JP6687948B2 - 遺伝子発現制御のための発現抑制核酸分子およびその用途 - Google Patents
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
Description
本発明は、遺伝子発現を抑制する発現抑制核酸分子およびその用途に関する。
近年、遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）等の医療分野への応用が、試みられている。しかしながら、これらの核酸分子は、遺伝子発現を抑制するものの、反対に、生体内の自然免疫を作動させてしまうことが懸念されている。
そこで、本発明は、新たな発現抑制核酸分子の提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明の発現抑制核酸分子は、標的遺伝子の発現抑制核酸分子であって、
Ｘ領域とＹ領域とが連結した一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域は、
発現抑制配列であり、
前記Ｙ領域に対する連結側領域（ＸＢ）および非連結側領域（ＸＦ）からなり、
前記連結側領域（ＸＢ）は、その領域内でステムループ構造またはステム構造を形成する配列であり、
前記非連結側領域（ＸＦ）は、前記Ｙ領域と、分子内アニーリングするアニーリング配列を含むことを特徴とする。
Ｘ領域とＹ領域とが連結した一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域は、
発現抑制配列であり、
前記Ｙ領域に対する連結側領域（ＸＢ）および非連結側領域（ＸＦ）からなり、
前記連結側領域（ＸＢ）は、その領域内でステムループ構造またはステム構造を形成する配列であり、
前記非連結側領域（ＸＦ）は、前記Ｙ領域と、分子内アニーリングするアニーリング配列を含むことを特徴とする。
本発明の組成物は、遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の発現抑制核酸分子を含むことを特徴とする。
本発明の組成物は、薬学的組成物であって、前記本発明の発現抑制核酸分子を含むことを特徴とする。
本発明の発現抑制方法は、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の発現抑制核酸分子を使用することを特徴とする。
本発明の疾患の治療方法は、前記本発明の発現抑制核酸分子を、患者に投与する工程を含むことを特徴とする。
本発明の発現抑制核酸分子は、前述のように、前記発現抑制配列の内部で、ステム間にループを有するステムループ構造（以下、「ヘアピン構造」ともいう）またはステム間にループを有さないステム構造を形成する構造をとる。すなわち、本発明の発現抑制核酸分子は、例えば、同じ一本鎖核酸であっても、ｓｈＲＮＡよりも、相対的に短い全長とすることができ、また、ｓｉＲＮＡのような二本鎖構造ではなく、一本鎖構造とすることができる。このため、本発明の発現抑制核酸分子によれば、核酸に対する自然免疫の作動を回避して、標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。このため、本発明の発現抑制核酸分子は、遺伝子治療等の医療分野において、非常に有用といえる。
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
（１）発現抑制核酸分子
本発明の発現抑制核酸分子は、前述のように、標的遺伝子の発現抑制核酸分子であって、
Ｘ領域とＹ領域とが連結した一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域は、
発現抑制配列であり、
前記Ｙ領域に対する連結側領域（ＸＢ）および非連結側領域（ＸＦ）からなり、
前記連結側領域（ＸＢ）は、その領域内でステムループ構造またはステム構造を形成する配列であり、
前記非連結側領域（ＸＦ）は、前記Ｙ領域と、分子内アニーリングするアニーリング配列を含むことを特徴とする。
本発明の発現抑制核酸分子は、前述のように、標的遺伝子の発現抑制核酸分子であって、
Ｘ領域とＹ領域とが連結した一本鎖核酸であり、
前記Ｘ領域は、
発現抑制配列であり、
前記Ｙ領域に対する連結側領域（ＸＢ）および非連結側領域（ＸＦ）からなり、
前記連結側領域（ＸＢ）は、その領域内でステムループ構造またはステム構造を形成する配列であり、
前記非連結側領域（ＸＦ）は、前記Ｙ領域と、分子内アニーリングするアニーリング配列を含むことを特徴とする。
本発明の発現抑制核酸分子は、例えば、標的遺伝子の発現を抑制できる。発現抑制とは、例えば、前記標的遺伝子の翻訳の抑制、すなわち、前記標的遺伝子がコードするタンパク質の翻訳の抑制を意味し、より詳細には、前記標的遺伝子のｍＲＮＡからの前記タンパク質の翻訳の抑制を意味する。前記標的遺伝子の発現抑制は、例えば、前記標的遺伝子からの転写産物の生成量の減少、前記転写産物の活性の減少、前記標的遺伝子からの翻訳産物の生成量の減少、または前記翻訳産物の活性の減少等によって確認できる。前記タンパク質は、例えば、成熟タンパク質、または、プロセシングもしくは翻訳後修飾を受ける前の前駆体タンパク質があげられる。
