脳幹及び皮質におけるＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの量を決定した。一貫して、形質導入レベルは同様であり、ＡＴＸＮ３低下は、異なる群間でも一致した。マウスにおいて産生されるヒト配列、配列番号１１を標的化する推定ガイド鎖が、そのマウスＡＴＸＮ３にミスマッチを有し、完全な相補性を有することがアタキシン－３をさらに低下させると予測されることから、観察されたＡＴＸＮ３低下は過小評価される場合があることは記される。このためこれらの結果に基づいて、ヒトにおいて配列番号９、１０、１１及び１３を標的化することは、ＡＴＸＮ３の十分な低下を生じることが予測される一方で、ヒトにおいて配列番号１１を標的化することが最も強い低下を生じることが予測される。

配列番号９、１１及び１３を標的化するＡＡＶのｉｎ ｖｉｖｏ投与のさらなる結果は、図９に示されている。前記のとおり、ＡＡＶを３つの異なる注射経路を介してＦ５１２ ＳＣＡ３マウスに注射した：ＩＣＶ、大槽内又はＤＣＮ中（図９のＡ）。注射は、配列番号９、１１又は１３を標的化するＲＮＡ（すなわち、ＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３＿９、ＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３＿１１、ＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３＿１３）を含むウイルスベクターを用いて実施し、ＡＡＶ５－ＧＦＰを対照として伴った。ゲノムＤＮＡあたりに検出されたｇｃの量を各投与経路について皮質、小脳及び脳幹において決定した。ＩＣＶ投与は、３つすべての分析された脳領域への比較的低いベクターコピー分布を生じた。小脳及び脳幹と比較して、高い形質導入が皮質において観察された（図９のＢ）。大槽への投与は、皮質の低い形質導入を生じたが、脳幹及び小脳の強い形質導入を生じた（図９のＣ）。最も高い形質導入は、ゲノムコピー２．９×１０^７個（ｇｃ）／μｇ組織ＤＮＡに至って脳幹において検出された。ＤＣＮへの直接注射も小脳及び脳幹の比較的高い形質導入を生じた。大槽投与と比較して、ＤＣＮ注射は、小脳の良好な形質導入及び脳幹の少ない形質導入を生じた（図９のＤ）。最新の観察に基づいて、３つすべての投与経路は、脳の形質導入を生じたが、大槽への投与がマウスの小脳及び脳幹の両方の最も高い組合せ形質導入をもたらした。患者において小脳及び脳幹は、主に冒される領域である。

Ｆ５１２マウスにおけるｍｉＡＴＸＮ３発現及び変異体アタキシン－３のサイレンシングをさらに分析した。ＤＣＮへの直接注射は、小脳における成熟ｍｉＡＴＸＮ３の最も高い発現を示した（図１０のＡ）。ｍｉＡＴＸＮ３＿１１は、最も高いマイクロＲＮＡ発現を示した。マイクロＲＮＡ発現は、小脳においてｍｉＡＴＸＮ３＿１１及びｍｉＡＴＸＮ３＿１３によるＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの顕著な低減（約１５～２０％）と良好に相関した（図１０のＢ）。大槽への投与は、ＤＣＮ注射と比較して小脳における低い成熟マイクロＲＮＡ発現を生じた（図１０のＣ）。それにも関わらず、ｍｉＡＴＸＮ３＿１１が最良に発現され、小脳におけるＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの顕著な低下（約１５％）を生じた（図１０のＤ）。３つすべての送達経路から最も高いマイクロ発現及びサイレンシング効果は、大槽での投与後に脳幹において観察された（図１０のＥ～Ｆ）。ｍｉＡＴＸＮ３候補の発現は、脳幹において高く、すべてが約４０％のＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡの強い低減をもたらした。ＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３＿１１及びＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３＿１３の両方は、脳幹において同等の有効性を有した。大槽へのＡＡＶ５＿ｍｉＡＴＸＮ３＿１１は、ＳＣＡ３患者において冒される主なエリアである小脳及び脳幹の両方においてＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡ低減を生じた。

ヒトＳＣＡ３遺伝子座の病理学的対立遺伝子を保有するトランスジェニックマウスにおけるコンストラクトのｉｎ ｖｉｖｏ試験
ヒトＭＪＤ１遺伝子座の病理学的対立遺伝子を保有するトランスジェニック（ｔｇ）マウスは記載されている（Ｃｅｍａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２００２（１１）１０７５～１０９４）。これらのｔｇマウスは、６４、６７、７２、７６及び８４リピートの長さのポリグルタミントラクトを有する病理学的対立遺伝子を含有している。対照として、野生型１５リピートを含有するｔｇマウスを作製した。これらの伸長された対立遺伝子を有するｔｇマウスが、軽度及びゆっくり進行する小脳の欠陥を実証することが示された。このモデルにおいて疾患重症度は、伸長されたタンパク質の発現レベル及びリピートのサイズと共に増加した。ヒト疾患の範囲の上限に伸長されたリピートを有するＴｇマウス、ＣＡＧ_８４（Ｑ８４、Ｔｇ（ＡＴＸＮ３＊）８４．２Ｃｃｅ／Ｔｇ（ＡＴＸＮ３＊）８４．２Ｃｃｅ）は、ＳＣＡ３のいくつかの重要な病理学的特徴を再現し、早期の発症、容易に定量化できる運動表現型を示す。対照的に、通常の長さのＣＡＧリピート（野生型ＣＡＧ_１５、Ｑ１５）を保有するｔｇマウスは、完全に正常と考えられた（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｌｅｂｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１３（２１）１９０９～１９１８；Ｃｏｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１３（２１）１８９８～１９０８）。

続く実験では、上に記載されるヒトＳＣＡ３疾患についてのトランスジェニックマウスモデルにおいてＡＡＶベース遺伝子送達を使用して、上に記載される最も好ましいＲＮＡ標的配列を検査する。本研究では、ホモ接合性Ｑ８４／Ｑ８４マウスを、ＡＴＸＮ３のＣＡＧリピート領域の５’のｍｉＲＮＡの標的化領域のＡＡＶベース送達後のヒトＡＴＸＮ３発現の選択的低減、運動機能の改善及び生存期間の延長に注目して研究する。