本発明の発現抑制核酸分子は、前述の構造をとることで、例えば、Ｄｉｃｅｒ非依存で、発現抑制を行うことができる。一般的に、多くの腫瘍細胞ではＤｉｃｅｒの発現が低下しているため、本発明の発現抑制核酸分子は、Ｄｉｃｅｒ非依存であることで、例えば、Ｄｉｃｅｒの発現が低下している腫瘍細胞においても有効に機能できる。また、自然免疫に関与するＴＬＲ ｆａｍｉｌｙ、ＲＩＧ-Ｉ、ＭＤＡ５による核酸認識は、核酸の長さに強く依存する。本発明の発現抑制核酸分子は、例えば、全長の短縮が可能であるため、自然免疫反応を回避できる。さらに、本発明の発現抑制核酸分子は、例えば、ｓｉＲＮＡのように二本の一本鎖をアニーリングする必要もなく、安価に製造できる。
本発明の発現抑制核酸分子における前記Ｘ領域および前記Ｙ領域の配置関係の概略を、図１に示す。なお、図１は、概略であって、例えば、各領域の長さ、形状等は、制限されない。本発明の発現抑制核酸分子は、図１に示すように、５’側に前記Ｘ領域が配置され、３’側に前記Ｙ領域が配置されてもよいし、また、図示していないが、５’側に前記Ｙ領域が配置され、３’側に前記Ｘ領域が配置されてもよく、好ましくは、前者である。前者の場合、本発明の発現抑制核酸分子は、５’側から、前記Ｘ領域における前記非連結側領域（ＸＦ）と前記連結側領域（ＸＢ）、および前記Ｙ領域とが、この順序で配置されている。後者の場合、本発明の発現抑制核酸分子は、５’側から、前記Ｙ領域と、前記Ｘ領域における前記連結側領域（ＸＢ）と前記非連結側領域（ＸＦ）とが、この順序で配置されている。
本発明の発現抑制核酸分子において、前記連結側領域（ＸＢ）は、その領域内でステムループ構造またはステム構造を形成する配列であり、前記非連結側領域（ＸＦ）は、前記Ｙ領域と、分子内アニーリングするアニーリング配列を含む。また、本発明の発現抑制核酸分子において、前記Ｙ領域は、前記連結側領域（ＸＢ）の一端側に位置し、前記連結側領域（ＸＢ）の他端側に位置する前記非連結側領域（ＸＦ）に分子内アニーリングする配列を含む。分子内アニーリングとは、例えば、自己アニーリングともいう。
本発明の発現抑制核酸分子は、その５’末端と３’末端とが未連結である、線状一本鎖核酸分子ということもできる。本発明の発現抑制核酸分子は、例えば、両末端の未結合の維持のため、５’末端が非リン酸基であることが好ましい。
本発明の発現抑制核酸分子において、前記Ｘ領域は、前述のように、発現抑制配列である。前記発現抑制配列は、例えば、標的遺伝子において、分子内アニーリングにより前記ステムループ構造または前記ステム構造を形成する領域を選択し、前記領域の相補配列とすることで設定できる。
本発明の発現抑制核酸分子において、各領域の長さは、特に制限されない。以下に、条件を例示するが、本発明の発現抑制核酸分子は、これらの記載には限定されない。また、本発明において、塩基の数値範囲は、その範囲に属する正の整数を全て開示するものであり、例えば、「１〜４塩基」との記載は、「１、２、３、４塩基」の全ての開示を意味する（以下、同様）。
前記Ｘ領域における前記連結側領域（ＸＢ）の長さは、例えば、ステムループ構造またはステム構造をとり得る長さであり、具体的に、下限が、例えば、５塩基長、８塩基長、１０塩基長であり、上限が、例えば、２３塩基長、２１塩基長、１９塩基長であり、範囲が、例えば、５〜２３塩基長、１０〜２３塩基長、８〜２３塩基長、または、５〜２１塩基長、８〜２１塩基長、１０〜２１塩基長、１０〜１９塩基長である。
前記連結側領域（ＸＢ）において、ステムの長さは、下限が、例えば、０塩基長、２塩基長、４塩基長であり、上限が、例えば、１０塩基長、８塩基長、６塩基長であり、範囲が、例えば、０〜１０塩基長、２〜８塩基長、４〜６塩基長である。
前記連結側領域（ＸＢ）において、ループの長さ（ＸＢ）は、下限が、例えば、３塩基長、４塩基長、５塩基長であり、上限が、例えば、２１塩基長、１９塩基長、１７塩基長であり、範囲が、例えば、３〜２１塩基長、４〜１９塩基長、５〜１７塩基長である。
前記Ｘ領域における前記非連結側領域（ＸＦ）について、前記Ｙ領域と分子内アニーリングするアニーリング配列の長さは、下限が、例えば、０塩基長、２塩基長、４塩基長であり、上限が、例えば、１８塩基長、１６塩基長、１４塩基長であり、範囲が、例えば、０〜１８塩基長、２〜１６塩基長、４〜１４塩基長である。
前記Ｘ領域は、例えば、前記Ｙ領域と未連結の末端側に、オーバーハングを有してもよい。すなわち、前記非連結側領域（ＸＦ）は、例えば、末端にオーバーハングを有してもよく、具体的には、前記アニーリング配列と前記オーバーハングとを有してもよい。前記オーバーハングは、下限が、例えば、１塩基長、２塩基長であり、上限が、例えば、３塩基長であり、範囲が、例えば、１〜３塩基長、１塩基長または２塩基長である。前記Ｘ領域のオーバーハングの配列は、前記発現抑制配列に付加する配列でもよいし、前記発現抑制配列の末端の配列でもよく、好ましくは後者である。
前記Ｙ領域は、例えば、前記Ｘ領域と未連結の末端にオーバーハングを有してもよく、具体的には、前記アニーリング配列と前記オーバーハングとを有してもよい。前記オーバーハングは、下限が、例えば、１塩基長、２塩基長であり、上限が、例えば、３塩基長であり、範囲が、例えば、１〜３塩基長、１塩基長または２塩基長である。
前記Ｙ領域のオーバーハングの配列は、特に制限されず、例えば、３’側から、ＵＵ、ＣＵ、ＧＣ、ＵＡ、ＡＡ、ＣＣ、ＵＧ、ＣＧ、ＡＵ、ＴＴ等からなる配列またはこれらを含む配列が例示できる。前記オーバーハングは、例えば、ＴＴとすることで、ＲＮＡ分解酵素に対する耐性を付加できる。
本発明の発現抑制核酸分子において、前記Ｘ領域の長さ（Ｘ）は、特に制限されず、下限が、例えば、５塩基長、７塩基長、９塩基長であり、上限が、例えば、２３塩基長、２１塩基長、１９塩基長であり、範囲が、例えば、５〜２３塩基長、５〜２１塩基長、７〜２１塩基長、または５〜１９塩基長である。
本発明の発現抑制核酸分子において、前記Ｙ領域の長さ（Ｙ）は、特に制限されず、下限が、例えば、１塩基長、３塩基長、５塩基長であり、上限が、例えば、１８塩基長、１６塩基長、１４塩基長であり、範囲が、例えば、１〜１８塩基長、３〜１６塩基長、５〜１４塩基長である。
本発明の発現抑制核酸分子の全長は、特に制限されず、下限が、例えば、５塩基長、７塩基長、９塩基長であり、上限が、例えば、４１塩基長、３９塩基長、３７塩基長であり、範囲が、例えば、５〜４１塩基長、７〜３９塩基長、９〜３７塩基長である。
本発明の発現抑制核酸分子の構成単位は、特に制限されず、例えば、ヌクレオチド残基があげられる。前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基およびデオキシリボヌクレオチド残基があげられる。本発明の発現抑制核酸分子において、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基が好ましい。前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾されていない非修飾ヌクレオチド残基および修飾された修飾ヌクレオチド残基があげられる。本発明の発現抑制核酸分子は、例えば、前記修飾ヌクレオチド残基を含むことによって、ヌクレアーゼ耐性を向上し、安定性を向上可能である。また、本発明の発現抑制核酸分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基の他に、さらに、非ヌクレオチド残基を含んでもよい。
本発明の発現抑制核酸分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記修飾リボヌクレオチド残基を含む場合、前記修飾リボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１個もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個である。前記非修飾リボヌクレオチド残基に対する前記修飾リボヌクレオチド残基は、例えば、リボース残基がデオキシリボース残基に置換された前記デオキシリボヌクレオチド残基であってもよい。本発明の発現抑制核酸分子が、例えば、前記非修飾リボヌクレオチド残基の他に前記デオキシリボヌクレオチド残基を含む場合、前記デオキシリボヌクレオチド残基の個数は、特に制限されず、例えば、「１もしくは数個」であり、具体的には、例えば、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個である。
前記ヌクレオチド残基は、例えば、構成要素として、糖、塩基およびリン酸を含む。前記リボヌクレオチド残基は、例えば、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）またはウラシル（Ｕ）を有し、前記デオキシリボース残基は、例えば、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）を有する。
前記非修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一または実質的に同一であり、具体的には、例えば、人体において天然に存在するものと同一または実質的に同一である。
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等があげられる。
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記非修飾ヌクレオチドの代替物の残基であってもよい。前記代替物は、例えば、人工核酸モノマー残基があげられる。具体例として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）等があげられる。
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されない。前記塩基は、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基は、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ等が使用できる。