ＡＡＶ－ｍｉＡＴＸＮ３ベクターをおよそ２カ月齢のＴｇ（ＡＴＸＮ３＊）８４．２Ｃｃｅ／Ｔｇ（ＡＴＸＮ３＊）８４．２Ｃｃｅホモ接合性トランスジェニックＳＣＡ３マウスに注射する。１個のコホートを対照アームとして使用する。注射の経路は大槽中である。生存中は体重をモニターする。ビームウォーク及びオープンフィールド試験を、機能性改善の可能性を調査するために投薬前及び毎月の注射後に実施する。注射４～７カ月後、分子分析をＡＡＶ－ｍｉＡＴＸＮ３の生体内分布、生物学的活性及び治療有効性を評価するために実施する。重要な予測される発見は、続く変異体アタキシン－３凝集の軽減を伴うヒト変異体アタキシン－３の低下であり、神経変性の停止及び運動機能不全の改善である機能性改善を生じる。

第２の研究ではＴｇ（ＡＴＸＮ３＊）８４．２Ｃｃｅ／Ｔｇ（ＡＴＸＮ３＊）８４．２Ｃｃｅホモ接合性トランスジェニックＳＣＡ３マウスに上に記載のとおり注射し、生存期間分析のために使用する。重要な発見は、１回のＡＡＶ－ｍｉＡＴＸＮ３処置でのホモ接合性ＳＣＡ３マウスの生存期間中央値の増加が予測されることである。

全長ヒト変異体アタキシン－３をコードするレンチウイルスベクターの注射で変異体アタキシン－３を過剰発現するマウスにおけるコンストラクトのｉｎ ｖｉｖｏ試験
さらなる実験では、最も好ましいＲＮＡ標的配列を、ヒトＳＣＡ３疾患についての別のマウスモデルにおいてＡＡＶベース遺伝子送達を使用して、Ｎｏｂｒｅｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ ２０１３（１２）４４１～４５５に記載されるとおり検査する。簡潔には、マウス線条体におけるヒト変異体アタキシン－３のレンチウイルスベクターに基づく発現が限局性神経病理を誘導することが示された。このようなマウスは、本発明者らのＲＮＡｉアプローチの治療可能性を評価するための効率的なモデルを提供する。ＡＡＶ－ｍｉＡＴＸＮ３ウイルスは、レンチウイルスベクターを用いておよそ２カ月齢マウスに低、中及び高ＡＡＶ投与量（合計３コホート）で両側に同時注射する。もう１つのコホートにはレンチウイルスベクター及び対照を注射する。群のサイズは、１群あたりマウス８匹である。注射の経路及び領域は、定位固定両側性の線条体注射である。変異体アタキシン－３レベル及びＡＡＶゲノムコピーを決定する。同様に、変異体アタキシン－３凝集物及び免疫反応性のｄａｒｐｐ－３２減少の面積を定量する。重要な予測される発見は、変異体アタキシン－３凝集物軽減及び神経変性の予防である。

マウスにおける線条体ウイルス注射
注射は、以前記載のとおり実施した（Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，７３（５），６５５～６６６）。簡潔には、２カ月齢のマウスをアバチン（avertin）（１２μＬ／ｇ、ｉ．ｐ．）を用いて麻酔し、レンチウイルスベクター（変異体アタキシン－３（ａｔｘ３－７２Ｑ）をコードする）とＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３＿１１との混合物を線条体に定位的に注射した。座標：体軸方向：＋０．６ｍｍ；外側：±１．８ｍｍ；腹側：－３．３ｍｍ；トゥースバー（tooth bar）：０、これらの座標は、背腹側及び内側－外側構造を分ける線条体の中央を通じて通る内包、大線維トラクト（large fiber tract）に対応している。マウスは、各半球に１μＬのレンチウイルス（２００’０００ｎｇのｐ２４／ｍＬ）及び１μＬ ＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３からなる２μＬ注射、マウス１匹あたり合計２×１０^９から５×１０^１０ゲノムコピーを受けた。注射７週間後、マウスを形態学的及び神経化学的変化、並びに線条体でのアタキシン－３レベルの免疫組織化学分析のために殺した。

組織調製物
ケタミン／キシラジンの過剰投与後、マウスを冷ＰＢＳ１Ｘを用いて心臓内灌流した。次に脳を除去し、左及び右半球を分割した。右半球をその後、４％パラホルムアルデヒド中、７２時間、４℃で固定し、２５％ショ糖／ＰＢＳ１Ｘ中、４８時間、４℃でのインキュベーションによって凍結防止した。左半球では、線条体を切断し、ＲＮＡ／ＤＮＡ／タンパク質抽出のために－８０℃で保存した。各動物について、１２０個の２５μｍ冠状切片をクリオスタット（ＬＥＩＣＡ ＣＭ３０５０Ｓ、ドイツ）を使用して、－２０℃で右脳半球全体を切断した。次に個々の切片を回収し、４８ウエルプレートにおいて０．０５％アジ化ナトリウムを添加したＰＢＳ１Ｘ中、４℃で浮遊切片として保存した。

マウス線条体由来総ＲＮＡ及びタンパク質の精製
線条体の左部分をＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ）カラムを用いてホモジナイズした。ホモジナイズ後、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びタンパク質をオールプレップＤＮＡ／ＲＮＡ／プロテインキット（Ａｌｌ Ｐｒｅｐ ＤＮＡ／ＲＮＡ／Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｔ）（ＱＩＡＧＥＮ）を製造者の説明書に従って使用して単離した。線条体に加えた緩衝液ＲＬＴの初期体積は３５０μＬであった。ＲＮＡの総量をＮａｎｏｄｒｏｐ ２０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量し、純度を２６０及び２８０ｎｍでのＯＤの比を測定することによって評価した。タンパク質を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８ １％ＳＤＳ中の８Ｍ尿素溶液に溶解し、５０ｍＡで１パルス３秒間を用いて超音波処理した。総タンパク質抽出物を－８０℃で保存した。

ｃＤＮＡ合成及び定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
最初に、ＲＮＡ調製物中のゲノムＤＮＡ混入を回避するために、製造者の説明書に従ってＱｉａｇｅｎ ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅセット（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を使用して、ＤＮａｓｅ処理を先に実施した。次に、ｃＤＮＡをｉＳｃｒｉｐｔセレクトｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）を製造者の説明書に従って使用して浄化した総ＲＮＡの転換によって得た。逆転写反応後、混合物を－２０℃で保存した。定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）をＳｓｏＡｄｖａｎｃｅｄ ＳＹＢＲグリーンスーパーミックス（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＵＳＡ）を製造者の説明書に従って使用して実施した。簡潔には、ｑＰＣＲ反応をこの混合物１０μＬ、１０ｎｇのＤＮＡテンプレート並びにヒトアタキシン－３、マウスアタキシン－３及びマウスヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）に対する５００ｎＭの検証した特異的プライマーを含有する総体積２０μｌで実施した。ｑＰＣＲプロトコールは、変性プログラム（９５℃、３０秒間）で開始し、４０サイクルの２ステップ：９５℃、５秒間での変性及び５６℃、１０秒間でのアニーリング／伸長が続いた。サイクル閾値（Ｃｔ）をステップワンプラスソフトウェア（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ）によって自動的に決定した。各遺伝子について、標準曲線を得て、定量的ＰＣＲ効率をソフトウェアによって決定した。対照サンプルに対するｍＲＮＡ相対的定量をＰｆａｆｆｌ法（Ｐｆａｆｆ ｅｔ ａｌ．（２００１）ＮＡＲ、Ｍａｙ １、２９（９）：ｅ４５）によって決定した。

ウエスタンブロット
ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をタンパク質濃度を決定するために使用した。７０マイクログラムの線条体タンパク質抽出物をドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル（４％スタッキング及び１０％ランニング）に溶解した。次にタンパク質をフッ化ポリビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移行させ、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水中の０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０に溶解した５％脱脂粉乳を用いて１時間、室温でブロックした。次に膜を一晩、４℃で、一次抗体：マウス抗１Ｈ９（１：１０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及びマウス抗βアクチン（１：５０００）とインキュベートした。対応するアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウス二次抗体と２時間、室温でインキュベートした。結合をインキュベーション後にエンハンストケミフルオレッセンスサブストレイト（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて検出し、化学発光画像化法で可視化した（ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ Ｔｏｕｃｈ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。半定量的分析をイメージＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）を使用して走査した膜のバンドに基づいて実行し、同じゲルの対応するレーンにロードしたβ－アクチンの量に関して標準化した。

免疫組織化学
各動物について、切片間距離２００μｍで１６個及び１２個の冠状切片をＤＡＲＰＰ３２及び１Ｈ９（アタキシン－３）染色のためにそれぞれ選択した。手順は、０．１％フェニルヒドラジン（Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）含有ＰＢＳ中で切片を３０分間、３７℃でインキュベートすることによる内在性ペルオキシダーゼ阻害で開始した。続いて、組織ブロッキング及び透過処理をＰＢＳ中に調製した１０％ＮＧＳ（正常ヤギ血清、Ｇｉｂｃｏ）を含む０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００中で１時間、室温で実施した。次に切片を一晩、４℃で、適切な希釈率で（１：２０００）ブロッキング溶液中に予め調製した一次抗体ウサギ抗ＤＡＲＰＰ３２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）及びニワトリ抗１Ｈ９（ＨｅｎＢｉｏｔｅｃｈ）を用いてインキュベートした。３回洗浄後、脳薄片をブロッキング溶液中に希釈（１：２５０）した抗ウサギ又は抗ニワトリビオチン化二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と室温で、２時間インキュベートした。続いて、浮遊切片をリンスし、ベクタスタインＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて３０分間、室温で処理し、アビジン／ビオチン化ペルオキシダーゼ複合体の形成を誘導した。次いでシグナルを薄片をペルオキシダーゼ基質：３，３’－ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ基質キット、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートすることによって発色させた。最適な染色を達成した後に切片をＰＢＳ中で洗浄することによって反応を停止させた。続いて脳切片をゼラチンコートスライドにマウントし、エタノールを上昇させた系列（７５、９５及び１００％）中で脱水した、キシレンで透徹し、最後にＥｕｋｉｔｔマウンティングメディウム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してカバーガラスをかけた。

ＤＡＲＰＰ－３２枯渇領域の体積の評価
免疫組織化学に供する冠状脳切片の画像をＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１顕微鏡において得た。脳全体の画像をプランアポクロマート２０ｘ／０．８対物レンズを用いて取得した。線条体におけるＤＡＲＰＰ－３２減少の程度を線条体の完全な体軸方向での試料採取を得るために染色した切片（２００μｍ間隔の２５μｍ厚切片）のデジタル化によって分析した。ＤＡＲＰＰ－３２減少を算出するために、切片をＺｅｎソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）のタイルスフューチャー（tiles feature）を使用して画像化した。線条体の枯渇した面積を次の式を使用して概算した：体積＝ｄ（ａ１＋ａ２＋ａ３＋．．．）。式中、ｄは系列切片間の距離（２００μｍ）であり、ａ１、ａ２、ａ３は個々の系列切片についてのＤＡＲＰＰ－３２枯渇面積である。

アタキシン－３凝集物の定量的分析（１Ｈ９染色）
免疫組織化学に供する冠状脳切片の画像をＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏ Ｓｃａｎ．Ｚ１顕微鏡において得た（２００μｍ間隔の２５μｍ厚切片）。脳全体の画像をプランアポクロマート２０ｘ／０．８対物レンズを用いて取得した。線条体の染色切片をすべての動物について同じ基準に従って選択した：すなわち、対照群において高いＤＡＲＰＰ－３２枯渇面積を有する切片を最初に同定し、その解剖学的位置をさらなる１Ｈ９陽性封入体定量のための１０個の切片の選択のための中心とした。自動画像分析ソフトウェア（Ｑｕｐａｔｈ）を使用してすべての線条体１Ｈ９陽性封入体を選択した切片において計数した。

統計解析
統計解析をＰｒｉｓｍ ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアを使用して実施した。データを平均±標準誤差（ＳＥＭ）として表し、外れ値をグラッブス検定（アルファ＝０．０５）に従って除いた。一元配置ＡＮＯＶＡ検定を多重比較のために使用した。パラメーター間の相関をピアソン相関係数に従って決定した。有意性を次の基準に従って決定した：ｐ＞０．０５＝有意でない（ｎｓ）；^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１ ^＊＊＊ｐ＜０．００１及び^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