本発明の発現抑制核酸分子は、例えば、標識物質を含み、前記標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は、特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等があげられる。前記標識物質は、例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３色素、Ｃｙ５色素等の蛍光団があげられ、前記色素は、例えば、Ａｌｅｘａ４８８等のＡｌｅｘａ色素等があげられる。前記同位体は、例えば、安定同位体および放射性同位体があげられ、好ましくは安定同位体である。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓおよび３６Ｓがあげられる。
本発明の発現抑制核酸分子は、前述のように、前記標的遺伝子の発現抑制ができる。このため、本発明の発現抑制核酸分子は、例えば、遺伝子が原因となる疾患の治療剤として使用できる。本発明において、「治療」は、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。前記疾患は、特に制限されず、例えば、目的の疾患に応じて前記発現抑制配列を適宜設定できる。前記疾患としては、例えば、乳がん、肺がん、胃がん、大腸がん、肝がん、膵がん、食道がん、前立腺がん、胆嚢がん、子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がん、骨肉腫、白血病等のがん、肺線維症、肝線維症等の疾患があげられる。
本発明の発現抑制核酸分子の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記発現抑制核酸分子を投与すればよい。
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
本発明において、発現抑制の対象となる前記標的遺伝子は、特に制限されず、所望の遺伝子を設定できる。そして、前記標的遺伝子の種類に応じて、例えば、前述のようにして、前記発現抑制配列を設定すればよい。
本発明の発現抑制核酸分子の使用に関しては、後述する本発明の組成物、発現抑制方法および治療方法等の記載を参照できる。
本発明の発現抑制核酸分子は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制可能であることから、例えば、医薬品、診断薬および農薬、ならびに、農薬、医学、生命科学等の研究ツールとして有用である。
本発明の発現抑制核酸分子の合成方法は、特に制限されず、従来公知の核酸の製造方法が採用できる。前記合成方法は、例えば、遺伝子工学的手法による合成法、化学合成法等があげられる。遺伝子工学的手法は、例えば、インビトロ転写合成法、ベクターを用いる方法、ＰＣＲカセットによる方法があげられる。前記ベクターは、特に制限されず、プラスミド等の非ウイルスベクター、ウイルスベクター等があげられる。前記化学合成法は、特に制限されず、例えば、ホスホロアミダイト法およびＨ−ホスホネート法等があげられる。前記化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を使用可能である。前記化学合成法は、一般に、アミダイトが使用される。前記アミダイトは、特に制限されず、市販のアミダイトとして、例えば、ＲＮＡ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳｉ、商品名、三千里製薬）、ＡＣＥアミダイトおよびＴＯＭアミダイト、ＣＥＥアミダイト、ＣＥＭアミダイト、ＴＥＭアミダイト等があげられる。
（２）組成物
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の発現抑制核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の発現抑制核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
本発明の発現抑制用組成物は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、前記本発明の発現抑制核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明の発現抑制核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の発現抑制用組成物は、例えば、発現抑制用試薬ということもできる。
本発明によれば、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に投与することで、前記標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。
また、本発明の薬学的組成物は、前述のように、前記本発明の発現抑制核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の薬学的組成物は、前記本発明の発現抑制核酸分子を含むことが特徴であり、その他の構成は何ら制限されない。本発明の薬学的組成物は、例えば、医薬品ということもできる。
本発明によれば、例えば、遺伝子が原因となる疾患の患者に投与することで、前記遺伝子の発現を抑制し、前記疾患を治療することができる。本発明において、「治療」は、前述のように、例えば、前記疾患の予防、疾患の改善、予後の改善の意味を含み、いずれでもよい。