結果
ＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３はレンチウイルスＳＣＡ３マウスモデルにおいて強いアタキシン－３ノックダウンを誘導する
ＡＡＶ５送達ｍｉＡＴＸＮ３のｉｎ ｖｉｖｏ作用強度を確認するために、両側線条体注射をマウスで実施した。ＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３＿１１を変異体アタキシン－３（７２Ｑ）をコードするレンチウイルスベクターと同時注射した。このレンチウイルスＳＣＡ３マウスモデルは、線条体全体に変異体アタキシン－３（７２Ｑ）の強い発現を示し、この脳構造における疾患のいくつかの分子的特徴を生じた（Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，７３（５），６５５～６６６）。マウスを注射後７週間経過観察し、この期間に体重へのＡＡＶの影響は観察されなかった、図１１Ａ。マウスの右線条体を、変異体アタキシン－３タンパク質の発現をＰＢＳ処置対照群におけるｑＰＣＲを通じて確認した分子分析のために使用した。対照的に、変異体アタキシン－３ ｍＲＮＡの強いノックダウンをｍｉＡＴＸＮ３処置動物において観察した。低用量（２×１０^９ｇｃ）のＡＡＶ５は、およそ５０％ＡＴＸＮ３ ｍＲＮＡノックダウンを生じ、一方中（１×１０^１０ｇｃ）及び高用量（２×１０^１０ｇｃ）は、ＡＴＸＮ３発現をほとんど完全に消失させた（図１１Ｂ）。注目すべきことに、内在性マウスＡＴＮＸ３ ＲＮＡは、標的配列中に１個だけのミスマッチを保有するにもかかわらず、ｍｉＡＴＸＮ３処置によって影響を受けなかった（図１３）。

ＳＣＡ３患者と同様に、本明細書において使用されるマウスモデルは、変異体アタキシン－３タンパク質の可溶性及び不溶性形態の両方を示した。高分子量凝集物が分離ゲル中に移動しないことから、ウエスタンブロット分析を通じて、アタキシン－３タンパク質のこれらの異なる状態は調査できる。ｍＲＮＡ結果によって予測されるとおり、可溶性及び不溶性アタキシン－３タンパク質の両方における用量依存的低減を観察した。注目すべきことに、推定的に毒性のアタキシン－３凝集物は、ｍｉＡＴＸＮ３処置によって完全に消失した（図１１Ｃ及びＤ）。追加的に、線条体における可溶性アタキシン－３タンパク質レベルは、低用量処置がおよそ５０％低減を生じ、高ｍｉＡＴＸＮ３用量がアタキシン－３タンパク質レベルを約９０％低減して、ｍＲＮＡレベルを密接に映していた。ｍＲＮＡ結果とは対照的に、内在性マウスアタキシン－３タンパク質のわずかな低減が高用量ｍｉＡＴＸＮ３処置後に観察された。併せて、これらの結果は、軽度のオフターゲット有効性だけを伴うｍｉＡＴＸＮ３のＡＴＸＮ３遺伝子に対する強い作用強度を示唆している。

アタキシン－３封入物の低減
本明細書において使用されるレンチウイルスＳＣＡ３マウスモデルは、持続的なアタキシン－３ ７１Ｑ発現の結果としてＳＣＡ３のいくつかの組織学的特性を発症する（Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，７３（５），６５５～６６６）。特に興味深いのは、発現カセットで形質導入されたエリアにおいて形成される特徴的なアタキシン－３封入物である（Ｐａｕｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｅｕｒｏｎ，１９（２），３３３～３４４；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，８（４），６６９～６７９）。これらのタンパク質封入物は、長いリピート長でのみ生じ、これらのマウスにおける疾患進行と相関する。
ウエスタンブロット分析で示されたのと同様に、ＳＣＡ３マウス脳の組織学的検査は、線条体全体のアタキシン－３封入物負荷の非常に強い低減を明らかにした（図１２－１のＡ及び図１２－２のＣ）。低用量ｍｉＡＴＸＮ３処置は、アタキシン－３封入物の数を約５０％まで低減した一方で、中及び高用量ｍｉＡＴＸＮ３において核封入体はほとんど検出できなかった。興味深いことに、低用量ｍｉＡＴＸＮ３を用いて処置されたマウスにおける封入物数は、この処置群では変異体アタキシン－３ ｍＲＮＡ及び総アタキシン－３タンパク質レベルにおける５０％低減と直接相関した。このことは、封入物の総数が変異体タンパク質の発現レベルによって密接に影響を受けることを示唆している。本明細書において使用されるレンチウイルスマウスモデルにおけるアタキシン－３発現レベルが、内在性アタキシン－３よりも少なくとも４倍高いことも述べられるべきである（Ａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８、Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，１７（１４），２０７１～２０８３；Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，７３（５），６５５～６６６）。それにより、本明細書において報告されるよりも実質的なノックダウンより少ない内在性発現レベルで、核アタキシン－３封入物の発生を予防するために十分であり得る。

神経機能障害のレスキュー
他のポリグルタミンタンパク質と同様に、変異体アタキシン－３は、経時的に、細胞性ストレス及び神経機能障害を誘発することが周知である（Ｅｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１４），Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，４９（３），１５１３～１５３１；Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ，２０１４，７０１７５８）。本発明者らは、ＳＣＡ３マウスにおいて神経機能障害の程度を評価するために線条体のドーパミンマーカーｄａｒｐｐ－３２に免疫染色を実施した。以前の報告と一致して（Ａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ，１７（１４），２０７１～２０８３；Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，７３（５），６５５～６６６）、ＰＢＳ処置ＳＣＡ３マウスは、線条体において平均約２＊１０^８μｍ^３のｄａｒｐｐ－３２枯渇領域を示した（図１２－１のＢ及び図１２－２のＤ）。低用量ｍｉＡＴＸＮ３処置は、統計的有意性に達しなかったが（ｐ＝０．１９）、ＰＢＳ処置動物の平均の半分のサイズであった平均病変サイズを生じた。対照的に、中及び高用量ｍｉＡＴＸＮ３を用いて処置した動物は、１匹を除いてすべての動物がいかなる観察可能なｄａｒｐｐ－３２枯渇エリアも表さなかったことからこの表現型において著しい改善を示した。本明細書において報告したようなポリグルタミン疾患の早期では、ｄａｒｐｐ－３２下方制御は、シナプスシグナル伝達欠損などの神経機能障害の発症を表すと考えられる（ｖａｎ Ｄｅｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，１１（１７），３７５１～３７５７）。さらにｄａｒｐｐ－３２は、電気生理学的及び転写応答の制御に関与し（Ｓｖｅｎｎｉｎｇｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｏｘｉｃｏｌ，４４，２６９～２９６）、神経細胞の健康を維持するためにこのタンパク質の発現を保持することの重要性をさらに強調している。

ＮＨＰにおけるコンストラクトのｉｎ ｖｉｖｏ試験
サイノモルガス・マカク（Cynomolgous macaques）に１ｋｇあたりゲノムコピーおよそ１×１０^１３～１×１０^１４個のＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３＿１１を大槽及び／又はくも膜下腔内注射した。ＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３＿１１の用量あたり合計３匹のサイノモルガス・マカクに、ＳＣＡ３－対照ＡＡＶ－ｍｉＲＮＡについて３匹に注射した。１～２か月後に生存している動物を屠殺し、分子分析を脳パンチ及び末梢器官にベクターゲノムコピー並びにアタキシン－３ ＲＮＡ及びタンパク質の低下を評価するために実施した。重要な発見は、急性毒性又はｍｉＡＴＸＮ３関連オフターゲット効果を伴わずに１回のＣＳＦ内投与後に４０％に至るアタキシン－３の低下であった（図１４）。

本発明者らのｍｉＡＴＸＮ３候補を用いて、本発明者らは、ＳＣＡ３ノックインマウスにおける変異体アタキシン－３の用量依存的低下及びＬＶ－ＳＣＡ３マウスにおける毒性アタキシン－３凝集の予防を示した。これらの低下は、中及び高用量のｍｉＡＴＸＮ３の両方でＬＶ－ＳＣＡ３マウス脳の神経病理の完全な予防を生じた。カニクイザル（cynomolgous）での中用量のＡＡＶ５－ｍｉＡＴＸＮ３の１回のくも膜下腔内の投与は、順調な形質導入、ｍｉＡＴＸＮ３発現及び続く、ＳＣＡ３によって最も影響を受ける脳エリアである深部小脳核における４０％に至る内在性アタキシン－３タンパク質低下を生じた。本発明者らの知る限りでは、これは、大型動物モデルにおけるＲＮＡｉ媒介アタキシン－３低下の最初の概念の実証である。ＳＣＡ３げっ歯類及び大型動物におけるこれらの結果は、ＡＡＶベースｍｉＡＴＸＮ３の疾患改変可能性を示している。

[実施形態］
１．第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列を含む２本鎖ＲＮＡをコードする発現カセットであって、
前記第１の及び第２のＲＮＡ配列は実質的に相補的であり、
前記第１のＲＮＡ配列は、少なくとも１９ヌクレオチドの長さの配列を有し、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子によってコードされるＲＮＡに含まれる標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的である、発現カセット。
２．前記標的ＲＮＡ配列が、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子の配列番号２のヌクレオチド９４２～１０６０に対応する配列によってコードされるＲＮＡ配列に対して５’の領域に含まれる、実施形態１に記載の発現カセット。
３．前記標的ＲＮＡ配列が、配列番号２の領域３９０～４５６及びそれから３’の配列によってコードされるＲＮＡ配列に含まれる、実施形態２に記載の発現カセット。
４．前記標的ＲＮＡ配列が、配列番号３～１３からなる群から、より好ましくは配列番号９～１３からなる群から選択される、実施形態２～３のいずれか１つに記載の発現カセット。
５．前記標的ＲＮＡ配列が配列番号１１である、実施形態１に記載の発現カセット。
６．前記第１及び第２のＲＮＡ配列がｐｒｅ－ｍｉＲＮＡスキャホールド、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡスキャホールド又はｓｈＲＮＡに含まれる、実施形態１～５のいずれか１つに記載の発現カセット。
７．前記ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡスキャホールド又は前記ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡスキャホールドがｍｉＲ４５１由来である、実施形態６に記載の発現カセット。
８．前記第１のＲＮＡ配列がガイド配列に含まれる、実施形態１～７のいずれか１つに記載の発現カセット。
９．細胞において発現された場合に、前記第１のＲＮＡ配列及び前記第２のＲＮＡ配列が、第１のＲＮＡ配列を含むガイド配列を産生するように細胞によってプロセシングされる、実施形態１～８のいずれか１つに記載の発現カセット。
１０．前記第１のＲＮＡ配列が、配列番号１４～１７からなる群から選択される、実施形態１～９のいずれか１つに記載の発現カセット。
１１．前記第２のＲＮＡ配列が、配列番号１８～２１からなる群から選択される、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の発現カセット。
１２．前記第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列が、配列番号１４及び１８；配列番号１５及び１９；配列番号１６及び２０；配列番号１７及び２１の組合せからなる群から選択される、実施形態１１に記載の発現カセット。
１３．前記コードされるＲＮＡが配列番号２２～２９からなる群から選択されるＲＮＡ配列を含む、実施形態１２に記載の発現カセット。
１４．前記第１のＲＮＡ配列及び前記第２のＲＮＡ配列をコードする前記核酸配列に作動可能に連結された、ＰＧＫプロモーター、ＣＭＶプロモーター、神経細胞特異的プロモーター、星状細胞特異的プロモーター又はＣＢＡプロモーターを含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の発現カセット。
１５．前記第１のＲＮＡ配列及び前記第２のＲＮＡ配列をコードする前記核酸配列に作動可能に連結された誘導性又は抑制性プロモーターを含む、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の発現カセット。
１６．実施形態１～１５のいずれか１つに記載の発現カセットを含む遺伝子治療ベクターであって、好ましくはＡＡＶベクターである、遺伝子治療ベクター。
１７．医学的治療における使用のための、実施形態１６に記載の遺伝子治療ベクター、又は実施形態１～１５のいずれか１つに記載の発現カセット。
１８．ＳＣＡ３／ＭＪＤの医学的治療における、実施形態１７に記載の使用。
１９．ＡＴＸＮ３遺伝子発現の少なくとも部分的なノックダウンを含む、好ましくはＡＴＸＮ３遺伝子発現のトータルノックダウンを含む、実施形態１７又は実施形態１８に記載の使用。
２０．ＡＴＸＮ３タンパク質発現の少なくとも５０％の低減を含む、実施形態１７～１９のいずれか１つに記載の使用。
２１．細胞において発現された場合に、前記第１のＲＮＡ配列及び前記第２のＲＮＡ配列が、第１のＲＮＡ配列を含むガイド配列を産生するように細胞によってプロセシングされ、
前記ガイド配列が、細胞によって産生される総ｍｉＲＮＡ数の最大１０％を占める、実施形態１７～２０のいずれか１つに記載の使用。
２２．脳幹及び／又は小脳におけるＡＴＸＮ３遺伝子発現のノックダウンを含む、実施形態１７～２１のいずれか１つに記載の使用。
２３．運動機能の改善及び／又は生存期間の延長を含む、実施形態１７～２２のいずれか１つに記載の使用。
２４．ヒト対象の医学的治療を含む、実施形態１７～２３のいずれか１つに記載の使用。