本発明において、治療の対象となる疾患は、特に制限されず、例えば、遺伝子の発現が原因となる疾患があげられる。前記疾患の種類に応じて、その疾患の原因となる遺伝子を前記標的遺伝子に設定すればよい。
本発明の発現抑制用組成物および薬学的組成物（以下、組成物という）は、その使用方法は、特に制限されず、例えば、前記標的遺伝子を有する投与対象に、前記発現抑制核酸分子を投与すればよい。
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。前記細胞は、特に制限されず、例えば、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞等の各種培養細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞等の幹細胞、初代培養細胞等の生体から単離した細胞等があげられる。
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与対象が培養細胞の場合、例えば、トランスフェクション試薬を使用する方法、エレクトロポレーション法等があげられる。
本発明の組成物は、例えば、本発明の発現抑制核酸分子のみを含んでもよいし、さらにその他の添加物を含んでもよい。前記添加物は、特に制限されず、例えば、薬学的に許容された添加物が好ましい。前記添加物の種類は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
本発明の組成物において、前記発現抑制核酸分子は、例えば、前記添加物と複合体を形成してもよい。前記添加物は、例えば、複合化剤ということもできる。前記複合体形成により、例えば、前記発現抑制核酸分子を効率よくデリバリーすることができる。
前記複合化剤は、特に制限されず、ポリマー、シクロデキストリン、アダマンチン等があげられる。前記シクロデキストリンは、例えば、線状シクロデキストリンコポリマー、線状酸化シクロデキストリンコポリマー等があげられる。
前記添加剤は、この他に、例えば、担体、標的細胞への結合物質、縮合剤、融合剤、賦形剤等があげられる。
（３）発現抑制方法
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の発現抑制核酸分子を使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明の発現抑制核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の発現抑制方法は、前述のように、標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、前記本発明の発現抑制核酸分子を使用することを特徴とする。本発明の発現抑制方法は、前記本発明の発現抑制核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記標的遺伝子が存在する対象に、前記発現抑制核酸分子を投与する工程を含む。前記投与工程により、例えば、前記投与対象に前記発現抑制核酸分子を接触させる。前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類等の非ヒト動物があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。
本発明の発現抑制方法は、例えば、前記発現抑制核酸分子を単独で投与してもよいし、前記発現抑制核酸分子を含む前記本発明の組成物を投与してもよい。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象の種類に応じて適宜選択できる。
（４）治療方法
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明の発現抑制核酸分子を、患者に投与する工程を含むことを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明の発現抑制核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の疾患の治療方法は、前述のように、前記本発明の発現抑制核酸分子を、患者に投与する工程を含むことを特徴とする。本発明の治療方法は、前記本発明の発現抑制核酸分子を使用することが特徴であって、その他の工程および条件は、何ら制限されない。
本発明の治療方法は、例えば、前記本発明の発現抑制方法等を援用できる。前記投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与および非経口投与のいずれでもよい。
（５）発現抑制核酸分子の使用
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明の発現抑制核酸分子の使用である。
本発明の使用は、前記標的遺伝子の発現抑制のための、前記本発明の発現抑制核酸分子の使用である。
本発明の核酸分子は、疾患の治療に使用するための核酸分子であって、前記核酸分子は、前記本発明の発現抑制核酸分子であることを特徴とする。
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