配列番号２
GAGAGGGGCAGGGGGCGGAGCTGGAGGGGGTGGTTCGGCGTGGGGGCCGTTGGCTCCAGACAAATAAACATGGAGTCCATCTTCCACGAGAAACAAGAAGGCTCACTTTGTGCTCAACATTGCCTGAATAACTTATTGCAAGGAGAATATTTTAGCCCTGTGGAATTATCCTCAATTGCACATCAGCTGGATGAGGAGGAGAGGATGAGAATGGCAGAAGGAGGAGTTACTAGTGAAGATTATCGCACGTTTTTACAGCAGCCTTCTGGAAATATGGATGACAGTGGTTTTTTCTCTATTCAGGTTATAAGCAATGCCTTGAAAGTTTGGGGTTTAGAACTAATCCTGTTCAACAGTCCAGAGTATCAGAGGCTCAGGATCGATCCTATAAATGAAAGATCATTTATATGCAATTATAAGGAACACTGGTTTACAGTTAGAAAATTAGGAAAACAGTGGTTTAACTTGAATTCTCTCTTGACGGGTCCAGAATTAATATCAGATACATATCTTGCACTTTTCTTGGCTCAATTACAACAGGAAGGTTATTCTATATTTGTCGTTAAGGGTGATCTGCCAGATTGCGAAGCTGACCAACTCCTGCAGATGATTAGGGTCCAACAGATGCATCGACCAAAACTTATTGGAGAAGAATTAGCACAACTAAAAGAGCAAAGAGTCCATAAAACAGACCTGGAACGAGTGTTAGAAGCAAATGATGGCTCAGGAATGTTAGACGAAGATGAGGAGGATTTGCAGAGGGCTCTGGCACTAAGTCGCCAAGAAATTGACATGGAAGATGAGGAAGCAGATCTCCGCAGGGCTATTCAGCTAAGTATGCAAGGTAGTTCCAGAAACATATCTCAAGATATGACACAGACATCAGGTACAAATCTTACTTCAGAAGAGCTTCGGAAGAGACGAGAAGCCTACTTTGAAAAACAGCAGCAAAAGCAGCAACAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGGGGGACCTATCAGGACAGAGTTCACATCCATGTGAAAGGCCAGCCACCAGTTCAGGAGCACTTGGGAGTGATCTAGGTGATGCTATGAGTGAAGAAGACATGCTTCAGGCAGCTGTGACCATGTCTTTAGAAACTGTCAGAAATGATTTGAAAACAGAAGGAAAAAAATAATACCTTTAAAAAATAATTTAGATATTCATACTTTCCAACATTATCCTGTGTGATTACAGCATAGGGTCCACTTTGGTAATGTGTCAAAGAGATGAGGAAATAAGACTTTTAGCGGTTTGCAAACAAAATGATGGGAAAGTGGAACAATGCGTCGGTTGTAGGACTAAATAATGATCTTCCAAATATTAGCCAAAGAGGCATTCAGCAATTAAAGACATTTAAAATAGTTTTCTAAATGTTTCTTTTTCTTTTTTGAGTGTGCAATATGTAACATGTCTAAAGTTAGGGCATTTTTCTTGGATCTTTTTGCAGACTAGCTAATTAGCTCTCGCCTCAGGCTTTTTCCATATAGTTTGTTTTCTTTTTCTGTCTTGTAGGTAAGTTGGCTCACATCATGTAATAGTGGCTTTCATTTCTTATTAACCAAATTAACCTTTCAGGAAAGTATCTCTACTTTCCTGATGTTGATAATAGTAATGGTTCTAGAAGGATGAACAGTTCTCCCTTCAACTGTATACCGTGTGCTCCAGTGTTTTCTTGTGTTGTTTTCTCTGATCACAACTTTTCTGCTACCTGGTTTTCATTATTTTCCCACAATTCTTTTGAAAGATGGTAATCTTTTCTGAGGTTTAGCGTTTTAAGCCCTACGATGGGATCATTATTTCATGACTGGTGCGTTCCTAAACTCTGAAATCAGCCTTGCACAAGTACTTGAGAATAAATGAGCATTTTTTAAAATGTGTGAGCATGTGCTTTCCCAGATGCTTTATGAATGTCTTTTCACTTATATCAAAACCTTACAGCTTTGTTGCAACCCCTTCTTCCTGCGCCTTATTTTTTCCTTTCTTCTCCAATTGAGAAAACTAGGAGAAGCATAGTATGCAGGCAAGTCTCCTTCTGTTAGAAGACTAAACATACGTACCCACCATGAATGTATGATACATGAAATTTGGCCTTCAATTTTAATAGCAGTTTTATTTTATTTTTTCTCCTATGACTGGAGCTTTGTGTTCTCTTTACAGTTGAGTCATGGAATGTAGGTGTCTGCTTCACATCTTTTAGTAGGTATAGCTTGTCAAAGATGGTGATCTGGAACATGAAAATAATTTACTAATGAAAATATGTTTAAATTTATACTGTGATTTGACACTTGCATCATGTTTAGATAGCTTAAGAACAATGGAAGTCACAGTACTTAGTGGATCTATAAATAAGAAAGTCCATAGTTTTGATAAATATTCTCTTTAATTGAGATGTACAGAGAGTTTCTTGCTGGGTCAATAGGATAGTATCATTTTGGTGAAAACCATGTCTCTGAAATTGATGTTTTAGTTTCAGTGTTCCCTATCCCTCATTCTCCATCTCCTTTTGAAGCTCTTTTGAATGTTGAATTGTTCATAAGCTAAAATCCAAGAAATTTCAGCTGACAACTTCGAAAATTATAATATGGTATATTGCCCTCCTGGTGTGTGGCTGCACACATTTTATCAGGGAAAGTTTTTTGATCTAGGATTTATTGCTAACTAACTGAAAAGAGAAGAAAAAATATCTTTTATTTATGATTATAAAATAGCTTTTTCTTCGATATAACAGATTTTTTAAGTCATTATTTTGTGCCAATCAGTTTTCTGAAGTTTCCCTTACACAAAAGGATAGCTTTATTTTAAAATCTAAAGTTTCTTTTAATAGTTAAAAATGTTTCAGAAGAATTATAAAACTTTAAAACTGCAAGGGATGTTGGAGTTTAGTACTACTCCCTCAAGATTTAAAAAGCTAAATATTTTAAGACTGAACATTTATGTTAATTATTACCAGTGTGTTTGTCATATTTTCCATGGATATTTGTTCATTACCTTTTTCCATTGAAAAGTTACATTAAACTTTTCATACACTTGAATTGATGAGCTACCTAATATAAAAATGAGAAAACCAATATGCATTTTAAAGTTTTAACTTTAGAGTTTATAAAGTTCATATATACCCTAGTTAAAGCACTTAAGAAAATATGGCATGTTTGACTTTTAGTTCCTAGAGAGTTTTTGTTTTTGTTTTTGTTTTTTTTTGAGACGGAGTCTTGCTATGTCTCCCAGGCTGGAGGGCAGTGGCATGATCTCGGCTCACTACAACTTCCACCTCCCGGGTTCAAGCAATTCTCCTGCCTCAGCCTCCAGAGTAGCTGGGATTACAGGCGCCCACCACCACACCCGGCAGATTTTTGTATTTTTGGTAGAGACGCGGTTTCATCATGTTTGGCCAGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTCAGGTGATCCGCCTGCCTTGGCCTCCCAAAGTGTTGGGATTACAGGCATGAGCCACTGCGCCTGGCCAGCTAGAGAGTTTTTAAAGCAGAGCTGAGCACACACTGGATGCGTTTGAATGTGTTTGTGTAGTTTGTTGTGAAATTGTTACATTTAGCAGGCAGATCCAGAAGCACTAGTGAACTGTCATCTTGGTGGGGTTGGCTTAAATTTAATTGACTGTTTAGATTCCATTTCTTAATTGATTGGCCAGTATGAAAAGATGCCAGTGCAAGTAACCATAGTATCAAAAAAGTTAAAAATTATTCAAAGCTATAGTTTATACATCAGGTACTGCCATTTACTGTAAACCACCTGCAAGAAAGTCAGGAACAACTAAATTCACAAGAACTGTCCTGCTAAGAAGTGTATTAAAGATTTCCATTTTGTTTTACTAATTGGGAACATCTTAATGTTTAATATTTAAACTATTGGTATCATTTTTCTAATGTATAATTTGTATTACTGGGATCAAGTATGTACAGTGGTGATGCTAGTAGAAGTTTAAGCCTTGGAAATACCACTTTCATATTTTCAGATGTCATGGATTTAATGAGTAATTTATGTTTTTAAAATTCAGAATAGTTAATCTCTGATCTAAAACCATCAATCTATGTTTTTTACGGTAATCATGTAAATATTTCAGTAATATAAACTGTTTGAAAAGGCTGCTGCAGGTAAACTCTATACTAGGATCTTGGCCAAATAATTTACAATTCACAGAATATTTTATTTAAGGTGGTGCTTTTTTTTTTTGTCCTTAAAACTTGATTTTTCTTAACTTTATTCATGATGCCAAAGTAAATGAGGAAAAAAACTCAAAACCAGTTGAGTATCATTGCAGACAAAACTACCAGTAGTCCATATTGTTTAATATTAAGTTGAATAAAATAAATTTTATTTCAGTCAGAGCCTAAATCACATTTTGATTGTCTGAATTTTTGATACTATTTTTAAAATCATGCTAGTGGCGGCTGGGCGTGGTAGCTCACGCCTGTAATCCCAGCATTTTGGGAGGCCGAAGTGGGTGGATCACGAGGTCGGGAGTTCGAGACCAGCTTGGCCAAAATGGTGAAACCCCATCTGTACTAAAAACTACAAAAATTAGCTGGGCGCGGTGGCAGGTGCCTGTAATCCCAGCTACCTGGGAGTCTGAGGCAGGAGAATTGCTTGAACCCTGGCGACAGAGGATGCAGTGAGCCAAGATGGTGCCACTGTACTCCAGACTGGGCGACAGAGTGAGACTCTGTCTCAAAAAAAAAAAAAAAATCATGCTAGTGCCAAGAGCTACTAAATTCTTAAAACCGGCCCATTGGACCTGTACAGATAAAAAATAGATTCAGTGCATAATCAAAATATGATAATTTTAAAATCTTAAGTAGAAAAATAAATCTTGATGTTTTAAATTCTTACGAGGATTCAATAGTTAATATTGATGATCTCCCGGCTGGGTGCAGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCAGTTCTGGAGGCTGAGGTGGGCGAATCACTTCAGGCCAGGAGTTCAAGACCAGTCTGGGCAACATGGTGAAACCTCGTTTCTACTAAAAATACAAAAATTAGCCGGGCGTGGTTGCACACACTTGTAATCCCAGCTACTCAGGAGGCTAAGAATCGCATGAGCCTAGGAGGCAGAGGTTGCAGAGTGCCAAGGGCTCACCACTGCATTCCAGCCTGCCCAACAGAGTGAGACACTGTTTCTGAAAAAAAAAAATATATATATATATATATATATGTGTGTATATATATATGTATATATATATGACTTCCTATTAAAAACTTTATCCCAGTCGGGGGCAGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAACACTTTGGGAGGCTGAGGCAGGTGGATCACCTGAAGTCCGGAGTTTGAGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAACCCCATCTCTACTAAAAATACAAAACTTAAGCCAGGTATGGTGGCGGGCACCTGTAATCCCAGTTACTTGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGTTTAAACCCAGGAGGTGGAGGTTGCAGTGAGCTGAGATCGTGCCATTGCACTCTAGCCTGGGCAACAAGAGTAAAACTCCATCTTAAAGGTTTGTTTGTTTTTTTTTAATCCGGAAACGAAGAGGCGTTGGGCCGCTATTTTCTTTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTTTTTTTTTTTCTGAGACGGAGTCTAGCTCTGCTGCCCAGGCTGGAGTACAATGACACGATGTTGGCTCACTGCAACCTCCACCTCCTGGGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTACCTGGGATTACAGGCACCTGCCACTACACCTGGCGAATATTTGTTTTTTTTAGTAGAGACGGGCTTTTACCATGTTAGGCTGGTCTCAAACTCCTGACCTCAGGTGATCTGCCTGCCTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGTGCAGGCCACCACACCCGGCCTTGGGCCACTGTTTTCAAAGTGAATTGTTTGTTGTATCGAGTCCTTAAGTATGGATATATATGTGACCCTAATTAAGAACTACCAGATTGGATCAACTAATCATGTCAGCAATGTAAATAACTTTATTTTTCATATTCAAAATAAAAACTTTCTTTTATTTCTGGCCCCTTTATAACCAGCATCTTTTTGCTTTAAAAAATGACCTGGCTTTGTATTTTTTTAGTCTTAAACATAATAAAAATATTTTTGTTCTAATTTGCTTTCATGAGTGAAGATTATTGACATCGTTGGTAAATTCTAGAATTTTGATTTTGTTTTTTAATTTGAAGAAAATCTTTGCTATTATTATTTTTTCCAAGTGGTCTGGCATTTTAAGAATTAGTGCTAATAACGTAACTTCTAAATTTGTCGTAATTGGCATGTTTAATAGCATATCAAAAAACATTTTAAGCCTGTGGATTCATAGACAAAGCAATGAGAAACATTAGTAAAATATAAATGGATATTCCTGATGCATTTAGGAAGCTCTCAATTGTCTCTTGCATAGTTCAAGGAATGTTTTCTGAATTTTTTTAATGCTTTTTTTTTTTTTGAAAGAGGAAAACATACATTTTTAAATGTGATTATCTAATTTTTACAACACTGGGCTATTAGGAATAACTTTTTAAAAATTACTGTTCTGTATAAATATTTGAAATTCAAGTACAGAAAATATCTGAAACAAAAAGCATTGTTGTTTGGCCATGATACAAGTGCACTGTGGCAGTGCCGCTTGCTCAGGACCCAGCCCTGCAGCCCTTCTGTGTGTGCTCCCTCGTTAAGTTCATTTGCTGTTATTACACACACAGGCCTTCCTGTCTGGTCGTTAGAAAAGCCGGGCTTCCAAAGCACTGTTGAACACAGGATTCTGTTGTTAGTGTGGATGTTCAATGAGTTGTATTTTAAATATCAAAGATTATTAAATAAAGATAATGTTTGCTTTTCTA