ルシフェラーゼ遺伝子を標的遺伝子とする発現抑制核酸分子（以下、「核酸分子」ともいう。）を合成し、ルシフェラーゼの発現抑制を確認した。
ルシフェラーゼ遺伝子を標的遺伝子とする発現抑制核酸分子（以下、「核酸分子」ともいう。）を合成し、ルシフェラーゼの発現抑制を確認した。
（１）核酸分子の合成
ルシフェラーゼ遺伝子の配列から、ステムループ構造を形成する１９塩基長の領域を複数選択して、これらを発現抑制配列（＃１、＃２、＃３、＃４、＃６）とした。
ルシフェラーゼ遺伝子の配列から、ステムループ構造を形成する１９塩基長の領域を複数選択して、これらを発現抑制配列（＃１、＃２、＃３、＃４、＃６）とした。
まず、コントロールとして、前記発現抑制配列の３’末端にオーバーハング（ＴＴ）を付加したアンチセンス鎖と、それに相補的であり且つ３’末端にオーバーハング（ＴＴ）を付加したセンス鎖とからなるｓｉＲＮＡを合成した。これらの配列を図２に示す。
つぎに、オーバーハング（ＴＴ）を有していない前記発現抑制配列（＃１、＃２、＃３、＃４、＃６）を用いて、本発明の発現抑制核酸分子を合成した。これらの配列を図３に示す。図３において、下線部は、前記各発現抑制配列に該当し、縦線が相補関係にある核酸を示す。
（２）ｍＲＮＡの検出
前記核酸分子を、ヒト非小細胞性肺がん細胞株（ＮＣＩ―Ｈ１２９９）に導入し、ルシフェラーゼ ｍＲＮＡの検出を行った。
前記核酸分子を、ヒト非小細胞性肺がん細胞株（ＮＣＩ―Ｈ１２９９）に導入し、ルシフェラーゼ ｍＲＮＡの検出を行った。
まず、前記核酸分子を、注射用蒸留水（大塚製薬、以下同様）で溶解し、１００μｍｏｌ／Ｌの核酸分子溶液を調製した。ｍＲＮＡの検出には、ＮＣＩ―Ｈ１２９９細胞（ＡＴＣＣ社）を使用した。培地は、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ―１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２下とした。
まず、細胞を、前記培地中で培養し、その培養液を、２４穴プレートに、５００μＬずつ、１×１０４細胞／ウェルとなるように分注した。さらに、前記ウェル中の細胞を２４時間培養した後、前記核酸分子をトランスフェクション試薬ＲＮＡｉ ＭＡＸ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用い、添付プロトコールに従って、トランスフェクションした。トランスフェクションは、前記ウェルあたりの組成を以下のように設定した。下記組成において、（Ｂ）は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、（Ｃ）は、前記ＲＮＡ溶液であり、両者をあわせて５０μＬ添加した。なお、前記ウェルにおいて、前記核酸分子およびｓｉＲＮＡの最終濃度は、５ｎｍｏｌ／Ｌ、５０ｎｍｏｌ／Ｌとした。トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を２日間培養した。
そして、得られた培養細胞について、ＩＳＯＧＥＮ ｒｅａｇｅｎｔ（商品名、ニッポンジーン）を用い、添付のプロトコールに従って、ＲＮＡを回収した。
次に、逆転写酵素（商品名Ｍ−ＭＬＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、添付のプロトコールに従って、前記ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、合成した前記ｃＤＮＡを鋳型として定量ＰＣＲを行い、ルシフェラーゼ ｃＤＮＡの量を測定した。また、ルシフェラーゼ ｍＲＮＡは、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを内部コントロールとし、そのｃＤＮＡの量をあわせて測定した。
前記定量ＰＣＲは、試薬として、ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ（商品名、Ｒｏｃｈｅ）、サーモサイクラーとしてＭＸ３０００Ｐ（商品名、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、解析機器としてＭｘＰｒｏ（商品名、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いた（以下、同様）。前記ルシフェラーゼ ｃＤＮＡおよび前記ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡの増幅には、それぞれ、下記プライマーセットを使用した。反応液の全量は２５μＬとして、それぞれ３回測定した。
ルシフェラーゼ プライマーセット
5’-CGATTTTGTGCCAGAGTCCT-3’ （配列番号１６）
5’-AATCTCACGCAGGCAGTTCT-3’ （配列番号１７）
GAPDH プライマーセット
5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’ （配列番号１８）
5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’ （配列番号１９）
5’-CGATTTTGTGCCAGAGTCCT-3’ （配列番号１６）
5’-AATCTCACGCAGGCAGTTCT-3’ （配列番号１７）
GAPDH プライマーセット
5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’ （配列番号１８）
5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’ （配列番号１９）
そして、各発現抑制配列について、ｓｉＲＮＡを使用した際のルシフェラーゼ ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを１とした場合における、各核酸分子を使用した場合におけるルシフェラーゼ ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの相対値を算出した。これらの結果を、図４に示す。図４は、ルシフェラーゼ ｍＲＮＡ／ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの相対値であり、左から＃１、＃２、＃３、＃４および＃６の核酸分子の結果である。
図４に示すように、前記各発現抑制配列を用いたｓｉＲＮＡと比べ、本発明の核酸分子は、いずれも、ルシフェラーゼの発現を抑制することができた。
さらに、実施例の核酸分子は、二本鎖のｓｉＲＮＡとは異なり、一本鎖の核酸分子であるため、使用時に各一本鎖をアニーリングする必要がなく、また、自然免疫に関与するＴＬＲ３等に認識されることも回避できる。また、実施例の核酸分子は、トータルの塩基数が、ｓｉＲＮＡのトータル塩基数４２塩基よりも少ない２６〜３４塩基であるため、安価な合成が可能であり、自然免疫の作動を防止できる。
（実施例２）
ルシフェラーゼ遺伝子を標的遺伝子とする発現抑制核酸分子を合成し、ルシフェラーゼタンパク質の発現抑制を確認した。
ルシフェラーゼ遺伝子を標的遺伝子とする発現抑制核酸分子を合成し、ルシフェラーゼタンパク質の発現抑制を確認した。
ＮＣＩ―Ｈ１２９９細胞に加えて、ルシフェラーゼ遺伝子を導入したヒト肺がん細胞株（Ａ５４９細胞、ＡＴＣＣ社）を用い、前記核酸分子として＃１、＃４および＃６の核酸分子を用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、トランスフェクションした。前記トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を７２時間培養した。
つぎに、前記培養後の細胞を回収し、ルシフェラーゼ測定キット（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用い、添付のプロトコールに基づき、発光強度を測定した。発光強度の測定は、ルミノメーター（Ｌｕｍａｔ ＣＢ ９５０７、Ｂｅｌｔｈｏｌｄ Ｗｉｌｄｂａｄ社製）を用い行った。無処置群は、トランスフェクションしなかった以外は同様にして、Ｍｏｃｋは、前記核酸分子をトランスフェクションしなかった以外は同様にして、コントロールは、前記核酸分子に変えて、下記のコントロールｓｉＲＮＡを用いた以外は同様にして、発光強度を測定した。
コントロールｓｉＲＮＡ
Ｓ鎖： 5’-UACUAUUCGACACGCGAAGTT-3’（配列番号２０）
ＡＳ鎖：5’-CUUCGCGUGUCGAAUAGUATT-3’（配列番号２１）
Ｓ鎖： 5’-UACUAUUCGACACGCGAAGTT-3’（配列番号２０）
ＡＳ鎖：5’-CUUCGCGUGUCGAAUAGUATT-3’（配列番号２１）
この結果を、図５に示す。図５は、発光強度を示すグラフであり、左から、無処置群、Ｍｏｃｋ、コントロール、ならびに＃１、＃４、および＃６の核酸分子の結果である。また、図５（Ａ）は、ＮＣＩ―Ｈ１２９９細胞を用いた場合の結果であり、図５（Ｂ）は、Ａ５４９細胞を用いた場合の結果である。図５（Ａ）および（Ｂ）に示すように、無処置群、Ｍｏｃｋおよびコントロールと比べ、本発明の核酸分子は、いずれも発光強度を抑制すること、すなわち、ルシフェラーゼタンパク質の発現を抑制することができた。
（実施例３）
ヒトＫＲＡＳ遺伝子を標的遺伝子とする発現抑制核酸分子を合成し、ＫＲＡＳ遺伝子の発現抑制を確認した。
ヒトＫＲＡＳ遺伝子を標的遺伝子とする発現抑制核酸分子を合成し、ＫＲＡＳ遺伝子の発現抑制を確認した。
（１）核酸分子の合成
ＫＲＡＳ遺伝子の配列から、ステムループ構造を形成する１９塩基長の領域を１つ選択して、これらを発現抑制配列とした。
ＫＲＡＳ遺伝子の配列から、ステムループ構造を形成する１９塩基長の領域を１つ選択して、これらを発現抑制配列とした。
つぎに、前記発現抑制配列を用いて、本発明の発現抑制核酸分子（Ｇ１９／Ｐ９）を合成した。これらの配列を図６に示す。図６において、下線部は、前記発現抑制配列に該当し、縦線が相補関係にある核酸を示す。また、前記実施例２のコントロールｓｉＲＮＡを合成した。
（２）ｍＲＮＡの検出
前記核酸分子を、活性型ヒトＫＲＡＳ（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ）を有するＡ５４９細胞に導入し、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの検出を行った。