Claims (15)

1. 第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列を含む２本鎖ＲＮＡをコードする発現カセットであって、
   前記第１の及び第２のＲＮＡ配列は実質的に相補的であり、
   前記第１のＲＮＡ配列は、少なくとも１９ヌクレオチドの長さの配列を有し、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子によってコードされるＲＮＡに含まれる標的ＲＮＡ配列に実質的に相補的である、発現カセット。
2. 前記標的ＲＮＡ配列が、ヒトＡＴＸＮ３遺伝子の配列番号２のヌクレオチド９４２～１０６０に対応する配列によってコードされるＲＮＡ配列に対して５’の領域に含まれる、請求項１に記載の発現カセット。
3. 前記標的ＲＮＡ配列が、配列番号２の領域３９０～４５６及びそれから３’の配列によってコードされるＲＮＡ配列に含まれる、請求項２に記載の発現カセット。
4. 前記標的ＲＮＡ配列が、配列番号９～１３からなる群から選択される、請求項２～３のいずれか一項に記載の発現カセット。
5. 前記第１及び第２のＲＮＡ配列がｐｒｅ－ｍｉＲＮＡスキャホールド、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡスキャホールド又はｓｈＲＮＡに含まれる、請求項１～４のいずれか一項に記載の発現カセット。
6. 前記ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡスキャホールド又は前記ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡスキャホールドがｍｉＲ４５１由来である、請求項５に記載の発現カセット。
7. 第１のＲＮＡ配列が、配列番号１４～１７からなる群から選択される、請求項３～６のいずれか一項に記載の発現カセット。
8. 前記第１のＲＮＡ配列及び第２のＲＮＡ配列が、配列番号１４及び１８；配列番号１５及び１９；配列番号１６及び２０；配列番号１７及び２１の組合せからなる群から選択される、請求項７に記載の発現カセット。
9. 前記コードされるＲＮＡが配列番号２２～２９からなる群から選択されるＲＮＡ配列を含む、請求項８に記載の発現カセット。
10. 前記第１のＲＮＡ配列及び前記第２のＲＮＡ配列をコードする前記核酸配列に作動可能に連結された、ＰＧＫプロモーター、ＣＭＶプロモーター、神経細胞特異的プロモーター、星状細胞特異的プロモーター又はＣＢＡプロモーターを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の発現カセット。
11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載の発現カセットを含む遺伝子治療ベクターであって、
    好ましくはＡＡＶベクターである、遺伝子治療ベクター。
12. 医学的治療における使用のための、請求項１１に記載の遺伝子治療ベクター、又は請求項１～１０のいずれか一項に記載の発現カセット。
13. ＳＣＡ３／ＭＪＤの医学的治療における、請求項１２に記載の使用。
14. ＡＴＸＮ３遺伝子発現のトータルノックダウンを含む、請求項１２又は１３に記載の使用。
15. 脳幹及び／又は小脳におけるＡＴＸＮ３遺伝子発現のノックダウンを含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の使用。

Images