前記核酸分子を、活性型ヒトＫＲＡＳ（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ）を有するＡ５４９細胞に導入し、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡの検出を行った。
まず、ＮＣＩ―Ｈ１２９９細胞に代えて、前記活性型ＫＲＡＳ（ＫＲＡＳ Ｇ１２Ｓ）を有するＡ５４９細胞を用い、前記核酸分子として前記核酸分子（Ｇ１９／Ｐ９）を用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、トランスフェクションした。前記トランスフェクション後、前記ウェル中の細胞を４８時間培養した。
そして、得られた培養細胞について、前記ルシフェラーゼ プライマーセットに代えて、下記ＫＲＡＳ プライマーセットを用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にしてＫＲＡＳ ｃＤＮＡの量を測定した。また、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡは、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを内部コントロールとし、そのｃＤＮＡの量をあわせて測定した。
ＫＲＡＳ プライマーセット
5’-GGGGAGGGCTTTCTTTGTGTA-3’ （配列番号２３）
5’-GTCCTGAGCCTGTTTTGTGTC-3’ （配列番号２４）
5’-GGGGAGGGCTTTCTTTGTGTA-3’ （配列番号２３）
5’-GTCCTGAGCCTGTTTTGTGTC-3’ （配列番号２４）
また、無処置群は、トランスフェクションしなかった以外は同様にして、Ｍｏｃｋは、前記核酸分子をトランスフェクションしなかった以外は同様にして、コントロールは、前記核酸分子に変えて、前記実施例３（１）のコントロールｓｉＲＮＡを用いた以外は同様にして、ＫＲＡＳ ｃＤＮＡおよびＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡの発現量を測定した。そして、無処置群のＫＲＡＳ ｃＤＮＡ／ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡの発現量の相対値を１とした場合における、前記核酸分子（Ｇ１９／Ｐ９）、Ｍｏｃｋ、およびコントロールのＫＲＡＳ ｃＤＮＡ／ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡの相対値を算出した。これらの結果を図７に示す。図７は、ＫＲＡＳ ｃＤＮＡ／ＧＡＰＤＨ ｃＤＮＡの相対値を示すグラフであり、左から、無処置群、Ｍｏｃｋ、コントロール、および前記核酸分子（Ｇ１９／Ｐ９）の結果である。
図７に示すように、無処置群、Ｍｏｃｋ、およびコントロールと比べ、本発明の核酸分子は、ＫＲＡＳの発現を抑制することができた。
以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
この出願は、２０１４年７月１４日に出願された日本出願特願２０１４−１４４５８１を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
本発明の発現抑制核酸分子によれば、例えば、同じ一本鎖核酸であっても、ｓｈＲＮＡよりも、相対的に短い全長とすることができ、また、ｓｉＲＮＡのような二本鎖構造ではなく、一本鎖構造とすることができる。このため、本発明の発現抑制核酸分子によれば、例えば、長鎖の一本鎖核酸に反応する自然免疫や、二本鎖核酸に反応する自然免疫の作動を回避して、標的遺伝子の発現抑制を行うことができる。このため、本発明の発現抑制核酸分子は、遺伝子治療等の医療分野において、非常に有用といえる。
Claims (6)
- 配列番号１１、１２、１３、１４、１５または２２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、標的遺伝子の発現抑制核酸分子。
- 標的遺伝子の発現を抑制するための組成物であって、
請求項１に記載の発現抑制核酸分子を含むことを特徴とする、発現抑制用組成物。 - 標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
非ヒト動物に対して、請求項１に記載の発現抑制核酸分子を使用することを特徴とする発現抑制方法。 - 前記発現抑制核酸分子を、細胞、組織または器官に投与する工程を含む、請求項３に記載の発現抑制方法。
- 前記発現抑制核酸分子を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで投与する、請求項３または４に記載の発現抑制方法。
- 標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、
請求項１に記載の発現抑制核酸分子をｉｎ ｖｉｔｒｏで使用することを特徴とする発現抑制方法。
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